ES2340057T3

ES2340057T3 - Expresion mejorada de la proteina insecticida cry3b en plantas.

Info

Publication number: ES2340057T3
Application number: ES06113589T
Authority: ES
Inventors: Charles P. Romano
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 1998-08-19
Filing date: 1999-08-19
Publication date: 2010-05-28
Anticipated expiration: 2019-08-19
Also published as: EP1104481B1; ME00085B; CA2340324A1; AU5571999A; ATE459717T1; ZA200100874B; CZ301915B6; BR9913690A; AU5578399A; CZ302074B6; EP1698699B1; WO2000011178A3; EP2811024A1; CN100390284C; WO2000011200A2; DE69937459T2; DE69943375D1; DK1698699T3; EP1104481A2; EP1698699A3

Abstract

Un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica expuesta en la SEC ID Nº 11.

Description

Expresión mejorada de la proteína insecticida Cry3B en platas.

1.1 Campo de la invención

La presente invención divulga plantas transgénicas que expresan niveles sustancialmente mayores de la b-endotoxina de Bacillus thuringiensis que controla los insectos. Se describen procedimientos para obtener dichas plantas y composiciones, y procedimientos para usar dichas plantas y composiciones.

También se divulgan casetes polinucleotídicos mejorados que contienen secuencias codificantes de proteínas preferidas que confieren los niveles sustancialmente mayores de b-endotoxinas que controlan los insectos. Las realizaciones preferidas de la invención proporcionan sorprendentemente niveles hasta diez veces mayores de la proteína que controla los insectos con relación a los niveles más elevados obtenidos usando composiciones anteriores. En particular, maíz transgénico que expresa niveles mayores de una proteína diseñada para mostrar toxicidad aumentada hacia plagas de coleópteros da niveles superiores de protección contra insectos y tienen menor probabilidad de soportar el desarrollo de poblaciones de insectos diana que son resistentes a la proteína insecticidamente activa.

1.2 Descripción de la técnica relacionada

Casi todos los cultivos de campo, plantas, y áreas de agricultura comercial son susceptibles al ataque por una o más plagas de insectos. Son particularmente problemáticas las plagas de coleópteros y lepidópteros.

Como los cultivos de interés comercial a menudo son la diana del ataque de los insectos, son deseables procedimientos tolerantes con el medioambiente para controlar o erradicar la infestación con insectos. Esto es particularmente cierto para agricultores, horticultores, cultivadores, y áreas comerciales y residenciales que buscan controlar las poblaciones de insectos usando composiciones ecológicamente respetuosas. Las formulaciones insecticidas tolerantes con el medioambiente más ampliamente usadas desarrolladas en los últimos años han estado compuestas de pesticidas de proteínas microbianas derivadas de la bacteria Bacillus thuringiensis, una bacteria gram-positiva que produce proteínas cristalinas o cuerpos de inclusión que son específicamente tóxicos contra ciertos órdenes y especies de insectos. Se han identificado muchas variedades diferentes de B. thuringiensis que producen una o más proteínas cristalinas insecticidas así como otras proteínas insecticidas que no forman cristales. Las composiciones que incluyen variedades de B. thuringiensis que producen proteínas insecticidas han estado disponibles en el mercado y se han usado como insecticidas medioambientalmente aceptables porque son bastante tóxicas para las plagas de insectos diana específicos, pero son inofensivas para las plantas y para los animales vertebrados e invertebrados. De forma más importante, como estas proteínas de control de insectos tienen que ingerirse por las plagas de insectos diana susceptibles para ejercer sus efectos insecticidas o tóxicos, la aplicación prudente de dichas composiciones proteicas limita o evita miembros de insectos no diana del orden susceptible que también pueden ser susceptibles a la composición a partir de una exposición significativa a las proteínas (por ejemplo, especies de lepidópteros no diana donde se usa una proteína cristalina de B.t. específica para lepidópteros en una formulación insecticida). Además, se ha demostrado que insectos de diversos órdenes carecen totalmente de susceptibilidad a las proteínas insecticidas específicamente dirigidas incluso cuando se ingieren en grandes cantidades.

1.2.1\delta-endotoxinas

Las \delta-endotoxinas se usan para controlar una amplia gama de orugas y escarabajos que comen plantas, así como mosquitos. Estas proteínas, también mencionadas como proteínas cristalinas insecticidas, proteínas cristalinas, y toxinas Bt, representan una gran serie de proteínas insecticidas producidas por B. thuringiensis que son tóxicas después de la ingestión por un insecto huésped susceptible. Durante la década pasada la investigación sobre la estructura y función de las toxinas de B. thuringiensis ha cubierto todas las categorías de toxinas principales, y aunque estas toxinas difieren en la estructura y la función específicas, se asumen similitudes generales en la estructura y la función. Una revisión reciente describe la genética, bioquímica, y biología molecular de la toxinas Bt (Schnepf y col., Bacillus thuringiensis and its Pesticidal Crystal Proteins, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806, 1998). En base al conocimiento acumulado de las toxinas de B. thuringiensis, se ha creado un modo generalizado de acción para las toxinas de B. thuringiensis e incluye: la ingestión por el insecto, la solubilización en el intestino medio del insecto (una combinación de estómago e intestino delgado), la resistencia a las enzimas digestivas a veces con digestión parcial por las proteasas específicas del intestino que catalizan específicamente una escisión en un sitio peptídico dentro de la estructura de la protoxina que "activa" la toxina, la unión de la toxina al borde en cepillo de las células del intestino medio, la formación de un poro en las células del intestino medio del insecto, y la alteración de la homeostasis celular (English y Slatin, 1992).

1.2.2 Genes que codifican proteínas cristalinas

Muchas de las \delta-endotoxinas están relacionadas en diversos grados por similitudes en sus secuencias de aminoácidos. Históricamente, las proteínas y los genes que las codifican se clasificaron en gran medida en base a su espectro de actividad insecticida. Una revisión por Hofte y Whiteley (1989) analiza los genes y las proteínas que se identificaron en B. thuringiensis antes de 1990, y expone la nomenclatura y el esquema de clasificación que se ha aplicado tradicionalmente a los genes y proteínas de B. thuringiensis. La nomenclatura original aprovechaba el descubrimiento de que las pocas proteínas Bt Cry conocidas en ese momento generalmente pertenecían a una cantidad limitada de clases, donde cada clase representaba proteínas que tenían especificidad por órdenes específicos de insectos. Por ejemplo, los genes cry1 codificaban proteínas Cry1 tóxicas para lepidópteros. Los genes cry2 codificaban proteínas Cry2 que generalmente eran tóxicas tanto para lepidópteros como para dípteros. Los genes cry3 codificaban las proteínas Cry3 tóxicas para coleópteros, mientras que los genes cry4 codificaban proteínas Cry4 con toxicidad específica para dípteros. La nomenclatura ha llegado a ser, durante la pasada década o más bastante confusa con el descubrimiento de clases relacionadas de forma más distante de proteínas Bt insecticidas. Más recientemente, se han adoptado una nomenclatura homogénea y simplificada y una base para las clasificaciones de proteínas Bt y se ha revisado por Schnepf y col. (1998). Schnepf y col. (1998) también proporciona una solución estructural para un cristal Cry 1. Esta nomenclatura simplificada se adoptará en este documento. También se observará en este documento el convenio de identificar los genes Bt con letras en cursiva y en minúscula (por ejemplo, cry1Ab1) y de identificar las proteínas Bt con el primer carácter en mayúscula (por ejemplo, Cry1Ab1).

En base al grado de similitud de secuencia, las proteínas se han clasificado adicionalmente en subfamilias. A las proteínas que parecen estar más estrechamente relacionadas dentro de cada familia se les asigna letras divisionales tales como Cry1A, Cry1 B, Cry1C, etc. Incluso a proteínas más estrechamente relacionadas dentro de cada división se les da nombres tales como Cry1Ca, Cry1Cb, etc. y proteínas aún más estrechamente relacionadas dentro de cada división se denominan con nombres tales como Cry1 Bb1, Cry1 Bb2, etc.

La nomenclatura moderna clasifica sistemáticamente las proteínas Cry en base a la homología de secuencia de aminoácidos en lugar de en las especificidades de insecto diana. El esquema de clasificación para muchas toxinas conocidas, sin incluir variaciones alélicas en las proteínas individuales, se resume en las tablas actualizadas regularmente que pueden obtenerse del Dr. Neil Crickmore en http://epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Ncil_Crickmorc/Btlindex.html.

1.2.3 Composiciones polipeptídicas bio-insecticidas

La utilidad de las proteínas cristalinas bacterianas como insecticidas se extendido más allá de larvas de lepidópteros y dípteros cuando se informó del primer aislamiento de una variedad de B. thuringiensis tóxica para coleópteros (Krieg y col., 1983; 1984). Se informó de que esta variedad (descrita en la patente de Estados Unidos 4.766.203, incorporada específicamente en este documento por referencia), denominada B. thuringiensis var. tenebrionis, era tóxica para larvas de los insectos coleópteros Agelastica alni (crisomela del aliso) y Leptinotarsa decemlineata (escarabajo de la patata).

La patente de Estados Unidos 5.024.837 también describe variedades híbridas de B. thuringiensis var. kurstaki que mostraron actividad contra insectos lepidópteros. La patente de Estados Unidos 4.797.279 (que corresponde al documento EP 0221024) describe un B. thuringiensis híbrido que contiene un plásmido de B. thuringiensis var. kurstaki que codifica un gen codificante de la proteína cristalina tóxica para lepidópteros y un plásmido de B. thuringiensis tenebrionis que codifica un gen codificante de la proteína cristalina tóxica para coleópteros. La variedad híbrida de B. thuringiensis produce proteínas cristalinas características de las creadas tanto por B. thuringiensis kurstaki como por B. thuringiensis tenebrionis. La patente de Estados Unidos 4.910.016 (que corresponde al documento EP 0303379) describe un aislado de B. thuringiensis identificado como B. thuringiensis MT 104 que tiene actividad insecticida contra coleópteros y lepidópteros. Más recientemente, Osman y col. describieron un aislado de Bacillus thuringiensis natural que presentaba actividad contra al menos dos órdenes de insectos y contra nematodos (documento WO
98/30700).

Se ha sabido durante más de dos décadas que composiciones que comprenden proteínas insecticidas Bt son eficaces para proporcionar protección contra la infestación por insectos a plantas tratadas con dichas composiciones. Más recientemente, las técnicas de genética molecular han posibilitado la expresión de proteínas insecticidas Bt a partir de secuencias nucleotídicas insertadas de forma estable en genomas vegetales (Perlak y col., Brown y Santino, etc.). Sin embargo, la expresión de transgenes en plantas ha proporcionado una vía para resistencia aumentada de los insectos a Bt producidas en plantas porque no se ha demostrado que las plantas produzcan elevados niveles de proteínas insecticidas. Inicialmente se creyó que las burdas diferencias morfológicas o topológicas en la estructura y arquitectura génica entre los sistemas vegetales y bacterianos era la limitación que evitaba la sobre-expresión de transgenes Bt en las plantas. Estas diferencias se superaron aparentemente como se describe por Perlak y col. (patente de Estados Unidos Nº 5.500.365) y por Brown y col. (patentes de Estados Unidos Nº 5.424.412 y 5.689.052) donde se demostró que transgenes que codifican la proteína insecticida Bt que contenía codones preferidos para las plantas mejoraban los niveles de expresión. Como alternativa, el truncamiento del dominio que codifica la protoxina en el dominio que codifica un péptido más corto que aún codificaba una proteína insecticida también se consideró suficiente para superar la limitación de los niveles de expresión evanescentemente bajos del transgén que codifica Bt in planta. Los niveles de expresión de proteínas Bt in planta a partir de transgenes ha variado ampliamente de forma independiente del medio usado para la expresión, y los niveles proteicos acumulados han variado desde casi indetectables a 2 partes por millón a aproximadamente 20 a 30 partes por millón. Sin embargo, aunque todos estos enfoques proporcionaron niveles mejorados de la acumulación de proteína Bt en plantas, ninguno proporcionó niveles de expresión que pudieran asegurar que la resistencia de los insectos no llegara a resultar un problema sin la necesidad de expresión coordinada de una o más toxinas insecticidas adicionales por la planta transgénica, o como alternativa, sin la aplicación tópica coordinada de Bt suplementaria adicional o composiciones químicas insecticidas.

La importancia de la acumulación de niveles mayores de toxina Bt para evitar la resistencia de los insectos a toxinas Bt individuales se ha comprendido desde hace algún tiempo. Diversos estudios de laboratorio en los que se aplicó la selección contra Bt sobre varias generaciones de insectos han confirmado que la resistencia contra proteínas insecticidas Bt rara vez se obtiene. Debe enfatizarse que las condiciones de laboratorio representan condiciones de presión de selección bastante bajas aunque constantes, que permiten la supervivencia de una sub-población de insectos que se ha sometido a presión insecticida y que produce las posteriores generaciones de insectos. Las generaciones sucesivas también se mantienen en medios que contienen concentraciones bajas pero constantes de proteína insecticida. Generalmente, las concentraciones usadas para las presiones de selección varían de CL40 a aproximadamente CL60 o también, sin embargo, se han ensayado además concentraciones CL95 para el desarrollo de resistencia. En la mayoría de los casos, la resistencia se adquiere lentamente, generalmente desarrollándose en razonablemente pocas generaciones, por ejemplo 10-50 generaciones. Sin embargo, dicha resistencia no se observa cuando se usan niveles sustancialmente mayores de toxina, o en situaciones en las que se proporcionan múltiples toxinas.

Actualmente, las plantas recombinantes que expresan niveles comercialmente útiles de la proteína insecticida Bt generalmente contienen solamente un gen que codifica una única clase de Bt. Se prevé que dichas plantas tengan una duración muy limitada de uso por dos razones. Primero, estas plantas están expresando niveles insuficientes de la proteína insecticida para asegurar que todos los insectos diana expuestos a y que se alimentan de los tejidos vegetales sucumban debido a la dosis de toxina ingerida. Segundo, a causa de los niveles insuficientes de proteína insecticida, el potencial para el desarrollo de resistencia está irrazonablemente aumentado. Esto no es decir que el nivel de toxina producido por dichas plantas transgénicas es insuficiente para ser eficaz. Esto simplemente representa las limitaciones de la expresión de \delta-endotoxinas in planta incluso cuando se usan secuencias que codifican la \delta-endotoxina Bt que se ha modificado para amoldarse a las secuencias preferidas de la planta. Una limitación que se ha observado para muchas secuencias que codifican \delta-endotoxina Bt modificadas para la expresión en plantas es que ha sido imposible predecir que la \delta-endotoxina Bt fuera eficaz para la expresión en plantas. (Por ejemplo, la expresión de Cry2Aa en plantas de algodón provoca fitotoxicidad cuando se dirige al cloroplasto, sin embargo, la expresión de una secuencia muy relacionada cry2,4b no es fitotóxica cuando se dirige al cloroplasto. (Corbin y col., solicitud de patente de Estados Unidos, Nº de serie 09/186.002). Aún así, los niveles de la proteína \delta-endotoxina producidos en plantas no son suficientes para ser eficaces contra todas las especies de insectos diana deseadas que se sabe que son susceptibles a un tipo y clase dados de \delta-endotoxina.

Como se ha indicado anteriormente, los enfoques alternativos para el desarrollo de resistencia a proteínas insecticidas ha incluido intentos ineficaces de aumentar los niveles de expresión de transgenes en plantas. Como alternativa, podrían diseñarse genes insecticidas adicionales en plantas de modo que se expresan de forma coordinada múltiples toxinas. Esto proporcionaría un medio más eficaz para retardar la aparición de resistencia contra una combinación cualquiera de Bt, sin embargo, esto todavía no supera la limitación de los niveles insuficientes de proteína insecticida que se acumula en la(s) planta(s) recombinantes. Una alternativa adicional a los niveles insuficientes de expresión ha sido diseñar genes que codifican proteínas cristalinas insecticidas Bt que muestran propiedades insecticidas mejoradas, que tienen un espectro más ancho de huésped o una actividad biológica aumentada, que podría provocar concebiblemente menor requerimiento de la proteína recombinante para controlar una especie de insecto diana que la que se requiere de la forma nativa de la proteína.

La combinación de análisis estructurales de toxinas de B. thuringiensis seguido de una investigación de la función de dichas estructuras, motivos, y similares ha mostrado que regiones específicas de las endotoxinas proteicas cristalinas son, de un modo general, responsables de funciones particulares.

Se ha descubierto que el dominio 1, por ejemplo, de Cry3Bb y Cry1Ac es responsable de la actividad de canal de iones, la etapa inicial en la formación de un poro (Walters y col., 1993; Von Tersch y col., 1994). Se ha descubierto que los dominios 2 y 3 son responsables de la unión al receptor y la especificidad insecticida (Aronson y col., 1995; Caramori y col., 1991; Chen y col. 1993; de Maagd y col., 1996; Ge y col., 1991; Lee y col., 1992; Lee y col., 1995; Lu y col., 1994; Smedley y Ellar, 1996; Smith y Ellar, 1994; Rajamohan y col., 1995; Rajamohan y col., 1996; Wu y Dean, 1996). Regiones del dominio 2 y 3 también pueden conferir la actividad de canal de iones de algunas toxinas (Chen y col., 1993, Wolfersberger y col., 1996; Von Tersch y col., 1994).

Desafortunadamente, aunque muchos investigadores lo han intentado, pocos han tenido éxito en crear proteínas cristalinas mutadas con toxicidad insecticida mejorada. En casi todos los ejemplos de toxinas de B. thuringiensis modificadas por ingeniería genética en la bibliografía, la actividad biológica de la proteína cristalina mutada no es mejor que la de la proteína de tipo silvestre, y en muchos casos, la actividad está disminuida o destruida por completo (Almond y Dean, 1993; Aronson y col., 1995; Chen y col., 1993, Chen y col., 1995; Ge y col., 1991; Kwak y col., 1995; Lu y col., 1994; Rajamohan y col., 1995; Rajamohan y col., 1996; Smedley y Ellar, 1996; Smith y Ellar, 1994; Wolfersberger y col., 1996; Wu y Aronson, 1992). Sin embargo, Van Rie y col. han conseguido recientemente la mejora de una \delta-endotoxina Cry3A que tiene actividad insecticida aumentada para coleópteros identificando un mutante sencillo que tiene actividad insecticida aumentada. Van Rie y col. proponen un procedimiento para identificar mutantes que tienen actividad insecticida aumentada en el que el procedimiento cosiste en identificar mutaciones aminoacídicas que disminuyen la actividad insecticida, y alterar selectivamente esos restos por mutagénesis dirigida al sitio para incorporar uno o más de los 20 aminoácidos de origen natural en esas posiciones, y suministrar las diversas formas de la proteína alterada resultante a gusanos occidentales o del norte de la raíz del maíz para identificar las que tienen actividad mejorada (patente de Estados Unidos 5.659.123). Aunque no se posibilitaron secuencias usando el procedimiento, como se ha mencionado anteriormente, Van Rie y col. tuvieron éxito en la identificación de una única secuencia que tenía actividad aumentada y no mostraba un aumento en la expresión de la forma mutante en comparación con la secuencia nativa.

Para una proteína cristalina que tiene aproximadamente 650 aminoácidos en la secuencia de su toxina activa, y la posibilidad de 20 aminoácidos diferentes en cada posición en esta secuencia, la probabilidad de crear arbitrariamente una nueva estructura satisfactoria es remota, incluso si puede asignarse una función general a un tramo de 250-300 aminoácidos. De hecho, la técnica previa anterior con respecto a la mutagénesis de genes de la proteína cristalina ha estado afectada principalmente por el estudio de la estructura y la función de las proteínas cristalinas, usando mutagénesis para alterar alguna etapa en el modo de acción, en lugar de con toxinas mejoradas por ingeniería.

Colectivamente, el éxito limitado en la técnica para desarrollar toxinas de origen no natural con actividad insecticida mejorada ha reprimido el progreso en esta área y desorientó la búsqueda de endotoxinas o proteínas cristalinas mejoradas. En lugar de seguir las reglas simples y predecibles, la modificación exitosa por ingeniería de una proteína cristalina mejorada puede implicar diferentes estrategias, dependiendo de la proteína cristalina que se está mejorando y las plagas de insectos que se están abordando. Por tanto, el procedimiento es muy empírico.

Por consiguiente, la tecnología de ADN recombinante tradicional claramente no es experimentación rutinaria para proporcionar proteínas cristalinas insecticidas mejoradas. De lo que ha carecido la técnica anterior ha sido de procedimientos racionales para producir proteínas cristalinas de B. thuringiensis modificadas por ingeniería genética que tengan actividad insecticida mejorada y, en particular, toxicidad mejorada hacia una amplia gama de plagas de insectos lepidópteros, coleópteros, o dípteros. Se describieron procedimientos y composiciones que abordan estas preocupaciones en el documento WO 99/31248 que reivindica prioridad de las solicitudes de patente de Estados Unidos Nº 08/993.170 (18 de diciembre de 1997; English y col.), 08/993.722 (18 de diciembre de 1997, English y col.), 08/993.755 (18 de diciembre de 1997, English y col.), y 08/996.441 (18 de diciembre de 1997, English y col.) y en Van Rie y col. (patente de Estados Unidos 5.659.123, 1 de junio de 1999). Además, las \delta-endotoxinas mejoradas de forma recombinante han continuado expresándose poco y/o causando efectos fitotóxicos cuando se expresan en plantas, conduciendo de este modo a la recuperación de pocos acontecimientos transgénicos comercialmente útiles.

2.0 Sumario de la invención

En el presente documento se describen nuevas composiciones y procedimientos para expresar en plantas transformadas \delta-endotoxinas Cry3 variantes de B. thuringiensis que tienen actividad inhibidora de coleópteros significativa. Estas composiciones y procedimientos producen ventajosamente plantas que expresan \delta-endotoxinas Cry3 de B. thuringiensis a niveles aumentados no observados previamente para \delta-endotoxinas Cry. Los niveles aumentados de la expresión de \delta-endotoxina Cry3 se reflejan en la obtención de niveles de expresión máxima mayores en acontecimientos de inserción transgénica individuales. Inesperadamente, las composiciones particulares descritas en este documento provocan la recuperación de un porcentaje aumentado de acontecimientos transgénicos que manifiestan niveles de expresión que exceden en mucho los valores umbral de expresión necesarios para el control de insectos coleópteros y que proporcionan suficientes niveles de toxinas capaces de soportar una estrategia de tratamiento de la resistencia. Como las \delta-endotoxinas Cry3 típicamente son menos potentes que otras \delta-endotoxinas habitualmente usadas para controlar plagas diana de lepidópteros o dípteros cuando se expresan en plantas transgénicas, la obtención de niveles máximos mayores de la expresión de \delta-endotoxina Cry3 y la recuperación de más acontecimientos transgénicos con niveles eficaces de expresión ambas son críticas para aislar acontecimientos transgénicos que expresan la \delta-endotoxina Cry3 que muestra niveles comercialmente útiles de control de insectos diana.

Otra limitación de la técnica anterior abordada por la presente invención es el desarrollo de resistencia de los insectos a \delta-endotoxinas proporcionadas por expresión vegetal. Específicamente, la presente invención proporciona una estrategia superior para el retardo o eliminación del desarrollo de resistencia a \delta-endotoxinas Cry3 a través de la acumulación mejorada de \delta-endotoxina dentro de las células vegetales de modo que los niveles de la \delta- endotoxina se mantienen in-planta por encima de un nivel umbral de proteína, típicamente medido en partes por millón (ppm). Se cree que la expresión mejorada de \delta-endotoxinas, que también debe tomar como significado expresión aumentada en vista de lo que se ha observado previamente en la técnica, provoca una aparición retardada de la resistencia de los insectos y por tanto amplía la utilidad de las \delta-endotoxinas expresadas en plantas como agentes de control de insectos.

Se descubrió que una nueva proteína \delta-endotoxina Cry3B que tiene la secuencia de la SEC ID Nº 12 muestra actividad insecticida particularmente eficaz dirigida al control de especies de insectos de plagas de coleópteros (a partir de ahora mencionada de forma corta como proteína \delta-endotoxina de la presente invención).

La invención por tanto proporciona:

(1) una secuencia nucleotídica que tiene la secuencia de la SEC ID Nº 11 (que codifica la nueva proteína \delta-endotoxina Cry3B mencionada anteriormente);

(2) un casete de expresión que comprende la secuencia nucleotídica definida en (1) anteriormente;

(3) un vector que comprende la secuencia nucleotídica de la reivindicación 1 y/o el casete de expresión definido en (2) anteriormente;

(4) una célula transformada que comprende la secuencia nucleotídica de (1) anterior y/o el casete de expresión definido en (2) anteriormente;

(5) una planta o semilla vegetal que comprende la secuencia nucleotídica de (1) anterior y/o el casete de expresión definido en (2) anteriormente;

(6) un procedimiento para producir una célula transformada, que comprende introducir la secuencia nucleotídica de (1) anterior y/o el casete de expresión de (2) anterior en una célula, donde la célula es una célula vegetal o una célula microbiana;

(7) un procedimiento para producir una planta de maíz transformada, que comprende las etapas de:

introducir la secuencia nucleotídica de (1) anterior y/o el casete de expresión de (2) anterior en una célula vegetal de maíz;

seleccionar una célula vegetal de maíz transformada; y

regenerar una planta de maíz a partir de la célula vegetal de maíz transformada, donde la planta de maíz comprende la secuencia nucleotídica de (1) anterior y/o el casete de expresión de (2) anterior; y

(8) un procedimiento para controlar la infestación por insectos coleópteros en un campo de plantas de cultivo, que comprende proporcionar al insecto coleóptero una planta transgénica de la que se alimenta el insecto coleóptero, donde dicha planta transgénica es la planta de (5) anterior.

La proteína \delta-endotoxina mencionada anteriormente de la presente invención se proporciona por la expresión a partir de ADN o secuencias polinucleotídicas aisladas, purificadas y mejoradas o potenciadas que comprenden, cada una, una secuencia codificante de \delta-endotoxina Cry3 colocada bajo el control de los elementos de expresión génica funcionales en plantas preferidos tales como un promotor, una secuencia líder no traducida, un intrón y una secuencia de terminación de la transcripción y de poliadenilación. Algunos ADN o secuencias polinucleotídicas preferidas también pueden proporcionar secuencias de proteínas de dirección al plástido o cloroplasto. Las construcciones de ADN preferidas de la presente invención incluyen aquellas construcciones que codifican \delta-endotoxinas Cry3 que muestran actividad inhibidora de coleópteros o de control de coleópteros. En una realización ilustrativa, se ensamblan secuencias polinucleotídicas en un casete de expresión para su introducción en el ADN genómico de la planta, donde el casete de expresión comprende una secuencia codificante de una \delta-endotoxina Cry3Bb variante unida de forma funcional a una secuencia que comprende un promotor, una secuencia líder no traducida, un intrón y una secuencia de terminación de la transcripción y de poliadenilación. En particular, un transgén localizado dentro de un casete de expresión polinucleotídico o secuencia polinucleotídica funcional en vegetales que comprende un casete de expresión que está compuesto por elementos genéticos que funcionan en células vegetales para expresar una proteína deseada a partir de una secuencia codificante de ácido nucleico (el transgén) que está localizada de forma funcional dentro de dicho casete de expresión. La secuencia codificante está unida cadena arriba a al menos una secuencia promotora, una secuencia líder no traducida (UTL), una secuencia intrónica, y en marco en ciertas realizaciones indicadas a una secuencia que codifica un péptido de dirección al plástido o cloroplasto. La secuencia codificante también está unida cadena abajo a al menos una secuencia de terminación de la transcripción y de poliadenilación funcional en plantas. En este documento se muestra que las secuencias polinucleotídicas que comprenden dicho casete de expresión mejoran la expresión de la proteína deseada codificada dentro del casete, mejoran la cantidad de acontecimientos obtenidos a partir del uso de la secuencia polinucleotídica en la transformación de plantas, donde dicha cantidad de acontecimientos mejorada contiene el transgén deseado localizado dentro del casete de expresión y muestra niveles mejorados de expresión de una o más proteínas deseadas. También se observa sorprendentemente que la cantidad de acontecimientos mejorada expresa la proteína deseada a niveles por encima de 2 a 5 partes por millón pero en general por debajo de 200 a 500 partes por millón de las proteínas celulares totales. Fueron incluso más sorprendentes algunos acontecimientos en particular que expresaron la proteína deseada a niveles muy por encima de 500 ppm. La presente invención proporciona particularmente una secuencia nucleotídica que codifica una \delta-endotoxina Cry3Bb variante que comprende la SEC ID Nº 11 aislada y purificada, de NcoI a EcoRI expuesta en la Figura 2 que ilustra el plásmido pMON33741.

La invención proporciona plantas transgénicas que se han transformado con una construcción de ADN o casete de expresión de la presente invención que se expresa y traduce a niveles inesperadamente elevados por la planta que produce niveles sorprendentemente elevados de acumulación de \delta-endotoxina. Las plantas monocotiledóneas pueden transformarse de acuerdo con los procedimientos y con las construcciones de ADN descritas en este documento. Sin embargo, también se espera que las plantas dicotiledóneas puedan transformarse también con secuencias de ADN descritas en este documento por los especialistas en la técnica para obtener plantas transgénicas que proporcionen niveles inesperadamente útiles de resistencia a insectos sin el riesgo de desarrollar resistencia en los insectos a la \delta-endotoxina.

La planta transformada por la presente invención puede prepararse, en una realización preferida adicional, por un procedimiento que incluye obtener la construcción de ADN aislada y purificada contenida dentro del casete de expresión, y después transformar la planta con la construcción de modo que la planta exprese la proteína que codifica la construcción. Como alternativa, la planta transformada por la presente invención puede prepararse, en una realización preferida adicional, por un procedimiento que incluye la introducción de la construcción de ADN aislada y purificada en una cepa de Agrobacterium competente para la transformación, y después transformar la planta con la cepa de Agrobacterium que contiene la construcción de modo que la planta exprese las proteínas que codifica la construcción.

En este documento se ha observado que la transformación de plantas por las composiciones y procedimientos descritos provoca sorprendentemente frecuencias aumentadas de transformantes que muestran la expresión del transgén así como la recuperación de acontecimientos transgénicos individuales que muestran niveles absolutos inesperadamente mayores de expresión del transgén.

Se contempla que los niveles de expresión aumentados observados en la invención descrita permitirán un desarrollo reducido de resistencia de los insectos a las \delta-endotoxinas Bt presentadas a las plagas de insectos diana. Esto puede conseguirse transformando una planta con la construcción de ADN preferida para conseguir elevados índices de expresión de Cry3 sola, o exponiendo simultáneamente los insectos diana a las \delta-endotoxinas Cry3 descritas junto con otras composiciones eficaces para controlar especies de coleópteros tales como variantes de Cry3B (English y col., documento WO 99/31248), Cry3A variante o Cry3D variante (patente de Estados Unidos 5.659.123), CryET33 y CryET34 (Donovan y col., documento WO 97/17600), CryET70 (solicitud de Estados Unidos Nº de serie 09/184.748; Mettus y col., 2 de noviembre de 1998), Cry6A, Cry6B, Cry8B (patente de Estados Unidos Nº 5.277.905), CryET29 (Rupar y col., documento WO 97/21587), hidrolasas insecticidas de acil-lípidos, combinaciones de oxidasas de aminoácidos y tedanalactama sintasas (Romano y col., solicitud de Estados Unidos Nº de serie 09/063.733, presentada el 21 de abril de 1998), o proteínas insecticidas tales como VIP1 (Gay, documento WO 97/26339; Gourlet y col., documento WO 98/02453) y VIP3 (Estruch y col., patente de Estados Unidos Nº 5.877.012; 1999) entre otras. Los insectos diana susceptibles incluyen el gusano de la raíz Diabroticus spp. en Zea mays y Leptinotarsa decemlineata (Say) en Solanum tuberosum, y gorgojo del algodón en especies Gossypium (algodón).

Por lo tanto se contempla que las composiciones y procedimientos descritos por la presente invención proporcionarán muchas ventajas sobre la técnica anterior incluyendo las resumidas específicamente anteriormente. Otras ventajas incluyen el control mejorado de plagas de insectos diana susceptibles y la obtención de protección a largo plazo de insectos patógenos. Una ventaja adicional de la presente invención proporciona reducir la cantidad de acontecimientos transgénicos que tienen que explorarse para identificar uno que contenga niveles beneficiosos de una o más composición de control de insectos. La presente invención también abarca células transformadas con las construcciones de ADN descritas en este documento. Además, se contemplan vectores de transformación tales como plásmidos, bácmidos, cromosomas artificiales, vectores virales y semejantes como elementos para su uso en el suministro de composiciones nucleotídicas de la presente invención en células contempladas para obtener células huésped transformadas, tanto procariotas como eucariotas, que expresan las proteínas \delta-endotoxina codificadas por la nueva construcción de ADN descrita en este documento. Se contempla adicionalmente que en algunos casos el genoma de la planta transgénica de la presente invención se aumentará a través de la integración estable de un casete de expresión que codifica una \delta-endotoxina de B. thuringiensis inhibidora o de control de coleópteros o variantes de la misma como se describe en este documento. Además, se incorporará más de un transgén que codifica una composición insecticida en el genoma nuclear, o como alternativa, en el genoma del cloroplasto o plástido de la célula vegetal huésped transformada. Se tiene la visión de que se incorporará más de un polinucleótido que codifica una proteína cristalina insecticida en el genoma de una célula vegetal y puede ser deseable tener dos o incluso más secuencias que codifican proteínas insecticidas u otras proteínas beneficiosas para las plantas dentro de las secuencias nucleotídicas contenidas dentro de la célula. Dichas proteínas obtenidas de forma recombinante pueden existir como precursores, pro-toxinas, o como fusiones de proteínas beneficiosas unidas por secuencias enlazadoras de aminoácidos flexibles o por secuencias de escisión específica con proteasas bien conocidas en la técnica. También se contemplan quimeras que comprenden fusiones de proteínas insecticidas. La descendencia de células huésped vegetales transgénicas pueden manipularse artificialmente para producir plantas recombinantes completas que muestren propiedades insecticidas mejoradas, y en este documento se ha mostrado que las secuencias nucleotídicas recombinantes son heredables. La capacidad de herencia de los elementos es un aspecto preferido de esta invención, ya que los elementos de expresión son capaces de suministrarse a descendientes lineales de la célula vegetal huésped transformada original, dando lugar primero a una planta transformada de forma estable cuyas células constituyentes expresan el transgén deseado, aunque la expresión específica de tejido generalmente puede manipularse selectivamente a través de la elección del promotor funcional en la planta seleccionado para su uso en un casete de expresión dado, como se ha descrito anteriormente. Las plantas transformadas dan lugar a semillas que contienen el casete de expresión heredable, y las semillas por tanto dan lugar a plantas de modo lineal que contienen el casete de expresión, generalmente de forma mendeliana, particularmente cuando se cruzan por endogamia de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica.

3.0 Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra el plásmido pMON25096.

La Figura 2 ilustra el plásmido pMON33741.

La Figura 3 ilustra el plásmido pMON25097.

La Figura 4 ilustra el plásmido pMON33748.

La Figura 5 ilustra la traducción de la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de una proteína insecticida variante Cry3Bb.11098 que se muestra en la SEC ID Nº 9.

La Figura 6 ilustra la traducción de la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de una proteína insecticida variante Cry3Bb.11231 que se muestra en la SEC ID Nº 11.

4.0 Descripción detallada de la invención

La siguiente descripción detallada de la invención se proporciona para ayudar a los especialistas en la técnica en la práctica de la presente invención.

4.1 Definiciones

Las siguientes palabras y expresiones tienen los significados expuestos a continuación.

Equivalentes funcionales biológicos. Como se usa en este documento dichos equivalentes con respecto a las proteínas insecticidas son péptidos, polipéptidos y proteínas que contienen una secuencia o un resto que muestra una similitud de secuencia con los nuevos péptidos de la presente invención, tales como Cry3Bb.11231, y que muestra las mismas propiedades funcionales o similares que las de los polipéptidos descritos en este documento, incluyendo la actividad insecticida. Los equivalentes biológicos también incluyen péptidos, polipéptidos y proteínas que reaccionan con, es decir, se unen específicamente a anticuerpos creados contra Cry3Bb y que muestran la misma actividad insecticida o similar, incluyendo anticuerpos tanto monoclonales como policlonales.

Combate o Control del Daño por Insectos en un contexto agrícola se refiere a la reducción del daño en unidades relativas a un cultivo o parte vegetal causada por infestación de la plaga de insectos. En líneas más generales, esta expresión se refiere a la reducción en los efectos adversos causados por la presencia de un insecto no deseado en cualquier localización particular.

Acontecimiento se refiere a una planta transgénica obtenida a partir de una de las siguientes:

1. la inserción de ADN foráneo en uno más sitios únicos en el ADN genómico nuclear;

2. la inserción de ADN foráneo en uno o más sitios únicos en el genoma del plástido, cloroplasto o mitocondria;

3. la introducción de un vector estable, heredable, epigenético en el citoplasma de un plástido, cloroplasto, o mitocondria; o

4. una combinación de cualquiera de los procesos anteriores.

Los acontecimientos derivados de estos procesos contienen un casete de expresión que expresa una secuencia codificante deseada como se describe en este documento. Los acontecimientos también se mencionan como ITE (del inglés independent transformation events (acontecimientos de transformación independientes)).

Expresión: La combinación de procesos intracelulares, incluyendo la transcripción, la traducción, y otros procesamientos intracelulares de la proteína y el ARN y las funciones de estabilización, experimentados por una secuencia que codifica un ácido nucleico controlada por secuencias genéticas que funcionan en células vegetales para conseguir la producción de un producto deseado, tal como un gen estructural que codifica una molécula de ARN, o una molécula de ARN que se usa como sustrato para una enzima o complejo enzimático transcriptasa inversa.

Casete de expresión mejorado o potenciado se refiere a la combinación específica y orden de elementos genéticos asociados con la secuencia que codifica la proteína insecticida que, cuando se expresa dentro de una célula vegetal:

da lugar al sorprendente nivel promedio de esa proteína expresada en plantas, tejido vegetal, o células vegetales;

da lugar a la cantidad inesperada de acontecimientos de transformación que expresan un nivel promedio sorprendentemente mayor de proteína insecticida;

da lugar a plantas individuales, tejido vegetal, o células vegetales que expresan un nivel inesperadamente elevado de la proteína insecticida; y

da lugar a plantas que expresan niveles inesperados de proteína insecticida eficaz para controlar o combatir plagas de coleópteros y prevenir el desarrollo de resistencia por la plaga de coleópteros a la proteína insecticida particular.

Polipéptido insecticida se refiere a un polipéptido que tiene propiedades insecticidas, por ejemplo, un polipéptido que muestra las propiedades de inhibir el crecimiento, desarrollo, viabilidad o fecundidad de las plagas de insectos diana.

Unido de forma funcional: Secuencias de ácido nucleico o polinucleotídicas conectadas secuencialmente en forma lineal, de modo que las propiedades de una influyen en las características de expresión de la otra. Un promotor, por ejemplo, unido de forma funcional a otras secuencias polinucleotídicas (que pueden constar de secuencias operadoras o potenciadoras, secuencias líder no traducidas o traducidas, secuencias intrónicas, secuencias codificantes de genes estructurales, genes no estructurales, secuencias de terminación de la transcripción y la traducción, y secuencias de poliadenilación) influye en la expresión de una secuencia codificante o no codificante, ya sea el producto ARN, proteína, u otro producto. Asimismo, un intrón o una secuencia líder no traducida puede incluir en la expresión y estabilidad de secuencias unidades de forma funcional a las mismas, y secuencias génicas estructurales o no estructurales pueden verse influidas por elementos unidos de forma funcional cadena arriba, dentro, o cadena abajo.

Regiones codificantes que se expresan en plantas: regiones codificantes de aminoácidos o marcos de lectura abierta (ORF del inglés open reading frame) que se pueden expresar in planta porque contienen elementos reguladores típicos de plantas que facilitan su expresión, y a menudo incluyen cambios en la secuencia codificante de modo que se utilizan los codones preferidos de las plantas en lugar de los codones no preferidos donde se contemplan regiones codificantes heterólogas.

Péptido de tránsito del plástido: Cualquier secuencia de aminoácidos útil para dirigir un aminoácido unido, tal como una fusión proteica, a un compartimiento subcelular u orgánulo tal como un plástido o cloroplasto.

Secuencia polinucleotídica: Cualquier secuencia de ADN o ARN de cuatro o más nucleótidos o ribonucleótidos consecutivos. Generalmente, las secuencias polinucleotídicas descritas en este documento comprenden al menos 50 o más nucleótidos o ribonucleótidos.

Descendencia: "Descendencia" incluye cualquier progenie o descendiente de la planta transgénica, o cualquier planta posterior que contenga el(los) transgén(es) en forma funcional. La descendencia no está limitada a una generación, sino que más bien abarca los descendientes del transformante siempre que contengan o expresen el(los) transgén(es). Las semillas que contienen embriones transgénicos así como las semillas de las plantas transgénicas y su progenie o descendientes que, después de la segregación mendeliana siguen conteniendo el(los) transgén(es), también son parte importantes de la invención.

Promotor: Un sitio de reconocimiento en una secuencia de ADN o grupo de secuencias de ADN que proporciona un elemento de control de la expresión para una secuencia polinucleotídica preferida y a la que se une específicamente la ARN polimerasa e inicia la síntesis de ARN (transcripción) de esa secuencia preferida.

R_{0} es la planta regenerante primaria obtenida de la transformación de tejido o células vegetales en cultivo. La descendencia o generaciones posteriores derivadas de la R_{0} se conocen como R_{1} (primera generación), R_{2} (segunda generación), etc.

Regeneración: El procedimiento de cultivar una planta a partir de una célula vegetal o grupo de células vegetales (por ejemplo, protoplasto, embrión, callo, o explante vegetal).

Secuencia codificante estructural se refiere a una secuencia de ADN que codifica un péptido, polipéptido, o proteína que fabrica una célula después de la transcripción de la secuencia codificante estructural en ARN mensajero (ARNm), seguido de la traducción del ARNm en el producto peptídico, polipeptídico, o proteico deseado.

Gen estructural: Un gen o secuencia polinucleotídica que contiene la secuencia codificante de un polipéptido deseado que se expresa por transcripción y traducción para producir el polipéptido deseado.

Gen sintético: Los genes sintéticos que codifican las \delta-endotoxinas de B. thuringiensis de la presente invención son aquellos preparados de un modo que implica cualquier tipo de aislamiento o manipulación genética que altere la secuencia codificante de origen natural del gen de la \delta-endotoxina. Esto incluye el aislamiento del gen de su estado de origen natural, la manipulación del gen como por modificación de codones (como se describe en este documento), o mutagénesis específica de sitio (como se describe en este documento), truncamiento del gen o cualquier otro procedimiento de manipulación o aislamiento. Un gen sintético también puede ser una secuencia polinucleotídica que se sabe que no es de origen natural pero que codifica un polipéptido útil u otro producto tal como un ARNt o un polinucleótido antisentido. Una secuencia polinucleotídica de origen no natural.

Homología sustancial: Según se usa este término en este documento, se refiere a secuencias de ácido nucleico o polipeptídicas que son aproximadamente un 86% homólogas, aproximadamente un 90% homólogas, aproximadamente un 95% homólogas, aproximadamente un 99% homólogas. Más específicamente, los inventores imaginan que los homólogos sustanciales son aproximadamente el 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, y 99 por ciento homólogos a la secuencia de ácido nucleico del polipéptido referente.

Terminador: Con referencia a los procesos de expresión génica nuclear eucariota, la secuencia de terminación de la transcripción en el extremo 3' funcional y de poliadenilación. Con referencia a la expresión génica procariota, e incluyendo la expresión génica del plástido o cloroplasto, la secuencia de ADN funcional en el extremo 3' de una fase de lectura abierta que, para ORF que expresan producto proteico, al menos un codón de terminación en fase con la secuencia codificante de la ORF, que también puede estar seguido de una secuencia de ADN que codifican una señal de terminación de la transcripción que puede causar que el producto de ARN traducido o ARNm forme una horquilla u otra estructura tridimensional que puede actuar o no junto con una o más soluble proteínas estructurales para causar que se interrumpa la transcripción.

Transformación: Un procedimiento para introducir una secuencia polinucleotídica exógena (por ejemplo, un vector, o una molécula de ADN o ARN recombinante o no recombinante) en una célula o protoplasto en el que ese polinucleótido exógeno se incorpora en un elemento genético heredable o tiene capacidad de replicación autónoma y por tanto se mantiene de forma estable dentro de la célula o protoplasto así como en la descendencia de esa célula o protoplasto.

Célula transformada: Una célula que contiene un elemento genético heredable alterado por la introducción de una o más moléculas de ADN exógenas. Una célula transgénica. Células transformadas o transgénicas ejemplares incluyen callos vegetales derivados de una célula vegetal transformada y células particulares tales como de hojas, raíces, troncos, por ejemplo, células somáticas, o células reproductoras (germinales) obtenidas de una planta transgénica.

Transgén: Una construcción génica, casete de expresión, o segmento o secuencia de ADN que comprende una ORF que se desea expresar en la célula, tejido u organismo receptor. Esto puede incluir un plásmido completo, u otro vector, o puede incluir simplemente la secuencia, región, dominio, o segmento codificante funcional de la secuencia de ADN transferida.

Acontecimiento transgénico: Una planta o descendencia de la misma obtenida de una célula vegetal o protoplasto creado o construido para que contenga una o más moléculas de ADN exógeno insertadas en el genoma nuclear u otro genoma de la célula vegetal, o introducido y mantenido de forma estable dentro del citoplasma de un plástido, cloroplasto, o mitocondria, que confiere algún fenotipo físicamente detectable sobre la planta o descendencia de la misma.

Planta transgénica: Una planta o descendencia de la misma que se ha modificado genéticamente para que contenga y exprese secuencias de ADN heterólogo en forma de proteínas o en forma de ácidos nucleicos. Como se ejemplifica específicamente en este documento, una planta transgénica de maíz se modifica genéticamente para que contenga y exprese al menos una secuencia de ADN heterólogo unida de forma funcional a y bajo el control regulador de secuencias de control de la transcripción que funcionan juntas en células o tejido vegetal o en plantas completas para conseguir la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína \delta-endotoxina insecticida o una secuencia de aminoácidos variante de la misma. Una planta transgénica también puede mencionarse como una planta transformada. Una planta transgénica también se refiere a la descendencia de la planta transgénica inicial donde esa descendencia contiene y expresa la secuencia codificante heteróloga bajo el control regulador de las secuencias de control de la transcripción que se expresan en la planta descritas en este documento.

Vector: Un polinucleótido capaz de replicarse en una célula huésped y/o a la que puede unirse de forma funcional otra secuencia polinucleotídica para dar lugar a la replicación de la secuencia unida. Un plásmido es un vector ejemplar.

La presente invención describe nuevas construcciones de ADN que comprenden secuencias polinucleotídicas que codifican \delta-endotoxinas de B. thuringiensis, concretamente una secuencia nucleotídica que tiene la secuencia de la SEC ID Nº 11. Los procedimientos para la construcción y expresión de genes sintéticos de B. thuringiensis en plantas son bien conocidos para los especialistas en la técnica y se describen en detalle en patente de Estados Unidos 5.500.365. La presente invención contempla el uso de los genes Cry3B de B. thuringiensis en la transformación de plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Para potencia la expresión de estos genes, la presente invención proporciona construcciones de ADN que comprenden segmentos polinucleotídicos que codifican péptidos de dirección al plástido colocados cadena arriba de y en fase con las secuencias polinucleotídicas que codifican las \delta-endotoxinas de B. thuringiensis deseadas, junto con diversas combinaciones de secuencias líder no traducidas, secuencias intrónicas funcionales vegetales, y secuencias de terminación de la transcripción y de poliadenilación.

En un aspecto, la información de la secuencia nucleotídica proporcionada por la invención permite la preparación de secuencias de ADN relativamente cortas que tienen la capacidad de hibridar específicamente con secuencias génicas de los polinucleótidos seleccionados descritos en este documento. En estos aspectos, se preparan sondas de ácido nucleico de una longitud apropiada en base a la consideración de las secuencias polipeptídicas seleccionadas que codifican el polipéptido de \delta-endotoxina Cry3B inhibidora de coleópteros: SEC ID Nº 12. Estas sondas de ácido nucleico también pueden prepararse en base a la consideración de secuencias polinucleotídicas seleccionadas que codifican un péptido de dirección al plástido, tal como la mostrada en la SEC ID Nº 26. La capacidad de dichas sondas de ácido nucleico de hibridar específicamente con una secuencia génica que codifica un polipéptido de \delta-endotoxina o una secuencia peptídica de dirección al plástido les otorga utilidad particular en una diversidad de realizaciones. De forma más importante, las sondas pueden usarse en una diversidad de ensayos para detectar la presencia de secuencias complementarias en una muestra dada.

En ciertas realizaciones, es ventajoso usar cebadores oligonucleotídicos. La secuencia de dichos cebadores se diseña usando un polinucleótido de la presente invención para su uso en la detección, amplificación o mutación de un segmento definido de un gen de proteína cristalina de B. thuringiensis usando tecnología de amplificación térmica. El procedimiento también puede usarse para detectar, amplificar o mutar un segmento definido del polinucleótido que codifica un péptido de dirección al plástido. También pueden amplificarse segmentos de genes relacionados con los polinucleótidos que codifican los polipéptidos \delta-endotoxina y los péptidos de dirección al plástido de la presente invención usando dichos cebadores y procedimientos de amplificación térmica.

Para proporcionar ciertas de las ventajas de acuerdo con la presente invención, una secuencia de ácido nucleico preferida empleada para estudios o ensayos de hibridación incluye secuencias polinucleotídicas de al menos aproximadamente 14 a 30 o más o menos nucleótidos de longitud complementarias a una secuencia nucleotídica que codifica una proteína cristalina, o secuencias polinucleotídicas de al menos aproximadamente 14 a 30 o más o menos nucleótidos de longitud complementarias a una secuencia nucleotídica que codifica un péptido de dirección al
plástido.

Un tamaño de al menos 14 nucleótidos de longitud ayuda a asegurar que el fragmento será de suficiente longitud para formar una molécula dúplex que es tanto estable como selectiva. Generalmente se prefieren moléculas que tienen secuencias complementarias sobre segmentos mayores de 14 bases de longitud. Para aumentar la estabilidad y la selectividad del híbrido, y por lo tanto mejorar la calidad y el grado de las moléculas híbridas específicas obtenidas, generalmente se preferirá diseñar moléculas de ácido nucleico que tengan secuencias complementarias al gen de 14 a 20 nucleótidos, o incluso más largas cuando se desee. Dichos fragmentos pueden prepararse fácilmente, por ejemplo, sintetizando directamente el fragmento por medios químicos, por aplicación de tecnología de reproducción de ácidos nucleicos, tal como la tecnología PCR^{TM} de las patentes de Estados Unidos 4.683.195, y 4.683.202, o escindiendo fragmentos de ADN seleccionados de plásmidos recombinantes que contienen insertos apropiados y sitios de restricción adecuados.

La presente invención también contempla un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. Por tanto, en una realización un vector de expresión es una molécula de ADN aislada y purificada que comprende un promotor unido de forma funcional a una región codificante que codifica un polipéptido de la presente invención, estando dicha región codificante unida de forma funcional a una región de terminación de la transcripción, por lo cual el promotor dirige la transcripción de la región codificante. La región codificante puede incluir un segmento que codifica una \delta-endotoxina de B. thuringiensis y un segmento que codifica un péptido diana de plástidos. La molécula de ADN que comprende el vector de expresión también puede contener un intrón funcional. Como se usa en este documento, las expresiones "unido funcionalmente" o "unido de forma funcional" significan que un promotor está conectado a una región codificante de tal modo que la transcripción de esa región codificante esté controlada y regulada por ese promotor. Los medios para unir e forma funcional un promotor a una región codificante para regularla tanto cadena arriba como cadena abajo son bien conocidos en la técnica.

Los vectores de transformación de vegetales preferidos incluyen los derivados de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, así como los descritos, por ejemplo, por Herrera-Estrella (1983), Bevan (1983), Klee (1985) y la solicitud de patente europea Nº EP 0120516.

Los promotores que funcionan en bacterias son bien conocidos en la técnica. Los promotores ejemplares y preferidos para las proteínas cristalinas de B. thuringiensis incluyen los promotores de los genes sigA, sigE, y sigK. Como alternativa, pueden usarse promotores nativos, mutagenizados, heterólogos, o recombinantes derivados de las secuencias que codifican la proteína \delta-endotoxina de Bacillus thuringiensis.

Cuando tiene que usarse un vector de expresión de la presente invención para transformar una planta, se selecciona un promotor que tenga la capacidad de dirigir la expresión en esa especie particular de planta. Los promotores que funcionan en diferentes especies vegetales también son bien conocidos en la técnica. Los promotores útiles en la expresión de secuencias codificantes de polipéptidos en plantas son aquellos que son inducibles, virales, sintéticos, o constitutivos como se ha describe (Poszkowski y col., 1989; Odell y col., 1985), y/o están regulados temporalmente, regulados espacialmente, y regulados espacio-temporalmente (Chau y col., 1989). Los promotores preferidos incluyen los promotores potenciados CaMV35S, y el promotor FMV35S. Otros promotores incluyen el promotor POX, el promotor temprano viral ScbDNA, y el promotor del virus del moteado amarillo.

De acuerdo con la presente invención, los vectores de expresión diseñados para potenciar específicamente la expresión del polipéptido en la planta transformada pueden incluir ciertas regiones que codifican péptidos de dirección al plástido (PTP). Estas regiones permiten que se exploten completamente los procesos celulares implicados en la transcripción, la traducción y la expresión de la proteína codificada cuando se asocian con ciertas \delta-endotoxinas de B. thuringiensis. Dichos péptidos de dirección al plástido funcionan de una diversidad de maneras, tales como por ejemplo, transfiriendo la proteína expresada a la estructura celular en la que funciona de la manera más eficaz, o transfiriendo la proteína expresada a áreas de la célula en las que se concentran los procesos celulares necesarios para la expresión.

En el caso de Cry3B, la expresión elevada es crítica para obtener maíz transgénico con control de CRW (del inglés Corn Rootworm (gusano de la raíz del maíz)) ya que la CL_{50} de Cry3B contra CRW es significativamente mayor que la CL_{50} de las toxinas de B. thuringiensis actualmente usadas para controlar plagas tales como el escarabajo de la patata de Colorado en las patatas (Cry3A) o el barrenador europeo del maíz en el maíz (Cry1Ab).

La expresión aumentada también es especialmente valiosa porque proporciona protección adicional contra el desarrollo de resistencia mediante una estrategia de dosis elevada (McGaughey y Whalon, 1993; Roush, 1994). La expresión de elevado nivel es incluso adicionalmente deseable ya que proporciona protección sostenida contra insectos en casos en los que disminuye la expresión del gen insecticida debido a condiciones medioambientales. Además e inesperadamente, las plantas del maíz transformadas con vectores que expresan Cry3B inhibidora de coleópteros o proteínas variantes mostraban crecimiento y desarrollo normales.

Un ejemplo de un péptido de dirección al plástido o cloroplasto (CTP) es un péptido de dirección al cloroplasto. Los péptidos de dirección al cloroplasto se han hallado particularmente útiles en el sistema marcado de selección resistente a glifosato. En este sistema, las plantas transformadas para expresar una proteína que confiere resistencia a glifosato se transforman con un PTP que dirige el péptido a los cloroplastos de las células. El glifosato inhibe la vía del ácido siquímico que conduce a la biosíntesis de compuestos aromáticos incluyendo aminoácidos y vitaminas. Específicamente, el glifosato inhibe la conversión del ácido fosfoenolpirúvico y el ácido 3-fosfosiquímico en ácido 5-enolpiruvil-3-fosfosiquímico inhibiendo la enzima ácido 5-enolpiruvil-3-fosfosiquímico sintasa (EPSP sintasa o EPSPS). La EPSPS suplementaria, conferida mediante la inserción de un transgén que codifica esta enzima, permite que la célula resista los efectos del glifosato. Por tanto, como el herbicida glifosato funciona eliminando la célula interrumpiendo la biosíntesis de aminoácidos aromáticos, particularmente en el cloroplasto de la célula, el CTP permite una resistencia aumentada al herbicida concentrado la enzima de resistencia a glifosato que expresa la célula en el cloroplasto, es decir, en el orgánulo diana de la célula. Las enzimas de resistencia a herbicidas ejemplares incluyen EPSPS como se ha indicado anteriormente, la glifosato óxido-reductasa (GOX) y el gen aro-A (patente de Estados Unidos Nº 4.535.060).

Los CTP pueden dirigir proteínas a cloroplastos y otros plástidos. Por ejemplo, el orgánulo diana puede ser el amiloplasto. Los CTP preferidos de la presente invención incluyen los que se dirigen tanto a cloroplastos así como también a otros plástidos. Los ejemplos específicos de CTP preferidos incluyen el CTP proteico RUBISCO SSU del maíz, y péptidos funcionalmente relacionados. Un polipéptido CTP ejemplar se muestra en la SEC ID Nº 26. Una secuencia polinucleotídica que codifica este polipéptido CTP se muestra en la en SEC ID Nº 25.

La expresión de un gen que existe en forma de ADN bicatenario implica la transcripción de ARN mensajero (ARNm) a partir de la cadena codificante del ADN por una enzima ARN polimerasa, y el posterior procesamiento del transcrito primario de ARNm en el interior del núcleo. La transcripción de ADN en ARNm está regulada por una región de ADN habitualmente conocida por el "promotor". La región promotora contiene una secuencia de bases que señaliza a la ARN polimerasa para asociarse con el ADN y para iniciar la transcripción del ARNm usando una de las cadenas de ADN como molde para crear una cadena correspondiente de ARN. El promotor particular seleccionado debe ser capaz de causar suficiente expresión de la secuencia codificante de la enzima para provocar la producción de una cantidad insecticida eficaz de la proteína de B. thuringiensis.

La región no traducida 3' de los genes de las plantas quiméricas de la presente invención también contiene una señal de poliadenilación que funciona en las plantas causando la adición de nucleótidos adenilato en el extremo 3' del ARN. Ejemplos de regiones 3' preferidas son (1) las regiones transcritas, no traducidas 3' que contienen la señal de poliadenilación de los genes plasmídicos que inducen tumores (Ti) de Agrobacterium, tales como el gen de la nopalina sintasa (NOS) y (2) los extremos 3' de genes vegetales tales como el gen ssRUBISCO E9 del guisante (Fischhoff y col., 1987).

Un promotor se selecciona por su capacidad de dirigir la actividad transcripcional de células vegetales transformadas o plantas transgénicas para la región codificante, para asegurar suficientes expresión de la secuencia codificante de la enzima para provocar la producción de cantidades insecticidas de la proteína de B. thuringiensis. Los genes estructurales pueden estar dirigidos por una diversidad de promotores en tejidos vegetales. Los promotores pueden ser casi constitutivos (es decir, dirigen la transcripción del transgén en todo el tejido), tales como el promotor CaMV35S, o promotores específicos de tejido o específicos en el desarrollo que afectan a dicotiledóneas o monocotiledóneas. Cuando el promotor es un promotor casi constitutivo tal como CaMV35S o FMV35S, se hallan aumentos en la expresión de polipéptido en una diversidad de tejidos vegetales transformados y la mayoría de los órganos vegetales (por ejemplo, el callo, las hojas, la semilla y la raíz). Las versiones potenciadas o duplicadas de los promotores CaMV35S y FMV35S son particularmente útiles en la práctica de esta invención (Kay y col., 1987; Rogers, patente de Estados Unidos 5.378.619). Se ha demostrado que secuencias potenciadores duplicadas en forma de tándem son de particular significado, por ejemplo, como se describe en Neuhaus y col. (Tissue-specific expression from promoter AS-1 in transgenic tobacco. Plant Cell 6: 827-834; 1994).

Los especialistas en la técnica reconocerán que hay varios promotores que son activos en células vegetales, y se han descrito en la bibliografía. Dichos promotores pueden obtenerse de plantas o virus de plantas e incluyen, aunque sin limitación, los promotores de la nopalina sintasa (NOS) y la octopina sintasa (OCS) (que los portan los plásmidos que inducen tumores de A. tumefaciens), los promotores 19S y 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor inducible por la luz de la subunidad pequeña de la ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa (ssRUBISCO, un polipéptido vegetal muy abundante), el promotor Act1 del arroz, el promotor POX, el promotor del virus del moteado amarillo, el promotor temprano del virus ScBV, el promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia (FMV), y el promotor AS4 35S (expresión potenciada en la raíz del promotor 35S unido a secuencias as-1 de tándem múltiple como en Neuhaus y col.). Todos estos promotores se han usado para crear diversos tipos de construcciones de ADN que se han expresado en plantas (véase, por ejemplo, McElroy y col., 1990, patente de Estados Unidos 5.463.175).

Además, puede preferirse provocar la expresión de la \delta-endotoxina de B. thuringiensis en tejidos específicos de la planta usando vectores de integración en plantas que contienen un promotor específico de tejido. Los tejidos diana específicos pueden incluir la hoja, el tronco, la raíz, el tubérculo, la semilla, el fruto, etc., y el promotor elegido debe tener la especificidad deseable de tejido y de desarrollo. Por lo tanto, la función del promotor debe optimizarse seleccionando un promotor con las capacidades de expresión tisular y la fuerza aproximada del promotor deseadas y seleccionando un transformante que produzca la actividad insecticida deseada en los tejidos diana. Este procedimiento de selección entre la combinación de transformantes se emplea rutinariamente en la expresión de genes estructurales heterólogos en plantas ya que existe variación entre transformantes que contienen el mismo gen heterólogo debido al sitio de inserción del gen dentro del genoma de la planta (habitualmente conocido como "efecto de posición"). Además de los promotores que se sabe que causan la transcripción (constitutiva o específica de tejido) del ADN en células vegetales, pueden identificarse otros promotores para su uso en la presente invención explorando una biblioteca de ADNc vegetal para genes que se expresan selectiva o preferiblemente en los tejidos diana y después se determinan las regiones promotoras.

Un promotor específico de tejido ejemplar es el promotor de lectina, que es específico para tejido de semillas. La proteína lectina en semillas de soja está codificada por un único gen (Le1) que se expresa solamente durante la maduración de la semilla y representa aproximadamente del 2 a aproximadamente el 5% del ARNm total de la semilla.

El gen de la lectina y el promotor específico de semillas se han caracterizado completamente y se han usado para dirigir la expresión específica de semillas en plantas de transgénicas de tabaco (Vodkin y col., 1983; Lindstrom y col., 1990).

Un vector de expresión que contiene una región codificante que codifica un polipéptido de interés puede diseñarse para que esté bajo el control del promotor de lectina y ese vector puede introducirse en plantas usando, por ejemplo, un procedimiento de transformación de protoplastos (Dhir y col., 1991). La expresión del polipéptido entonces estaría dirigida específicamente a las semillas de la planta transgénica.

Una planta transgénica de la presente invención producida a partir de una célula vegetal transformada con un promotor específico de tejido puede cruzarse con una segunda planta transgénica desarrollada a partir de una célula vegetal transformada con un promotor específico de tejido diferente para producir una planta transgénica híbrida que muestra los efectos de transformación en más de un tejido específico.

Otros promotores específicos de tejido ejemplares son la sacarosa sintetasa 1 del maíz (Yang y col., 1990), la alcohol deshidrogenasa 1 del maíz (Vogel y col., 1989), el complejo antena del maíz (Simpson, 1986), la proteína de choque térmico del maíz (Odell y col., 1985), la subunidad pequeña de la RuBP carboxilasa del guisante (Poulsen y col., 1986; Cashmore y col., 1983), la manopina sintasa del plásmido Ti (McBride y Summerfelt, 1989), la nopalina sintasa del plásmido Ti (Langridge y col., 1989), la chalcona isomerasa de petunia (Van Tunen y col., 1988), la proteína rica en glicina 1 de la judía (Keller y col., 1989), el transcrito CaMV 35s (Odell y col., 1985) y la patatina de la patata (Wenzler y col., 1989). Promotores preferidos son el promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S) y el promotor de la subunidad pequeña S-E9 de la RuBP carboxilasa.

Los promotores usados en las construcciones de ADN de la presente invención pueden modificarse, si se desea, para afectar a sus características de control. Por ejemplo, el promotor CaMV35S puede ligarse a la parte del gen de la ssRUBISCO que reprime la expresión de la ssRUBISCO en ausencia de luz, para crear un promotor que sea activo en las hojas pero no en las raíces. El promotor quimérico resultante puede usarse como se describe en este documento. Para los propósitos de esta descripción, la expresión promotor "CaMV35S" incluye por tanto variaciones del promotor CaMV35S, por ejemplo, promotores obtenidos mediante ligamiento con regiones operadoras, mutagénesis aleatoria o controlada, etc. Además, los promotores pueden alterarse para que contengan múltiples "secuencias potenciadoras" para ayudar a elevar la expresión génica. Se ha informado de ejemplos de dichas secuencias potenciadoras por Kay y col. (1987) y Ncuhaus y col. (1994).

El ARN producido por una construcción de ADN de la presente invención también contiene una secuencia líder no traducida 5'. Esta secuencia puede obtenerse a partir del promotor seleccionado para expresar el gen, y puede modificarse específicamente para aumentar la traducción del ARNm. Las regiones no traducidas 5' también pueden obtenerse de ARN virales, de genes eucariotas adecuados, o de una secuencia génica sintética. La presente invención no se limita a construcciones en las que la región no traducida se obtiene de la secuencia no traducida 5' que acompaña a la secuencia promotora. Como se muestra a continuación, una secuencia líder de un gen vegetal que es útil en la presente invención es la secuencia líder de la proteína de choque térmico 70 (hsp70) de petunia (Winter y col., 1988), la secuencia líder de CAB del trigo, o la secuencia líder de PER del trigo.

Una realización ejemplar de la invención implica dirigir al plástido la secuencia de B. thuringiensis. Dichas secuencias de dirección al plástido se ha aislado de numerosos genes vegetales codificados en el núcleo y se ha demostrado que dirigen la importación de proteínas sintetizadas en el citoplasma al interior de los plástidos (revisado en Keegstra y Olsen, 1989). Puede utilizarse una diversidad de secuencias de dirección, bien conocidas en la técnica, incluyendo, aunque sin limitación, ADPGPP, EPSP sintasa, o ssRUBISCO, en la práctica de esta invención. En realizaciones alternativas preferidas, las secuencias de dirección al plástido (péptido y ácido nucleico) para cultivos de monocotiledóneas pueden constar de un fragmento genómico codificante que contiene una secuencia intrónica así como un sitio de escisión proteolítica duplicado en las secuencias de dirección al plástido codificadas.

La secuencia de ácido nucleico codificante de CTP más preferida, mencionada en este documento como zmSSU CTP (SEC ID Nº 25), que consta de un fragmento genómico que contiene una secuencia intrónica así como un sitio de escisión proteolítica duplicado en las secuencias de dirección al plástido codificadas, se obtuvo a partir de una secuencia de dirección al plástido zmS1 (Russell y col., 1993). Se ha demostrado que fusiones de traducción directas de la secuencia peptídica de zmSSU CTP (SEC ID Nº 26) con el extremo amino de la secuencia son útiles para obtener niveles elevados del polipéptido en maíz transgénico. Pueden realizarse fusiones en fase de la secuencia de ácido nucleico de zmSSU CTP (SEC ID Nº 25) con un gen cry3b (SEC ID Nº 1) o variante génica por ligamiento de un sitio NcoI diseñado en el extremo 3' (codificación C-terminal) de la secuencia de zmSSU CTP en un sitio NcoI 5' diseñado en el extremo codificante N-terminal de cry3B o de la secuencia codificante variante.

La secuencia de CTP preferida para cultivos de dicotiledóneas consta de un fragmento codificante genómico que contiene la secuencia del péptido de dirección al cloroplasto del gen de la EPSP sintasa de Arabidopsis thaliana en la que el sitio de escisión del péptido de tránsito del CTP de ssRUBISCO del guisante remplaza el sitio de escisión del CTP de la EPSP sintasa nativa (Klee y col., 1987).

Como se ha indicado anteriormente, la región no traducida 3' de los genes de las plantas quiméricas de la presente invención contiene una señal de poliadenilación que funciona en plantas para causar la adición de nucleótidos adenilato en el extremo 3' del ARN. Ejemplos de regiones 3' preferidas son (1) las regiones transcritas, no traducidas 3' que contienen la señal de poliadenilato de genes del plásmido que induce tumores (Ti) de Agrobacterium, tales como el gen de la nopalina sintasa (NOS) y (2) genes de plantas tales como el gen de la ssRUBISCO E9 del guisante (Fischhoff y col., 1987).

Para la expresión optimizada en plantas monocotiledóneas, también puede incluirse un intrón en la construcción de expresión de ADN. Dicho intrón se coloca típicamente cerca del extremo 5' del ARNm en una secuencia no traducida. Este intrón podría obtenerse de, aunque sin limitación, una serie de intrones que consta del intrón 70 de la proteína de choque térmico del maíz (HSP) (patente de Estados Unidos 5.424.412; 1995), el intrón Act del arroz (McElroy y col., 1990), el intrón Adh 1 (Callis y col., 1987), o el intrón de la sacarosa sintasa (Vasil y col., 1989). Como se muestra en este documento, el intrón HSP70 del maíz (SEC ID Nº 33) y el intrón de la actina del arroz (SEC ID Nº 32) son particularmente útiles en la presente invención.

La ARN polimerasa transcribe una secuencia de ADN codificante hasta un sitio en el que sucede la poliadenilación. Típicamente, las secuencias de ADN localizadas unos pocos cuentos de pares de bases cadena debajo del sitio de poliadenilación sirven para termina la transcripción. Esas secuencias de ADN se mencionan en este documento como regiones de terminación de la transcripción. Esas regiones son necesarias para una poliadenilación eficaz del ARN mensajero (ARNm) transcrito.

Las construcciones incluirán típicamente el gen de interés junto con una secuencia de ADN en el extremo 3' que actúa como señal para terminar la transcripción y permitir la poliadenilación del ARNm resultante. Se contempla que los elementos 3' más preferidos son aquellos del gen de la nopalina sintasa de A. tumefaciens (extremo 3' de nos) (Bevan y col., 1983), el terminador para el transcrito T7 del gen de la octopina sintasa de A. tumefaciens, y el extremo 3' de los genes del inhibidor de proteasa i o ii de la patata o el tomate. Pueden incluirse adicionalmente elementos reguladores tales como el elemento \Omega de TMV (Gallie, y col., 1989), cuando se desee.

Otro tipo de elemento que puede regular la expresión génica es la secuencia de ADN entre el sitio de inicio de la transcripción y el inicio de la secuencia codificante, llamada la secuencia líder no traducida. La secuencia líder puede influir en la expresión génica. Se han creado compilaciones de secuencias líder para predecir las secuencias óptimas o sub-óptimas y generar secuencias líder "consenso" y preferidas (Joshi, 1987). Se contempla que las secuencias líder preferidas incluyen aquellas que comprenden secuencias de las que se ha predicho que dirigen la expresión óptima del gen estructural unido, es decir, que incluyen una secuencia líder consenso preferida que puede aumentar o mantener la estabilidad del ARNm y evitar el inicio inapropiado de la traducción. La elección de dichas secuencias será conocida para los especialistas en la técnica a la luz de la presente descripción. Las secuencias que se obtienen de genes que se expresan elevadamente en plantas, y en el maíz en particular, serán las más preferidas. Una secuencia líder particularmente preferida puede ser la secuencia líder de CAB del trigo (SEC ID Nº 31).

Podrían usarse potenciadores de la transcripción o réplicas de potenciadores para aumentar la expresión. Estos potenciadores a menudo se encuentran 5' al inicio de la transcripción en un promotor que funciona en células eucariotas, pero a menudo puede insertarse en orientación directa o inversa 5' o 3' a la secuencia codificante. Los ejemplos de potenciadores incluyen elementos del promotor CaMV 35S, los genes de la octopina sintasa (Ellis y col., 1987), el gen de la actina del arroz, y el promotor de eucariotas no vegetales (por ejemplo, levaduras; Ma y col., 1988).

La elección de qué vector de expresión y finalmente a qué promotor se une de forma funcional una región codificante de un polipéptido depende directamente de las propiedades funcionales deseadas, por ejemplo, la ubicación y el momento de la expresión de la proteína, y la célula huésped a transformar. Éstas son limitaciones bien conocidas inherentes en la técnica de la construcción de moléculas de ADN recombinante. Sin embargo, un vector útil en la práctica de la presente invención es capaz de dirigir la expresión de la región codificante del polipéptido a la que está unido de forma funcional.

Los vectores típicos útiles para la expresión de genes en plantas superiores son bien conocidos en la técnica e incluyen vectores derivados del plásmido que induce tumores (Ti) de A. tumefaciens descrito (Rogers y col., 1987). Sin embargo, se sabe que otros varios sistemas de vector de integración en plantas funcionan en plantas incluyendo el vector de control de la transferencia pCaMVCN descrito (Fromm y col., 1985). El vector pCaMVCN (disponible en Pharmacia, Piscataway, NJ) incluye el promotor CaMV35S.

En realizaciones preferidas, el vector usado para expresar el polipéptido incluye un marcador de selección que es eficaz en una célula vegetal, preferiblemente un marcador de selección de resistencia a fármacos. Un marcador de resistencia a fármacos preferido es el gen cuya expresión provoca resistencia a kanamicina; es decir, el gen quimérico que contiene el promotor de la nopalina sintasa, la neomicina fosfotransferasa II (nptII) de Tn5 y la región no traducida 3' de la nopalina sintasa descrita (Rogers y col., 1988).

Los medios para preparar vectores de expresión son bien conocidos en la técnica. Se describen vectores de expresión (transformación) usados para transformar plantas y procedimiento para crear esos vectores en las patentes de Estados Unidos 4.971.908, 4.940.835, 4.769.061 y 4.757.011. Esos vectores pueden modificarse para que incluyan una secuencia codificante de acuerdo con la presente invención.

Una región codificante que codifica un polipéptido que tiene la capacidad de conferir actividad insecticida a una célula es preferiblemente un polinucleótido que codifica una \delta-endotoxina de B. thuringiensis concretamente es una región codificante que comprende la secuencia de ADN de la SEC ID Nº 11.

Se ha demostrado que las ORF que codifican el polipéptido de \delta-endotoxina de B. thuringiensis específicas contenidas dentro de casetes de expresión expresan las \delta-endotoxinas de B. thuringiensis a elevados niveles en plantas transformadas. Los casetes preferidos incluyen aquellos contenidos en los plásmidos pMON33741, y pMON33748. Los casetes de expresión en estos plásmidos están respectivamente codificados por las secuencias mostradas en la SEC ID Nº 21, y la SEC ID Nº 23. Más preferiblemente, las plantas pueden transformar satisfactoriamente con cualquier casete de expresión que comprende las secuencias nucleotídicas del nucleótido 14 al 3020 de la SEC ID Nº 21 o del 25 al 3450 de la SEC ID Nº 23 (pMON33741, y pMON33748). Más preferiblemente, las plantas pueden transformarse satisfactoriamente con cualquier casete de expresión que comprende las secuencias nucleotídicas del nucleótido 14 al 3020 de la SEC ID Nº 21 o del 25 al 3450 de la SEC ID Nº 23 (pMON33741, y pMON33748).

El trabajo descrito en este documento ha identificado procedimientos para potenciar la expresión in planta de \delta-endotoxinas de B. thuringiensis, que confieren resistencia a insectos patógenos cuando se incorporan en el genoma de plantas susceptibles. La patente de Estados Unidos 5.500.365 describe un procedimiento para sintetizar genes vegetales para optimizar el nivel de expresión de la proteína que codifica el gen sintetizado. Este procedimiento se refiere a la modificación de secuencias de genes estructurales del transgén exógeno, para hacerlas más "tipo planta" y por lo tanto con más probabilidad de traducirse y expresarse por la planta. Se describe un procedimiento similar para la expresión potenciada de transgenes en plantas monocotiledóneas en la patente de Estados Unidos 5.689.052. Puede hacerse que plantas agrícolas, hortícolas, ornamentales, y otras plantas económica o comercialmente útiles de acuerdo con los procedimientos descritos en este documento, expresen \delta-endotoxinas de B. thuringiensis a niveles suficientemente elevados para conferir resistencia a insectos patógenos.

Dichas plantas pueden co-expresar el polipéptido \delta-endotoxina de B. thuringiensis junto con otros péptidos, polipéptidos, o proteínas relacionadas con patogénesis antifúngicas, antibacterianas, o antivirales; proteínas insecticidas; proteínas que confieren resistencia a herbicidas; y proteínas implicadas en la mejora de la calidad de productos vegetales o el rendimiento agrícola de las plantas. La coexpresión simultánea de múltiples proteínas en plantas es ventajosa porque explota más de un modo de acción para controlar el daño patogénico de la planta. Esto puede minimizar la posibilidad de desarrollar cepas patógenas resistentes, ampliar el alcance de la resistencia, y provocar potencialmente un efecto insecticida sinérgico, potenciado de este modo la capacidad de las plantas de resistir la infestación por insectos (documento WO 92/17591).

Finalmente, los segmentos de ADN más deseables para su introducción en un genoma de monocotiledónea pueden ser genes o familias de genes homólogos que codifican un rasgo deseado (por ejemplo, producción aumentada), y que se introducen bajo el control de nuevos novel promotores o potenciadores, etc., o quizá incluso promotores homólogos o específicos de tejido (por ejemplo, específicos de cuello de la raíz/vaina, verticilo, tallo, espiga, grano u hoja) o elementos de control. De hecho, se prevé que un uso particular de la presente invención puede ser la producción de transformantes que comprenden un transgén que está dirigido de un modo específico de tejido. Por ejemplo, pueden expresarse genes de resistencia a insectos de forma específica en tejidos del verticilo y del cuello/vaina que son dianas para la primera y segunda progenies, respectivamente, de ECB. Asimismo, es deseable que genes que codifican proteínas con actividad particular contra el gusano de la raíz se expresen preferentemente en tejidos de la raíz.

Los vectores para su uso en la dirección específica de tejido de la expresión génica en plantas transgénicas típicamente incluirán promotores específicos de tejido y también pueden incluir otros elementos de control específicos de tejido tales como secuencias potenciadoras. Los promotores que dirigen la expresión específica o potenciada en ciertos tejidos vegetales serán bien conocidos para los especialistas en la técnica a la luz de la presente descripción.

También se contempla que la expresión específica de tejido puede conseguirse funcionalmente introduciendo un gen expresado constitutivamente (todos los tejidos) en combinación con un gen antisentido que se expresa solamente en aquellos tejidos donde no se desea al producto génico. Por ejemplo, un gen que codifica la proteína de toxina cristalina de B. thuringiensis puede introducirse de modo que se exprese en todos los tejidos usando el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor. Como alternativa, también podría usarse un promotor de actina del arroz o un promotor de histona de una especie dicotiledónea o monocotiledónea para la expresión constitutiva de un gen. Además, se contempla que pueden ser útiles promotores que combinan elementos de más de un promotor. Por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.491.288 describe la combinación de un promotor del virus del mosaico de la coliflor con un promotor de histona. Por lo tanto, la expresión de un transcrito antisentido de un gen de \delta-endotoxina Bt en un grano de maíz, usando por ejemplo un promotor de zeína, evitaría la acumulación de la \delta-endotoxina en la semilla. Por tanto, la proteína codificada por el gen introducido estaría presente en todos los tejidos excepto en el grano. Los inventores contemplan específicamente que podría usarse una estrategia similar con la presente invención para dirigir la expresión de un marcador de exploración o selección en el tejido de la semilla.

Como alternativa, se puede desear obtener nuevas secuencias promotoras específicas de tejido para su uso de acuerdo con la presente invención. Para conseguir esto, primero se pueden aislar clones de ADNc del tejido afectado e identificar aquellos clones que se expresan específicamente en ese tejido, por ejemplo, usando transferencia de Northern. De forma ideal, se querría identificar un gen que no esté presente en una elevada cantidad de copias, pero que su producto génico sea relativamente abundante en tejidos específicos. El promotor y los elementos de control de los clones genómicos correspondientes por tanto pueden localizarse usando las técnicas de biología molecular conocidas para los especialistas en la técnica.

Se contempla que la expresión de algunos genes en plantas transgénicas se deseará solamente en condiciones específicas. Por ejemplo, se propone que la expresión de ciertos genes que confieren resistencia a factores de estrés medioambiental tales como sequía se deseará solamente en condiciones reales de estrés. Se contempla adicionalmente que la expresión de dichos genes en todo el desarrollo de las plantas puede tener efectos perjudiciales. Se sabe que existe una gran cantidad de genes que responden al medioambiente. Por ejemplo, la expresión de algunos genes tales como rbcS, que codifica la subunidad pequeña de la ribulosa bisfosfato carboxilasa, está regulado por la luz mediada a través del fitocromo. Otros genes se inducen por estímulos secundarios. Por ejemplo, la síntesis de ácido abscísico (ABA) se induce por ciertos factores medioambientales, incluyendo, aunque sin limitación, estrés por agua. Se ha demostrado que varios genes se inducen por ABA (Skriver y Mundy, 1990). También se espera que la expresión de genes que confieren resistencia a la depredación por insectos se desee solamente en condiciones de infestación real por insectos. Por lo tanto, para algunos rasgos deseados, se deseará la expresión inducible de genes en plantas
transgénicas.

Se propone que, en algunas realizaciones de la presente invención, se deseará la expresión de un gen en una planta transgénica solamente en un cierto periodo de tiempo durante el desarrollo de la planta. El momento del desarrollo frecuentemente está correlacionado con la expresión génica específica de tejido. Por ejemplo, la expresión de proteínas de almacenamiento de zeína se inicia en el endosperma aproximadamente 15 días después de la polinización.

Se contempla que el procedimiento descrito en esta invención podría usarse para obtener una expresión sustancialmente mejorada de varias endotoxinas nuevas de B. thuringiensis aisladas como se describe a continuación. La identificación de nuevas cepas de Bacillus thuringiensis que codifican endotoxinas cristalinas con actividad insecticida se ha descrito previamente (Donovan y col., 1992). El aislamiento de la endotoxina de B. thuringiensis, seguido de la secuenciación de aminoácidos amino terminales, la traducción inversa de la secuencia de aminoácidos para diseñar una sonda oligonucleotídica o el uso de un gen relacionado de B. thuringiensis como sonda, seguido de la clonación del gen que codifica la endotoxina por hibridación son conocidos para los especialistas en la técnica y se han descrito (véase, por ejemplo, Donovan y col., 1992, patente de Estados Unidos 5.264.364). Pueden conseguirse \delta-endotoxinas Cry3Bb de Bacillus thuringiensis con actividad inhibidora de coleópteros mejorada usando los procedimientos descritos en English y col. (documento WO 99/31248).

También se contempla una planta transformada con un vector de expresión de la presente invención. También se contempla una planta transgénica derivada de dicha célula transformada o transgénica. Los especialistas en la técnica reconocerán que puede insertarse un gen vegetal quimérico que contiene una secuencia codificante estructural de la presente invención en el genoma de una planta por procedimientos bien conocidos en la técnica. Dichos procedimientos para la transformación con ADN de células vegetales incluyen la transformación de plantas mediada por Agrobacterium, el uso de liposomas, la transformación usando virus o polen, electroporación, transformación del protoplasto, transferencia génica en polen, inyección o infiltración al vacío (Bechtold y col., Meth. Mo. Biol., 82:259-266; 1998) en órganos reproductores, inyección en embriones inmaduros y bombardeo con partículas. Cada uno de estos procedimientos tiene ventajas y desventajas distintas. Por tanto, un procedimiento particular para introducir genes en una variedad de planta particular puede no ser necesariamente el más eficaz para otra variedad de planta, pero es bien sabido que los procedimientos son útiles para una variedad particular de planta.

La tecnología para introducir ADN en células es bien conocida para los especialistas en la técnica. Se han descrito cuatro procedimientos generales para suministrar un gen en células: (1) procedimientos químicos (Graham y van der Eb, 1973); (2) procedimientos físicos tales como microinyección (Capecchi, 1980), electroporación (Wong y Neumann, 1982; Fromm y col., 1985) y la pistola génica (Johnston y Tang, 1994; Fynan y col., 1993); (3) vectores virales (Clapp, 1993; Lu y col., 1993; Eglitis y Anderson, 1988a; 1988b); y (4) mecanismos mediados por receptor (Curiel y col., 1991; 1992; Wagner y col., 1992).

Un procedimiento ventajoso para suministrar segmentos de ADN de transformación a células vegetales es el bombardeo con microproyectiles. En este procedimiento, las partículas pueden revestirse con ácidos nucleicos y suministrarse en células por una fuerza de propulsión. Las partículas ejemplares incluyen las compuestas por tungsteno, oro, platino, y similares. Usando estas partículas, el ADN se transporta a través de la pared celular y al interior del citoplasma sobre la superficie de pequeñas partículas metálicas como se ha descrito (Klein y col., 1987; Klein y col., 1988; Kawata y col., 1988). Las partículas metálicas penetran a través de varias capas de las células y por tanto permiten la transformación de las células dentro de explantes tisulares.

Una ventaja del bombardeo con microproyectiles, además de ser un medio eficaz para transformar de forma estable y reproducible células vegetales, es que no se requiere el aislamiento de protoplastos (Cristou y col., 1988) ni la susceptibilidad a infección por Agrobacterium. Una realización ilustrativa de un procedimiento para suministrar ADN en células vegetales por aceleración es un sistema de suministro de partículas por biolística, que puede usarse para propulsar partículas revestidas con ADN o células a través de un tamiz, tal como un tamiz de acero inoxidable o Nytex, sobre una superficie de filtro cubierta con las células vegetales cultivadas en suspensión. El tamiz dispersa las partículas de modo no se suministran a las células receptores en grandes agregados. Se cree que un tamiz interpuesto entre el aparato de proyectiles y las células a bombardear reduces el tamaño de los proyectiles agregados y puede contribuir a una frecuencia mayor de transformación reduciendo el daño inflingido sobre las células receptoras por los proyectiles que son demasiado grandes.

Para el bombardeo, las células en suspensión se concentran preferiblemente sobre filtros o medio de cultivo sólido. Como alternativa, pueden disponerse embriones inmaduros u otras células diana sobre el medio de cultivo sólido. Las células a bombardear se colocan a una distancia apropiada debajo de la placa de detención de macroproyectiles. Si se desea, también se colocan uno o más tamices entre el dispositivo de aceleración y las células a bombardear. A través del uso de las técnicas expuestas en este documento se pueden obtener hasta 1000 o más focos de células que expresan de forma transitoria un gen marcador. La cantidad de células en un foco que expresa el producto génico exógeno 48 horas después del bombardeo a menudo varía de 1 a 10 y promedia de 1 a 3.

En la transformación por bombardeo, se pueden optimizar las condiciones de cultivo previas al bombardeo y los parámetros del bombardeo para producir las cantidades máximas de transformantes estables. Son importantes los parámetros tanto físicos como biológicos para el bombardeo en esta tecnología. Los factores físicos son aquellos que implican la manipulación del precipitado ADN/microproyectil o aquellos que afectan al vuelo y la velocidad de los macro- o microproyectiles. Los factores biológicos incluyen todas las etapas implicadas en la manipulación de las células antes e inmediatamente después del bombardeo, el ajuste osmótico de las células diana para ayudar a aliviar el traumatismo asociado con el bombardeo, y también la naturaleza del ADN transformante, tal como ADN linealizado o plásmidos superenrollados intactos. Se cree que las manipulaciones previas al bombardeo son especialmente importantes para la transformación satisfactoria de embriones vegetales inmaduros.

Por consiguiente, se contempla que se puede desear ajustar diversos parámetros del bombardeo en estudios a pequeña escala para optimizar completamente las condiciones. Un puede desear particularmente ajustar los parámetros físicos tales como la distancia de hueco, la distancia de vuelo, la distancia del tejido, y la presión de helio. También se puedes minimizar los factores de reducción de traumatismo (TRF) modificando las condiciones que influyen en el estado fisiológico de las células receptoras y que por lo tanto pueden influir en las eficacias de transformación e integración. Por ejemplo, el estado osmótico, la hidratación del tejido y la fase de subcultivo o ciclo celular de las células receptoras pueden ajustarse para una transformación óptima. La ejecución de otros ajustes rutinarios será bien conocida para los especialistas en la técnica a la luz de la presente descripción.

Los procedimientos de transformación mediada por partículas son bien conocidos para los especialistas en la técnica. La patente de Estados Unidos 5.015.580 describe la transformación de semillas de soja usando dicha técni-
ca.

La transferencia mediada por Agrobacterium es un sistema ampliamente aplicable para introducir genes en células vegetales porque el ADN puede introducirse en tejidos vegetales completos, evitando por lo tanto la necesidad de regeneración de una planta intacta a partir de un protoplasto. El uso de vectores de integración en plantas mediados por Agrobacterium para introducir ADN en células vegetales es bien conocido en la técnica. Véanse, por ejemplo, los procedimientos descritos (Fraley y col.. 1985; Rogers y col., 1987). El diseño genético de plantas de algodón usando transferencia mediada por Agrobacterium se describe en la patente de Estados Unidos 5.004.863; la transformación similar de plantas de lechuga se describe en la patente de Estados Unidos 5.349.124; y la transformación mediada por Agrobacterium de soja se describe en la patente de Estados Unidos 5.416.011. Además, la integración del ADN de Ti es un procedimiento relativamente preciso que provoca pocos reordenamientos. La región de ADN a transferir está definida por las secuencias límite, y habitualmente se inserta ADN intermedio en el genoma vegetal como se ha descrito (Spielmann y col., 1986; Jorgensen y col., 1987).

Los vectores de transformación de Agrobacterium modernos tienen capacidad de replicación en E. coli así como Agrobacterium, lo que permite manipulaciones convenientes como se ha descrito (Klee y col., 1985). Además, recientes avances tecnológicos en los vectores para la transferencia génica mediada por Agrobacterium han mejorado el ordenamiento de genes y sitios de restricción en los vectores para facilitar la construcción de vectores capaces de expresar diversos genes que codifican polipéptidos. Los vectores descritos (Rogers y col., 1987), tienen regiones multi-engarce convenientes flanqueadas por un promotor y un sitio de poliadenilación para la expresión directa de genes insertados que codifican polipéptidos y son adecuadas para los presentes propósitos. Además, puede usarse Agrobacterium que contiene genes Ti tanto armados como desarmados para las transformaciones. En aquellas variedades de plantas en las que es eficaz la transformación mediada por Agrobacterium, éste es el procedimiento de elección debido a la facilidad y la naturaleza definida de la transferencia génica.

La transformación mediada por Agrobacterium de discos foliares y otros tejidos tales como los cotiledones y los hipocotilos parece limitarse a plantas a las que Agrobacterium infecta de forma natural. La transformación mediada por Agrobacterium es más eficaz en plantas dicotiledóneas. Parece que pocas monocotiledóneas son huéspedes naturales para Agrobacterium, aunque se han producido plantas transgénicas en espárragos usando vectores de Agrobacterium como se ha descrito (Bytebier y col., 1987). Otras monocotiledóneas también se han transformado recientemente con Agrobacterium. Se incluyen en este grupo el maíz (Ishida y col.) y el arroz (Cheng y col.).

Una planta transgénica formada usando procedimientos de transformación con Agrobacterium típicamente contiene un único gen en un cromosoma. Dichas plantas transgénicas aludirse como que son heterocigóticas para el gen añadido. Sin embargo, en la medida en que el uso de la palabra "heterocigótico" habitualmente implica la presencia de un gen complementario en el mismo locus del segundo cromosoma de un par de cromosomas, y no existe dicho gen en una planta que contiene un gen añadido como aquí, se cree que un nombre más exacto para dicha planta es un segregante independiente, ya que el gen exógeno añadido se segrega independientemente durante la mitosis y la meiosis.

Puede preferirse un segregante independiente cuando la planta se comercializa en forma de un híbrido, tal como el maíz. En este caso, se cruza un segregante independiente que contiene el gen con otra planta, para formar una planta híbrida que es heterocigótica para el gen de interés.

Una preferencia alternativa es una planta transgénica que es homocigótica para el gen estructural añadido; es decir, una planta transgénica que contiene dos genes añadidos, un gen en el mismo locus en cada cromosoma de una par de cromosomas. Una planta transgénica homocigótica puede obtenerse cruzando sexualmente (cruzando por endogamia) una planta transgénica segregante independiente que contiene un único gen añadido, germinando algunas de las semillas producidas y analizando las plantas resultantes producidas para la actividad del gen de interés y la herencia mendeliana que indica homocigosidad con relación a un control (nativo, no transgénico) o una planta transgénica segregante independiente.

Pueden cruzarse dos plantas transgénicas diferentes para producir descendencia que contenga dos genes exógenos añadidos de segregación independiente. El cruce por endogamia de la descendencia apropiada puede producir plantas que son homocigóticas para ambos genes exógenos añadidos que codifican un polipéptido de interés. También se contemplan el retro-cruce con una planta parental y el cruce exogámico con una planta no transgénica.

La transformación de protoplastos vegetales puede conseguirse usando procedimientos basados en precipitación de fosfato cálcico, tratamiento con polietilenglicol, electroporación, y combinaciones de estos tratamientos (véase, por ejemplo, Potrykus y col., 1985; Lorz y col., 1985; Fromm y col., 1985; Uchimiya y col., 1986; Callis y col., 1987; Marcotte y col., 1988). La aplicación de estos sistemas a diferente plasma germinal vegetal depende de la capacidad de regenerar esa variedad vegetal particular a partir de protoplastos. Los procedimientos ilustrativos para la regeneración de cereales a partir de protoplastos se han descrito (véase, por ejemplo, Fujimura y col., 1985; Toriyama y col., 1986; Yamada y col., 1986; Abdullah y col., 1986). Para transformar plasma germinal vegetal que no puede regenerarse satisfactoriamente a partir de protoplastos, pueden utilizarse otros modos para introducir ADN en células o tejidos intactos. Por ejemplo, la regeneración de cereales a partir de embriones inmaduros o explantes puede realizarse como se ha descrito (Vasil, 1988). El ADN también puede introducirse en plantas por transferencia directa de ADN en polen como se ha descrito (Zhou y col., 1983; Hess, 1987). La expresión de genes que codifican polipéptidos puede obtenerse por inyección del ADN en órganos reproductores de una planta como se ha descrito (Pena y col., 1987). El ADN también puede inyectarse directamente en las células de embriones inmaduros y la rehidratación de embriones desecados como se ha descrito (Neuhaus y col., 1987; Benbrook y col., 1986).

A menudo genes bacterianos no modificados se expresan mal en células vegetales transgénicas. Varios informes han descrito procedimientos para mejorar la expresión de genes recombinantes en plantas (Murray y col., 1989; Diehn y col., 1996; Iannacone y col., 1997; Rouwendal y col., 1997; Futterer y col., 1997; y Futterer y Hohn, 1996). Estos informes describen diversos procedimientos para diseñar secuencias codificantes que representan secuencias que se traducen de forma más eficaz en base a las tablas de frecuencia de codones de la planta, las mejoras en el sesgo de la posición de la tercera base del codón, usando secuencias recombinantes que evitan los supuestos dominios de poliadenilación o ricos en A/T o secuencias consenso de corte y empalme de intrones. Aunque estos procedimientos para la construcción de genes sintéticos son notables, los genes sintéticos de la presente invención se prepararon de acuerdo con el procedimiento de Brown y col. (patente de Estados Unidos Nº 5.689.052; 1997). Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar genes vegetales sintéticos que expresan in planta un producto proteico deseado a niveles significativamente mayores que los genes de tipo silvestre. En resumen, de acuerdo con Brown y col., la frecuencia de codones de monocotiledóneas raros y semi-raros en una secuencia polinucleotídica que codifica una proteína deseada se reduce y se remplaza con codones de monocotiledóneas más preferidos. La acumulación potenciada de un polipéptido deseado por una secuencia polinucleotídica modificada en una planta monocotiledónea es el resultado del aumento de la frecuencia de codones preferidos analizando la secuencia codificante en fragmentos de seis nucleótidos sucesivos y alterando la secuencia en base a la frecuencia de presencia de los oligómeros de seis unidades en cuanto a la frecuencia de presencia de los oligómeros de seis unidades más raros 284, 484, y 664 en plantas monocotiledóneas. Además, Brown y col. describen la expresión potenciada de un gen recombinante aplicando el procedimiento para reducir la frecuencia de codones raros con procedimientos para reducir la existencia de señales de poliadenilación y sitios de corte y empalme de intrones en la secuencia nucleotídica, eliminando las secuencias auto-complementarias en la secuencia nucleotídica y remplazado dichas secuencias con nucleótidos no auto-complementarios manteniendo al mismo tiempo un gen estructural que codifica el polipéptido, y reduciendo la frecuencia de la existencia de pares dinucleotídicos 5'-CG-3' en la secuencia nucleotídica. Estas etapas se realizan secuencialmente y tienen un efecto cumulativo que produce una secuencia nucleotídica que contiene una utilización preferente de los codones de monocotiledóneas más preferidos para plantas monocotiledóneas para una mayoría de los aminoácidos presentes en el polipéptido deseado.

Por tanto, la cantidad de un gen que codifica un polipéptido de interés (es decir, una proteína cristalina bacteriana o polipéptido \delta-endotoxina o dicha \delta-endotoxina unida a un péptido de dirección al plástido) puede aumentarse en plantas transformado esas plantas usando procedimientos de transformación tales como los descritos en este documento.

Después de realizar el suministro de ADN exógeno a las células receptoras, la siguiente etapa para obtener una planta transgénica generalmente concierne a la identificación de las células transformadas para el cultivo adicional y la regeneración de la planta. Como se menciona en este documento, para mejorar la capacidad de identificar transformantes, es preferible emplear un marcador de selección o exploración como, o además de, el gen expresable de interés. En este caso, después generalmente se ensayaría la población celular potencialmente transformada exponiendo las células a un agente o agentes selectivos, o se explorarían las células para el rasgo del gen marcador deseado.

Una realización ejemplar de procedimientos para identificar células transformadas implica exponer los cultivos transformados a un agente selectivo, tal como un inhibidor metabólico, un antibiótico, un herbicida o similares. Las células que se han transformado y han integrado de forma estable un gen marcador que confiere resistencia al agente selectivo usado, crecerán y se dividirán en cultivo. Las células sensibles no serán susceptibles a cultivo adicional. Un ejemplo de un gen marcador preferido que codifican es la EPSPS sintasa que es resistente a la inhibición con glifosato. Cuando se usa este gen como marcador de selección, el cultivo celular supuestamente transformado se trata con glifosato. Después del tratamiento, las células transgénicas estarán disponibles para cultivo adicional mientras que las células sensibles, o no transformadas, no. Este procedimiento se describe con detalle en la patente de Estados Unidos 5.569.834. Otro ejemplo de un sistema marcador de selección preferido es el sistema nptII por el cual se confiere resistencia a los antibióticos kanamicina, neomicina, y paromomicina o antibióticos relacionados, como se describe en la patente de Estados Unidos 5.569.834. De nuevo, después de la transformación con este sistema, las células transformadas que contienen un gen nptII que se expresa en plantas estarán disponibles para cultivo adicional después del tratamiento con kanamicina o un antibiótico relacionado, mientras que las células no transformadas no. El uso de este tipo de sistema marcador de selección se describe en Brown y col. (patente de Estados Unidos Nº 5.424.412). Otro marcador de exploración que puede usarse es el gen que codifica la proteína verde fluorescente. Todos los ensayos contemplados son no destructivos y las células transformadas pueden cultivarse adicionalmente después de la identificación.

Se contempla adicionalmente que combinaciones de marcadores de exploración y de selección serán útiles para la identificación de células transformadas. En algunos tipos de células o tejidos, un agente de selección, tal como glifosato o kanamicina, puede no proporcionar suficiente actividad de eliminación para reconocer claramente las células transformadas o puede causar inhibición no selectiva sustancial de los transformantes y no transformantes parecidos, causando por tanto que la técnica de selección no sea eficaz. Se propone que la selección con un compuesto inhibidor de crecimiento, tal como glifosato a concentraciones por debajo de las que causan el 100% de inhibición seguido de exploración del tejido en crecimiento para la expresión de un gen marcador de exploración tal como kanamicina permitiría que se recuperaran transformantes de tipos celulares o tisulares que no son susceptibles a selección sola. Se propone que combinaciones de selección y exploración pueden posibilitar que se identifiquen transformantes en una diversidad más amplia de tipos celulares y tisulares.

El desarrollo o regeneración de plantas a partir de un único protoplasto vegetal o diversos explantes es bien conocido en la técnica (Weissbach y Weissbach, 1988). Este procedimiento de regeneración y cultivo típicamente incluye las etapas de selección de células transformadas, el cultivo de aquellas células individualizadas a través de las fases habituales de desarrollo embrionario a través de la fase de plántula enraizada. Los embriones y las semillas transgénicas se regeneran de forma similar. Los brotes transgénicos resultantes después se plantan en un medio de crecimiento apropiado para plantas tal como tierra.

El desarrollo o regeneración de plantas que contienen el gen foráneo, exógeno que codifica un polipéptido de interés introducido por Agrobacterium a partir de explantes foliares puede conseguirse por procedimientos bien conocidos en la técnica tales como los descritos (Horsch y col., 1985). En este procedimiento, los transformantes se cultivan en presencia de un agente de selección y en un medio que induce la regeneración de los brotes en la variedad de planta que se está transformado como se ha descrito (Fraley y col., 1983). En particular, la patente de Estados Unidos 5.349.124 detalla la creación de células de lechuga genéticamente transformadas y plantas resultantes de las mismas que expresan proteínas cristalinas híbridas que confieren actividad insecticida contra larvas de lepidópteros a dichas plantas. Este procedimiento típicamente produces brotes en dos a cuatro meses y esos brotes después se transfieren a un medio apropiado que no induce raíces que contiene el agente selectivo y un antibiótico para evitar el crecimiento bacteriano. Los brotes que enraízan en presencia del agente selectivo para formar plántulas después de transplantan a la tierra u otro medio para permitir la producción de raíces. Estos procedimientos varían dependiendo de la variedad de planta particular empleada, siendo dichas variaciones bien conocidas en la técnica.

Una planta transgénica de esta invención por tanto tiene una cantidad aumentada de una región codificante que codifica un polipéptido \delta-endotoxina de B. thuringiensis o variante del mismo o puede codificar dicha \delta-endotoxina unida a un péptido de dirección al plástido. Una planta transgénica preferida es un segregante independiente y puede transmitir ese gen y su actividad a su descendencia. Una planta transgénica más preferida es homocigótica para ese gen, y transmite ese gen a toda su progenie en un cruce sexual. La semilla de una planta transgénica puede cultivarse en el campo o en el invernadero, y las plantas transgénicas sexualmente maduras resultantes se auto-polinizan para generar plantas de verdadera reproducción. La descendencia de estas plantas llegan a ser líneas de verdadera reproducción que se evalúan para la expresión aumentada del transgén que codifica la \delta-endotoxina.

Para identificar una planta transgénica que exprese elevados niveles de la \delta-endotoxina de interés, es necesario explorar las plantas regeneradas, transgénicas resistentes a herbicida o antibiótico (generación R_{0}) para la actividad insecticida y/o la expresión del gen de interés. Esto puede realizarse por diversos procedimientos bien conocidos para los especialistas en la técnica, incluyendo, aunque sin limitación: 1) obtener pequeñas muestras tisulares de la planta R_{0} transgénica y ensayar directamente el tejido para la actividad contra insectos susceptibles en paralelo con tejido derivado de una planta de control negativo sin expresión. Por ejemplo, pueden identificarse plantas de maíz transgénicas R_{0} que expresan \delta-endotoxinas de B. thuringiensis tales como Cry3B ensayando tejido foliar o tejido de la raíz derivado de dichas plantas para la actividad contra CRW; 2) análisis de extractos proteicos por inmunoensayos ligados a enzimas (ELISA) específicos para el gen de interés (Cry3B); o 3) amplificación térmica con transcriptasa inversa para identificar acontecimientos que expresen el gen de interés.

Los genes y las \delta-endotoxinas de acuerdo con la presente invención incluyen no solamente las secuencias de longitud completa descritas en este documento sino también fragmentos de estas secuencias, o proteínas de fusión, que retienen la actividad insecticida característica de las secuencias ejemplificadas específicamente en este documento.

Debe ser evidente para los especialistas en la técnica que las \delta-endotoxinas insecticidas pueden identificarse y obtenerse a través de varios medios. Los genes específicos, o partes de los mismos, pueden obtenerse de un cultivo de depósito, o construido sintéticamente, por ejemplo, mediante el uso de una máquina génica. Pueden construirse fácilmente variaciones de estos genes usando técnicas convencionales para crear mutaciones puntuales. Además, pueden crearse fragmentos de estos genes usando exonucleasas o endonucleasas disponibles en el mercado de acuerdo con procedimientos convencionales. Por ejemplo, pueden usarse enzimas tales como Bal31 o mutagénesis dirigida al sitio para eliminar por corte sistemáticamente nucleótidos de los extremos de estos genes. Además, pueden obtenerse genes que codifican fragmentos activos usando una diversidad de enzimas de restricción diferentes. Pueden usarse proteasas para obtener directamente fragmentos activos de estas \delta-endotoxinas.

También pueden aislarse \delta-endotoxinas equivalentes y/o genes que codifican estas \delta-endotoxinas de cepas de Bacillus y/o bibliotecas de ADN usando los contenidos proporcionados en este documento. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos contra las \delta-endotoxinas descritas y reivindicadas en este documento para identificar y aislar otras \delta-endotoxinas de una mezcla de proteínas. Específicamente, pueden crearse anticuerpos contra las partes de las \delta-endotoxinas que son más constantes y más distintas de otras \delta-endotoxinas de B. thuringiensis. Estos anticuerpos entonces pueden usarse para identificar específicamente \delta-endotoxinas equivalentes con la actividad insecticida característica por inmunoprecipitación, inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA), o transferencia de Western.

Un procedimiento adicional para identificar las \delta-endotoxinas y genes de la presente invención es a través del uso de sondas oligonucleotídicas. Estas sondas son secuencias nucleotídicas que tienen un marcador detectable. Como se sabe bien en la técnica, si la sonda molecular y la muestra de ácido nucleico hibridan cuando están juntas en una muestra formando enlaces de hidrógeno entre las dos moléculas, puede suponerse razonablemente que la sonda y la muestra son esencialmente idénticas o sustancialmente similares u homólogas al menos a lo largo de la longitud de la sonda. El marcado detectable de la sonda proporciona un medio para determinar de un modo conocido si ha sucedido la hibridación. Dicho análisis de sondas proporciona un procedimiento rápido para identificar genes de \delta-endotoxina insecticida de la presente invención.

La formación y estabilidad de dúplex depende de la complementariedad sustancial entre las dos cadenas de un híbrido y, como se ha indicado anteriormente, se puede tolerar un cierto grado de desapareamiento. Por lo tanto, las sondas de la presente invención incluyen mutaciones (tanto sencillas como múltiples), deleciones, inserciones de las secuencias descritas, y combinaciones de los mismos, donde dichas mutaciones, inserciones y deleciones permiten la formación de híbridos estables con el polinucleótido diana de interés. Las mutaciones, inserciones, y deleciones pueden producirse en una secuencia polinucleotídica dada de muchos modos, por procedimiento actualmente conocidos para los especialistas en la técnica, y quizá por otros procedimiento que pueden llegar a conocerse en el futuro.

Las variaciones potenciales en las sondas enumeradas se deben, en parte, a la redundancia del código genético. A causa de la redundancia del código genético, puede usarse más de un triplete de nucleótidos codificante (codón) para la mayoría de los aminoácidos usados para crear proteínas. Por lo tanto, diferentes secuencias nucleotídicas pueden codificar un aminoácido particular. Por tanto, las secuencias de aminoácidos de las \delta-endotoxinas y péptidos de B. thuringiensis, y los péptidos de dirección al plástido y los polinucleótidos que los codifican, pueden prepararse por secuencias nucleotídicas equivalentes que codifican la misma secuencia de aminoácidos de la proteína o
péptido.

La mutagénesis específica de sitio es una técnica útil en la preparación de péptidos individuales, o proteínas o péptidos equivalentes biológicamente funcionales, a través de mutagénesis específica del ADN subyacente. La técnica proporciona adicionalmente una fácil capacidad para preparar y ensayar variantes de secuencia, por ejemplo, incorporando una o más de las consideraciones anteriores, introduciendo uno o más cambios de secuencia nucleotídica en el ADN.

En general, la técnica de mutagénesis específica de sitio es bien conocida en la técnica, como se ejemplifica por diversas publicaciones. Como se apreciará, la técnica típicamente emplea un vector fágico que existe en forma tanto monocatenaria como bicatenaria. Los vectores típicos útiles en mutagénesis dirigida al sitio incluyen vectores tales como el fago M13 o plásmidos que contienen un origen de replicación de M13. Estos fagos están fácilmente disponibles en el mercado y su uso es generalmente bien conocido para los especialistas en la técnica.

Pueden hacerse modificaciones y cambios en la estructura de los péptidos de la presente invención y los segmentos de ADN que los codifican y aún obtener una molécula funcional que codifica una proteína o péptido con características deseables. Los péptidos, polipéptidos, y proteínas equivalentes biológicamente funcionales contemplados en este documento deben tener aproximadamente el 80% o más de similitud de secuencia, preferiblemente aproximadamente el 85% o más de similitud de secuencia, y mucho más preferiblemente aproximadamente el 90% o más de similitud de secuencia, con la secuencia de, o el resto correspondiente dentro de, la secuencia de aminoácidos fundamental de Cry3B.

A continuación se proporciona un análisis basado en el cambio de los aminoácidos de una proteína para crear un equivalente, o incluso una molécula de segunda generación mejorada. En realizaciones particulares de la invención, se contemplan proteínas cristalinas mutadas que son útiles para aumentar la actividad insecticida de la proteína, y por consiguiente para aumentar la actividad insecticida y/o la expresión del transgén recombinante en una célula vegetal. Los cambios de aminoácidos pueden conseguirse cambiando los codones de la secuencia de ADN, de acuerdo con los codones dados en las tablas de codones de aminoácidos fácilmente disponibles.

Por ejemplo, pueden sustituirse ciertos aminoácidos por otros aminoácidos en una estructura proteica sin pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión a antígeno de anticuerpos o sitios de unión sobre sustratos moleculares. Como es la capacidad y naturaleza interactiva de una proteína lo que define la actividad funcional biológica de esa proteína, pueden hacerse ciertas sustituciones de aminoácidos en una secuencia proteica y, por supuesto, su secuencia codificante de ADN subyacente, y no obstante obtener una proteína con propiedades similares. Por tanto los inventores contemplan que pueden hacerse diversos cambios en las secuencias peptídicas de las composiciones descritas, o las secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos péptidos sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica.

Al hacer dichos cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína está comprendida generalmente en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982, incorporado en este documento por referencia). Está aceptado que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuya a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares.

Se sabe en la técnica que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice o valor hidropático similar y aún producir una proteína con actividad biológica similar, es decir, aún obtener una proteína biológica funcionalmente equivalente. También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede hacerse efectivamente en base a la hidrofilicidad. La patente de Estados Unidos 4.554.101 indica que la hidrofilicidad promedio local mayor de una proteína, controlada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Se entiende que un aminoácido puede sustituirse por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar y aún obtener una proteína biológicamente equivalente, y en particular, inmunológicamente equivalente.

Como se ha resumido anteriormente, las sustituciones de aminoácidos, por lo tanto, generalmente se basan en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral del aminoácido, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño, y similares. Las sustituciones ejemplares que toman diversas de las características anteriores en consideración son bien conocidas para los especialistas en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Los especialistas en la técnica saben que los polinucleótidos que codifican \delta-endotoxinas derivadas de B. thuringiensis se expresan mal cuando se incorporan en el ADN nuclear de plantas transgénicas (revisado por Diehn y col., 1996). La secuencia nucleotídica que codifica la \delta-endotoxina de interés se diseña esencialmente como se describe en las patentes de Estados Unidos 5.500.365 y 5.689.052 y es útil para la expresión de 11231mv2 (SEC ID Nº 11).

Los péptidos, polipéptidos, y proteínas biológica y funcionalmente equivalentes a Cry3B incluyen secuencias de aminoácidos que contienen cambios de aminoácidos conservativos en la secuencia fundamental mostrada en la SEC ID Nº 12 (11231mv2).

En dichas secuencias de aminoácidos, uno o más aminoácidos de la secuencia fundamental se sustituyen con otro aminoácido, cuya carga y polaridad son similares a las del aminoácido nativo, es decir, una sustitución conservativa de aminoácidos, que provoca un cambio silencioso.

Los sustitutos para un aminoácido dentro de la secuencia polipeptídica fundamental pueden seleccionarse entre otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido de origen natural. Los aminoácidos pueden dividirse en los siguientes cuatro grupos: (1) aminoácidos ácidos; (2) aminoácidos básicos; (3) aminoácidos polares neutros; y (4) aminoácidos no polares neutros. Los aminoácidos representativos dentro de estos diversos grupos incluyen, aunque sin limitación: (1) aminoácidos ácidos (cargados negativamente) tales como ácido aspártico y ácido glutámico; (2) aminoácidos básicos (cargados positivamente) tales como arginina, histidina, y lisina; (3) aminoácidos polares neutros tales como glicina, serina, treonina, cisteína, cistina, tirosina, asparagina, y glutamina; (4) aminoácidos no polares neutros (hidrófobos) tales como alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, y metionina.

Los cambios conservativos de aminoácidos dentro de la secuencia polipeptídica fundamental pueden hacerse sustituyendo un aminoácido dentro de uno de estos grupos con otros aminoácido dentro del mismo grupo. Los equivalentes biológicamente funcionales de Cry3B pueden tener 10 o menos cambios conservativos de aminoácidos, más preferiblemente siete o menos cambios conservativos de aminoácidos, y mucho más preferiblemente cinco o menos cambios conservativos de aminoácidos. La secuencia nucleotídica codificante (gen, ADN plasmídico, ADNc, ADN de origen no natural o sintético) por tanto tendrá las sustituciones de bases correspondientes, lo que le permite codificar formas equivalentes biológicamente funcionales de Cry3B.

La presente invención proporciona procedimientos y composiciones para expresar \delta-endotoxinas Cry3B de B. thuringiensis inhibidoras de coleópteros o variantes de secuencia de aminoácidos de las mismas a niveles inesperadamente elevados en plantas transgénicas. Los procedimientos y composiciones descritos pueden explotar cualquiera de las construcciones de ADN descritas así como cualquiera de los vectores de transformación descritos en este documento. Los procedimientos y composiciones contemplados posibilitan que las \delta-endotoxinas Cry3Bb o variantes de secuencia de aminoácidos de las mismas se expresen en plantas sin afectar de forma negativa a la recuperación de las cualidades agrícolas de las plantas transgénicas. La invención descrita en este documento también posibilita la expresión de \delta-endotoxinas Cry3B y variantes a niveles hasta 500 veces mayores que los conseguidos por procedimientos y composiciones previos.

Los procedimientos descritos en este documento por tanto posibilitan que se usen plantas que expresan Cry3B o variantes como alternativa o suplemento para plantas que expresan otras proteínas Cry tales como Cry3B variante, Cry3A o Cry3D o variante, CryET33 y CryET34 o variantes de las mismas, CryET70 o variante, CryET29 o variante, Cry6A o Cry6B o variante, Cry8B o variante, hidrolasas insecticidas de acil-lípidos, combinaciones de oxidasas de aminoácidos y tedanalactama sintasas, y otras proteínas insecticidas tales como VIP1 y VIP3 y diversas combinaciones aisladas de las especies Heterorhabdus, Photorhabdus, y Xenorhabdus tanto para el control como el tratamiento de la resistencia de plagas clave de insectos, incluyendo Ostrina sp, Diatraea sp., Diabrotica, Helicoverpa sp, Spodoptera sp en Zea mays; Heliothis virescens, Helicoverpa sp, Pectinophora sp. en Gossypium hirsutum; y Anticarsia sp, Pseudoplusia sp, Epinotia sp en Glycine max. También se contempla que los procedimientos descritos pueden usarse para aumentar drásticamente la expresión de \delta-endotoxinas de B. thuringiensis incluyendo y relacionadas con Cry3, aumentando de este modo su eficacia contra plagas diana y disminuyendo la probabilidad de resistencia desarrollada a estas proteínas. En una realización de la presente invención, se expresa una \delta-endotoxina Cry3. Las plagas diana de esta proteína y sus huéspedes comunes se muestran a continuación en la Tabla 1.

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TABLA 1 Plagas Diana Afectadas por \delta-Endotoxina Cry3B Activa (Inhibidora) para Coleópteros y Huéspedes Vegetales Comunes de Esas Plagas

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Se necesitaron anticuerpos para estudios de comparación de la expresión de diversas secuencias codificantes de Cry3, de modo que se generó suero policlonal del siguiente modo. Se recogieron cristales Bt Cry3 de una fermentación esporulada de la cepa recombinante 11037 de Bacillus thuringiensis que expresa Cry3Bb nativa. Los cristales se solubilizaron en tampón carbonato sódico 100 mM, pH 10,5, para dar una concentración de 2,7 mg de proteína por ml medida por un ensato colorimétrico con ácido bicinconínico (Smith y col., 1985). Se diluyó una muestra hasta una concentración de 0,4 mg/ml y se mezcló con un volumen igual de adyuvante completo de Freund. Se usó una alícuota de 1 ml de esta mezcla para la primera inyección intradérmica en un conejo. Se recogió una primera muestra de sangre dos semanas después. Se prepararon posteriores inyecciones de proteína Cry3Bb diseñadas para reforzar el título inmune mezclando volúmenes iguales de 0,2 mg/ml de proteína con volúmenes iguales de adyuvante incompleto de Freund. Se administraron inyecciones de 1 ml a intervalos de cuatro semanas, y se obtuvieron muestras de sangre adicionales cada dos semanas. Se preparó suero inmune adecuado para propósitos analíticos del conejo nº 783 después de la purificación en una cromatografía de afinidad de Proteína A Sepharose CL-4B de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Sigma Chemical Co, St. Louis, Missouri) y se concentró a 1 mg de proteína IgG por ml y se almacenó en la oscuridad a 4ºC. Se conjugó una muestra de este antisuero con la enzima fosfatasa alcalina para su posterior uso en ensayos ELISA cuantitativos.

Se recogieron muestras de hoja y raíz de plantas que expresaban las proteínas variantes de Cry3Bb 11231, 11084, 11098, y 11247. Se prepararon extractos de muestras vegetales del siguiente modo. Se recogió y pesó tejido vegetal, partes de la raíz o la hoja, a una escala en gramos. El tejido foliar se mezcló con 20 partes de tampón TBA, peso a volumen. El tejido de la raíz se mezcló con 10 partes de tampón TBA, peso a volumen. Los tejidos se molieron en una emulsión usando un molino elevado Wheaton^{TM} y se almacenaron en hielo o a -20ºC. Se distribuyeron 250 microlitros de antisuero de conejo anti-Cry3Bb diluido 1:1000 en tampón de revestimiento carbonato, pH 9,6, sobre cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos y se incubaron durante una noche a 4ºC. La placa después se lavó con PBST (3 x 5 min). Las muestras de extracto tisular se cargaron por duplicado a 20 \mul por pocillo y a diluciones variadas en orden para obtener un valor dentro de una curva patrón establecida usando Cry3Bb variante 11231. Las placas se incubaron durante una noche a 4ºC, después se lavaron con PBST tres veces, cinco minutos cada vez. Se añadieron 50 \mul del anticuerpo policlonal de conejo anti-Cry3B conjugado con fosfatasa alcalina a cada pocillo, seguido de la adición de 180 \mul de PBST que contenía PVP-40 (Sigma) al 1%. Después de incubación durante una noche, las placas se lavaron con PBST (3 x 5 min) y se revelaron con solución de revelado de color con fosfatasa alcalina que constaba de 20 mg de fosfato de para-nitrofenilo en 25 ml de dietanolamina, pH 9,8, 200 \mul/pocillo). Las placas se leyeron a \lambda405 después de 15-20 min., usando una curva cuadrática ajustada a una curva patrón de proteína donde la densidad óptica del patrón más elevado era aproximadamente 1,00.

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5.0 Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las realizaciones preferidas de la invención. Los especialistas en la técnica deben apreciar que las técnicas descritas en los siguientes ejemplos representan técnicas descubiertas por el inventor para que funcionen bien en la práctica de la invención, y por tanto puede considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica. Los ejemplos que ya no están dentro del alcance de las reivindicaciones se mantuvieron para propósitos ilustrativos.

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5.1 Ejemplo 1 Aislamiento, Caracterización, e Identificación de proteínas y genes Cry3, y Construcción de Variantes de Secuencia de Aminoácidos de los Mismos

Los medios para identificar y caracterizar productos génicos tóxicos para coleópteros están bien documentados en la técnica, y también son conocidos en la técnica los procedimientos para aislar, caracterizar e identificar los genes que codifican dichos productos. Además, también se conocen bien los medios para producir variantes de secuencia de aminoácidos de dichas proteínas \delta-endotoxina tóxicas para coleópteros. En particular, Van Rie y col. (patente de Estados Unidos Nº 5.659.123; 1997) identifican toxinas Cry3A y D que muestran propiedades inhibidoras de coleópteros, y también exponen un procedimiento para identificar mutantes que pueden construirse que tienen actividad insecticida reducida con referencia a la proteína de tipo silvestre. Van Rie y col. describen cómo pueden manipularse adicionalmente esos mutantes particulares para identificar toxinas variantes de secuencia de aminoácidos que muestran actividad insecticida aumentada con referencia a la proteína de tipo silvestre. English y col. (documento WO 99/31248) describen otros procedimientos y composiciones, en particular para Cry3B, que posibilitan la identificación de genes codificantes y productos génicos de Cry3 y los procedimientos que pueden usarse para construir e identificar variantes de secuencia de aminoácidos que muestren actividad insecticida mejorada con referencia a la proteína Cry3 de tipo silvestre. Se obtuvieron varias secuencias codificantes usadas en este documento a partir de las descritas en English y col. y las proteínas producidas a partir de estas secuencias codificantes representan en particular las variantes 11231 ó 11098 que se describen en el mismo.

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5.2 Ejemplo 2 Construcción de vectores de expresión en plantas monocotiledóneas para las variantes de Cry3Bb Diseño de genes variantes de cry3Bb para la expresión en plantas

Para la expresión eficaz de las variantes de Cry3Bb en plantas transgénicas, el gen que codifica las variantes debe tener una composición de secuencia adecuada (Diehn y col., 1996). Un ejemplo de dicha secuencia se muestra para el gen v11231 (SEC ID Nº 7) que codifica la variante 11231 de la proteína Cry3Bb (SEC ID Nº 8) que muestra actividad contra Diabroticus. Este gen se obtuvo mediante mutagénesis (Kunkel, 1985) de un gen sintético de Cry3Bb (SEC ID Nº 5) que codificaba una proteína esencialmente homóloga a la proteína codificada por el gen nativo de Cry3Bb (Número de Acceso a Gen Bank m89794; SEC ID Nº 1). Se usaron los siguientes oligonucleótidos en la mutagénesis del gen sintético original de Cry3Bb (SEC ID Nº 5) para crear el gen v11231 (SEC ID Nº 7)

Oligo nº 1:	TAGGCCTCCATCCATGGCAAACCCTAACAATC	(SEC ID Nº 40)

Oligo nº 2:	TCCCATCTTCCTACTTACGACCCTGCAGAAATACGGTCCAAC	(SEC ID Nº 41)

Oligo nº 3:	GACCTCACCTACCAAACATTCGATCTTG	(SEC ID Nº 42)

Oligo nº 4:	CGAGTTCTACCGTAGGCAGCTCAAG	(SEC ID Nº 43)

Construcción del vector de expresión en plantas monocotiledóneas de cry3Bb

Para situar el gen v11231 de la variante de Cry3Bb en un vector adecuado para la expresión en plantas monocotiledóneas (es decir, bajo el control del promotor 35S potenciado el engarce del virus del mosaico de la coliflor al intrón hsp70 seguido de un sitio de poliadenilación de la nopalina sintasa como en Brown y Santino patente de Estados Unidos número 5.424.412; 1995), se digirió el vector pMON19469 con NcoI y EcoRI. Se aisló la banda más grande del vector de aproximadamente 4,6 kb después de electroforesis de los productos de digestión a través de un gel de agarosa, se purificó, y se ligó con la ADN ligasa T4 al fragmento NcoI-EcoRI de aproximadamente 2 kb que contenía el gen v11231 (SEC ID Nº 7). La mezcla de ligamiento se introdujo por transformación en una cepa de laboratorio útil de E. coli, y se recuperaron las colonias resistentes a carbenicilina. Se recuperó el ADN plasmídico por procedimientos miniprep de ADN a partir de cultivos posteriores durante una noche de colonias resistentes a carbenicilina seleccionadas en caldo que contenía antibióticos. Este ADN se sometió a análisis con endonucleasas de restricción con enzimas tales como NcoI y EcoRI, NotI, y PstI para identificar clones que contenían la secuencia codificante v11231 fusionada al intrón hsp70 bajo el control del promotor potenciado CaMV35S. Los clones identificados como tales se denominaron como pMON33708.

Para situar el gen v11231 en un vector adecuado para su recuperación de plantas transformadas de forma estable y resistentes a insectos, se aisló y se purificó el fragmento de restricción NotI de 3,75 kb de pMON33708 que contenía la secuencia codificante de la lisina oxidasa fusionada con el intrón hsp70 bajo el control del promotor potenciado CaMV35S después de la extracción desde un gel de agarosa. Este fragmento se ligó con pMON30460 tratado con NotI y fosfatasa alcalina intestinal de ternera. pMON30460 contiene la secuencia codificante de la neomicina fosfotransferasa bajo el control del promotor CaMV35S. Se obtuvieron colonias resistentes a kanamicina por introducción por transformación de esta mezcla de ligamiento en E. coli y se identificaron las colonias que contenían la banda apropiada por digestión con endonucleasas de restricción y se denominaron como pMON33710. Se usaron enzimas de restricción tales como NotI, EcoRV, HindIII, NcoI, EcoRI, y BglII para identificar los clones apropiados que contenían el fragmento NotI de pMON33708 en el sitio NotI de pMON30460 (es decir pMON33710) en la orientación tal que ambos genes estuvieran en tándem (es decir, el extremo 3' del casete de expresión de v11231 está unido al extremo 5' del casete de expresión de nptII). La expresión de la proteína v11231 por pMON33710 en protoplastos de maíz se confirmó por electroporación del ADN plasmídico circular covalentemente cerrado de pMON33710 en protoplastos seguido de transferencia de proteínas y análisis ELISA. Este vector puede introducirse en el ADN genómico de embriones de maíz por bombardeo con pistola de partículas seguido de selección con paromomicina para obtener plantas de maíz que expresan el gen v11231 esencialmente como se describe en Brown y Santino patente de Estados Unidos número 5.424.412. En este ejemplo, el vector se introdujo en tejido escutelar de embriones inmaduros (IES del inglés immature embryo scutella) de maíz mediante cobombardeo junto con un plásmido que confiere resistencia a higromicina, seguido de selección con higromicina, y regeneración. Las líneas de maíz transgénico que expresaban la proteína v11231 se identificaron por análisis ELISA que valoraba tanto la presencia como la cantidad de proteína v11231 presente en cada muestra de extracto. Las plantas se cruzaron por endogamia y se dejaron continuar hasta echar semilla. Las semillas descendentes se curaron y se plantaron para producir plántulas de maíz que posteriormente se ensayaron para la protección contra la alimentación por Diabroticus.

Funcionamiento en plantas de Cry3Bb variante 11231

Las plantas de maíz transformadas que expresaban la proteína Cry3Bb variante 11231 se expusieron a larvas del gusano occidental de la raíz del maíz (CRW) en un ensayo tanto en plántulas como en macetero de 25,9 cm (10 pulgadas). El genotipo transformado era A634, donde se evaluó la descendencia del cruce R_{0} por A634. Las observaciones incluían el efecto sobre el desarrollo de las larvas (peso), índice de daño en la raíz (RDR), y la expresión de proteínas. El vector de transformación que contenía el gen de la variante de Cry3Bb era pMON33710. Los tratamientos incluyeron las iso-poblaciones positivas y negativas para cada acontecimiento y una comprobación de A634.

El ensayo en plántulas constaba de las siguientes etapas; i. se colocaron semillas individuales en tarros de 29,6 ml (1 onza) que contenían tierra de macetero; ii. al anclarse, cada plántula se infestó con 4 larvas neonatas, y iii. después de la infestación, las plántulas se incubaron durante 7 días a 25ºC, HR al 50%, y fotoperiodo de 14:10 (L:O). Se añadió humedad adecuada a la tierra de macetero durante el periodo de incubación para mantener el vigor de la plántula.

El ensayo en macetero de 25,4 cm (10 pulgadas) constaba de las siguientes etapas; i. se colocaron semillas individuales en maceteros de 25,4 cm (10 pulgadas) que contenían tierra de macetero; ii. a los 14 días después de plantarlas, cada macetero se infestó con 800 huevos que se habían pre-incubado de modo que la eclosión sucediera 5-7 días después de la infestación; y iii. después de la infestación, las plantas se incubaron durante 4 semanas en las mismas condiciones medioambientales que el ensayo en plántulas. Los maceteros se regaron tanto por abajo como por arriba diariamente.

Para el ensayo en plántulas, en el día 7 se dio a las plantas un índice de daño en la raíz (Tabla 1) y se pesaron las larvas supervivientes. También en ese momento, se determinaron las concentraciones de proteína Cry3Bb en las raíces por ELISA.

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TABLA 1 Escala de Índice de Daño en la Raíz para el ensayo en plántulas

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Los resultados del ensayo en plántulas se muestran en la Tabla 2. Las plantas que expresaban la proteína Cry3Bb estaban completamente protegidas de la alimentación por CRW, donde las larvas supervivientes en este tratamiento no habían crecido. Los pesos medios de las larvas variaban de 2,03 - 2,73 mg para los tratamientos sin expresión, donde el peso promedio de las larvas supervivientes era de 0,11 mg en el tratamiento de expresión de Cry3Bb. Los índices de daño en la raíz eran 3,86 y 0,33 para las iso-poblaciones sin expresión y con expresión, respectivamente. La supervivencia de las larvas variaba del 75 - 85% para los tratamientos negativo y de control, donde solamente el 25% de las larvas sobrevivían en el tratamiento con Cry3Bb.

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TABLA 2 Efecto de plantas que expresan Cry3Bb sobre larvas CRW en un ensayo en plántulas

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Para el ensayo en macetero de 25,4 cm (10 pulgadas), a las 4 semanas después de la ingestación se registró la altura de la planta y se dio un índice de daño en la raíz (Iowa 1-6 scale; Hills, T.M. y D.C. Peters. 1971; A method of evaluating post planting insecticide treatments for control of western corn rootworm larvae. Journal of Economic Entomology 64: 764-765.).

Los resultados del ensayo en macetero de 25,4 cm (10 pulgadas) se muestran en la Tabla 3. Las plantas que expresaban la proteína Cry3Bb tuvieron significativamente menos daño por alimentación y eran más altas que las plantas sin expresión. El acontecimiento 16, el más alto de los dos acontecimientos de expresión proporcionó un control casi completo. Los tratamientos negativos tuvieron unos índices de daño en la raíz muy elevados lo que indica presión muy elevada por los insectos. Los índices medios de daño en la raíz positivos fueron 3,4 y 2,2 para el acontecimiento 6 y 16, respectivamente. El RDR medio para el tratamiento negativo fue 5,0 y 5,6.

TABLA 3 Efecto de Cry3Bb expresada en maíz para controlar la alimentación por larvas CRW en un ensayo en macetero de 24,5 cm (10 pulgadas)

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En resumen, las plantas de maíz que expresan la proteína Cry3Bb tienen un efecto biológico significativo sobre el desarrollo de larvas CRW como se observa en el ensayo en plántulas. Cuando se expusieron a niveles de infestación muy elevados, las plantas que expresaban la proteína Cry3Bb estuvieron protegidas del daño por alimentación de las larvas CRW como se ilustra en el ensayo en macetero de 24,5 cm (10 pulgadas).

5.3 Ejemplo 3 Expresión Aumentada de una proteína Cry3Bb en maíz transgénico

Se comparó la expresión de una proteína Cry3Bb en plantas de maíz transformadas con vectores de expresión convencionales o preferidos para Cry3Bb. Las plantas transformadas con los vectores mejorados demostraron coherentemente niveles significativamente mayores de expresión de Cry3Bb cuando se compararon con plantas transformadas con los vectores convencionales de Cry3Bb. Un vector de expresión convencional de Cry3Bb para plantas pMON33710 contiene un casete de expresión compuesto por una secuencia promotora potenciada CaMV35S (P-CaMV.35S, SEC ID Nº 29), una secuencia intrónica Hsp70 de Zea mays (I-Zm.Hsp70, SEC ID Nº 33), una secuencia de origen no natural que codifica la proteína Cry3Bb variante v11231 (Bt.cry3Bb.v11231, SEC ID Nº 7), y una secuencia de terminación de la transcripción y de poliadenilación de la nopalina sintasa (T-AGRtu.nos, SEC ID Nº 34). Otro vector de expresión convencional de Cry3Bb para plantas pMON33709 contiene un casete de expresión compuesto por una secuencia promotora potenciada CaMV35S (P-CaMV.35S, SEC ID Nº 29), una secuencia intrónica Hsp70 de Zea mays (I-Zm.Hsp70, SEC ID Nº 33), una secuencia codificante de CTP de Zea mays (TS-Zm.rbc1, SEC ID Nº 25), una secuencia de origen no natural que codifica la proteína Cry3Bb variante v11231 (Bt.cry3Bb.v1 1231, SEC ID Nº 7), y una secuencia de terminación de la transcripción y de poliadenilación de la nopalina sintasa (T-AGRtu.nos, SEC ID Nº 34). El vector de expresión pMON25097 para plantas está mejorado en comparación con pMON33710 evaluado por los niveles de expresión de Cry3Bb in planta, y contiene un casete de expresión que comprende una secuencia promotora de origen no natural CaMV35S AS4 (P-CaMV.AS4, SEC ID Nº 30), una secuencia líder no traducida de la proteína de unión a clorofila A/B del trigo (L-Ta.hcb1, SEC ID Nº 31), una secuencia intrónica de actina del arroz (I-Os.Act1, SEC ID Nº 32), y una secuencia de origen no natural que codifica la proteína Cry3Bb variante 11231mv1 (11098) (Bt.cry3Bb. 11231mv1, SEC ID Nº 9) unida a una secuencia de terminación de la transcripción y de poliadenilación de Hsp17 de choque térmico del trigo (T-Ta.Hsp17, SEC ID Nº 35). Otro vector preferido es pMON25096, que contiene un casete de expresión (SEC ID Nº 17) que comprende una secuencia promotora de origen no natural CaMV35S AS4 (P-CaMV.AS4, SEC ID Nº 30), una secuencia líder no traducida de la proteína de unión a clorofila A/B del trigo (L-Ta.heb1, SEC ID Nº 31), una secuencia intrónica de actina del arroz (I-Os.Act1, SEC ID Nº 32), una secuencia codificante de CTP de Zea mays (TS-Zm.rbc1, SEC ID Nº 25), y una secuencia de origen no natural que codifica la proteína Cry3Bb variante 11231mv1 (Bt.cry3Bb.11231mv1, SEC ID Nº 9) unida a una secuencia de terminación de la transcripción y de poliadenilación de Hsp 17 de choque térmico del trigo (T-Ta.Hsp17, SEC ID Nº 35). Todos los vectores contienen un casete idéntico unido al casete de expresión de Cry3Bb que confiere resistencia a paromomicina al tejido vegetal transformado. Este casete de resistencia consta de una secuencia promotora potenciada CaMV35S, y una secuencia codificante de la neomicina fosfotransferasa unida a una secuencia de terminación de la transcripción y de poliadenilación de la nopalina sintasa. Se presenta un resumen de los vectores convencionales y mejorados en la Tabla 4. Las plantas de maíz transgénicas resistentes a paromomicina se obtuvieron esencialmente como se ha descrito en la patente de Estados Unidos 5.424.412 (1995).

TABLA 4 Resumen de Vectores de Expresión de Plantas

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TABLA 4 (continuación)

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Se sometieron a electroporación protoplastos foliares de maíz con vectores convencionales (pMON33709 o
pMON33710) o vectores mejorados (pMON33722, pMON33723, pMON25096, pMON25097, pMON33741) como se ha descrito (Sheen, Plant Cell 2: 1027-1038, 1990) y se comparó la expresión transitoria de proteínas Cry3Bb variantes por procedimientos de análisis ELISA y de transferencia de Western. El ELISA usó un anticuerpo de captura IgG de conejo anti-Cry3B purificado por cromatografía creado contra Cry3B 11231, una muestra de ese anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina como anticuerpo de detección secundario, y una proteína nativa Cry3Bb purificada como patrón. La comparación de la proporción de los niveles de expresión de Cry3Bb a neomicina fosfotransferasa (Npt II) por ELISA indicó que se obtuvieron aumentos de aproximadamente dos veces en los niveles de expresión normalizados de la proteína Cry3Bb variante 11231 con los vectores mejorados pMON33723 y pMON33722 con relación a los vectores convencionales pMON33710 y pMON33709, respectivamente. (Expt. 1, Tabla 5). Las diferencias en la expresión de Cry3Bb se atribuyen directamente al casete de expresión mejorado de los vectores mejorados en lugar de a diferencias en la eficacia de electroporación del protoplasto ya que la expresión de la proteína Cry3Bb está normalizada a la de Npt II producida por el gen nptII unido idéntico presente en todos los vectores. Los vectores mejorados más preferidos tales como pMON25096, pMON25097, y pMON33741 expresaban niveles normalizados aproximadamente 10 veces mayores de Cry3Bb y proteína Cry3Bb variante que los vectores mejorados preferidos tales como pMON33722 o pMON33723 (Tabla 5, Expt. 2, 3). Finalmente, los vectores igual de preferidos pMON33741 y pMON25097 producían expresión normalizada casi equivalente de Cry3Bb (Tabla 5, Expt. 4)

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TABLA 5

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Como el casete de expresión mejorado de pMON25097 codifica la toxina variante de Cry3Bb 11231mv1 (11098), y el casete convencional de pMON33710 codifica la variante de Cry3Bb v11231 que difiere en un único aminoácido, se comparó la inmunorreactividad intrínseca de las dos proteínas en el ensayo ELISA. Experimentos ELISA posteriores con las proteínas variantes de Cry3Bb v11231 y 11231 mv1 (11098) producidas en y purificadas de B. thuringiensis indican que las dos proteínas tienen niveles similares de inmunorreactividad. Por consiguiente, el aumento observado en los niveles de la proteína Cry3Bb 11231 mv 1 (11098) producida a partir del casete de expresión de pMON25097 se debe a niveles de expresión aumentados en lugar de a una diferencia en la inmunorreactividad. Los análisis de transferencia de proteínas confirman que el nivel aumentado de material de reactividad cruzada producido en protoplastos de maíz a partir del casete de expresión de Cry3Bb mejorado de pMON25097 se debía a la acumulación aumentada de una proteína de aproximadamente 60.000 Mr inmunorreactiva con antisuero Cry3B que también co-migra con la proteína Cry3Bb variante 11231 producida en una cepa de B. thuringiensis recombinante cry- de pEG7174. Los casetes de expresión igual de preferidos y mejorados de la proteína Cry3Bb variante de pMON33741 y pMON33748 que codifican Cry3Bb.11231 también muestran niveles de expresión aumentados de Cry3Bb con relación a la expresión observada del casete convencional de pMON33710. Estos resultados confirman que las diferencias de expresión se deben a las composiciones mejoradas descritas en este documento en lugar de a diferencias en la inmunorreactividad intrínseca de las diferentes variantes.

El tejido de la raíz de plantas transgénicas en la fase R_{0} obtenidas independientemente después de la transformación con un vector mejorado (pMON33723, 25097) o con un vector convencional (pMON33710) se sometió a análisis cuantitativo de los niveles de proteína Cry3Bb por un ensayo ELISA cuantitativo. La comparación de los niveles de expresión de Cry3Bb o la proteína Cry3Bb variante en plantas de maíz transformadas con un vectores mejorado y convencional muestra que la expresión de la variante Cry3Bb.11231 no excede de 50 ppm en los transgénicos pMON33710 convencionales mientras que la expresión de Cry3Bb.11098 (11231mv1) en los transgénicos pMON25097 mejorados es frecuentemente mayor de 50 ppm (Tabla 6). Los análisis de transferencia de proteínas confirman que el nivel aumentado de material con reactividad cruzada producido por pMON25097 (mejorado) se debía a la acumulación aumentada de una proteína de aproximadamente 60.000 Mr que migra con Cry3Bb1 convencional de B. thuringiensis. Otros casetes de expresión mejorados de la proteína Cry3Bb variante hallados en pMON33741 y 33748 también producen de forma coherente acontecimientos transformados independientemente (ITE de inglés independently transformed events) exclusivos con niveles de proteína Cry3Bb variante mayores de 100 PPM mientras que los vectores convencionales nunca han dado lugar a ITE con más de 50 PPM de la proteína Cry3Bb variante (Tabla 7). Es evidente la expresión de elevado nivel en los genotipos de maíz tanto H99 como A634, lo que indica que las composiciones descritas en este documento tienen amplia utilidad para muchas variedades de maíz cultivado de forma comercial. Se espera que dichas líneas de elevada expresión de proteína Cry3 variante exclusivas obtenidas con los vectores descritos en este documento sean especialmente ventajosas para conferir elevados niveles de protección contra el daño por la alimentación de insectos y para reducir la incidencia de resistencia de los insectos a proteínas insecticidas Cry3.

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TABLA 6 Comparación de la Expresión de Cry3Bb en Maíz R_{0} Transformado con Casetes de Expresión Convencionales y Mejorados de la Proteína Cry3Bb Variante

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TABLA 7 Expresión de Cry3Bb en Maíz R_{0} Transformado con Casetes de Expresión Mejorados de Proteína Cry3Bb Variante

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La descendencia obtenida de plantas de maíz transformadas con los casetes tanto convencionales (pMON33709 y pMON33710) como preferidos (pMON25096, 25097, 33722, 33723, 33726, 33741, y 33748) que expresan 10 ppm o más de la proteína Cry3 Bb se ensayó adicionalmente para la resistencia al daño por la alimentación del gusano de la raíz del maíz (CRW) en bioensayos basados en invernadero o cámaras de cultivo como se ha descrito previamente (English y col., documento WO 99/31248). Se obtuvieron plantas de maíz transgénicas resistentes al gusano de la raíz del maíz a partir de casi todos los vectores preferidos (Tabla 8). Por ejemplo, el vector mejorado pMON25096 se usó para generar 89 acontecimientos transformados independientemente (ITE), 14 líneas descendientes pMON25096 F_{1} independientes que expresaban 10 ppm o más de Cry3Bb y 7 líneas descendientes F_{1} que presentaban niveles significativos de resistencia a CRW (un valor RDR \leq3,5 en una escala de valoración de 0-6). En contraste, no se obtuvo ni un único acontecimiento con un valor de RDR \leq3,5 entre las 12 líneas descendientes F_{1} con el casete convencional pMON33710 que expresaban 10 PPM o más de la proteína Cry3Bb variante. El fallo en obtener líneas resistentes a CRW con cualquier de los vectores convencionales (pMON33709 o pMON33710) no se debió a insuficientes cantidades de ITE ya que se generaron más de 300 ITE de cada uno de estos vectores y se exploraron para la descendencia F_{1} resistente a CRW. Se genero mucha menos cantidad de ITE con vectores preferidos tales como pMON33722, pMON33723, y pMON25096, pero finalmente todos dieron lugar a líneas descendientes F_{1} resistentes a CRW.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 8

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En ejemplos proporcionados en este documento, los experimentos evidencian que composiciones sustancialmente equivalentes basadas en las mejoras descritas en este documento producen mejoras equivalentes en el rendimiento con relación a los estándares descritos previamente. Más específicamente, se demuestra que composiciones mejoradas que codifican las variantes tanto Cry3Bb. 11098 como Cry3Bb. 11231 ambas producen un rendimiento equivalentemente mejorado con relación a las composiciones convencionales descritas previamente que codifican Cry3Bb.1 1231. Por tanto se entiende que el uso de otras variantes de Cry3B con actividades biológicas específicas que sean mayores o iguales que Cry3Bb.11098 o Cry3Bb.11231 se contempla por y dentro del alcance de esta invención. Por ejemplo, composiciones de vector mejoradas que codifican variantes de Cry3Bb incluyendo 11231, 11084, 11098, 11247, y otras expuestas en English y col., solicitudes de Estados Unidos Nº de serie 08/993.170, 08/993.722, 08/993.755, y U8/996.441, todas presentadas el 18 de diciembre de 1997 pueden obtenerse a partir de pMON25095 usando procedimientos de mutagénesis convencionales de un modo casi equivalente a la construcción de pMON33740.

5.4 Ejemplo 4 Casetes de Expresión Preferidos Confieren Resistencia al daño por CRW en Ensayos de Campo

Se evaluaron plantas de maíz genéticamente modificadas para expresar proteínas Cry3Bb variantes derivadas de los vectores preferidos pMON33722, pMON33723, pMON25096, y pMON25097 en el campo para el control del gusano occidental de la raíz el maíz, Diabrotica vergifera vergifera LeConte (CRW). Ninguna de las plantas de maíz transformadas con los vectores convencionales se hizo avanzar hasta el ensayo de campo ya que ninguna presento control adecuado del gusano de la raíz del maíz en ensayos de invernadero (Ejemplo 3, Tabla 8). Los ensayos de eficacia se mantuvieron en una granja de investigación de Monsanto en Jerseyville, Illinois y en el Northern Grain Insects Research Laboratory, estación de investigación USDA ARS en Brookings, South Dakota. Estos ensayos sirven para evaluar el rendimiento de los casetes preferidos en el campo bajo presión masiva de los insectos y para comparar su rendimiento con los insecticidas actualmente disponibles en el mercado.

Se seleccionaron diecisiete acontecimientos de transformación independiente (ITE) para la evaluación en campo en base al rendimiento en invernadero. La cantidad de semillas disponibles para la evaluación en campo varió para cada ITE. De estos 17 acontecimientos, solamente siete se plantaron en la estación de investigación de Brookings. El diseño de campo para el emplazamiento de Brookings fue un bloque completo aleatorizado (RCB del inglés randomized complete block) con 2 réplicas, donde cada cultivo era una única fila que contenía un máximo de 30 plantas. Los 17 ITE se plantaron en el emplazamiento de Jerseyville, donde el diseño era un RCB con un máximo de 4 réplicas, cultivos de 1 fila cada uno, donde la cantidad de réplicas dependía de las semillas disponibles de cada ITE. A causa de esto, la cantidad de réplicas en Jerseyville varió de dos a cuatro. Tratamientos adicionales incluían una comprobación sin tratar (maíz no transgénico) e insecticidas comerciales, incluyendo Counter®, Lorsban®, y Force®. Los tratamientos con insecticida fueron solamente en el emplazamiento de Jerseyville. Los insecticidas se aplicaron en forma de una banda de 20,32 cm (ocho pulgadas) al plantar usando la cantidad recomendada.

Las fechas de la siembre fueron el 28 de mayo y el 3 de junio para Jerseyville y Brookings, respectivamente. El estudio se realizó del siguiente modo; los cultivos se infestaron con huevos de CRW al plantar con 1.600 huevos por cada 30,48 cm (1 pie) de fila, aproximadamente 800 huevos por planta. En la fase de crecimiento vegetal V1-V2, se analizaron las plantas para la presencia de la expresión de la proteína Cry3Bb variante usando un ELISA. Las plantas negativas para el gen se recogieron del cultivo.

Al final de la fase de alimentación larvaria de CRW, cuando habría sucedido el daño máximo, todas las plantas restantes en cada cultivo se evaluaron para la lesión en la raíz por la alimentación usando una escala del 1-6 del índice de daño en la raíz (RDR) descrita por Hills y Peters (1971). La escala de RDR es la siguiente; Índice de Daño en la Raíz:

1. Sin cicatrices de alimentación

2. Cicatrices visibles de alimentación, pero sin raíces cortadas hasta 4 cm del tallo

3. Una o más raíces nodales cortadas hasta 4 cm del tallo, pero menos de un nudo considerado raíces

4. Un nudo considerado raíces cortadas

5. Dos nudos considerados raíces cortadas

6. Tres o más nudos considerados raíces cortadas

El 25 de julio y el 3 de agosto se evaluaron los ensayos de campo en Jerseyville y Brookings, respectivamente. Los RDR promedio para todos los tratamientos se ilustran en la Tabla 9. De los diecisiete ITE evaluados, 16 ITE controlaron la alimentación de CRW, RDR \leq3,0. Dos de los tres patrones químicos tuvieron un RDR menor de 3,0. Force® tuvo un índice de daño en la raíz de 3,2. Excepto para un ITE, WCR20, todos los tratamientos fueron significativamente mejores que las comprobaciones (p < 0,01) pero no diferían significativamente entre sí. La Figura uno ilustra la diferencia en el daño por la alimentación de las larvas entre una planta transgénica resistente a CRW y una comprobación no tratada.

Aunque los ITE no diferían significativamente de los patrones químicos con respecto al índice de daño en la raíz, la cantidad de lesiones por alimentación observada en las raíces de los tratamientos con insecticida fue mayor que en las raíces que expresan el gen propiedad de Monsanto. La ausencia de diferencia entre el índice de daño en la raíz es un artefacto de la escala de valoración de la raíz, donde esta escala se basa en raíces "cortadas". Hills y Peters describen una raíz cortada como la que es de menor de 4 cm de longitud debido a la alimentación por CRW. Por lo tanto, a las masas de raíces sin una raíz "cortada" pero con cicatrices visibles de alimentación se les da un valor de 2. Las raíces fuera de la zona de protección de los tratamientos con insecticida tenían muchas más cicatrices por alimentación y en la mayoría de los casos las puntas de la raíz estaban destruidas en comparación con los ITE. A diferencia de los tratamientos con insecticida, las plantas transgénicas expresan el gen resistente a CRW en toda la masa de la raíz completa. Pero como el mecanismo para el control de la planta transgénica estaba mediado oralmente, se requiere una cantidad mínima de alimentación para controlar cualquier lesión adicional por las larvas CRW. Esta necesidad de alimentación mínima provocaba un RDR de 2.

En resumen, las plantas de maíz que expresan proteínas Cry3Bb variantes estaban completamente protegidas de la alimentación por larvas CRW. Este nivel de protección elimina la necesidad de un tratamiento con insecticida. Los insecticidas, incluyendo organofosfatos, carbamatos y piretroides se incorporan en la tierra sobre más de 16 millones de acres de maíz anualmente para controlar el CRW. La tecnología de resistencia a CRW tiene el potenciar de reducir significativamente el nivel de exposición actual de estos insecticidas al medioambiente. Los beneficios de desviarse de los insecticidas de la tierra a un enfoque transgénico son impresionantes e incluyen una reducción en los riesgos potenciales para la salud y seguridad humanas, impactos directos reducidos sobre organismos no diana, contaminación reducida de los suministros de agua superficial y del suelo, problemas disminuidos en el desecho de los recipientes de pesticidas, y compatibilidad general con otros programas de tratamientos de plagas y agrícolas.

TABLA 9 Medias del daño por la alimentación en la raíz (RDR) por el gusano de la raíz del maíz para acontecimientos de transformación independiente del maíz que contienen el gen resistente a CRW propiedad de Monsanto

12

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5.5 Ejemplo 5 Transformación del Cloroplasto del Tabaco con un gen cry3B

Pueden producirse plantas recombinantes en las que se ha alterado solamente el ADN mitocondrial o el cloroplasto para incorporar las moléculas ideadas en esta solicitud. Se han conocido los promotores que funcionan en cloroplastos en la técnica (Hanley-Bowden y col., Trends in Biochemical Sciences 12:67-70, 1987). Se han descrito procedimientos y composiciones para obtener células que contienen cloroplastos en los que se ha insertado ADN heterólogo, por ejemplo por Daniell y col. (patente de Estados Unidos Nº 5.693.507; 1997) y Maliga y col. (patente de Estados Unidos Nº 5.451.513; 1995). Pude construirse un vector que contenga un casete de expresión a partir del cual podría producirse una proteína Cry3B. Un casete podría contener una secuencia promotora funcional en cloroplastos que dirija la expresión del gen de la proteína cristalina cry3 B, construido en su mayor parte del mismo modo que otros polinucleótidos de este documento, usando metodologías de amplificación térmica, digestión con endonucleasas de restricción, y ligamiento etc. Un gen que se puede expresar en cloroplastos proporcionaría un promotor y una secuencia no traducida 5' de un gen heterólogo o gen de cloroplastos tal como psbA, que proporcionaría la transcripción y la traducción de una secuencia de ADN que codifica una proteína Cry3B en el cloroplasto; una secuencia de ADN que codifica una proteína Cry3B; y un región de terminación de la transcripción y la traducción tal como una región repetida invertida 3' de un gen del cloroplasto que estabilizaría un ARNm de cry3 B expresado. La expresión desde dentro del cloroplasto potenciaría la acumulación del producto génico cry3 B. Puede transformarse una célula huésped que contiene cloroplastos o plástidos con el casete de expresión y después puede cultivarse la célula resultante que contiene los cloroplastos transformados para expresar la proteína Cry3B. Un casete también puede incluir un gen marcado de selección de tolerancia a antibióticos, herbicidas, u otros genes marcadores de selección además del gen cry3 B. El casete de expresión puede estar flanqueado por secuencias de ADN obtenidas de un ADN de cloroplasto que facilitaría la integración estable del casete de expresión en el genoma del cloroplasto, particularmente por recombinación homóloga. Como alternativa, el casete de expresión puede no integrarse, pero incluyendo un origen de replicación obtenido de un ADN de cloroplasto, sería capaz de proporcionar la replicación del gen cry3 B heterólogo en el cloroplasto. Pueden generarse plantas a partir de células que contienen cloroplastos transformados y después también pueden cultivarse para producir semillas, a partir de las cuales pueden generarse plantas adicionales. Dichos procedimientos de transformación son ventajosos sobre la transformación del genoma nuclear, en particular cuando la transformación del cloroplasto se realiza por integración en el genoma del cloroplasto, porque en general los genes del cloroplasto se heredan por vía materna. Esto proporciona plantas transgénicas medioambientalmente "más seguras", eliminando prácticamente la posibilidad de fugas en el medioambiente. Además, los cloroplastos pueden transformarse múltiples veces para producir genomas de cloroplasto funcionales que expresan múltiples proteínas recombinantes deseadas, mientras que la transformación genómica nuclear ha demostrado ser bastante limitada cuando se desean múltiples genes. Los acontecimientos de segregación por tanto se evitan usando la transformación de cloroplastos o plástidos. A diferencia de la expresión en el genoma nuclear de la planta, la expresión en cloroplastos o plástidos puede iniciarse a partir solamente de un promotor y continuar a través de una región policistrónica para producir múltiples péptidos a partir de un único ARNm.

El casete de expresión se produciría en gran medida del mismo modo en que se construyen otros vectores de transformación para plantas. Pueden insertarse secuencias de ADN funcionales en el cloroplasto de la planta en un plásmido bacteriano y unirse a secuencias de ADN que expresan productos génicos deseados, tales como proteínas Cry3B, de modo que se produce la proteína Cry3B dentro del cloroplasto, obviando la necesidad de regulación génica nuclear, recubrimiento, corte y empalme, o poliadenilación de los genes nucleares regulados, o secuencias de dirección al cloroplasto o plástido. Se insertaría un casete de expresión que comprende un gen cry3 B, que se construye sintéticamente o un gen nativo obtenido directamente de un genoma de B. thuringiensis o un elemento episómico de B. thuringiensis, en un sitio de restricción en un vector construido para el propósito de transformación del cloroplasto o plástido. El casete estaría flanqueado cadena arriba por un promotor funcional en cloroplastos o plástidos y cadena abajo por una secuencia de terminación de la transcripción y la traducción funcional en cloroplastos o plástidos. El casete resultante se incorporaría en el genoma del cloroplasto o plástido usando procedimientos de recombinación homóloga bien conocidos.

Como alternativa, la transformación del cloroplasto o plástido podría obtenerse usando un plásmido de replicación autónoma u otro vector con capacidad de propagación dentro del cloroplasto o plástido. Un medio para realizar este procedimiento sería utilizar una parte del genoma del cloroplasto o plástido necesaria para el inicio de la replicación del cloroplasto o plástido como un medio para mantener el plásmido o vector en el cloroplasto o plástido transformado. Se identificaría fácilmente una secuencia que posibilite la replicación estable de un elemento epigenético del cloroplasto o plástido a partir de la clonación aleatoria de un genoma de cloroplasto o plástido en un vector bacteriano convencional que también contenga un gen marcador de selección para cloroplastos o plástidos, seguido de transformación de los cloroplastos o plástidos y la selección de células transformadas en un medio de selección apropiado. La introducción de un casete de expresión como se describe en este documento en un elemento epigenético replicable en cloroplastos o plástidos por tanto proporcionaría un medio eficaz para localizar una \delta-endotoxina Cry3B de B. thuringiensis en el cloroplasto o plástido.

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5.6 Ejemplo 6 Dirección de la Proteína Cry3Bb o Cry3Bb Variante a Plástidos

La expresión mejorada dirigiendo una proteína insecticida recombinante al cloroplasto puede producir tejidos que se exponen a la luz y que acumulan cloroplastos maduros como resultado. La mejora de la expresión en tejido foliar para inhibir las plagas que se alimentan de hojas susceptibles a la proteína insecticida podría ser ventajosa. Para ensayar esto, se construyeron dos plásmidos, pMON33709 y pMON33710 que eran isogénicos con respecto a todos los elementos con la excepción de una secuencia de dirección al plástido o cloroplasto unidad en fase a la variante mejorada de Cry3Bb insecticida en pMON33709. Se recuperaron plantas de maíz R_{0} y se demostró que contenían y expresaban el transgén por ELISA. Se recuperaron seis líneas pMON33709 y dieciséis pMON33710 que expresaban el transgén tanto en la raíz como en las hojas. Se recuperó tejido foliar y de la raíz y se analizó para la presencia y cantidad de proteína Cry3Bb variante, medida en partes por millón. Los resultados se muestran en la Tabla 10.

TABLA 10

14

TABLA 10 (continuación)

15

Todas salvo una línea pMON33709 (R053643) produjeron entre 3 a 15 veces más proteína insecticida en las hijas que en tejidos de la raíz. La línea que produjo menor en las hojas también produjo menos de 1 ppm en la raíz, mientras que las otras líneas produjeron hasta casi 100 ppm en las hojas. La cantidad de proteína Cry3Bb variante expresada fue incluso más variable en las líneas no dirigidas derivadas de acontecimientos de transformación de pMON33710 que se determinó que expresaban la proteína recombinante tanto en tejido foliar como de la raíz. Aunque la mayoría de estas líneas produjo más proteína en las hojas que en las raíces, algunas también produjeron más en las raíces, pero la diferencia entre la cantidad producida en las raíces en aquellas de expresión mejorada en la raíz fue menos sustancial que en el único acontecimiento dirigido pMON33709. Además, el intervalo de niveles de expresión fue menor pronunciado en los acontecimientos no dirigidos con una excepción. Sorprendentemente, una línea (R053904) produjo sustancialmente más proteína en las hojas que la observada en cualquier otra línea, dirigida o no dirigida. Se esperaría que esta línea fuera un candidato para una línea comercial dirigida a la protección contra plagas de coleópteros que se alimentan de tejidos foliares. A la inversa, se esperaría que líneas tales como R053923 fueran candidatos óptimos para proteger a las plantas del maíz contra plagas que se alimentan de la raíz tales como los gusanos de la raíz del maíz.

Los datos, en resumen, indican que dirigir la proteína Bt Cry3B al plástido o cloroplasto mejora la acumulación de la proteína en tejido foliar pero no en tejido de la raíz, y mejora la expresión global de la proteína en las hojas de plantas transformadas con dichas construcciones en comparación con los niveles de expresión observados en tejidos de la raíz de esas mismas plantas.

En vista de lo anterior, se observará que se consiguen varias ventajas de la invención y se obtienen otros resultados ventajosos. Como podrían hacerse diversos cambios en los procedimientos y composiciones anteriores sin alejarse del alcance de la invención, se pretende que toda la materia contenida en al anterior descripción y mostrada en los dibujos adjuntos se interprete como ilustrativa y no en un sentido limitante.

<110> Monsanto Technology LLP

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<120> Expresión Mejorada de la Proteína Insecticida Cry3Bb en Plantas

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<130> 060854ep

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<150> PCT/US99/18883

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<151> 19-08-1999

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<150> 60/097.150

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<151> 19-08-1998

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<160> 43

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<170> PatentIn versión 3.3

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<210> 1

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<211> 1959

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<212> ADN

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<213> Bacillus thuringiensis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1956)

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<223> secuencia nucleotídica de origen natural que codifica una secuencia de aminoácidos de Cry3Bb1

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<400> 1

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16

17

18

19

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<210> 2

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<211> 652

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<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

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<400> 2

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20

21

22

23

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<210> 3

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<211> 1959

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<212> ADN

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<213> Bacillus thuringiensis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1956)

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<223> secuencia nucleotídica de origen natural que codifica una secuencia de aminoácidos de Cry3Bb2

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<400> 3

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24

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26

27

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<210> 4

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<211> 652

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<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

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<400> 4

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28

29

30

31

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<210> 5

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<211> 1962

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> secuencia nucleotídica sintética o de origen no natural que codifica una secuencia de aminoácidos de Cry3Bb

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1956)

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<400> 5

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32

33

34

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<210> 6

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<211> 652

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Construcción Sintética

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<400> 6

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35

36

37

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<210> 7

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<211> 1989

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> secuencia nucleotídica de origen no natural que codifica una secuencia de aminoácidos de Cry3Bb variante v11231

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<220>

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<221> CDS

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<222> (3)..(1961)

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<223> secuencia codificante para la secuencia de aminoácidos de Cry3Bb variante v11231

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<400> 7

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39

40

41

42

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<210> 8

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<211> 653

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Construcción Sintética

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<400> 8

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45

46

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<210> 9

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<211> 1984

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> secuencia nucleotídica de origen no natural que codifica una secuencia de aminoácidos de Cry3Bb variante 1123mv1

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<220>

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<221> CDS

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<222> (3)..(1961)

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<223> secuencia codificante para una secuencia de aminoácidos de Cry3Bb variante 11231mv1

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<400> 9

47

48

49

50

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<210> 10

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<211> 653

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Construcción Sintética

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<400> 10

51

53

54

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<210> 11

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<211> 1984

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> secuencia nucleotídica de origen no natural que codifica una secuencia de aminoácidos de Cry3Bb variante 11231 mv2

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<220>

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<221> CDS

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<222> (3)..(1961)

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<223> secuencia codificante para una secuencia de aminoácidos de Cry3Bb variante 11231 mv2

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<400> 11

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<210> 12

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<211> 653

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Construcción Sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

59

60

61

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4149

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> casete de expresión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)..(640)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P-CaMV.35S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (669)..(1972)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Zm.Hsp70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido de tránsito

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1489)..(1635)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Extremo amino TS-ZM.rbcS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1636)..(1798)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Zm.rbcS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido de tránsito

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1799)..(1885)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Extremo carboxi TS-ZM.rbcS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1885)..(3843)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cry3Bb1 variante v11231

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> terminador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3871)..(4127)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de terminación de la transcripción 3' y de poliadenilación T-AGRtu.nos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

63

64

65

66

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 653

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Construcción Sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

68

69

70

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3754

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> casete de expresión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)..(640)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P-CaMV.35S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (669)..(1472)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Zm.Hsp70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1990)..(3948)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cry3Bb1 variante v11231

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> terminador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3475)..(3730)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de terminación de la transcripción 3' y de poliadenilación de nos de Agrobacterium tumefaciens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

72

73

74

75

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 653

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Construcción Sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

77

78

79

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3450

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> casete de expresión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(235)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P-CaMV.AS4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> 5'UTR

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (240)..(304)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> L-Ta.hcb1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (318)..(805)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Os.Act1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido de tránsito

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (825)..(971)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> extremo amino TS-Zm.rbcS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (972)..(1134)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Zm.rbcS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido de tránsito

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1135)..(1221)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> extremo carboxi TS-Zm.rbcS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1222)..(3180)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cry3Bb1 variante 11231mv1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> terminador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3198)..(3931)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> T-Ta.hsp17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

81

82

83

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 653

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Construcción Sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

85

86

87

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3039

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> casete de expresión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(235)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P-CaMV.AS4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> 5'UTR

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (240)..(304)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> L-Ta.hcb1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (318)..(805)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Os.Act1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (811)..(2769)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cry3Bb1 variante 11231mv1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> terminador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2787)..(3020)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> T-Ta.hsp17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

88

89

90

91

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 653

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Construcción Sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

93

94

95

96

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3039

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> casete de expresión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(235)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P-CaMV.AS4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> 5'UTR

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (240)..(304)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> L-Ta.hcb1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (318)..(805)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Os.Act1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (811)..(2769)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cry3Bb1 variante 11231mv2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> terminador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2787)..(3020)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> T-Ta.hsp17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

97

98

99

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 653

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Construcción Sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

101

102

103

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3469

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> casete de expresión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)..(690)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P-CaMV.35S

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> 5'UTR

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (664)..(734)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> L-Ta.hcb1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (748)..(1238)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Os.Act1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1241)..(3199)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cry3Bb1 variante 11231mv2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> terminador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3217)..(3450)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> T-Ta.hsp17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

105

106

107

108

109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 653

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Construcción Sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

110

111

112

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 416

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia nucleotídica de origen no natural que codifica el péptido de direccionamiento a cloroplastos de la ribulosa bis-fosfato carboxilasa de Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(162)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (163)..(325)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Zm.rbcS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (326)..(415)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

114

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

115

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Construcción Sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

116

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Construcción Sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

117

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 202

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus del mosaico de la coliflor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

118

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 416

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> promotor AS4 del virus del mosaico de la coliflor modificado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Triticum aestivum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 804

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sp.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 804

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

122

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 257

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Agrobacterium tumefaciens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Triticum aestivum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3455

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> casete de expresión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(235)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P.CaMV.AS4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> 5'UTR

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (240)..(304)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> L-Ta.hcb1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (318)..(805)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Os.Act1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido de tránsito

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (825)..(971)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia codificante amino terminal TS-Am.rbcS cadena arriba del intrón rbcS de Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido de tránsito

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (825)..(971)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia codificante amino terminal TS-Zm.rbcS cadena arriba del intrón rbcS de Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (972)..(1134)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Zm.rbcS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido de tránsito

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1135)..(1221)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia codificante carboxi terminal TS-ZM.rbcS cadena abajo del intrón rbcS de Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1222)..(3180)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia codificante de Cry3BB1 variante que codifica v11231

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> terminador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3198)..(3431)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> T-Ta.hsp17

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

125

126

127

128

129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 653

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Construcción Sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

130

131

132

133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3044

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> casete de expresión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(235)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P-CaMV.AS4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> 5'UTR

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (240)..(304)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> L-Ta.hcb1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Intrón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (318)..(805)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-Os.Act1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (811)..(2769)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia codificante de Cry3Bb1 variante que codifica v11231

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> terminador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2792)..(3025)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> T-Ta.hsp17

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

134

135

136

137

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 653

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Construcción Sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

138

139

140

141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taggcctcca tccatggcaa accctaacaa tc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcccatcttc ctacttagca ccctgcagaa atacggtcca ac

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacctcacct accaaacatt cgatcttg

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgagttctac cgtaggcagc tcaag

\hfill

25

Claims

1. Un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica expuesta en la SEC ID Nº 11.

2. Un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un péptido expuesto en la SEC ID Nº 12.

3. Un casete de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2.

4. El casete de expresión de la reivindicación 3, que comprende del nucleótido 14 al nucleótido 3020 de la SEC ID Nº 21.

5. El casete de expresión de la reivindicación 3, que comprende del nucleótido 25 al nucleótido 3450 de la SEC ID Nº 23.

6. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2 y/o el casete de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

7. Una célula transformada que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2 y/o el casete de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

8. La célula transformada de la reivindicación 7, en la que la célula es una célula vegetal o una célula bacteriana.

9. La célula transformada de la reivindicación 8, en la que la célula vegetal es una célula de maíz.

10. Una planta o semilla de una planta que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2 y/o el casete de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

11. Una planta o semilla de una planta de la reivindicación 10, en la que la planta es una monocotiledónea o una dicotiledónea.

12. La planta o semilla de la planta de la reivindicación 11, en la que la planta es una monocotiledónea.

13. La planta o semilla de la planta de la reivindicación 12, en la que la planta es maíz.

14. Un procedimiento para producir una célula transformada, que comprende introducir el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2 y/o el casete de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en una célula, en el que la célula es una célula vegetal o una célula microbiana.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la célula es una célula vegetal.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que la célula vegetal es una célula monocotiledónea.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que la célula vegetal es una célula de maíz.

18. Un procedimiento para producir una planta de maíz transformada, que comprende las etapas de:

introducir el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2 y/o el casete de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en una célula vegetal de maíz;

seleccionar una célula vegetal de maíz transformada; y

regenerar una planta de maíz a partir de la célula vegetal de maíz transformada, en el que la planta de maíz comprende el polinucleótido y/o el casete de expresión.

19. Un procedimiento para controlar la infestación con insectos coleópteros en un campo de plantas de cultivo, que comprende proporcionar al insecto coleóptero una planta transgénica de la que se alimenta el insecto coleóptero, en el que la planta transgénica es la planta de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13.