AXMI-027, AXMI-036 Y AXMI-038. UNA FAMILIA DE GENES DELTA-ENDOTOXINA Y MÉTODOS PARA SU USO
CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere al campo de la biología molecular Se proporcionan nuevos genes que codifican proteínas pesticidas Estas proteínas y las secuencias de ácido nucleico que las codifican son útiles en la preparación de formulaciones pesticidas y en la producción de plantas transgénicas resistentes a pestes
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Bacillus thunngiensis es una espora de Gram positivo que forma bacterias de tierra caracterizada por su habilidad para producir inclusiones cristalinas que son específicamente tóxicas para ciertas órdenes y especies de insectos, pero son inofensivas para plantas y otros organismos no especificados Por esta razón, las composiciones que incluyen cepas de Bacillus thunngiensis o sus proteínas insecticidas pueden usarse como insecticidas ambientalmente aceptables para controlar pestes de insectos agrícolas o vectores de insectos para una variedad de enfermedades humanas o animales
Las proteínas de Cristal (Cry) (delta-endotoxinas) de Bacillus thurmgiensis tienen actividad insecticida potente predominantemente contra larvas de Lepidópteros, Dípteros y Coleópteros Estas proteínas también han mostrado actividad contra ordenes de pestes de Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga y Acan, así como otras órdenes de invertebrados tales como Nemathelminthes, Platyhelminthes y Sarcomastigorphora (Feítelson (1993) "The Bacillus Thuringiensis family tree" en Advanced Engineered Pesticides (Marcel Dekker, Ine , Nueva York)) Estas proteínas fueron originalmente clasificadas como Cryl a CryV con base principalmente en su actividad insecticida Las clases mas importantes eran ep/dopfera-específica (I), Lepidoptera y D/pf era-específica (II), Co/eoptera-específica (lll), D/pfera-específica (IV) y nemátodo-específico (V) y (VI) Las proteínas se clasificaron además en subfamilias, a las proteínas más altamente relacionadas dentro de cada familia se les asignaron letras divisionales tal como CrylA CrylB, CrylC etc A las proteínas incluso mas cercanamente relacionadas dentro de cada división se les dieron nombres tales como Cry1C1 Cry1C2 etc
Una nueva nomenclatura se describió recientemente para los genes Cry con base en la homología de secuencia de aminoácido en lugar de la especificidad de objetivo de insecto (Crickmore et al (1998) Microbiol Mol Biol Rev 62 807-813) En la nueva clasificación a cada toxina se le asigna un nombre único incorporando una clasificación principal (un numero arábigo) una clasificación secundaria (una letra mayúscula), una tercera clasificación (una letra minúscula) y una cuarta clasificación (otro numero arábigo) En la nueva clasificación, se han cambiado los números romanos por números arábigos en la clasificación principal Las proteínas con menos de 45% de identidad de secuencia tienen diferentes clasificaciones principales y los criterios para la segunda y tercera clasificación son 78% y 95% respectivamente
La proteina de cristal no exhibe actividad insecticida hasta que ha sido ingerida y solubilizada en el intestino medio del insecto La protoxma ingerida es hidrolizada por proteasas en el tubo digestivo del insecto a una molécula toxica activa (Hofte y Whiteley (1989) Microbiol Rev 53 242-255) Esta toxina se enlaza a receptores del extremo de las escobillas apicales en el intestino medio de las larvas objetivo y se inserta en la membrana apical creando canales de iones o poros resultando en la muerte de la larva
Las delta-endotoxmas generalmente tienen cinco dominios de secuencia conservados y tres dominios estructurales conservados (ver por ejemplo, de Maagd ef al (2001) Trends Genetics 17 193-199) El primer dominio estructural conservado consiste de siete hélices alfa y esta involucrado en la inserción de membrana y formación de poro El dominio II consiste de tres beta-hojas arregladas en una configuración de llave griega y el dominio lll consiste de dos beta-hojas antiparalelas en formación de rollo de jalea' (de Maagd ef al , 2001 , supra) Los dominios II y lll están involucrados con el reconocimiento y enlace de receptor y por lo tanto se consideran determinantes de la especificidad de la toxina
Debido a la devastación que los insectos pueden conferir existe una necesidad continua de 5 descubrir nuevas formas de delta-endotoxmas Bacillus thupngiensis
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan composiciones y métodos para conferir resistencia pesticida a la bacteria,
I ¡ plantas, células de plantas, tejidos y semillas Las composiciones incluyen moléculas de ácido
10 nucleico que codifican secuencias para polipéptidos de delta-endotoxinas, vectores comprendiendo esas moléculas de ácido nucleico y células hospedantes comprendiendo los vectores Las composiciones también incluyen las secuencias de po péptido de la endotoxina y los anticuerpos para esos polipéptidos Las secuencias de nucleótidos pueden ser usadas en construcciones de
! ADN o cassettes de expresión para transformación y expresión en organismos, incluyendo
15 microorganismos y plantas Las secuencias de nucleótidos o aminoácidos pueden ser secuencias i i sintéticas que han sido diseñadas para expresión en un organismo incluyendo, pero sin limitarse a,
I 1 un microorganismo o una planta Las composiciones también comprenden bacteria, plantas,
¡ células de planta, tejidos y semillas transformadas I
I I 20 En particular, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que corresponden a las secuencias de ácido nucleico de delta-endotoxina Adicionalmente, se comprenden las secuencias de acido nucleico que corresponden a los polinucleótidos En particular, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácido mostrada en la SEQ ID NO 2, una secuencia
25 de nucleótido establecida en la SEQ ID NO 1 , o la secuencia de nucleótido de delta-endotoxina depositada en un hospedante bacterial como Adquisición No NRRL B-30818, así como vanantes y fragmentos de la misma También están comprendidas las secuencias de nucleótido que son complemento de una secuencia de nucleotido de la invención o que hibpdizan una secuencia de la invención
Se proporcionan métodos para producir los polipéptidos de la invención y para usar esos 5 polipéptidos para controlar o matar una peste de lepidoptero, heteróptero o coleóptero También están incluidos los métodos y equipos para detectar los ácidos nucleicos y polipéptidos de la invención en una muestra
Las composiciones y métodos de la invención son útiles para la producción de organismos 10 con resistencia pesticida, específicamente bacteria y plantas Estos organismos y las composiciones derivadas de ellos son deseables para propósitos agrícolas Las composiciones de la invención también son útiles para generar proteínas de delta-endotoxina alteradas o mejoradas que tienen actividad pesticida o para detectar la presencia de proteínas de delta-endotoxina o ácidos nucleicos en productos u organismos 15 DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una alineación de AXMI-027 (SEQ ID NO 2), AXMI-036 (SEQ ID NO
1 1 ) y AXMI-038 (SEQ ID NO 13) con cry11Aa (SEQ ID NO 14), cry11 Ba (SEQ ID NO 15), i I cry18Aa (SEQ ID NO 3), cry18Ba (SEQ ID NO 4), cry18Ca (SEQ ID NO 5) y cry2Aa (SEQ ID NO i 20 6) Las toxinas que tienen dominios C-terminal no tóxicos fueron artificialmente truncadas como se muestra El grupo conservado 1 se encuentra desde aproximadamente el residuo aminoácido 223
! hasta aproximadamente 252 de la SEQ ID NO 2 El grupo conservado 2 se encuentra desde
¡ aproximadamente el residuo aminoácido 301 hasta aproximadamente 318 de la SEQ ID NO 2 El
! grupo conservado 4 se encuentra desde aproximadamente el residuo aminoácido 610 hasta
! 25 aproximadamente 621 de la SEQ ID NO 2 El grupo conservado 5 se encuentra desde
I ! aproximadamente el residuo aminoácido 684 hasta aproximadamente 693 de la SEQ ID NO 2 DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención esta enfocada a composiciones y métodos para regular la resistencia pesticida en organismos, particularmente plantas o células de plantas Los métodos involucran transformar organismos con una secuencia de nucleótido que codifica una proteína de 5 delta-endotoxina de la invención En particular, las secuencias de nucleótido de la invención son útiles para preparar plantas y microorganismos que poseen actividad pesticida Así, se proporcionan bacterias, plantas, células de plantas, tejidos de plantas y semillas transformados Las composiciones son ácidos nucleicos de delta-endotoxina y proteínas de Bacillus thupngiensis
I Las secuencias encuentran su uso en la construcción de vectores de expresión para la i i 10 transformación subsiguiente de organismos de ínteres, como sondas para el aislamiento de otros
I genes de delta-endotoxina y para la generación de proteínas pesticidas alteradas por métodos i conocidos en la técnica, tales como intercambio de dominio o mezcla de ADN Las proteínas
! encuentran su uso para controlar o matar poblaciones de peste de lepidópteros, heterópteros o
I coleópteros y para producir composiciones con actividad pesticida 15 Un plásmido que contiene la secuencia de nucleótido de resistencia herbicida de la
1 invención se deposito en la colección permanente de la Agncultural Research Service Culture
¡ Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL), 1815 North University Street, Peona, i ¡ Illinois 61604, Estados Unidos de América, el 8 de febrero del 2005 y se le asignó el No de
¡ 20 Adquisición NRRL B-30818 (para AXMI-027) Este depósito se mantendrá bajo los términos del
I | Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para
' los Propósitos de Procedimiento de Patente Este depósito se hizo simplemente por ser conveniente para aquellos con experiencia en la técnica y no es un admisión de que un depósito sea requerido bajo 35 U S C § 112
! 25 Por "delta-endotoxina" se quiere decir una toxina de Bacillus thunngiensis que tiene actividad tóxica contra una o más pestes, incluyendo, pero sin limitarse a, miembros de los ordenes de Lepidópteros, Dípteros y Coleópteros o una protema que tiene homología con dicha proteina En algunos casos, las proteínas de delta-endotoxina han sido aisladas de otros organismos, incluyendo Clostndium bifermentans y Paenibacillus popillae Las proteínas de delta-endotoxina incluyen secuencias de aminoácidos deducidas de las secuencias de nucleótido completas divulgadas en el presente documento y secuencias de aminoácidos que son más cortas que las secuencias completas, ya sea debido al uso de un sitio de inicio descendente alterno o debido al procesamiento que produce una proteína más corta que tiene actividad pesticida El procesamiento puede ocurrir en el organismo en el cual la proteína se expresa o en la peste después de la ingestión de la proteína Las delta-endotoxinas incluyen proteínas identificadas como cryl hasta cry43, cytl y cyt2 y toxina similar a Cyt Actualmente existen más de 250 especies conocidas de delta-endotoxinas con amplio rango de especificidades y toxicidades Para una lista expansiva ver Crickmore ef al (1998), Microbiol Mol Biol Rev 62 807-813 y para actualizaciones regulares ver Crickmore ef al (2003) "Bacillus thunngiensis toxm nomenclature", en www biols susx ac uk/Home/Ne?l_Cpckmore/Bt/?ndex
En el presente documento se proporcionan nuevas secuencias de nucleótido aisladas que confieren actividad pesticida También se proporcionan las secuencias de aminoácidos de las proteínas de delta-endotoxma La proteína resultante de la conversión de este gen permite a las células controlar o matar pestes que la ingieren
Moléculas de Ácido Nucleico Aisladas y Variantes y Fragmentos de las Mismas Un aspecto de la invención pertenece a las moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican proteínas de delta-endotoxma y polipéptidos o pociones biológicamente activas de los mismos, así como moléculas de ácido nucleico suficientes para usarse como sondas de hibpdización para identificar ácidos nucleicos que codifican delta-endotoxinas Como se usa en el presente documento, el término "molécula de ácido nucleico" quiere decir que incluye moléculas de ADN (por ejemplo, cADN o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, mARN) y análogos de ADN y ARN generados usando análogos de nucleótido La molécula de ácido nucleico puede ser de una sola puede ser de una sola hebra o de doble hebra, pero preferiblemente es ADN de doble hebra
Una molécula de ácido nucleico "aislada" o "purificada" o proteína o porción biológicamente activa de la misma es sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza químicamente Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" es libre de secuencias (preferiblemente secuencias que codifican proteínas) que naturalmente flanquean el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual el acido nucleico se deriva Para los propósitos de la invención, "aislado" cuando se usa para referirse a moléculas de ácido nucleico excluye cromosomas aislados Por ejemplo, en diversas modalidades, la molécula de ácido nucleico que codifica delta-endotoxina aislada puede contener menos de aproximadamente 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1kb, 0 5kb o 0 1 kb de secuencias de nucleotido que naturalmente flanquean la molécula de ácido nucleico en ADN genómico de la célula de la cual el ácido nucleico se deriva Una proteína de delta-endotoxma que es sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos que aproximadamente 30%, 20%, 10% o 5% (por peso seco) de protema de no-delta-endotoxma (también denominada en el presente documento como "proteína contaminante")
Las secuencias de nucleótido que codifican las proteínas de la presente invención incluyen las secuencias establecidas en SEQ ID NO 1 , 10 y 12, la secuencia de nucleótido de delta-endotoxma depositada en un hospedante bacterial como Adquisición No NRRL B-30818 y vanantes, fragmentos y complementos de las mismas Por "complemento" se quiere decir una secuencia de nucleótido que es suficientemente complementaria para una secuencia de nucleótido dada de manera que pueda hibpdizar la secuencia de nucleótido dada para así formar un dúplex estable La secuencia de aminoácido correspondiente para la proteína de delta-endotoxina codificada por estas secuencias de nucleotido se establece en SEQ ID NO 2, 11 y 13 Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de estas secuencias de nucleótido que codifican delta-endotoxinas también están comprendidas en la presente invención Por "fragmento" se quiere decir una porción de la secuencia de nucleótido que codifica la proteína de delta-endotoxina Un fragmento de secuencia de nucleótido puede codificar una porción biológicamente activa de una proteína de delta-endotoxina o puede ser un fragmento que se puede utilizar como una sonda de hibpdización o imprimador PCR usando los métodos divulgados a continuación Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótido de delta-endotoxina comprenden al menos aproximadamente 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000 o 2050 nucleótidos contiguos o hasta el número de nucleótidos presente en una secuencia de nucleótido que codifica delta-endotoxinas completas divulgada en el presente documento (por ejemplo, 2050 nucleótidos para SEQ ID NO 1 , 2050 nucleótidos para SEQ ID NO 11 , 2151 nucleótidos para SEQ ID NO 13) dependiendo del uso previsto Por nucleótidos "contiguos" se entiende residuos de nucleótido que están inmediatamente adyacentes uno al otro Los fragmentos de las secuencias de nucleótido de la presente invención codificarán fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica de la proteína de delta-endotoxma y, por esto, retienen actividad pesticida Por "retener actividad" se entiende que el fragmento tendrá al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 70% o al menos aproximadamente 80% de la actividad pesticida de la protema de delta-endotoxina Los métodos para medir la actividad pesticida son bien conocidos en la técnica Ver, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J Econ Entomol 83 2480-2485, Andrews ef al (1988) Biochem J 252 199-206, Marrone et al (1985) J of Economic Entomology 78 290-293 y Patente de EUA No 5,743,477, todos los cuales están incorporados en el presente documento como referencia en su totalidad
Un fragmento de una secuencia de nucleótido que codifica delta-endotoxinas que codifica una porción biológicamente activa de una proteína de la invención codificará al menos aproximadamente 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 o 650 aminoácidos contiguos o hasta el número total de aminoácidos presente en una proteína de delta-endotoxina completa de la invención (por ejemplo, 700 aminoácidos para SEQ ID NO 2, 685 aminoácidos para SEQ ID NO 11 , 717 aminoácidos para SEQ ID NO 13)
Las proteínas de delta-endotoxina preferidas de la presente invención son codificadas por una secuencia de nucleótido suficientemente idéntica a la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO 1 , 10 o 12 Por "suficientemente idéntica" se entiende una secuencia de aminoácido o nucleotido que tiene al menos aproximadamente 60% o 65% de identidad de secuencia, preferiblemente aproximadamente 70% o 75% de identidad de secuencia, más preferiblemente aproximadamente 80% u 85% de identidad de secuencia y lo más preferiblemente aproximadamente 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia comparado con una secuencia de referencia usando uno de los programas de alineación descrito en el presente documento usando parámetros estándar Una persona con experiencia en la técnica reconocerá que estos valores pueden ajustarse apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótido tomando en cuenta la degeneración del codón, la similitud del aminoácido, la posición del marco de lectura y similares
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para óptimos propósitos de comparación El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas/ número total de posiciones (por ejemplo, posiciones superpuestas) x 100) En una modalidad, las dos secuencias tienen la misma longitud El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede ser determinada usando técnicas similares a las descritas a continuación, permitiendo o no espacios Mediante el cálculo de porcentaje de identidad, se calculan las combinaciones típicamente exactas La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlm y Altschul (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87 2264 modificado como en Kar n y Altschul (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90 5873-5877 Dicho algoritmo esta incorporado en los programas BLASTN y BLASTX de Altschul et al (1990) J Mol Biol 215 403 Las búsquedas de nucleótido BLAST pueden llevarse a cabo con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótido homologas a las moléculas de ácido nucleico similares a las delta-endotoxinas de la invención Las búsquedas de protema BLAST pueden llevarse a cabo con el programa BLASTX, puntuación - 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácido homologas a las moléculas de proteína similares a las delta-endotoxmas de la invención Para obtener alineaciones con espacios para propósitos de comparación, BLAST Espaciado (en BLAST 2 0) se puede utilizar como se describe en Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res 25 3389 Alternativamente, PSI-Blast se puede usar para desempeñar una búsqueda iterativa que detecta relaciones distantes entre moléculas Ver Altschul ef al (1997) supra Cuando se utilizan los programas BLAST, BLAST Espaciado y PSI-Blast, los parámetros de incumplimiento de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTX y BLASTN) se pueden usar La alineación también puede desempeñarse manualmente por inspección visual
Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo ClustalW (Higgms ef al (1994) Nucleic Acids Res 22 4673-4680) ClustalW compara secuencias y alinea la totalidad de la secuencia de aminoácido o ADN y puede proporcionar así datos acerca de la conservación de la secuencia de toda la secuencia de aminoácido El algoritmo ClustalW se usa en diversos paquetes de software de análisis de aminoácido/ ADN comercialmente disponibles, tales como el módulo ALIGNX del Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) Después de la alineación de las secuencias de aminoácido con ClustalW, el porcentaje de identidad de aminoácido puede ser evaluado Un ejemplo no limitante de un programa de software útil para análisis de alineaciones ClustalW es GENEDOC™ GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite evaluar la similitud e identidad de aminoácido (o ADN) entre múltiples proteínas Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4 11-17 Dicho algoritmo esta incorporado en el programa ALIGN (versión 2 0), que es parte del GCG Wisconsin Genetics Software Package, Versión 10 (disponible en Accelrys, Ine , 9685 Scranton Rd , San Diego, CA, EUA) Cuando se utiliza el programa ALIGN para compara secuencias de aminoácidos, se puede utilizar una tabla de residuo de peso PAM120, un castigo de longitud de espacio de 12 y un castigo de espacio de 4
I 10 Un programa preferido es GAP versión 10, que usa el algoritmo de Needleman y Wunsch
(1970) J Mol Biol 48 443-453 GAP Versión 10 se puede usarse con los siguientes parámetros % I de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótido usando Peso GAP de 50 y Peso
I
I Longitud de 3 y la matriz de puntaje nwsgapdna emp, % de identidad y % de similitud para una
¡ secuencia de aminoácido usando Peso GAP de 8 y Peso Longitud de 2 y la Matriz de Puntaje
, 15 BLOSUM62 Programas equivalentes también usarse Por "programa equivalente" se entiende
I cualquier programa de comparación de secuencia que, para cualquier par de secuencias en ¡ cuestión, genera una alineación teniendo combinaciones de residuo de nucleótido o aminoácido idénticas e identidad de porcentaje de secuencia idéntica cuando se compara con la alineación ' correspondiente generada por GAP Versión 10 I 20 I \ La invención también comprende moléculas de ácido nucleico variables "Variables" de las
1 secuencias de nucleótido que codifican delta-endotoxinas incluyen aquellas secuencias que
¡ codifican las proteínas de delta-endotoxma divulgadas en el presente documento pero que difieren
I conservadoramente debido a la degeneración del código genético así como aquellas que son
25 suficientemente idénticas como se discute anteriormente Las vanantes alé cas que ocurren
! naturalmente pueden ser identificadas con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, tales como reacción de cadena de polimerasa (PCR) y técnicas de hibpdización como se destaca a
I ! continuación Las secuencias de nucleotido variables también incluyen secuencias de nucleótido sintéticamente derivadas que han sido generadas, por ejemplo, mediante el uso de mutagénesis dirigida al sitio pero que aún codifican las proteínas de delta-endotoxina divulgadas en la presente invención como se discute anteriormente Las proteínas variables comprendidas en la presente invención son biológicamente activas, esto es que continúan poseyendo la actividad biológica 5 deseada de la proteína nativa, esto es, reteniendo actividad pesticida Por "retener actividad" se entiende que la vanante tendrá al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 70% o al menos aproximadamente 80% de la actividad pesticida de la proteína nativa Los métodos para medir la actividad pesticida son bien conocidos en la técnica Ver, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J Econ Entomol 83 2480-2485, Andrews et al (1988) 10 Biochem J 252 199-206, Marrone et al (1985) J of Economic Entomology 78 290-293 y Patente de EUA No 5,743,477, todos los cuales están incorporados al presente documento como referencia en su totalidad i I | El artesano experimentado además apreciará que los cambios pueden ser introducidos por
15 mutación en las secuencias de nucleótido de la invención conduciendo así a cambios en la secuencia de aminoácido de las proteínas de delta-endotoxina codificadas, sin alterar la actividad
1 biológica de las proteínas Así, las moléculas de ácido nucleico aisladas variables se pueden crear i ¡ mediante la introducción de una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de nucleótido en la i ! secuencia de nucleótido correspondiente divulgada en el presente documento, de modo que una o I 20 más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácido se introduzcan en la proteína codificada Las mutaciones se pueden introducir mediante técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR Dichas secuencias de nucleótido variables también están comprendidas en la presente invención
! 25 Por ejemplo, las sustituciones de aminoácido preferiblemente conservadoras pueden hacerse en uno o más residuos de aminoácido predicho, preferiblemente no-esenciales Un residuo
I de aminoácido "no-esencial" es un residuo que puede ser alterado a partir de la secuencia de tipo
¡ salvaje de una proteína de delta-endotoxma sin alterar la actividad biológica, mientras un residuo de aminoácido "esencial" es requerido por su actividad biológica Una "sustitución de aminoácido conservador" es una en la cual el residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar Las familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, sina, arginina, histidina) cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagma, glutamina, sepna, treonina, tirosma, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, pro na, fenilalanina, metiomna, triptofano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosma, fenilalanma, triptofano, histidina)
Las delta-endotoxmas generalmente tienen cinco dominios de secuencia conservados y tres dominios estructurales conservados (ver, por ejemplo, de Maagd et al (2001) Trends Genetics 17 193-199) El primer dominio estructural conservado consiste de siete hélices alfa y está involucrado en la inserción de membrana y formación de poro El dominio II consiste de tres beta-hojas arregladas en una configuración de llave griega y el dominio lll consiste de dos beta-hojas antiparalelas en formación de "rollo de jalea" (de Maagd ef al , 2001 , supra). Los dominios II y lll están involucrados en el reconocimiento y enlace de receptor y son por lo tanto considerados determinantes de la especificidad de toxina Los dominios conservados en las secuencias de delta-endotoxína de la invención pueden ser identificados, por ejemplo, mediante la alineación de las secuencias de aminoácidos de la invención con secuencias de aminoácidos de delta-endotoxina conocidas e identificación de las regiones conservadas como lo enseña de Maagd, 2001 , supra
Las sustituciones de aminoácidos pueden hacerse en regiones no conservadoras que retienen función En general, dichas sustituciones no se harían para residuos de aminoácido conservados o para residuos de aminoácidos que residen dentro de un motivo conservado, donde dichos residuos son esenciales para la actividad de proteína Ejemplos de residuos que están conservados y que pueden ser esenciales para la actividad de proteína incluyen, por ejemplo, residuos que son idénticos entre todas las proteínas contenidas en la alineación de la Figura 1 Ejemplos de residuos que están conservados pero que pueden permitir sustituciones de aminoácidos conservadores y aún retener actividad incluyen, por ejemplo, residuos que sólo tienen sustituciones conservadoras entre todas las proteínas contenidas en la alineación de la Figura 1 Sin embargo, una persona con experiencia en la técnica entendería que las vanantes funcionales pueden tener pequeñas alteraciones conservadas o no conservadas en los residuos conservados
Alternativamente, las secuencias de nucleótido variables pueden hacerse mediante la introducción aleatoria de mutaciones a lo largo de toda o parte de la secuencia de codificación, tal como mediante mutagenesis de saturación y los mutantes resultantes pueden ser cribados por su habilidad para conferir actividad de delta-endotoxma para identificar los mutantes que retienen actividad Después de la mutación, la proteina codificada puede expresarse de manera recombmante y la actividad de la proteína puede determinarse usando técnicas de análisis estándar
Usando métodos tales como PCR, hibpdización y similares, se pueden identificar secuencias de delta-endotoxina correspondientes, dichas secuencias teniendo identidad sustancial con las secuencias de la invención Ver, por ejemplo, Sambrook J y Russell, D W (2001) Molecular Cloning A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sppng Harbor, NY) e Innis, et al (1990) PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY)
En un método de hibpdización, toda o parte de la secuencia de nucleótido de delta-endotoxma puede ser usada para cribar bibliotecas de cADN o genómicas Los métodos para la construcción de dichas bibliotecas de cADN y genómicas son generalmente conocidos en la técnica y están divulgados en Sambrook y Russell, 2001 , supra Las así llamadas sondas de hibpdización pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADN, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos y pueden ser etiquetados con un grupo detectable tal como 32P o cualquier otro marcador detectable, tal como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima o un co-factor de enzima Las sondas para hibpdización pueden hacerse mediante el etiquetado de oligonucleótidos sintéticos con base en la secuencia conocida de nucleótido que codifica delta-endotoxinas divulgada en el presente documento Los imprimadores degenerados diseñados en la base de residuos de nucleotido o aminoácido conservados en la secuencia de nucleótido o secuencia de aminoácido codificado pueden usarse adicionalmente La sonda típicamente comprende una región de secuencia de nucleotido que hibpdiza bajo condiciones estrictas a al menos aproximadamente 12, preferiblemente aproximadamente 25, más preferiblemente al menos aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 o 400 nucleótidos consecutivos de delta-endotoxma que codifica secuencias de nucleótido de la invención o un fragmento o vanante de los mismos Los métodos para la preparación de sondas para hibpdización son generalmente conocidos en la técnica y están divulgados en Sambrook y Russell, 2001 , incorporado al presente documento como referencia
Por ejemplo, una secuencia entera de delta-endotoxina divulgada en el presente documento o una o mas porciones de la misma puede usarse como una sonda capaz de hibpdizar específicamente secuencias tipo delta-endotoxina correspondientes y ARN mensajero Para lograr la hibridización específica bajo una variedad de condiciones, dichas sondas incluyen secuencias que son únicas y que tienen al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud o al menos aproximadamente 20 nucleotidos de longitud Dichas sondas pueden usarse para amplificar secuencias de delta-endotoxma correspondientes de un organismo elegido por PCR Esta técnica puede usarse para aislar secuencias de codificación adicionales de un organismo deseado o como un análisis de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias de codificación en un organismo Las técnicas de hibpdizacion incluyen cribado de hibpdización de bibliotecas de ADN recubierto (ya sean placas o colonias, ver, por ejemplo, Sambrook ef al (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2da ed , Cold Spring Harbor Laboratory Press, cold Spring Harbor, New York) La hibpdizacion de dichas secuencias puede llevarse a cabo bajo condiciones estrictas Por "condiciones estrictas" o ' condiciones de hibpdiza on estrictas" se entiende condiciones bajo las cuales una sonda hibpdizara su secuencia objetivo a un grado detectablemente mayor que otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces sobre el fondo) Las condiciones estrictas son dependientes de secuencias y serán diferentes en diferentes circunstancias Mediante el control de lo estricto de la hibpdizacion y/o condiciones de lavado, las secuencias objetivo que son 100% complementarias a la sonda pueden identificarse (sondeo homólogo) Alternativamente, las condiciones estrictas pueden ajustarse para permitir algunas malas combinaciones en secuencias de manera que grados mas bajos de similitud se detecten (sondeo heterólogo) Generalmente, una sonda tiene menos de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, preferiblemente menos de 500 nucleotidos de longitud
Típicamente, las condiciones estrictas serán aquellas en las cuales la concentración de sal sea menor que aproximadamente 1 5 M Na iones, típicamente aproximadamente 0 01 a 1 0 M Na concentración de iones (u otras sales) en un pH de 7 0 a 8 3 y la temperatura sea de al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, mayores que 50 nucleotidos) Las condiciones estrictas también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida Condiciones estrictas bajas ejemplares incluyen hibpdizacion con una solución reguladora de 30 a 35% de formamida, 1 M NaCI, 1 % SDS (sulfato dodecil de sodio) a 37°C y un lavado en 1X a 2X SSC (20X SSC = 3 0 M NaCI/0 3 M citrato de tpsodio) a 50 a 55°C Condiciones estrictas moderadas ejemplares incluyen hibpdización en 40 a 45% de formamida, 1 0 M NaCI, 1% SDS a 37°C y un lavado en 0 5X a 1X SSC a 55 a 60°C Condiciones estrictas altas ejemplares incluyen hibpdizacion en 50% de formamida, 1 M NaCI, 1% SDS a 37°C y un lavado en 0 1a SSC a 60 a 65°C Opcionalmente, los reguladores de lavado pueden comprender aproximadamente 0 1% a aproximadamente 1 % SDS La duración de la hibpdización es generalmente menor que aproximadamente 24 horas, usualmente aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas La especificidad es típicamente la función de lavados post-hibpdizacion, los factores críticos siendo la fuerza iónica y temperatura de la solución de lavado final Para híbridos ADN-ADN, Tm puede aproximarse a partir de la ecuación de Memkoth y Wahl (1984) Anal Biochem 138 267-284 Tm = 81 5°C + 16 6 (log M) + 0 41 (% GC) - 0 61 (% form) - 500/L, donde M es la molapdad de cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibpdización y L es la longitud del híbrido en pares de base Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica definida y pH) en la cual 50% de una secuencia objetivo complementaria hibndiza una sonda perfectamente combinada Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1% de mala combinación, así, Tm, hibpdizacion y/o condiciones de lavado se pueden ajustar para hibpdizar secuencias de la identidad deseada Por ejemplo, si se buscan secuencias con > 90% de identidad, Tm puede disminuir 10°C Generalmente, las condiciones estrictas se seleccionan para que sean aproximadamente 5°C menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica y su complemento en una fuerza iónica definida y pH Sin embargo, condiciones severamente estrictas pueden utilizar una hibpdización y/o lavado a 1 , 2, 3 o 4°C menor que el punto de fusión térmico (Tm), condiciones estrictas moderadas pueden utilizar una hibpdización y/o lavado a 6, 7, 8, 9 o 10°C menor que el punto de fusión térmico (Tm), condiciones estrictas bajas pueden utilizar una hibpdizacion y/o lavado a 11 , 12, 13, 14, 15 o 20°C menor que el punto de fusión térmico (Tm) Usando la ecuación, hibpdizacion y composiciones de lavado y Tm deseada, aquellos con experiencia en la técnica entenderán que las variaciones en lo estricto de la hibpdización y/o soluciones de lavado se describen inherentemente Si el grado de mala combinación deseado resulta en Tm menor que 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida), se prefiere incrementar la concentración de SSC de manera que una temperatura mayor se pueda usar Una guía extensiva para la hibndización de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hibndization with Nuclßic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, New York) y Ausubel et al (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York) Ver Sambrook ef al (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2d ed , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)
Proteínas Aisladas y Vanantes y Fragmentos de las Mismas Las proteínas de delta-endotoxina también están comprendidas dentro de la presente invención Por "protema de delta-endotoxina" se entiende una proteína que tiene la secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO 2, 11 o 13 Los fragmentos, porciones biológicamente activas y vanantes de las mismas también se proporcionan y pueden usarse para practicar los métodos de la presente invención
"Fragmentos" o "porciones biológicamente activas" incluyen fragmentos de polipéptido que comprenden secuencias de aminoácido suficientemente idénticas a las secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NO 2, 11 o 13 y que exhiben actividad pesticida Una porción biológicamente activa de una proteína de delta-endotoxma puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplol 0, 25, 50, 100 o más aminoácidos de longitud Dichas porciones biológicamente activas pueden prepararse por técnicas recombinantes y evaluarse por su actividad pesticida Los métodos para medir la actividad pesticida son bien conocidos en la técnica Ver, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J Econ Entomol 83 2480-2485, Andrews ef al (1988) Biochem J 252 199-206, Marrone ef al (1985) J of Economic Entomology 78 290-293 y Patente de EUA No 5,743,477, todos los cuales están incorporados en el presente documento como referencia en su totalidad Como se usa aquí, un fragmento comprende al menos 8 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO 2 La invención comprende otros fragmentos, sin embargo, tales como cualquier fragmento en la proteína mayor que aproximadamente 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 o 650 aminoácidos
Por "vanantes" se entiende proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácido que es al menos aproximadamente 60%, 65%, preferiblemente aproximadamente 70%, 75%, más preferiblemente 80%, 85%, lo más preferiblemente aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácido SEQ ID NO 2, 11 o 13 Las vanantes también incluyen polipeptidos codificados por una molécula de ácido nucleico que hibpdiza la molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO 1 , 10 o 12, o un complemento de la misma, bajo condiciones estrictas Las vanantes incluyen polipéptidos que difieren en secuencia de 5 aminoácido debido a la mutagénesis Las proteínas vanantes comprendidas por la presente invención son biológicamente activas, es decir que continúan poseyendo la actividad biológica deseada de la protema nativa, esto es, reteniendo actividad pesticida Los métodos para medir la actividad pesticida son bien conocidos en la técnica Ver, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J Econ Entomol 83 2480-2485, Andrews et al (1988) Biochem J 252 199-206, Marrone et al 10 (1985) J of Economic Entomology 78 290-293 y Patente de EUA No 5,743,477, todos los cuales están incorporados al presente documento como referencia en su totalidad
i Los genes bacteriales, tales como los genes axm?-027, axm?-036 o axm?-038 de esta
I I invención a menudo poseen múltiples codones de iniciación de metionina en proximidad con el
15 inicio del marco de lectura abierto A menudo, la iniciación de la traslación en uno o más de estos codones de inicio llevará a la generación de una proteina funcional Estos codones de inicio i pueden incluir codones ATG Sin embargo, bacterias tales como Bacillus sp también reconocen el codon GTG como un codón de inicio y las proteínas que inician la traslación en codones GTG contienen una metionina en el primer aminoácido Además, a menudo no se determina a pnop cual
20 de estos codones se usan naturalmente en las bacterias Así, se entiende que el uso de uno de los codones de metiomna alternos también puede llevar a la generación de proteínas de delta- endotoxina que codifican actividad pesticida Estas proteínas de delta-endotoxina están comprendidas en la presente invención y pueden usarse en los métodos de la presente invención
25 Los anticuerpos para los po péptidos de la presente invención, o para las vanantes o fragmentos de los mismos, también están comprendidas Los métodos para producir anticuerpos son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, eds (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, Patente de EUA No 4,196,265)
Vanantes Alteradas o Meioradas Es reconocido que las secuencias de ADN de una delta-endotoxina pueden alterarse por diversos métodos y que estas alteraciones pueden resultar en secuencias de ADN que codifican proteínas con secuencias de aminoácidos diferentes a las codificadas por una delta-endotoxma de la presente invención Esta protema puede alterarse en diversas maneras incluyendo sustituciones, eliminaciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos Los métodos para dichas manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica Por ejemplo, las vanantes de secuencia de aminoácido de una protema de delta-endotoxina pueden prepararse por mutaciones en el ADN Esto también puede lograrse mediante una de las diversas formas de mutagénesis y/o en evolución dirigida En algunos aspectos, los cambios codificados en la secuencia de aminoácido no afectarán sustancialmente la función de la proteína Dichas vanantes poseerán la actividad pesticida deseada Sin embargo, se entiende que la habilidad de una delta-endotoxina para conferir actividad pesticida puede mejorarse por el uso de dichas técnicas sobre las composiciones de esta invención Por ejemplo, uno puede expresar una delta-endotoxma en células hospedantes que exhibe altos índices de mala incorporación de base durante la reiteración de ADN, tal como XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA) Después de la propagación de dichas cepas, uno puede aislar el ADN de la delta-endotoxina (por ejemplo al preparar ADN plásmido o al amplificar por PCR y clonar el fragmento PCR resultante en un vector), cultivar las mutaciones de delta-endotoxina en una cepa no mutagénica e identificar genes de delta-endotoxma mutados con actividad pesticida, por ejemplo al desempeñar un análisis para probar la actividad pesticida Generalmente, la proteína se mezcla y usa en análisis de alimentación Ver, por ejemplo Marrone ef al (1985) J of Economic Entomology 78 290-293 Dichos análisis pueden incluir contactar plantas con una o más pestes y determinar la habilidad de la planta de sobrevivir y/o causar la muerte de las pestes Ejemplos de mutaciones que resultan en toxicidad incrementada se encuentran en Schnepf ef al (1998) Microbio! Mol Biol Rev 62 775-806 Alternativamente, las alteraciones pueden hacerse a la secuencia de proteína de muchas proteínas en las terminales amino o carboxi sin afectar sustancialmente la actividad Esto puede incluir inserciones, eliminaciones o alteraciones introducidas mediante métodos moleculares modernos, tales como PCR, incluyendo amplificaciones PCR que alteran o extienden la secuencia de codificación de la proteina por virtud de la inclusión de secuencias de codificación de aminoácido en los o gonucleótidos utilizados en la amplificación PCR Alternativamente, las secuencias de proteína añadidas pueden incluir secuencias enteras de codificación de proteina, tales como las usadas comunmente en la técnica para generar fusiones de proteína Dichas fusiones de protema a menudo se usan para (1 ) incrementar la expresión de una proteína de interés, (2) introducir un dominio enlazante, actividad enzimática o epítope para facilitar ya sea la purificación de proteína, detección de proteína u otros usos experimentales conocidos en la técnica o (3) tener como objetivo la secreción o traslación de una proteína para un organelo subcelular, tal como el espacio pepplásmico de bacterias de Gram negativo o el retículo endoplásmico de células eucariotas, las últimas de las cuales a menudo resultan en g cosilacion de la proteína
Las secuencias de nucleótido y aminoácido vanantes de la presente invención también comprenden secuencias derivadas de procedimientos mutagénicos y recombinogénicos tales como mezcla de ADN Con un procedimiento tal, una o más regiones de codificación de proteínas de delta-endotoxina se pueden usar para crear una nueva proteína de delta-endotoxina que posee las propiedades deseadas De esta manera, las bibliotecas de po nucleótidos recombinantes son generadas de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que comprenden regiones de secuencia que tienen identidad de secuencia sustancial y pueden ser homólogamente recombinadas in vitro o in vivo Por ejemplo, usando este acercamiento, los motivos de secuencia que codifican un dominio de ínteres pueden ser mezclados entre un gen de delta-endotoxina de la invención y otros genes de delta-endotoxina conocidos para obtener un nuevo gen que codifica para una protema con una propiedad mejorada de interés, tal como una actividad insecticida incrementada Las estrategias para dicha mezcla de ADN son conocidas en la técnica Ver, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91 10747-10751 , Stemmer (1994) Nature 370 389-391 , Cramep ef al (1997) Nature Biotech 15 436-438, Moore et al (1997) J Mol Biol 272 336-347 , Zhang et al (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94 4504-4509 , Cramep et al (1998) Nature 391 288-291 y Patente de EUA No 5,605,793 y 5,837,458
El intercambio o mezcla de dominio es otro mecanismo para generar proteínas de delta-endotoxina alteradas Los dominios II y lll pueden ser intercambiados entre proteínas de delta-endotoxina, resultando en toxinas híbridas o quiméricas con actividad pesticida mejorada o espectro de objetivo Los métodos para generar proteínas recombmantes y probarlas por su actividad pesticida son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Naimov ef al (2001) Appl Environ Microbio! 67 5328-5330, de Maagd et al (1996) Appl Environ Microbiol 62 1537-1543, Ge et al (1991) J Biol Chem 266 17954-17958 , Schnepf ef al (1990) J Biol Chem 265 20923-20930 , Rang et al (1999) Appl Environ Microbio! 65 2918-2925
Vectores Una secuencia de delta-endotoxina de la invención puede ser proporcionada en un cassette de expresión para expresión en una planta de interés Por "cassette de expresión de planta" se entiende una construcción de ADN que es capaz de resultar en la expresión de una protema desde un marco de lectura abierto en una célula de planta Típicamente estas contienen un promotor y una secuencia de codificación A menudo, dichas construcciones también contendrán una región no trasladada 3' Dichas construcciones pueden contener una "secuencia de señal" o "secuencia líder" para facilitar el transporte co-traslacional o post-traslacional del péptido a ciertas estructuras intracelulares tales como el cloroplasto (u otro plástido), retículo endoplásmico o aparato de Golgí
Por "secuencia de señal" se entiende una secuencia que es conocida o se sospecha que resulta en el transporte de péptido co-traslacional o post-traslacional a través de la membrana de la célula En eucariotes, esto típicamente involucra la secreción en el aparato de Golgí, con algo de g cosilación resultante Por "secuencia líder" se entiende cualquier secuencia que cuando es trasladada, resulta en una secuencia de aminoácido suficiente para disparar el transporte co-traslacional de la cadena de péptido a un organelo subcelular Así, esto incluye secuencias líder que tienen como objetivo el transporte y/o la g cosilación por pasaje por el retículo endoplásmico, pasaje por vacuolas, plástidos incluyendo cloroplastos, mitocondpa y similares
Por "vector de transformación de planta" se entiende una molécula de ADN que es necesaria para la transformación eficiente de una célula de planta Dicha molécula puede consistir de uno o más cassettes de expresión de planta y puede organizarse en más de una molécula de ADN de "vector" Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformación de planta que utilizan dos vectores de ADN no contiguos para codificar todas las funciones requeridas de actuación cis- y trans- para la transformación de células de planta (Hellens y Mullmeaux (2000) Trends in Plant Science 5 446-451) "Vector" se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para transferencia entre diferentes células hospedantes "Vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la habilidad de incorporar, integrar y expresar secuencias de ADN heterólogas o fragmentos en una célula extraña El cassette incluirá secuencias reguladoras 5' y 3' enlazadas operativamente a una secuencia de la invención Por "enlazadas operativamente" se entiende un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en donde la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia Generalmente, enlazado operativamente significa que las secuencias de ácido nucleico que se están enlazando son contiguas y, donde es necesario unir dos regiones de codificación de proteína, contiguas y en el mismo marco de lectura El cassette puede contener adicionalmente al menos un gen adicional que será co-transformado en el organismo Alternativamente, el (los) gen(es) ad?c?onal(es) puede(n) proporcionarse en múltiples cassettes de expresión
"Promotor" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que funciona para dirigir la transcripción de una secuencia de codificación descendente El promotor junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras de transcripción y traslación (también designadas "secuencias de control") son necesarios para la expresión de una secuencia de ADN de interés Dicho cassette de expresión está provisto con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia de delta-endotoxina que estará bajo regulación de transcripción de las regiones reguladoras
El cassette de expresión incluirá en la dirección 5'-3' de transcripción una región de iniciación de transcripción y traslación (es decir, un promotor), una secuencias de ADN de la invención y una región de terminación de transcripción y traslación (es decir, región de terminación) funcional en plantas El promotor puede ser nativo o análogo, o extraño o heterólogo, a la planta hospedantes y/o a la secuencia de ADN de la invención Adicionalmente, el promotor puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética Cuando el promotor es "nativo" u "homólogo" a la planta hospedante, se entiende que el promotor se encuentra en la planta nativa en la cual el promotor es introducido Cuando el promotor es "extraño" o "heterólogo" a la secuencia de ADN de la invención, se entiende que el promotor no es el promotor nativo o que ocurre naturalmente para la secuencia de ADN operativamente enlazada de la invención
La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de transcripción, puede ser nativa con la secuencia de ADN operativamente enlazada de interés, puede ser nativa con la planta hospedante o puede ser derivada de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga al promotor, la secuencia de ADN de ínteres, la planta hospedante o cualquier combinación de las mismas) Las regiones de terminación convenientes están disponibles en el Ti-plásmido de A tumefaciens, tales como las regiones de terminación de smtasa octopina y sintasa nopa na Ver también Guepneau et al (1991) Mol Gen Genet 262 141-144, Proudfoot (1991) Cell 64 671-674, Sanfacon ef a/ (1991) Genes Dev 5 141-149, Mogen ef al (1990) Plant Cell 2 1261-1272, Munroe ef al (1990) Gene 91 151 -158, Bailas ef al (1989) Nucleic Acids Res 17 7891-7903 y Joshi et al (1987) Nucleic Acid Res 15 9627-9639
Cuando es apropiado, el (los) gen(es) puede(n) optimizarse para expresión incrementada en la célula hospedante transformada Esto es, los genes pueden ser sintetizados usando codones preferidos por células hospedantes para expresión mejorada o pueden ser sintetizados usando codones en una frecuencia de uso de codón preferido por hospedante Generalmente, el contenido GC del gen será incrementado Ver, por ejemplo, Campbell y Gowp (1990) Plant Physiol 92 1-11 para una discusión de uso de codon preferido por hospedante Los métodos están disponibles en la técnica para genes sintetizadores preferidos por plantas Ver, por ejemplo, Patente de EUA No 5,380,831 y 5,436,391 y Murray ef al (1989) Nucleic Acids Res 17 477-498, incorporados en el presente documento como referencia
En una modalidad, la delta-endotoxina es dirigida al cloroplasto para expresión De esta manera, cuando la delta-endotoxma no es insertada directamente en el cloroplasto, el cassette de expresión contendrá adicionalmente un ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito para dirigir la delta-endotoxina al cloroplasto Dichos péptidos de tránsito son conocidos en la técnica Ver, por ejemplo, Von Heijne et al (1991 ) Plant Mol Biol Rep 9 104-126, Clark eí al (1989) J Biol Chem 264 17544-17550, Della-Cioppa ef al (1987) Plant Physiol 84 965-968, Romer ef al (1993) Biochem Biophys Res Commun 196 1414-1421 y Shah ef al (1986) Science 233 48-481
El gen de delta-endotoxma que será dirigido al cloroplasto puede ser optimizado para expresión en el cloroplasto para dar cuenta de las diferencias en el uso de codón entre el núcleo de la planta y su organelo De esta manera, los ácidos nucleicos de interés pueden ser sintetizados usando los codones preferidos por cloroplastos Ver, por ejemplo, Patente de EUA No 5,380,831 , incorporada al presente documento como referencia
Transformación de Planta Los métodos de la invención involucran la introducción de una construcción de nucleótido en una planta Por "introducción" se entiende presentar a la planta la construcción de nucleótido de manera tal que la construcción gane acceso al interior de una célula de la planta Los métodos de la invención no requieren que se use un método en particular para la introducción de una construcción de nucleótido en una planta, solo que la construcción de nucleótido gane acceso al interior de al menos una célula de la planta Los métodos para introducir las construcciones de nucleótido en plantas son conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, métodos de transformación estable, métodos de transformación transiente y métodos mediados por virus
Por "planta" se entiende plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc ), semillas, células de plantas, propágulos, embriones y descendencia de la misma Las células de plantas pueden ser diferenciadas o no diferenciadas (por ejemplo, callo, células de cultivo de suspensión, protoplastos, células de hojas, células de raíces, células de floema, polen)
"Plantas transgénicas" o "plantas transformadas" o plantas o células o tejidos
"transformados establemente" se refiere a plantas que tienen incorporadas o integradas secuencias de ácido nucleico exógenas o fragmentos de ADN en la célula de la planta Estas secuencias de ácido nucleico incluyen aquellas que son exógenas, o no están presentes en la célula de planta no transformada, así como aquellas que pueden ser endógenas, o estar presentes en la célula de planta no transformada "Heterólogo" generalmente se refiere a las secuencias de ácido nucleico que no son endógenas a la célula o parte del genoma nativo en el cual están presentes y han sido añadidas a la célula por infección, transfección, microinyección, electroporación, microproyección, o similares
La transformación de las células de las plantas puede lograrse por una o diversas técnicas conocidas en la técnica El gen de delta-endotoxina de la invención puede ser modificado para obtener o mejorar la expresión en las células de plantas Típicamente una construcción que expresa dicha proteina contendría un promotor para dirigir la transcripción del gen, así como una región no trasladada 3' para permitir la terminación de la transcripción y poliadenilación La organización de dichas construcciones es bien conocida en la técnica En algunos casos, puede ser útil manipular el gen de manera que el péptido resultante sea secretado, o de otra manera dirigido dentro de la célula de la planta Por ejemplo, el gen puede ser manipulado para contener un péptido de señal para facilitar la transferencia del péptido al retículo endoplásmico También puede ser preferible manipular el cassette de expresión de la planta para contener un intrón, de manera que el procesamiento de mARN del mtrón sea requerido para la expresión
I Típicamente este "cassette de expresión de planta" será insertado en un "vector de
I 5 transformación de planta" Este vector de transformación de planta puede comprender uno o más vectores de ADN necesarios para lograr la transformación de la planta Por ejemplo, es práctica común en la técnica utilizar vectores de transformación de planta que comprenden más de un segmento de ADN contiguo Estos vectores a menudo se denominan en la técnica como "vectores binarios" Los vectores binarios así como los vectores con plasmidos ayudantes más a menudo
10 usados para la transformación mediada por Agrobacterium, cuando el tamaño y la complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr la transformación eficiente es bastante grande y es ventajoso separar funciones en moléculas de ADN separadas Los vectores binarios típicamente contienen un vector plásmido que contiene las secuencias de actuación cis- requeridas para la transferencia de T-ADN (tal como borde izquierdo y borde derecho), un marcador seleccionable
15 que es manipulado para ser capaz de expresión en una célula de planta y un "gen de interés" (un gen manipulado para ser capaz de expresión en una célula de planta para la cual se desea generación de plantas transgenicas) También están presentes en este vector plásmido las i secuencias requeridas para la rep cación bacterial Las secuencias de actuación cis- están i arregladas de manera que permiten la transferencia efectiva en las células de planta y expresión
¡ \ 20 en las mismas Por ejemplo, el gen marcador seleccionable y la delta-endotoxina están localizados entre los bordes izquierdo y derecho A menudo un segundo vector plásmido contiene los factores de actuación trans- que median la transferencia de T-ADN de Agrobacterium a células de plantas
Este plásmido a menudo contiene funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de las células de planta por Agrobacterium y transferencia de ADN por fragmentación en secuencias I 25 de borde y transferencia de ADN mediada por vir-, como se entiende en la técnica (Hellens y
Mullmeaux (2000) Trends in Plant Science 5 446-451) Diversos tipos de cepas de Agrobacterium
(por ejemplo, LBA4404, GV3101 , EHA101 EHA105, etc ) pueden usarse para transformación de planta El segundo vector plasmido no es necesario para transformar las plantas por otros métodos tales como microproyeccion, microinyección, electroporación, g col polipéptido, etc
En general, los métodos de transformación de planta involucran la transferencia de ADN heterologo en las células de planta objetivo (por ejemplo, embriones inmaduros o maduros, cultivos de suspensión, callo no diferenciado, protoplastos, etc ) seguida de la aplicación de un nivel de límite máximo de selección apropiada (dependiendo del gen marcador seleccionable) para recuperar las células de planta transformada de un grupo de masa de célula no transformada Los explantes son típicamente transferidos a un suministro fresco del mismo medio y cultivados rutinariamente Subsiguientemente, las células transformadas son diferenciadas en brotes después de colocarlas en medios de regeneración suplementados con un nivel de límite máximo de agente de selección Los brotes son entonces transferidos a un medio selectivo de arraigamiento para recuperar brotes arraigados o retoños El retoño transgénico entonces se convierte en una planta madura y produce semillas fértiles (por ejemplo, Hiei et al (1994) The Plant Journal 6 271-282, Ishida ef al (1996) Nature Biotechnology 14 745-750 Los explantes son típicamente transferidos a un suministro fresco del mismo medio y cultivados rutinariamente Una descripción general de las técnicas y métodos para generar plantas transgénicas se encuentra en Ayres y Park (1994) Critica! Reviews in Plant Science 13 219-239 y Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42 107-120 Debido a que el material transformado contiene muchas células, tanto las células transformadas como las no transformadas están presentes en cualquier pieza de callo objetivo sometido o tejido o grupo de células La habilidad de matar células no transformadas y permitir a las células transformadas proliferar resulta en cultivos de planta transformada A menudo, la habilidad de remover células no transformadas es una limitación para la recuperación rápida de las células de planta transformada y generación exitosa de plantas transgenicas
Los protocolos de transformación así como los protocolos para la introducción de secuencias de nucleotido en plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula de planta, es decir, monocot o dicot, objetivo de la transformación La generación de plantas transgenicas puede desempeñarse por uno o diversos métodos, incluyendo, pero sin limitarse a, microinyección, electroporación, transferencia de gen directa, introducción de ADN heterólogo por Agrobacterium en células de planta (transformación mediada por Agrobacterium), bombardeo de células de planta con ADN extraño heterólogo adherido a partículas, aceleración de partícula de balística, transformación de haz de aerosol (Solicitud Publicada de EUA No 20010026941 , Patente de EUA No 4,945,050, Publicación Internacional No WO 91/00915, Solicitud Publicada de EUA No 2002015066), transformación Led y otros muchos métodos de no partícula mediados directos para transferir ADN
Los métodos para transformación de cloroplasto son conocidos en la técnica Ver, por ejemplo, Svab et al (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87 8526-8530, Svab y Maliga (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90 913-917, Svab y Maliga (1993) EMBO J 12 601-606 El método depende de la entrega por pistola de partícula de ADN que contiene un marcador seleccionable y de dirigir el ADN al genoma plastido a través de la recombinación homologa Adicionalmente, la transformación de plástido puede lograrse por la transactivación de un transgen de terminal de plástido silencioso por expresión preferida de tejido de una polimerasa de ARN dirigida por plástido y codificación nuclear Dicho sistema ha sido reportado en McBride ef al (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91 7301-7305
Después de la integración del ADN extraño heterologo en las células de plantas, uno entonces aplica un nivel de limite máximo de selección apropiada en el medio para matar las células no transformadas y separar y proliferar las células transformadas putativamente que sobreviven a este tratamiento de selección al transferirlas regularmente a un medio fresco Mediante el pasaje continuo y el reto con selección apropiada, uno identifica y prolifera las células que son transformadas con el vector plásmido Entonces los métodos moleculares y bioquímicos se usarán para confirmar la presencia del gen heterólogo integrado de interés en el genoma de la planta transgénica Las células que han sido transformadas pueden convertirse en plantas de acuerdo con maneras convencionales Ver, por ejemplo, McCormick et al (1986) Plant Cell Reports 5 81-84 Estas plantas después pueden cultivarse y polmarse ya sea con la misma cepa transformada o diferentes cepas y el híbrido resultante teniendo expresión consecutiva de la característica 5 fenotipica deseada identificada Dos o más generaciones pueden cultivarse para asegurar que la expresión de la característica fenotipica deseada sea establemente mantenida y heredada y luego las semillas sean cosechadas para asegurar que se logre la expresión de la característica fenotípica deseada De esta manera, la presente invención proporciona semillas transformadas (también denominadas "semillas transgénicas") que tienen una construcción de nucleótido de la 10 invención, por ejemplo, un cassette de expresión de la invención, establemente incorporado en su genoma
Evaluación de Transformación de la Planta Siguiendo la introducción de ADN extraño heterólogo en células de planta, la 15 transformación o integración del gen heterologo en el genoma de la planta se confirma mediante diversos métodos tales como análisis de ácidos nucleicos, proteínas y metabolitos asociados con el gen integrado
El análisis PCR es un método rápido para cribar las células transformadas, tejido o brotes
I I 20 para la presencia del gen incorporado en una etapa anterior al transplante en el suelo (Sambrook y i i Russell (2001) Molecular cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY) PCR se lleva a cabo usando imprimadores de oligonucleótido específicos para el gen de interés o fondo de vector Agrobacterium, etc
25 La transformación de la planta puede ser confirmada por análisis de Southern blot del ADN genómico (Sambrook y Russell, 2001 , supra) En general, el ADN total se extrae del transformante, digiere con enzimas de restricción apropiada, fracciona en un gel de agarosa y transfiere a una membrana de nitrocelulosa o nylon La membrana o "blot" se sondea entonces con, por ejemplo, fragmento de ADN objetivo 23P radioetiquetado para confirmar la integración del gen introducido en el genoma de la planta de acuerdo con técnicas estándar (Sambrook y Russell, 2001 , supra)
En el análisis de Northern blot, el ARN es aislado de tejidos específicos de transformante, fraccionado en un gel de agarosa de formaldehído, transferido a un filtro de nylon de acuerdo con procedimientos estándar que son usados rutinariamente en la técnica (Sambrook y Russell, 2001 , supra) La expresión del ARN codificado por la delta-endotoxma es entonces probado al hibndizar el filtro para una sonda radioactiva derivada de una delta-endotoxina, por métodos conocidos en la técnica (Sambrook y Russell, 2001 , supra)
Los análisis Western blot y bioquímicos y similares pueden llevarse a cabo en plantas transgénicas para confirmar la presencia de proteína codificada por el gen de delta-endotoxina por procedimientos estándar (Sambrook y Russell, 2001 , supra) usando anticuerpos para enlazar uno o más epítopes presentes en la proteína de delta-endotoxina
Actividad Pesticida en Plantas En otro aspecto de la invención, uno puede genera plantas transgénicas que expresan un delta-endotoxina que tiene actividad pesticida, los métodos descritos en el presente documento por medio de ejemplos pueden utilizarse para generar plantas transgénicas, pero la manera en que las células de plantas transgenicas se generan no es crítica para esta invención Los métodos conocidos o descritos en la técnica tales como transformación mediada por Agrobacterium, transformación biolística y métodos mediados por no partícula pueden usarse a discreción del experimentador Las plantas que expresan una delta-endotoxina pueden ser aisladas por métodos comunes descritos en la técnica, por ejemplo por transformación de callo, selección de callo transformado y regeneración de plantas fértiles de dicho callo transgénico En dichos procesos, uno puede usar cualquier gen como un arcador seleccionable siempre y cuando su expresión el células de planta confiera la habilidad de identificar o seleccionar células transformadas Un numero de marcadores se han desarrollado para usarse con células de plantas, tales como resistencia al cloramfenicol, el aminog cósido G418, higromicina o similares Otros genes que codifican un producto involucrado en el metabolismo también pueden usarse como marcadores seleccionados Por ejemplo, los genes que proporcionan resistencia a herbicidas de planta tales como g fosfato, bromoximl o imidazo nona pueden encontrar un uso particular Dichos genes han sido reportados (Stalker ef al (1985) J Biol Chem 263 6310-6314, gen de nitplasa de resistencia al bromoxinil y Sathasivan ef al (1990) Nucí Acids Res 18 2188, gen de resistencia a la imidazohnona AHAS)
Las plantas fértiles que expresan una delta-endotoxma pueden probarse por actividad pesticida y las plantas que muestran actividad óptima pueden seleccionarse para reproducción adicional Los métodos están disponibles en la técnica para analizar actividad de peste Generalmente, la proteína es mezclada y usada en análisis de alimentación Ver, por ejemplo, Marrone et al (1985) J of Economic Entomology 78 290-293
La presente invención puede usarse para la transformación de cualquier especie de planta, incluyendo, pero sin limitarse a, monocots y dicots Ejemplos de plantas de interés incluyen, pero no se limitan a, elote (maíz), sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, papas, algodón, arroz, soya, remolacha, caña de azúcar, tabaco, cebada y cañóla, Brassica sp , alfalfa, centeno, mijo, cártamo, cacahuates, camote, tapioca, café coco, pina, árboles cítrico, cacao, te, plátano, aguacate, higo, guayaba, mango, olivo, papaya, castaña, macadamia, almendra, avena, vegetales, ornamentales y coniferas
Los vegetales incluyen, pero no están limitados a, tomates, lechuga, judías verdes, limas, chícharos y miembros del género Cucumis tales como pepino y melón Los ornamentales incluyen, pero no están limitados a, azalea, hortensia, hibisco, rosas, tulipanes, narciso, petunia, clavel, nochebuena y crisantemo Preferiblemente, las plantas de la presente invención son plantas de cosecha (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, papas, algodón, soya, remolacha, caña de azúcar, tabaco, cebada, cañóla, etc )
Uso en Control Pesticida Los métodos generales para emplear cepas que comprenden una secuencia de nucleótido de la presente invención, o una variante de la misma, en control pesticida o en la manipulación de otros organismos como agentes pesticidas se conocen en la técnica Ver, por ejemplo, Patente de EUA No 5,039,523 y EP 0480762A2
Las cepas de Bacillus que contienen una secuencia de nucleotido de la presente invención, o una vanante de la misma, o el microorganismo que ha sido genéticamente alterado para contener un gen pesticida y proteína se pueden usar para proteger cosechas agrícolas y productos de las pestes En un aspecto de la invención, células enteras, es decir, sin lisar, de un organismo que produce una toxina (pesticida) se tratan con reactivos que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se aplica al ambiente de la(s) peste(s) objetivo
Alternativamente, el pesticida es producido mediante la introducción de un gen de delta-endotoxina en un hospedante celular La expresión del gen de delta-endotoxina resulta, directa o indirectamente, en la producción intracelular y mantenimiento del pesticida En un aspecto de esta invención, estas células son entonces tratadas bajo condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula es aplicada al ambiente de la(s) peste(s) objetivo El producto resultante retiene la toxicidad de la toxina Estos pesticidas naturalmente encapsulados pueden ser entonces formulados de acuerdo con técnicas convencionales para aplicación al ambiente que hospeda a la peste objetivo, por ejemplo, suelo, agua y follaje de plantas Ver, por ejemplo, EPA 0192319 y las referencias citadas en el mismo Alternativamente, uno puede formular las células que expresan un gen de esta invención tal como para permitir la aplicación del material resultante como un pesticida Los ingredientes activos de la presente invención son normalmente aplicados en la forma de composiciones y pueden ser aplicados al área de cosecha o planta a tratar, simultáneamente o en sucesión, con otros compuestos Estos compuestos pueden ser fertilizantes, mata hierbas, cpoprotectores, agentes tensoactivos, detergentes, jabones pesticidas, aceites latentes, polímeros y/o formulaciones de portador de liberación por tiempo o biodegradables que permiten la dosificación a largo plazo de un área objetivo después de una sola aplicación de la formulación También pueden ser herbicidas selectos, insecticidas químicos, virucidas, microbicidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, moluscocidas o mezclas de muchas de estas preparaciones, si se desea, junto con otros portadores, agentes tensioactivos o coadyuvantes que promueven aplicación agrícolamente aceptables habitualmente empleados en la técnica de la formulación Los portadores aceptables y coadyuvantes pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a las sustancias ordinariamente empleadas en tecnología de formulación, por ejemplo sustancias minerales naturales o regeneradas, solventes, dispersantes, agentes humectantes, agentes de pegajosidad, aglutinantes y fertilizantes De manera similar las formulaciones pueden prepararse como "carnadas" comestibles o modelarse como "trampas" para peste para permitir la alimentación o ingestión de una peste objetivo de la formulación pesticida
Los métodos de aplicación de un ingrediente activo de la presente invención o una composición agroquimica que contiene al menos una de las proteínas pesticidas producidas por las cepas bacteriales de la presente invención incluyen aplicación a la hoja, recubrimiento de semilla y aplicación al suelo El número de aplicaciones y la regularidad de aplicación dependen de la intensidad de infestación de la peste correspondiente
La composición puede estar formulada como un polvo, polvillo, pastilla, granulo, rocío, emulsión, coloide, solución o similar y puede prepararse por medios convencionales como desecación, liofilización, homogemzación, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células que comprende el polipéptido. En todas esas composiciones que contienen al menos uno de dichos po péptidos pesticidas, el polipéptido puede estar presente en una concentración de desde aproximadamente 1 % hasta aproximadamente 99% por peso
Las pestes de lepidópteros, heterópteros o coleópteros pueden matarse o reducirse en numero en un área determinada por los métodos de la invención o pueden aplicarse profilácticamente a un área ambiental para prevenir la infestación de una peste susceptible Preferiblemente la peste ingiere, o hace contacto con, una cantidad pescadamente efectiva del polipeptido "Por cantidad pescadamente efectiva" se entiende una cantidad de pesticida que es capaz de matar al menos una peste, o reducir notablemente el crecimiento, alimentación o desarrollo fisiológico normal de la peste Esta cantidad variará dependiendo de factores como, por ejemplo, las pestes objetivo especificas que serán controladas, el ambiente específico, ubicación, planta, cosecha o sitio agrícola a tratar, las condiciones ambientales y el método, regularidad, concentración, estabilidad y cantidad de aplicación de la composición de po péptido pescadamente efectiva Las formulaciones también pueden variar con respecto a las condiciones climáticas, consideraciones ambientales y/o frecuencia de aplicación o severidad de la infestación de la peste
Las composiciones pesticidas descritas pueden hacerse mediante la formulación ya sea de célula bacterial, suspensión de cristal y/o espora o componente de proteína aislada con el portador agrícolamente aceptable Las composiciones pueden formularse antes de la administración de medios apropiados tales como liofi zados, cposecados, desecados o en un portador, medio o diluyente acuoso apropiado, tal como suero u otro regulador Las composiciones formuladas pueden estar en la forma de un polvo o material granular o una suspensión en aceite (vegetal o mineral) o agua o emulsiones de aceite/agua o como un polvo humedeable o en combinación con cualquier otro material portador apropiado para aplicación agrícola Los portadores agrícolas apropiados pueden ser solidos o líquidos y son bien conocidos en la técnica El término "portador agpcolamente aceptable" cubre todos los coadyuvantes, componentes inertes, dispersantes, agentes tensionantes, agentes de pegajosidad, aglutinantes, etc que se usan ordinariamente en tecnología de formulación pestiada, estos son bien conocidos para aquellos expertos en formulación pesticida, las formulaciones pueden mezclarse con uno o más coadyuvantes solidos o líquidos y prepararse por diversos medios, por ejemplo, al mezclar, combinar y/o moler homogéneamente la composición pestiada con coadyuvantes apropiados usando técnicas de formulación convencionales Las formulaciones apropiadas y métodos de aplicación se describen en la Patente de EUA No 6,468,523 incorporada al presente documento como referencia
"Peste" incluye pero no se limita a, insectos, hongos, bacterias, nemátodos, ácaros, garrapatas y similares Las pestes de insectos incluyen insectos seleccionados de los órdenes Coleóptera, Heteroptera, Díptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera,
Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Tnchoptera, etc , particularmente Coleptera, Lepidoptera y Díptera
El orden Coleóptera incluye los subórdenes Adephaga y Polyphaga El suborden Adephaga incluye las superfamilias Caraboidea y Gypnoidea, mientras que el suborden Polyphaga incluye las superfamilias Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea,
Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebnonoidea,
Bostnchoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea y Curculionoidea La superfami a
Caraboidea incluye las familias Cicindelidae, Carabidae y Dytiscidae La superfami a Gypnoidea incluye la familia Gynnidae La superfamilia Hydrophiloidea incluye la familia Hydrophilidae La superfamilia Staphylinoidea incluye las familias Silphidae y Staphyhnidae La superfami a
Cantharoidea incluye las familias Canthandae y Lampyndae La superfamilia Cleroidea incluye las familias Clendae y Dermestidae La superfamilia Elateroidea incluye las familias Elatepdae y
Buprestidae La superfamiha Cucujoidea incluye la familia Coccinellidae La superfamilia Meloidea incluye la familia Meloidae La superfami a Tenebponoidea incluye la familia Tenebponidae La superfamilia Scarabaeoidea incluye las familias Passalidae y Scarabaeidae La superfamilia
Cerambycoidea incluye la familia Cerambycidae La superfamilia Chrysomeloidea incluye la familia
Chrysomelidae La superfami a Curculionoidea incluye las familias Curculionidae y Scolytidae El orden Díptera incluye las subórdenes Nematocera, Brachycera y Cyclorrhapha El suborden Nematocera incluye las familias Tipulidae, Psychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae Simuludae, Bibionidae y Cecidomyndae El suborden Brachycera incluye las familias Stratiornyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyludae y Dolichopodidae El suborden Cyclorrhapha incluye las divisiones Aschiza y Aschiza La división Aschiza incluye las familias Phondae, Syphidae y Conopidae La división Aschiza incluye las secciones Acalyptratae y Calyptratae La sección Acalyptratae incluye las familias Otitidae, Tephntidae, Agromyzidae y Drosophilidae La sección Calyptratae incluye las familias Hippoboscidae, Oestpdae, Tachmidae, Anthomyndae, Muscidae, Calliphopdae y Sarcophagidae
El orden Lepidoptera incluye las familias Papilionidae, Piepdae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyndae, Hespepidae, Sphingidae, Saturnndae, Geometpdae, Arctndae, Noctuidae, Lymantnidae, Sesndae y Tineidae
El orden Heteroptera incluye las familias Mindae, Lygaeidae, Pentatomidae, Tmgidae,
Coreidae, Alydidae, Rhopalidae y Rhopalidae
Las pestes de insectos de la invención para cosechas importantes incluyen Maíz Ostnnia nubilalis, gusano barrenador europeo, Agrotis ípsilon, gusano negro, Helicoverpa zea, gusano del elote del maíz, Spodoptera frugiperda, oruga militar, Diatraea grandiosella, gusano barrenador del suroeste, Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor, Diatraea saccharalis, barrenador de caña de azúcar, Diabrotica virgifera, gusano de la raíz del oeste Diabrotica longicornis barben, gusano de la raíz del norte, Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del sur, Melanotus spp gusano de alambre, Cyclocephala Borealis, gallina ciega del norte (gusano blanco), Cyclocephala Immaculata, gallina ciega del sur (gusano blanco), Popillia japónica, escarabajo japonés, Chaetocnema Pulicaria, pulguilla del maíz, Sphenophorus maidis, gorgojo del maíz, Rhopalosiphum maidis, afido pulgones del maíz, Blissus leucopterus leucopterus, chinche del prado, Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas, Melanoplus sangumipes, saltamontes migratorio, Hylemya platura, mosca de la semilla, Agromyza parvicornis, minador de las hojas del maíz, Anaphothnps obscrurus, tppidos del pasto, Solenopsis milesta, hormiga ladrona, Tetranychus urticae, arañuela bicolor, Sorgo Chilo partellus, barrenador de sorgo, Spodoptera frugiperda, oruga militar, Helicoverpa zea, gusano del elote del maíz, Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor,
5 Feltia subterránea, gusano trozador, Phyllophaga ermita, gusano blanco, Eleodes, Conoderus y
Aeolus spp , gusanos de alambre, Oulema melanopus, cpocero de los cereales, Chaetocnema pulicaria, pulguilla del maíz, Sphenophorus maidis, gorgojo del maíz, Rhopalosiphum maidis, áfido pulgones del maíz, Sipha flava, afido de caña de azúcar amarillo, Blissus leucopterus leucopterus, chinche del prado, Contannia sorghicola, mosquito del sorgo, Tetranychus cmnabarinus, arañuela
10 del clarel, Tetranychus urticae, arañuela bicolor, Trigo Pseudaletia unipunctata, gusano militar,
Spodoptera frugiperda, oruga militar, Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor, Agrotis
I orthogonia, agrotis occidental, Elasmopalpus lignosellus, barrenador menor, Oulema melanopus, cpocero de los cereales, Hypera punctata, gorgojo del trébol, Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del sur, afido ruso del trigo, Schizaphis graminum, áfido verde, Macrosiphum
¡ 15 avenae, áfido de grano inglés, Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas, Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial, Melanoplus sanguinipes, saltamontes migratorio, Mayetiola destructor, mosca de Hesse, Sitodiplosis mosellana, mosquito del tpgo, Meromyza americana,
¡ gusano del tallo del trigo, Hylemya coarctata, mosca gris del trigo, Frankliniella fusca, tppidos del
! tabaco, Cephus cinctus, cefo del trigo, Acería tulipae, acaro blanco del bulbo, Girasol Suleima l 20 helianthana, polilla del botón del girasol, Homoeosoma electellum, polilla del girasol, zygogramma
1 exclamationis, escarabajo del girasol, Bothyrus gibbosus, escarabajo de la zanahoria,
I | Neolasioptera murtfeldtiana, mosquilla de la semilla del girasol, Algodón Heliothis virescens, gusano del algodón, Helicoverpa zea, gusano bellotero del algodón, Spodoptera exigua, gardama de la remolacha, Pectinophora gossypiella, gusano bellotero rosa, Anthonomus grandis, picudo del
! 25 algodonero, Aphis gossypn, áfido del algodón, Pseudatomoscelis senatus, saltahojas de algodón,
I Tpaleurodes abutilonea, mosca blanca con alas con bandas, Lygus Uneolaps, chinche manchador, i ' Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas, Melanoplus differentialis, saltamontes
I diferencial, Thrips tabací, trípidos de cebolla, Frankliniella fusca, trípidos del tabaco, Tetranychus cinnabannus, arañuela del clarel, Tetranychus urticae, arañuela bicolor, Arroz Diatraea saccharalis, barrenador de caña de azúcar, Spodoptera frugiperda, oruga militar, Helicoverpa zea, gusano del elote del maíz, Colaspis brunnea, colaspis de uva, Lissorhoptrus oryzophilus, picudo acuático de arroz, Sitophilus oryzae, picudo de arroz, Nephotettix nigropictus, saltahojas de arroz, 5 Blissus leucopterus leucopterus, chinche del prado, Acrosternum hilare, chinche hedionda verde, Soya Pseudoplusia includens, gusano medidor de soya, Anticarsia gemmatalis, langosta del mam, Plathypena scabra, gusano verde del trébol, Ostpnia nubilalis, gusano barrenador europeo, Agrotis ípsilon, gusano negro, Spodoptera exigua, gardama de la remolacha, Heliothis virescens, gusano del algodón, He coverpa zea, gusano bellotero del algodón, Epilachna vapvestis, escarabajo del 10 frijol mexicano, Myzus persicae, afido del durazno verde, Empoasca fabae, saltahojas de la papa, Acrosternum hilare, chinche hedionda verde, Melanoplus femurrubrum, saltamontes de patas rojas, Melanoplus differentialis, saltamontes diferencial, Hylemya platura, mosca de la semilla, Sencothnps vanabilis, trípido de la soya, Thrips tabací, tppidos de cebolla, Tetranychus turkestam, arañuela de la fresa, Tetranychus urticae, arañuela bicolor, Cebada Ostnnia nubilalis, gusano
15 barrenador europeo, Agrotis ípsilon, gusano negro, Schizaphis grammum, áfido verde, Blissus
I leucopterus leucopterus, chinche del prado, Acrosternum hilare, chinche hedionda verde, euschistus servus, chinche hedionda café, Delia platura, mosca de la semilla, Mayetiola destructor, i mosca de Hesse, Petrobia latens, acaro de trigo cafe, Cañóla Brevicoryne brassicae, áfido de col,
Phyllotreta cruciferae, pulguilla, Mamestra configurata, oruga militar berta, Plutella xylostella,
I 20 palomilla de dorso diamante, Delia spp , gusano de raíz i
Los nematodos incluyen nemátodos parasitarios tales como nemátodos de nudo de raíz, i j de quiste y de lesión, incluyendo Heterodera spp , Meloidogyne spp y Globodera spp , particularmente miembros de los nematodos de quiste, incluyendo, pero sin limitarse a, Heterodera
¡ 25 glycines (nemátodo de quiste de soya), Heterodera schachtn (nemátodo de quiste de remolacha),
< Heterodera avenae (nematodo de quiste de cereal) y Globodera rostochiensis y Globodera pailida i (nemátodos de quiste de papa) Los nematodos de lesión incluyen Pratylenchus spp Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación
EXPERIMENTAL Ejemplo 1 Extracción de ADN Plasmido 5 Un cultivo puro de cepa ATX14819 se cultivo en grandes cantidades de medios ricos El cultivo se hizo girar para cultivar la pastilla de célula La pastilla de célula fue entonces preparada por tratamiento con SDS por métodos conocidos en la técnica, resultando en la división de la pared celular y liberación de ADN Las proteínas y ADN genomico grande fueron entonces precipitados por una alta concentración de sal El ADN plásmido fue entonces precipitado por precipitación de
10 etanol estándar El ADN plasmido fue separado de cualquier ADN cromosómico restante por centrifugación a alta velocidad a través de gradiente de cloruro de cesio El ADN fue desplegado en el gradiente por luz UV y la banda de baja densidad (es decir, la banda baja) se extrajo usando una jeringa Esta banda contenía el ADN plásmido de la Cepa ATX14819 La cantidad de ADN se revisó por despliegue en un gel de agarosa 15 Eiemplo 2 Clonación de Genes El ADN plásmido purificado fue cortado en fragmentos de 5-10 kb y las salientes de una sola cepa 5' y 3' reparadas usando polímeros T4 ADN y fragmento de Klenow en la presencia de los cuatro dNTPs Los fosfatos se fijaron a los extremos de 5' por tratamiento con cinasa de
20 polmucleótido T4 Los fragmentos de ADN reparados fueron entonces ligados durante la noche en un vector de copia alta estándar (es decir, pBLUESCRIPT® SK+), preparado apropiadamente para aceptar los insertos como se conoce en la técnica (por ejemplo por digestión con una enzima de restricción que produce extremos redondeados)
25 La calidad de la biblioteca se analizó mediante la digestión de un subconjunto de clones con una enzima de restricción conocida por tener un sitio de fragmentación flanqueando un sitio de
I clonación Se determinó que un alto porcentaje de clones contenía insertos, con un tamaño i promedio de inserto de 5-6 kb Eiemplo 3 Secuenaaaón de Fluio Alto de Placas de Biblioteca Una vez que se revisó y confirmó la calidad de la biblioteca de perdigón, las colonias se cultivaron en un caldo rico en bloques de 96 pocilios de 2ml durante la noche a 37°C a una velocidad de agitación de 350 rpm Los bloques fueron girados para cosechar las células del fondo
5 del bloque Los bloques fueron entonces preparados con preparación de lisis alcalina estándar en un formato de flujo alto
Las secuencias finales de clones de esta biblioteca fueron entonces determinadas para un gran número de clones de cada bloque de la siguiente manera la secuencia de ADN de cada clon
10 elegido para análisis se determinó usando una técnica de secuenaaaón de termmador de tinte fluorescente (Applied Biosystems) e imprimadores estándar flanqueando cada lado del sitio de clonación Una vez que las reacciones se llevaron a cabo en el vapador térmico, el ADN se precipitó usando precipitación de etanol estándar El ADN fue resuspendido en agua y cargado en una máquina de secuenaaaón capilar Cada placa de biblioteca fue secuenaada por cualquiera
15 de los extremos del sitio de clonación, produciendo dos lecturas por placa en cada inserto
Eiemplo 4 Ensamble y Cribado de Datos de Secuenaación Las secuencias de ADN obtenidas fueron compiladas en un proyecto de ensamble y alineadas juntas para formar contiguos Esto se puede hacer eficientemente usando un programa
20 de computadora, tal como Vector NTi, o alternativamente usando la sene Pred/Phrap de alineación de ADN y programas de análisis Estos contiguos, junto con cualquier lectura individual que pudiera no haber sido añadida a un contiguo, se compararon con una base de datos compilada de todas las clases de genes pestiadas conocidos Los contiguos o lecturas individuales identificadas como i ¡ que tenían identidad con una endotoxma conocida o gen pestiada se analizaron adicionalmente i 25 Un solo clon, pAX027, se encontró que tenía ADN que mostraba homología con genes de
I I endotoxina conocidos Por lo tanto, pAX027 se seleccionó para secuenaaaón adicional
! Eiemplo 5 Secuenaación de pAX027 e Identificación de AXMI-027 Los imprimadores se diseñaron para templar pAX027, de manera que las secuencias de ADN generadas a partir de dichos imprimadores traslaparan las secuencias de ADN existentes de este clon Este proceso, conocido como "desplazamiento oligo", es bien conocido en la técnica Este proceso se utilizo para determinar la secuencia de ADN entera de la región que exhibía homología con un gen de endotoxina conocido En el caso de pAX027, este proceso se usó para determinar la secuencia de ADN del clon entero, resultando en una sola secuencia de nucleotido La secuencia de ADN completada se volvió a colocar en el ensamble grande original para validación adicional Esto permitió la incorporación de mas lecturas de secuencia de ADN en el contiguo, resultando en 6-7 lecturas de cobertura sobre la región entera
El análisis de la secuencia de ADN de pAX027 por métodos conocidos en la técnica identifico un marco de lectura abierto que consistía de 2100 nucleótidos y 700 aminoácidos, con homología a genes de delta-endotoxma conocidos Este marco de lectura abierto es denominado como AXMI-027 La secuencia de ADN de AXMI-027 esta provista como SEQ ID NO 1 y la secuencia de aminoácido de la proteina AXMI-027 predicha esta provista en la SEQ ID NO 2
Eiemplo 6 Homología de AXMI-027 con Genes de Endotoxina Conocidos Las búsquedas de bases de datos de ADN y proteina con la secuencia de ADN y secuencia de aminoácido de AXMI-027 revelaron que AXMI-027 es homólogo con endotoxinas conocidas Las búsquedas Blast identificaron a la proteina cry18Aa (Adquisición No CAA67506) como la que tenia el bloque mas fuerte de homología, con una identidad de secuencia general en el dominio tóxico de 26% (ver Tabla 1 )
La Figura 1 muestra una alineación de AXMI-027 (SEQ ID NO 2) con las proteínas de más alta puntuación identificadas por búsqueda Blast AXMI-027 parece ser una delta-endotoxina naturalmente truncada, conteniendo solo los dominios de terminal N tóxicos Todas las menciones
Blast también eran genes naturalmente truncados excepto por cry26Aa(*), que era artificialmente truncado en su sitio de fragmentación predicho Tabla 1 Identidad de Aminoácido de AXMI-027 con Clases de Endotoxinas Ejemplares
Las búsquedas de la base de datos pFAM identificaron a AXMI-027 como que tenía homología con la delta-endotoxina, familia de dominio de terminal N (PFAM Adquisición No PF03945) Un dominio de Endotox?na_N se encontró entre los residuos de aminoácido 90 y 323 de AXMI-027 (SEQ ID NO 2)
Esta familia contiene toxinas insecticidas producidas por la especie de bacteria Bacillus La terminal N de la protema cristalizada es fragmentada después de la ingestión del insecto, resultando en una protema activada La extensión de la terminal C es fragmentada en algunos miembros de proteína Esta región activada de la delta-endotoxina está compuesta por tres dominios estructurales El dominio helicoidal de terminal N está involucrado en la inserción de membrana y formación de poro El segundo y tercer dominio están involucrados en el enlazamiento de receptor
Eiemplo 7 Clonación de AXMI-027 para Expresión de Protema AXMI-027 es clonado en un vector para la expresión de £ coll como sigue pAX998 contiene el gen de resistencia a la ampialina para la selección de transformantes y el promotor tac que se puede inducir por IPTG para expresión de proteína regulada pAX998 también tiene una región de etiqueta 6xH?s inmediatamente ascendente de la región de clonación de inserto, de manera que cualquier clon resultante contendría una etiqueta 6xH?s en la terminal N de la proteína expresada Los métodos para expresar proteínas con fusiones de etiqueta 6xH?s y su uso para la purificación y análisis de expresión de proteína son bien conocidos en la técnica
La secuencia de codificación para AXMI-027 es amplificada por PCR usando Pohmerasa de ADN de Alta Fidelidad PFUULTRA™ (Stratagene) Los imprimadores de oligonucleótido están diseñados de manera que el producto PCR resultante contenga los sitios de restricción deseados cerca de cada extremo, para facilitar la clonación El producto PCR resultante (aproximadamente 2 2 kb) es digerido con la enzima de restricción apropiada y subclonado con el vector de expresión de E coli, pAX997 Los clones que contienen insertos son identificados por análisis de restricción El clon resultante, pAX965, contiene el marco de lectura abierto de AXMI-027 fusionado con la etiqueta 6xH?s, de manera que la transcripción y traslación resulten en la producción de una "proteína de fusión" con un estiramiento de seis histidinas La secuencia de ADN de pAX965 es confirmada por análisis de secuencia de ADN y es subsiguientemente transformada en E coll BL21 químicamente competente, como lo describe el fabricante (Stratagene, La Jolla, CA)
Una sola colonia de pAX965 en BL21 es inoculada en medios LB suplementados con ampicilina y crecen por vanas horas a 37°C con agitación vigorosa Estos cultivos se diluyen en medios LB frescos en una dilución de 1 50 y luego crecen en un OD600 que varía de 0 6-0 8 La producción de proteína es inducida por adición de 0 1 mM IPTG y los cultivos crecen bajo condiciones de inducción durante la noche a 20°C Las células son entonces granuladas por centrifugación y resuspendidas en PBS Las células son sonicadas por un total de 30 segundos usando intervalos de sonicaaón de 10 segundos e incubadas en hielo por un minuto
Eiemplo 8 Expresión de AXMI-027 en Bacillus El gen insecticida AXMI-027 es amplificado por PCR a partir de pAX027 y clonado en el vector de Expresión Bacillus pAX916 por métodos bien conocidos en la técnica La cepa de Bacillus que contiene el vector con AXMI-027, pAX967 puede ser cultivada en una variedad de medios de crecimiento convencionales Una cepa de Bacillus que contiene pAX931 crece en un medio CYS (10 g/l Bacto-casitona, 3 g/l extracto de levadura, 6 g/l KH2P04, 14 g/l K2HP04, 0 5 mM MgS04, 0 05 mM MnCI2, 0 05 mM FeS04), hasta que la esporulación es evidente por examen microscópico Las muestras son preparadas y AXMI-027 es probado por actividad insecticida en un bioanálisis contra pestes de insectos importantes
Eiemplo 9 Expresión de AXMI-036 en Bacillus El gen insecticida axm?-036 fue identificado en una biblioteca de ADN de la cepa ATXI14759, en pATX147599010H12 plásmido El marco de lectura abierto fue amplificado por PCR del pATX147599010H12 plásmido y clonado en el vector de expresión Bacillus pAX916 por métodos bien conocidos en la técnica para crear el pAX2567 plásmido La cepa Bacillus que contiene pAX2567 puede cultivarse en una variedad de medios de crecimiento convencionales Una cepa de Bacillus que contiene pAX2567 creció en un medio CYS (10 g/l Bacto-casitona, 3 g/l extracto de levadura, 6 g/l KH2P04, 14 g/l K2HP04, 0 5 mM MgS04, 0 05 mM MnCI2, 0 05 mM FeS04, 7 g/l glucosa), hasta que la esporulaaón y sis fueron evidentes por examen microscópico Las muestras fueron preparadas a partir de esos cultivos esporulados por prueba de bioanálisis
Para preparar medios CYS 10 g/l Bacto-casitona, 3 g/l extracto de levadura, 6 g/l KH2P04,
14 g/l K2HP04, 0 5 mM MgS04, 0 05 mM MnCI2, 0 05 mM FeS04 La mezcla CYS debe tener un pH de 7, si un ajuste es necesario NaOH o HCl son preferidos El medio es entonces curado en autoclave y 100 ml de 10X glucosa filtrada se añaden después de la curación por autoclave Si la solución resultante es turbia se puede revolver a temperatura ambiente para aclararla
Eiemplo 10 Clonación de axm?-038 de Paenibacillus popilliae amx?-038 fue amplificado como dos fragmentos de PCR que se traslapan de la cepa de ATX21738 (Paembacillus popilliae) y ensamblado en un solo clon de ADN por virtud de un sitio de enzima de restricción compartido Nsp I como se conoce en la técnica para producir pAX2003 plásmido La secuencia de ADN del clon resultante se determinó por métodos conocidos en la técnica Eiemplo 11 Homología de AXMI-027, AXMI-036 y AXMI 038 con genes conocidos Las secuencias de aminoácido de AXMI-027, AXMI-036 y AXMI-038 se compararon con bases de datos públicas, tales como GENBANK® y se determinaron las proteínas con homología de aminoácido más cercana Estas proteínas fueron entonces alineadas con las secuencias de aminoácidos de los homólogos más cercanos y se determinó el siguiente porcentaje de identidad
Tabla 2 Identidad de aminoácido con proteínas conocidas
Eiemplo 12 Análisis de Actividad Pestiada La habilidad de una proteína pestiada de actuar como un pestiada sobre una peste es a menudo evaluada de diversas maneras Una manera bien conocida en la técnica es desempeñar un análisis de alimentación En dicho análisis de alimentación, uno expone la peste a una muestra que contiene ya sea compuestos a ser probados o muestras de control A menudo estos análisis se desempeñan al colocar el material que va a ser probado o una dilución apropiada de dicho material, en un material que la peste ingerirá, tal como una dieta artificial El material que va a ser probado puede estar compuesto de un líquido, sólido o suspensión El material que va a ser probado puede colocarse sobre la superficie y luego dejarse secar Alternativamente, el material que va a ser probado puede mezclarse con una dieta artificial fundida, luego dispersarse en la cámara de análisis La cámara de análisis puede ser, por ejemplo, una taza, un plato o un pocilio de una placa de microtítulo
Los análisis para pestes chupadoras (por ejemplo, áfidos) pueden involucrar separar el material de prueba del insecto por partición, idealmente una porción que pueda ser perforada por el insecto chupador, para permitir la ingestión del material de prueba A menudo el material de prueba se mezcla con un estimulante de alimentación, tal como sucrosa, para promover la ingestión del compuesto de prueba
Otros tipos de análisis pueden incluir la microinyeccion del material de prueba en la boca o
5 intestino de la peste, asi como desarrollar plantas transgénicas, seguido de la prueba de habilidad de la peste para alimentarse de la planta transgénica La prueba de plantas puede involucrar el aislamiento de las partes de la planta que normalmente se consumen, por ejemplo, pequeñas jaulas fijas a las hojas, o aislamiento de plantas entera en jaulas que contienen insectos
10 Otros métodos y acercamientos para analizar pestes se conocen en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo en Robertson y Preisler, eds (1992) Pesticide Bioassays with arthropods (CRC, Boca Ratón, FL) Alternativamente, los análisis se describen comúnmente en los diarios Arthropod Management Tests y Journal of Economic Entomology o por discusión con miembros de la Sociedad Entomológica de America (ESA) 15 Eiemplo 13 Actividad Insecticida de AXMI-036 en Lygus lineolans Los extractos de proteína libres de células se prepararon como sigue La cepa de Bacillus j que alberga pAX2567 creció en 25 ml de medio CYS por 9 días a 30°C Dieciocho ml de cultivo fueron entonces centrifugados a 8,600 xg por diez minutos y el sobrenadante fue eliminado La j 20 pastilla fue resuspendida en 20 ml de 20 mM Tris HCL en un pH de 8, centrifugada como
! anteriormente y el sobrenadante fue eliminado La pastilla lavada fue resuspendida en 18 ml de 50
I mM de regulador de carbonato de sodio (pH 10 5) que contenía 5 mM ditiotreitol, sonicada e
! incubada a temperatura ambiente por aproximadamente 1 5 horas La suspensión fue centrifugada como anteriormente y el sobrenadante pasó a través de un filtro de 2 µm El filtrado contenía I ! 25 aproximadamente 350 µg de protema AXMI-036 por ml
Los bioaná sis fueron desempeñados usando placas de microtítulo de múltiples pocilios como cámaras de alimentación La proteína insecticida o control se presentó al insecto en una solución contenida en paquetes formados por una doble capa de película parafilm (Pechiney Plástic Packaging, Chicago, IL) estampados en una plantilla y sellados con una membrana (Research Products Int Corp , Mt Prospect, IL) que el insecto puede perforar al alimentarse La hoja de película parafilm que contiene los paquetes se colocó sobre la placa después de que la 1 ra o 2da fase de ninfas Lygus es colocada en pocilios individuales con un pincel de punta fina La hoja de película de parafilm actúa como un sello que contiene el lygus dentro de un pocilio individual y también proporciona un sitio de alimentación La cámara de análisis resultante fue incubada a temperatura ambiente Las proteínas insecticidas fueron mezcladas a 1 1 con una dieta de lygus comercialmente disponible (Bio Serv, Frenchtown, NJ) y probadas en una concentración de 175 v?/µl
Tabla 3 Actividad Insecticida de AXMI-036 en Lygus lineolans
Eiemplo 14 Vectopzación de axm?-027. axm?-036 y axm?-038 para Expresión de Planta El ADN de la región de codificación de axm?-027, axm?-036 y axm?-038 está operativamente conectado con las secuencias de promotor y terminador apropiadas para expresión en plantas Dichas secuencias son bien conocidas en la técnica y pueden incluir el promotor de actina del arroz o el promotor de ubiquitina del maíz para expresión en monocots, el promotor Arabidopsis UBQ3 o promotor CaMV 35S para expresión en dicots y los terminadores nos o Pmll La técnicas de producción y confirmación de construcción promotor - gen - termmador también son bien conocidas en la técnica
Los cassettes de expresión de planta descritos anteriormente se combinan con un marcador selecaonable de planta apropiado para ayudar en las selecciones de células transformadas y tejidos y se ligan con vectores de transformación de planta Estos pueden incluir vectores binarios de transformación mediada por Agrobacterium o vectores plásmidos simples para aerosol o transformación biolística
Eiemplo 15 Transformación de Células de Maíz con axm?-027. axm?-036 y axm?-038 Las mazorcas de maíz se recolectan mejor 8-12 días después de la polinización Los embriones están aislados de las mazorcas y esos embriones de 0 8-1 5 mm de tamaño se prefieren para usarse en la transformación Los embriones se colocan con el escutelo hacia arriba en un medio de incubación apropiado, tal como medio DN62A5S (3 98 g/L Sales N6, 1 mL/L (de 1000x Reserva) Vitaminas N6, 800 mg/L L-Asparagina, 100 mg/L Myo-inositol, 1 4 g/L L-Prohna, 100 mg/L ácidos Casamino, 50 g/L sucrosa, 1 mL/L (de 1 mg/mL Reserva) 2,4-D) Sin embargo, medios y sales diferentes a DN62A5S son apropiados y conocidos en la técnica Los embriones son incubados durante la noche a 25°C en la oscuridad Sin embargo, no es necesario per se incubar los embriones durante la noche
Los explantes resultantes son transferidos a mallas cuadradas (30-40 por placa), transferidos a medios osmóticos por aproximadamente 30-45 minutos, luego transferidos a una placa de irradiación (ver, por ejemplo, Publicación PCT No WO/0138514 y Patente de EUA No 5,240,842)
Las construcciones de ADN diseñadas para expresar axm?-027, axm?-036 o axm?-038 en células de plantas son aceleradas en tejido de planta usando un acelerador de haz de aerosol, usando condiciones esencialmente como se describe en la Publicación PCT No WO/0138514 Después de la irradiación, los embriones son incubados por aproximadamente 30 minutos en medios osmóticos y colocados en medios de incubación durante la noche a 25°C en la oscuridad Para evitar explantes irradiados indebidamente dañados, son incubados por al menos 24 horas antes de la transferencia a medios de recuperación Los embriones son entonces esparcidos en medios de período de recuperación por aproximadamente 5 días a 25°C en la oscuridad, luego transferidos a medios de selección Los explantes son incubados en medios de selección por hasta ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y características de la selección particular utilizada Después del período de selección, los callos resultantes se transfieren a medios de maduración de embriones, hasta que la formación de embriones somáticos maduros se observa Los embriones somáticos maduros resultantes se colocan entonces bajo luz tenue y el proceso de regeneración se inicia por métodos conocidos en la técnica Los brotes resultantes se dejan arraigar en medios de arraigamiento y las plantas resultantes se transfieren a viveros en macetas y se propagan como plantas transgenicas
Materiales
Tabla 3 Medios DN62A5S
El pH de la solución se ajusta a un pH de 5 8 con 1 N KOH/1 N KCl, Gelpte (Sigma) se añade a una concentración de hasta 3 g/L y el medio es ajustado por autoclave Después de enfriar a 50°C, se añaden 2 ml/L de una solución de reserva de 5 m/g de nitrato de plata (Phytotechnology Labs)
Eiemplo 16 Transformación de axm?-027, axm?-036 y axm?-038 en Células de Planta por Transformación Mediada por Agrobactenum Las mazorcas se recolectan mejor 8-12 días después de la polinización Los embriones son aislados de las mazorcas y esos embriones de 0 8-1 5 mm de tamaño se prefieren para usarse en la transformación Los embriones se colocan con el escutelo hacia arriba en un medio de incubación apropiado y se incuban durante la noche a 25°C en la oscuridad Sin embargo, no es necesario per se incubar los embriones durante la noche Los embriones hacen contacto con una cepa de Agrobacterium que contiene los vectores apropiados para transferencia mediada por Ti plásmido por aproximadamente 5-10 minutos y luego son colocados en medios de co-cultivación por aproximadamente 3 días (25°C en la oscuridad) Después de la co-cultivación, los explantes son transferidos a medios de periodo de recuperación por aproximadamente cinco días (a 25°C en la oscuridad) Los explantes son incubados en medios de selección por hasta ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y características de la selección particular utilizada Después del período de selección, los callos resultantes se transfieren a medios de maduración de embriones, hasta que la formación de embriones somáticos maduros se observa Los embriones somáticos maduros resultantes son entonces colocados bajo luz tenue y el proceso de regeneración se inicia como es conocido en la técnica Los brotes resultantes se dejan arraigar en medios de arraigamiento y las plantas resultantes se transfieren a viveros en macetas y se propagan como plantas transgénicas
Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de experiencia de aquellos experimentados en la técnica a la cual esta invención pertenece Todas las publicaciones y solicitudes de patente están incorporadas en el presente documento como referencia en la misma extensión en que cada publicación individual o solicitud de patente fue especifica e individualmente indicada como incorporada por referencia
Aunque la invención anterior ha sido descrita en detalle por medio de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones pueden practicarse dentro del alcance de las reivindicaciones anexas