CN104745603B - 使用不需要钙黏着蛋白受体的毒素遏制昆虫对苏云金芽孢杆菌cry毒素的抗性 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用不需要钙黏着蛋白受体的毒素遏制昆虫对苏云金芽孢杆菌CRY毒素的抗性。本发明涉及用于获得编码具有3个缺少α‑1螺旋的结构域的Cry毒素(也称为Cry毒素、Bt毒素或δ‑内毒素)的DNA构建体的方法。所述DNA构建体被修饰以编码可杀死对相应的未修饰的Cry毒素具有抗性的昆虫的蛋白质。本发明涉及修饰的3‑结构域Cry毒素的基因的DNA构建体和修饰的3‑结构域Cry蛋白质，以及方法、含有所述构建体的分子载体和宿主细胞，以及产生修饰的3‑结构域Cry毒素的重组方法。此外，本发明涉及含有修饰的3‑结构域Cry毒素的制剂。昆虫对未修饰的Cry毒素的抗性是由于毒素与昆虫肠中的受体的结合降低。更具体地，本发明涉及修饰的3‑结构域Cry毒素的表达、表达所述修饰的3‑结构域Cry毒素的方法、具有表达所述修饰的3‑结构域Cry毒素的构建体的转化微生物和转基因植物以及遏制害虫对未修饰的Cry毒素的抗性的方法。

Description

使用不需要钙黏着蛋白受体的毒素遏制昆虫对苏云金芽孢杆 菌CRY毒素的抗性

本申请是国际申请日为2007年6月8日的国际申请PCT/MX2007/000068进入中国、申请号为200780053274.5的题为“使用不需要钙黏着蛋白受体的毒素遏制昆虫对苏云金芽孢杆菌CRY毒素的抗性”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的Cry毒素由于它们在控制不同栽培品种、林木中的虫害和在人类中传播疾病的昆虫的能力而具有重要价值。昆虫侵袭对Bt毒素抗性的产生是继续成功使用此环境友好的杀虫剂的主要障碍。昆虫中对Cry毒素抗性的主要机制包括Cry毒素与位于昆虫肠道的特异性受体的结合降低(Ferré和Van Rie，2002)。

Cry1A蛋白质是杀死一些重要鳞翅目昆虫的一组Bt毒素。在三种主要的棉花害虫品系中[烟芽夜蛾(Heliothis virescens)(Gahan等人，2001)、红铃麦蛾(Pectinophoragossypiella)(Morin等人，2003)和棉铃虫(Helicoverpa armígera)(Xu等人，2005)]，对Cry1A毒素的抗性与钙黏着蛋白的变化有关，钙黏着蛋白担当易感昆虫的肠中Cry毒素的初级受体(pnmary receptor)。钙黏着蛋白基因的突变产生对Bt毒素的“1型”抗性，这种类型的抗性是不同昆虫中出现频率最高的抗性。这种类型的抗性呈现对至少一种Cry1A毒素的高水平抗性，其本质是隐性的，它降低至少一种Cry1A毒素与抗性昆虫的膜的结合并呈现非常小的对毒素Cry1C的交叉抗性(Ferre和Van Rie，2002)。令人感兴趣的是，小菜蛾(gusanodorso de diamante，DBM)，Plutella xylostella，攻击蔬菜诸如西兰花(brócoli)和花椰菜的一种世界范围的害虫，呈现对Cry1A毒素的“1型”抗性，但是在这种情况下它并不与钙黏着蛋白基因中的突变直接相关。DBM是田间选择的世界上唯一的Bt毒素抗性昆虫(Tabashnik，2004)。与钙黏着蛋白的结合促进了结构域I的α-1螺旋的蛋白水解切割和负责这些蛋白质的毒性的寡聚体前孔(pre-poro)的形成(Gómez等人，2002)。

在本发明中，证明了从缺少编码螺旋α-1的DNA的3-结构域Cry基因构建体(constmcciones)产生的修饰的3-结构域Cry毒素，杀死对野生型(silvestres)3-结构域Cry毒素(未修饰的Cry毒素)具有抗性的昆虫。

昆虫对未修饰的3-结构域Cry毒素的抗性的遗传基础与编码Cry1A毒素初级受体的钙黏着蛋白基因中的突变有关。在抗性昆虫中，所述初级受体被截短或不存在，所以Cry毒素与肠细胞膜的结合被降低或不存在。因此，抗性昆虫对未修饰的3-结构域Cry毒素不敏感。本发明中介绍的修饰的3-结构域Cry毒素通过不需要毒素与钙黏着蛋白受体的结合来遏制抗性。修饰的3-结构域Cry毒素的毒性得到了对野生型Cry1A毒素具有抗性的两种昆虫品系的证明，其还在通过沉默钙黏着蛋白RNA诱导的对Cry毒素的具有降低的易感性的昆虫中进行了测试。一个抗性昆虫品系通过钙黏着蛋白基因的遗传修饰呈现1型抗性，而另一品系则呈现与钙黏着蛋白基因中的突变无关的1型抗性。

通过构建缺少α-1螺旋的基因产生的修饰的Cry1A蛋白质诱导寡聚体前孔的体外(in vitro)形成而不需要结合钙黏着蛋白受体，也不需要含有Cry毒素结合位点的钙黏着蛋白的片段或scFv格式的抗体(scFv73)(其模拟钙黏着蛋白受体中存在的Cry毒素结合区)(Gómez等人，2002)。另一方面，未修饰的Cry1A蛋白质需要scFv73抗体或钙黏着蛋白的片段或钙黏着蛋白的存在以体外产生寡聚体前孔。

由于Cry1A蛋白质作用模式与其他3-结构域Cry毒素的相似性、以及各种昆虫对Cry毒素具有共同的抗性机制，本文描述的发明可具有非常广泛的应用。除了Cry1A蛋白质之外，还有许多其他为具有3-结构域结构的Cry毒素的Bt毒素，其中包括氨基酸序列具有低相似性的蛋白质(de Maagd等人2001)。已报告不同的3-结构域Cry毒素(Cry1A、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Crv1E、Crv1F、Cry3A、Cry3B、Cry3C、Cry4A、Cry4B和Cry11)形成与对Cry1Ab毒素观察到的那些相似的寡聚体结构，并且所述结构插入靶幼虫肠细胞的膜形成离子孔。这表明3-结构域Cry蛋白质具有相似的作用机制(Gómez等人，2002；Rausell等人，2004a；Rausell等人，2004b；Herrero，S.等人，2004；-Garav等人，2006)。此外，昆虫中对Cry1A毒素最常见的抗性机制包括初级钙黏着蛋白受体的改变。这些改变避免了通常由Cry毒素与钙黏着蛋白受体的相互作用介导的寡聚体前孔结构的形成。因此，我们预测对未修饰的3-结构域Cry毒素具有抗性的不同昆虫可能对相应的修饰的3-结构域Cry毒素敏感，其中编码α-1螺旋的片段已被除去(revealed)。由本文描述的基因构建体产生的修饰的3-结构域Cry毒素可作为局部施用的杀虫剂(例如，作为喷雾杀虫剂)、作为转基因微生物、或作为转基因植物呈现于昆虫群体。

背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bt)是属于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)组的细菌(Helgason等人2000)。与蜡状芽孢杆菌组的其他成员不同，Bt产生主要由称为Cry毒素、Bt毒素或δ-内毒素的杀虫剂蛋白质构成的伴胞晶体。

Bt毒素对一些特定的昆虫有毒性，而对人类、脊椎动物和植物无毒。它们还是完全生物可降解的。因此，Bt毒素对控制害虫是安全和有效的。这些毒素的应用包括：1)控制林木的落叶侵袭，2)控制蚊和黑蝇，它们是人类疾病的载体，3)使用含有Bt毒素的杀虫剂制剂或表达它们的微生物控制农业侵袭，和4)通过使用产生Bt毒素的转基因植物控制农业侵袭。

根据Cry蛋白质的同源性，它们可划分为几个组。含有最大数量的Cry毒素变体的组是3-结构域Cry蛋白质组。具有Cry毒素同源性的其他组包括与球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)产生的Bin和Mtx毒素相似的Cry毒素(Crickmore等人，1998；Crickmore等人，2002)。

截至目前，已分离了大量Bt株系，找到了对鳞翅目、双翅目或鞘翅目昆虫有活性的毒素(Schnepf等人，1998)。Cry毒素杀死昆虫，因为它们在幼虫的肠表皮细胞的膜上形成溶孔。

3-结构域Cry毒素的结构。3-结构域Cry毒素家族的成员是由通过简单的接头(conectores)连接的三个结构域形成的球形蛋白质。已报道了以Cry1Aa蛋白酶(鳞翅类特异的)、Cry3A、Cry3B(鞘翅类特异的)、Cry4Aa和Cry4Ba(双翅类特异的)和Cry2Aa原毒素(protoxin)(双翅类和鳞翅类特异的)作用的毒素的三维结构(Grouchulski等人，1995；Li等人，1991；Galistki等人，2001；Morse等人，2001；Boomserm等人，2005；Boomserm等人，2006)。这些毒素中的一些毒素之间的序列同一性是低的。例如，Cry2Aa和Cry3Aa之间为20％同一性，而毒素Cry2Aa和Cry1Aa存在仅17％序列同一性。尽管这些毒素的低序列同一性，但是它们的三维结构是相似的，表明它们共有相似的作用机制(图1)。

3-结构域Cry毒素家族的每种毒素具有称为I、II和III的三个结构性域。结构域I是通过七个α-螺旋的分支形成的，其中中央螺旋(α5螺旋)被外部螺旋包围。α5螺旋在3-结构域Cry毒素家族内是高度保守的。此结构域已参与靶昆虫膜的离子孔的形成。结构域II由形成β-结构棱的沿疏水中心堆叠的三个反平行的β-折叠组成。结构域II已被指定为决定特异性的结构域，它是最富变化的结构域(de Maagd等人，2001)。参与结构域I和II之间的接触的氨基酸残基(存在于α-7螺旋和β-1折叠)在毒素Cry家族中是高度保守的。结构域III由两个反平行的β-折叠形成。此结构域还参与特异性和与受体的相互作用(de Maagd等人，2001)。结构域II和III之间的接触部分(对应于β-11和β-12折叠)以及结构域III的内部区域(对应于β-17和β-23折叠)在3-结构域Cry毒素家族中也是高度保守的。

作用机制为了杀死昆虫，3-结构域Cry毒素从由原毒素构成的伴胞晶体被转变成由插入膜的寡聚体结构形成的离子通道，所述离子通道造成离子的输出和细胞裂解。伴胞晶体被易感的幼虫摄取；此晶体在幼虫肠内溶解。如图1所示，溶解的原毒素被肠的蛋白酶切割，产生60-70kDa的蛋白片段(de Maagd等人，2001)。毒素的此初始活化包括N-末端(对Cry1毒素为25-30个氨基酸，对Cfy3毒素为58个残基，而对Cry2Aa为49个)的蛋白水解加工，并且在130kDa的长Cry原毒素(Cry1、Cry4、Cry5、Cry7-Cry14、Cry16-21、Crv24-Cry32、Cry39-44、Cry47-48和Cry50)情形中，其C-末端的大约一半蛋白质也被加工。

在初始的蛋白水解切割后，毒素结合于肠上皮中存在的柱状细胞的顶膜微绒毛(刷状缘)中的特异性受体(Schnepf等人，1998；de Maagd等人，2001)。与初级受体的相互作用诱导所述毒素的第二次蛋白水解切割，其中α-1螺旋被除去。第二次切割后，毒素分子被完全活化，并可与其他相似分子缔合以形成寡聚体结构。毒素的寡聚体呈现对二级受体(氨肽酶或碱性磷酸酶)的高亲和性。与二级受体的相互作用促进插入膜的微结构域(Schnepf等人，1998；Aronson和Shai，200l；Bravo等人，2004；Pardo等人，2006)。毒素的插入导致在顶膜微绒毛形成溶孔，并最终导致细胞的死亡(Schnepf等人，1998；Aronson和Shai，2001)。

已描述了鳞翅目昆虫中能够结合Cry1A毒素的至少四种不同的蛋白质：初级受体表征为类似于钙黏着蛋白的蛋白质(CADR)；二级受体是通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)桥锚定于膜的两种蛋白质，氨肽酶-N(APN)和碱性磷酸酶(FAL)。最后，还报道270kDa的糖轭合物(glicoconjugato)是可能的初级受体(Vadlamudi等人，1995；Knight等人，1994；Jurat-Fuentes等人，2004；Valaitis等人，2001)。

在本发明中，我们将使用缩写CADR来指担当一种或多种Bt毒素的初级受体的钙黏着蛋白类型的蛋白质。由于这些蛋白质的系统命名尚未确立的事实，不同昆虫中存在的不同CADR的名称有所不同，例如，Bt-R1代表烟草天蛾(Manduca sexta)的钙黏着蛋白(Vadlamudi等人，1995)，而BtR代表红铃麦蛾的钙黏着蛋白(Morin等人，2003)。CADR是具有细胞质结构域并具有细胞外的胞外域的跨膜蛋白质，所述胞外域含有表征钙黏着蛋白的各种重复的模体，在Bt-R₁的情形中为12个重复的模体(Vadlamldi等人，1995)。这些胞外域含有钙结合位点、与整联蛋白和钙黏着蛋白结合序列相互作用的序列。

已详细描述了烟草天蛾中Cry1A毒素的毒素与不同受体相互作用的连续过程。在此昆虫中，毒素首先结合于初级Bt-R₁受体。毒素寡聚体化之后，它与通过GPI锚定于膜的二级受体APN或FAL结合(Bravo等人，2004；Jurat-Fuentes等人，2006)。

烟草天蛾中Cry1Ab与Bt-R₁的结合促进了毒素N-末端的又一次蛋白水解切割(除去α-1螺旋)。此切割促进了具有寡聚体结构的前孔的形成，所述前孔增加毒素对二级受体的亲和性，并且对毒素插入膜和对毒性是重要的(Gómez等人，2002；Rausell等人，2004a)。将Cry1Ab原毒素与烟草天蛾肠中存在的蛋白酶在单链抗体scFv73(其模拟Bt-R₁受体上存在的结合位点)存在下孵育，也产生了含有250kDa寡聚体的毒素制品，所述250kDa寡聚体缺少结构域Iα-1螺旋(Gómez等人，2002，2003)。此250kDa寡聚体也形成于当将Cry1Ab原毒素与烟草天蛾肠的蛋白酶在含有Bt-R₁受体用于特异性结合毒素的序列(CADR 7和11上的重复区)的肽的存在下孵育时(Gómez等人，2002，2003)。

Crv1Ab和Crv1Ac的寡聚体结构使它们结合二级APN受体的亲和性增加大约100至200倍，显示0.75-1nM的表观解离常数(Gómez等人，2003、Pardo等人，2006)。与60kDa的单体相反，250kDa的寡聚体能够插入膜(Rausell等人，2004a)。用合成脂构建的平面脂双层中的孔形成分析证明了Cry1Ab寡聚体和单体孔形成的差异。首先，对于寡聚体，孔形成以比单体的低得多的浓度发生。第二，寡聚体诱导的离子通道更稳定，并呈现更高的开放概率，而不像单体诱导的离子通道(Rausell等人，2004a)。

对于Crv1Aa、Cry1Ab、Cry1Ca、Cry1Da、Cry1Ea、Cry1Fa、Cry1Ca、Crv3A、Cry3B、Cry3C和Cry4B毒素，已证明了从Cry毒素的寡聚体形成(Gómez等人，2002；Rausell等人，2004a，Rausell等人，2004b；Herrero，S.等人，2004；-Garay等人，2006；Tigue等人，2001；Likitvivatanavong等人，2006)。Cry11Aa毒素还在它们的受体存在下寡聚化(Perez，个人交流)。在所有这些情形中，含有寡聚体结构的毒素样品中的孔形成活性比仅含有毒素的单体结构的那些高得多。此数据支持Cry毒素寡聚体的形成增加这些蛋白质的毒性的假设。

APN和FAL受体已被牵涉入Cry1A毒素插入膜的过程。经由使用磷脂酰肌醇特异性的磷脂酶C处理(此酶移除GPI锚定的蛋白质)的GPI切割移除APN和FAL，显著地减少了插入膜微结构域的Cry1Ab寡聚体水平，并显著降低毒素孔形成活性(Bravo等人，2004)。此外，将APN掺入合成的平面双层增加了Crv1Aa孔形成活性(Schwartz等人，1997)。

基于上文描述的数据，提出了Cry1A毒素的作用机制模型，其包括Cry1A毒素首先与Bt-R₁受体和然后与APN-FAL分子的连续相互作用。Cry1A单体与钙黏着蛋白受体的相互作用促进寡聚体前孔结构的形成，其呈现与二级APN或FAL受体的结合亲和性的增加。毒素前孔然后与APN或FAL结合。最后，毒素前孔插入膜微结构域(或脂筏)，诱导孔形成和细胞裂解(Bravo等人，2004)。

昆虫对Cry毒素的抗性。对Cry毒素的主要抗性机制包括毒素与位于昆虫的肠的受体结合的降低(Ferré和Van Rie，2002)。编码CADR的基因的突变与至少三种极为重要的昆虫害虫中对Cry1A毒素的抗性强烈相关：烟芽夜蛾(Gahan等人，2001)、红铃麦蛾(棉红铃虫)(Morin等人，2003)和棉铃虫(xu等人，2005)。在小菜蛾(DBM)，Plutella xylostella，攻击蔬菜诸如西兰花和花椰菜的一种世界范围的害虫的情形中，“1型”抗性与钙黏着蛋白基因的突变不是直接相关。不过，可能是该抗性昆虫系的突变可间接影响钙黏着蛋白的表达(Baxter等人2005)。

产生Crv毒素以杀死主要害虫的转基因作物的创建是减少化学杀虫剂使用和增加环境兼容和友好的控制昆虫的替代物的使用的决定性时刻。转基因植物中不断产生Cry毒素，这允许它们控制表面喷雾化学杀虫剂无法杀死的昆虫蛀虫。已通过具有与植物的密码子(codons)使用兼容的密码子使用的Cry基因的遗传工程、消除可能的RNA加工序列和切割原毒素C-末端区改进了Cry毒素的产生(Schuler等人，1998)。

昆虫抗性转基因植物自1996年起已大观模使用。2005年Bt-玉米和Bt-棉花的种植已达2600万公顷(James，2005)。Bt作物的这一非常广泛的使用激励了昆虫害虫群体中对Bt毒素抗性的强烈选择压力(Tabashnik，1994，Gould，1998)。如果昆虫害虫发展抗性，Bt毒素的有效性就结束了。响应这一挑战，已发展并实施了控制抗性的策略以延长Bt作物的效用。

防止Bt作物抗性的基本策略是使用保护区(refugios)(Gould，1998)。保护区是在Bt作物附近种植的非转基因作物区域。保护区策略的目标是回溯可与抗性昆虫配偶的易感昆虫的抗性保持群体。在所研究的大多数情形中，对Cry毒素的抗性是通过隐性突变赋予的(Ferré和Van Rie，2002；Conner等人，2003；Tabashnik等人，2003)。鉴于是隐性抗性，可由Bt作物出现的抗性纯合子昆虫与保护区区域的易感纯合子昆虫之间的杂交将产生对Bt作物表达的Cry毒素易感的杂合子后代。虽然此策略看似对回溯抗性有用，但是尚未执行仔细的大规模田间试验(Tabashnik等人，2005)。在任何情形中，保护区策略都是假定抗性将被回溯而不是被防止。

虽然尚未报道田间的Bt作物抗性，不过实验室选择已在许多昆虫害虫中产生了Bt抗性株系(Tabashnik，1994；Ferré和Van Rie，2002；Tabashnik等人，2003)。另外，田间已发展了小菜蛾Plutella xylostella(L)对喷雾Bt毒素的抗性，并且花椰菜100pers温室群体发展了粉纹夜蛾Trichoplusia ni(Hübner)对喷雾Bt毒素的抗性(Tabashnik，1994；Ferré和Van Rie，2002；Janmaat和Meyers，2003；Tabashnik等人，2003)。鉴于Bt毒素在世界的广泛使用并鉴于其使用的快速增加，昆虫害虫对目前使用的Cry毒素的抗性是人类健康、食物生产和环境的日益严重的成胁。因此，杀死抗性昆虫的修饰的Cry毒素是期望的并且是完全必要的。

附图说明

图1.-未修饰的3-结构域Cry毒素的作用机制。

图2.-修饰的3-结构域Cry毒素的作用机制。

图3.-用于长(130kDa)和短(70kDa)Cry毒素的PCR反应的引物(primeros)的设计。

图4.-用于产生缺少蛋白质的N-末端至最多达到α-1螺旋的末端的Cry1Ab和Cry1Ac的PCR策略。

启动子区(390bp)

含有α-1螺旋的氨基末端

α-2螺旋至β-23的毒素区(1687bp)

原毒素的C-末端片段(2069bp)

终止子区(368bp)

图5.-无α-1螺旋的突变的修饰Cry1Ab和Cry1Ac毒素的SDS-PAGE丙烯酰胺凝胶电泳证明产生130kDa原毒素蛋白质。

图6.-将Cry1Ab原毒素与烟草天蛾肠的胃液在CADR蛋白质片段(含有重复段7-12、11-12或12)存在下、或在scFv73抗体存在下、或无CADR片段或抗体下(对照)孵育后，获得的未修饰的Cry1Ab毒素的寡聚体结构(250kDa)的经由蛋白质印迹免疫检测的检测。

图7.-仅通过用胰蛋白酶处理修饰的3-结构域Cry毒素、Cry1AbMod和Cry1AcMod获得的寡聚体结构(250kDa)的经由蛋白质印迹免疫检测的检测。

图8.-琼脂糖凝胶电泳显示用T7聚合酶体外转录后获得的Bt-R₁基因片段和基因对照的双链RNA(dsRNA)。

图9.-幼虫肠匀浆液(10μg)经由蛋白质印迹免疫检测的检测，以抗Bt-R₁抗体或以针对肠的顶膜微绒毛的总蛋白质的抗体(抗-BBMV)检测(reveal)。对照(泳道(líne)1和2)是注射水并以无毒素的人工饲料培养的两种分开的幼虫。注射1μg dsRNA Bt-R₁并以含20ng Cry1Ab/cm²的人工饲料培养的7种分开的幼虫(泳道(líne)3至9)的肠样品。

图10.-烟草天蛾幼虫注射1μg Bt-R₁dsRNA并在Petri箱中以含以下的人工饲料孵育三天：A)20ng Cry1Ab/cm²；B)5ng Cry1AbMod/cm²；C)水(对照)。

发明内容

定义

术语“3-结构域Cry毒素”指杀虫剂晶体蛋白质家族(也称为Cry毒素、Bt毒素或δ-内毒素)的亚组的一个(一些)成员，它们是由三个不同的结构域(I、II和III)通过简单的键连接构成的球形蛋白质。虽然这些毒素中的一些毒素之间的序列同一性低，但是它们的结构拓扑是相似的，表明它们共有相似的作用机制(图1)。在这些3-结构域毒素中，本发明靶向非常公知的一组尤其是短Cry毒素(Cry3、Cry2和Cry11)和长cry毒素(Cry1、Cry4、Cry5、Cry7、Cry8、Cry9、Cry10、Cry11、Cry12、Cry13、Cry14、Cry16、Cry17、Cry18、Cry19、Cry20、Cry21、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry28、Cry29、Cry30、Cry31、Cry32、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry47、Cry48和Cry50)，它们拥有共同的作用机制。为了杀死昆虫，这些毒素必须在形成寡聚体结构之前结合于初级受体，所述寡聚体结构将其自身插入膜以生成孔。

术语“未修饰的3-结构域Cry毒素”代表未被修饰的野生型(silvestre)3-结构域Cry毒素。这些未修饰的毒素需要结合于初级受体，并且必须被酶促加工移除α-1螺旋，以完全活化和对易感幼虫具有毒性(图1)。

术语“修饰的3-结构域Crv毒素”代表被修饰的以使它们缺乏α-1螺旋的3-结构域Cry毒素。这些毒素不需要结合初级受体，它们也不需要其α-1螺旋被酶促加工才能变得有活性(图2)。

术语“Cry1AbMod”和“Cry1AcMod”代表两种具体的缺少α-1螺旋的修饰的3-结构域Cry毒素，它们分别对应于未修饰的3-结构域Cry毒素Cry1Ab和Cry1Ac。

术语“合格的抗性昆虫”指对未修饰的3-结构域Cry毒素具有抗性的昆虫，其抗性与影响初级受体基因(对于Cry1A毒素，称为钙黏着蛋白)表达的突变有关，无论所述突变是直接存在于初级受体基因或存在于影响所述初级受体表达的其他基因。由于当初级受体被修饰、截短或不表达时，未修饰的3-结构域Cry毒素与肠细胞顶膜的结合被降低或消除，并且毒素不能被完全活化，不能形成寡聚体，寡聚体不能将自身插入膜，也就不能杀昆虫。因此，这些昆虫对未修饰的3-结构域Cry毒素具有抗性。这些抗性昆虫是本发明修饰的3-结构域Cry毒素的靶，其中所述修饰的3-结构域Cry毒素遏制昆虫的抗性，已经能够形成寡聚体，将它们自身插入膜，并最终杀死这些抗性昆虫。

如上所述，存在可能目前是农业、林业和公众健康的重要难题的问题。这一问题是持续暴露于这些毒素的昆虫害虫中出现对未修饰的3-结构域Cry毒素的抗性，因为这些毒素被喷雾或通过转基因植物产生。已出现了不同的策略来追溯这一问题，但是预期这些策略并不能在问题发生时阻止或解决它。

本发明的发明人设计并实施了遏制昆虫中对未修饰的3-结构域Cry毒素的抗性的方法，所述方法通过合格的抗性昆虫并用修饰的3-结构域Cry毒素进行，所述修饰的3-结构域Cry毒素绕过了未修饰的3-结构域Cry毒素(图2)作用机制的两个步骤：1)毒素与初级受体之间的结合，和2)毒素N-末端的另外的蛋白水解切割，这使得切割α-1螺旋成为可能。对于未修饰的3-结构域Cry毒素来说，需要这些步骤以促进具寡聚体结构的前孔的形成，所述寡聚体前孔对于将毒素插入膜和对于毒性是重要的(Gómez等人，2002；Rausell等人，2004a)。

本发明是基于对3-结构域Cry家族的某些成员的作用机制(在图1中阐明)的理解，并希望这一机制对3-结构域Cry毒素家族的其他成员也是共同的(Bravo等人，2004；Gómez等人，2002；Rausell等人，2004a，Rausell等人，2004b；Herrero，S.等人，2004；-Garay等人，2006)。本发明还基于对初级受体中的缺陷构成昆虫藉以对Cry毒素产生抗性的最普遍和重要的机制的理解(Gahan等人，2001，Ferré和Van Rie，2002；Morin等人，2003；Xu等人，2005)。

在第一个方面(alcance)，本发明涉及获得编码缺少α-1螺旋的3-结构域Cry毒素的DNA构建体的方法。如上文已提及的，毒素此部分的体外酶促切割促进未修饰的3-结构域Cry毒素中寡聚体前孔的形成(图1)。与未修饰的3-结构域Cry毒素相反，所指的修饰的3-结构域Cry毒素的毒性或与初级受体(对于Cry1A毒素为CADR)的结合或α-1螺旋的酶促切割都不需要与初级受体的键的缔合(图2)。这些DNA构建体对于产生绕过与初级受体的结合步骤和α-1螺旋的酶促切割的修饰的3-结构域Cry毒素是重要的。所述修饰的3-结构域Cry毒素是有用的，无论它们是通过转基因植物产生或表达于其他系统如微生物，或以另一途径诸如喷雾杀虫剂施用。

获得编码缺少α-1螺旋的修饰的3-结构域Cry毒素的DNA构建体的方法由下列步骤组成：

a)选择希望修饰的3-结构域Cry毒素靶基因。

b)鉴定启动子区、编码蛋白质片段的区域和α-1螺旋的编码区。

c)扩增所述基因，并不包括编码氨基末端和α-1螺旋的区域。

缺少α-1螺旋的基因的扩增可使用聚合酶链式反应(PCR)进行，使用含有所选的未修饰的3-结构域Cry毒素基因的适当的DNA模板。这可以两个或多个扩增步骤进行，取决于基因的大小和希望使用的片段。扩增的第一个步骤(PCR1)仅扩增启动子区，第二PCR(PCR2)和随后的扩增步骤(PCR3)扩增从a-2螺旋开始至达β-23的编码区并扩增(如果存在)对应于蛋白质的羧基末端的区域。

对于PCR1，对扩增反应首先设计了包含起始密码子(ATG)和内部限制性酶切位点Ncol的寡核苷酸。对于PCR2和下列扩增，寡核苷酸必须设计为获得期望以包含从α-2螺旋至达β-23折叠的蛋白质编码区的DNA片段数。所选3-结构域Cry毒素的蛋白质羧基末端(如果存在)也必须扩增，以包含蛋白质的终止子区。

优选地，所述寡核苷酸必须在其5’端包含不存在于所选基因中的限制性酶切位点。可使用内部Ncol位点以使PCR1的产物与PCR2的产物连接(unir)。限制性酶切位点的选择方式应使PCR-1反应的产物的3’端仅可连接于PCR-2反应的产物的5’端，而PCR-2的产物的3’端仅可连接于PCR-3的产物的5’端，以此类推(图3)。优选地，必须使用包含于含有启动子区的PCR1的产物的5’端并包含于含有终止子的PCR产物的3’端的特异性限制性酶切位点，以使这些DNA片段连接(ligar)于适当的质粒载体。

对于Cry1Ab和Cry1Ac毒素，此方法的应用在实施例1中说明。然而，这可应用于任何其他未修饰的3-结构域Cry毒素以获得对应的缺少α-1螺旋的修饰的3-结构域Cry毒素。Neil Crickmore的网页(Crickmore，N.、zeigler，D.R.、Schnepf，E.、Van Rie，J.、Lereclus，D.、Baum，J、Bravo，A.和Dean，D.H.“Bacillus thuringiensis toxinanomenclature”(苏云金芽孢杆菌毒素命名)，2005，httD：//www.lifesci.sussex.ac.uk/ Home/Neil Chekmore/Bt/)列出了大多数已知的Cry毒素和3-结构域Cry毒素，包括它们的编码DNA的NCBI登录号。可选择这些3-结构域Cry毒素的任一种来应用本发明的方法，以获得修饰的3-结构域Cry毒素的相应DNA构建体。这些DNA构建体的表达可容易地实现，如实施例2所示。

优选地，所述质粒载体将是具有可在大肠杆菌(Escherichia coli)和苏云金芽孢杆菌细胞中复制的双复制起点的载体。所述表达载体可含有选择标记，其是载体转化的宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质编码基因。典型地，选择标记基因编码赋予对抗生素或其他物质(例如，氨苄青霉素、新霉素或甲氨蝶呤)的抗性的蛋白质。选择标记基因还可以是补足营养缺陷或提供复合培养基中没有的关键营养的基因。选择适当的选择标记基因将取决于宿主细胞；在本领域现有技术中，不同宿主的适当选择标记是已知的。

连接(ligación)混合物可转化入大肠杆菌细胞，然后可纯化转化的质粒并将其转化入苏云金芽孢杆菌细胞以表达修饰的3-结构域Cry毒素和产生生物杀虫剂。可选地，修饰的3-结构域Cry毒素基因可表达于异源(heterólogos)的系统，如使用适当载体的其他微生物(包括细菌、病毒、藻类和酵母)或其他生物体包括转基因昆虫和植物细胞。对于转基因植物，所述载体必须适合植物(诸如玉米、棉花和大豆或其他)中的转化和表达，以使加工的植物产生修饰的3-结构域Cry毒素。以此方式转化的植物可免受对未修饰的3-结构域Cry毒素具有抗性的靶昆虫的攻击。以喷雾生物杀虫剂施用的修饰的3-结构域Cry毒素的优选用途包括而不限于保护蔬菜和林木。我们努力以此方式控制的优选侵袭包括但不限于鳞翅目昆虫的侵袭。

为了证明此方法如何工作，通过如实施例1所示的本发明方法，从缺少α-1螺旋的Crv1Ab和Cry1Ac毒素获得了蛋白质片段。

通过上述方法获得的编码缺少α-1螺旋的修饰的3-结构域Cry毒素的DNA构建体也包括在本发明的范围内。

在实施例2中，说明了含有上文提及的编码缺少α-1螺旋的修饰的3-结构域Cry毒素的构建体的载体，其包括在本发明的范围内。本领域技术人员公知，载体的选择将具体取决于所用的宿主细胞。含有前述载体的遗传加工的宿主细胞也包括在本发明的范围内，一些优选的宿主细胞包括细菌，特别是革兰氏阳性细菌诸如芽孢杆菌属(género Bacillus)的那些，或革兰氏阴性细菌诸如假单胞菌属(Pseudomonas)和埃希氏菌属(Escherichia)，和植物细胞诸如玉米、大豆、马铃薯、棉花和其他植物。

产生本发明的修饰的3-结构域Cry毒素的重组方法应包括在本发明的范围内。一般而言，这些方法包括培养遗传加工的宿主细胞的步骤，所述遗传加工的宿主细胞含有容纳修饰的3-结构域Cry毒素的DNA构建体的载体。在适当的生长条件下，遗传加工的宿主细胞产生修饰的3-结构域Cry毒素。这些方法还包括任选地(opción)从细胞培养物中回收修饰的3-结构域Cry毒素，无论是以孢子，或作为纯化的蛋白质，或包含于宿主生物体内。

对于修饰的3-结构域Cry毒素(Cry1AbMod和Cry1AcMod)，这些方法在实施例2中说明。

在另一方面(alcance)，描述了所编码的修饰的3-结构域Cry毒素。修饰的3-结构域Cry毒素不需要结合于初级受体来形成前孔寡聚体结构。因此，鉴于缺少α-1螺旋的修饰的3-结构域Cry毒素对合格的抗性昆虫具有毒性，它们还将继续对未修饰的3-结构域Cry毒素敏感的昆虫具有毒性。

如上文提及的，在溶解于肠基质(intestino medio)后，作用模式中接下来的三个步骤是：1)由肠基质的蛋白酶进行的初始酶促切割，造成从C-末端区(如果其存在于毒素中)移除N-末端肽；2)结合于初级受体，和3)第二次酶促切割，造成α-1螺旋的移除。这三个步骤产生能够形成称为前孔的寡聚体结构的蛋白质(图1)。

缺陷的初级受体(CADR)是昆虫对Cry毒素产生抗性的最重要和普遍的机制(Gahan等人，2001，Ferré和Van Rie，2002；Morin等人，2003；Xu等人，2005)。初级受体的改变降低或消除未修饰的3-结构域Cry毒素的结合，明显阻止α-1螺旋的酶促切割并抑制毒性必需的前孔寡聚体结构的形成。修饰的3-结构域Cry毒素缺少α-1螺旋。这样，为了杀死昆虫，这些毒素不需要结合于初级受体，也不需要造成失去α-1螺旋的与此结合相关的切割。因为它们不需要结合于初级受体，所以阻止此结合的初级受体的缺陷不阻止其毒性。换言之，修饰的3-结构域Cry毒素遏制昆虫的抗性是因为不需要与初级受体的相互作用。

为了说明这些修饰的3-结构域Cry毒素，获得了编码修饰的Cry1Ab和Cry1Ac毒素(缺少α-1螺旋)的DNA构建体，如实施例1所示，并且表达了所述修饰的毒素，如实施例2所示。

为了证明修饰的3-结构域Cry毒素能够形成前孔寡聚体结构，两种修饰的3-结构域Cry毒素的原毒素Cry1AbMod和Cry1AcMod仅用胰蛋白酶处理，由此产生250kDa寡聚体。相反，用胰蛋白酶对两种对应的未修饰的3-结构域Cry毒素Cry1Ab和Cry1Ac的原毒素的相同处理仅产生60kDa单体结构，如实施例3所示。

通过在生物测定中向抗性和易感幼虫喂食含有不同浓度的修饰的3-结构域Cry毒素的食物，确定了修饰的3-结构域Cry毒素的毒性。比较了Cry1AbMod和Cry1AcMod与它们的未修饰的对等物Cry1Ab和Cry1Ac，针对棉红铃虫(红铃麦蛾)的第一期易感(野生型(silvestre))幼虫和对Cry1Ab和Cry1Ac具有抗性的棉红铃虫的毒性。还比较了Cry1AcMod与其对等物未修饰的Cry1Ac针对小菜蛾的Cry1Ac易感和抗性株系的一龄幼虫的毒性。未修饰的Cry1Ab和Cry1Ac毒素对易感幼虫具有高度毒性，但是对抗性幼虫则不是这样(表1和2)。相反，修饰的3-结构域Cry毒素Cry1AbMod和Cry1AcMod杀死易感幼虫以及抗性幼虫(表1和2)。这些结果显示所用来举例的修饰的3-结构域Cry毒素(Cry1AbMod和Cry1AcMod)遏制合格的抗性昆虫对未修饰的Cry1A毒素的高水平抗性，所述抗性与影响初级受体(在Cry1A的情形中为CADR)表达的突变有关，无论它们是所述初级受体基因的直接突变(如在棉红铃虫的情形中)或是间接影响初级受体表达的基因中的突变(如在小菜蛾的情形中)。

为了测试本发明的修饰的3-结构域Cry毒素针对另一靶昆虫烟草天蛾(尚未分离或培养其抗性昆虫群体)的毒性，获得了CADR受体被沉默的烟草天蛾幼虫，并测试它们以确定它们对未修饰的Cry1Ab的抗性，如实施例5中所述。使用这些烟草天蛾幼虫(CADR受体被沉默)，测试了修饰的3-结构域Cry毒素Cry1AbMod的毒性，如实施例6所述。结果再一次证明修饰的3-结构域Cry毒素杀死对相应的未修饰的3-结构域Cry毒素具有抗性的昆虫。

在另一方面(alcance)，本发明涉及遏制合格的抗性昆虫的抗性的方法，所述方法是基于通过允许所述昆虫食用含有足量的本发明的修饰的3-结构域Cry毒素的食物而杀死它们。致死剂量取决于许多因素，包括所用的赋形剂混合物；施用的技术和条件；所述制剂是气雾剂、薄膜还是小颗粒；薄膜的厚度或颗粒的大小和其他此类的因素。决定这些因素和适合确定修饰的3-结构域Cry毒素的致死剂量的其他考虑因素在本技术领域的专业人员的能力之内。

为了向合格的抗性昆虫喂食修饰的3-结构域Cry毒素，所述毒素必须在昆虫群体的食物内可获得。这可通过应用含有修饰的3-结构域Cry毒素的制剂实现。这还可通过产生含有编码修饰的3-结构域Cry毒素的DNA构建体的转基因植物实现，所述DNA构建体以可操作方式连接于适合植物表达的载体，以使所述转基因植物产生修饰的3-结构域Cry毒素。

制剂和转基因生物可用于农业作物、林木和控制疾病载体。例如，存在一些产生Bt毒素的遗传改造的树木，藻类也被遗传改造为产生Bt毒素以控制蚊类。

为了杀死合格的抗性昆虫，可定期向昆虫侵袭传播的地方施用含有修饰的3-结构域Cry毒素的制剂。例如，它可施用于植物(叶、茎、根或其他植物部位)以杀死侵袭作物或林木的合格的抗性昆虫，和施用于水体以杀死为人类疾病载体的在幼虫期生活于水中的合格的抗性昆虫(例如，蚊和黑蝇)。这可通过循环交替施用含有未修饰的3-结构域Cry毒素的制剂(不含修饰的3-结构域Cry毒素)和施用含有修饰的3-结构域Cry毒素制剂实现。可施用未修饰的3-结构域Cry毒素，直至计算到要发生或观察到合格的抗性昆虫的出现，此后可施用含有修饰的3-结构域Cry毒素的制剂以杀死抗性昆虫。

本发明的另一方面(alcance)涉及含有一种或多种修饰的3-结构域Cry毒素以遏制合格的抗性昆虫的抗性的新的制剂或组合物。在所述制剂中，所述修饰的3-结构域Cry毒素可以是包含于宿主生物体中或联合孢子或在纯蛋白质的均一制品中或在孢子与培养的转化生物体的混合物中。所述修饰的3-结构域Cry毒素还可以包含于不产生孢子的微生物诸如大肠杆菌或产生孢子的微生物诸如巨大芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌中、联合用于表达它们的株系的孢子或作为与赋形剂混合物一起的分离的晶体(并且任选地纯的Cry蛋白)。使用的赋形剂混合物的量将取决于制剂中期望的效价。在选择作为制剂组分的赋形剂混合物时，应考虑制剂追求的最终目的。例如，对于将施用于作物的制剂，必须使用农业可接受的赋形剂混合物，而对于将施用于林木(以控制合格的抗性昆虫的林木侵袭)和水体(控制为合格的抗性昆虫的载体昆虫)的制剂，则必须选择生态可接受的赋形剂。

赋形剂的混合物可包含载体(carrier)、表面活性剂、紫外线防护剂和其他组分，并可采取可湿性粉剂、液体浓缩物、粒剂或其他制剂的形式。这些制剂和应用程序是本技术领域公知的。

如本文所用，术语“赋形剂”意指与活性化合物混合或配制以便于所述活性化合物在植物、种子、地面、水或要处理的其他物体上的应用或它的储存、运输和/或管理的惰性固体或液体材料，其可以是无机的或有机的，并且可以是合成或天然来源。生物杀虫剂的制剂中通常使用的任何材料，例如园艺、农业和生态可接受的添加剂，是合适的。

一些合适的固体赋形剂是天然的和合成的粘土和硅酸盐类，例如天然硅石，诸如硅藻土；硅酸镁类，例如，滑石；硅酸铝镁类，例如，绿坡缕石和蛭石；硅酸铝类，例如，高岭石、蒙脱石和云母；碳酸钙；硫酸钙；合成的羟基硅酮(óxidos hidratados de siliconsinteticos)和合成的硅酸钙或硅酸铝；元素诸如，例如，碳和硫；天然和合成的树脂诸如，例如，香豆酮(coumarone)树脂、聚氯乙烯以及苯乙烯聚合物和共聚物；沥青；蜡诸如，例如，蜂蜡、石蜡和氯化矿物蜡；固体肥料，例如，过磷酸盐类；和研磨的(molidos)天然纤维材料，诸如研磨的玉米芯。

合适的液体赋形剂是水、醇类诸如异丙醇和乙二醇；酮类诸如丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮和环己酮；醚类诸如溶纤剂；芳香烃类诸如苯、甲苯和二甲苯；石油馏分诸如煤油、轻矿物油；氯代烃类诸如四氯化碳、全氯乙烯和三氯甲烷。其他合适的化合物为液化的通常为蒸气或气体的化合物。不同液体的混合物通常是合适的。

可添加表面活性剂，所述表面活性剂可以是乳化剂、分散剂或增湿剂：可以是非离子的或离子的。可使用除草剂或杀虫剂的制剂中通常应用的这些表面活性剂的任一种。合适的表面活性剂的一些实例是聚丙烯酸和磺酸的钠盐和钙盐；在环氧乙烷和/或环氧丙烷分子中含有至少12个碳原子的脂肪酸或脂肪胺或酰胺缩合产物；甘油酯和脂肪酸、山梨聚糖、蔗糖或戊硫醇；这些与环氧乙烷和/或环氧丙烷的缩合；脂肪酸或烷基酚例如对辛基苯酚(p-octylfenol)或对辛基甲酚(p-octilcresol)，与环氧乙烷和/或环氧丙烷的缩合产物；这些缩合产物的硫酸酯或磺酸酯的碱金属盐或碱土金属盐，优选地分子中含有至少10个碳原子的硫酸酯或磺酸酯的钠盐，例如，十二烷基硫酸钠、仲烷基硫酸钠、磺化蓖麻油的钠盐，和烷基芳基磺酸钠诸如十二烷基苯基磺酸钠；和环氧乙烷聚合物和环氧乙烷或环氧丙烷共聚物。

美国专利第5,14l,744号中提及了紫外线防护剂的一些实例，其中描述了含有用于杀虫剂包括Bt毒素的紫外线防护剂(如辛基二甲基PABA)的稳定的大粒凝胶(macrogeles)(至少六个月)，所述紫外线防护剂提供防止被阳光灭活的优点。美国专利第4,094,969号公开了通过添加磺酸酯共聚物建立含有Bt毒素的杀虫剂制剂的另一方式，Bt毒素在暴露于阳光时快速降解。

本发明的组合物可制备为可湿性粉剂、粒剂、溶液、乳化原液、浓悬剂(concentrados en suspensión)和气雾剂。所述可湿性粉剂通常复合为含有按重量计25至75％的活性化合物，并通常在固体载体之外含有按重量计3％至10％的分散剂、12％至15％的表面活性剂、必要时直至按重量计0至10％的稳定剂和其他添加剂诸如渗透剂或黏合剂。所述粉剂通常配制为组成类似于可湿性粉剂但不合分散剂或表面活性剂的浓缩粉剂，并在田间以另外的固体载体稀释以获得含有按重量计0.5％至10％的活性化合物的组合物。所述粒剂通常制备为10至100BS目(1,676-0.152mm)大小，并可通过凝聚或注入(impregnación)技术制备。一般而言，所述粒剂含有按重量计0.5％至25％的活性化合物、按重量计0至1％的添加剂诸如稳定剂、减缓释放的改性剂和胶黏剂(agglutinating agent)。除了溶剂和必要时助溶剂之外，乳化原液通常含有按体积重量计10％至50％的活性化合物、按体积重量计2％至20％的乳化剂和按体积重量计0至20％的适当添加剂诸如稳定剂、渗透剂和缓蚀剂。浓悬剂被复合为获得稳定的、不易沉降的和液体的产物，并通常含有按重量计0至75％的活性化合物、按重量计0.5％至5％的分散剂、1％至5％的表面活性剂、按重量计0.1％至10％的悬浮剂诸如消泡剂、缓蚀剂、稳定剂(尤其是用于蛋白质的)、渗透剂和黏合剂和作为载体的水或活性化合物在其中基本不溶的有机液体；某些有机固体或无机盐可溶解于所述载体中以帮助防止沉淀或作为水的防冻剂。

可水分散的粒剂制剂是以基本不含粉末并耐磨损和处理的硬的、干燥颗粒形式，这样可使粉末的形成最小化。与水接触后，所述粒剂迅速瓦解以形成活性材料的颗粒悬浮液。这种类型的制剂含有按重量计90％或更多的活性材料、按重量计3％至7％的研磨的表面活性剂(充当分散保湿剂、悬浮剂和胶黏剂)和按重量计1％至3％的载体(充当悬浮剂)。

水分散剂和乳剂，例如通过将根据本发明的可湿性粉剂或浓缩物用水稀释获得的制剂，也属于本发明的范围。所述乳剂可以是油包水类型或水包油类型，或其可具有像蛋黄酱一样浓稠(espesa)的黏稠度。

根据上文显然的，本发明提供含有低至按重量计0.0001％和高至按重量计95％的本发明的修饰的3-结构域Cry毒素作为活性剂的制剂。由于商业制品优选地配制为浓缩物，因此最终的使用者一般使用显著更低浓度的稀释制剂。

本发明的组合物还含有其他活性成分，例如，拥有杀虫剂(pesticidal)性质尤其是杀昆虫剂(insecticida)(特别是Cry和Crt毒素之外的)、杀螨剂或杀真菌剂性质的，适合预定目的的其他化合物。

含有修饰的3-结构域Cry毒素的制剂根据已知方法制备，例如通过将活性成分与载体混合物均匀混合和/或研磨。

本发明的修饰的3-结构域Cry毒素还可通过表达这些修饰的毒素的转基因植物施用于靶昆虫侵袭。有几种商业可得的转基因Bt作物，包括玉米和棉花。构建这些和其他转基因植物以表达Cry Bt毒素基因的方法是本领域技术人员公知的。简要而言，有几种方法来转化植物细胞和组织：“基因枪”方法(也称为显微注射或生物射弹轰击(参见授予Cornell的美国专利第4,945,050号和授予DowElanco，现在的Dow AgroSciences，LLC的美国专利第5,141,131号)；电穿孔方法(参见授予Boyce Thompson Institute的WO87/06614和授予Plant Genetic Systems的WO92/09696和W093/21335)，该方法在转化单子叶物种诸如玉米和水稻时尤其有用；和农杆菌(Agrobacteriun)介导的方法(Vaeck等人，1987)，该方法已成功在双子叶植物(具有较大叶片的植物诸如大豆和番茄)中实践多年，并且最近已有效用于一些单子叶植物(草和其他相关植物)(参见授予University of Toledo的美国专利第5,177,010号；授予Texas A&M的美国专利第5,104,310号；授予Schilperoot的欧洲专利申请0131624B1、120516、159418B1和176,112；授予Schilperoot的美国专利第5,149,645、5,469,976、5,464,763、4,940,838和4,693,976号；授予Max Planck Institute的欧洲专利申请第116718、290799、320500号；授予Ciba Geigv，现在的Novartis的欧洲专利申请0267159和0292435和美国专利第5,231,019号)。

一般而言，由于农杆菌方法的高频率外源DNA单位点插入使得监测更加容易，认为其优于基因枪方法。如果使用农杆菌转化植物，插入植物基因组的DNA必须克隆于特殊的质粒中，无论是以中间载体或双元载体。本领域技术人员可容易地使用此转化方法，用含有本发明的修饰的3-结构域Cry毒素基因的构建体转化植物，以产生杀死田间的合格的抗性昆虫或避免其出现的转基因植物。

下面的实施例说明了本发明是如何构思和实践的，并显示了其应用方法。这些实施例绝不是用来限制本发明。下面的实施例中提供的描述涉及使用用于构建载体和其他DNA分子的公布方案的可用策略的优选分子生物学方法。所有必需的分子克隆和重组DNA技术可通过标准方法执行(Sambrook等人，1995)。

具体实施方式

实施例1.使用本发明的方法获得编码缺少α-1螺旋的修饰的3-结构域Cry毒素的DNA构建体实例。

为了说明本发明的方法，选择了两种3-结构域Cry毒素：Cry1Ab和Cry1Ac。鉴定了这两者中的启动子区、完整蛋白质的编码区和α-1螺旋，如下所示：

pb，碱基对

为了除去α-1螺旋的编码区，扩增了称为Cry1AbMod和Cry1AcMod的修饰的3-结构域Crv毒素的基因构建体，如下所示：

在这些情形中，执行图4中显示的3个PCR步骤。使用含有pHT315Cry1Ab质粒的苏云金芽孢杆菌株系Bt407的总DNA和BtHD73株系的总DNA(其分别含有Cry1Ab和Cry1Ac基因；根据Gene Bank中的报告，登录号分别为X98793和ML 1068)作为模板。对于PCR1，正向寡核苷酸在5’端包含限制性酶切位点Hind III(其将用于插入合适的载体)，后跟启动子区的前18pb，而反向寡核苷酸在5’端含有ATG密码子和Neo I限制性酶切位点(以与PCR2片段连接)。

PCR2的寡核苷酸设计为在正向寡核苷酸的5’端包含Neo I限制性酶切位点，后跟α-2螺旋的前20pb。反向寡核苷酸包含α-23螺旋的最后20pb，后跟BamHI限制性酶切位点(以与PCR3片段连接)。

PCR3的正向寡核苷酸设计为在5’端包含BamHI限制性酶切位点，后跟蛋白质C-末端的前19pb。反向寡核苷酸在5’端包含终止子区的最后21pb和SmaI限制性酶切位点(用于克隆于合适的载体中)。

纯化三种PCR片段并将其分别连接于pBCKS载体，所述载体已预先用对应于每种PCR产物的限制性酶消化。最后，纯化每种pBCKS质粒并用对应的限制性酶切割以释放PCR片段(PCR1HindIII-NcoI；PCR2NcoI-BamHI和PCR3BamHI-SmaI)。纯化这些PCR片段并将其连接于双复制起点载体pHT-315(Lereclus等人，1989)，所述载体预先用限制性酶HindIII和SmaI消化。所得质粒含有cry1Ab和cry1Ac基因的修饰形式，其缺少α-1螺旋的编码区。这些基因被称为Cry1AbMod和Cry1AcMod。

实施例2.获得含有编码修饰的3-结构域Cry毒素的DNA构建体的载体和宿主细胞以及它们在产生修饰的3-结构域Cry毒素的重组方法中的用途。

获得包含基因构建体Cry1AbMod和Cry1AcMod的载体，所述基因构建体克隆于双复制起点载体pHT-315中(Lereclus等人，1989)。通过用上述载体转化去晶体化(acristalífera)的株系Bt407Cry^-(血清型H1，Lereclus等人，1989)获得含有所述构建体的遗传改造的宿主细胞。

为了产生此实施例的修饰的和未修饰的(野生型(silvestre))3-结构域Cry毒素，转化和野生型(silvestre)株系在振荡孵育器中于29℃和200rpm下在补充10μg/ml的红霉素的营养产孢培养基(Lereclus等人，1995)中培养3天。通过蔗糖梯度回收并纯化修饰的和未修饰的3-结构域Cry毒素晶体(Thomas和Ellar，1983)，并将其溶解于10mM pH 10.5的碳酸盐缓冲液。蛋白质样品在10％SDS-PAGE丙烯酰胺凝胶中分离(Laemmli，1970)。遗传改造的细胞以及未改变的细胞产生表观分子量为大约130kDa的蛋白质(图5)。

实施例3.用作实例的修饰的3-结构域Cry毒素寡聚体的形成(Crv1AbMod和Cry1AcMod)。

通过含有毒素结合区的Bt-R₁蛋白质片段存在下或在模拟对CADR受体的这些毒素结合区的scFv73抗体存在下，用蛋白酶活化Cry1A原毒素来促进寡聚体的体外形成(Gómez等人，2003)。当与含有CADR的7-12、11-12或12重复段的CADR片段孵育时，Cry1Ab原毒素产生250kDa寡聚体(图6)。

当在不存在CADR受体下用胰蛋白酶处理Cry1AbMod和Cry1AcMod原毒素时，它们产生250kDa寡聚体，但在这些条件下，野生型(silvestre)原毒素Cry1Ab和Cry1Ac不形成寡聚体，而仅产生60kDa单体(图7)。这些结果表明当修饰的3-结构域Cry毒素在不存在初级受体下被蛋白水解活化时，它们产生250kDa寡聚体前孔。

实施例4.蛋白质Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1AbMod和Cry1AcMod在红铃麦蛾(棉红铃虫)和Plutellaxylostella(小菜蛾)的易感和抗性株系中的毒性。

在几种鳞翅目昆虫中，对Bt毒素抗性的最常见类型(称为“模式1”)与CADR基因的突变有关(Gahan等人，2001；Morin等人，2003；Xu等人，2005)。不过，在小菜蛾的情形中，此昆虫呈现的1型抗性与钙黏着蛋白基因的突变无关(Baxter等人2005)。通过在10块棉花田中选择暴露于Cry1Ac毒素的幸存者获得棉红铃虫的AZP-R抗性株系(Tabashnik等人，2000)。重复的选择使AZP-R株系对Cry1Ac的抗性相对于棉红铃虫的易感APHIS-S株系增加高达3,100倍(Tabashnik等人，2002a)。在棉红铃虫AZP-R株系中，对Cry1Ac的抗性是隐性遗传的，并与CADR(BtR)基因的3个突变等位基因(r1、r2和r3)有关(Morin等人，2003)。具有任何组合的2个突变r等位基因的个体对毒素Cry1Ac和产生此毒素的转基因棉花植物具有抗性(Morin等人，2003)。AZP-R株系还呈现对毒素Cry1Ab的交叉抗性和Cry1Ab毒素与幼虫肠细胞顶端微绒毛结合的降低(Tabashnik等人，2002b，González-Cabrera等人，2003)。小菜蛾是对在田间以喷雾形式施用的Cry1Ac毒素发展抗性的唯一昆虫害虫(Tabashnik 2004)。

在此实验中，我们执行了确认所用的未修饰的3-结构域Cry毒素的生物测定，例如：Cry1Ac和Cry1Ac对所分析的昆虫棉红铃虫和小菜蛾的易感幼虫具有高度毒性，但对抗性幼虫则没有(表1和2)。在100μg毒素/ml食物浓度下，对于未修饰的Cry1Ab和Cry1Ac，抗性棉红铃虫的存活率是高的(分别为94％和100％)。相反，所用的修饰的3-结构域Cry毒素例如(Cry1AbMod和Cry1AcMod)杀死易感幼虫以及抗性幼虫。在30μg毒素/ml食物浓度下，对于修饰的3-结构域Cry毒素Cry1AbMod和Cry1AcMod二者，抗性棉红铃虫的存活率均为0％(表2)。这些结果显示，本发明的修饰的3-结构域Cry毒素遏制使用合格的抗性昆虫实例(即，具有与初级受体突变相关的抗性的棉红铃虫的幼虫)对相应的未修饰的3-结构域Cry毒素的抗性。表2显示，像棉红铃虫一样，Cry1AcMod蛋白质杀死抗性rPxAc小菜蛾，不同的是Cry1Ac蛋白质对DBM的rPxAc株系没有毒性。此株系对Cry1Ac毒素的抗性范围增高30,000倍，因为Cry1Ac毒素的LC₅₀剂量是易感DBM株系0.3ng/孔和抗性株系＞10,000ng/孔。在Cry1AcMod毒素的情形中，抗性范围被降低5倍，因为Cry1AcMod的LC₅₀剂量是DBM易感株系20ng/孔和DBM抗性rPxAc株系100ng/孔。

表1.Cry1AbMod和Cry1AcMod毒素杀死对Cry1Ab和Cry1Ac毒素具有抗性的棉红铃虫。观察到在100μg毒素/ml食物浓度下，对于Cry1Ab和Cry1Ac毒素，棉红铃虫的存活率是高的(分别为94％和100％)。然而，在30μg毒素/ml食物浓度下，对于Cry1AbMod和Cry1AcMod毒素，抗性棉红铃虫的存活率均为0％。因此，修饰的毒素Cry1AbMod和Cry1AcMod遏制棉红铃虫对未修饰的毒素Cry1Ab和Cry1Ac的抗性。在10μg毒素/ml食物浓度下，修饰的毒素以及未修饰的毒素杀死超过87％的棉红铃虫易感幼虫。

*存活率值根据未处理食物上对照昆虫的死亡率进行了调整。调整后的存活率计算为处理的食物上的存活率除以未处理的食物上的存活率。样本大小＝40至80只幼虫/株系/处理。

**ND＝未确定

表2.Cry1AcMod蛋白质杀死对Cry1Ac毒素具有抗性的小菜蛾。我们观察到，在20微克(μg)毒素/ml食物下，当用毒素Cry1Ac处理时，抗性存活的小菜蛾的幸存者的数量是非常高的(90.6％)。然而，在20μg毒素/ml食物浓度下，当用Cry1AcMod毒素处理时，小菜蛾抗性株系的存活率为0％。因此，修饰的毒素Cry1AcMod遏制小菜蛾对未修饰的毒素Cry1Ac的抗性。在20μg毒素/ml食物下，修饰的和未修饰的Cry1Ac毒素杀死100％的小菜蛾易感昆虫。

*存活率值根据未处理食物上对照昆虫的死亡率进行了调整。调整后的存活率计算为处理的食物上的存活率除以未处理的食物上的存活率。样本大小＝32只幼虫/株系/处理。

实施例5.沉默烟草天蛾幼虫的CADR受体降低对Cry1Ab毒素的易感性。

为了确定棉红铃虫的结果是否扩展至其他鳞翅目昆虫，使用RNA干扰(RNAi)阻断CADR受体(Bt-R₁)的产生，创建了具有降低的对Cry1Ab毒素的易感性的烟草天蛾幼虫。关于RNAi，特定基因的双链RNA(dsRNA)干扰所述基因的翻译，从而抑制此基因编码的蛋白质的产生(Sijen等人，2001)。为了从烟草天蛾的编码基因Bt-R₁产生dsRNA，通过rtPCR从产自RNAm样品的cDNA扩增了所述基因的442pb片段(残基8至155)，所述RNAm样品是使用下列寡核苷酸作为rtPCR反应中的引物(first)从5°龄幼虫获得的：GCTCTAGAGCTGCCTTCCTGCTGGTGTTTA和GGAATTCCTCCACGCGCACATTG AACAT。用限制性酶XbaI和EcoRI消化此442pb片段，并克隆于预先用相同的限制性酶消化的pLITMUS 28i(HiScribe^TM)中，此载体具有侧翼于多克隆位点的两个T7启动子。这允许克隆片段的扩增，和插入物的两条DNA链的体外转录，产生dsRNA。图8显示通过使用T7聚合酶扩增的Bt-R₁基因片段的体外转录获得的dsRNA。

为了证明是否可沉默Bt-R₁蛋白质，向于血淋巴中的一龄烟草天蛾幼虫注射于100nl水中的1μgBt-R₁的dsRNA或仅100nl水(对照)。在不含毒素的人工食物上12小时后，35只注射Bt-R₁的dsRNA的幼虫的存活率为74％，而35只对照幼虫的存活率为75％。在未处理的食物上存活12小时的幼虫中，将注射dsRNA幼虫组或对照幼虫组的各24只幼虫转移至用20ng原毒素Cry1Ab/cm²处理的食物。在用所述毒素处理的食物上3天后，对照幼虫全部死亡，而注射Bt-R₁的dsRNA的幼虫全部存活(表3)。通过使用特异性抗-Bt-R₁抗体的蛋白质印迹免疫检测测定，证明注射dsRNA显著地降低或完全消除幼虫肠基质中的Bt-R₁蛋白质(图9)。生物测定和Bt-R₁免疫检测的结果表明，RNAi降低烟草天蛾幼虫中Bt-R₁蛋白质的产生和对毒素Cry1Ab的易感性。

表3.注射Bt-R₁dsRNA的烟草天蛾幼虫对Cry1Ab毒素不易感。向烟草天蛾幼虫注射100nl水或于100nl水中的1μg Bt-R₁dsRNA并暴露于含有20ng Crv1Ab毒素/cm²的人工食物。

实施例6.Crv1Ab和Cry1AbMod毒素对Bt-R₁受体被沉默的烟草天蛾幼虫的毒性。

为了确定Cry1AbMod对于对野生型(silvestre)Cry1Ab毒素具有降低的易感性(通过用Bt-R₁RNAi沉默造成)的幼虫是否具有毒性，向一龄烟草天蛾幼虫注射如实施例5所述的1μgBt-R₁dsRNA。向注射后的幼虫喂养补充20ng野生型(silvestre)Cry1Ab原毒素/cm²或5ng Cry1AbMod原毒素/cm²的食物。通过Bt-R₁的RNAi沉默的幼虫对野生型(silvestre)Cry1Ab毒素不易感，但是它们对修饰的Cry1AbMod毒素易感(图10)。

这些结果显示所用的修饰的3-结构域Cry毒素之一，例如Cry1AbMod，遏制烟草天蛾幼虫中由通过RNAi阻断Bt-R₁表达造成的易感性降低的效应。

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全部参考文献通过参考被引入。

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Claims (3)

1. 一种遏制合格的抗性昆虫的抗性的方法，其包括使所述合格的抗性昆虫食用致死剂量的遗传改造的杀死合格的抗性昆虫的缺少α-1螺旋但保持α-2螺旋的修饰的3-结构域Cry1C 亚家族毒素或Cry2A亚家族毒素的步骤。

2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述修饰的3-结构域Cry1C 亚家族毒素或Cry2A亚家族毒素作为组合物的一部分被食用。

3. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述修饰的3-结构域Cry1C 亚家族毒素或Cry2A亚家族毒素存在于转基因植物中。