ES2294857T3

ES2294857T3 - Expresion mejorada de la proteina insecticida cry3b en plantas.

Info

Publication number: ES2294857T3
Application number: ES99942313T
Authority: ES
Inventors: Charles P. Romano
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 1998-08-19
Filing date: 1999-08-19
Publication date: 2008-04-01
Anticipated expiration: 2019-08-19
Also published as: CZ301915B6; DE69937459D1; BR9913690A; EP1698699A2; YU13501A; CN1334874A; BRPI9913690B1; ATE377080T1; ZA200100874B; EP2811024A1; AR075146A2; EP1121440B1; EP1104481B1; AU767146B2; AU5571699A; CA2340286C; CZ2001597A3; ME00085B; EP1698699B1; DK1121440T3

Abstract

Una composición de monómero biocompatible, que comprende: A. al menos un monómero que forma un polímero de cierre de heridas aceptable en medicina; B. al menos un agente plastificante presente en la composición en una cantidad de 0, 5% en peso a 16% en peso de la composición; C. al menos un agente estabilizante ácido que tiene una constante de ionización pKa de 0 a 7; y D. un iniciador seleccionado del grupo constituido por tensioactivos, imidazol, arginina, povidina, fosfinas, fosfito de trietilo, sales de fosfonio, galato de metilo, bisulfito de sodio, sulfato de calcio, silicato de sodio, tiourea, polisulfuros, monensina, nonactina, calixarenos, epóxidos polímeros, carbonatos, naftenato de cobalto, acetilacetonato de manganeso y catalizadores de transferencia de fase.

Description

Expresión mejorada de la proteína insecticida Cry3b en plantas.

1.0 Antecedentes de la invención 1.1 Campo de la invención

La presente invención da a conocer plantas transgénicas que expresan niveles sustancialmente más altos de \delta-endotoxina de Bacillus thuringiensis que controla insectos. Se describen procedimientos para obtener tales plantas y composiciones, y procedimientos para usar tales plantas y composiciones. También se dan a conocer casetes de polinucleótidos mejorados que contienen las secuencias codificantes proteicas preferidas que confieren los niveles sustancialmente más altos de \delta-endotoxinas que controlan insectos.

En particular, el maíz transgénico que expresa niveles más altos de una proteína diseñada para mostrar una toxicidad aumentada hacia plagas de coleópteros, proporciona niveles superiores de protección contra insectos y es menos probable que promueva el desarrollo de poblaciones de insectos diana que son resistentes a la proteína activa frente a insectos.

1.2 Descripción de la técnica relacionada

Casi todos los cultivos extensivos, plantas y zonas de agricultura comercial pueden sufrir el ataque de una o más plagas de insectos. Particularmente problemáticas son las plagas de coleópteros y lepidópteros. Debido a que los cultivos de interés comercial son con frecuencia el objetivo del ataque de insectos, se desean procedimientos que respeten el medio ambiente para controlar o erradicar la infestación por insectos. Esto es particularmente cierto para agricultores, encargados de viveros, cultivadores y zonas residenciales y comerciales que tratan de controlar las poblaciones de insectos usando composiciones ecológicamente respetuosas.

Las formulaciones insecticidas que respetan el medio ambiente más ampliamente usadas desarrolladas en los últimos años se han compuesto de pesticidas de proteínas microbianas de la bacteria Bacillus thuringiensis, una bacteria Gram-positiva que produce proteínas cristal o cuerpos de inclusión que son específicamente tóxicos frente a determinados órdenes y especies de insectos. Se han identificados muchas cepas diferentes de B. thuringiensis que producen una o más proteínas cristal insecticidas así como otras proteínas que no forman cristales insecticidas. Las composiciones que incluyen cepas de B. thuringiensis que producen proteínas insecticidas han estado comercialmente disponibles y se han usado como insecticidas aceptables para el medio ambiente debido a que son bastante tóxicas frente a plagas de insectos diana específicas, pero son inocuas para las plantas y para los animales vertebrados e invertebrados. De manera más importante, debido a que estas proteínas que controlan insectos han de ingerirse por las plagas de insectos diana sensibles con el fin de ejercer sus efectos tóxicos o insecticidas, la aplicación acertada de tales composiciones de proteínas limita o previene la exposición significativa a las proteínas de los miembros de insectos no diana del orden sensible que también pueden ser sensibles a la composición (por ejemplo, especies de lepidópteros no diana, en las que se usa la proteína cristal de B.t. específica de lepidópteros en una formulación insecticida). Adicionalmente, se ha demostrado que insectos de diversos órdenes carecen totalmente de sensibilidad a proteínas insecticidas dirigidas específicamente, aun cuando se ingieren en grandes cantidades.

1.2.1\delta-Endotoxinas

Las \delta-endotoxinas se usan para controlar una amplia gama de escarabajos y orugas que se alimentan de plantas, así como mosquitos. Estas proteínas, también denominadas proteínas cristal insecticidas, proteínas cristal, y toxinas de Bt, representan una gran colección de proteínas insecticidas producidas por B. thuringiensis que son tóxicas tras la ingestión por un huésped de insecto sensible. Durante la pasada década, la investigación sobre la estructura y la función de las toxinas de B. thuringiensis ha cubierto todas las categorías de toxinas principales, y mientras que estas toxinas difieren en la estructura y función específicas, se asumen similitudes generales en la estructura y la función. Una recapitulación reciente describe la genética, bioquímica y biología molecular de las toxinas de Bt (Schnepf et al., Bacillus thuringiensis and its Pesticidal Crystal Proteins, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806, 1998). Basándose en el conocimiento acumulado de las toxinas de B. thuringiensis, se ha creado un modo de acción generalizado para las toxinas de B. thuringiensis e incluye: ingestión por el insecto, solubilización en el intestino medio del insecto (una combinación del estómago y el intestino delgado), resistencia a las enzimas digestivas algunas veces con digestión parcial mediante proteasas específicas del intestino que catalizan específicamente una escisión en un sitio peptídico dentro de una estructura de protoxina que "activa" la toxina, la unión de la toxina al borde en cepillo de las células del intestino medio, la formación de un poro en la célula del intestino medio del insecto y la alteración de la homeostasis celular (English and Slatin, 1992).

1.2.2 Genes que codifican proteínas cristal

Muchas de las \delta-endotoxinas están relacionadas en diversos grados mediante similitudes en sus secuencias de aminoácidos. Históricamente, las proteínas y los genes que las codifican se clasificaron basándose en gran parte en su espectro de actividad insecticida. Una recapitulación de Höfte y Whiteley (1989) trata de los genes y las proteínas que se identificaron en B. thuringiensis antes de 1990, y expone la nomenclatura y el esquema de clasificación que se ha aplicado tradicionalmente a las proteínas y los genes de B. thuringiensis. La nomenclatura original se aprovechó del descubrimiento de que las pocas proteínas Cry de Bt conocidas en ese momento se clasificaban en un número limitado de clases, en el que cada clase representaba proteínas que tenían una especificidad por órdenes específicos de insectos. Por ejemplo, los genes cry1 codificaban proteínas Cry1 tóxicas para lepidópteros. Los genes cry2 codificaban proteínas Cry2 que generalmente eran tóxicas tanto para lepidópteros como para dípteros. Los genes cry3 codificaban proteínas Cry3 tóxicas para coleópteros, mientras que los genes cry4 codificaban proteínas Cry4 tóxicas específicas para dípteros. La nomenclatura ha llegado a ser, durante la pasada década o más, bastante confusa con el descubrimiento de clases más vagamente relacionadas de proteínas de Bt insecticidas. Más recientemente, se ha adoptado una nomenclatura homogénea simplificada y una base para las clasificaciones de las proteínas de Bt y se ha recapitulado por Schnepf et al. (1998). Schnepf et al. (1998) proporcionan también una solución estructural para un cristal Cry1. En el presente documento se adoptará esta nomenclatura simplificada. En el presente documento se respetará también el convenio para identificar genes de Bt con letras en minúscula, en cursiva (por ejemplo, cry1Ab1) e identificar las proteínas de Bt con el primer carácter en mayúscula (por ejemplo, Cry1Ab1).

Basándose en el grado de similitud de secuencia, las proteínas se han clasificado adicionalmente en subfamilias. Se asignó a las proteínas que parecían estar más estrechamente relacionadas letras divisionarias tales como Cry1A, Cry1B, Cry1C, etc. Se dio a las proteínas incluso más estrechamente relacionadas dentro de cada división, nombres tales como Cry1Ca, Cry1Cb, etc., y las proteínas incluso todavía más estrechamente relacionadas se designaron con nombres tales como Cry1Bb1, Cry1Bb2, etc.

La nomenclatura moderna clasifica sistemáticamente las proteínas Cry basándose en la homología de secuencia de aminoácidos en vez de en las especificidades diana de los insectos. El esquema de clasificación para muchas toxinas conocidas, sin incluir las variaciones alélicas en proteínas individuales, se resume en tablas actualizadas regularmente que pueden obtenerse de Dr. Neil Crickmore en http://epunix.biols.susx.ac.uk/Home/NeilCrickmore/Bt/index.html.

1.2.3 Composiciones polipeptídicas bioinsecticidas

La utilidad de las proteínas cristal bacterianas como insecticidas se extendió más allá de las larvas de lepidópteros y dípteros cuando se notificó el primer aislamiento de una cepa de B. thuringiensis tóxica para coleópteros (Krieg et al., 1983; 1984). Se notificó que esta cepa (descrita en la patente estadounidense 4.766.203, incorporada específicamente al presente documento como referencia), designada var. tenebrionis de B. thuringiensis, era tóxica para las larvas de los insectos coleópteros Agelastica alni (crisomela del aliso azul) y Leptinotarsa decemlineata (escarabajo de la patata de Colorado).

La patente estadounidense 5.024.837 describe también cepas de la var. kurstaki de B. thuringiensis híbrido que mostraban actividad contra insectos lepidópteros. La patente estadounidense 4.797.279 (correspondiente al documento EP 0221024) da a conocer un B. thuringiensis híbrido que contiene un plásmido de la var. kurstaki de B. thuringiensis que codifica un gen que codifica la proteína cristal tóxica para lepidópteros y, un plásmido de B. thuringiensis tenebrionis que codifica un gen que codifica la proteína cristal tóxica para coleópteros. La cepa de B. thuringiensis híbrido produce proteínas cristal características de las producidas mediante tanto B. thuringiensis kurstaki como B. thuringiensis tenebrionis. La patente estadounidense 4.910.016 (correspondiente al documento EP 0303379) da a conocer un aislado de B. thuringiensis identificado como B. thuringiensis MT 104, que tiene actividad insecticida contra coleópteros y lepidópteros. Más recientemente, Osman et al. dieron a conocer un aislado de Bacillus thuringiensis natural que mostraba actividad contra al menos dos órdenes de insectos y contra nematodos (documento WO 98/30700).

Durante más de dos décadas se ha sabido que las composiciones que comprenden proteínas insecticidas de Bt son eficaces para proporcionar protección frente a la infestación por insectos a las plantas tratadas con tales composiciones. Más recientemente, las técnicas de genética molecular han permitido la expresión de proteínas insecticidas de Bt a partir de secuencias de nucleótidos insertadas de manera estable en genomas de plantas (Perlak et al., Brown & Santino, etc.). Sin embargo, la expresión de transgenes en las plantas ha proporcionado una vía para el aumento de la resistencia de los insectos frente a los Bt producidos en plantas, ya que no se ha demostrado que las plantas produzcan altos niveles de proteínas insecticidas. Inicialmente se creyó que las diferencias en la topología o morfología macroscópica de la arquitectura y estructura génica entre los sistemas de bacterias y de plantas era la limitación que evitaba la sobreexpresión de los transgenes de Bt en las plantas. Estas diferencias se superaron aparentemente tal como se describe por Perlak et al. (patente estadounidense número 5.500.365) y por Brown et al. (patente estadounidense números 5.424.412 y 5.689.052), en las que se demostró que, los transgenes que codifican la proteína insecticida de Bt que contenía los codones preferidos de las plantas, mejoraban los niveles de expresión. Como alternativa, el truncamiento del dominio que codifica protoxina para dar el dominio más corto que codifica el péptido que todavía codificaba una proteína insecticida, se consideró también suficiente para superar la limitación de niveles de expresión extremadamente bajos del transgén que codifica Bt in planta. Los niveles de expresión de proteínas de Bt in planta a partir de transgenes ha variado de manera ampliamente independiente de los medios usados para la expresión y, los niveles de proteína acumulada han oscilado desde casi indetectables hasta 2 partes por millón hasta aproximadamente de 20 a 30 partes por millón. Sin embargo, aun cuando todos estos enfoques proporcionaban niveles mejorados de acumulación de proteína de Bt en las plantas, ninguno proporcionaba niveles de expresión que pudieran garantizar que la resistencia de los insectos no llegaría a ser un problema sin necesidad de coordinar la expresión de una o más toxinas insecticidas adicionales por la planta transgénica, o como alternativa, sin la aplicación tópica coordinada de composiciones químicas insecticidas o de Bt complementarias adicionales.

Durante algún tiempo se ha entendido la importancia de la acumulación de niveles más altos de toxina de Bt para evitar la resistencia de los insectos a las toxinas de Bt individuales. Diversos estudios de laboratorio, en los que se aplicó la selección contra Bt durante varias generaciones de insectos, han confirmado que rara vez se obtiene la resistencia contra las proteínas insecticidas de Bt. Debe hacerse hincapié en que las condiciones del laboratorio representan condiciones de presión de selección bastante bajas pero constantes, permitiendo la supervivencia de una subpoblación de insectos que se han sometido a presión de insecticida y que producen las posteriores generaciones de insectos. Las generaciones subsiguientes se mantienen también en medios que contienen concentraciones bajas pero constantes de la proteína insecticida. Generalmente, las concentraciones usadas para las presiones de selección oscilan desde CL40 hasta aproximadamente CL60 más o menos, sin embargo, se han sometido a prueba también concentraciones de CL95 para determinar el desarrollo de la resistencia. En la mayoría de los casos, la resistencia se adquiere lentamente, generalmente desarrollándose en el plazo de razonablemente pocas generaciones, por ejemplo 10-50 generaciones. Sin embargo, no se observa tal resistencia cuando se usan niveles sustancialmente más altos de toxina, o en situaciones en las que se proporcionan múltiples toxinas.

En la actualidad, las plantas recombinantes que expresan niveles comercialmente útiles de la proteína insecticida de Bt contienen generalmente sólo un gen que codifica una única clase de Bt. Se prevé que tales plantas tendrán una duración de uso muy limitada por dos razones. En primer lugar, estas plantas están expresando niveles insuficientes de la proteína insecticida para garantizar que todos los insectos diana expuestos a y que se alimentan de los tejidos de la planta sucumbirán debido a la dosis de toxina ingerida. En segundo lugar, debido a los niveles insuficientes de proteína insecticida, se aumenta excesivamente el potencial para el desarrollo de la resistencia. Esto no quiere decir que el nivel de toxina producida por tales plantas transgénicas sea insuficiente para ser eficaz. Esto representa simplemente las limitaciones de la expresión de las \delta-endotoxinas in planta aun cuando se usan secuencias que codifican \delta-endotoxina de Bt que se han modificado para ajustarse a las secuencias preferidas de las plantas. Una limitación que se ha observado para muchas secuencias que codifican \delta-endotoxina de Bt modificadas para la expresión en plantas es que ha sido imposible predecir qué \delta-endotoxina de Bt sería eficaz para la expresión en plantas. (Por ejemplo, la expresión de Cry2Aa en algodoneros da como resultado una fitotoxicidad cuando se dirige al cloroplasto, sin embargo la expresión de una secuencia de cry2Ab estrechamente relacionada no es fitotóxica cuando se dirige al cloroplasto. (Corbin et al., solicitud de patente estadounidense, número de serie 09/186.002). Aun así, los niveles de proteína \delta-endotoxina producida en las plantas no son suficientes para ser eficaces contra todas las especies de insectos diana deseadas que se sabe que son sensibles a una clase y a un tipo dados de \delta-endotoxina.

Tal como se indicó anteriormente, los enfoques alternativos al desarrollo de la resistencia frente a proteínas insecticidas han incluido intentos ineficaces para aumentar los niveles de expresión de transgenes en plantas. Como alternativa, podrían producirse mediante ingeniería genética genes insecticidas adicionales en plantas, de modo que se expresen de manera coordinada múltiples toxinas. Esto proporcionaría un medio más eficaz para retrasar la aparición de la resistencia a una combinación cualquiera de los Bt, sin embargo, esto no supera todavía la limitación de niveles insuficientes de proteína insecticida que se acumula en la(s) planta(s) recombinante(s). Una alternativa adicional a los niveles de expresión insuficientes, ha sido producir mediante ingeniería genética genes que codifican proteínas cristal insecticidas de Bt que demuestran propiedades insecticidas mejoradas, que tienen una variedad más amplia de huéspedes o bien una actividad biológica aumentada, que, posiblemente podría dar como resultado necesitar menos cantidad de la proteína recombinante para controlar una especie de insecto diana que la que se requería de la forma nativa de la proteína.

La combinación de los análisis estructurales de las toxinas de B. thuringiensis seguido de una investigación de la función de tales estructuras, motivos y similares, ha enseñado que regiones específicas de las endotoxinas de proteína cristal son, de manera general, responsables de funciones particulares.

Se ha descubierto que el dominio 1, por ejemplo, de Cry3Bb y Cry1Ac es responsable de la actividad de los canales iónicos, la etapa inicial en la formación de un poro (Walters et al., 1993; Von Tersch et al., 1994). Se ha descubierto que los dominios 2 y 3 son responsables de la unión del receptor y de la especificidad insecticida (Aronson et al., 1995; Caramori et al., 1991; Chen et al. 1993; de Maagd et al., 1996; Ge et al., 1991; Lee et al., 1992; Lee et al., 1995; Lu et al., 1994; Smedley y Ellar, 1996; Smith y Ellar, 1994; Rajamohan et al., 1995; Rajamohan et al., 1996; Wu y Dean, 1996). Las regiones en el dominio 2 y 3 pueden también tener un impacto sobre la actividad de los canales iónicos de algunas toxinas (Chen et al., 1993, Wolfersberger et al., 1996; Von Tersch et al., 1994).

Desgraciadamente, aunque muchos investigadores lo han intentado, pocos han conseguido producir proteínas cristal mutadas con una toxicidad insecticida mejorada. En casi todos los ejemplos de toxinas de B. thuringiensis modificado mediante ingeniería genética de la bibliografía, la actividad biológica de la proteína cristal mutada no es mejor que la de la proteína de tipo natural, y, en muchos casos, la actividad se disminuye o destruye totalmente (Almond y Dean, 1993; Aronson et al., 1995; Chen et al., 1993, Chen et al., 1995; Ge et al., 1991; Kwak et al., 1995; Lu et al., 1994; Rajamohan et al., 1995; Rajamohan et al., 1996; Smedley y Ellar, 1996; Smith y Ellar, 1994; Wolfersberger et al., 1996; Wu y Aronson, 1992). Sin embargo, Van Rie et al. han logrado recientemente la mejora de una \delta-endotoxina de Cry3A que tiene una actividad insecticida frente a coleópteros aumentada identificando un mutante individual que tiene una actividad insecticida aumentada. Van Rie et al. proponen un procedimiento para identificar mutantes que tienen una actividad insecticida aumentada en el que el método consiste en identificar mutaciones de aminoácidos que disminuyen la actividad insecticida, y alteran de manera selectiva esos restos mediante mutagénesis dirigida al sitio, para incorporar uno o más de los 20 aminoácidos que se producen de manera natural en esas posiciones, y administrando las diversas formas de la proteína alterada resultante a gusanos de la raíz del maíz del oeste y del norte (Diabrotica virgifera, Diabrotica longicornis) para identificar los que tienen una actividad mejorada (patente estadounidense 5.659.123). Aunque no se facilitó ninguna secuencia usando el procedimiento, tal como se mencionó anteriormente, Van Rie et al. consiguieron identificar sólo una secuencia que tenía una actividad aumentada y no demostraron un aumento en la expresión de la forma mutante en comparación con la secuencia nativa.

Para una proteína cristal que tiene aproximadamente 650 aminoácidos en la secuencia de su toxina activa y la posibilidad de 20 aminoácidos diferentes en cada posición de esta secuencia, la probabilidad de crear arbitrariamente una nueva estructura de éxito es remota, aun cuando puede asignarse una función general a un tramo de 250-300 aminoácidos. De hecho, la anterior técnica anterior con respecto a la mutagénesis de gen de proteína cristal, se ha se ha ocupado principalmente de estudiar la estructura y la función de las proteínas cristal, usando la mutagénesis para alterar alguna etapa del modo de acción, en lugar de producir mediante ingeniería genética toxinas mejoradas.

En conjunto, los éxitos limitados en la técnica para desarrollar toxinas que no se producen de forma natural con actividad insecticida mejorada, han contenido el progreso en esta área y frustrado la investigación para desarrollar proteínas cristal o toxinas mejoradas. En lugar de seguir normas simples y predecibles, la ingeniería genética exitosa de una proteína cristal mejorada puede implicar diferentes estrategias, dependiendo de la proteína cristal que se está mejorando y de la plaga de insectos que a la que se está dirigiendo. Así, el procedimiento es sumamente empírico.

Por consiguiente, la tecnología de ADN recombinante tradicional claramente no es experimentación de rutina para proporcionar proteínas cristal insecticidas mejoradas. Lo que ha faltado en la técnica anterior son procedimientos racionales de producción de proteínas cristal de B. thuringiensis producidas mediante ingeniería genética que tienen una actividad insecticida mejorada y, en particular, una toxicidad mejorada hacia una amplia variedad de plagas de insectos lepidópteros, coleópteros o dípteros. Procedimientos y composiciones que se refieren a estos aspectos se dan a conocer en los documentos WO 99/31248 (que reivindica la prioridad de la solicitud de patente estadounidense número 08/993.170 (18 de diciembre de 1997; English et al.); 08/993.722 (18 de diciembre de 1997, English et al); 08/993.755 (18 de diciembre de 1997, English et al); y 08/996.441 (18 de diciembre de 1997, English et al.)) y en Van Rie et al. (patente estadounidense 5.659.123, 1 de junio de 1999). Además, las \delta-endotoxinas mejoradas de manera recombinante continúan expresándose mal y/o producen efectos fitotóxicos cuando se expresan en plantas, conduciendo así a la recuperación de menos acontecimientos transgénicos comercialmente útiles.

2.0 Sumario de la invención

En el presente documento se describen composiciones y procedimientos novedosos para expresar en plantas transformadas \delta-endotoxinas de B. thuringiensis variante Cry3 que tienen una actividad inhibidora frente a coleópteros significativa. Estas composiciones y procedimientos dan como resultado de manera ventajosa plantas que expresan \delta-endotoxinasCry3 de B. thuringiensis a niveles aumentados no observados anteriormente para las \delta-endotoxinas Cry. Los niveles aumentados de expresión de la \delta-endotoxina Cry3 se reflejan en la consecución de niveles de expresión máxima más altos en acontecimientos de inserción transgénica individuales. Inesperadamente, las composiciones particulares descritas en el presente documento, dan como resultado la recuperación de un porcentaje aumentado de acontecimientos transgénicos que manifiestan niveles de expresión que exceden con mucho los niveles umbral de expresión necesarios para el control de insectos coleópteros y que proporcionan niveles de toxina suficientes que pueden soportar una estrategia de manejo de la resistencia. Ya que las \delta-endotoxinas Cry3 son normalmente menos potentes que otras \delta-endotoxinas usadas comúnmente para controlar plagas diana de lepidópteros o de dípteros cuando se expresan en plantas transgénicas, la consecución de niveles máximos más altos de expresión de \delta-endotoxina Cry3 y la recuperación de más acontecimientos transgénicos con niveles de expresión eficaces son ambas críticas para aislar acontecimientos transgénicos que expresan \delta-endotoxina Cry3 que exhibe niveles comercialmente útiles del control de insectos diana.

Otra limitación de la técnica anterior referida por la presente invención es el desarrollo de la resistencia de los insectos frente a las \delta-endotoxinas proporcionadas por la expresión de la planta. Específicamente, la presente invención proporciona una estrategia superior para el retraso o la eliminación del desarrollo de la resistencia frente a las \delta-endotoxinas Cry3 a través de la acumulación mejorada de la \delta-endotoxina dentro de células vegetales de modo que los niveles de la \delta-endotoxina se mantienen in planta por encima de nivel umbral de proteína, medido normalmente en partes por millón (ppm). La expresión mejorada de las \delta-endotoxinas, que debe considerarse también que significa la expresión aumentada en vista de lo que se ha observado previamente en la técnica, se cree que da como resultado la aparición retardada de la resistencia de los insectos, y así extiende la utilidad de las \delta-endotoxinas expresadas por la planta como agentes de control de insectos.

Se descubrió una proteína \delta-endotoxina Cry3B novedosa, que tiene la secuencia de SEC ID NO: 10, que muestra una actividad insecticida particularmente eficaz dirigida hacia el control de especies de insectos de plagas de coleópteros (a continuación en el presente documento denominado brevemente proteína \delta-endotoxina de la presente invención).

La invención proporciona así:

(1) una secuencia de nucleótidos que tiene la secuencia de SEC ID NO: 9 (que codifica la proteína \delta-endotoxina Cry3B novedosa mencionada anteriormente);

(2) un casete de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos tal como se definió en (1) anteriormente;

(3) un vector que comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1 y/o el casete de expresión tal como se definió en (2) anteriormente;

(4) una célula transformada que comprende la secuencia de nucleótidos de (1) anterior y/o el casete de expresión tal como se definió en (2) anteriormente;

(5) una planta o semilla de planta que comprende la secuencia de nucleótidos de (1) anterior y/o el casete de expresión tal como se definió en (2) anteriormente;

(6) un procedimiento de producción de una célula transformada, que comprende introducir la secuencia de nucleótidos de (1) anterior y/o el casete de expresión de (2) anterior en una célula, en el que la célula es una célula vegetal o una célula microbiana;

(7) un procedimiento de producción de una planta de maíz transformada, que comprende las etapas de:

introducir la secuencia de nucleótidos de (1) anterior y/o el casete de expresión de (2) anterior en una célula de planta de maíz;

seleccionar una célula de planta de maíz transformada; y

regenerar una planta de maíz a partir de la célula de planta de maíz transformada, en el que la planta de maíz comprende la secuencia de nucleótidos de (1) anterior y/o el casete de expresión de (2) anterior; y

(8) un procedimiento de control de la infestación por insectos coleópteros en un campo de plantas de cultivo, que comprende proporcionar al insecto coleóptero una planta transgénica sobre la que se alimenta el insecto coleóptero, en el que dicha planta transgénica es la planta de (5) anterior.

La proteína \delta-endotoxina mencionada anteriormente de la presente invención se proporciona mediante la expresión de secuencias de polinucleótidos o ADN aislados, purificados y mejorados o potenciados, comprendiendo cada uno una secuencia codificante de \delta-endotoxina Cry3 situada bajo el control de los elementos de expresión génica funcional de la planta preferidos, tales como un promotor, una secuencia líder no traducida, un intrón y una secuencia de terminación de la transcripción y de poliadenilación. Algunas secuencias de polinucleótidos o ADN preferidos pueden proporcionar también secuencias proteicas que se dirigen a plástidos o cloroplastos. Los constructos de ADN preferidos de la presente invención incluyen aquellos constructos que codifican \delta-endotoxinas Cry3 que muestran una actividad de control de coleópteros o de inhibición de coleópteros. En una realización ilustrativa, se unen secuencias de polinucleótidos en un casete de expresión para la introducción en el ADN genómico de la planta, en la que el casete de expresión comprende una secuencia codificante de la variante de \delta-endotoxina Cry3Bb operativamente unida a una secuencia que comprende un promotor, una secuencia líder no traducida, un intrón y una secuencia de terminación de la transcripción y de poliadenilación. En particular, un transgén localizado dentro de la secuencia de polinucleótidos o casete de expresión de polinucleótidos operable de la planta, que comprende un casete de expresión que se compone de elementos genéticos que funcionan en células vegetales para expresar una proteína deseada a partir de una secuencia codificante de ácido nucleico (el transgén) que se localiza operativamente dentro de dicho casete de expresión. La secuencia codificante está unida en el sentido de 5' al menos a una secuencia promotora, una secuencia líder no traducida (UTL), una secuencia de intrón, y en marco de determinadas realizaciones indicadas, a una secuencia que codifica un péptido que se dirige a plástidos o cloroplastos. La secuencia codificante está unida también en el sentido de 3' al menos a una secuencia de terminación de la transcripción y de poliadenilación funcional de la planta. En el presente documento se muestra que las secuencias de polinucleótidos que comprenden un casete de expresión de este tipo mejoran la expresión de la proteína deseada codificada a partir del interior del casete, mejoran el número de acontecimientos obtenidos a partir del uso de la secuencia de polinucleótidos en la transformación de la planta, en las que dicho número mejorado de acontecimientos contiene el transgén deseado localizado dentro del casete de expresión y muestran niveles de expresión mejorados de una o más proteínas deseadas. Se observa también sorprendentemente que el número mejorado de acontecimientos expresa la proteína deseada a niveles por encima de 2 a 5 partes por millón, pero en general por debajo de 200 a 500 partes por millón de proteína celular total. Incluso más sorprendentes fueron algunos acontecimientos, en particular que expresaban la proteína deseada a niveles bastante por encima de 500 ppm. La invención proporciona particularmente:

una secuencia de nucleótidos que codifica una \delta-endotoxina de variante Cry3Bb que comprende la SEC ID NO: 9 aislada y purificada, desde NcoI hasta EcoRI tal como se expone en la figura 1 que ilustra el plásmido pMON25096.

La invención proporciona plantas transgénicas que se han transformado con un casete de expresión o constructo de ADN de la presente invención que se expresa y traduce a niveles inesperadamente altos por la planta que da como resultado niveles sorprendentemente altos de acumulación de \delta-endotoxina. Las plantas monocotiledóneas pueden transformarse según los procedimientos y con los constructos de ADN descritos en el presente documento. Sin embargo, se prevé también que las plantas dicotiledóneas podrían transformarse también con las secuencias de ADN descritas en el presente documento por un experto en la técnica, con el fin de obtener plantas transgénicas que proporcionen niveles inesperadamente útiles de resistencia de los insectos, sin el riesgo de desarrollo de resistencia de los insectos a la \delta-endotoxina. La planta transformada por la presente invención puede prepararse, en otra realización preferida, mediante un procedimiento que incluye la obtención del constructo de ADN aislado y purificado contenido dentro del casete de expresión, y transformando luego la planta con el constructo, de modo que la planta expresa la proteína que el constructo codifica. Como alternativa, la planta transformada mediante la presente invención puede prepararse, en otra realización preferida, mediante un procedimiento que incluye la introducción del constructo de ADN aislado y purificado en una cepa de Agrobacterium competente de transformación, y transformando luego la planta con la cepa de Agrobacterium que contiene el constructo, de modo que la planta expresa las proteínas que el constructo codifica. En el presente documento se ha observado que la transformación de plantas mediante las composiciones y procedimientos dados a conocer da como resultado sorprendentemente, frecuencias aumentadas de transformantes que muestran expresión transgénica, así como la recuperación de acontecimientos transgénicos individuales que muestran niveles absolutos inesperadamente más altos de expresión de transgén.

Se contempla que los niveles de expresión aumentados observados en la invención dada a conocer, permitirán el desarrollo reducido de la resistencia de los insectos a las \delta-endotoxinas de Bt a las que se exponen las plagas de insectos diana. Esto puede lograrse transformando una planta con el constructo de ADN preferido para lograr tasas altas de expresión de Cry3 solo, o exponiendo simultáneamente los insectos diana a las \delta-endotoxinas Cry3 descritas junto con otras composiciones eficaces para controlar especies de coleópteros tales como variantes de Cry3B (English et al., documento WO 99/31248), variante Cry3A o variante Cry3D (patente estadounidense 5.659.123), CryET33 y CryET34 (Donovan et al., documento WO 97/17600), CryET70 (solicitud estadounidense, número de serie 09/184.748; Mettus et al., 2 de noviembre de 1998), Cry6A, Cry6B, Cry8B (patente estadounidense número 5.277.905), CryET29 (Rupar et al., documento WO 97/21587), lípido acilhidrolasas insecticidas, combinaciones de aminoácido oxidasas y tedanalactama sintasas (Romano et al., solicitud estadounidense, número de serie 09/063.733, presentado el 21 de abril de 1998), o proteínas insecticidas tales como VIP1 (Gay, documento WO 97/26339; Gourlet et al., documento WO 98/02453) y VIP3 (Estruch et al., patente estadounidense número 5.877.012; 1999) entre otros. Los insectos diana sensibles incluyen Diabroticus spp., gusano alambre en Zea mays y Leptinotarsa decemlineata (Say) en Solanum tuberosum y, gorgojo en especies de Gossypium (algodón).

Por tanto, se contempla que las composiciones y procedimientos descritos por la presente invención proporcionarán muchas ventajas sobre la técnica anterior, incluyendo las específicamente resumidas anteriormente. Otras ventajas incluyen el control mejorado de plagas de insectos diana sensibles y lograr la protección durante la temporada frente a patógenos de insectos. Otra ventaja de la presente invención proporciona la reducción del número de acontecimientos transgénicos que han de examinarse con el fin de identificar uno que contenga niveles beneficiosos de una o más composiciones que controlan insectos. La presente invención engloba también células transformadas con los constructos de ADN dados a conocer en el presente documento. También se contemplan vectores de transformación, tales como plásmidos, bácmidos, cromosomas artificiales, vectores virales y similares, como elementos para su uso para suministrar las composiciones de nucleótidos de la presente invención en las células contempladas, con el fin de obtener células huésped transformadas, tanto procariotas como eucariotas, que expresan las proteínas \delta-endotoxina codificadas por el constructo de ADN novedoso dado a conocer en el presente documento. Se contempla además que, en algunos casos, se aumentará el genoma de una planta transgénica de la presente invención a través de la integración estable de un casete de expresión que codifica una \delta-endotoxina de B. thuringiensis de control o inhibición de coleópteros, o variantes de la misma, tal como se describe en el presente documento. Además, se incorporará más de un transgén que codifica una composición insecticida al genoma nuclear, o como alternativa, al genoma del plástido o del cloroplasto de la célula vegetal huésped transformada. Se prevé que se incorporará más de un polinucleótido que codifica una proteína cristal insecticida en el genoma de una célula vegetal, y puede ser deseable tener dos o incluso más secuencias que codifiquen proteínas insecticidas u otras proteínas beneficiosas de la planta en las secuencias de nucleótidos contenidas dentro de la célula. Tales proteínas derivadas de manera recombinante, pueden existir como precursores, protoxinas o como fusiones de proteínas beneficiosas unidas mediante secuencias conectoras de aminoácidos flexibles o mediante secuencias de escisión específicas de proteasas muy conocidos en la técnica. También se prevén quimeras que comprenden fusiones de proteínas insecticidas. La descendencia de las células huésped de plantas transgénicas puede manipularse artificialmente para producir plantas recombinantes completas que muestran propiedades insecticidas mejoradas, y en el presente documento se muestra que las secuencias de nucleótidos recombinantes son hereditarias. La heredabilidad de los elementos es un aspecto preferido de esta invención, de modo que los elementos de expresión puede suministrarse a los descendientes lineales de la célula vegetal huésped transformada original, originando en primer lugar una planta transformada de manera estable cuyas células constituyentes expresan el transgén deseado, aunque puede manipularse selectivamente la expresión específica de tejidos, generalmente a través de la elección del promotor operable de la planta seleccionado para su uso en un casete de expresión dado, tal como se describió anteriormente. Las plantas transformadas originan semillas que contienen el casete de expresión hereditario, y así, las semillas originan plantas de manera lineal que contienen el casete de expresión, generalmente de manera mendeliana, particularmente cuando se autopolinizan según procedimientos muy conocidos en la técnica.

3.0 Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra el plásmido pMON25096.

La figura 2 ilustra el plásmido pMON33741.

La figura 3 ilustra el plásmido pMON25097.

La figura 4 ilustra el plásmido pMON33748.

La figura 5 ilustra la traducción de la secuencia de aminoácidos y nucleótidos de una proteína insecticida de variante Cry3Bb.11098 tal como se muestra en la SEC ID NO: 9.

La figura 6 ilustra la traducción de la secuencia de aminoácidos y nucleótidos de una proteína insecticida de variante Cry3Bb.11231 tal como se muestra en la SEC ID NO: 11.

4.0 Descripción detallada de la invención

La siguiente descripción detallada se proporciona para ayudar a los expertos en la técnica a llevar a la práctica la presente invención.

4.1 Definiciones

Las siguientes palabras y frases tienen los significados se que exponen a continuación.

Equivalentes funcionales biológicos. Tal como se usa en el presente documento, tales equivalentes, con respecto a las proteínas insecticidas de la presente invención, son péptidos, polipéptidos y proteínas que contienen una secuencia o resto que muestra similitud de secuencia con respecto a los péptidos novedosos de la presente invención, tales como Cry3Bb.11231, y que muestran propiedades funcionales iguales o similares que las de los polipéptidos dados a conocer en el presente documento, incluyendo la actividad insecticida. Los equivalentes biológicos incluyen también péptidos, polipéptidos y proteínas que reaccionan con, es decir, se unen específicamente a anticuerpos surgidos contra Cry3Bb y que muestran la actividad insecticida igual o similar, incluyendo anticuerpos tanto monoclonales como
policlonales.

Combatir o controlar el daño de los insectos en un contexto agrícola, se refiere a la reducción del daño en las unidades relativas con respecto a una parte de la planta o del cultivo producido por la infestación de una plaga de insectos. Más generalmente, esta frase se refiere a la reducción de los efectos adversos producidos por la presencia de un insecto no deseado en cualquier ubicación en particular.

Acontecimiento se refiere a una planta transgénica derivada de una de las siguientes:

1. la inserción de ADN foráneo en uno o más sitios únicos del ADN genómico nuclear;

2. la inserción de ADN foráneo en uno o más sitios únicos del genoma de plástido, cloroplasto o mitocondria;

3. la introducción de un vector estable, hereditario, epigenético en el citoplasma de un plástido, cloroplasto o mitocondria; o

4. una combinación de cualquiera de los procedimientos anteriores.

Los acontecimientos derivados de estos procedimientos contienen un casete de expresión que expresa una secuencia codificante deseada, tal como se describe en el presente documento. Los acontecimientos se denominan también ATI (acontecimientos de transformación independiente).

Expresión: la combinación de procesos intracelulares, incluyendo transcripción, traducción y otras funciones de estabilización y procesamiento del ARN y otras proteínas intracelulares, experimentadas por una secuencia codificante de ácido nucleico controlada por secuencias genéticas que funcionan en células vegetales para lograr la producción de un producto deseado, tal como un gen estructural que codifica una molécula de ARN, o usándose una molécula de ARN como sustrato para un complejo de enzima o de enzima transcriptasa inversa.

Casete de expresión mejorado o potenciado se refiere a la combinación y al orden específicos de los elementos genéticos asociados a la secuencia que codifica la proteína insecticida que, cuando se expresa dentro de una célula vegetal:

origina el sorprendente nivel medio de esa proteína expresada en plantas, tejido vegetal o células vegetales;

origina el número inesperado de acontecimientos de transformación que expresan un nivel promedio sorprendentemente más alto de proteína insecticida;

origina plantas individuales, tejido vegetal, o células vegetales que expresan un nivel inesperadamente alto de la proteína insecticida; y

origina plantas que expresan niveles inesperados de proteína insecticida eficaz para controlar o combatir plagas de coleópteros y evitar el desarrollo de resistencia por la plaga de coleópteros a la proteína insecticida particular.

\newpage

Polipéptido insecticida se refiere a un polipéptido que tiene propiedades insecticidas, por ejemplo, un polipéptido que muestra las propiedades de inhibir el crecimiento, desarrollo, viabilidad o fecundidad de las plagas de insectos diana.

Operativamente unido: secuencias de polinucleótidos o de ácido nucleico conectadas consecutivamente en forma lineal, de modo que las propiedades de una influyen en las características de expresión de la otra. Un promotor, por ejemplo, operativamente unido a otras secuencias de polinucleótidos (que pueden consistir en las secuencias operadora o potenciadora, secuencias líder traducidas o no traducidas, secuencias de intrón, secuencias codificantes de genes estructurales, genes no estructurales, secuencias de transcripción y de terminación de la traducción y secuencias de poliadenilación), influye en la expresión de una secuencia codificante o no codificante, ya sea el producto ARN, proteína u otro producto. De manera similar, un intrón o una secuencia líder no traducida pueden influir en la expresión y estabilidad de las secuencias operativamente unidas a ellos y, las secuencias de genes estructurales y no estructurales pueden
resultar influidas por elementos operativamente unidos en el sentido de 5', dentro de ellas, o en el sentido de 3'.

Regiones codificantes que pueden expresarse en plantas: los marcos de lectura abiertos (ORF, open reading frames) o las regiones codificantes de aminoácidos que pueden expresarse in planta debido a que contienen elementos reguladores vegetales típicos que facilitan su expresión y, con frecuencia incluyen cambios en la secuencia codificante, de modo que se utilizan codones preferidos vegetales en lugar de codones no preferidos en los que se contemplan las regiones codificantes heterólogas.

Péptido de tránsito de plástido: cualquier secuencia de aminoácidos útil para dirigir un aminoácido unido, tal como una fusión de proteínas, a un orgánulo o compartimento subcelular tal como un plástido o cloroplasto.

Secuencia de polinucleótidos: cualquier secuencia de ADN o ARN de cuatro o más nucleótidos o ribonucleótidos consecutivos. Generalmente, las secuencias de polinucleótidos tal como se dan a conocer en el presente documento comprenden al menos 50 o más nucleótidos o ribonucleótidos.

Progenie: "progenie" incluye cualquier vástago o descendiente de la planta transgénica, o cualquier planta posterior que contenga el/los transgén/transgenes de forma operable. La progenie no se limita a una generación, sino que más bien engloba los descendientes del transformante siempre que estos contengan o expresen el/los transgén/transgenes. Las semillas que contienen embriones transgénicos, así como las semillas de las plantas transgénicas y sus vástagos o descendientes que, tras la segregación mendeliana siguen conteniendo el/los transgén/trangenes, son también partes importantes de la invención.

Promotor: un sitio de reconocimiento en una secuencia de ADN o grupo de secuencias de ADN que proporcionan un elemento de control de la expresión para una secuencia de polinucleótidos preferida y al que se une específicamente la ARN polimerasa e inicia la síntesis del ARN (transcripción) de esa secuencia preferida.

R_{0} es la planta regenerante principal derivada de la transformación de células o tejido vegetales en cultivo. Las generaciones o progenie posteriores derivadas de R_{0} se denominan R_{1} (primera generación), R_{2} (segunda generación), etc.

Regeneración: el proceso de hacer crecer una planta a partir de una célula vegetal o un grupo de células vegetales (por ejemplo, explante, callos, embrión o protoplasto vegetal).

Secuencia codificante estructural se refiere una secuencia de ADN que codifica un péptido, polipéptido o proteína que se produce mediante una célula tras la transcripción de la secuencia codificante estructural para dar el ARN mensajero (ARNm), seguido por la traducción del ARNm para dar el producto de péptido, polipéptido o proteína deseado.

Gen estructural: una secuencia de polinucleótidos o gen que contiene la secuencia codificante de un polipéptido deseado que se expresa mediante transcripción y traducción produciendo el polipéptido deseado.

Gen sintético: los genes sintéticos que codifican las \delta-endotoxinas de B. thuringiensis de la presente invención son los preparados de una manera que implica cualquier tipo de aislamiento o manipulación genéticos que altere la secuencia codificante que se produce de manera natural del gel de \delta-endotoxina. Esto incluye el aislamiento del gen a partir de su estado que se produce de forma natural, la manipulación del gen tal como mediante modificación de codones (tal como se describe en el presente documento) o la mutagénesis específica de sitio (tal como se describe en el presente documento), truncamiento del gen o cualquier otro procedimiento de aislamiento o manipulación. Un gen sintético puede ser también una secuencia de polinucleótidos que no se sabe que se produzca de forma natural, pero que codifica un polipéptido u otro producto útil tal como un ARNt o un polinucleótido antisentido. Una secuencia de polinucleótidos que no se produce de forma natural.

Homología sustancial: tal como se usa este término en el presente documento, se refiere a secuencias de polipéptidos o de ácido nucleico que son homólogas de en aproximadamente un 86%, a homólogas en aproximadamente un 90%, homólogas en aproximadamente un 95%, homólogas en aproximadamente un 99%. Más específicamente, los inventores prevén que los homólogos sustanciales son homólogos en aproximadamente un 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 y 99 por ciento con respecto a la secuencia de ácido nucleico del polipéptido.

Terminador: con referencia a los procesos de expresión génica nuclear eucariota, la secuencia de poliadenilación y de terminación de la transcripción del extremo 3' operable. Con referencia a la expresión génica procariota, e incluyendo la expresión génica de plástidos o cloroplastos, la secuencia de ADN operable en el extremo 3' de un marco de lectura abierto que es, para los ORF que expresan producto de proteína, al menos un codón de terminación en marco con la secuencia codificante del ORF, que puede estar seguido también por una secuencia de ADN que codifica una señal de terminación de la transcripción que puede hacer que el producto de ARNm o ARN traducido forme una horquilla u otra estructura tridimensional que puede actuar o no junto con una o más proteínas estructurales solubles haciendo que se interrumpa la transcripción.

Transformación: un proceso para introducir una secuencia de polinucleótidos exógena (por ejemplo, un vector o una molécula de ADN o ARN recombinante o no recombinante) en una célula o un protoplasto en el que se incorpora ese polinucleótido exógeno en un elemento genético hereditario o puede realizar replicación autónoma y así mantenerse de manera estable dentro de esa célula o ese protoplasto, así como en la progenie de esa célula o ese protoplasto.

Célula transformada: una célula que contiene un elemento genético heredado alterado mediante la introducción de una o más moléculas de ADN exógeno. Una célula transgénica. Las células transgénicas o transformadas a modo de ejemplo incluyen células vegetales derivadas de una célula vegetal transformada y células particulares tales como células de la hojas, de la raíz, del tallo, por ejemplo, células somáticas o células reproductoras (germinales) obtenidas a partir de una planta transgénica.

Transgén: un constructo génico, casete de expresión, o secuencia o segmento de ADN que comprende un ORF que se desea que se exprese en la célula, tejido u organismo receptor. Esto puede incluir un plásmido entero u otro vector, o puede simplemente incluir el segmento, dominio, región o secuencia codificante de la secuencia de ADN transferida.

Acontecimiento transgénico: una planta o progenie de la misma derivada de una célula o protoplasto vegetal obtenido o construido para contener una o más moléculas de ADN exógeno insertadas en el genoma nuclear u otro genoma de la célula vegetal, o introducidas y mantenidas de manera estable dentro del citoplasma de un plástido, cloroplasto o mitocondria, lo que confiere cierto fenotipo físicamente detectable en la planta o progenie de la misma.

Planta transgénica: una planta o progenie de la misma que se ha modificado genéticamente para contener y expresar secuencias de ADN heterólogas como proteínas o bien como ácidos nucleicos. Tal como se muestra a modo de ejemplo específicamente en el presente documento, se modifica genéticamente una planta de maíz transgénico para contener y expresar al menos una secuencia de ADN heteróloga operativamente unida a, y bajo el control regulador de, secuencias de control transcripcional que funcionan juntas en células o tejidos vegetales o en plantas enteras para lograr la expresión a partir de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína \delta-endotoxina insecticida o una variante de secuencia de aminoácidos de la misma. Una planta transgénica también puede denominarse una planta transformada. Una planta transgénica también puede denominarse progenie de la planta transgénica inicial, en la que esas progenies contienen y expresan la secuencia codificante heteróloga bajo el control regulador de las secuencias de control de la transcripción que pueden expresarse en plantas descritas en el presente documento.

Vector: un polinucleótido que puede replicarse en una célula huésped y/o al que puede estar operativamente unida otra secuencia de polinucleótidos de modo que se provoque la replicación de la secuencia unida. Un plásmido es un vector a modo de ejemplo.

La presente invención da a conocer constructos de ADN novedosos que comprenden una secuencia de polinucleótidos que codifica la \delta-endotoxinade B. thuringiensis, concretamente una secuencia de nucleótidos que tiene la secuencia de SEC ID NO: 9. Los expertos en la técnica conocen bien los procedimientos para la construcción y expresión de genes de B. thuringiensis sintéticos en plantas y se describen en detalle en la patente estadounidense 5.500.365. La presente invención contempla el uso de genes de B. thuringiensis de Cry3B en la transformación de plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Para potenciar la expresión de estos genes, la presente invención proporciona constructos de ADN que comprenden segmentos de polinucleótidos que codifican péptidos que se dirigen a plástidos situados en el sentido de 5' de y en marco con las secuencias de polinucleótidos que codifican las \delta-endotoxinas de B. thuringiensis, junto con diversas combinaciones de secuencias líder no traducidas, secuencias de intrón funcionales vegetales y secuencias de terminación de la transcripción y de poliadenilación.

En un aspecto, la información de secuencia de nucleótidos proporcionada por la invención, permite la preparación de secuencias de ADN relativamente cortas que tienen la capacidad de hibridarse específicamente con secuencias génicas de los polinucleótidos seleccionados dados a conocer en el presente documento. En estos aspectos, se preparan sondas de ácido nucleico de una longitud apropiada basándose en una consideración de secuencias de polipéptidos seleccionadas que codifican el polipéptido de \delta-endotoxina Cry3B inhibidora de coleópteros: mostrado en la SEC ID NO: 10.

Estas sondas de ácido nucleico pueden prepararse también basándose en una consideración de secuencias de polinucleótidos seleccionadas que codifican un péptido que se dirige a plástidos, tal como los mostrados en la SEC ID NO: 26. La capacidad de tales sondas de ácido nucleico para hibridarse específicamente con una secuencia génica que codifica un polipéptido de \delta-endotoxina o una secuencia de péptido que se dirige a plástidos, conduce a su particular utilidad en una variedad de realizaciones. Y lo que es más importante, pueden usarse las sondas en una variedad de ensayos para detectar la presencia de secuencias complementarias en una muestra dada.

En realizaciones determinadas, es ventajoso usar cebadores de oligonucleótidos. La secuencia de tales cebadores se diseña usando un polinucleótido de la presente invención para su uso para detectar, amplificar o mutar un segmento definido de un gen de proteína cristal de B. thuringiensis usando tecnología de amplificación térmica. El procedimiento puede usarse también para detectar, amplificar o mutar un segmento definido del polinucleótido que codifica un péptido que se dirige a plástidos. Los segmentos de genes relacionados con los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de \delta-endotoxina y péptidos que se dirigen a plástidos de la presente invención, pueden amplificarse también usando tales cebadores y procedimientos de amplificación térmica.

Para proporcionar determinadas ventajas según la presente invención, una secuencia de ácido nucleico preferida empleada para ensayos o estudios de hibridación incluye secuencias de polinucleótidos de al menos aproximadamente de 14 a 30 nucleótidos de longitud más o menos, complementarias a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína cristal, o secuencias de polinucleótidos de al menos aproximadamente de 14 a 30 nucleótidos de longitud más o menos, complementarias a una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido que se dirige a plástidos.

Un tamaño de al menos 14 nucleótidos de longitud ayuda a garantizar que el fragmento tendrá la longitud suficiente para formar una molécula bicatenaria que es tanto estable como selectiva. Generalmente se prefieren moléculas que tienen secuencias complementarias a lo largo de segmentos mayores de 14 bases de longitud. Con el fin de aumentar la estabilidad y selectividad del híbrido, y así mejorar la calidad y el grado de las moléculas híbridas obtenidas, se preferirá generalmente diseñar moléculas de ácido nucleico que tengan secuencias complementarias de 14 a 20 nucleótidos o incluso más largas si se desea. Tales fragmentos pueden prepararse fácilmente, por ejemplo, sintetizando directamente el fragmento mediante medios químicos, mediante aplicación de tecnología de reproducción de ácidos nucleicos, tal como la tecnología de PCR^{TM} de las patentes estadounidenses 4.683.195 y 4.683.202, o cortando fragmentos de ADN seleccionados a partir de plásmidos recombinantes que contienen insertos apropiados y sitios de restricción adecuados.

La presente invención contempla también un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. Así, en una realización, un vector de expresión es una molécula de ADN aislada y purificada que comprende un promotor operativamente unido a una región codificante que codifica un polipéptido de la presente invención, región codificante que está operativamente unida a una región de terminación de la transcripción, en la que el promotor dirige la transcripción de la región codificante. La región codificante puede incluir un segmento que codifica una \delta-endotoxina de B. thuringiensis y un segmento que codifica un péptido que se dirige a plástido. La molécula de ADN que comprende el vector de expresión puede contener también un intrón funcional. Tal como se usan en el presente documento, los términos "operativamente unido" o "operablemente unido" significan que un promotor está conectado a una región codificante de un modo tal que la transcripción de esa región codificante está controlada y regulada por ese promotor. Los medios para unir operativamente un promotor a una región codificante para regular tanto en el sentido de 5' como en el sentido de 3' se conocen bien en la técnica.

Los vectores de transformación vegetales preferidos incluyen los derivados de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, así como los descritos, por ejemplo, por Herrera-Estrella (1983), Bevan (1983), Klee (1985) y solicitud de patente europea número EP 0120516.

Los promotores que funcionan en bacterias son muy conocidos en la técnica. Promotores preferidos y a modo de ejemplo para las proteínas cristal de B. thuringiensis incluyen los promotores génicos sigA, sigE y sigK. Como alternativa pueden usarse promotores naturales, mutagenizados, heterólogos o recombinantes derivados de secuencias codificantes de la proteína \delta-endotoxina de Bacillus thuringiensis.

Cuando ha de usarse un vector de expresión de la presente invención para transformar una planta, se selecciona un promotor que tenga la capacidad de dirigir la expresión en esa especie de planta particular. También se conocen bien en la técnica promotores que funcionan en diferentes especies vegetales. Los promotores útiles en la expresión de secuencias codificantes de polipéptidos en plantas son aquellos que son inducibles, virales, sintéticos o constitutivos tal como se describen en (Poszkowski et al., 1989; Odell et al., 1985), y/o regulados temporalmente, regulados espacialmente y regulados espacio-temporalmente (Chau et al., 1989). Los promotores preferidos incluyen el promotor FMV35S y los promotores CaMV35S potenciados. Otros promotores incluyen el promotor de POX, el promotor temprano del virus ScbDNA y el promotor del virus del moteado amarillo.

Según la presente invención, los vectores de expresión diseñados para potenciar de manera específica la expresión del polipéptido en la planta transformada pueden incluir determinadas regiones que codifican péptidos que se dirigen a plástidos (PDP). Estas regiones permiten que los procesos celulares implicados en la transcripción, traducción y expresión de la proteína codificada se aprovechen completamente cuando están asociados a determinadas \delta-endotoxinas de B. thuringiensis. Tales péptidos que se dirigen a plástidos funcionan en una variedad de modos, tales como por ejemplo, transfiriendo la proteína expresada a la estructura celular en la que actúa de la manera más eficaz, o transfiriendo la proteína expresada a zonas de la célula en las que se concentran los procesos celulares necesarios para la expresión.

En el caso de Cry3B, la expresión elevada es crítica para obtener maíz transgénico con control de CRW (corky rugose wood, (madera rugosa acorchada) ya que la CL_{50} de Cry3B contra CRW es significativamente más alta que la CL_{50} de las toxinas de B. thuringiensis usadas actualmente para controlar plagas tales como el escarabajo de la patata de Colorado en la patata (Cry3A) o el barrenador europeo del maíz en el maíz (Cry1Ab).

La expresión aumentada es también especialmente valiosa porque proporciona una protección adicional contra el desarrollo de resistencia por medio de una estrategia de dosis alta (McGaughey y Whalon, 1993; Roush, 1994). El alto nivel de expresión es incluso más deseable porque proporciona una protección frente insectos sostenida en los casos en que la expresión génica insecticida disminuye debido a las condiciones ambientales. De manera adicional e inesperada, las plantas de maíz transformadas con vectores que expresan Cry3B inhibidoras de coleópteros o proteínas variantes mostraban un desarrollo y crecimiento normales.

Un ejemplo de un péptido que se dirige a plástidos o cloroplastos (PDC) es un péptido que se dirige a cloroplastos. Se ha descubierto que los péptidos que se dirigen a cloroplastos son particularmente útiles en el sistema de marcador seleccionable de resistencia a glifosato. En este sistema, las plantas transformadas para expresar una proteína que confiere resistencia a glifosato se transforman con un PDP que se dirige el péptido a los cloroplastos de la célula. El glifosato inhibe la ruta del ácido shikímico que conduce a la biosíntesis de compuestos aromáticos incluyendo aminoácidos y vitaminas. Específicamente, el glifosato inhibe la conversión de ácido fosfoenolpirúvico y el ácido 3-fosfoshikímico en ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshikímico mediante la inhibición de la enzima ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshikímico sintasa (EPSP sintasa o EPSPS). La EPSPS complementaria, proporcionada por medio de la inserción de un transgén que codifica esta enzima, permite que la célula resista los efectos del glifosato. Así, a medida que el herbicida glifosato funciona para destruir la célula interrumpiendo la biosíntesis de aminoácidos aromáticos, particularmente en el cloroplasto de la célula, el PDC permite una resistencia aumentada al herbicida mediante la concentración de la enzima de resistencia a glifosato que expresa la célula en el cloroplasto, es decir, en el orgánulo diana de la célula. Las enzimas de resistencia a herbicida a modo de ejemplo incluyen EPSPS tal como se observó anteriormente, glifosato óxido-reductasa (GOX) y el gen aro-A (patente estadounidense número 4.535.060).

Los PDC pueden dirigir proteínas a cloroplasto y otros plástidos. Por ejemplo, el orgánulo diana puede ser el amiloplasto. Los PDC preferidos de la presente invención incluyen los que se dirigen tanto a cloroplastos como a otros plástidos. Los ejemplos específicos de PDC preferidos incluyen el PDC de la proteína RUBISCO SSU del maíz y péptidos funcionalmente relacionados. Un polipéptido PDC a modo de ejemplo se muestra en la SEC ID NO: 26. Una secuencia de polinucleótidos que codifica para este polipéptido PDC se muestra en la SEC ID NO: 25.

La expresión de un gen que existe en forma de ADN bicatenario implica la transcripción de ARN mensajero (ARNm) a partir de la cadena codificante del ADN mediante una enzima ARN polimerasa, y el posterior tratamiento del transcrito primario de ARNm dentro del núcleo. La transcripción de ADN para dar ARNm está regulada por una región de ADN denominada normalmente el "promotor". La región promotora contiene una secuencia de bases que señala la ARN polimerasa para asociarse al ADN y para iniciar la transcripción del ARNm usando una de las cadenas de ADN como molde para producir una cadena correspondiente de ARN. El promotor particular seleccionado debe poder producir una expresión suficiente de la secuencia codificante de enzima para dar como resultado la producción una cantidad insecticida eficaz de la proteína de B. thuringiensis proteína.

La región no traducida en 3' de los genes vegetales quiméricos de la presente invención contiene también una señal de poliadenilación que funciona en plantas para producir la adición de nucleótidos adenilados al extremo 3' del ARN. Los ejemplos de regiones en 3' preferidas son (1) las regiones no traducidas, transcritas en 3' que contienen la señal de poliadenilación de genes del plásmido inductor de tumores (Ti) de Agrobacterium, tales como el gen de nopalina sintasa (NOS) y (2) los extremos 3' de genes vegetales tales como el gen de ssRUBISCO E9 de guisante (Fischhoff et al., 1987).

Un promotor se selecciona por su capacidad para dirigir la actividad transcripcional de la planta transgénica o de la célula vegetal transformada hacia la región codificante, para garantizar una expresión suficiente de la secuencia codificante de la enzima para dar como resultado la producción de cantidades insecticidas de la proteína de B. thuringiensis. Los genes estructurales pueden dirigirse mediante una variedad de promotores en tejidos vegetales. Los promotores pueden ser casi constitutivos, (es decir, dirigen la transcripción del transgén en todo el tejido), tales como que el promotor CaMV35S, o promotores específicos del desarrollo o específicos de tejido que afectan a dicotiledóneas o monocotiledóneas. Cuando el promotor es un promotor casi constitutivo tal como CaMV35S o FMV35S, se descubren aumentos en la expresión de polipéptidos en una variedad de tejidos vegetales transformados y en la mayoría de los órganos vegetales (por ejemplo, callo, hoja, semilla y raíz). Las versiones potenciadas o duplicadas de los promotores CaMV35S y FMV35S son particularmente útiles en la práctica de esta invención (Kay et al., 1987; Rogers, patente estadounidense 5.378.619). Se ha demostrado que las secuencias potenciadoras duplicadas en tándem son de importancia particular, por ejemplo, tal como se describe en Neuhaus et al. (Tissue-specific expression from promoter AS-1 in transgenic tobacco. Plant Cell 6: 827-834; 1994).

Los expertos en la técnica reconocerán que hay varios promotores que son activos en células vegetales y se han descrito en la bibliografía. Tales promotores pueden obtenerse a partir de plantas o virus de plantas, e incluyen, pero no se limitan a, los promotores de nopalina sintasa (NOS) y de octopina sintasa (OCS) (que portan los plásmidos inductores de tumores de A. tumefaciens), los promotores 19S y 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor inducible por luz de la subunidad pequeña de la ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa (ssRUBISCO, un polipéptido vegetal muy abundante), el promotor Act1 del arroz, promotor de POX, promotor del virus del moteado amarillo, promotor temprano del virus ScBV, el promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia (FMV, Figwort Mosaic Virus) y el promotor AS4 35S (expresión potenciada en la raíz del promotor 35S unido a múltiples secuencias as-1 en tándem tal como en Neuhaus et al.). Todos estos promotores se han usado para crear diversos tipos de constructor de ADN que se han expresado en plantas (véase por ejemplo, McElroy et al., 1990, patente estadounidense 5.463.175).

Además, puede preferirse provocar la expresión de la \delta-endotoxina de B. thuringiensis en tejidos específicos de la planta usando vectores de integración vegetales que contienen un promotor específico de tejido. Los tejidos diana específicos pueden incluir la hoja, el tallo, la raíz, el tubérculo, la semilla, el fruto, etc. y el promotor elegido debe tener la especificidad de desarrollo y de tejido deseadas. Por tanto, debe optimizarse la función del promotor seleccionando un promotor con las capacidades de expresión de tejido y fuerza de promotor aproximada deseadas y seleccionando un transformante que produce la actividad insecticida deseada en los tejidos diana. Este enfoque de selección a partir del conjunto de transformantes, se emplea rutinariamente en la expresión de genes estructurales heterólogos en plantas, ya que hay variación entre los transformantes que contienen el mismo gen heterólogo debido al sitio de inserción del gen en el genoma de la planta (denominado comúnmente "efecto de posición"). Además de los promotores que se sabe que producen la transcripción (constitutivos o específicos de tejido) de ADN en células vegetales, pueden identificarse otros promotores para su uso en la presente invención examinando una biblioteca de ADNc vegetal para detectar genes que se expresan selectiva o preferiblemente en los tejidos diana y entonces determinan las regiones promotoras.

Un promotor específico de tejido es el promotor de lectina, que es específico para tejido de semillas. La proteína lectina de las semillas de soja se codifica por un único gen (Le1) que se expresa sólo durante la maduración de la semilla y representa aproximadamente del 2 a aproximadamente el 5% del ARNm de la semilla total. El gen de lectina y el promotor específico de semilla se han caracterizado completamente y usado para dirigir la expresión específica de semilla en plantas de tabaco transgénicas (Vodkin et al., 1983; Lindstrom et al., 1990). Un vector de expresión que contiene una región codificante que codifica un polipéptido de interés, puede manipularse mediante ingeniería genética para estar bajo el control del promotor de lectina, y ese vector puede introducirse en plantas usando, por ejemplo, una procedimiento de transformación de protoplasto (Dhir et al., 1991). La expresión del polipéptido se dirigiría entonces específicamente a las semillas de la planta transgénica.

Una planta transgénica de la presente invención producida a partir de una célula vegetal transformada con un promotor específico de tejido, puede cruzarse con una segunda planta transgénica desarrollada a partir de una célula vegetal transformada con un promotor específico de tejido diferente para producir una planta transgénica híbrida que muestra los efectos de la transformación en más de un tejido específico.

Otros promotores específicos de tejido a modo de ejemplo son la sacarosa sintetasa 1 de maíz (Yang et al., 1990), alcohol deshidrogenasa 1 de maíz (Vogel et al., 1989), complejo de captación de luz de maíz (Simpson, 1986), proteína de choque térmico de maíz (Odell et al., 1985), RuBP carboxilasa de subunidad pequeña del guisante (Poulsen et al., 1986; Cashmore et al., 1983), manopina sintasa del plásmido Ti (McBride y Summerfelt, 1989), nopalina sintasa del plásmido Ti (Langridge et al., 1989), chalcona isomerasa de petunia (Van Tunen et al., 1988), proteína 1 rica en glicina de judía (Keller et al., 1989), transcrito 35s de CaMV (Odell et al., 1985) y patatina de patata (Wenzler et al., 1989). Los promotores preferidos son el promotor del virus del mosaico de la coliflor (35S de CaMV) y el promotor de RuBP carboxilasa de subunidad pequeña de S-E9.

Los promotores usados en los constructos de ADN de la presente invención pueden modificarse, si se desea, para afectar a sus características de control. Por ejemplo, el promotor CaMV35S puede estar acoplado a la parte del gen de ssRUBISCO que reprime la expresión de ssRUBISCO en ausencia de luz, para crear un promotor que es activo en las hojas pero no en las raíces. El promotor quimérico resultante puede usarse tal como se describe en el presente documento. Para los fines de esta descripción, la frase promotor "CaMV35S" incluye así las variaciones del promotor CaMV35S, por ejemplo, promotores derivados por medio de acoplamiento con regiones operadoras, mutagénesis al azar o controlada, etc. Además, los promotores pueden alterarse para que contengan múltiples "secuencias potenciadoras" para ayudar a aumentar la expresión génica. Kay et al. (1987) y Neuhaus et al. (1994) han notificado ejemplos de tales secuencias potenciadoras.

El ARN producido por un constructo de ADN de la presente invención contiene también una secuencia líder no traducida en 5'. Esta secuencia puede derivarse del promotor seleccionado para expresar el gen y puede modificarse específicamente de modo que se aumente la traducción del ARNm. Las regiones no traducidas en 5' pueden obtenerse también a partir de ARN virales, a partir de genes eucariotas adecuados o a partir de una secuencia génica sintética. La presente invención no se limita a constructos en los que la región no traducida se deriva de la secuencia no traducida en 5' que acompaña a la secuencia promotora. Tal como se muestra a continuación, una secuencia líder de gen vegetal que es útil en la presente invención es la secuencia líder de la proteína de choque térmico 70 de petunia (hsp70) (Winter et al., 1988), la secuencia líder CAB de trigo o la secuencia líder PER de trigo.

Una realización a modo de ejemplo de la invención implica el direccionamiento de plástidos de la secuencia de B. thuringiensis. Tales secuencias que dirigen plástidos se han aislado a partir de numerosos genes vegetales codificados nucleares y se ha mostrado que dirigen la importación de proteínas sintetizadas citoplásmicamente en los plástidos (recapitulado en Keegstra y Olsen, 1989). Puede utilizarse una variedad de secuencias que se dirigen a plástido, bien conocidas en la técnica, incluyendo pero no limitándose a ADPGPP, EPSP sintasa o ssRUBISCO, en la práctica de esta invención. En realizaciones alternativas preferidas, las secuencias (péptido y ácido nucleico) que se dirigen a plástidos para cultivos de monocotiledóneas, pueden estar constituidas por un fragmento genómico codificante que contiene una secuencia intrónica así como un sitio de escisión proteolítica por duplicado en las secuencias que se dirigen a plástidos codificadas.

La secuencia de ácido nucleico que codifica PDC más preferida, denominada en el presente documento zmSSU PDC (SEC ID NO: 25), que está constituida por un fragmento genómico que contiene una secuencia intrónica así como un sitio de escisión proteolítica por duplicado en las secuencias que se dirigen a plástidos codificadas, se derivó de la secuencia que se dirige a plástidos zmS1 (Russell et al., 1993). Se ha mostrado que las fusiones de traducción directas de la secuencia peptídica zmSSU PDC (SEC ID NO: 26) al extremo amino terminal de la secuencia son útiles para obtener niveles elevados del polipéptido en el maíz transgénico. Pueden efectuarse fusiones en marco de la secuencia de ácido nucleico zmSSU PDC (SEC ID NO: 25) a un gen cry3b (SEC ID NO: 1) o variante de gen, mediante acoplamiento de un sitio NcoI mediante ingeniería genética en el extremo (codificante de C-terminal) 3' de la secuencia zmSSU PDC a un sitio NcoI en 5' mediante ingeniería genética en el extremo codificante N-terminal de la secuencia codificante de cry3B o variante.

La secuencia de PDC preferida para cultivos de dicotiledóneas está constituida por un fragmento codificante genómico que contiene la secuencia peptídica que se dirige a cloroplastos del gen de EPSP sintasa de Arabidopsis thaliana en la que el sitio de escisión de péptido de tránsito del PDC por la ssRUBISCO de guisante sustituye al sitio de escisión de PDC por la EPSP sintasa (Klee et al., 1987).

Tal como se observó anteriormente, la región no traducida en 3' de los genes vegetales quiméricos de la presente invención contiene una señal de poliadenilación que funciona en plantas para producir la adición de nucleótidos adenilados al extremo 3' del ARN. Los ejemplos de regiones en 3' preferidas son (1) regiones no traducidas, transcritas en 3' que contienen la señal de poliadenilato de genes de plásmido inductor de tumores (Ti) de Agrobacterium, tales como el gen de nopalina sintasa (NOS) y (2) genes vegetales tales como el gen E9 de ssRUBISCO de guisante (Fischhoff et al., 1987).

Para la expresión optimizada en plantas monocotiledóneas, puede incluirse también un intrón en el constructo de expresión de ADN. Un intrón de este tipo se sitúa normalmente cerca del extremo 5' del ARNm de una secuencia no traducida. Este intrón podría obtenerse a partir de, pero sin limitarse a, un conjunto de intrones constituidos por el intrón de la proteína de choque térmico de maíz 70 (HSP) (patente estadounidense 5.424.412; 1995), el intrón de Act1 de arroz (McElroy et al., 1990), el intrón de Adh 1 (Callis et al., 1987) o el intrón de la sacarosa sintasa (Vasil et al., 1989). Tal como se muestra en el presente documento, el intrón de HSP70 de maíz (SEC ID NO: 33) y el intrón de actina de arroz (SEC ID NO: 32) son particularmente útiles en la presente invención.

La ARN polimerasa transcribe a través de una secuencia de ADN codificante hasta un sitio en el que se produce la poliadenilación. Normalmente, las secuencias de ADN situadas unos cientos de pares de bases en el sentido de 3' del sitio de poliadenilación sirven para terminar la transcripción. Estas secuencias de ADN se denominan en el presente documento regiones de terminación de la transcripción. Estas regiones se necesitan para la poliadenilación eficaz del ARN mensajero transcrito (ARNm).

Los constructos incluirán normalmente el gen de interés junto con una secuencia de ADN del extremo 3' que actúa como una señal para terminar la transcripción y permitir la poliadenilación del ARNm resultante. Se contempla que los elementos en 3' más preferidos son los del gen de nopalina sintasa de A. tumefaciens (nos en extremo 3') (Bevan et al., 1983), el terminador para el transcrito de T7 del gen de octopina sintasa de A. tumefaciens y el extremo 3' de los genes del inhibidor de la proteasa i o ii de patata o tomate. Cuando se desee pueden incluirse elementos reguladores tales como el elemento del TMV \Omega (Gallie, et al., 1989).

Otro tipo de elemento que puede regular la expresión génica es la secuencia de ADN entre el sitio de iniciación de la transcripción y el comienzo de la secuencia codificante, denominado la secuencia líder no traducida. La secuencia líder puede influir en la expresión génica. Se han realizado compilaciones de secuencias líder para predecir secuencias óptimas e inferiores a óptimas y generar "consenso" y secuencias líder preferidas (Joshi, 1987). Se contempla que las secuencias líder preferidas incluyen aquellas que comprenden secuencias que se ha predicho que dirigen la expresión óptima del gen estructural unido, es decir, que incluyen una secuencia líder consenso preferida que puede aumentar o mantener la estabilidad del ARNm y evitar el inicio inapropiado de la traducción. Los expertos en la técnica conocerán la elección de tales secuencias a la luz de la presente descripción. Las secuencias que se derivan de genes que se expresan altamente en plantas y en maíz en particular, serán las más preferidas. Una secuencia líder particularmente preferida puede ser la secuencia líder CAB de trigo (SEC ID NO: 31).

Podrían usarse duplicaciones o potenciadores de la transcripción de potenciadores para aumentar la expresión. Estos potenciadores se encuentran con frecuencia en 5' con respecto de transcripción en un promotor que funciona en células eucariotas, pero pueden insertarse con frecuencia en la orientación directa o inversa en 5' o 3' con respecto a la secuencia codificante. Los ejemplos de potenciadores incluyen elementos de los genes de octopina sintasa, promotor 35S de CaMV (Ellis et al., 1987), el gen de actina de arroz y el promotor de eucariotas no vegetales (por ejemplo, levadura; Ma et al., 1988).

La elección de qué vector de expresión y en última instancia a qué promotor está unida una región codificante de polipéptido, depende directamente de las propiedades funcionales deseadas, por ejemplo, la ubicación y el tiempo de la expresión proteica, y la célula huésped que va a transformarse. Éstas son limitaciones bien conocidas inherentes a la técnica de construcción de moléculas de ADN recombinante. Sin embargo, un vector útil para llevar a la práctica la presente invención puede dirigir la expresión de la región codificante de polipéptido a la que está operativamente unido.

\newpage

Los vectores típicos útiles para la expresión de genes en plantas superiores se conocen bien en la técnica e incluyen vectores derivados del plásmido inductor de tumores (Ti) de A. tumefaciens descrito (Rogers et al., 1987). Sin embargo, se conoce que varios sistemas de vector de integración vegetal distintos funcionan en plantas, incluyendo el vector de control de la transferencia de pCaMVCN descrito (Fromm et al., 1985). El pCaMVCN (disponible de Pharmacia, Piscataway, NJ) incluye el promotor CaMV35S.

En realizaciones preferidas, el vector usado para expresar el polipéptido incluye un marcador de selección que es eficaz en una célula vegetal, preferiblemente un marcador de selección de resistencia a fármacos. Un marcador de resistencia a fármacos preferido es el gen cuya expresión da como resultado resistencia a kanamicina; es decir el gen quimérico que contiene el promotor de nopalina sintasa, neomicina fosfotransferasa II (nptII) de Tn5 y región no traducida en 3' de nopalina sintasa descrito (Rogers et al., 1988).

En la técnica se conocen bien medios para preparar vectores de expresión. Los vectores de expresión (transformación) usados para transformar plantas y los procedimientos de producción de esos vectores se describen en las patentes estadounidenses 4.971.908, 4.940.835, 4.769.061 y 4.757.011. Esos vectores pueden modificarse para incluir una secuencia codificante según la presente invención.

Una región codificante que codifica un polipéptido que tiene la capacidad de conferir actividad insecticida a una célula, es preferiblemente un polinucleótido que codifica una \delta-endotoxina de B. thuringiensis o un equivalente funcional de un polinucleótido de este tipo. Según tales realizaciones, se prefiere una región codificante que comprende la secuencia de ADN de SEC ID NO: 9.

Los ORF que codifican polipéptidos de \delta-endotoxina de B. thuringiensis específicos contenidos en los casetes de expresión que se ha mostrado que expresan las \delta-endotoxinas de B. thuringiensis a altos niveles en plantas transformadas. Los casetes preferidos incluyen aquellos contenidos en los plásmidos pMON25096 y pMON25097.

Los casetes de expresión en estos plásmidos se codifican respectivamente mediante las secuencias mostradas en las SEC ID NO: 17 y SEC ID NO: 19.

Más preferiblemente, las plantas pueden transformarse satisfactoriamente con cualquier casete de expresión que comprenda las secuencias de nucleótidos del nucleótido 14 al 3431 de la SEC ID NO: 17, o del 14 al 3020 de la SEC ID NO: 19 (pMON25096 y pMON25097).

Lo más preferiblemente, las plantas pueden transformarse satisfactoriamente con cualquier casete de expresión que comprenda las secuencias de nucleótidos del nucleótido 14 al 3431 de la SEC ID NO: 17, del 14 al 3020 de la SEC ID NO: 19 (pMON25096 y pMON25097).

El trabajo descrito en el presente documento ha identificado procedimientos de potenciación de la expresión in planta de \delta-endotoxinas de B. thuringiensis, que confieren resistencia frente a patógenos de insectos cuando se incorporan al genoma de plantas sensibles. La patente estadounidense 5.500.365 describe un procedimiento para sintetizar genes vegetales para optimizar el nivel de expresión de la proteína que codifica el gen sintetizado. Este procedimiento se refiere a la modificación de las secuencias de genes estructurales del transgén exógeno, para hacerlas más "de tipo vegetal" y que, por tanto, sea más probable que se traduzcan y expresen por la planta. Un procedimiento similar para la expresión potenciada de transgenes en plantas monocotiledóneas se da a conocer en la patente estadounidense 5.689.052. Pueden producirse plantas agronómicas, hortícolas, ornamentales y otras económica o comercialmente útiles según los procedimientos descritos en el presente documento, para expresar \delta-endotoxinas de B. thuringiensis a niveles suficientemente altos para conferir resistencia frente a patógenos de insectos.

Tales plantas pueden expresar conjuntamente el polipéptido de \delta-endotoxina de B. thuringiensis junto con otros péptidos, polipéptidos o proteínas relacionados con patogenia antiviral, antibacteriana o antifúngica; proteínas insecticidas; proteínas que confieren resistencia a herbicida; y proteínas implicadas en mejorar la calidad de los productos vegetales o el rendimiento agronómico de las plantas. La expresión conjunta simultánea de múltiples proteínas en plantas es ventajosa porque se aprovecha de más de un modo de acción para controlar el daño patogénico de la planta. Esto puede minimizar la posibilidad de desarrollar cepas de patógenos resistentes, ampliar el alcance de la resistencia y potencialmente da como resultado un efecto insecticida sinérgico, potenciando así la capacidad de las plantas para resistir a la infestación por insectos (documento WO 92/17591).

En última instancia, los segmentos de ADN más deseables para la introducción en un genoma de monocotiledónea, pueden ser familias de genes o genes homólogos que codifican una características deseada (por ejemplo, un rendimiento aumentado), y que se introducen bajo el control de potenciadores o promotores, etc. novedosos, o quizá incluso elementos de control o promotores homólogos o específicos de tejido (por ejemplo, específicos de cuello de la raíz / vaina, verticilo, tronco, caña de la espiga, grano u hoja). De hecho, se prevé que un uso particular de la presente invención puede ser la producción de transformantes que comprenden un transgén que se dirige de una manera específica del tejido. Por ejemplo, pueden expresarse genes resistentes a insectos específicamente en los tejidos del verticilo y del cuello/vaina que son dianas para la primera y segunda generaciones, respectivamente de ECB. Asimismo, es deseable que los genes que codifican proteínas con una actividad particular contra el gusano de la raíz se expresen preferiblemente en los tejidos de la raíz.

Los vectores para su uso en el direccionamiento específico de tejido de la expresión génica en plantas transgénicas incluirán normalmente promotores específicos de tejido y también pueden incluir otros elementos de control específicos de tejido tales como secuencias potenciadoras. Los promotores que dirigen la expresión específica o potenciada en determinados tejidos vegetales se conocerán por los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción.

También se contempla que puede lograrse funcionalmente la expresión específica de tejido introduciendo un gen expresado de manera constitutiva (todos los tejidos) en combinación con un gen antisentido que se expresa sólo en aquellos tejidos en los que no se desea el producto génico. Por ejemplo, puede introducirse un gen que codifica la proteína toxina cristal de B. thuringiensis de modo que se exprese en todos los tejidos usando el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor. Como alternativa, también podría usarse un promotor de actina de arroz o promotor de histona de una especie de dicotiledónea o monocotiledónea para la expresión constitutiva de un gen. Además, se contempla que pueden ser útiles los promotores que combinan elementos de más de un promotor. Por ejemplo, la patente estadounidense 5.491.288 da a conocer la combinación de un promotor del virus del mosaico de la coliflor con un promotor de histona. Por tanto, la expresión de un transcrito antisentido de un gen de \delta-endotoxina de Bt en un grano de maíz, usando por ejemplo un promotor de ceína, evitará la acumulación de la \delta-endotoxina en la semilla. De ahí que la proteína codificada por el gen introducido estará presente en todos los tejidos excepto en el grano. Se contempla específicamente por los inventores que podría usarse una estrategia similar con la presente invención para dirigir la expresión de un marcador detectable o seleccionable en tejido de semilla.

Como alternativa, puede desearse obtener secuencias promotoras específicas de tejido novedosas para su uso según la presente invención. Para lograrlo, pueden aislarse en primer lugar clones de ADNc del tejido en cuestión e identificar aquellos clones que se expresan específicamente en ese tejido, por ejemplo usando transferencia de tipo Northern. De manera ideal, se querría identificar un gen que no está presente en alto número de copias, pero cuyo producto génico es relativamente abundante en tejidos específicos. El promotor y los elementos de control de los clones genómicos correspondientes pueden localizarse así usando las técnicas de biología molecular conocidas por los expertos en la técnica.

Se contempla que se deseará la expresión de algunos genes en plantas transgénicas sólo en condiciones específicas. Por ejemplo, se propone que se deseará la expresión de determinados genes que confieren resistencia frente a factores de estrés medioambiental tales como sequía, sólo en condiciones de estrés real. Se contempla además que la expresión de tales genes en todo el desarrollo de la planta puede tener efectos perjudiciales. Se sabe que existe un gran número de genes que responden al entorno. Por ejemplo, la expresión de algunos genes tales como rbcS, que codifica la subunidad pequeña de la ribulosa bisfosfato carboxilasa, se regula mediante la luz ya que está mediado por el fitocromo. Otros genes se inducen mediante estímulos secundarios. Por ejemplo, la síntesis del ácido abscísico (ABA) se induce mediante determinados factores medioambientales, incluyendo, pero sin limitarse a, estrés de agua. Se ha mostrado que varios genes se inducen mediante ABA (Skriver y Mundy, 1990). Se espera también que se deseará la expresión de genes que confieren resistencia frente a la depredación por insectos sólo en condiciones de infestación por insectos real. Por tanto, para algunas características deseadas, se deseará la expresión inducible de genes en plantas transgénicas.

Se propone que, en algunas realizaciones de la presente invención, se deseará la expresión de un gen en una planta transgénica sólo en un determinado periodo de tiempo durante el desarrollo de la planta. El momento del desarrollo se correlaciona frecuentemente con la expresión génica específica de tejido. Por ejemplo, la expresión de proteínas de reserva de ceína se inicia en el endosperma aproximadamente 15 días después de la polinización.

Se contempla que puede usarse el procedimiento descrito en esta invención para obtener una expresión sustancialmente mejorada de varias endotoxinas de B. thuringiensis novedosas aisladas tal como se describe a continuación. La identificación de nuevas cepas de Bacillus thuringiensis que codifican endotoxinas cristalinas con actividad insecticida se ha descrito previamente (Donovan et al., 1992). El aislamiento de la endotoxina de B. thuringiensis, seguido de la secuenciación de aminoácidos aminoterminales, traducción inversa de la secuencia de aminoácidos para diseñar una sonda de oligonucleótidos o el uso de un gen de B. thuringiensis relacionado como sonda, seguido de la clonación del gen que codifica la endotoxina mediante hibridación, son familiares para los expertos en la técnica y se han descrito (véase por ejemplo, Donovan et al., 1992, patente estadounidense 5.264.364). Las \delta-endotoxinas de Bacillus thuringiensis Cry3Bb con una actividad inhibidora de coleópteros mejorada pueden lograrse usando los procedimientos descritos en English et al. (documento WO99/31248).

También se contempla una planta transformada con un vector de expresión de la presente invención. También se contempla una planta transgénica derivada de una célula transgénica o transformada de este tipo. Los expertos en la técnica reconocerán que puede insertarse un gen vegetal quimérico que contiene una secuencia codificante estructural de la presente invención en el genoma de una planta mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Tales procedimientos para la transformación del ADN de células vegetales incluyen la transformación de plantas mediada por Agrobacterium, el uso de liposomas, transformación usando virus o polen, electroporación, transformación de protoplastos, transferencia génica en el polen, inyección o infiltración a vacío (Bechtold et al., Meth. Mo. Biol., 82:259-266; 1998) en órganos reproductores, inyección en embriones inmaduros y bombardeo de partículas. Cada unos de estos procedimientos tiene distintas ventajas y desventajas. Así, un procedimiento particular de introducción de genes en una cepa vegetal particular puede no ser necesariamente la más eficaz para otra cepa vegetal, pero se conoce bien qué procedimientos son útiles para una cepa vegetal particular.

Los expertos en la técnica conocen bien la tecnología para la introducción de ADN en células. Se han descrito cuatro procedimientos generales para suministrar un gen en células: (1) procedimientos químicos (Graham y van der Eb, 1973); (2) procedimientos físicos, tales como microinyección (Capecchi, 1980), electroporación (Wong y Neumann, 1982; Fromm et al., 1985) y pistola génica (Johnston y Tang, 1994; Fynan et al., 1993); (3) vectores virales (Clapp, 1993; Lu et al., 1993; Eglitis y Anderson, 1988a; 1988b); y (4) mecanismos mediados por receptor (Curiel et al., 1991; 1992; Wagner et al., 1992).

Un procedimiento ventajoso para suministrar segmentos de ADN transformante a células vegetales es el bombardeo de microproyectiles. En este procedimiento, las partículas pueden estar recubiertas con ácidos nucleicos y suministrarse a las células mediante una fuerza de propulsión. Las partículas a modo de ejemplo incluyen aquellas constituidas por tungsteno, oro, platino y similares. Usando estas partículas, se lleva el ADN a través de la pared celular y en el citoplasma sobre la superficie de pequeñas partículas de metal tal como se describe (Klein et al., 1987; Klein et al., 1988; Kawata et al., 1988). Las partículas de metal penetran a través de varias capas de células y así permiten la transformación de las células en los explantes de tejido.

Una ventaja del bombardeo de microproyectiles, además de que es un medio eficaz de transformar de manera reproducible y estable células vegetales, es que no se requiere ni aislamiento de protoplastos (Cristou et al., 1988) ni sensibilidad frente a infección por Agrobacterium. Una realización ilustrativa de un procedimiento para suministrar ADN en células vegetales mediante aceleración es un sistema de suministro de partículas de biolística, que puede usarse para propulsar partículas recubiertas con ADN o células a través de un tamiz, tal como un tamiz de Nytex o de acero inoxidable, sobre una superficie de filtro cubierta con las células cultivadas de la planta en suspensión. El tamiz dispersa las partículas de modo que no se suministran a las células receptoras en agregados grandes. Se cree que un tamiz que interviene entre el aparato de proyectil y las células que van a bombardearse reduce el tamaño de agregado de los proyectiles y puede contribuir a una frecuencia superior de la transformación reduciendo el daño infligido sobre las células receptoras mediante los proyectiles que son demasiado grandes.

Para el bombardeo, las células en suspensión se concentran preferiblemente sobre filtros o medio de cultivo sólido. Como alternativa, pueden disponerse embriones inmaduros u otras células diana sobre medio de cultivo sólido. Las células que van a bombardearse se colocan a una distancia apropiada por debajo de la placa que para los macroproyectiles. Si se desea, también se colocan uno o más tamices entre el dispositivo de aceleración y las células que van a bombardearse. A través del uso de técnicas expuestas en el presente documento, pueden obtenerse hasta 1000 o más focos de células que expresan de manera transitoria un gen marcador. El número de células en un foco que expresa el produc-
to génico exógeno 48 horas después del bombardeo oscila con frecuencia desde 1 hasta 10 y en promedio de 1 a 3.

En la transformación por bombardeo, pueden optimizarse las condiciones de cultivo previas al bombardeo y los parámetros de bombardeo produciendo el máximo número de transformantes estables. En esta tecnología son importantes tanto los parámetros físicos como los biológicos para el bombardeo. Los factores físicos son aquellos que implican la manipulación del precipitado de ADN/microproyectiles o aquellos que afectan al vuelo y velocidad de macro o bien microproyectiles. Los factores biológicos incluyen todas las etapas implicadas en la manipulación de las células antes e inmediatamente después del bombardeo, el ajuste osmótico de las células diana para ayudar a aliviar el traumatismo asociado al bombardeo y también la naturaleza del ADN transformante, tal como ADN linealizado o plásmidos superenrollados intactos. Se cree que son especialmente importantes las manipulaciones previas al bombardeo para la transformación satisfactoria de embriones vegetales inmaduros.

Por consiguiente se contempla que puede desearse ajustar varios de los parámetros de bombardeo en estudios a pequeña escala para optimizar completamente las condiciones. Puede desearse particularmente ajustar los parámetros físicos, tales como la distancia de separación, la distancia de vuelo y la presión de helio. También pueden optimizarse los factores de reducción del traumatismo (FRT) modificando las condiciones que influyen en el estado fisiológico de las células receptoras y que pueden por tanto influir en las eficacias de transformación y de integración. Por ejemplo, pueden ajustarse para la transformación óptima el estado osmótico, la hidratación del tejido y la fase del subcultivo o ciclo celular de las células receptoras. Los expertos en la técnica conocerán la ejecución de otros ajustes rutinarios a la luz de la presente descripción.

Los expertos en la técnica conocen bien los procedimientos de transformación mediada por partículas. La patente estadounidense 5.015.580 describe la transformación de semillas de soja usando una técnica de este tipo.

La transferencia mediada por Agrobacterium es un sistema ampliamente aplicable para introducir genes en células vegetales debido a que el ADN puede introducirse en tejidos vegetales completos, evitando así la necesidad de regeneración de una planta intacta a partir de un protoplasto. En la técnica se conoce bien el uso vectores de integración vegetales mediados por Agrobacterium para introducir ADN en células vegetales. Véanse, por ejemplo, los procedimientos descritos (Fraley et al., 1985; Rogers et al., 1987). La manipulación mediante ingeniería genética de plantas de algodón usando la transferencia mediada por Agrobacterium se describe en la patente estadounidense 5.004.863; así como la transformación de plantas de lechuga se describe en la patente estadounidense 5.349.124; y la transformación de la soja mediada por Agrobacterium se describe en la patente estadounidense 5.416.011. Además, la integración del Ti-ADN es un proceso relativamente preciso que da como resultado pocas transposiciones. La región de ADN que va a transferirse se define mediante las secuencias de borde y, el ADN de intervención se inserta normalmente en el genoma de la planta tal como se describe (Spielmann et al., 1986; Jorgensen et al., 1987).

Los vectores de transformación de Agrobacterium modernos pueden replicarse en E. coli así como Agrobacterium, permitiendo manipulaciones convenientes tal como se describe (Klee et al., 1985). Además, avances tecnológicos recientes en vectores para la transferencia génica mediada por Agrobacterium, han mejorado la disposición de los genes y sitios de restricción en los vectores para facilitar la construcción de vectores que puedan expresar diversos genes que codifican polipéptidos. Los vectores descritos (Rogers et al., 1987), tienen regiones multiconectoras convenientes flanqueadas por un promotor y un sitio de poliadenilación para la expresión directa de genes que codifican polipéptidos insertados y son adecuados para los presentes fines. Además, puede usarse para las transformaciones Agrobacterium que contiene genes de Ti tanto armado como desarmado. En aquellas variedades de plantas en las que es eficaz la transformación mediada por Agrobacterium, es el procedimiento de elección debido a la naturaleza fácil y definida de la transferencia génica.

La transformación mediada por Agrobacterium de discos de hojas y otros tejidos tales como cotiledones e hipocótilos parece limitarse a las plantas que Agrobacterium infecta de forma natural. La transformación mediada por Agrobacterium es la más eficaz en plantas dicotiledóneas. Pocas monocotiledóneas parecen ser huéspedes naturales para Agrobacterium, aunque se han producido plantas transgénicas en espárrago usando vectores de Agrobacterium tal como se describe (Bytebier et al., 1987). Recientemente también se han transformado con Agrobacterium otras monocotiledóneas. En este grupo se incluyen maíz (Ishida et al.) y arroz (Cheng et al.).

Una planta transgénica formada usando procedimientos de transformación de Agrobacterium contiene normalmente un único gen en un cromosoma. Tales plantas transgénicas pueden denominarse heterocigóticas para el gen añadido. Sin embargo, en tanto que el uso de la palabra "heterocigótico" implica normalmente la presencia de un gen complementario en el mismo locus del segundo cromosoma de un par de cromosomas, y no hay ningún gen de este tipo en una planta que contiene un gen añadido tal como en este caso, se cree que un nombre más exacto para una planta de este tipo es un segregado independiente, debido a que el gen exógeno añadido se segrega independientemente durante la mitosis y la meiosis.

Puede preferirse un segregado independiente cuando la planta se comercializa como un híbrido, tal como maíz. En este caso, se cruza un segregado independiente que contiene el gen con otra planta, formando una planta híbrida que es heterocigótica para el gen de interés.

Una preferencia alternativa es una planta transgénica que es homocigótica para el gen estructural añadido; es decir una planta transgénica que contiene dos genes añadidos, un gen en el mismo locus en cada cromosoma de un par de cromosomas. Puede obtenerse una planta transgénica homocigótica reproduciendo sexualmente (autopolinización) una planta transgénica de segregado independiente que contiene un único gen añadido, germinando parte de la semilla producida y analizando las plantas resultantes producidas para determinar actividad del gen de interés y herencia mendeliana lo que indica homocigocidad con respecto a un control (nativo, no transgénico) o una planta transgénica de segregado independiente.

Pueden reproducirse dos plantas transgénicas diferentes para producir descendencia que contenga dos genes exógenos, añadidos, que se segregan independientemente. La autopolinización de la progenie apropiada puede producir plantas que son homocigóticas para ambos genes exógenos, añadidos, que codifican un polipéptido de interés. También se contemplan el retrocruzamiento con una planta original e intercruzamiento con una planta no transgénica.

Puede lograrse la transformación de protoplastos vegetales usando procedimientos basados en la precipitación de fosfato de calcio, tratamiento con polietilenglicol, electroporación y combinaciones de estos tratamientos (véase, por ejemplo, Potrykus et al., 1985; Lorz et al., 1985; Fromm et al., 1985; Uchimiya et al., 1986; Callis et al., 1987; Marcotte et al., 1988). La aplicación de estos sistemas a germoplasma vegetal diferente depende de la capacidad para regenerar esa variedad de planta particular a partir de protoplastos. Se describen procedimientos ilustrativos para la regeneración de cereales a partir de protoplastos (véase, por ejemplo, Fujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Yamada et al., 1986; Abdullah et al., 1986). Para transformar un germoplasma vegetal que no puede regenerarse satisfactoriamente a partir de protoplastos, pueden utilizarse otros modos para introducir ADN en tejidos o células intactos. Por ejemplo, puede efectuarse la regeneración de cereales a partir de explantes o embriones inmaduros tal como se describe (Vasil, 1988). También puede introducirse ADN en plantas mediante transferencia de ADN directa en el polen, tal como se describe (Zhou et al., 1983; Hess, 1987). Puede obtenerse la expresión de genes que codifican polipéptidos mediante la inyección del ADN en órganos reproductores de una planta tal como se describe (Pena et al., 1987). También puede inyectarse ADN directamente en las células de embriones inmaduros y la rehidratación de embriones disecados tal como se describe (Neuhaus et al., 1987; Benbrook et al., 1986).

Con frecuencia los genes bacterianos no modificados se expresan mal en células de plantas transgénicas. Varios informes han dado a conocer métodos para mejorar la expresión de genes recombinantes en plantas (Murray et al., 1989; Diehn et al., 1996; Iannacone et al., 1997; Rouwendal et al., 1997; Futterer et al., 1997; y Futterer y Hohn, 1996). Estos informes dan a conocer diversos procedimientos para modificar mediante ingeniería secuencias codificantes para representar secuencias que se traducen más eficazmente basándose en tablas de frecuencia de codones de la planta, mejoras en la desviación de la posición de la tercera base del codón, usando secuencias recombinantes que evitan posible poliadenilación o dominios ricos en A/T o secuencias consenso de corte y empalme de intrón. Aunque estos procedimientos para la construcción de genes sintéticos son notables, los genes sintéticos de la presente invención se prepararon según el procedimiento de Brown et al. (patente estadounidense número 5.689.052; 1997). Así, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar genes vegetales sintéticos que expresan in planta un producto proteico deseado a niveles significativamente superiores a los genes de tipo natural. Brevemente, según Brown et al., la frecuencia de codones de monocotiledóneas raros y semi-raros en una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína deseada se reduce y sustituye por codones de monocotiledóneas más preferidos. La acumulación potenciada de un polipéptido deseado codificado por una secuencia de polinucleótidos modificada en una planta monocotiledónea es el resultado de aumentar la frecuencia de codones preferidos analizando la secuencia codificante en fragmentos de seis nucleótidos sucesivos y alterar la secuencia basándose en la frecuencia de aparición de los hexámeros así como la frecuencia de aparición de los hexámeros 284, 484 y 664 más raros en plantas monocotiledóneas. Además, Brown et al. dan a conocer la expresión potenciada de un gen recombinante aplicando el procedimiento para reducir la aparición de señales de poliadenilación y sitios de corte y empalme de intrón en la secuencia de nucleótidos, eliminar las secuencias autocomplementarias de la secuencia de nucleótidos y sustituir tales secuencias por nucleótidos no autocomplementarios mientras que se conserva un gen estructural que codifica el polipéptido, y reduciendo la frecuencia de aparición de pares de dinucleótidos de 5'-CG-3' en la secuencia de nucleótidos. Estas etapas se realizan secuencialmente y tienen un efecto acumulativo que da como resultado una secuencia de nucleótidos que contiene un uso preferencial de los codones de monocotiledónea más preferidos para las plantas monocotiledóneas para una mayoría de los aminoácidos presentes en el polipéptido deseado.

Por tanto, la cantidad de un gen que codifica un polipéptido de interés (es decir una proteína cristal bacteriana o polipéptido de \delta-endotoxina o tal \delta-endotoxina unida a un péptido que se dirige a plástidos) puede aumentarse en plantas transformando esas plantas usando procedimientos de transformación tales como los descritos en el presente documento.

Tras efectuar la administración de ADN exógeno a células receptoras, la siguiente etapa para obtener una planta transgénica implica generalmente identificar las células transformadas para el cultivo adicional y la regeneración de la planta. Tal como se menciona en el presente documento, con el fin de mejorar la capacidad para identificar transformantes, es preferible emplear un gen marcador seleccionable o detectable tal como, o además de, el gen expresable de interés. En este caso, generalmente se someterá a ensayo la población de células posiblemente transformadas exponiendo las células a un agente o agentes selectivo(s), o se examinarán las células para detectar la característica de gen marcador deseada.

Una realización a modo de ejemplo de procedimientos para identificar células transformadas implica exponer los cultivos transformados a un agente selectivo, tal como un inhibidor metabólico, un antibiótico, herbicida o similar. Las células que se han transformado y han integrado de manera estable un gen marcador que confiere resistencia al agente selectivo usado, crecerán y se dividirán en cultivo. Las células sensibles no podrán cultivarse adicionalmente. Un ejemplo de un gen marcador preferido que codifica una EPSPS sintasa que es resistente a la inhibición del glifosato. Cuando se usa este gen como marcador seleccionable, se trata el cultivo de células supuestamente transformadas con glifosato. Tras el tratamiento, las células transgénicas podrán cultivarse adicionalmente mientras que las células sensibles, no transformadas, no. Este procedimiento se describe en detalle en la patente estadounidense 5.569.834. Otro ejemplo de un sistema marcador seleccionable preferido es el sistema nptII mediante el que se confiere resistencia a los antibióticos kanamicina, neomicina y paromomicina o antibióticos relaciones, tal como se describe en la patente estadounidense 5.569.834. De nuevo, tras la transformación con este sistema las células transformadas que contienen un gen nptII que puede expresarse en plantas podrán cultivarse adicionalmente tras el tratamiento con kanamicina o antibiótico relacionado, mientras que las células no transformadas no. El uso de este tipo de sistema marcador seleccionable se describe en Brown et al. (patente estadounidense número 5.424.412). Otro marcador detectable que puede usarse es el gen que codifica la proteína fluorescente verde. Todos los ensayos contemplados son no destructivos y las células transformadas pueden cultivarse adicionalmente tras la identificación.

Se contempla además que las combinaciones de marcadores detectables y seleccionables serán útiles para la identificación de células transformadas. En algunos tipos de células o tejidos un agente de selección, tal como glifosato o kanamicina, puede no proporcionar suficiente actividad destructiva para reconocer claramente las células transformadas o bien puede provocar una inhibición no selectiva sustancial de transformantes y no transformantes por igual, provocando por tanto que la técnica de selección no sea eficaz. Se propone que la selección con un compuesto inhibidor del crecimiento, tal glifosato a concentraciones inferiores a las que pueden provocar una inhibición del 100% seguido del examen de tejido en crecimiento para detectar la expresión de un gen marcador detectable tal como kanamicina permitiría recuperar transformantes de los tipos de células o tejidos que no pueden seleccionarse por sí solos. Se propone que las combinaciones de selección y detección pueden permitir identificar transformantes en una variedad más amplia de tipos de células y tejidos.

El desarrollo o la regeneración de plantas a partir de protoplastos vegetales únicos o bien diversos explantes se conocen bien en la técnica (Weissbach y Weissbach, 1988). Este proceso de regeneración y crecimiento incluye normalmente las etapas de seleccionar células transformadas, cultivar aquellas células individualizadas mediante las fases usuales de desarrollo embrionario a través de la fase de plántula enraizada. Las semillas y embriones transgénicos se regeneran de manera similar. Los brotes enraizados transgénicos resultantes se plantan después de esto en un medio de crecimiento para plantas apropiado tal como tierra.

El desarrollo o regeneración de plantas que contienen el gen foráneo, exógeno que codifica un polipéptido de interés introducido mediante Agrobacterium a partir de explantes de hojas puede lograrse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica tal como se describe (Horsch et al., 1985). En este procedimiento, se cultivan transformantes en presencia de un agente de selección y en un medio que induce la regeneración de brotes en la cepa vegetal que está transformándose tal como se describe (Fraley et al., 1983). En particular, la patente estadounidense 5.349.124 detalla la creación de células de lechuga transformadas genéticamente y las plantas que resultan de las mismas que expresan proteínas cristal híbridas que confieren actividad insecticida contra larvas de lepidópteros a tales plantas. Este procedimiento produce normalmente brotes en el plazo de dos a cuatro meses y esos brotes se transfieren entonces a un medio apropiado que induce la formación de raíces que contiene el agente selectivo y un antibiótico para evitar el crecimiento bacteriano. Los brotes que enraizaron en presencia del agente selectivo para formar plántulas se transplantan entonces a tierra u otros medios para permitir la producción de raíces. Estos procedimientos varían dependiendo de la cepa vegetal particular empleada, conociéndose bien tales variaciones en la técnica.

Una planta transgénica de esta invención tiene por tanto una cantidad aumentada de una región codificante que codifica un polipéptido de \delta-endotoxina de B. thuringiensis o variante de la misma o puede codificar una \delta-endotoxina de este tipo unida a un péptido que se dirige a plástidos. Una planta transgénica preferida es un segregante independiente y puede transmitir ese gen y su actividad a su progenie. Una planta transgénica más preferida es homocigótica para ese gen, y transmite ese gen a toda su descendencia en la reproducción sexual. Puede hacerse crecer la semilla de una planta transgénica en el campo o invernadero, y las plantas transgénicas sexualmente maduras resultantes se autopolinizan para generar plantas genéticamente puras. La progenie de estas plantas llegan a ser líneas genéticamente puras que se evalúan para determinar el aumento de expresión del transgén que codifica la \delta-endotoxina.

Para identificar una planta transgénica que expresa niveles altos de la \delta-endotoxina de interés, es necesario examinar las plantas regeneradas, transgénicas resistentes a herbicidas o antibióticos (generación R_{0}) para detectar la actividad insecticida y/o expresión del gen de interés. Esto puede llevarse a cabo mediante diversos procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a: 1) obtener pequeñas muestras de tejido de la planta R_{0} transgénica y someter a ensayo directamente el tejido para determinar la actividad contra insectos sensibles en paralelo con el tejido derivado de una planta control negativa, sin expresión. Por ejemplo, las plantas de maíz transgénicas R_{0} que expresan endotoxinas de B. thuringiensis tales como Cry3B pueden identificarse sometiendo a ensayo tejido de las hojas y tejido de las raíces derivadas de tales plantas para determinar la actividad contra CRW; 2) análisis de extractos proteicos mediante inmunoensayos ligados a enzima (ELISA) específicos para el gen de interés (Cry3B); o 3) amplificación térmica mediante transcriptasa inversa para identificar acontecimientos que expresan el gen de interés.

Los genes y las \delta-endotoxinas según la invención objeto incluyen no sólo las secuencias de longitud completa descritas en el presente documento sino también fragmentos de estas secuencias, o proteínas de fusión, que conservan la actividad insecticida característica de las secuencias mostradas específicamente a modo de ejemplo en el presente documento.

Debe resultar evidente para un experto en la técnica que pueden identificarse y obtenerse \delta-endotoxinas insecticidas mediante varios medios. Los genes específicos, o porciones de los mismos, pueden obtenerse a partir de un depósito de cultivos, o construido sintéticamente, por ejemplo, mediante el uso de una máquina génica. Las variaciones de estos genes pueden construirse fácilmente usando técnicas convencionales para realizar mutaciones puntuales. Además, pueden prepararse fragmentos de estos genes usando exonucleasas o endonucleasas comercialmente disponibles según procedimientos convencionales. Por ejemplo, pueden usarse enzimas tales como Bal31 o mutagénesis dirigida al sitio para eliminar sistemáticamente mediante corte nucleótidos de los extremos de estos genes. Además, pueden obtenerse genes que codifican fragmentos activos usando una variedad de otras enzimas de restricción. Pueden usarse proteasas para obtener directamente fragmentos activos de estas \delta-endotoxinas.

También pueden aislarse \delta-endotoxinas equivalentes y/o genes que codifican estas \delta-endotoxinas a partir de cepas de Bacillus y/o bibliotecas de ADN usando las enseñanzas proporcionadas en el presente documento. Por ejemplo, pueden usarse los anticuerpos frente a las \delta-endotoxinas dadas a conocer y reivindicadas en el presente documento para identificar y aislar otras \delta-endotoxinas a partir de una mezcla de proteínas. Específicamente, pueden producirse anticuerpos frente a las porciones de las \delta-endotoxinas que son las más constantes y las más distintas de otras \delta-endotoxinas de B. thuringiensis. Estos anticuerpos pueden usarse entonces para identificar específicamente \delta-endotoxinas equivalentes con la actividad insecticida característica mediante inmunoprecipitación, inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) o inmunotransferencia de tipo Western.

Otro procedimiento para identificar las \delta-endotoxinas y los genes de la invención objeto es mediante el uso de sondas de oligonucleótidos. Estas sondas son secuencias de nucleótidos que tienen un marcador detectable. Tal como se conoce bien en la técnica, si la molécula de sonda y la muestra de ácido nucleico se hibridan cuando están juntas en una muestra formando enlaces de hidrógeno entre las dos moléculas, puede asumirse razonablemente que la sonda y la muestra son esencialmente idénticas o sustancialmente similares u homólogas al menos por toda la longitud de la sonda. El marcador detectable de la sonda proporciona un medio para determinar de una manera conocida si se ha producido la hibridación. Un análisis de sonda de este tipo proporciona un procedimiento rápido para identificar genes de \delta-endotoxina insecticida de la invención objeto.

La formación de dúplex y la estabilidad dependen de la complementariedad sustancial entre las dos cadenas de un híbrido, y, tal como se observó anteriormente, puede tolerarse un cierto grado de apareamiento erróneo. Por tanto, las sondas de la invención objeto incluyen mutaciones (tanto únicas como múltiples), deleciones, inserciones de las secuencias descritas, y combinaciones de las mismas, en las que dichas mutaciones, inserciones y deleciones permiten la formación de híbridos estables con el polinucleótido diana de interés. Las mutaciones, inserciones y deleciones pueden producirse en una secuencia de polinucleótidos dada de muchas maneras, mediante procedimientos conocidos actualmente por un experto habitual en la técnica, y quizás mediante otros procedimientos que pueden llegar a conocerse en el futuro.

Las posibles variaciones en las sondas enumeradas se deben, en parte, a la redundancia del código genético. Debido a la redundancia del código genético, pueden usarse más de un triplete (codón) de nucleótidos codificantes para la mayoría de los aminoácidos usados para preparar proteínas. Por tanto diferentes secuencias de nucleótidos pueden codificar un aminoácido particular. Por tanto, las secuencias de aminoácidos de los péptidos y las \delta-endotoxinas de B. thuringiensis, y los péptidos que se dirigen a plástidos y los polinucleótidos que los codifican, pueden prepararse mediante
secuencias de nucleótidos equivalentes que codifican la misma secuencia de aminoácidos de la proteína o el péptido.

La mutagénesis específica de sitio es una técnica útil en la preparación de péptidos individuales, o péptidos o proteínas equivalentes biológicamente funcionales, mediante mutagénesis específica del ADN subyacente. La técnica proporciona además una capacidad sencilla para preparar y someter a prueba variantes de secuencias, por ejemplo, incorporando una o más de las consideraciones anteriores, introduciendo uno o más cambios de la secuencia de nucléotidos en el ADN.

En general, la técnica de mutagénesis específica de sitio se conoce bien en la técnica, tal como se ejemplifica en diversas publicaciones. Tal como se apreciará, la técnica emplea normalmente un vector de tipo fago que existe tanto en una forma monocatenaria como bicatenaria. Los vectores típicos en la mutagénesis dirigida al sitio incluyen vectores tales como el fago M13 o plásmidos que contienen un origen de replicación M13. Este fago está comercialmente disponible fácilmente y los expertos en la técnica conocen su uso generalmente bien.

Pueden realizarse modificaciones y cambios en la estructura de los péptidos de la presente invención y los segmentos de ADN que los codifican y obtener aún una molécula funcional que codifica una proteína o un péptido con características deseables. Los péptidos, polipéptidos y proteínas equivalentes biológicamente funcionales contemplados en el presente documento deben tener aproximadamente el 80% o más de similitud de secuencia, de manera preferible aproximadamente el 85% o más de similitud de secuencia, y de la manera más preferible aproximadamente el 90% o más de similitud de secuencia, con respecto a la secuencia, o resto correspondiente dentro, de la secuencia de aminoácidos de Cry3B fundamental.

Lo siguiente es una discusión basada en el cambio de los aminoácidos de una proteína para crear una molécula de segunda generación equivalente, o incluso mejorada. En realizaciones particulares de la invención, se contempla que las proteínas cristal mutadas son útiles para aumentar la actividad insecticida de la proteína, y por consiguiente aumentar la actividad insecticida y/o expresión del transgén recombinante en una célula vegetal. Los cambios de aminoácidos pueden lograrse cambiando los codones de la secuencia de ADN, según los codones dados en tablas de codones de aminoácidos fácilmente disponibles.

Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en una estructura proteica sin pérdida apreciable de capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión a antígeno de anticuerpos o sitios de unión en moléculas sustrato. Puesto que son la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína las que definen la actividad funcional biológica de la proteína, pueden realizarse ciertas sustituciones de secuencias de aminoácidos en una secuencia proteica, y, naturalmente, su secuencia codificante de ADN subyacente, y sin embargo obtener una proteína con propiedades similares. Por tanto se contempla por los inventores que puedan realizarse diversos cambios en las secuencias peptídicas de las composiciones dadas a conocer, o secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos péptidos sin pérdida apreciable de su actividad o utilidad biológica.

Al realizar tales cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir una función biológica interactiva en una proteína se entiende generalmente en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982, incorporado al presente documento por referencia). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares.

Se conoce en la técnica que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen una puntuación o índice hidropático similar y aún dar como resultado una proteína con actividad biológica similar, es decir obtener aún una proteína funcionalmente equivalente biológica. También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse de manera eficaz basándose en la hidrofilia. La patente estadounidense 4.554.101 establece que la mayor hidrofilia promedio local de una proteína, tal como se determina por la hidrofilia de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Se entiende que un aminoácido puede sustituirse por otro que tiene un valor de hidrofilia similar y obtener aún una proteína biológicamente equivalente, y en particular, una inmunológicamente equivalente.

Tal como esbozó anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente por tanto en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobia, hidrofilia, carga, tamaño y similares. Los expertos en la técnica conocen bien las sustituciones a modo de ejemplo que tienen en consideración varias de las características anteriores e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Los expertos en la técnica saben que los polinucleótidos que codifican \delta-endotoxinas derivadas de B. thuringiensis se expresan poco cuando se incorporan en el ADN nuclear de plantas transgénicas (recapitulado por Diehn et al., 1996). La secuencia de nucleótidos que codifica la \delta-endotoxina de interés está diseñada esencialmente tal como se describe en las patentes estadounidenses 5.500.365 y 5.689.052 y es 11231mv1 (SEC ID NO: 9).

Los péptidos, polipéptidos y proteínas biológica y funcionalmente equivalentes a Cry3B incluyen secuencias de aminoácidos que contienen cambios de aminoácidos conservadores en la secuencia fundamental mostrada en la SEC ID NO: 10 (11231mv1).

En tales secuencias de aminoácidos, uno o más aminoácidos en la secuencia fundamental se sustituye(n) por
otro(s) aminoácido(s), cuya carga y polaridad es similar a la del/de los aminoácido(s) nativo(s), es decir una sustitución de aminoácidos conservadora, que da como resultado un cambio silencioso.

Los sustitutos para un aminoácido dentro de la secuencia de polipéptidos fundamental pueden seleccionarse de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido que se produce de manera natural. Los aminoácidos pueden dividirse en los cuatro grupos siguientes: (1) aminoácidos ácidos; (2) aminoácidos básicos; (3) aminoácidos polares neutros y (4) aminoácidos no polares neutros. Los aminoácidos representativos dentro de estos diversos grupos incluyen, pero no se limitan a: (1) aminoácidos ácidos (cargados negativamente) tales como ácido aspártico y ácido glutámico; (2) aminoácidos básicos (cargados positivamente) tales como arginina, histidina y lisina; (3) aminoácidos polares neutros tales como glicina, serina, treonina, cisteína, cistina, tirosina, asparagina y glutamina; (4) aminoácidos no polares neutros (hidrófobos) tales como alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina.

Los cambios de aminoácidos conservadores dentro de la secuencia de polipéptidos fundamental pueden realizarse sustituyendo un aminoácido dentro de uno de esto grupos por otro aminoácido dentro del mismo grupo. Los equivalentes biológicamente funcionales de Cry3B pueden tener 10 o menos cambios de aminoácidos conservadores, más preferiblemente siete o menos cambios de aminoácidos conservadores, y lo más preferiblemente cinco o menos cambios de aminoácidos conservadores. La secuencia de nucleótidos codificante (gen, ADN de plásmido, ADNc, ADN que no se produce de manera natural o sintético) tendrá por tanto las sustituciones de base correspondientes, permitiéndolo codificar formas equivalentes biológicamente funcionales de Cry3B.

La presente invención proporciona procedimientos y composiciones para expresar \delta-endotoxinas Cry3B de B. thuringiensis que inhiben coleópteros o variantes de la secuencia de aminoácidos de las mismas a niveles inesperadamente altos en plantas transgénicas. Las composiciones y los procedimientos dados a conocer pueden aprovechar cualquiera de los constructos de ADN dados a conocer así como cualquiera de los vectores de transformación dados a conocer en el presente documento. Las composiciones y los procedimientos contemplados permiten que se expresen las \delta-endotoxinas Cry3Bb o variantes de secuencias de aminoácidos de las mismas en plantas sin afectar de manera negativa a la recuperación de las cualidad agronómicas de las plantas transgénicas. Las invenciones descritas en el presente documento permiten también la expresión de \delta-endotoxinas Cry3B y variantes a niveles hasta 500 veces mayores que el conseguido mediante las composiciones y procedimientos previos.

Los procedimientos descritos aquí permiten por tanto el uso de las plantas que expresan Cry3B o variantes como una alternativa o bien complemento para plantas que expresan otras proteínas Cry tales como una variante de Cry3B, una Cry3A o Cry3D o variante, CryET33 y CryET34 o variantes de las mismas, una CryET70 o variante, una CryET29 o variante, una Cry6A o Cry6B o variante, una Cry8B o variante, acil-lípido-hidrolasas insecticidas, combinaciones de aminoácido oxidasas y tedanalactama sintasas, y otras proteínas insecticidas tales como VIP1 y VIP3 y diversas combinaciones aisladas de especies de Heterorhabdus, Photorhabdus y Xenorhabdus para la gestión tanto del control como de la resistencia de plagas de insectos clave, incluyendo Ostrina sp, Diatraea sp, Diabrotica, Helicoverpa sp, Spodoptera sp en Zea mays; Heliothis virescens, Helicoverpa sp, Pectinophora sp. en Gossypium hirsutum; y Anticarsia sp, Pseudoplusia sp, Epinotia sp en Glycine max. También se contempla que los procedimientos descritos puedan usarse para aumentar drásticamente la expresión de \delta-endotoxinas de B. thuringiensis que incluyen y relacionadas con Cry3, aumentando así su eficacia contra plagas diana y reducir la probabilidad de desarrollar resistencia a estas proteínas. En una realización de la presente invención, se expresa una \delta-endotoxina Cry3. Las plagas diana de esta proteína y sus huéspedes comunes se muestran a continuación en la tabla 1.

TABLA 1 Plagas diana afectadas por la \delta-endotoxina Cry3B activa (inhibidora) frente a coleópteros y huéspedes vegetales comunes de estas plagas

1

Se requirieron anticuerpos para estudios que comparan la expresión de diversas secuencias codificantes de Cry3, de modo que se generó suero policlonal tal como sigue. Se recogieron cristales de Cry3 Bt a partir de una fermentación esporulada de la cepa 11037 recombinante de Bacillus thuringiensis que expresa Cry3Bb nativa. Se solubilizaron los cristales en tampón carbonato de sodio 100 mM, pH 10,5, para dar una concentración de 2,7 mg de proteína por ml tal como se midió mediante un ensayo colorimétrico de ácido bicinconínico (Smith et al, 1985). Se diluyó una muestra hasta una concentración de 0,4 mg/ml y se mezcló con un volumen igual de adyuvante completo de Freund. Se usó un inóculo de 1 mililitro de esta mezcla para la primera inyección intradérmica en un conejo. Se recogió un primer sangrado dos semanas más tarde. Se prepararon inyecciones posteriores de proteína Cry3Bb diseñada para reforzar el título inmunológico mezclando volúmenes iguales de proteína 0,2 mg/ml con volúmenes iguales de adyuvante incompleto de Freund. Se administraron inyecciones de 1 ml a intervalos de cuatro semanas, y se obtuvieron sangrados adicionales cada dos semanas. Se preparó suero inmunológico adecuado para fines analíticos a partir del conejo nº 783 tras la purificación con una cromatografía de afinidad en proteína A Sepharose CL-4B según las instrucciones del fabricante (Sigma Chemical Co, St. Louis, Missouri) y se concentró hasta 1 mg de proteína IgG por ml y se almacenó a oscuras a 4ºC. Se conjugó una muestra de este antisuero con enzima fosfatasa alcalina para su uso posterior en ensayos ELISA cualitativos.

Se recogieron muestras de hojas y raíces a partir de plantas que expresaban las proteínas variantes 11231, 11084, 11098 y 11247 de Cry3Bb. Se prepararon extractos de muestras de plantas tal como sigue. Se recogió tejido vegetal, partes de raíces u hojas, y se pesó en una escala en gramos. Se mezcló tejido de hojas con 20 partes de tampón TBA, peso con respecto a volumen. Se mezcló tejido de raíces con 10 partes de tampón TBA, peso con respecto a volumen. Se trituraron los tejidos en una emulsión usando una trituradora superior Wheaton^{TM} y se almacenaron en hielo a -20ºC. Se distribuyeron 250 \mul de antisuero de conejo anti-Cry3Bb diluido 1:1000 en tampón que contenía carbonato, pH 9,6, sobre cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos y se incubaron durante la noche 4ºC. Entonces se lavó la placa con PBST (3 x 5 min). Se cargaron muestras de extracto de tejido por duplicado a 20 \mul por pocillo y a diluciones variables con el fin de obtener un valor dentro de una curva patrón establecida usando la variante 11231 de Cry3Bb. Se incubaron las placas durante la noche a 4ºC, entonces se lavaron con PBST tres veces, cinco minutos cada vez. Se añadieron 50 microlitros del anticuerpo policlonal de conejo anti-Cry3B conjugado con fosfatasa alcalina a cada pocillo, seguido de la adición de 180 \mul de PBST que contenía un 1% de PVP-40 (Sigma). Tras la incubación durante la noche, se lavaron las placas con PBST (3 X 5 min) y se revelaron con disolución de revelado en color de fosfatasa alcalina constituida por 20 mg de fosfato de para-nitrofenilo en 25 ml de dietanolamina, pH 9,8, 200 \mul/pocillo). Se leyeron las placas a \lambda405 tras 15-20 min, usando una curva cuadrática ajustada a una curva patrón de proteína en la que la densidad óptica del patrón mayor era de aproximadamente 1,00.

5.0 Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la técnica apreciarán que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por el inventor para que funcionen bien en la puesta en práctica de la invención y, por tanto, puede considerarse que constituyen modos preferidos para su puesta en práctica.

5.1 Ejemplo 1

Aislamiento, caracterización e identificación de genes y proteínas Cry3, y construcción de variantes de secuencias de aminoácidos de las mismas

Los medios para identificar y caracterizar productos génicos tóxicos de coleópteros están bien documentados en la técnica, y también se conocen bien en la técnica procedimientos para aislar, caracterizar e identificar los genes que codifican tales productos génicos. Además, los medios para producir variantes de secuencias de aminoácidos de tales proteínas \delta-endotoxinas tóxicas de coleópteros también se conocen bien. En particular, Van Rie et al. (patente estadounidense número 5.659.123; 1997) identifican toxinas Cry3A y D que muestran propiedades de inhibición de coleópteros, y también exponen un procedimiento para identificar mutantes que pueden construirse que tienen una actividad insecticida reducida con respecto a la proteína de tipo natural. Van Rie et al. describe cómo pueden manipularse adicionalmente estos mutantes particulares para identificar toxinas variantes de secuencias de aminoácidos que muestran una actividad insecticida aumentada con respecto a la proteína de tipo natural. English et al. (documento WO 99/31248) describen otros procedimientos y composiciones, en particular para Cry3B, que permiten la identificación de productos génicos y genes que codifican Cry3 y los procedimientos que pueden usarse para construir e identificar variantes de secuencias de aminoácidos que muestran una actividad insecticida mejorada con respecto a la de la proteína Cry3 de tipo natural. Varias secuencias codificantes usadas en el presente documento se derivaron de las descritas en English et al. y las proteínas producidas a partir de estas secuencias codificantes representan en particular las variantes 11231 ó 11098 tal como se describen en ese documento.

5.2 Ejemplo 2

Construcción de vectores de expresión de plantas monocotiledóneas para las variantes de Cry3Bb Diseño de genes de variantes de cry3Bb para la expresión en plantas

Para una expresión eficaz de las variantes de Cry3Bb en plantas transgénicas, el gen que codifica las variantes debe tener una composición de secuencia adecuada (Diehn et al, 1996). Se muestra un ejemplo de una secuencia de este tipo para el gen v11231 (SEC ID NO: 7) que codifica la variante 11231 de la proteína Cry3Bb (SEC ID NO: 8) que muestra una actividad de Diabroticus. Este gen se derivó mediante mutagénesis (Kunkel, 1985) de un gen sintético de Cry3Bb (SEC ID NO: 5) que codifica una proteína esencialmente homóloga a la proteína codificada por el gen de Cry3Bb nativa (número de acceso de Gen Bank m89794; SEC ID NO: 1). Se usaron los siguientes oligonucleótidos en la mutagénesis del gen sintético de Cry3Bb original (SEC ID NO: 5) para crear el gen v11231 (SEC ID NO: 7)

2

Construcción de vector de expresión de plantas monocotiledóneas para cry3Bb

Para colocar el gen v11231 de la variante de Cry3Bb en un vector adecuado para su expresión en plantas monocotiledóneas (es decir bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor y conector al intrón hsp70 seguido por un sitio de poliadenilación de nopalina sintasa tal como en la patente estadounidense número 5.424.412; 1995 de Brown y Santino), se digirió el vector pMON19469 con NcoI y EcoRI. Se aisló la banda de vector mayor de aproximadamente 4,6 kb tras la electroforesis de los productos de digestión a través de un gel de agarosa, se purificó y se acopló con ADN ligasa de T4 al fragmento NcoI-EcoRI de aproximadamente 2 kb que contenía el gen v11231 (SEC ID NO: 7). Se transformó la mezcla de acoplamiento en una cepa de laboratorio útil de E. coli y se recuperaron colonias resistentes a carbenicilina. Se recuperó ADN de plásmido mediante procedimientos de ADN de miniprep a partir de cultivos durante la noche posteriores de colonias resistentes a carbenicilina seleccionadas en caldo que contenía antibióticos. Se sometió este ADN a análisis mediante endonucleasa de restricción con enzimas tales como NcoI y EcoRI, NotI y PstI para identificar clones que contenían la secuencia codificante v11231 fusionada con el intrón hsp70 bajo el control del promotor CaMV35S potenciado. Los clones identificados como tales se denominaron pMON33708.

Para colocar el gen v11231 en un vector adecuado para recuperar plantas resistentes a insectos y transformadas de manera estable, se aisló el fragmento de restricción de NotI de 3,75 kb a partir de pMON33708 que contenía la secuencia codificante de lisina oxidasa fusionada con el intrón hsp70 bajo el control del promotor CaMV35S potenciado, y se purificó tras la extracción a partir de un gel de agarosa. Se acopló este fragmento con pMON30460 tratado con NotI y fosfatasa alcalina de intestino de ternero. pMON30460 contiene la secuencia codificante de neomicina fosfotransferasa bajo el control del promotor CaMV35S. Se obtuvieron colonias resistentes a kanamicina mediante la transformación de esta mezcla de acoplamiento en E. coli y se identificaron colonias que contenían la banda apropiada mediante digestión con endonucleasa de restricción y se denominaron pMON33710. Se usaron enzimas de restricción tales como NotI, EcoRV, HindIII, NcoI, EcoRI y BgIII para identificar los clones apropiados que contenían el fragmento de NotI de pMON33708 en el sitio NotI de pMON30460 (es decir pMON33710) en la orientación tal que ambos genes están en tándem (es decir el extremo 3' del casete de expresión de v11231 está acoplado al extremo 5' del casete de expresión de nptII). La expresión de la proteína v11231 mediante pMON33710 en protoplastos de maíz se confirmó mediante electroporación de ADN de plásmido circular covalentemente cerrado de pMON33710 en protoplastos seguido por transferencia de proteínas y análisis de ELISA. Este vector puede introducirse en el ADN genómico de embriones de maíz mediante bombardeo con pistola de partículas seguido por selección con paromomicina para obtener plantas de maíz que expresan el gen v11231 esencialmente tal como se describe en la patente estadounidense número 5.424.412 de Brown y Santino. En este ejemplo, se introdujo el vector en escutelos de embriones inmaduros (EEI) de maíz mediante bombardeo conjunto junto un plásmido que confiere resistencia frente a higromicina, seguido de selección con higromicina y regeneración. Se identificaron líneas de maíz transgénico que expresaban la proteína v11231 mediante análisis ELISA puntuando tanto la presencia como la cantidad de proteína v11231 presente en cada muestra de extracto. Se autopolinizaron las plantas y se dejaron crecer hasta formar semillas. Se curaron las semillas de la progenie y se plantaron para producir plantas de maíz para trasplantar que se sometieron a pruebas posteriormente para determinar la protección frente a la alimentación por Diabroticus.

Rendimiento en las plantas de la variante 11231 de Cry3Bb

Se expusieron plantas de maíz transformadas que expresaban la proteína variante 11231 de Cry3Bb a larvas de gusanos de la raíz del maíz del oeste (WCR) tanto en un ensayo de trasplante como de maceta de 25,4 cm (10 pulgadas). El genotipo transformado fue A634, en el que se evaluó la progenie del cruce R0 por A634. Las observaciones incluyeron el efecto sobre el desarrollo de las larvas (peso), clasificación del daño de la raíz (CDR) y expresión de proteínas. El vector de transformación que contenía el gen de variante de Cry3Bb fue pMON33710. Los tratamientos incluyeron las isopoblaciones positiva y negativa para cada acontecimiento y un control de A634.

El ensayo de trasplante consistió en las siguientes etapas; i. se colocaron semillas individuales en tazas de 29,6 ml (1 onza) que contenían tierra para macetas; ii. al aparecer espigas, se infestó cada trasplante con 4 larvas recién nacidas, y iii. tras la infestación, se incubaron los trasplantes durante 7 días a 25ºC, HR al 50%, y fotoperiodo 14:10 (L:O). Se añadió humedad adecuada a la tierra para macetas durante el periodo de incubación para mantener el vigor del trasplante.

El ensayo en macetas de 25,4 cm (10 pulgadas) consistió en las siguientes etapas; i. se colocaron semillas individuales en macetas de 25,4 cm (10 pulgadas) que contenían tierra para macetas; ii. a los 14 días tras plantarlas, se infestó cada maceta con 800 huevos que se habían incubado previamente de tal manera que la eclosión se produjo 5-7 días tras la infestación; y iii. tras la infestación, se incubaron las plantas durante 4 semanas en las mismas condiciones medioambientales que el ensayo de trasplante. Se irrigaron diariamente las macetas tanto por arriba como por abajo.

Para el ensayo de trasplante, en el día 7 se proporcionó a las plantas una clasificación del daño de raíz (tabla 1) y se pesaron las larvas supervivientes. También en este momento, se determinaron las concentraciones de proteína Cry3Bb en las raíces mediante ELISA.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Escala de clasificación del daño de la raíz para el ensayo de trasplante.

CDR: 0 = sin alimentación visible

\quad: 1 = alimentación muy leve

\quad: 2 = alimentación leve

\quad: 3 = alimentación moderada

\quad: 4 = alimentación grave

\quad: 5 = alimentación muy grave

\vskip1.000000\baselineskip

Los resultados del ensayo de trasplante se muestran en la tabla 2. Las plantas que expresaban proteína Cry3Bb estaban completamente protegidas mediante alimentación de WCR, en las que las larvas supervivientes en este tratamiento no habían crecido. Los pesos medios de larvas oscilaban desde 2,03 - 2,73 mg para los tratamientos sin expresión, en los que el peso promedio de larvas supervivientes fue de 0,11 mg en el tratamiento con Cry3Bb de expresión. Las clasificaciones del daño de la raíz fueron 3,86 y 0,33 para las isopoblaciones sin expresión y con expresión, respectivamente. La supervivencia de larvas osciló desde el 75% - 85% para los tratamientos negativo y de control, en los que sólo sobrevivió el 25% de las larvas en el tratamiento con Cry3Bb.

TABLA 2 Efecto de plantas que expresan Cry3Bb sobre las larvas de WCR en un ensayo de trasplante

3

Para el ensayo en macetas de 25,4 cm (10 pulgadas), a las 4 semanas tras la infestación se registró el peso de las plantas y se proporcionó una clasificación del daño de la raíz (escala 1-6 de Iowa; Hills, T.M. y D.C. Peters. 1971; A method of evaluating post planting insecticide treatments for control of western corn rootworm larvae. Journal of Economic Entomology 64: 764-765.).

Los resultados del ensayo en macetas de 25,4 cm (10 pulgadas) se muestran en la tabla 3. Las plantas que expresaban proteína Cry3Bb tenían significativamente menos daño por alimentación y eran más altas que las plantas que no la expresaban. El acontecimiento 16, el más alto de los dos acontecimientos con expresión proporcionó un control casi completo. Los tratamientos negativos tuvieron clasificaciones de daño de la raíz muy altas lo que indicaba una presión de insectos muy alta. Las clasificaciones de daño de la raíz medias positivas fueron de 3,4 y 2,2 para los acontecimientos 6 y 16, respectivamente. La CDR media para el tratamiento negativo fue de 5,0 y 5,6.

TABLA 3 Efecto de Cry3Bb expresada en maíz para controlar la alimentación de larvas de WCR en un ensayo en maceta de 25,4 cm (10 pulgadas)

4

En resumen, las plantas de maíz que expresan proteína Cry3Bb tienen un efecto biológico significativo sobre el desarrollo de larvas de WCR tal como se observa en el ensayo de trasplante. Cuando se expusieron a niveles de infestación muy elevados, las plantas que expresan la proteína Cry3Bb se protegieron del daño por alimentación de larvas de WCR tal como se ilustra en el ensayo en maceta de 25,4 cm (10 pulgadas).

5.3 Ejemplo 3

Aumento de la expresión de una proteína Cry3Bb en maíz transgénico

Se comparó la expresión de una proteína Cry3Bb en plantas de maíz transformadas con vectores de expresión de Cry3Bb convencionales o preferidos. Las plantas transformadas con los vectores mejorados demostraron sistemáticamente niveles de expresión significativamente más altos de Cry3Bb en comparación con plantas transformadas con los vectores de Cry3Bb convencionales. Un vector de expresión pMON33710 en plantas de Cry3Bb convencional contiene un casete de expresión compuesto por una secuencia de promotor CaMV35S mejorada (P-CaMV.35S, SEC ID NO: 29), una secuencia de intrón Hsp70 de Zea mays (I-Zm.Hsp70, SEC ID NO: 33), una secuencia que no se produce de manera natural que codifica proteína variante v11231 de Cry3Bb (Bt.cry3Bb.v11231, SEC ID NO: 7) y una secuencia de poliadenilación y terminación de la transcripción de nopalina sintasa (T-AGRtu.nos, SEC ID NO: 34). Otro vector de expresión pMON33709 en plantas de Cry3Bb convencional contiene un casete de expresión compuesto por una secuencia de promotor CaMV35S mejorada (P-CaMV.35S, SEC ID NO: 29), una secuencia de intrón Hsp70 de Zea mays (I-Zm.Hsp70, SEC ID NO: 33), una secuencia codificante de CTP de Zea mays (TS-Zm.rbc1, SEC ID NO: 25), una secuencia que no se produce de manera natural que codifica proteína variante v11231 de Cry3Bb (Bt.cry3Bb.v11231, SEC ID NO: 7) y una secuencia de poliadenilación y terminación de la transcripción de nopalina sintasa (T-AGRtu.nos, SEC ID NO: 34). El vector de expresión pMON25097 en plantas está mejorado en comparación con pMON33710 según se evalúa mediante los niveles de expresión de Cry3Bb in planta, y contiene un casete de expresión que comprende una secuencia de promotor CaMV35S AS4 que no se produce de manera natural (P-CaMV.AS4, SEC ID NO: 30), una secuencia líder no traducida de proteína de unión A/B a clorofila de trigo (L-Ta.hcb1, SEC ID NO: 31), una secuencia de intrón de actina de arroz (I-Os.Act1, SEC ID NO: 32) y una secuencia que no se produce de manera natural que codifica proteína variante 11231mv1 de Cry3Bb (11098) (Bt.cry3Bb.1 1231mv1, SEC ID NO: 9) unida a una secuencia de poliadenilación y terminación de la transcripción de Hsp17 de choque térmico de trigo (T-Ta.Hspl7, SEC ID NO: 35). Otro vector preferido es pMON25096, que contiene un casete de expresión (SEC ID NO: 17) que comprende una secuencia de promotor CaMV35S AS4 que no se produce de manera natural (P-CaMV.AS4, SEC ID NO: 30), una secuencia líder no traducida de proteína de unión A/B a clorofila de trigo (L-Ta.hcb1, SEC ID NO: 31), una secuencia de intrón de actina de arroz (I-Os.Actl, SEC ID NO: 32), una secuencia codificante de PDC de Zea mays (TS-Zm.rbcl, SEC ID NO: 25) y una secuencia que no se produce de manera natural que codifica proteína variante 11231mvl de Cry3Bb (Bt.cry3Bb.11231mv1, SEC ID NO: 9) unida a una secuencia de poliadenilación y terminación de la transcripción de Hsp17 de choque térmico de trigo (T-Ta.Hsp17, SEC ID NO: 35). Todos los vectores contienen un casete idéntico unido al casete de expresión de Cry3Bb que confiere resistencia a la paromomicina al tejido vegetal transformado. Este casete de resistencia consiste en una secuencia de promotor CaMV35S mejorada y una secuencia codificante de neomicina fosfotransferasa unida a una secuencia de poliadenilación y terminación de la transcripción de nopalina sintasa. En la tabla 4 se presenta un resumen de los vectores convencionales y mejorados. Las plantas de maíz transgénicas resistentes a paromomicina se derivaron esencialmente tal como se describe en la patente estadounidense 5.424.412 (1995).

TABLA 4 Resumen de vectores de expresión en plantas

5

Se sometieron protoplastos de hoja de maíz a electroporación con vectores convencionales (pMON33709 o
pMON33710) o vectores mejorados (pMON33722, pMON33723, pMON25096, pMON25097, pMON33741) tal como se describe (Sheen, Plant Cell 2: 1027-1038, 1990) y se comparó la expresión transitoria de proteínas variantes de Cry3Bb mediante procedimientos de análisis de ELISA y e inmunotransferencia de tipo Western. El ELISA utilizó un anticuerpo de captura de conejo anti-IgG purificada mediante cromatografía con Cry3B preparado contra Cry3B 11231, una muestra de ese anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina como el anticuerpo de detección secundario y una proteína nativa Cry3Bb purificada como patrón. La comparación de la proporción de los niveles de expresión de Cry3Bb con respecto a neomicina fosfotransferasa (Npt II) mediante ELISA indicó que se obtuvieron aumentos de aproximadamente dos veces en los niveles de expresión normalizados de proteína variante 11231 de Cry3Bb con los vectores mejorados pMON33723 y pMON33722 con respecto a los vectores convencionales pMON33710 y pMON33709, respectivamente (exp. 1, tabla 5). Las diferencias en la expresión de Cry3Bb se atribuyen directamente al casete de expresión mejorado en los vectores mejorados en vez de a diferencias en la eficacia de electroporación de protoplastos ya que la expresión de la proteína Cry3Bb está normalizada para el Npt II producido por el gen nptII unido idéntico presente en todos los vectores. Los vectores mejorados más preferidos tales como pMON25096, pMON25097 y pMON33741 expresaron niveles normalizados aproximadamente 10 veces superiores de proteína Cry3Bb y Cry3Bb variante que los vectores mejorados preferidos tales como pMON33722 o pMON33723 (tabla 5, exp. 2, 3). Finalmente, los vectores pMON33741 y pMON25097 igualmente preferidos proporcionaron una expresión de Cry3Bb normalizada aproximadamente equivalente (tabla 5, exp. 4)

TABLA 5

6

Ya que el casete de expresión mejorado en pMON25097 codifica la toxina variante 11231mvl de Cry3Bb (11098), y el casete convencional en pMON33710 codifica la variante v11231 de Cry3Bb que se diferencian en un único aminoácido, se comparó la inmunorreactividad intrínseca de las dos proteínas en el ensayo ELISA. Los experimentos de ELISA posteriores con proteínas variantes v11231 y 11231mv1 de Cry3Bb (11098) producidas en, y purificadas a partir de B. thuringiensis indican que las dos proteínas tienen niveles similares de inmunorreactividad. En consecuencia, el aumento observado en los niveles de proteína 11231mvl de Cry3Bb (11098) producidos por el casete de expresión en pMON25097 se debe a un aumento de los niveles de expresión en vez de a una diferencia en la inmunorreactividad. Los análisis de transferencia de proteínas confirman que el aumento del nivel de material de reacción cruzada producido en protoplastos de maíz a partir del casete de expresión mejorado de Cry3Bb en pMON25097 se debió a un aumento de la acumulación de una proteína de una Mr de aproximadamente 60.000 inmunorreactiva con antisuero de Cry3B que también migra conjuntamente con proteína variante 11231 de Cry3Bb producida en una cepa B. thuringiensis con cry recombinante a partir de pEG7174. Los casetes de expresión de proteína variante de Cry3Bb igualmente preferidos y mejorados en pMON33741 y pMON33748 que codifican Cry3Bb.11231 también muestran aumento de los niveles de expresión de Cry3Bb con respecto a la expresión observada a partir del casete convencional en pMON33710. Estos resultados confirman que las diferencias en la expresión se deben a las composiciones mejoradas descritas en el presente documento en vez de a diferencias en la inmunorreactividad intrínseca de las diferentes variantes.

Se sometió el tejido de raíz a partir de plantas transgénicas en la fase R_{0} obtenido independientemente tras la transformación con un vector mejorado (pMON33723, 25097) o con un vector convencional (pMON 33710) a análisis cuantitativo de los niveles de proteína Cry3Bb mediante un ensayo de ELISA cuantitativo. La comparación de los niveles de expresión de Cry3Bb o variante de proteína Cry3Bb en plantas de maíz transformadas con vector mejorado y convencional muestra que la expresión de la variante Cry3Bb.11231 no supera los 50 ppm en los transgénicos con pMON33710 convencional mientras que la expresión de Cry3Bb.11098 (11231mv1) en los transgénicos con pMON25097 mejorado es con frecuencia superior a 50 ppm (tabla 6). Los análisis de transferencia de proteínas confirman que el aumento del nivel de material de reacción cruzada producido por pMON25097 (mejorado) se debieron a un aumento de la acumulación de una proteína de Mr de aproximadamente 60.000 que migra con el patrón de Cry3Bb a partir de B. thuringiensis. Otros casetes de expresión de variante de proteína Cry3Bb mejorados encontrados en pMON33741 y 33748 también proporcionan de manera coherente acontecimientos de transformación independiente (ATI) seleccionados con niveles de variante de proteína Cry3Bb superiores a 100 ppm mientras que los vectores convencionales nunca dieron lugar a ATI con más de 50 ppm de variante de proteína Cry3Bb (tabla 7). La expresión de alto nivel es evidente en los genotipos de maíz tanto H99 como A634, lo que indica que las composiciones descritas en el presente documento tienen una amplia utilidad para muchas variedades de maíz cultivado comercialmente. Se espera que tales líneas de variante de proteína Cry3 de alta expresión seleccionadas obtenidas con los vectores descritos en el presente documento sean especialmente ventajosas para conferir altos niveles de protección frente al daño por alimentación de insectos y para reducir la incidencia de la resistencia de insectos frente a proteínas insecticidas Cry3.

TABLA 6 Comparación de la expresión de Cry3Bb en maíz R_{0} transformado con casetes de expresión de variante de proteína Cry3Bb convencionales y mejorados

7

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 7 Expresión de Cry3Bb en maíz R_{0} transformado con casetes de expresión de variante de proteína Cry3Bb mejorados

8

La progenie derivada a partir de plantas de maíz transformadas tanto con los casetes convencionales (pMON33709 y pMON33710) como preferidos (pMON25096, 25097, 33722, 33723, 33726, 33741 y 33748) que expresaban 10 ppm o más de proteína Cry3Bb se sometieron a pruebas adicionales para determinar su resistencia al daño por la alimentación del gusano de la raíz del maíz (CRW) en ensayos basados en invernaderos o cámara de crecimiento tal como se describió anteriormente (English et al., documento WO 99/31248). Se obtuvieron plantas de maíz transgénicas resistentes al gusano de la raíz del maíz a partir de esencialmente todos los vectores preferidos (tabla 8). Por ejemplo, se usó el vector pMON25096 mejorado para generar 89 acontecimientos de transformación independiente (ATI), 14 líneas de progenie F_{1} con pMON25096 independientes expresaban 10 ppm o más de la banda de Cry3B, presentando 7 líneas de progenie F_{1} niveles significativos de resistencia a CRW (una clasificación de CDR \geq 3,5 en una escala de clasificación de 0-6). En cambio, no se obtuvo ni un único acontecimiento con una escala de CDR \leq 3,5 a partir de 12 de las líneas de progenie F_{1} con casete pMON33710 convencional que expresaban 10 ppm o más de variante de proteína Cry3Bb. El fracaso en obtener líneas resistentes a CRW con cualquiera de los vectores convencionales (pMON33709 o pMON33710) no se debió a números insuficientes de ATI ya que se generaron más de 300 ATI a partir de cada uno de esos dos vectores y se examinaron para seleccionar progenie F_{1} resistente a CRW. Se generaron muchos menos ATI con vectores preferidos tales como pMON33722, pMON33723 y pMON25096, aunque todos dieron lugar finalmente a líneas de progenie F_{1} resistentes a CRW.

TABLA 8

9

En ejemplos proporcionados en el presente documento, se proporcionan evidencias experimentales de que composiciones sustancialmente equivalentes basadas en las mejoras descritas en el presente documento dan mejoras equivalentes en el rendimiento con respecto a patrones anteriormente descritos. Más específicamente, se demuestra que las composiciones mejoradas que codifican variantes tanto Cry3Bb.11098 como Cry3Bb.11231 ambas dan un rendimiento equivalentemente mejorado con respecto a las composiciones convencionales previamente descritas que codifican Cry3Bb.11231. Por tanto se deduce que se contempla el uso de otras variantes de Cry3B con actividades biológicas específicas que son superiores o iguales a Cry3Bb.11098 o Cry3Bb.11231 mediante y dentro del alcance de esta invención. Por ejemplo, las composiciones de vector mejorado que codifica variantes de Cry3Bb incluyen 11231, 11084, 11098, 11247 y otros tal como se expone en English et al., solicitudes estadounidenses con números de serie 08/993.170, 08/993.722, 08/993.755 y 08/996.441, todas presentadas el 18 de diciembre de 1997, y pueden derivarse de pMON25095 usando procedimientos de mutagénesis convencionales de una manera esencialmente equivalente para la construcción de pMON33740.

5.4 Ejemplo 4

Los casetes de expresión preferidos confieren resistencia al daño por CRW en pruebas en el campo

Se evaluaron en el campo plantas de maíz genéticamente modificadas para expresar variantes de proteína Cry3Bb derivadas de los vectores preferidos pMON33722, pMON33723, pMON25096 y pMON25097 para determinar el control del gusano de la raíz del maíz del oeste, Diabrotica vergifera vergifera LeConte (WCR). No se llevó ninguna de las plantas de maíz transformadas con los vectores convencionales a las pruebas en el campo ya que ninguna presentó un control del gusano de la raíz del maíz adecuado en las pruebas en invernadero (ejemplo 3, tabla 8). Los ensayos de eficacia se realizaron en una granja de investigación de Monsanto en Jerseyville, Illinois, y en el Northern Grain Insects Research Laboratory (laboratorio del norte de investigación de insectos del grano), estación de investigación ARS del USDA en Brookings, Dakota del sur. Estos ensayos sirven para evaluar el rendimiento de los casetes preferidos en el terreno con una gran presión de insectos y comparar su rendimiento con los insecticidas actuales comercialmente disponibles.

Se seleccionaron diecisiete acontecimientos de transformación independiente (ATI) para la evaluación en el campo basándose en el rendimiento en invernadero. La cantidad de semillas disponibles para la evaluación en el campo varió para cada ATI. De estos 17 acontecimientos, sólo se plantaron siete en la estación de investigación de Brookings. El diseño en el campo para la ubicación de Brookings fueron bloques completos aleatorizados (BCA) con 2 repeticiones, en el que cada parcela tenía una única fila que contenía un máximo de 30 plantas. Se plantaron los 17 ATI en la ubicación de Jerseyville, en la que el diseño fue BCA con un máximo de 4 repeticiones, parcelas de 1 fila cada una, en el que el número de repeticiones dependió de las semillas disponibles de cada ATI. Debido a esto, el número de repeticiones en Jerseyville osciló desde dos hasta cuatro. Los tratamientos adicionales incluyeron un control sin tratar (maíz no transgénico) e insecticidas comerciales, incluyendo Counter®, Lorsban® y Force®. Los tratamientos con insecticida sólo se realizaron en la ubicación de Jerseyville. Los insecticidas se aplicaron como una banda de veinte con treinta y dos centímetros (ocho pulgadas) usando las tasas recomendadas.

Las fechas de plantación fueron el 28 de mayo y el 3 de junio para Jerseyville y Brookings, respectivamente. El estudio se realizó tal como sigue; se infestaron las parcelas con huevos de CRW en la plantación con 1.600 huevos por 30,48 cm (1 pie) de fila, aproximadamente 800 huevos por planta. En la fase de crecimiento vegetal V1 - V2, se analizaron las plantas para determinar la presencia de expresión de la variante de proteína Cry3Bb usando un ELISA. Se eliminaron las plantas negativas para el gen de la parcela.

Al final de la fase de alimentación por larvas de CRW, cuando se había producido el daño máximo, se evaluaron todas las plantas restantes en cada parcela para determinar la lesión por alimentación de la raíz usando una escala de clasificación del daño de la raíz (CDR) de 1 - 6 descrita por Hills y Peters (1971). La escala de CDR es tal como sigue;

Clasificación del daño de la raíz:

1. Sin marcas por alimentación

2. Marcas por alimentación visibles, pero sin raíces cortadas hasta los 4 cm del tallo

3. Una o más raíces nodales cortadas hasta los 4 cm del tallo, pero menos del equivalente a un nódulo de raíces cortadas

4. Equivalente a un nódulo de raíces cortadas

5. Equivalente a dos nódulos de raíces cortadas

6. Equivalente a tres o más nódulos de raíces cortadas.

El 25 de julio y el 3 de agosto se evaluaron los ensayos en el campo en Jerseyville y Brookings, respectivamente. Las CDR medias para todos los tratamientos se ilustran en la tabla 9. De los diecisiete ATI evaluados, 16 ATI controlaron la alimentación de CRW, CDR \leq 3,0. Dos de los tres patrones químicos tuvieron una CDR inferior a 3,0. Force® tuvo una clasificación del daño de la raíz de 3,2. Todos los tratamientos, excepto un ATI, WCR20, fueron significativamente mejores que los controles (p < 0,01) pero no se diferenciaron significativamente entre sí. La figura uno ilustra la diferencia en el daño por alimentación de larvas entre una planta transgénica resistente a CRW y un control no tratado.

Aunque los ATI no se diferenciaron significativamente de los patrones químicos con respecto a la clasificación del daño de la raíz, la cantidad de lesión por alimentación observada en las raíces de los tratamientos con insecticida fue superior a las raíces que expresaban el gen propiedad de Monsanto. La falta de diferencia entre la clasificación del daño de la raíz es un artefacto de la escala de clasificación de la raíz, en el que esta escala se basa en raíces "cortadas". Hills y Peters describen una raíz cortada como que tiene menos de 4 cm de longitud debido a la alimentación de CRW. Por tanto, a las masas de raíz sin una raíz "cortada" pero marcas por alimentación visibles se les da una clasificación de 2. Las raíces fuera de la zona de protección de los tratamientos con insecticida pueden tener muchas más marcas por alimentación y en la mayoría de los casos se destruyeron las puntas de las raíces en comparación con los ATI. Al contrario que los tratamientos con insecticidas, las plantas transgénicas expresan el gen resistente a CRW a lo largo de toda la masa de la raíz. Pero debido a que el mecanismo para el control de la planta transgénica está mediado por vía oral, se requiere una cantidad mínima de alimentación para controlar cualquier lesión adicional por las larvas de CRW. Este requisito de alimentación mínimo dio como resultado una CDR de 2.

En resumen, las plantas de maíz que expresaban variantes de proteína Cry3Bb estaban totalmente protegidas frente a la alimentación de larvas de CRW. Este nivel de protección elimina la necesidad de un tratamiento con insecticidas. Se incorporan insecticidas, incluyendo organofosfatos, carbamatos y piretroides, a la tierra sobre más de 6,48 millones de hectáreas (16 millones de acres) de maíz al año para controlar el CRW. La tecnología de resistencia al CRW tiene el potencial para reducir significativamente el nivel de exposición actual de estos insecticidas en el medioambiente. Los beneficios de cambiar los insecticidas de la tierra por un enfoque transgénico son impresionantes e incluyen una reducción de los posibles riesgos de seguridad y salud humana, reducción de los impactos directos sobre organismos a los que no se dirigen, reducción de la contaminación de los suministros de agua de superficie y subterránea, disminución de los problemas de eliminación de depósitos de pesticidas y compatibilidad general con otros programas agronómicos y de control de plagas.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 9 Medios de daño por alimentación de la raíz (CDR) de gusano de la raíz del maíz para acontecimientos de transformación independientes de la raíz que contienen el gen resistente a CRW propiedad de Monsanto

12

\newpage

5.5 Ejemplo 5

Transformación de cloroplastos del tabaco con un gen cry3B

Pueden producirse plantas recombinantes en las que sólo se ha alterado el ADN de las mitocondrias o los cloroplastos para incorporar las moléculas previstas en esta solicitud. Se conocen promotores que funcionan en cloroplastos en la técnica (Hanley-Bowden et al., Trends in Biochemical Sciences 12: 67-70, 1987). Se han descrito procedimientos y composiciones para obtener células que contienen cloroplastos en los que se ha insertado ADN heterólogo, por ejemplo por Daniell et al. (patente estadounidense número 5.693.507; 1997) y Maliga et al. (patente estadounidense número 5.451.513; 1995). Puede construirse un vector que contiene un casete de expresión a partir del cual puede producirse una proteína Cry3B. Un casete puede contener una secuencia de promotor que funciona en cloroplastos que dirige la expresión de un gen cry3B de proteína cristal, construido de una manera muy similar a los otros polinucleótidos en el presente documento, usando metodologías de amplificación térmica, digestión por endonucleasa de restricción y acoplamiento etc. Un gen que puede expresarse en cloroplastos proporcionará un promotor y una región no traducida en 5' a partir de un gen heterólogo o gen de cloroplasto tal como psbA, que proveerá la transcripción y traducción de una secuencia de ADN que codifica una proteína Cry3B en el cloroplasto; una secuencia de ADN que codifica una proteína Cry3B; y una región de terminación de la transcripción y la traducción tal como una región de repetición invertida en 3' de un gen de cloroplasto que puede estabilizar un ARNm de cry3B expresado. La expresión desde dentro del cloroplasto potenciará la acumulación de producto del gen cry3B. Puede transformarse una célula huésped que contiene cloroplastos o plástidos con el casete de expresión y entonces puede hacerse crecer la célula resultante que contiene los cloroplastos transformados para expresar la proteína Cry3B. Un casete también puede incluir un gen de tolerancia a herbicida, antibiótico o de otro marcador seleccionable además del gen cry3B. El casete de expresión puede estar flanqueado por secuencias de ADN obtenidas a partir de un ADN de cloroplasto lo que facilitará la integración estable del casete de expresión en el genoma del cloroplasto, particularmente mediante recombinación homóloga. Como alternativa, el casete de expresión puede no integrarse, pero al incluir un origen de replicación obtenido de un ADN de cloroplasto, podrá proporcionar la replicación del gen cry3B heterólogo en el cloroplasto. Pueden generarse plantas a partir de células que contienen cloroplastos transformados y entonces pueden hacerse crecer para producir semillas, a partir de las cuales pueden generarse plantas adicionales. Tales procedimientos de transformación son ventajosos sobre la transformación de genoma nuclear, en particular cuando la transformación de los cloroplastos se realiza mediante integración en el genoma del cloroplasto, dado que los genes de cloroplastos se heredan generalmente por vía materna. Esto proporciona plantas transgénicas "más seguras" para el medioambiente, eliminando prácticamente la posibilidad de que escapen al medioambiente. Además, pueden transformarse cloroplastos múltiples veces para producir genomas de cloroplastos funcionales que expresan múltiples proteínas recombinantes deseadas, mientras que se ha demostrado que la transformación genómica nuclear está bastante limitada cuando se desean múltiples genes. Por tanto se evitan acontecimientos de segregación usando la transformación de cloroplastos o plástidos. Al contrario que la expresión en el genoma nuclear de la planta, la expresión en cloroplastos o plástidos puede iniciarse a partir de únicamente un promotor y continuar a lo largo de una región policistrónica para producir múltiples péptidos a partir de un único ARNm.

El casete de expresión se producirá de una manera muy similar a la que se construyen los otros vectores de transformación de plantas. Pueden insertarse secuencias de ADN que funcionan en cloroplastos de plantas en un plásmido bacteriano y acoplarse a secuencias de ADN que expresan los productos génicos deseados, tales como proteínas Cry3B, de manera que se produce proteína Cry3B dentro del cloroplasto, evitando la necesidad de una regulación génica nuclear, rematado de extremos, corte y empalme o poliadenilación de genes regulados de manera nuclear, o secuencias dirigidas a cloroplastos o plástidos. Un casete de expresión que comprende un gen cry3B, que se construye sintéticamente o bien es un gen nativo derivado directamente de un genoma de B. thuringiensis o un elemento episomal de B. thuringiensis, se insertará en un sitio de restricción en un vector construido con el fin de la transformación de cloroplastos o plástidos. El casete estará flanqueado en el sentido de 5' por un promotor funcional de cloroplastos o plástidos y en el sentido de 3' por una secuencia de terminación de la transcripción y la traducción funcional de cloroplastos o plástidos. El casete resultante se incorporará en el genoma del cloroplasto o plástido usando procedimientos de recombinación homóloga bien conocidos.

Como alternativa, podía obtenerse la transformación de cloroplastos o plástidos usando un plásmido de replicación autónoma u otro vector que pueda propagarse dentro del cloroplasto o plástido. Un medio para llevar a cabo este procedimiento sería utilizar una porción del genoma del cloroplasto o plástido requerida para el inicio de la replicación del cloroplasto o plástido como un medio para mantener el plásmido o vector en el cloroplasto o plástido transformado. Una secuencia que permite la replicación estable de un elemento epigenético de cloroplasto o plástido se identificaría fácilmente a partir de la clonación aleatoria de un genoma de cloroplasto o plástido en un vector bacteriano convencional que también contiene un gen marcador seleccionable para cloroplastos o plástidos, seguido de la transformación de cloroplastos o plástidos y la selección de células transformadas en un medio de selección apropiado. La introducción de un casete de expresión tal como se describe en el presente documento en un elemento epigenético replicable en cloroplastos o plástidos proporcionaría así un medio eficaz para localizar una \delta-endotoxina Cry3B de B. thuringiensis en el cloroplasto o plástido.

\newpage

5.6 Ejemplo 6

Direccionamiento de la proteína Cry3Bb variante o Cry3Bb a plástidos

La expresión mejorada mediante el direccionamiento de proteína insecticida recombinante al cloroplasto puede dar como resultado tejidos que están expuestos a la luz y que acumulan cloroplastos maduros como resultado. La mejora de la expresión en el tejido de las hojas para inhibir plagas que se alimentan de hojas susceptibles a la proteína insecticida podría ser ventajosa. Para someter esto a prueba, se construyeron dos plásmidos, pMON33709 y pMON33710, que eran isogénicos con respecto a todos los elementos con la excepción de una secuencia que se dirige a plástidos o cloroplastos unida en marco a la variante insecticida mejorada de Cry3Bb en pMON33709. Se recuperaron las plantas de maíz R_{0} y se demostró que contenían y expresaban el transgén mediante ELISA. Se recuperaron seis líneas de pMON33709 y dieciséis líneas de pMON33710 que expresaban el transgén tanto en la raíz como en las hojas. Se recuperó tejido de las hojas y de la raíces y se analizó para determinar la presencia y cantidad de proteína variante de Cry3Bb, medida en partes por millón. Los resultados se muestran en la tabla 10.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 10 Comparación de la expresión no dirigida y dirigida a plástidos en hojas frente a raíces de la variante v11231 de Cry3Bb en acontecimientos de transformación en maíz R_{0}

13

14

Todas excepto una línea de pMON33709 (R053643) produjeron entre 3 y 15 veces más proteína insecticida en las hojas que en el tejido de las raíces. La línea que produjo menos en las hojas también produjo menos de 1 ppm en la raíz, mientras que las otras líneas produjeron hasta casi 100 ppm en las hojas. La cantidad de proteína variante de Cry3Bb expresada era incluso más variable en las líneas no dirigidas derivadas de acontecimientos de transformación de pMON33710 que se determinó que expresaban la proteína recombinante tanto en los tejidos de las hojas como de las raíces. Mientras que la mayoría de estas líneas producían más proteína en las hojas que en las raíces, algunas también producían más en las raíces, pero la diferencia en la cantidad producida en las raíces en expresores de raíz mejorados era menos sustancial que el único acontecimiento dirigido de pMON33709. Además, el intervalo de niveles de expresión era menos pronunciado en los acontecimientos no dirigidos con una excepción. Sorprendentemente, una línea (R053904) produjo sustancialmente más proteína en las hojas que lo observado en cualquier otra línea, dirigida o no dirigida. Se espera que esta línea sea un candidato para una línea comercial dirigida a la protección contra plagas de coleópteros que se alimentan de tejidos de las hojas. A la inversa, se espera que las líneas tales como R053923 sean candidatos óptimos para proteger plantas de maíz contra plagas que se alimentan de raíces tales como los gusanos de la raíz del maíz.

Los datos en resumen indican que el direccionamiento de la proteína Cry3B de Bt al plástido o cloroplasto mejora la acumulación de la proteína en el tejido de las hojas pero no en el tejido de las raíces y mejora la expresión global de la proteína en hojas en plantas transformadas con tales constructos en comparación con los niveles de expresión observados en los tejidos de raíces en esas mismas plantas.

En vista de lo anterior, se observará que se logran las diversas ventajas de la invención y se obtienen otros resultados ventajosos.

<110> Romano, Charles P.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Expresión mejorada de Cry3Bb en maíz

\vskip0.400000\baselineskip

<130> Expresión mejorada de Cry3Bb 38-21(15304) en maíz

\vskip0.400000\baselineskip

<140> desconocido

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 19-08-1999

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/097.150

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 19-08-1998

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2,0

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1959

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1956)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de nucleótidos que se produce de manera natural que codifica una secuencia de aminoácidos de Cry3Bb1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

15

16

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 652

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

19

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1959

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1956)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de nucleótidos que se produce de manera natural que codifica una secuencia de aminoácidos de Cry3Bb2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 652

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1962

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de nucleótidos sintética o que no se produce de manera natural que codifica una secuencia de aminoácidos de Cry3Bb

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1956)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

28

29

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 652

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

31

32

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1989

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de nucleótidos que no se produce de manera natural que codifica una secuencia de aminoácidos de la variante v11231 de Cry3Bb

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(1961)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia codificante para la secuencia de aminoácidos de la variante v11231 de Cry3Bb

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

34

35

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 653

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

37

38

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1984

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de nucleótidos que no se produce de manera natural que codifica una secuencia de aminoácidos de la variante 11231mv1 de Cry3Bb

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(1961)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia codificante para una secuencia de aminoácidos de la variante 11231mv1 de Cry3Bb

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

40

42

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 653

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

44

45

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1984

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de nucleótidos que no se produce de manera natural que codifica una secuencia de aminoácidos de la variante 11231mv2 de Cry3Bb

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(1961)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia codificante para una secuencia de aminoácidos de la variante 11231mv2 de Cry3Bb

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

47

48

49

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 653

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

51

52

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4149

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: casete de expresión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)..(640)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P-CaMV.35S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (669)..(1472)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Zm.Hsp70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido de tránsito

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1489)..(1635)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TS-Zm.rbcS aminoterminal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1636)..(1798)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Zm.rbcS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido de tránsito

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1799)..(1885)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TS-Zm.rbcS de extremo carboxiterminal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1885)..(3843)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> variante v11231 de Cry3Bb1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> terminador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3871)..(4127)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de poliadenilación y terminación de la transcripción 3' de T-AGRtu.nos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

54

55

56

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 653

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

58

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3754

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: casete de expresión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)..(640)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P-CaMV.35S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (669)..(1472)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Zm.Hsp70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1490)..(3448)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> variante v11231 de Cry3Bb1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> terminador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3475)..(3730)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de poliadenilación y terminación de la transcripción en 3' de Agrobacterium tumefaciens nos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

60

61

62

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 653

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

64

65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3450

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: casete de expresión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(235)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P-CaMV.AS4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> 5'UTR

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (240)..(304)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> L-Ta.hcb1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (318)..(805)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Os.Act1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido de tránsito

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (825)..(971)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TS-Zm.rbcS aminoterminal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (972)..(1134)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Zm.rbcS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido de tránsito

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1135)..(1221)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TS-Zm.rbcS de extremo carboxiterminal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1222)..(3180)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> variante 11231mv1 de Cry3Bb1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> terminador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3198)..(3431)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> T-Ta.hsp17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

67

68

69

70

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 653

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

72

73

74

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3039

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: casete de expresión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(235)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P-CaMV.AS4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> 5'UTR

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (240)..(304)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> L-Ta.hcb1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (318)..(805)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Os.Act1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (811)..(2769)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> variante 11231mv1 de Cry3Bb1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> terminador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2787)..(3020)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> T-Ta.hsp17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

75

76

77

78

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 653

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

79

80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3039

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: casete de expresión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(235)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P-CaMV.AS4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> 5'UTR

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (240)..(304)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> L-Ta.hcb1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (318)..(805)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Os. Act1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (811)..(2769)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> variante 11231mv2 de Cry3Bb1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> terminador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2787)..(3020)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> T-Ta.hsp17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

81

82

83

84

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 653

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

85

86

87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3469

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: casete de expresión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)..(640)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P-CaMV.35S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> 5'UTR

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (664) .. (734)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> L-Ta.hcb1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (748)..(1238)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 1-Os.Act1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1241)..(3199)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> variante 11231mv2 de Cry3Bb1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> terminador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3217)..(3450)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> T-Ta.hsp17

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

88

89

90

91

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 653

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

92

93

94

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 416

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de nucleótidos que no se produce de manera natural que codifica el péptido ribulosa bis-fosfato carboxilasa que se dirige a cloroplastos de Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(162)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (326)..(415)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (163)..(325)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Zm.rbcS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

95

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

96

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

97

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

98

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 202

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del mosaico de la coliflor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

99

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 416

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: promotor AS4 del virus del mosaico de la coliflor modificado

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

100

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Triticum aestivum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

101

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 804

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

102

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 804

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

103

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 257

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Agrobacterium tumefaciens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

104

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Triticum aestivum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3455

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: casete de expresión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14).. (235)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P.CaMV.AS4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> 5'UTR

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (240)..(304)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> L-Ta.hcb1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (318)..(805)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Os.Act1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido de tránsito

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (825)..(971)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia codificante de TS-Zm.rbcS aminoterminal en el sentido de 5' de intrón rbcS de Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (972)..(1134)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Zm.rbcS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido de tránsito

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1135)..(1221)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia codificante de TS-Zm.rbcS de extremo carboxiterminal en el sentido de 3' de intrón rbcS de Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1222)..(3180)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia codificante que codifica la variante v11231 de Cry3BB1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> terminador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3198)..(3431)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> T-Ta.hsp17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

106

107

108

109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 653

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

110

111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3044

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: casete de expresión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(235)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P-CaMV.AS4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> 5'UTR

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (240)..(304)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> L-Ta.hcb1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (318)..(805)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Os. Act1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (811)..(2769)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia codificante que codifica la variante v11231 de Cry3Bb1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> terminador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2792)..(3025)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> T-Ta.hspl7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

112

113

114

115

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 653

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

116

117

118

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taggcctcca tccatggcaa accctaacaa tc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcccatcttc ctacttagca ccctgcagaa atacggtcca ac

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacctcacct accaaacatt cgatcttg

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgagttctac cgtaggcagc tcaag

\hfill

25

Claims

1. Una secuencia de nucleótidos que tiene la secuencia de SEC ID NO: 9.

2. Un casete de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1.

3. El casete de expresión según la reivindicación 2, que comprende desde el nucleótido 14 hasta el nucleótido 3020 de la SEC ID NO: 19.

4. El casete de expresión según la reivindicación 2, que comprende desde el nucleótido 14 hasta el nucleótido 3431 de la SEC ID NO: 17.

5. Un vector que comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1 y/o el casete de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.

6. Una célula transformada que comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1 y/o el casete de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.

7. La célula transformada según la reivindicación 6, en la que la célula es una célula vegetal o una célula bacteriana.

8. La célula transformada según la reivindicación 7, en la que la célula vegetal es célula de maíz.

9. Una planta o semilla de planta que comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1 y/o el casete de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.

10. La planta o semilla de planta según la reivindicación 9, en las que dicha planta es una monocotiledónea o una dicotiledónea.

11. La planta o semilla de planta según la reivindicación 10, en las que dicha planta es una monocotiledónea.

12. La planta o semilla de planta según la reivindicación 11, en las que dicha planta es maíz.

13. Un procedimiento de producción de una célula transformada, que comprende introducir la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1 y/o el casete de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 en una célula, en el que la célula es una célula vegetal o una célula microbiana.

14. El procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicha célula es una célula vegetal.

15. El procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicha célula vegetal es una célula de monocotiledónea.

16. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicha célula vegetal es una célula de maíz.

17. Un procedimiento de producción de una planta de maíz transformada, que comprende las etapas de:

introducir la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1 y/o el casete de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 en una célula de planta de maíz;

seleccionar una célula de planta de maíz transformada; y

regenerar una planta de maíz a partir de la célula de planta de maíz transformada, en el que la planta de maíz comprende la secuencia de nucleótidos y/o el casete de expresión.

18. Un procedimiento de control de la infestación por insectos coleópteros en un campo de plantas de cultivo, que comprende proporcionar al insecto coleóptero una planta transgénica sobre la que se alimenta el insecto coleóptero, en el que dicha planta transgénica es la planta según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.