MXPA06011694A - Composiciones y metodos para el control de infestaciones de insectos en plantas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion esta dirigida al control de una infestacion de una plaga, inhibiendo una o mas funciones biologicas en una plaga invertebrada; la invencion describe metodos y composiciones para utilizarse en el control de infestaciones de plagas, alimentando una o mas moleculas diferentes de ARN recombinante de doble hebra a las plagas, con el fin de lograr una reduccion en la infestacion de la plaga a traves de la supresion de la expresion del gen; la invencion tambien esta dirigida a metodos para hacer plantas transgenicas que expresen las moleculas de ARN de doble hebra, y con combinaciones particulares de agentes plaguicidas Transgenicos para utilizarse para proteger las plantas de la infestacion de la plaga.

Description

ácido ribonucleico (ARN) interfiriente pequeño o de doble hebra, transcrito de toda o una porción de una secuencia codificante objetivo, controlando por lo tanto la infestación. Por lo tanto, la presente invención se relaciona con la inhibición específica de la secuencia de la expresión de secuencias codificantes utilizando el ARN de doble hebra (ARNds) o ARN interfiriente pequeño (ARNsi), para alcanzar los niveles pretendidos de control de la plaga. También se proporcionan las moléculas de ácido nucleico novedosas aisladas y sustancialmente purificadas incluyendo, de manera no exclusiva, secuencias nucleotídicas y constructos de ADN recombinantes no naturales, para transcribir las moléculas de ARNds o ARNsi de la presente invención, que suprimen o inhiben la expresión de una secuencia codificante endógena o una secuencia codificante objetivo en la plaga cuando se introduce a la misma. También se proporcionan las plantas transgénicas que (a) contienen las secuencias nucleotídicas que codifican las moléculas de ácido nucleico aisladas y sustancialmente purificadas y los constructos de ADN recombinantes no naturales para transcribir las moléculas de ARNds o ARNsi para controlar las infestaciones de plagas en plantas, y (b) muestran resistencia y/o tolerancia mejorada a las infestaciones por insectos. También se describen composiciones que contiene las secuencias nucleotídicas de ARNds de la presente invención para utilizarse en las aplicaciones tópicas en plantas o en animales o en el medio ambiente de un animal para alcanzar la eliminación o reducción de la infestación de la plaga.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El medio ambiente en el cual los humanos viven, está repleto con infestación de plagas. Las plagas incluyen insectos, arácnidos, crustáceos, hongos, bacterias, virus, nemátodos, gusanos planos, gusanos redondos, oxiuros, uncinarias, tenias, tripanosomas, esquistosomas, moscardones, pulgas, garrapatas, ácaros, y piojos y lo similar, son penetrantes en el medio ambiente humano, y se han utilizado una multitud de medios para intentar controlar las infestaciones por estas plagas. Las composiciones para controlar infestaciones mediante plagas microscópicas tales como bacterias, hongos y virus, se han proporcionado en la forma de composiciones antibióticas, composiciones antivirales y composiciones antimicóticas. Las composiciones para controlar las infestaciones por plagas más grandes, tales como nemátodos, gusanos planos, gusanos redondos, oxiuros, gusanos cardiacos, tenias, tripanosomas, esquistosomas, y lo similar, típicamente ha sido en la forma de composiciones químicas que pueden aplicarse ya sea en las superficies de sustratos en los cuales se sabe que las plagas infestan, o ingerirse por un animal infestado en la forma de gránulos, polvos, tabletas, pastas o cápsulas y lo similar. La presente invención está dirigida a proporcionar un medio mejorado para controlar la infestación de plagas en comparación con las composiciones conocidas en la técnica. Las cosechas comerciales con frecuencia son objetivos del ataque de insectos. Se ha hecho un progreso sustancial en las últimas décadas hacia el desarrollo de métodos y composiciones más eficientes para controlar las infestaciones de insectos en las plantas. Los plaguicidas químicos han sido muy efectivos para erradicar las infestaciones de plagas. Sin embargo, existen varias desventajas al utilizar agentes plaguicidas químicos. Los agentes plaguicidas químicos no son selectivos. Las aplicaciones de los plaguicidas químicos pretenden controlar plagas invertebradas que son dañinas a varias cosechas y otras plantas. Sin embargo, debido a la falta de selectividad, los agentes plaguicidas químicos, también ejercen sus efectos en fauna no objetivo, con frecuencia de manera efectiva, esterilizando un campo durante un periodo de tiempo durante el cual los agentes plaguicidas se han aplicado. Los agentes plaguicidas químicos persisten en el medio ambiente y generalmente son lentos de metabolizarse, si lo hacen. Se acumulan en la cadena alimenticia, y particularmente en las especies predadoras superiores. Las acumulaciones de estos agentes plaguicidas químicos resulta en el desarrollo de resistencia a los agentes y en especies más altas en la escalera evolutiva, actúa como mutágenos y/o carcinógenos, causando con frecuencia modificaciones genéticas irreversibles y dañinas. Así, ha habido una necesidad muy sentida por métodos ambientalmente amigables para controlar o erradicar las infestaciones de insectos sobre o en plantas, es decir, métodos que sean selectivos, ambientalmente inertes, no persistentes y biodegradables, y que se ajusten bien en los esquemas de manejo de resistencia de la plaga.

Las composiciones que incluyen bacterias Bacillus thuringiensis (B.t.), han estado comercialmente disponibles y se utilizaron como insecticidas ambientalmente seguros y aceptables durante más de treinta años. El efecto insecticida de la bacteria Bt surge como resultado de las proteínas que se producen exclusivamente por estas bacterias, y que no persisten en el medio ambiente, que son altamente selectivas para las especies objetivo afectadas, ejercen sus efectos sólo tras la ingestión por una plaga objetivo, y han mostrado ser inocuas a las plantas y otros organismos no objetivo, incluyendo los humanos. Las plantas transgénicas que contienen uno o más genes que codifican la proteína B.t. insecticida también están disponibles en la técnica y son notablemente eficientes para controlar la infestación de plagas de insectos. Un resultado sustancial del uso de plantas recombinantes que expresan las proteínas insecticidas Bt es una disminución marcada en la cantidad de agentes plaguicidas químicos que se aplican al medio ambiente para controlar la infestación de plagas en los campos de cosechas en áreas en las cuales tales cosechas transgénicas se utilizan. La disminución en la aplicación de los agentes plaguicidas químicos ha resultado en suelos más limpios y aguas más limpias que corren de los suelos hacia las corrientes, ríos, pozas y lagos circundantes. Además de estos beneficios ambientales, ha habido un incremento notable en el número de insectos benéficos en los campos de cosechas en los cuales se cultivan las cosechas resistentes a los insectos transgénicos, debido al incremento en el uso de agentes insecticidas químicos.

Se han reportado en la técnica métodos y composiciones antisentido y se cree que ejercen sus efectos a través de la síntesis de una molécula de ARN de una sola hebra que en teoría se híbrida in vivo a una molécula de ARN con una hebra sentido sustancialmente complementaria. La tecnología antisentido ha sido difícil de emplear en muchos sistemas por tres razones principales. Primero, la secuencia antisentido expresada en la célula transformada es inestable. Segundo, la inestabilidad de la secuencia antisentido expresada en la célula transformada crea, de manera concomitante, dificultad al suministrar la secuencia a un sistema hospedero del tipo celular o biológico remoto a la célula transgénica. Tercero, las dificultades encontradas con la inestabilidad y el suministro de la secuencia antisentido crea dificultades al intentar proporcionar una dosis dentro de la célula recombinante que expresa la secuencia antisentido que puede modular de manera efectiva el nivel de expresión de la secuencia nucleotídica sentido objetivo. Ha habido pocas mejoras en las tecnologías para modular el nivel de expresión del gen dentro de una célula, tejido u organismo, y en particular, una falta de tecnologías desarrolladas para retrasar, reprimir o reducir de otra manera la expresión de genes específicos utilizando la tecnología del ADN recombinante. Además, como una consecuencia de la ¡mpredecibilidad de estos procedimientos, no están disponibles medios comercialmente viables para modular el nivel de expresión de un gen específico en un organismo eucariótico o procariótico.

La inhibición mediada por el ADN de doble hebra de genes específicos en varias plagas se ha demostrado previamente. Los procedimientos mediados por el ARNds para el control genético se han probado en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster (Tabara et al., 1998, Science 282:430-431 ). Tabara et. al., describen un método para suministrar un ARNds que involucra generar insectos transgénicos que expresan moléculas de ARN de doble hebra o inyectar soluciones de ARNds en el cuerpo del insecto o dentro del saco de huevos antes de o durante el desarrollo embriónico. Los investigadores han demostrado previamente que la supresión del gen mediada por el ARN de doble hebra puede lograrse en nemátodos ya sea alimentando o remojando los nemátodos en soluciones que contienen las moléculas de ARN de doble hebra o de ARN ¡nterfiriente pequeño e inyectando las moléculas de ARNds. Rajagopal et al., describieron intentos fallidos para suprimir un gen endógeno en larvas de plagas de insectos Spodoptera litura alimentando o remojando las larvas neonatas en soluciones que contienen ARNds específico para el gen objetivo, pero fueron exitosos en la supresión después de que las larvas se inyectaron con ARNds en la hemolinfa de la larva de la 5a instar utilizando un microaplicador (J. Biol. Chem., 2002, 277:46849-46851 ). De manera similar, Mesa et al. (US 2003/0150017), describió de manera profética un sitio preferido para la inhibición de la larva de lepidóptero Helicoverpa armígera utilizando el ARNds suministrado a la larva por la ingestión de una planta transformada para producir el ARNds. Se cree que sería impráctico proporcionar moléculas de ARNds en la dieta de la mayoría de las especies de plagas invertebradas o inyectar composiciones que contienen el ARNds en los cuerpos de las plagas invertebradas. El método de dieta de proporcionar moléculas de ARNds a las plagas invertebradas es impráctico debido a que las moléculas de ARN, incluso las moléculas de ARN de doble hebra estabilizadas, son en efecto, altamente inestables en medios levemente alcalinos o ácidos, tales como aquéllos encontrados en los tractos digestivos de la mayoría de las plagas invertebradas, y se degradan fácilmente por las nucleasas en el medio ambiente. Por lo tanto, existe la necesidad de métodos mejorados de modular la expresión del gen, reprimiendo, retrasando o reduciendo de otra manera la expresión dentro de una plaga invertebrada particular, con el propósito de controlar la infestación de la plaga o introducir rasgos fenotípicos novedosos.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención, en una modalidad, comprende un método para inhibir la expresión de un gen objetivo en una plaga invertebrada. De manera específica, la presente invención comprende un método para modular o inhibir la expresión de uno o más genes objetivo en una plaga invertebrada, en particular, en el gusano de la raíz del maíz Occidental (WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte) y lo similar, que causan el cese de la alimentación, el crecimiento, el desarrollo, la reproducción y la infectividad, y resulta finalmente en la muerte del insecto. El método comprende la introducción de un ARN de doble hebra (ARNds) parcial o completamente estabilizado o sus formas modificadas, tales como secuencias de ARN interfiriente pequeño (ARNsi), en las células o en un medio extracelular, tal como el intestino medio, dentro del cuerpo de una plaga invertebrada, en donde el ARNds o el ARNsi entra en las células e inhibe la expresión de al menos uno o más genes objetivo y en donde la inhibición de uno o más genes objetivo ejerce un efecto dañino en la plaga invertebrada. Se contempla de manera específica que los métodos y composiciones de la presente invención serán útiles para limitar o eliminar la infestación de plagas invertebradas en o sobre cualquier hospedero de la plaga, simbionte de la plaga, o medio que una plaga prefiera, proporcionando una o más composiciones que comprenden moléculas de ARNds en la dieta de la plaga, siempre que el pH del sistema digestivo de la plaga esté dentro del intervalo de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 9.5, de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, y de aproximadamente pH 7.0. La presente solicitud describe un listado de secuencias ejemplar que contiene las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos del Gusano de la Raíz del Maíz Occidental (WCR, Diabrotica virgifera), como se expone en la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 y la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO: 174, y de otros insectos coleópteros, incluyendo el Escarabajo de la Papa de Colorado (CPB, Leptinotarsa decemlineata) y el Escarabajo Rojo de la Harina (RFB, Tríbolium castaneum), de insectos lepidópteros incluyendo el Gorgojo del Maíz Europeo (ECB, Ostrinia nubilalis), la Oruga Nocturna Negra (BCW, Agrotis ípsilon), la Lombriz de Tierra del Maíz (CEW, Helicoveipa zea), el Gusano Guerrero de Otoño (FAW, Spodoptera frugiperda), el Gorgojo de la Vaina de Algodón (BWV, Anthonomus grandis), los gusanos de seda (Bombyx morí) y Manduca sexta y de insectos Dípteros incluyendo Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae y Aedes aegypti, expuestas en la SEQ ID NO: 144 hasta la SEQ ID NO: 159. El listado de secuencias se incluye junto con la copia en papel de esta solicitud en un disco CD-ROM. La forma legible en computadora del archivo que corresponde al listado de la secuencia, contiene la información del listado de la secuencia para las secuencias Unigene del gusano de la raíz del maíz, las secuencias EST, las secuencias de la sonda específica del gusano de la raíz del maíz, secuencias del cebador, secuencias del amplicón, y las secuencias que codifican las secuencias del ARN de doble hebra y los ortólogos de v-ATPasa y de la proteína L19 ribosomal de otros insectos como se describió anteriormente (SEQ ID NO:144 hasta la SEQ ID ??.? 59). La presente invención proporciona un método para suprimir la expresión del gen en una plaga invertebrada, tal como el gusano de la raíz del maíz o especies relacionadas, que comprende el paso de proporcionar en la dieta de la plaga una cantidad supresora del gen de al menos una molécula de ARNds transcrita de una secuencia nucleotídica, como se expone en la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 y de la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174 en el listado de las secuencias, al menos un fragmento de la cual es complementario a una secuencia de ARNm formada dentro de las células de la plaga, y observando la muerte, inhibición, atrofia o cese de la alimentación de la plaga. En otro aspecto de la presente invención, el método comprende el paso de alimentar a la plaga con una (o más) moléculas de ARNds estabilizadas o su forma modificada, tal como una molécula de ARNsi, la secuencia nucieotídica de la cual es al menos de aproximadamente 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o aproximadamente 100% idéntica a una molécula de ARN transcrita de una secuencia nucieotídica seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143, y de la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO: 174. En consecuencia, en otro aspecto de la presente invención, se proporciona un conjunto de secuencias nucleotídicas aisladas y purificadas como se expone en la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143, y en la SEQ ID NO: 169 hasta la SEQ ID NO: 174, como se expone en el listado de las secuencias. Las secuencias nucleotídicas descritas en la presente como se expone en la SEQ ID NO. hasta la SEQ ID NO:143, se aislaron y purificaron sustancialmente a partir de bibliotecas de ADN complementario (ADNc), hechas a partir de larvas de insectos WCR. Las secuencias nucleotídicas descritas en la presente como se expone en la SEQ ID NO: 169 hasta la SEQ ID NO: 74 en el listado de secuencias, se aislaron y purificaron sustancialmente del ADN genómico de la plaga del insecto del gusano de la raíz del maíz Sureño o las recolecciones de ARNm aislado de las plagas de insectos, de las secuencias nucleotídicas de ADNc derivadas de tales recolecciones de ARNm, o sintetizadas denovo basándose en las secuencias nucleotídicas descritas en la presente o conocidas en la técnica, como las secuencias del promotor de la ARN polimerasa del fago T7. La presente invención proporciona una molécula de ARNds o ARNsi estabilizada o la expresión de uno o más ARNmi para la inhibición de la expresión de un gen objetivo en una plaga invertebrada tal como un insecto WCR. Una molécula de ARNds, ARNmi o ARNsi estabilizada, puede comprender al menos dos secuencias codificantes que están colocadas en una orientación sentido y antisentido con relación a al menos un promotor, en donde la secuencia nucleotídica que comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, está enlazada o conectada por una secuencia separadora de al menos de aproximadamente cinco a aproximadamente mil nucleótidos, en donde la hebra sentido y la hebra antisentido son de diferente longitud, y en donde cada una de las dos secuencias codificantes comparte al menos 80% de identidad de la secuencia, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o incluso 100% de identidad de la secuencia, con una secuencia nucleotídica como se expone en una de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 o en una de la SEQ ID ??. 69 hasta la SEQ ID NO:174 en el listado de secuencias. La invención también proporciona secuencias nucleotídicas no naturales (NNO), que pueden utilizarse para genes objetivo en las plagas invertebradas para la supresión mediada por ARN de doble hebra con el fin de alcanzar la inhibición deseada de los genes objetivo. Cualquiera de las secuencias nucleotídicas como se expone en la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 o en la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, puede utilizarse para construir tal secuencia nucleotídica NNO. La presente invención también proporciona un constructo de ADN recombinante que codifica las moléculas de ARNds contempladas en la presente para la introducción en una célula hospedera. El constructo de ADN recombinante comprende una secuencia nucleotídica que se transcribe en el ARN por la célula hospedera. El ARN transcrito forma al menos una molécula de ARNds, de manera que una molécula de ARNds se codifica por una porción de la secuencia nucleotídica que es al menos aproximadamente 80% a aproximadamente 100% idéntica a una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 y de la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174. El constructo de ADN recombinante es capaz de producir moléculas de ARNds en la célula hospedera y de inhibir la expresión del gen endógeno o el gen objetivo o un derivado del mismo o una secuencia complementaria al mismo en la célula hospedera, o en una célula de la plaga tras la ingestión de la célula hospedera transformada por una plaga invertebrada. Una secuencia nucleotídica de la presente invención se coloca bajo el control de una secuencia promotora que es operable en la célula hospedera y se expresa para producir las secuencias de ácido ribonucleico que forman las moléculas de ARNds dentro de la célula hospedera. Las moléculas de ARNds pueden procesarse además ya sea en la célula hospedera o en una plaga invertebrada para formar las moléculas de ARNsi. La presente invención también proporciona una secuencia de ADN recombinante para la transformación de una planta construida para contener al menos una secuencia nucleotídica no natural que puede transcribirse en una molécula de ARN de una sola hebra. La molécula de ARN de una sola hebra forma una molécula de ARN de doble hebra in vivo a través de la hibridación intermolecular que, cuando se proporciona en la dieta de una plaga invertebrada, inhibe la expresión de al menos un gen objetivo en una célula de la plaga invertebrada. La secuencia nucleotídica no natural, se enlaza de manera operable a al menos una secuencia promotora que funciona en una célula de planta transgénica para transcribir la secuencia nucleotídica no natural enlazada de manera operable en una o más secuencias de ácido ribonucleico. Las secuencias de ARN se automontan en moléculas de ARN de doble hebra y se proporcionan en la dieta de una plaga invertebrada que se alimenta de la planta transgénica. La provisión de las moléculas de ARNds en la dieta de la plaga logra la inhibición deseada de la expresión de uno o más genes objetivo dentro de la plaga. La presente invención también proporciona una célula hospedera recombinante que tiene en su genoma al menos una secuencia de ADN recombinante que se transcribe en la célula hospedera para producir al menos una molécula de ARNds que funciona cuando se ingiere por una plaga invertebrada para inhibir la expresión de un gen objetivo en la plaga. La molécula de ARNds se codifica por una porción de la secuencia nucleotídica que exhibe al menos de aproximadamente 80 a aproximadamente 100% de identidad con una secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 o de la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174 en el listado de secuencias. Las secuencias nucleotídicas ejemplares para utilizarse en la construcción de los agentes de ARNds que seleccionan los genes de WCR para la supresión, se exponen en la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 y de la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174 en el listado de secuencias. La presente invención también proporciona un constructo de ADN recombinante para la transformación de plantas, que consiste de al menos dos diferentes secuencias no naturales que, cuando se expresan in vivo como secuencias de ARN y se proporcionan en la dieta de una plaga invertebrada, inhiben la expresión de al menos dos genes objetivo diferentes en la célula de la plaga invertebrada. La primera secuencia no natural se transcribe en el ARN que forma al menos una primera molécula de ARNds. Una porción de la primera molécula de ARNds se codifica por una porción de la primera secuencia no natural y exhibe al menos de aproximadamente 80 a aproximadamente 100% de identidad con al menos una de las secuencias nucleotídicas expuestas en la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO: 43 o en la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174 en el listado de secuencias, y con la secuencia nucleotídica del primer gen objetivo, derivado de la misma, o una secuencia complementaria de la misma. La segunda secuencia no natural se transcribe en el ARN que forma una segunda molécula de ARNds. Una porción de la segunda molécula de ARNds se codifica por una porción de la segunda secuencia no natural y exhibe al menos de aproximadamente 80 a aproximadamente 100% de identidad con una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo como se expone en la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 y en la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174 en el listado de secuencias y con la secuencia nucleotídica del segundo gen objetivo, derivado de la misma, o una secuencia complementaria de la misma. Las dos secuencias no naturales se colocan de manera operable bajo el control de al menos una secuencia promotora. La secuencia promotora funciona para expresar la primera y segunda moléculas de ARNds en la célula de la planta transgénica. Las moléculas de ARNds se proporcionan en una concentración inhibidora de la plaga en la dieta de una plaga invertebrada que se alimenta de la planta transgénica, y la ingestión de las células de la planta por la plaga logra la inhibición deseada de la expresión de los genes objetivo en la plaga. La presente invención también proporciona una célula de planta transformada que tiene en su genoma al menos una de las secuencias de ADN recombinante mencionadas anteriormente para la transformación de la planta. Las plantas transgénicas se generan a partir de una célula de planta transformada, y las plantas, semillas y productos de las plantas de la progenie, cada una que comprende el ADN recombinante, se producen de las plantas transgénicas.

Los métodos y composiciones de la presente invención pueden aplicarse a cualquier planta monocotiledónea y dicotiledónea, dependiendo del control de la plaga invertebrada deseada, o pueden aplicarse a través de formulaciones farmacéuticamente aceptables a animales vertebrados con el fin de proporcionar algún nivel de reducción de infestación de plagas invertebradas. De manera específica, las plantas pretenden comprender sin limitación plantas de alfalfa, eneldo, manzana, albaricoque, alcachofa, arúgula, espárrago, aguacate, plátano, cebada, frijoles, remolacha, zarzamora, arándano, brócoli, coles de Bruselas, coles, colza, cantalupo, zanahoria, mandioca, coliflor, apio, cereza, cilantro, cítricos, clementina, café, maíz, algodón, pepino, abeto Douglas, berenjena, endivia, escarola, eucalipto, hinojo, higos, calabaza, uva, toronja, ligamaza, jicama, kiwi, lechuga, puerros, limón, lima, pino del incienso, mango, melón, hongos, nueces, avena, quimbombó, cebolla, naranja, una planta ornamental, papaya, perejil, chícharos, duraznos, cacahuate, pera, pimienta, placaminero, pino, piña, plátano, ciruelo, granada, álamo, papa, calabaza, membrillo, pino radiata, achicoria roja, rábano, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, pino Sureño, soya, espinaca, calabaza, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, papa dulce, liquidámbar, tangerina, té, tabaco, jitomate, césped, un vino, sandía, trigo, ñames y calabacines. La presente invención también proporciona un agente para el control de las plagas que comprende una molécula de ARNds transcrita de una secuencia nucleotídica de la presente invención. La secuencia nucleotídica comparte al menos de aproximadamente 80 a aproximadamente 100% de identidad de la secuencia con al menos una de las secuencias nucleotídicas como se expone en la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 o en la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174 en el listado de secuencias. En una forma, los agentes para el control de las plagas comprenden moléculas de ARNds. En otra forma, los agentes para el control de las plagas comprenden moléculas de ARNsi. En aún otra forma, los agentes para el control de las plagas comprenden secuencias de ADN recombinante que codifican moléculas de ARNm que forman las moléculas de ARNds o ARNsi para la introducción en plantas y microbios. En aún otra forma, los agentes para el control de las plagas son microbios que contienen secuencias de ADN recombinante que codifican las moléculas de ARN que forman las moléculas de ARNds o ARNsi. El agente para el control de las plagas es de manera preferida un agente para el control de las plagas de insectos o de nemátodos. Se pretende que el agente para el control de las plagas actúe para reducir o eliminar la infestación de un gusano de la raíz del maíz, pero también está contemplado que los métodos y las composiciones expuestos en la presente sean capaces de ser utilizadas para derivar secuencias relacionadas de otras plagas y utiliza esos derivados para controlar la infestación de otras plagas. Se contempla además que la plaga de insectos pueda seleccionarse de cualquier género, familia u orden de insectos. Para los gusanos de la raíz del maíz, se contempla que la plaga se seleccione del mismo género, la misma familia u orden a la cual pertenezca el gusano de la raíz del maíz. Además, los presentes inventores contemplan que la presente invención pueda utilizarse y aplicarse para controlar cualquier especie del reino de los insectos y de los nemátodos, patógenos micóticos, virus, bacterias y cualesquier otras plagas invertebradas de plantas. La invención también proporciona combinaciones de métodos y composiciones para controlar infestaciones de plagas invertebradas. Un medio proporciona los métodos y composiciones de ARNds descritos en la presente para proteger las plantas de la infestación de insectos junto con uno o más agentes insecticidas que exhiben diferentes características de aquéllas exhibidas por los métodos y composiciones de ARNds. Por ejemplo, cuando las proteínas Bt se proporcionan en la dieta de las plagas de insectos, se exhibe un modo de acción para controlar las plagas de insectos que es dramáticamente diferente del modo de acción de los métodos y composiciones de la presente invención. Una composición, ya sea formulada para la aplicación tópica o una derivada utilizando un procedimiento transgénico que combina los métodos y composiciones del ARNds con los métodos y composiciones de Bt, resulta en sinergias que no se conocían previamente en la técnica para controlar la infestación de insectos. Las plantas transgénicas que producen una o más moléculas de ARNds o ARNsi que inhiben alguna función biológica esencial en una plaga objetivo junto con una o más proteínas insecticidas B.t. que son tóxicas a la plaga objetivo proporcionan sinergias sorprendentes. Una sinergia es la reducción en el nivel de expresión requerido para el ARNds o la proteína Bt. Cuando se combinan, se requiere una dosis efectiva menor de cada agente de control de las plagas. Se cree que las proteínas insecticidas Bt crean poros de entrada a través de los cuales las moléculas de ARNds o ARNsi son capaces de penetrar de manera más efectiva en los espacios del intestino de la plaga de los insectos, o de manera más eficiente, en las células en la proximidad de lesiones creadas por las proteínas Bt, requiriendo por lo tanto menos de Bt o ARNds para alcanzar el resultado insecticida deseado o la inhibición deseada o la supresión de una función biológica objetivo en la plaga objetivo. Los inventores describen en la presente una pluralidad de invenciones, incluyendo un método para controlar las infestaciones de plagas invertebradas, proporcionando una dieta a una plaga invertebrada, un agente que comprende o que consiste de un ácido ribonucleico que funciona tras la ingestión por la plaga para inhibir la expresión de secuencia nucleotídica objetivo que está dentro de las células de la plaga. El ácido ribonucleico que se proporciona en la dieta, consiste de una secuencia ribonucleotídica que es, o que es complementaria a la secuencia nucleotídica objetivo. La secuencia ribonucleotídica se transcribe de la secuencia de ADN contigua que es al menos de aproximadamente 19 a aproximadamente 5000 nucleótidos de longitud y que se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO: 43, de la SEQ ID NO. 69 hasta la SEQ ID NO.174, y el complemento de las mismas. El método proporciona la construcción de una secuencia nucleotídica que puede utilizarse para expresar una molécula de ARN que puede ingerirse por la plaga en una dieta proporcionada a la plaga.

La dieta puede ser una dieta artificial formulada para cumplir con los requisitos nutritivos particulares para mantener a una plaga con tal dieta, y puede suplementarse con una cantidad que controla la plaga del ARN que se ha purificado a partir de un sistema de expresión separado, la suplementación de la dieta es con el propósito de determinar la cantidad que controla la plaga de la composición de ARN, o determinar uno o más ARN particulares construidos de manera específica para unirse o hibridarse en parte a una o más secuencias objetivo dentro de la plaga, que son funcionales para lograr alguna actividad supresora del gen tras la ingestión de la dieta suplementada por la plaga. La dieta también puede ser una célula recombinante transformada con una secuencia de ADN construida para la expresión del agente, el ARN, o el agente de supresión del gen. Tras la ingestión de una o más de tales células transformadas por la plaga, se observa un resultado genotípico o fenotípico deseado, indicando que el agente ha funcionado para inhibir la expresión de una secuencia nucleotídica objetivo que está dentro de las células de la plaga. La plaga invertebrada es de manera preferida un insecto, un arácnido, un nematodo, un platelminto, un asquelminto, una plaga micótica o cualquier otra plaga invertebrada para la cual la tecnología de supresión del gen es adecuada. De manera más preferida, la plaga invertebrada es una que es particularmente problemática en términos de infestación de animales o plantas. Más particularmente, la plaga invertebrada es un insecto o un nematodo o una plaga micótica que infesta de manera preferida plantas de cosechas, ornamentales y/o pastos.

Una secuencia de ADN que se selecciona para utilizarse en la expresión de un agente de supresión del gen de la presente invención es, de manera preferida al menos aproximadamente 19 a aproximadamente 5000 nucleótidos de longitud, y es al menos en parte sustancialmente idéntica en secuencia a la hebra sentido o antisentido de una secuencia objetivo presente en el ADN de una o más especies de la plaga objetivo particular. La frase "al menos en parte", pretende referirse al concepto de que la secuencia de ADN seleccionada para utilizarse en la expresión de un agente de supresión del gen puede construirse a partir de una sola secuencia derivada de una o más plagas objetivo y pretende utilizarse en la expresión de un ARN que funciona en la supresión de un solo gen o familia de genes en una o más plagas objetivo, o que la secuencia de ADN puede construirse como una quimera a partir de una pluralidad de secuencias de ADN. La pluralidad de secuencias de ADN puede derivarse cada una de una o más secuencias nucleotídicas de dentro de una sola plaga, o pueden derivarse de una o más secuencias nucleotídicas de una pluralidad de diferentes plagas. En particular, la secuencia seleccionada debe exhibir de aproximadamente 80 a aproximadamente 100% de identidad de la secuencia nucleotídica con una secuencia nucleotídica del ADN de la especie de la plaga. El ADN de la especie de la plaga puede identificarse aislando directamente el ADN de la especie de la plaga o mediante la identificación de las secuencias del ARN dentro de la especie de la plaga y la traducción inversa de las secuencias del ARN al ADN. El ADN que ejemplifica las secuencias de la especie de la plaga del gusano de la raíz del maíz se expone en la presente en el listado de las secuencias como la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143, la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, y los complementos de la misma. Las secuencias de ADN seleccionadas para utilizarse en la expresión de una molécula de ARN que suprime el gen, pueden incluirse en una composición polinucleotídica para utilizarse en una célula de planta. En particular, las secuencias de ADN pueden incorporarse en un vector para utilizarse para transformar el genoma de una célula de planta, y pueden incorporarse en un cásete de expresión que contiene al menos un promotor funcional de la planta, enlazado de manera operable a la secuencia de ADN seleccionada junto con cualquier otro elemento de control de la expresión deseado para alcanzar un nivel de expresión celular temporal o espacial apropiado en la planta. La introducción de la composición polinucleotídica en el genoma de una célula de la planta, proporciona una célula transformada que puede seleccionarse, con la condición de que los medios selectivos apropiados se hayan incluido junto con la composición polinucleotídica, y regenerarse en una planta recombinante transgénica. La planta transgénica, un evento, puede proporcionarse en la dieta de la plaga o plagas para alcanzar el control de una infestación de las plagas. La planta transgénica puede dar lugar a plantas de progenie, células de plantas y semillas, cada una que contiene la composición polinucleotídica. La presente invención proporciona un método para proteger una planta de la infestación de insectos, proporcionando a la plaga de insectos una o más de las células de la planta, cada una que expresa una molécula de ARN que suprime un gen de una secuencia de ADN que se selecciona del grupo que consiste de las secuencias ejemplificadas en la presente. La ingestión de las células de plantas que contienen el ARN que suprime el gen, el agente que controla la plaga o los insectos, resulta en la inhibición de una o más funciones biológicas en la plaga o el insecto. La presente invención proporciona una composición que contiene dos o más diferentes agentes plaguicidas, cada uno tóxico a la misma especie de plaga o insectos. Como se indica en la presente, uno de estos agentes plaguicidas puede ser una molécula de ARN que funciona para suprimir una función biológica esencial en una o más células de la plaga. Un segundo agente plaguicida puede incluirse junto con el primero. El segundo agente puede ser un segundo ARN que suprime el gen que es diferente del primero, o el segundo agente puede ser un agente seleccionado del grupo que consiste de una patatina, una proteína insecticida de Bacillus thuringiensis, una proteína insecticida de Xenorhabdus, una proteína insecticida de Photorhabdus, una proteína insecticida de Bacillus laterosporous, una proteína insecticida de Bacillus sphearicus, y una lignina. Una proteína insecticida de Bacillus thuringiensis puede ser cualquiera de varias proteínas insecticidas, incluyendo de manera no exclusiva, una Cry1 , una Cry3, una TIC851 , una CryET70, una Cry22, una proteína insecticida binaria CryET33 y CryET34, una proteína insecticida binaria CryET80 y CryET76, una proteína insecticida binaria TIC100 y TIC101 , una proteína insecticida binaria PS149B1 , una proteína insecticida VIP, una proteína TIC900 o relacionada, una TIC901 , TICI201 , TIC407, TIC417, y quimeras insecticidas de cualquiera de las proteínas insecticidas anteriores. El gen seleccionado para la supresión, o la función en una célula de la plaga o como un aspecto fisiológico o metabolico de la plaga que se permite por la expresión del gen seleccionado para la supresión, puede codificar una proteína esencial, la función predicha de la cual se selecciona del grupo que consiste de formación del músculo, formación de la hormona juvenil, regulación de la hormona juvenil, regulación y transporte iónico, síntesis de la enzima digestiva, mantenimiento del potencial de la membrana celular, biosíntesis de aminoácidos, degradación de aminoácidos, formación de esperma, síntesis de feromonas, detección de feromonas, formación de antenas, formación de alas, formación de patas, desarrollo y diferenciación, formación de huevos, maduración de la larva, formación de una enzima digestiva, síntesis de la hemolinfa, mantenimiento de la hemolinfa, neurotransmisión, división celular, metabolismo de la energía, respiración y apoptosis. Se prefiere que la secuencia de ADN seleccionada para construir el constructo de la supresión se derive del conjunto de las secuencias nucleotídicas en el listado de secuencias para la supresión de un gen del gusano de la raíz del maíz. Se considera que el método para controlar la infestación de las plagas invertebradas incluirá proporcionar en la dieta de la plaga invertebrada un agente, por ejemplo, una primera secuencia ribonucleotídica expresada de una primera secuencia de ADN que funciona tras la ingestión por la plaga para inhibir una función biológica dentro de la plaga, y que la primera secuencia de ADN exhibe de aproximadamente 85 a aproximadamente 100% de identidad de la secuencia nucleotídica con una secuencia codificante derivada de la plaga. La primera secuencia ribonucleotídica puede hibridarse a una segunda secuencia ribonucleotídica que es complementaria o sustancialmente complementaria a la primera secuencia ribonucleotídica, y la segunda secuencia ribonucleotídica se expresa de una segunda secuencia de ADN que corresponde a una secuencia codificante derivada de la plaga invertebrada, seleccionada de las secuencias expuestas en la presente en el listado de las secuencias, o los complementos de las mismas. Se prefiere que la primera y la segunda secuencias de ADN comprendan una secuencia contigua de identidad con una o más de las secuencias expuestas en el listado de las secuencias, y que sean de aproximadamente 14 a aproximadamente 25 o más nucleótidos contiguos. La invención funciona en lo óptimo cuando una dieta que contiene una cantidad de un agente insecticida que suprime un gen de la plaga, tal como una o más moléculas de ARN producidas de la expresión de una o más secuencias expuestas en la presente en el listado de secuencias, se proporciona a una plaga invertebrada que exhibe un pH del sistema digestivo que es de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 9.5, o de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 9.0, o de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 8.5, o de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0, o de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.0, o de aproximadamente 7.0.

Cualquiera de los métodos, ácidos nucleicos, ácidos ribonucleicos, secuencias ribonucleotídicas, composiciones, plantas, células de plantas, plantas de progenie, semillas, agentes para el control de insectos, agentes para el control de las plagas, casetes de expresión descritos en la presente, son funcionales opcionalmente cuando se proporcionan en una dieta para una o más plagas que comprenden tal pH del tracto digestivo. La dieta de la presente invención puede ser cualquier dieta suficiente para la plaga que incluya, de manera no exclusiva, una dieta o formulación artificial, una célula de planta, una pluralidad de células de planta, un tejido de planta, una raíz de una planta, una semilla de una planta y una planta crecida de una semilla de planta, en donde la dieta comprende una cantidad inhibidora de la plaga de una molécula de ARN codificada de una secuencia de ADN que es o es complementaria a, o que es sustancialmente o es sustancialmente complementaria a una o más contiguas, al menos de aproximadamente 19 a aproximadamente 5000 nucleótidos seleccionados de las secuencias nucleotídicas expuestas en el listado de secuencias, o seleccionadas de las secuencias nucleotídicas derivadas de una especie de plaga invertebrada particular. Los productos y/o composiciones de interés agronómica y comercialmente importantes incluyendo, de manera no exclusiva alimentos para animales, mercancías y productos y subproductos de maíz que están pretendidos para utilizarse como alimentos para consumo humano o para utilizarse en composiciones y mercancías que están pretendidas para consumo humano incluyendo, de manera no exclusiva harina de maíz, grano molido de maíz, jarabe de maíz, aceite de maíz, almidón de maíz, palomitas de maíz, tortas de maíz, cereales que contienen maíz y subproductos de maíz y lo similar, pretenden estar dentro del alcance de la presente invención si estos productos y composiciones de interés contienen cantidades detectables de las secuencias nucleotídicas expuestas en la presente como diagnóstico para cualquier evento transgénico que contiene tales secuencias nucleotídicas. Estos productos son útiles al menos debido a que es probable que se deriven de cosechas y productos que se propagan en campos que contienen menos plaguicidas y organofosfatos como resultado de su incorporación de los nucleótidos de la presente invención para controlar la infestación de plagas invertebradas en plantas. Tales mercancías y productos de mercancías, se producen de semillas producidas de una planta transgénica, en donde la planta transgénica expresa el ARN de uno o más nucleótidos contiguos de la presente invención o nucleótidos de una o más plagas invertebradas y los complementos de los mismos. Tales mercancías y productos de mercancías también pueden ser útiles para controlar plagas de invertebrados de tales mercancías y productos de mercancías, tales como por ejemplo, control de gorgojos de la harina, debido a la presencia en las mercancías o productos de mercancías del ARN supresor del gen de la plaga expresado de una secuencia génica como se expone en la presente invención.

La invención también proporciona un medio legible por computadora que tiene registrado en el mismo una o más de las secuencias nucleotídicas como se expone en la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 o en la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, como se expone en el listado de las secuencias, o los complementos de las mismas, para utilizarse en varias aplicaciones basadas en computadora, incluyendo de manera no exclusiva, identidad del ADN y búsqueda de similitud, identidad de la proteína y búsqueda de similitud, caracterizaciones de perfilado de la transcripción, comparaciones entre genomas y análisis de hibridación artificial.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Lo siguiente es una descripción detallada de la invención proporcionada para ayudar a aquellos con experiencia en la técnica a practicar la presente invención. Aquellos de experiencia ordinaria en la técnica pueden hacer modificaciones y variaciones en las modalidades descritas en la presente sin apartarse del espíritu o alcance de la presente invención. Los inventores han descubierto en la presente que, de manera contraria a las enseñanzas en la técnica anterior, la alimentación de una composición que contiene moléculas de ARN de doble hebra que consisten de secuencias encontradas dentro de una o más secuencias nucleotídicas expresadas de una especie invertebrada, a las especies invertebradas de las cuales se obtuvieron las secuencias nucleotídicas, resulta en la inhibición de una o más funciones biológicas dentro de las especies invertebradas. Particularmente, los inventores han descubierto que la alimentación de las moléculas de ARN de doble hebra que consisten de secuencias de ARN de gusano de la raíz del maíz respectivamente, a gusanos de la raíz del maíz resulta en la muerte o inhibición del desarrollo y diferenciación de los gusanos de la raíz del maíz que ingieren estas composiciones. Los inventores han identificado la secuencia nucleotídica de miles de secuencias de ADNc obtenidas de cada una de las especies de plagas invertebradas. Las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de ADNc se dedujeron y compararon a todas las secuencias de aminoácidos conocidas. Muchas de las secuencias de ADNc se predijeron para codificar las proteínas que tienen alguna información de anotación asociada con las mismas. La información de anotación que está asociada con una secuencia nucleotídica particular y la secuencia de proteína codificada de la misma, se basa en la homología o similitud entre las secuencias de aminoácidos deducidas a través de la traducción de las secuencias de ADNc descritas en la presente como se expone en las secuencias de aminoácidos que se conocen en la técnica en bases de datos disponibles al público. Las secuencias de aminoácidos deducidas expuestas en la presente, fueron comparadas con BLASTX contra todas las secuencias de aminoácidos conocidas, y las funcionalidades probables de cada una de las secuencias de aminoácidos deducidas se asignaron basándose en los resultados de la alineación. Las secuencias de ADNc que codifican las proteínas o partes de proteínas conocidas en la técnica como esenciales para la supervivencia, tales como las secuencias de aminoácidos involucradas en varias trayectorias bioquímicas metabólicas o catabólicas, división celular, reproducción, metabolismo de la energía, digestión, función neurológica y lo similar, se seleccionaron para utilizarse en la preparación de las moléculas de ARN de doble hebra que se proporcionaron en la dieta de una plaga invertebrada. Como se describe en la presente, la ingestión por una plaga objetivo de las composiciones que contienen uno o más ARNds, al menos un segmento de los cuales corresponde a al menos un segmento sustancialmente idéntico de ARN producido en las células de las plagas objetivo, resultó en la muerte, atrofia, u otra inhibición de la plaga objetivo. Estos resultados indicaron que una secuencia nucleotídica, ya sea de ADN o ARN, derivada de una plaga invertebrada, puede utilizarse para construir un hospedero recombinante de la plaga o un simbionte que es un objetivo para la infestación por la plaga. El hospedero de la plaga o el simbionte puede transformarse para que contenga una o más de las secuencias nucleótídicas derivadas de la plaga invertebrada. La secuencia nucleotídica transformada en el hospedero de la plaga o el simbionte, codifica uno o más ARN que forman una secuencia de ARNds en las células o fluidos biológicos dentro del hospedero transformado o el simbionte, haciendo así el ARNds disponible en la dieta de la plaga si/cuando la plaga se alimenta del hospedero transgénico o el simbionte, resultando en la supresión de la expresión de uno o más genes en las células de la plaga y finalmente en la muerte, atrofia u otra inhibición de la plaga. La presente invención se relaciona generalmente con el control genético de infestaciones de plagas invertebradas en organismos hospederos. Más particularmente, la presente invención incluye los métodos para suministrar los agentes para el control de las plagas a una plaga invertebrada. Tales agentes para el control de las plagas causan, de manera directa o indirecta, una disminución en la capacidad de la plaga para mantenerse a sí misma, crecer o infestar de otra manera un hospedero o simbionte objetivo. La presente invención proporciona métodos para emplear moléculas de ARNds estabilizadas en la dieta de la plaga como un medio para la supresión de los genes seleccionados en la plaga, alcanzando así un control deseado de las infestaciones de la plaga en, o alrededor del hospedero o simbionte seleccionado por la plaga. Las plantas transgénicas pueden producirse utilizando los métodos de la presente invención que expresan las moléculas de ARNds o ARNsi estabilizadas recombinantes. Para lograr lo anterior, la presente invención proporciona un método para inhibir la expresión de un gen objetivo en una plaga invertebrada, y en particular, en el gusano de la raíz del maíz Occidental (WCR) o en otras especies de insectos coleópteros, resultando en el cese de la alimentación, crecimiento, desarrollo, reproducción, infectividad y finalmente puede resultar en la muerte de la plaga. El método comprende introducir parcial o completamente moléculas nucleotídicas de ARN de doble hebra estabilizadas (ARNds) o sus formas modificadas, tales como moléculas de ARN ¡nterfiriente pequeño (ARNsi) en composiciones nutritivas en las que la plaga se basa como la fuente de alimento, y haciendo disponible la composición nutritiva a la plaga para alimentación. La ingestión de la composición nutritiva que contiene las moléculas de doble hebra o de ARNsi resulta en la captación de las moléculas por las células de la plaga, resultando en la inhibición de la expresión de al menos un gen objetivo en las células de la plaga. La inhibición del gen objetivo ejerce un efecto dañino en la plaga. Las moléculas de ARNds o las moléculas de ARNsi consisten de secuencias nucieotídicas como se expone en cualquiera de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 y la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO: 74, la inhibición de las cuales resulta en la reducción o el retiro de un agente de una secuencia nucleotídica o una proteína que es esencial para el crecimiento y el desarrollo de la plaga u otra función biológica. La secuencia nucleotídica seleccionada exhibe de aproximadamente 80% a al menos aproximadamente 100% de identidad de la secuencia con una de las secuencias nucieotídicas como se expone en la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 y la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO: 174, como se expone en el listado de las secuencias, o el complemento de las mismas. Tal inhibición es específica en que re elige una secuencia nucleotídica de una porción del gen objetivo, del cual se transcribe el ARNds o el ARNsi inhibidor. El método es efectivo para inhibir la expresión de al menos un gen objetivo y puede utilizarse para inhibir muchos diferentes tipos de genes objetivo en la plaga.

La presente invención también proporciona diferentes formas de agentes para el control de las plagas para lograr la reducción deseada en la infestación de la plaga. En una forma, los agentes para el control de las plagas comprenden moléculas de ARNds. En otra forma, los agentes para el control de las plagas comprenden moléculas de ARNsi. En aún otra forma, los agentes para el control de las plagas comprenden constructos de ADN recombinante que pueden utilizarse para transformar de manera estable microorganismos o plantas, permitiendo que los microbios o plantas transformados codifiquen las moléculas de ARNds o ARNsi. En otra forma, los agentes para el control de las plagas son microbios que contienen los constructos de ADN recombinante que codifican las moléculas de ARNds o ARNsi. Los pares de las secuencias nucleotídicas aisladas y purificadas se proporcionan de la biblioteca de ADNc y/o la información de la biblioteca genómica. Los pares de las secuencias nucleotídicas se derivan de cualquier plaga invertebrada preferida para utilizarse como los cebadores de la amplificación térmica para generar las moléculas de ARNds y ARNsi de la presente invención. La presente invención proporciona constructos de ADN recombinantes para utilizarse para lograr la transformación estable de objetivos de plagas de hospederos o simbiontes particulares. Los objetivos de la plaga de los hospederos o simbiontes transformados expresan niveles plaguicidamente efectivos de las moléculas preferidas de ARNds o ARNsi de los constructos de ADN recombinantes, y proporcionan las moléculas en la dieta de la plaga. La presente invención también proporciona, como un ejemplo de un organismo objetivo de la plaga de un hospedero transformado o simbionte, células de plantas transformadas y plantas transformadas y su progenie. Las células de plantas transformadas y las plantas transformadas expresan una o más de las secuencias de ARNds o ARNsi de la presente invención de una o más de las secuencias de ADN como se expone en la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 y la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, como se expone en el listado de las secuencias, o el componente de las mismas. Como se utiliza en la presente, las palabras "supresión del gen", cuando se toman juntas, pretenden referirse a cualquiera de los métodos bien conocidos para reducir los niveles de proteína producida como resultado de la transcripción del gen al ARNm y la traducción posterior del ARNm. La supresión del gen también pretende significar la reducción de la expresión de la proteína de un gen o una secuencia codificante incluyendo la supresión del gen postranscripcional y la supresión transcripcional. La supresión del gen postranscripcional es mediada por la homología entre todo o parte de un ARNm transcrito de un gen o secuencia codificante seleccionado para la supresión y el ARN de doble hebra correspondiente utilizado para la supresión, y se refiere a la reducción sustancial y mensurable de la cantidad de ARNm disponible en la célula para unirse a los ribosomas. El ARN transcrito puede utilizarse puede utilizarse en la orientación sentido para efectuar lo que se llama la supresión antisentido o en ambas orientaciones, produciendo un ARNds para efectuar lo que se llama el ARN de interferencia (ARNi). La supresión transcripcional está mediada por la presencia en la célula de un ARNds, un agente de supresión del gen, que exhibe una identidad de la secuencia sustancial a una secuencia de ADN promotor o el complemento de la misma, para efectuar lo que se refiere como una supresión trans del promotor. La supresión del gen puede ser efectiva contra un gen nativo de la planta asociado con un rasgo, por ejemplo, para proporcionar a las plantas niveles reducidos de una proteína codificada por un gen nativo o con niveles mejorados o reducidos de un metabolito afectado. La supresión del gen también puede ser efectiva contra los genes objetivo en las plagas de las plantas que pueden ingerir o entrar en contacto con el material de la planta que contiene los agentes de supresión del gen, diseñados específicamente para inhibir o suprimir la expresión de una o más secuencias homologas o complementarias en las células de la plaga. La supresión del gen postranscripcional mediante el ARN orientado antisentido o sentido para regular la expresión del gen en las células de las plantas se describe en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,107,065, 5,759,829, 5,283,184 y 5,231 ,020. El uso del ARNds para suprimir los genes en las plantas se describe en la WO 99/53050, WO 99/49029, la Publicación de la Solicitud de Patente de E.U.A. No. 2003/0175965 y 2003/0061626, las Solicitudes de Patente de E.U.A. No. 10/465,800, y las Patentes de E.U.A. No. 6,506,559 y 6,326,193.

Un método preferido de supresión del gen postranscripcional en las plantas emplea tanto ARN transcrito orientado sentido como orientado antisentido, que está estabilizado, por ejemplo, como una estructura de horquilla y tallo y espira. Un constructo de ADN preferido para efectuar la supresión del gen postranscripcional es uno en el cual un primer segmento codifica un primer segmento que codifica un ARN que exhibe una orientación antisentido que exhibe una identidad sustancial con un segmento de un gen seleccionado para la supresión, que está enlazado a un segundo segmento que codifica un ARN que exhibe una complementariedad sustancial con el primer segmento. Se esperaría que tal constructo formara una estructura de tallo y espira mediante la hibridación del primer segmento con el segundo segmento, y una estructura de espira de las secuencias nucleotídicas que une los dos segmentos (véanse la WO94/01550, WO98/05770, US 2002/0048814 y la US 2003/0018993). Como se utiliza en la presente, el término "ácido nucleico", se refiere a un polímero de una sola hebra o de doble hebra de bases desoxirribunocleotídicas o ribonucleotídicas leídas del extremo 5' al 3'. El "ácido nucleico" puede también contener opcionalmente bases nucleotídicas no naturales o alteradas que permiten la lectura correcta a través, mediante una polimerasa y no reducen la expresión de un polipéptido codificado por ese ácido nucleico. El término "secuencia nucleotídica" o "secuencia de ácido nucleico", se refiere a las hebras sentido y antisentido del ácido nucleico como hebras sencillas individuales o en el dúplex. El término "ácido ribonucleico" (ARN) es inclusivo del ARNi (ARN inhibidor), ARNds (ARN de doble hebra), ARNsi (ARN interfiriente pequeño), ARNm (ARN mensajero), ARNmi (micro ARN), ARNt (ARN de transferencia, ya sea cargado o descargado con un aminoácido acilado correspondiente), y ARNc (ARN complementario) y el término "ácido desoxirribonucleico" (ADN), es inclusivo del ADNc y el ADN genómico y los híbridos de ADN-ARN. Las palabras "segmento de ácido nucleico", "segmento de la secuencia nucleotídica" o más generalmente "segmento", se entenderán por aquellos con experiencia en la técnica como un término funcional que incluye tanto secuencias genómicas, secuencias de ARN ribosomal, secuencias de ARN de transferencia, secuencias de ARN mensajero, secuencias de operón y secuencias nucleotídicas diseñadas más pequeñas que expresan o pueden adaptarse para expresar proteínas, polipéptidos o péptidos. Como se utiliza en la presente, el término "plaga", se refiere a insectos, arácnidos, crustáceos, hongos, bacterias, virus, nemátodos, gusanos planos, gusanos redondos, oxiuros, uncinarias, tenias, tripanosomas, esquistosomas, moscardones, pulgas, garrapatas, ácaros y piojos y lo similar que son penetrantes en el medio ambiente humano y que pueden ingerir o entrar en contacto con una o más células, tejidos o fluidos producidos por un hospedero o simbionte de la plaga, transformado para expresar o recubierto con un agente de supresión del gen de doble hebra o que pueden ingerir material de la planta que contiene el agente de supresión del gen. Como se utiliza en la presente, un rasgo de "resistencia a la plaga" es una característica de una planta transgénica, un animal transgénico, un hospedero transgénico o un simbionte transgénico que causa que la planta, el animal, el hospedero, o el simbionte sean resistentes al ataque de una plaga que típicamente es capaz de infligir daño o pérdida a la planta, animal, hospedero o simbionte. Tal resistencia a las plagas puede surgir de una mutación natural o más típicamente de una incorporación del ADN recombinante que confiere resistencia a la plaga. Para impartir resistencia a los insectos a una planta transgénica, un ADN recombinante puede, por ejemplo, codificar una proteína inhibidora del insecto o letal para el insecto, tal como una endotoxina delta derivada de la bacteria B. thuringiensis, por ejemplo, como se utiliza en las variedades comercialmente disponibles de algodón y maíz, o transcribirse en una molécula de ARN que forma una molécula de ARNds dentro de los tejidos o fluidos de la planta recombinante. La molécula de ARNds está comprendida en parte de un segmento de ARN que es idéntico a un segmento de ARN correspondiente codificado de una secuencia de ADN dentro de una plaga de insectos que prefiere alimentarse de la planta recombinante. La expresión del gen dentro de la plaga del insecto objetivo es suprimida por el ARNds, y la supresión de la expresión del gen en la plaga del insecto objetivo resulta en que la planta es resistente al insecto. Fire et al. (Patente de E.U.A. No. 6,506,599), describieron genéricamente la inhibición de la infestación de plagas, proporcionando especificaciones sólo sobre varias secuencias nucleotídicas que eran efectivas para la inhibición de la función génica en las especies de nemátodos Caenorhabditis elegans. De manera similar, Plaetinck et al. (US 2003/0061626), describen el uso del ARNds para inhibir la función del gen en una variedad de plagas de nemátodos. Mesa et al. (US 2003/0150017), describen el uso de secuencias de ADNds para transformar las células hospederas para expresar secuencias de ARNds correspondientes que son sustancialmente idénticas a las secuencias objetivo en patógenos específicos, y describen particularmente la construcción de plantas recombinantes que expresan tales secuencias de ARNds para la ingestión por varias plagas de plantas, facilitando la desregulación de un gen en el genoma de la plaga y mejorando la resistencia de la planta a la infestación de la plaga. La presente invención proporciona la inhibición de la expresión del gen de uno o más genes objetivo en un insecto objetivo utilizando los métodos de ARNds estabilizado. La invención es particularmente útil en la modulación de la expresión de un gen eucariótico, en particular la modulación de la expresión de genes presentes en insectos que exhiben un nivel de pH del sistema digestivo que es de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 9.5, de manera más preferida de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0, y aún de manera más preferida de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5. Las plagas de plantas con un sistema digestivo que exhibe niveles de pH fuera de estos intervalos, no son candidatos preferidos para los métodos mediados por el ARN de doble hebra para la supresión del gen utilizando un método de suministro que requiera la ingestión de las moléculas de ARNds preferidas. El efecto modulador es aplicable a una variedad de genes expresados en las plagas incluyendo, por ejemplo, genes endógenos responsables del metabolismo celular o la transformación celular, incluyendo genes de mantenimiento, factores de transcripción y otros genes que codifican polipéptidos involucrados en el metabolismo celular. Como se utiliza en la presente, el término "expresión" se refiere a la transcripción y la acumulación estable del ARN sentido o antisentido derivado de los ácidos nucleicos descritos en la presente invención. La expresión también puede referirse a la traducción del ARNm en un polipéptido o proteína. Como se utiliza en la presente, el término ARN "sentido" se refiere a un transcripto de ARN que corresponde a una secuencia o segmento que cuando se produce por la plaga objetivo, está en la forma de un ARNm que es capaz de ser traducido en una proteína por la célula de la plaga objetivo. Como se utiliza en la presente, el término "ARN antisentido", se refiere a un transcripto de ARN que es complementario a todo o una parte de un ARNm que se produce normalmente en una célula de una plaga objetivo. La complementariedad de un ARN antisentido puede ser con cualquier parte del transcripto del gen específico, es decir, en la secuencia no codificante 5', la secuencia no traducida 3', intrones o la secuencia codificante. Como se utiliza en la presente, el término "transcripto de ARN" se refiere al producto que resulta de la transcripción catalizada por la ARN polimerasa de una secuencia de ADN. Cuando el transcripto de ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, se refiere como en transcripto primario o puede ser una secuencia de ARN derivada de un procesamiento postranscripcional del transcripto primario y se refiere como el ARN maduro.

Como se utiliza en la presente, la frase "inhibición de la expresión del gen" o "que inhibe la expresión de un gen objetivo en la célula de un insecto", se refiere a la ausencia (o disminución observable) en el nivel de proteína y/o producto del ARNm del gen objetivo. La especificidad se refiere a la capacidad para inhibir al gen objetivo sin efectos manifiestos en otros genes de la célula y sin ningún efecto en ningún gen dentro de la célula que está produciendo la molécula de ARNds. La inhibición de la expresión del gen del gen objetivo en la plaga de insecto puede resultar en rasgos fenotípicos novedosos en la plaga de insectos. Sin limitar el alcance de la presente invención, se proporciona, en un aspecto, un método para controlar la infestación de un insecto objetivo, utilizando las estrategias de ARNds estabilizado. El método involucra generar moléculas de ARNds estabilizadas como un tipo de agentes de control de insectos para inducir el silenciamiento de los genes en una plaga de insectos. Los agentes para el control de los insectos de la presente invención inducen de manera directa o indirecta los eventos se silenciamiento del gen postranscripcional de genes objetivo en el insecto. La desregulación de la expresión del gen objetivo evita o al menos retarda el crecimiento, desarrollo, reproducción e infectividad de los insectos a los hospederos. Como se utiliza en la presente, la frase "generando una molécula de ARNds estabilizada", se refiere a los métodos que emplean tecnologías de ADN recombinante fácilmente disponibles en la técnica (por ejemplo, por Sambrook, et al., En: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Edición, Coid Spring Harbor Press, Coid Spring Harbor, New York, 1989), para construir una secuencia nucleotídica de ADN que transcribe el ARNds estabilizado. Los métodos de construcción detallados de la presente invención se describen a continuación en esta descripción. Como se utiliza en la presente, el término "silenciar", se refiere a la "desregulación" efectiva de la expresión de la secuencia nucleotídica objetivo y, por lo tanto, la eliminación de la capacidad de la secuencia para causar un efecto dentro de la célula de los insectos. La presente invención proporciona en parte, un sistema de suministro para el suministro de los agentes para el control de los insectos a los insectos, a través de su exposición a una dieta que contiene los agentes para el control de los insectos de la presente invención. De acuerdo con una de las modalidades, las moléculas de ARNds o ARNsi estabilizado pueden incorporarse en la dieta de los insectos o pueden superponerse en la parte superior de la dieta para el consumo por un insecto. La presente invención también proporciona en parte, un sistema de suministro para el suministro de los agentes para el control de los insectos a los insectos, a través de su exposición a un microorganismo o un hospedero, tal como una planta que contiene los agentes para el control de los insectos de la presente invención, mediante la ingestión de los microorganismos o las células hospederas o el contenido de las células. De acuerdo con otra de más modalidades, la presente invención involucra generar una célula de planta o una planta transgénica que contiene un constructo de ADN recombinante que transcribe las moléculas de ARNds estabilizadas de la presente invención. Como se utiliza en la presente, la frase "generando una célula de planta o una planta transgénica", se refiere a los métodos que emplean las tecnologías de ADN recombinante fácilmente disponibles en la técnica (por ejemplo, por Sambrook, et al.), para construir un vector de transformación de una planta que transcribe las moléculas de ARNds estabilizadas de la presente invención, para transformar la célula de la planta o la planta, y para generar la célula de planta transgénica o la planta transgénica que contiene las moléculas de ARNds transcrito estabilizadas. En particular, el método de la presente invención puede comprender el constructo recombinante en una célula de una planta, que resulta en transcriptos de ARNds que son sustancialmente homólogos a una secuencia de ARN codificada por una secuencia nucleotídica dentro del genoma de un insecto. En donde la secuencia nucleotídica dentro del genoma de un insecto codifica un gen esencial para la viabilidad e infectividad del insecto, su desregulación resulta en una capacidad reducida del insecto para sobrevivir e infectar las células hospederas. Por lo tanto, tal desregulación resulta en un "efecto dañino" en el mantenimiento de la viabilidad e infectividad del insecto, en que evita o reduce la capacidad del insecto para alimentarse y sobrevivir con los nutrientes derivados de las células hospederas. En virtud de esta reducción en la viabilidad de infectividad del insecto, la resistencia y/o tolerancia aumentada a la infección por un insecto se facilita en las células de una planta. Los genes en el insecto pueden seleccionarse en las etapas madura (adulto), inmadura (larvaria), o de huevo.

En aún otra modalidad, pueden utilizarse cepas no patogénicas atenuadas de microorganismos como un portador para los agentes para el control de los insectos y, en esta perspectiva, los microorganismos que portan tales agentes también son referidos como los agentes para el control de los insectos. Los microorganismos pueden diseñarse para expresar una secuencia nucleotídica de un gen objetivo para producir moléculas de ARN que comprenden secuencias de ARN homologas o complementarias a las secuencias de ARN encontradas típicamente dentro de las células de un insecto. La exposición de los insectos a los microorganismos, resulta en la ingestión de los microorganismos y la desregulación de la expresión de los genes objetivo mediada directa o indirectamente por las moléculas de ARN o fragmentos o derivados de las mismas. La presente invención proporciona de manera alterna la exposición de un insecto a los agentes para el control de los insectos de la presente invención, incorporados en un mezclador de rocío y aplicados a la superficie de un hospedero, tal como una planta hospedera. En una modalidad ejemplar, la ingestión de los agentes para el control de los insectos por un insecto, suministra los agentes para el control de los insectos al intestino del insecto, y en consecuencia, a las células dentro del cuerpo del insecto. En otra modalidad, la infección del insecto por los agentes para el control de los insectos a través de otros medios tales como mediante inyección u otros métodos físicos, también permite el suministro de los agentes para el control de los insectos. En aún otra modalidad, las moléculas de ARN mismas están encapsuladas en una matriz sintética tal como un polímero, y se aplican a la superficie de un hospedero tal como una planta. La ingestión de las células hospederas por un insecto permite el suministro de los agentes para el control de los insectos al insecto, y resulta en la desregulación de un gen objetivo en el hospedero. Se considera que las composiciones de la presente invención pueden incorporarse dentro de las semillas de una especie de plantas, ya sea como un producto de expresión de un gen recombinante incorporado en un genoma de las células de la planta, o incorporadas en un recubrimiento o tratamiento de la semilla que se aplica a la semilla antes de la plantación. La célula de planta que contiene un gen recombinante se considera en la presente como un evento transgénico. Se cree que un tratamiento para la semilla plaguicida puede proporcionar ventajas significativas cuando se combina con un evento transgénico que proporciona protección de la infestación de plagas invertebradas que está dentro del intervalo de efectividad preferida contra una plaga objetivo. Además, se cree que hay situaciones que son bien conocidas por aquellos que tienen experiencia en la técnica, en donde es ventajoso obtener tales eventos transgénicos dentro del intervalo preferido de efectividad. La presente invención también incluye semillas y plantas que tienen más de un evento transgénico. Tales combinaciones se refieren como eventos transgénicos "apilados". Estos eventos transgénicos apilados pueden ser eventos que están dirigidos a la misma plaga objetivo, o pueden dirigirse a diferentes plagas objetivo. En un método preferido, una semilla que tiene la capacidad de expresar una proteína Cry 3 o una variante insecticida de la misma, también tiene la capacidad de expresar al menos otro agente insecticida, incluyendo de manera no exclusiva, una proteína que es diferente de una proteína Cry 3 y/o una molécula de ARN, la secuencia del cual se deriva de la secuencia de un ARN expresado en una plaga objetivo, y que forma una estructura de ARN de doble hebra tras expresarse en la semilla o las células de una planta que crece de la semilla, en donde la ingestión de una o más de las células de la planta por la plaga objetivo resulta en la supresión de la expresión del ARN en las células de la plaga objetivo. En otro método preferido, la semilla que tiene la capacidad de expresar un ARNds, la secuencia del cual se deriva de una plaga objetivo también tiene un evento transgénico que proporciona tolerancia a los herbicidas. Se prefiere que el evento transgénico que proporciona la tolerancia a los herbicidas, sea un evento que proporcione resistencia al glifosato, N-(fosfonometil)glic¡na, incluyendo la forma de la sal de ¡sopropilamina de tal herbicida. En el presente método, una semilla que comprende un evento transgénico se trata con un plaguicida. Se cree que la combinación de una semilla transgénica que exhibe bioactividad contra una plaga objetivo como resultado de la producción de una cantidad insecticida de un ARNds insecticida dentro de las células de la semilla o planta transgénica que crece de la semilla acoplada con el tratamiento de la semilla con ciertos plaguicidas químicos o proteínas, proporciona ventajas sinergísticas inesperadas a las semillas que tienen tal tratamiento, incluyendo ineficacia inesperadamente superior para la protección contra el daño a la planta transgénica resultante por la plaga objetivo. En particular, se cree que el tratamiento de una semilla transgénica que es capaz de expresar ciertos constructos que forman las moléculas de ARNds, la secuencia de la cual se deriva de una o más secuencias expresadas en un gusano de la raíz del maíz, con de aproximadamente 100 gm a aproximadamente 400 gm de ciertos plaguicidas por 100 kg de semilla, proporciona protección inesperadamente superior contra el gusano de la raíz del maíz. Además, se cree que tales combinaciones también son efectivas para proteger las plantas emergentes de maíz contra el daño por la oruga nocturna negra. También se cree que las semillas de la presente invención tienen la propiedad de disminuir el costo del uso del plaguicida, debido a que pueden utilizarse menos plaguicida para obtener una cantidad requerida de protección que si no se utiliza la composición y el método innovador. Además, debido a que se utiliza menos plaguicida y debido a que se aplica antes de la plantación y sin una aplicación separada del campo, se cree que el método objeto es por lo tanto más seguro para el operador y para el medio ambiente, y es potencialmente menos caro que los métodos convencionales. Cuando se dice que algunos efectos son "sinergísticos", se quiere decir que incluyen los efectos sinergísticos de la combinación de la actividad plaguicida (o eficacia) de la combinación del evento transgénico y el plaguicida. Sin embargo, no se pretende que tales efectos sinergísticos se limiten por la actividad plaguicida, sino que también deben incluir tales ventajas inesperadas como el alcance incrementado de la actividad, el perfil ventajoso de la actividad relacionado con el tipo y cantidad de reducción del daño, costo disminuido del plaguicida y la aplicación, distribución disminuida del plaguicida en el medio ambiente, exposición disminuida del plaguicida del personal que produce, maneja y planta semillas de maíz, y otras ventajas conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. Los plaguicidas e insecticidas que son útiles en las composiciones en combinación con los métodos y composiciones de la presente invención, incluyendo los tratamientos y recubrimientos de las semillas, así como los métodos para utilizar tales composiciones pueden encontrarse, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. No. 6,551 ,962, la totalidad de la cual se incorpora en la presente como referencia. Se ha encontrado que la presente invención es útil para proteger las semillas y plantas contra un amplio arreglo de plagas agrícolas, incluyendo insectos, ácaros, hongos, levaduras, mohos, bacterias, nemátodos, malezas, y plantas parasitarias y saprofíticas. Se prefiere que los tratamientos y recubrimientos de las semillas descritos en la presente se utilicen junto con las semillas transgénicas de la presente invención, en particular mediante la aplicación de un agente plaguicida diferente a las moléculas de ARNds derivadas de las secuencias descritas en la presente, como expone en la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 y la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO: 74, como se expone en el listado de las secuencias, o los complementos de las mismas a la semilla transgénica. Aunque se cree que los tratamientos de la semilla pueden aplicarse a una semilla transgénica en cualquier estado fisiológico, se prefiere que la semilla esté en un estado suficientemente durable que no incurra en daño durante el procedimiento de tratamiento. Típicamente, la semilla sería una semilla que se ha recolectado del campo; se ha retirado de una planta transgénica y se ha separado de cualquier otro material de la planta que no es de semilla. La semilla de manera preferida sería también biológicamente estable al grado de que el tratamiento no causaría daño biológico a la semilla. En una modalidad, por ejemplo, el tratamiento puede aplicarse a la semilla del maíz que se ha recolectado, limpiado y secado a un contenido de humedad por debajo de aproximadamente 15% en peso. En una modalidad alterna, la semilla puede ser una que se ha secado y a continuación cebado con agua y/u otro material, y a continuación rehidratado antes o durante el tratamiento con el plaguicida. Dentro de las limitaciones apenas descritas, se cree que el tratamiento puede aplicarse a la semilla en cualquier momento entre la recolección de la semilla y el sembrado de la semilla. Como se utiliza en la presente, el término "semilla no sembrada", pretende incluir una semilla en cualquier periodo entre la recolección de la semilla y el sembrado de la semilla en la tierra para el propósito de germinación y crecimiento de la planta.

Cuando se dice que la semilla no sembrada está "tratada" con el plaguicida, tal tratamiento no pretende incluir aquellas prácticas en las cuales el plaguicida se aplica al suelo, más que la semilla. Por ejemplo, tales tratamientos como la aplicación del plaguicida en bandas, bandas en "T" o en surco, al mismo tiempo que la semilla se siembra, no se consideran como incluidos en la presente invención. El plaguicida, o combinación de plaguicidas, puede aplicarse "puro", es decir, sin ninguna dilución o componentes adicionales presentes. Sin embargo, el plaguicida se aplica típicamente a las semillas en la forma de una formulación plaguicida. Esta comulación puede contener uno o más componentes deseables, incluyendo, de manera no exclusiva, diluyentes líquidos, aglutinantes para servir como una matriz para el plaguicida, rellenos para proteger las semillas durante las condiciones de agresión, y plastificantes para mejorar la flexibilidad, adhesión y/o dispersabilidad del recubrimiento. Además, para las formulaciones plaguicidas oleosas que contienen poco o ningún relleno, puede ser deseable agregar a la formulación agentes secantes tales como carbonato de calcio, caolín o arcilla de bentonita, perlita, tierra diatomácea o cualquier otro material adsorbente. El uso de tales componentes en los tratamientos de la semilla se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 5,876,739. El experto con experiencia puede seleccionar fácilmente los componentes deseables para utilizarse en la formulación plaguicida dependiendo del tipo de la semilla a ser tratada y del plaguicida particular que se selecciona. Además, pueden utilizarse formulaciones comerciales fácilmente disponibles de plaguicidas conocidos, como se demuestra en los ejemplos siguientes. Los plaguicidas objeto pueden aplicarse a la semilla como un componente de un recubrimiento de la semilla. Los métodos y composiciones de recubrimiento de la semilla que son conocidos en la técnica, son útiles cuando se modifican mediante la adición de una de las modalidades de la combinación de plaguicidas de la presente invención. Tales métodos y aparatos de recubrimiento para su aplicación se describen en, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 5,918,413, 5,891 ,246, 5,554,445, 5,389,399, 5,107,787, 5,080,925, 4,759,945 y 4,465,017. Las composiciones de recubrimiento de la semilla se describen, por ejemplo, en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,939,356, 5,882,713, 5,876,739, 5,849,320, 5,834,447, 5,791 ,084, 5,661 ,103, 5,622,003, 5,580,544, 5,328,942, 5,300,127, 4,735,015, 4,634,587, 4,383,391 , 4,372,080, 4,339,456, 4,272,417 y 4,245,432, entre otras. Los plaguicidas que son útiles en los recubrimientos son aquellos plaguicidas que se describen en la presente. La cantidad de plaguicida que se utiliza para el tratamiento de la semilla variará dependiendo del tipo de semilla y del tipo de ingredientes activos, pero el tratamiento comprenderá poner en contacto las semillas con una cantidad de la combinación de los plaguicidas que es plaguicidamente efectiva. Cuando los insectos son la plaga objetivo, la cantidad será la cantidad del insecticida que es insecticidamente efectiva. Como se utiliza en la presente, una cantidad insecticidamente efectiva significa aquella cantidad de insecticida que destruirá las plagas de insectos en el estado de crecimiento de las larvas o pupas, o que reducirá o retardará de manera consistente la cantidad de daño producido por las plagas de insectos. En general, la cantidad de plaguicida que se aplica a las semillas en el tratamiento, variará de aproximadamente 10 gm a aproximadamente 2000 gm del ingrediente activo del plaguicida por 100 kg del peso de la semilla. De manera preferida, la cantidad del plaguicida estará dentro del intervalo de aproximadamente 50 gm a aproximadamente 1000 gm de ingrediente activo por 100 kg de semilla, de manera más preferida dentro del intervalo de aproximadamente 100 gm a aproximadamente 600 gm del ingrediente activo por 100 kg de semilla, y aún de manera más preferida dentro del intervalo de aproximadamente 200 gm a aproximadamente 500 gm del ingrediente activo por 100 kg en peso de semilla. De manera alterna, se ha encontrado que se prefiere que la cantidad del plaguicida sea de aproximadamente 60 gm del ingrediente activo del plaguicida por 100 kg de la semilla, y de manera más preferida de aproximadamente 80 gm por 100 kg de semilla. Los plaguicidas que se utilizan en el tratamiento no deben inhibir la germinación de la semilla y deben ser eficaces para proteger la semilla y/o la planta durante el tiempo en el ciclo de vida del insecto objetivo, en el cual causa lesión a la semilla o planta. En general, el recubrimiento será eficaz durante aproximadamente 0 a 120 días después de la siembra.

Los plaguicidas de la invención objeto pueden aplicarse a la semilla en la forma de un recubrimiento. El uso de un recubrimiento es particularmente efectivo para acomodar cargas altas de plaguicida, que pueden requerirse para tratar plagas típicamente difíciles de tratar, tales como el gusano de la raíz del maíz, mientras que al mismo tiempo evitan la fototoxicidad inaceptable debido a la carga plaguicida incrementada. Los recubrimientos formados con una composición plaguicida contemplados en la presente son capaces, de manera preferida, de efectuar una velocidad de liberación lenta del plaguicida mediante difusión o movimiento a través de la matriz al medio circundante. Además de la capa de recubrimiento, la semilla puede tratarse con uno o más de los siguientes ingredientes: otros plaguicidas incluyendo fungicidas y herbicidas; protectores herbicidas; fertilizantes y/o agentes de biocontrol. Estos ingredientes pueden agregarse como una capa separada, o de manera alterna pueden agregarse en la capa de recubrimiento del plaguicida. La formulación plaguicida puede aplicarse a las semillas utilizando técnicas y máquinas de recubrimiento convencionales, tales como técnicas de lecho fluidizado, el método de molino de rodillos, tratadores de semillas rotostáticos y recubridores de tambor. Otros métodos, tales como lechos con chorros pueden también ser útiles. Las semillas pueden preseleccionarse por tamaño antes del recubrimiento. Después del recubrimiento, las semillas se secan típicamente, y a continuación se transfieren a una máquina seleccionadora del tamaño para la selección del tamaño. Tales procedimientos se conocen en la técnica. Como se utiliza en la presente, el término "agente para el control de los insectos", o "agente para la supresión del gen", se refiere a una molécula de ARN particular que consiste de un primer segmento de ARN y un segundo segmento de ARN enlazados por un tercer segmento de ARN. El primer y el segundo segmentos de ARN caen en la longitud de la molécula de ARN y son sustancialmente repeticiones invertidas uno del otro, y están enlazados juntos por el tercer segmento de ARN. La complementariedad entre el primer y el segundo segmentos de ARN resulta en la capacidad de los dos segmentos para hibridarse in vivo e in vitro para formar una molécula de doble hebra, es decir, un tallo, enlazado junto a un extremo de cada uno del primer y el segundo segmentos por el tercer segmento que forma una espira, de manera que toda la estructura forma una estructura de tallo y espira, o incluso estructuras que se hibridan más estrechamente, pueden formar una estructura enlazada de tallo-espira. El primer y el segundo segmentos corresponden de manera invariable y no respectivamente a una secuencia sentido y una antisentido con respecto al ARN objetivo transcrito del gen objetivo en la plaga del insecto objetivo que es suprimida por la ingestión de la molécula de ARNds. El agente para el control de los insectos también puede ser una molécula de ácido nucleico sustancialmente purificado (o aislado) y más específicamente, moléculas de ácido nucleico o moléculas de un fragmento de ácido nucleico del mismo de un ADN genómico (ADNg) o una biblioteca de ADNc. De manera alterna, los fragmentos pueden comprender oligonucleótidos más pequeños que tienen de aproximadamente 15 a aproximadamente 250 residuos nucleotídicos, y de manera más preferida, aproximadamente 15 a aproximadamente 30 residuos nucleotídicos. El "agente para el control de los insectos" puede también referirse a un constructo de ADN que comprende las moléculas de ácido nucleico aisladas y purificadas o moléculas de un fragmento de ácido nucleico del mismo de un ADNg o una biblioteca de ADNc. El "agente para el control de los insectos" puede referirse además a un microorganismo que comprende tal constructo de ADN que comprende las moléculas de ácido nucleico purificadas y aisladas o las moléculas de un fragmento de ácido nucleico del mismo de un ADNg o una biblioteca de ADNc. Como se utiliza en la presente, la frase "generar un agente para el control de los insectos", se refiere a los métodos que emplean las tecnologías de ADN recombinante fácilmente disponibles en la técnica (por ejemplo, por Sambrook, et al.), para preparar un constructo de ADN recombinante que transcribe las moléculas de ARNds o ARNsi estabilizado, para construir un vector que transcribe las moléculas de ARNds o ARNsi estabilizado y/o para transformar y generar las células de los microorganismos que contienen las moléculas de ARNds o ARNsi transcrito, estabilizado. El método de la presente invención proporciona la producción del transcripto de ARNds, la secuencia nucleotídica del cual es sustancialmente homologa a una secuencia de ARN objetivo codificada por una secuencia nucleotídica objetivo dentro del genoma de una plaga de insecto objetivo.

Como se utiliza en la presente, el término "genoma" como se aplica a las células de un insecto o un hospedero, abarca no sólo el ADN cromosomal encontrado dentro del núcleo, sino el ADN de organelo encontrado dentro de los componentes subcelulares de la célula. El ADN de la presente invención introducido en las células de plantas puede, por lo tanto, estar integrado cromosomalmente o localizado en el organelo. El término "genoma", como se aplica a las bacterias, abarca tanto el cromosoma como a los plásmidos dentro de la célula hospedera bacteriana. El ADN de la presente invención introducido en las células hospederas bacterianas puede, por lo tanto, estar integrado cromosomalmente o localizado en el plásmido. La inhibición de la expresión del gen objetivo puede cuantificarse midiendo ya sea el ARN objetivo endógeno de la proteína producida por la traducción del ARN objetivo y las consecuencias de la inhibición pueden confirmarse por el examen de las propiedades externas de la célula u organismo. Las técnicas para cuantificar el ARN y las proteínas son bien conocidas por alguien con experiencia en la técnica. Están disponibles múltiples marcadores seleccionares que confieren resistencia a la ampicilina, bleomicina, cloramfenicol, gentamicina, higromicina, canamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, espectinomicina, rifampicina y tetraciclina y lo similar. En ciertas modalidades preferidas, la expresión del gen se inhibe por al menos 10%, de manera preferida, por al menos 33%, de manera más preferida por al menos 50%, y aún de manera más preferida por al menos 80%. En las modalidades particularmente preferidas de la invención, la expresión del gen se inhibe por al menos 80%, de manera más preferida por al menos 90%, de manera más preferida por al menos 95%, o por al menos 99% dentro de las células en los insectos, de manera que tiene lugar una inhibición significativa. La inhibición significativa pretende referirse a una inhibición suficiente que resulta en un fenotipo detectable (por ejemplo, cese del crecimiento de la larva, parálisis o mortalidad, etc.), o una disminución detectable en el ARN y/o la proteína que corresponde al gen objetivo que se inhibe. Aunque en ciertas modalidades de la invención, la inhibición ocurre en sustancialmente todas las células del insecto, en otras modalidades preferidas, la inhibición ocurre en sólo un subconjunto de las células que expresan el gen. Por ejemplo, si el gen a ser inhibido juega un papel esencial en las células en el tracto alimenticio del insecto, la inhibición del gen dentro de estas células es suficiente para ejercer un efecto dañino en el insecto. Las ventajas de la presente invención pueden incluir, de manera no exclusiva, lo siguiente: la facilidad para introducir el ARNds en las células del insecto, la baja concentración del ARNds o el ARNsi que puede utilizarse, la estabilidad del ARNds o el ARNsi, y la efectividad de la inhibición. La capacidad para utilizar una baja concentración de un ARNds estabilizado evita las desventajas de la interferencia antisentido. La presente invención no está limitada al uso in vitro o a composiciones de secuencia específica, a un conjunto particular de genes objetivo, una porción particular de la secuencia nucleotídica del gen objetivo o un transgen particular o a un método de suministro particular, en oposición a algunas de las técnicas conocidas en el campo, tal como el antisentido y la cosupresión. Además, la manipulación genética se vuelve posible en organismos que no son modelos genéticos clásicos. En la práctica de la presente invención, es importante que la presencia de las secuencias nucleotídicas que se transcriben del constructo recombinante no sean dañinas a las células de la planta en las cuales se expresan de acuerdo con la invención, ni dañinas a una cadena alimenticia del animal y en particular a los humanos. Debido a que el producto de la planta puede hacerse disponible para la ingestión humana, la desregulación de la expresión de la secuencia nucleotídica objetivo ocurre sólo en el insecto. Por lo tanto, con el fin de lograr la inhibición de un gen objetivo de manera selectiva dentro de una especie de insecto que se desea controlar, el gen objetivo debe exhibir de manera preferida un bajo grado de la identidad de la secuencia con los genes correspondientes en una planta o un animal vertebrado. De manera preferida, el grado de identidad de la secuencia es menor de aproximadamente 80%. De manera más preferida, el grado de identidad de las secuencia es menor que aproximadamente 70%. De manera más preferida, el grado de identidad de la secuencia es menor que aproximadamente 60%. De acuerdo con una modalidad de la presente invención, se proporciona una secuencia nucleotídica, para la cual la expresión in vitro resulta en la transcripción de una secuencia de ARN estabilizado que es sustancialmente homologa a una secuencia de ARN de un gen seleccionado en un insecto que comprende una secuencia de ARN codificada por una secuencia nucleotídica dentro del genoma del insecto. Así, después de que el insecto ingiere la secuencia de ARN estabilizado incorporada en una dieta o rociada en una superficie de la planta, se efectúa una desregulación de la secuencia nucleotídica que corresponde al gen objetivo en las células de un insecto objetivo. La secuencia nucleotídica desregulada en el insecto resulta en un efecto dañino en el mantenimiento, viabilidad, proliferación, reproducción e infectividad del insecto. Por lo tanto. La secuencia nucleotídica de la presente invención puede ser útil para modular o controlar la infestación por una variedad de insectos. De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, se proporciona una secuencia nucleotídica, la expresión de la cual en una célula microbiana resulta en una transcripción de una secuencia de ARN que es sustancialmente homologa a una molécula de ARN de un gen seleccionado en un insecto, que comprende una secuencia de ARN codificada por una secuencia nucleotídica dentro del genoma del insecto. Así, después de que el insecto ingiere la secuencia de ARN estabilizado contenido en la célula del microorganismo, efectuará la desregulación de la secuencia nucleotídica del gen objetivo en las células del insecto. La secuencia nucleotídica desregulada en el insecto resulta en un efecto dañino en el mantenimiento, viabilidad, proliferación, reproducción e infestación del insecto. Por lo tanto, la secuencia nucleotídica de la presente invención puede ser útil para modular o controlar la infestación por una variedad de insectos. De acuerdo con aún otra modalidad de la presente invención, se proporciona una secuencia nucleotídica, la expresión de la cual en una célula de una planta resulta en una transcripción de una secuencia de ARN que es sustancialmente homologa a una molécula de ARN de un gen seleccionado en un insecto, que comprende una secuencia de ARN codificada por una secuencia nucleotídica dentro del genoma del insecto. Así, después de que el insecto ingiere la secuencia del gen estabilizado contenida en la célula de la planta, efectuará la desregulación de la secuencia nucleotídica del gen objetivo en las células del insecto. La secuencia nucleotídica desregulada en el insecto resulta en un efecto dañino en el mantenimiento, viabilidad, proliferación, reproducción e infestación del insecto. Por lo tanto, la secuencia nucleotídica de la presente invención puede ser útil para modular o controlar la infestación por una variedad de insectos en las plantas. Como se utiliza en la presente, el término "sustancialmente homologa" u "homología sustancial", con referencia a una secuencia de ácido nucleico, se refiere a una secuencia nucleotídica que se híbrida bajo condiciones rigurosas a una secuencia codificante como se expone en cualquiera de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 o en cualquiera de la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, como se expone en el listado de las secuencias o los complementos de las mismas. Las secuencias que se hibridan bajo condiciones rigurosas a cualquiera de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 o cualquiera de la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174 como se expone en el listado de las secuencias, o los complementos de las mismas, son aquellas que permiten que tenga lugar una alineación antiparalela entre las dos secuencias, y las dos secuencias son capaces entonces, bajo condiciones rigurosas, de formar enlaces de hidrógeno, con las bases correspondientes en la hebra opuesta para formar una molécula dúplex que es suficientemente estable, bajo las condiciones rigurosas, para ser detectable utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Tales secuencias sustancialmente homologas tienen de manera preferida de aproximadamente 65% a aproximadamente 70% de identidad de la secuencia o de manera más preferida de aproximadamente 80% a aproximadamente 85% de identidad de la secuencia, o de manera más preferida de aproximadamente 90% a aproximadamente 95% de identidad de la secuencia, a aproximadamente 99% de identidad de la secuencia, a las secuencias nucleotídicas de referencia como se expone en cualquiera de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 o en cualquiera de la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174 como se expone en el listado de las secuencias, o los complementos de las mismas. Como se utiliza en la presente, el término "identidad de la secuencia", "similitud de la secuencia" u "homología", se utiliza para describir las relaciones de la secuencia entre dos o más secuencias nucleotídicas. El porcentaje de "identidad de la secuencia" entre dos secuencias se determina comparando dos secuencias alineadas de manera óptima sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico idéntico o un residuo de aminoácido ocurre en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones que corresponden, dividiendo el número de posiciones que corresponden entre el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de la secuencia. Una secuencia que es idéntica en cada posición en comparación con una secuencia de referencia se dice que es idéntica a la secuencia de referencia y viceversa. Se dice que una primera secuencia nucleotídica cuando se observa en la dirección 5' a 3' es un "complemento de", o complementaria a, una segunda secuencia nucleotídica o de referencia observada en la dirección 3' a 5' si la primera secuencia nucleotídica exhibe complementariedad completa con la segunda secuencia o de referencia. Como se utiliza en la presente, se dice que las moléculas de la secuencia de ácidos nucleicos exhiben "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las secuencias leída de 5' a 3' es complementario con cada nucleótido de la otra secuencia cuando se lee de 3' a 5'. Una secuencia nucleotídica que es complementaria a una secuencia nucleotídica de referencia exhibirá una secuencia idéntica a la secuencia complementaria inversa de la secuencia nucleotídica de referencia. Estos términos y descripciones están bien definidos en la técnica y son fácilmente entendidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Como se utiliza en la presente, una "ventana de comparación" se refiere a un segmento porcentual de al menos 6 posiciones continuas, de al menos aproximadamente 50 a aproximadamente 100, más usualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en el cual una secuencia se compara a una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que dos secuencias se alinean de manera óptima. La ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos) de aproximadamente 20% o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. Aquellos con experiencia en la técnica deben referirse a los métodos detallados para usarse en la alineación de la secuencia en el paquete de programas Wisconsin Genetics Versión 7.0, Grupo Genetics Computer, 575 Science Drive Madison, Wis., EUA) o referirse a Ausubel et al. (1998) para una discusión detallada del análisis de la secuencia. El gen objetivo de la presente invención se deriva de una célula de insecto o de manea alterna, un gen extraño tal como una secuencia genética extraña de un virus, un hongo, un insecto o un nematodo entre otros. Por "derivado" se pretende que una secuencia es toda o una parte de la secuencia nucleotídica natural del gen objetivo del genoma de una célula de insecto, particularmente toda o una parte de la secuencia nucleotídica natural del ARNm coronado, empalmado y poliadenilado expresado de la secuencia de ADN natural como se encuentra en la célula si el gen es un gen estructural, o la secuencia de todo o una parte de un ARN que es diferente de un gen estructural, incluyendo de manera no exclusiva, un ARNt, un ARN catalítico, un ARN ribosomal, un micro ARN y lo similar. Una secuencia se deriva de una de estas secuencias de ARN naturales, si la secuencia derivada se produce basándose en la secuencia nucleotídica del ARN nativo, exhibe de aproximadamente 80% a aproximadamente 100% de identidad de la secuencia con la secuencia nativa, y se híbrida a la secuencia nativa bajo condiciones de hibridación rigurosa. En una modalidad, el gen objetivo comprende una secuencia nucleotídica como se expone en cualquiera de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 o en cualquiera de la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, como se expone en el listado de las secuencias o los complementos de las mismas. Dependiendo del gen objetivo particular y de la dosis de las moléculas de ARNds suministradas, este procedimiento puede proporcionar una pérdida parcial o completa de la función del gen objetivo, o cualquiera de un nivel deseado de supresión intermedio. La presente invención también proporciona una secuencia de ADN artificial capaz de expresarse en una célula o microorganismo que es capaz de inhibir la expresión del gen objetivo en una célula, tejido u órgano de un insecto, en donde la secuencia artificial del ADN comprende al menos una molécula de ADNds que codifica una o más secuencias nucleotídicas diferentes, en donde cada una de las diferentes secuencias nucleotídicas comprende una secuencia nucleotídica sentido y una secuencia nucleotídica antisentido conectadas por una secuencia separadora que codifica una molécula de ARNds de la presente invención. La secuencia separadora constituye parte de la secuencia nucleotídica o la secuencia nucleotídica antisentido y se formará entro de ía molécula de ARNds entre Ja secuencia sentido y antisentido. La secuencia nucleotídica sentido o la secuencia nucleotídica antisentido es sustancialmente idéntica a la secuencia nucleotídica del gen objetivo o un derivado de la misma o una secuencia complementaria de la misma. La molécula de ADNds se coloca de manera operable bajo el control de una secuencia promotora que funciona en la célula, el tejido o el órgano del hospedero que expresa el ADNds para producir moléculas de ARNds. En una modalidad, le secuencia de ADN puede derivarse de una secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 o en la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174 como se expone en el listado de la secuencia. La invención también proporciona una secuencia de ADN para la expresión en una célula de una planta, en la que, tras la expresión del ADN al ARN y la ingestión por una plaga objetivo, logra la supresión de un gen objetivo en una célula, tejido o un órgano de una plaga de insectos. El ARNds comprende al menos una o múltiples secuencias estructurales del gen, en donde cada una de las secuencias estructurales del gen comprende una secuencia nucleotídica sentido y una secuencia nucleotídica antisentido conectadas por una secuencia separadora que forma una espira dentro de las secuencias complementaria y antisentido. La secuencia nucleotídica sentido o la secuencia nucleotídica antisentido es sustancialmente idéntica a la secuencia nucleotídica del gen objetivo, derivada de la misma, o un secuencia complementaria de la misma. La una o más secuencias estructurales del gen se colocan de manera operable bajo el control de una o más secuencias promotoras, al menos una de las cuales es operable en la célula, tejido u órgano del organismo procariótico o eucariótico, particularmente un insecto. En una modalidad, la secuencia de ADN artificial comprende de aproximadamente la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143, o de aproximadamente la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174 como se expone en el listado de las secuencia o los complementos de las mismas. Como se utiliza en la presente, el término "gen no natural", "secuencias codificantes no naturales", "secuencia artificial" o "secuencias codificantes sintéticas" para transcribir el ARNds o el ARNsi de la presente invención o fragmentos de los mismos, se refieren a aquéllos preparados de una manera que involucra cualquier clase de aislamiento o manipulación genética que resulta de la preparación de una secuencia codificante que transcriba un ARNds o un ARNsi de la presente invención o fragmentos de los mismos. Esto incluye el aislamiento de la secuencia codificante de su estado natural, la manipulación de la secuencia codificante mediante (1 ) la inserción, supresión o sustitución nucleotídica, (2) la inserción, supresión o sustitución del segmento, (3) síntesis química como química de la fosforamidita y lo similar, mutagénesis específica del sitio, truncamiento de la secuencia codificante o cualquiera otro método de manipulación o de aislamiento. La secuencia del gen no natural o el fragmento del mismo de acuerdo con este aspecto de la invención para el control del WCR, puede clonarse entre los promotores específicos del tejido, tales como dos promotores específicos de la raíz que son operables en una célula de planta transgénica y expresados en la misma para producir ARNm en la célula de la planta transgénica que forma las moléculas de ARNds de la misma. Las moléculas de ARNds contenidas en los tejidos de la planta se ingieren por un insecto de manera que se alcanza la supresión pretendida del gen objetivo. La presente invención también proporciona un método para obtener un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica para producir un ARNds o un ARNsi de la presente invención. En una modalidad preferida, el método de la presente invención para obtener un ácido nucleico comprende: (a) sondear una biblioteca de ADNc o ADNg con una sonda de hibridación que comprende toda o una porción de la secuencia nucleotídica o un homólogo de la misma de un insecto seleccionado; (b) identificar una clona de ADN que se híbrida con una sonda de hibridación; (c) aislar la clona de ADN identificada en el paso (b); y (d) secuenciar el fragmento de ADNc o ADNg que comprende la clona aislada en el paso (c) en donde la molécula de ácido nucleico secuenciada transcribe toda o una porción sustancial del ácido nucleotídico del ARN o un homólogo de la misma.

En una modalidad preferida, el método de la presente para obtener un fragmento de ácido nucleico comprende una secuencia nucleotídica para producir una porción sustancial de un ARNds o un ARNsi de la presente invención que comprende: (a) sintetizar un primer y un segundo cebadores oligonucleotídicos que corresponden a una porción de una de las secuencias nucleotídicas se un insecto seleccionado; y (b) amplificar un inserto de ADNc o ADNg presente en un vector de clonación utilizando el primer y segundo cebadores oligonucleotídicos del paso (a) en donde el ácido nucleico amplificado transcribe una porción sustancial de la porción sustancial de un ARNds o un ARNsi de la presente invención. En la práctica de la presente invención, un gen objetivo puede derivarse de un gusano de la raíz del maíz (CRW), tal como un WCR o un SCR, o cualquier especie de insectos que cause daño a las plantas de cosechas y en consecuencia pérdidas del rendimiento. Los inventores de la presente contemplan que varios criterios pueden ser empleados en la selección de los genes objetivo preferidos. El gen es uno cuyo producto de la proteína tiene una velocidad de recambio rápida, de manera que la inhibición del ARNds resultará en una disminución rápida de los niveles en una proteína. En ciertas modalidades es ventajoso seleccionar un gen para el cual una pequeña caída en el nivel de expresión resulta en niveles dañinos para el insecto. Si se desea seleccionar una amplia gama de especies de insectos, se selecciona un gen que está altamente conservado a través de estas especies. De manera inversa, para el propósito de la especificidad conferida, en ciertas modalidades de la invención, se selecciona un gen que contiene regiones que están conservadas de manera deficiente entre especies individuales de insectos, o entre insectos y otros organismos. En ciertas modalidades, puede ser deseable seleccionar un gen que no tiene homólogos conocidos en otros organismos. Como se utiliza en la presente, el término "derivado de" se refiere a una secuencia nucleotídica especifica que puede obtenerse de una fuente o especie especificada particular, auque no necesariamente de manera directa de la fuente o especie especificada. En una modalidad, se selecciona un gen que se expresa en el intestino del insecto. La selección de genes expresados en el intestino evita el requisito de que el ARNds se disperse dentro del insecto. Los genes objetivo para utilizarse en la presente invención pueden incluir, por ejemplo, aquéllos que comparten homologías sustanciales con las secuencias nucleotídicas de los genes conocidos expresados en el intestino, que codifican los componentes de la proteína de la V-ATPasa del protón de la membrana del plasma (Dow et al., 1997, J. Exp. Biol., 200:237-245; Dow, Bioenerg. Biomemb., 1999, 31 :75-83). Este complejo de la proteína es el único energizante del transporte del ion epitelial y es responsable de la alcalinización del lumen del intestino medio. La V-ATPasa también se expresa en el túbulo Malpighiano, una excrescencia del intestino posterior del insecto que funciona en el equilibrio de los fluidos y la detoxificación de los compuestos extraños de una manera análoga al órgano del riñon de un mamífero. En otra modalidad, se selecciona un gen que está involucrado esencialmente en el crecimiento, desarrollo y reproducción de insecto. Los genes ejemplares incluyen de manera no exclusiva un gen CHD3 y un gen de ß-tubulina. El gen de CHD3 en Drosophila melanogaster codifica una proteína con actividad de la helicasa dependiente de ATP que se involucra en el montaje/desmontaje de la cromatina en el núcleo. Se han encontrado secuencias similares en diversos organismos tales como Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans, y Saccharomyces cerevisiae. La familia del gen de la beta-tubulina codifica las proteínas asociadas con el microtúbulo que son un constituyente del citoesqueleto celular. Las secuencias relacionadas se encuentran en tales organismos diversos como Caenorhabditis elegans, y Manduca Sexta. Otros genes objetivo para utilizarse en la presente invención pueden incluir, por ejemplo, aquéllos que juegan papeles importantes en la viabilidad, crecimiento, desarrollo, reproducción e infectividad. Esos genes objetivo pueden ser uno de los genes de mantenimiento, factores de transcripción y genes específicos del insecto, o mutaciones nulas letales en Drosophila. Los genes objetivo para utilizarse en la presente invención también pueden ser aquéllos que son de otros organismos, por ejemplo, de un nematodo (por ejemplo, C. elegans). Además, las secuencias nucleotídicas para utilizarse en la presente invención pueden también derivarse de genes de planta, virales, bacterianos o de hongos, cuyas funciones se han establecido de la literatura y las secuencias nucleotídicas de los cuales, comparten una similitud sustancial con los genes objetivo en el genoma de un insecto. De acuerdo con un aspecto de la presente invención para el control del WCR, las secuencias objetivo pueden derivarse esencialmente del insecto WCR seleccionado. Algunas de las secuencias objetivo ejemplares de la biblioteca de ADNc de WCR que codifican las proteínas de D. v. virgifera o fragmentos de las mismas que son homólogos de proteínas conocidas, pueden encontrarse en el Listado de las Secuencias. Se conocen moléculas del ácido nucleico de los homólogos de proteínas conocidas que codifican a D. virgifera (Andersen 40 et al., Solicitud de Patente de E.U.A. No. de Serie 10/205,189). Aunque las secuencias descritas en Andersen et al. son principalmente con referencia a WCR, se prefiere en la práctica de la invención utilizar segmentos de ADN cuyas secuencias exhiben al menos de aproximadamente 80% de identidad o al menos aproximadamente 90% de identidad, o al menos aproximadamente 95% de identidad, o al menos aproximadamente 98% de identidad, o al menos aproximadamente 100% de identidad con las secuencias que corresponden a secuencias codificantes dentro de la plaga para la cual se desea el control. Secuencias menores que aproximadamente 80% idénticas a un gen objetivo son menos efectivas. La inhibición es específica al gen o genes de las plagas, la secuencia de los cuales corresponde al ARNds. La expresión de los genes no relacionados no se afecta. Esta especificidad permite la identificación selectiva de las especies de plagas, resultando en ningún efecto de otros organismos expuestos a las composiciones de la presente invención. Un segmento de ADN para utilizarse en la presente invención es al menos de aproximadamente 19 a aproximadamente 23, o de aproximadamente 100 nucleótidos, pero menos que aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. La invención no está limitada a los genes específicos descritos en la presente, pero abarcan cualquier gen, la inhibición de la cual ejerce un efecto dañino en una plaga de insectos. Para muchos de los insectos que son objetivos potenciales para el control por la presente invención, puede haber una información limitada con respecto a la mayoría de los genes o el fenotipo que resulta de la mutación de los genes particulares. Por lo tanto, los presentes inventores contemplan que la selección de los genes apropiados de las plagas de insectos para utilizarse en la presente invención, puede lograrse a través del uso de la información disponible del estudio de los genes correspondientes en un organismo modelo tal como la Drosophila, en algunas otras especies de insectos, o incluso en especies de nemátodos, en especies de hongos, en especies de plantas, en los cuales los genes se han caracterizado. En algunos casos, será posible obtener la secuencia de un gen correspondiente de un insecto objetivo buscando bases de datos tales como GenBank, utilizando ya sea el nombre del gen o la secuencia de por ejemplo, Drosophila, otro insecto, un nematodo, un hongo, o una planta de la cual se ha clonado el gen. Una vez que la secuencia se obtiene, puede utilizarse la PCR para amplificar un segmento seleccionado de manera apropiada del gen en el insecto para utilizarse en la presente invención. Con el fin de obtener un segmento de ADN del gen correspondiente en una especie de insectos, los cebadores de la PCR se diseñan basándose en la secuencia tal como se encuentra en el WCR u otros insectos de las cuales se ha clonado el gen. Los cebadores se diseñan para amplificar un segmento de ADN de suficiente longitud para utilizarse en la presente invención. El ADN (ya sea ADN genómico o ADNc) se prepara de las especies de insecto, y los cebadores de PCR son utilizados para amplificar el segmento de ADN. Las condiciones de amplificación se seleccionan de manera que la amplificación ocurrirá incluso si los cebadores no coinciden de manera exacta con la secuencia objetivo. De manera alterna, el gen (o una porción del mismo) puede clonarse de una biblioteca de ADNg o ADNc preparada de la especie de plaga de insectos, utilizando el gen del WCR u otro gen de insecto conocido como una sonda. Las técnicas para realizar la PCR y la clonación de bibliotecas se conocen. Los detalles adicionales del proceso mediante el cual los segmentos de ADN de las especies de plagas de insecto objetivo pueden aislarse basándose en las secuencias de genes previamente clonados de WCR u otras especies de insectos se proporcionan en los Ejemplos. Alguien con experiencia en la técnica reconocerá que puede usarse una variedad de técnicas para aislar los segmentos del gen de las especies de plagas de insectos que corresponden a los genes aislados previamente de otras especies. Los insectos que pueden causar daño en las plantas pertenecen generalmente a tres categorías basadas en sus métodos de alimentación y estas tres categorías son, respectivamente, insectos masticadores, succionadores y perforadores, que pertenecen a las Ordenes Coleóptera, Lepidoptera, Díptera, Orthoptera, Heteroptera, Ctenophalides, Arachnidiae e Hymenoptera. Los insectos masticadores que comen tejido de plantas, tales como raíces, hojas, flores, brotes y ramitas, causan el mayor daño. Los ejemplos de esta gran categoría de insectos incluyen escarabajos y sus larvas. WCR y SCR pertenecen a los insectos masticadores. Sus larvas se alimentan de las raíces de plantas, en particular, una planta de maíz, y los adultos principalmente del follaje. Los genes derivados de WCR o SCR o de cualquier otra especie de los órdenes listados anteriormente pueden considerarse como objetivos para realizar la presente invención. Se ha encontrado que el presente método es útil para proteger semillas y plantas contra una amplia gama de plagas agrícolas, incluyendo insectos, ácaros, hongos, levaduras, mohos, bacterias, nemátodos, malezas, y plantas parasitarias y saprofíticas y lo similar. Cuando un insecto es la plaga objetivo de la presente invención, tales plagas incluyen, de manera no exclusiva: del orden de los Lepidópteros, por ejemplo, Aclerís spp., Adoxophyes spp., Aegeria spp., Agrotis spp., Alabama argillaceae, Amylois spp., Anticarsia gemmatalis, Archips spp, Argyrotaenia spp., Autographa spp., Busseola fusca, Cadra cautella, Carposina nipponensis, Chilo spp., Chiritstoneura spp., Clysia ambiguella, Cnaphalocrocis spp., Cnephasia spp., Cochylis spp., Coleophora spp., Crocidolomia binotalis, Cryptophlebia leucotreta, Cydia spp., Diatraea spp., Diparopsis castanea, Earias spp., Ephestia spp., Eucosma spp., Eupoeciiia ambiguella, Euproctis spp., Euxoa spp., Grapholita spp., Hedya nubiferana, Heliothis spp., Hellula undalis, Hyphantria cunea, Keifería lycopersicella, Leucoptera scitella, Lithocollethis spp., Lobesia botrana, Lymantria spp., Lyonetia spp., Malacosama spp., Mamestra brassicae, Manduca sexta, Operophtera spp., Ostrinia Nubilalis, Pammene spp., Pandemis spp., Panolis flammea, Pectinophora gossypiella, Phthorimaea operculella, Pieris rapae, Pieris spp., Plutella xylostella, Prays spp., Scirpophaga spp., Sesamia spp., Sparganothis spp., Spodoptera spp., Synanthedon spp., Thaumetopoea spp., Tortrix spp., Trichoplusia ni e Yponomeuta spp.; del orden de los Coleópteros, por ejemplo, Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Erermnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. y Trogodenna spp.; del orden de los Ortópteros, por ejemplo, Blatta spp., Blattella spp., Gryllotalpa spp., Leucophaea maderae, Locusta spp., Periplaneta ssp. y Schistocerca spp.; del orden de los Isópteros, por ejemplo, Reticulitemes ssp; del orden de los Psocópteros, por ejemplo, Liposcelis spp.; del orden Anoplura, por ejemplo, Haematopinus spp., Linognathus spp., Pediculus spp., Pemphigus spp. y Phylloxera spp.; del orden de los Malófagos, por ejemplo, Damalinea spp. y Trichodectes spp.; del orden de los Tisanópteros, por ejemplo, Franklinella spp., Hercinothrips spp., Taeniothríps spp., Thrips palmi, Thrips tabaci y Scirtothrips aurantii; del orden de los Heterópteros, por ejemplo, Cimex spp., Distantiella theobroma, Dysdercus spp., Euchistus spp., Eurygaster spp., Leptocorisa spp., Nezara spp., Piesma spp., Rhodnius spp., Sahlbergella singularis, Scotinophara spp., Triatoma spp., familia de Miridae spp., tales como Lygus hesperus y Lygus lineolorís, familia de Lygaeidae spp., tal como Blissus leucopterus, y familia de Pentatomidae spp.; del orden de los Homópteros, por ejemplo, Aleurothrixus floccosus, Aleyrodes brassicae, Aonidiella spp., Aphididae, Aphis spp., Aspidiotus spp., Bemisia tabaci, Ceropiaster spp., Chrysomphalus aonidium, Chrysomphalus dictyospenni, Coccus hesperídum, Empoasca spp., Eriosoma larigerum, Erythroneura spp., Gascardia spp., Laodelphax spp., Lacanium corni, Lepidosaphes spp., Macrosiphus spp., Myzus spp., Nehotettix spp., Nilaparvata spp., Paratoria spp., Pemphigus spp., Planococcus spp., Pseudaulacaspis spp., Pseudococcus spp., Psylla ssp., Pulvinaria aethiopica, Quadraspidiotus spp., Rhopalosiphum spp., Saissetia spp., Scaphoideus spp., Schizaphis spp., Sitobion spp., Trialeurodes vaporariorum, Trioza erytreae y Unaspis citri, del orden de los Himenópteros, por ejemplo, Acromyrmex, Atta spp., Cephus spp., Diprion spp., Diprionidae, Gilpinia polytoma, Hoplocampa spp., Lasius sppp., Monomorium pharaonis, Neodipríon spp, Solenopsis spp. y Vespa ssp.; del orden de los Dípteros, por ejemplo, Aedes spp., Antherigona soccata, Bibio hortulanus, Calliphora erythrocephala, Cerarítis spp., Chrysomyia spp., Culex spp., Cuterebra spp., Dacus spp., Drosophila melanogaster, Fannia spp., Gastrophilus spp., Glossina spp., Hypoderma spp., Hyppobosca spp., Liriomysa spp., Lucilia spp., Melanagromyza spp., Musca ssp., Oestrus spp., Orseolia spp., Oscinella frit, Pegomyia hyoscyami, Phorbia spp., Rhogoletis pomonella, Sciara spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tannia spp. y Típula spp., del orden de los Sifonápteros, por ejemplo, Ceratophyllus spp. y Xenopsylla cheopis y del orden Tisanura, por ejemplo, Lepisma saccharina. Se ha encontrado que la presente invención es particularmente efectiva cuando la plaga de insectos es Diabrotíca spp., y especialmente cuando la plaga es Diabrotíca virgifera virgifera (Gusano de la Raíz del Maíz Occidental, WCR), Diabrotíca barben (Gusano de la Raíz del Maíz Norteño, NCR), Diabrotíca virgifera zeae (Gusano de la Raíz del Maíz Mexicano, MCR), Diabrotíca balteata (Gusano de la Raíz del Maíz Brasileño (BZR) o complejo del Gusano de la Raíz del Maíz Brasileño (BCR), que consiste de Diabrotíca viridula y Diabrotíca speciosa), o Diabrotíca undecimpunctata howardii (Gusano de la Raíz del Maíz Sureño, SCR). La presente invención también es particularmente efectiva para controlar especies de insectos que perforan y/o succionan los fluidos de las células y los tejidos de plantas incluyendo, de manera no exclusiva, insectos fétidos (especies de la familia Pentatomidae), e insectos de plantas en la familia Miridae, tales como los insectos de plantas manchadas occidentales (especie Lygus hesperus), insectos de plantas manchadas (especie Lygus lineolaris), e insectos de legumbres pálidas (Lygus elisus). Las modificaciones de los métodos descritos en la presente también son, de manera sorprendente, particularmente útiles para controlar las plagas de las cosechas dentro del orden de los lepidópteros.

La presente invención proporciona moléculas de ARNds o ARNsi estabilizadas para controlar las infestaciones de insectos. Las secuencias nucleotídicas de ARNds o ARNsi comprenden hebras dobles de ribonucleótidos polimerizados y pueden incluir modificaciones en la cadena principal de fosfato-azúcar o al nucleósido. Las modificaciones en la estructura del ARN pueden ajustarse para permitir la inhibición genética específica. En una modalidad, las moléculas de ARNds pueden modificarse a través de un proceso enzimático de manera que pueden generarse moléculas de ARNsi. El ARNsi puede mediar de manera eficiente el efecto de desregulación para algunos genes objetivo en algunos insectos. Este proceso enzimático puede lograrse utilizando una enzima de ARNasa III o una enzima DICER, presente en las células de un insecto, un animal vertebrado, un hongo o una planta en la trayectoria de ARNi eucariótico (Elbashir et al., 2002, Methods, 26(2): 99-213; Hamilton y Baulcombe, 1999, Science 286:950-952). Este procedimiento también puede utilizar una DICER o ARNasa III recombinante introducida en las células de un insecto objetivo a través de técnicas de ADN recombinante que se conocen fácilmente por el experto en la técnica. Tanto la enzima DICER como la ARNasa III, siendo naturales en un insecto o al hacerse a través de técnicas de ADN recombinante, escinden hebras de ARNds más grandes en oligonucleótidos más pequeños. Las enzimas DICER cortan de manera específica las moléculas de ARNds en piezas de ARNsi, cada una de las cuales es de aproximadamente 19-25 nucleótidos de longitud, mientras que las enzimas ARNasa III normalmente escinden las moléculas de ARNds en ARNsi de 12-15 pares de bases. Las moléculas de ARNsi producidas por cualquiera de las enzimas tienen salientes en el extremo 3' de 2 a 3 nucleótidos y términos fosfato 5' e hidroxilo 3'. Las moléculas de ARNsi generadas por la enzima ARNasa III, son las mismas que aquéllas producidas por las enzimas Dicer en la trayectoria de ARNi eucariótico y, por lo tanto, se seleccionan y degradan por un mecanismo de degradación del ARN celular inherente después de que se desenrollan posteriormente, se separan en ARN de una sola hebra, y se hibridan con las secuencias de ARN transcritas por el gen objetivo. Este procedimiento resulta en una degradación o retiro efectivo de la secuencia de ARN codificado por la secuencia nucleotídica del gen objetivo en el insecto. El resultado es el silenciamiento de una secuencia nucleotídica seleccionada particularmente dentro del insecto. Las descripciones detalladas de los procedimientos enzimáticos pueden encontrarse en Hannon (2002, Nature, 418:244-251 ). La inhibición de un gen objetivo utilizando la tecnología de ARNds estabilizado de la presente invención es específico de la secuencia en que las secuencias nucleotídicas correspondientes a la región dúplex del ARN son seleccionadas para la inhibición genética. El ARN que contiene las secuencias nucleotídicas idénticas a una porción del gen objetivo se prefiere para la inhibición. Las secuencias de ARN con inserciones, supresiones y mutaciones de un solo punto con relación a la secuencia objetivo, también se han encontrado que son efectivas para la inhibición. En la realización de la presente invención, se prefiere que el ARNds inhibidor y la porción del gen objetivo compartan al menos aproximadamente 80% de identidad de la secuencia, o aproximadamente 90% de identidad de la secuencia, o aproximadamente 95% de identidad de la secuencia, o aproximadamente 99% de identidad de la secuencia, o incluso aproximadamente 100% de identidad de la secuencia. De manera alterna, la región dúplex del ARN puede definirse funcionalmente como una secuencia nucleotídica que es capaz de hibridarse con una porción del transcripto del gen objetivo. Una secuencia de menos que la longitud completa que exhibe una homología mayor, compensa una secuencia más larga menos homologa. La longitud de las secuencias nucleotídlcas idénticas puede ser de al menos aproximadamente 25, 50, 00, 200, 300, 400, 500 o al menos aproximadamente 1000 bases. Normalmente, una secuencia mayor de 20-100 nucleótidos debe utilizarse, aunque una secuencia mayor que aproximadamente 200-300 nucleótidos sería preferida, y una secuencia mayor que aproximadamente 500-1000 nucleótidos sería especialmente preferida, dependiendo del tamaño del gen objetivo. La invención tiene la ventaja de ser capaz de tolerar variaciones de la secuencia que pueden esperarse debido a una mutación genética, polimorfismo de la cepa o divergencia evolutiva. La molécula de ácido nucleico introducida puede no necesitar ser de homología absoluta, puede no necesitar ser de longitud completa, con relación al producto de la transcripción primaria o el ARNm procesado completamente del gen objetivo. Por lo tanto, aquellos con experiencia en la técnica necesitan darse cuenta que, como se describe en la presente, no se requiere un 100% de identidad de la secuencia entre el ARN y el gen objetivo para la práctica de la presente invención. Las moléculas de ARNds pueden sintetizarse ya sea in vivo o in vitro. El ARNds puede formarse mediante una sola hebra de ARN autocomplementaria o de dos hebras de ARN complementarias. La ARN polimerasa endógena de la célula puede mediar la transcripción in vivo, o puede utilizarse la ARN polimerasa clonada para la transcripción in vivo o in vitro. La inhibición puede seleccionarse mediante la transcripción específica en un órgano, tejido o tipo de célula, estimulación de una condición ambiental (por ejemplo, infección, agresión, temperatura, inductores químicos); y/o transcripción diseñada en una etapa o edad de desarrollo. Las hebras de ARN pueden o no estar poliadeniladas; las hebras de ARN pueden o no ser capaces de ser traducidas en un polipéptido mediante un aparato traduccional de la célula. El ARN, ARNds, ARNsi, o ARNmi de la presente invención pueden producirse de manera química o enzimática por alguien con experiencia en la técnica a través de reacciones manuales o automáticas o in vivo en otro organismo. El ARN puede también producirse mediante síntesis orgánica parcial o total; cualquier ribonucleótido modificado puede introducirse mediante síntesis enzimática u orgánica in vitro. El ARN puede sintetizarse mediante una ARN polimerasa celular o una ARN polimerasa de bacteriófago (por ejemplo, T3, 17, SP6). El uso y producción de un constructo de expresión se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, la WO 97/320 6; las Patentes de E.U.A. Nos. 5,593,874, 5,698,425, 5,712,135, 5,789,214 y 5,804,693). Si se sintetiza químicamente o mediante síntesis enzimática in vitro, el ARN puede purificarse antes de la introducción en la célula. Por ejemplo, el ARN puede purificarse de una mezcla mediante extracción con un solvente o resina, precipitación, electroforesis, cromatografía o una combinación de los mismos. De manera alterna, el ARN puede utilizarse sin purificación o con un mínimo de purificación para evitar pérdidas debido al procesamiento de la muestra. El ARN puede secarse para el almacenamiento o disolverse en una solución acuosa. La solución puede contener amortiguadores o sales para fomentar el recocido y/o la estabilización de las hebras dúplex. Para la transcripción de un transgen in vivo o un constructo de expresión, puede utilizarse una región reguladora (por ejemplo, un promotor, mejorador, silenciador y poliadenilación) para transcribir la hebra (o hebras) de ARN. Por lo tanto, en una modalidad, las secuencias nucleotídicas para utilizarse para producir las moléculas de ARN pueden enlazarse de manera operable a una o más secuencias promotoras funcionales en un microorganismo, un hongo o una célula hospedera de una planta. Idealmente, las secuencias nucleotídicas se colocan bajo el control de un promotor endógeno, que reside normalmente en el genoma del hospedero. La secuencia nucleotídica de la presente invención, bajo el control de una secuencia promotora enlazada de manera operable, puede además estar flanqueado por secuencias adicionales que afectan de manera ventajosa su transcripción y/o la estabilidad de un transcripto resultante. Tales secuencias se localizan generalmente corriente arriba del promotor enlazado de manera operable y/o corriente abajo del extremo 3' del constructo de expresión, y pueden ocurrir tanto corriente arriba del promotor como corriente abajo del extremo 3' del constructo de expresión, aunque tal secuencia corriente arriba sólo se contempla también. En otra modalidad, la secuencia nucleotídica de la presente invención puede comprende una repetición invertida separada por una "secuencia separadora". La secuencia separadora puede ser una región que comprende cualquier secuencia de nucleótidos que facilite la formación de la estructura secundaria entre cada repetición, en donde esto se requiere. En una modalidad de la presente invención, la secuencia separadora es parte de una secuencia codificante sentido o antisentido para el ARNm. La secuencia separadora puede comprender de manera alterna cualquier combinación de nucleótidos u homólogos de las mismas, que son capaces de estar enlazados de manera covalente a una molécula de ácido nucleico. La secuencia separadora puede comprender una secuencia de nucleótidos de al menos aproximadamente 10-100 nucleótidos de longitud, o de manera alterna, al menos aproximadamente 100-200 nucleótidos de longitud, al menos aproximadamente 200-400 nucleótidos de longitud, o al menos aproximadamente 400-500 nucleótidos de longitud. Para el propósito de la presente invención, las moléculas de ARNds o ARNsi pueden obtenerse del CRW mediante la amplificación en cadena de la polimerasa (PCR) de una secuencia del gen de CRW objetivo derivada de una biblioteca de ADNg o ADNc del gusano de la raíz del maíz o porciones de las mismas. Las larvas del WCR pueden prepararse utilizando métodos conocidos por alguien con experiencia ordinaria en la técnica y el ADN/ARN puede extraerse. Las larvas con varios tamaños que varían de las primeras instars a CRW completamente crecidos, pueden utilizarse con el propósito de la presente invención para la extracción del ADN/ARN. El ADN genómico o las bibliotecas de ADNc generadas del WCR, pueden utilizarse para la amplificación con PCR para la producción del ARNds o el ARNsi. Los genes objetivo pueden amplificarse a continuación mediante PCR y secuenciarse utilizando los métodos fácilmente disponibles en la técnica. Alguien con experiencia en la técnica puede ser capaz de modificar las condiciones de la PCR para asegurar la formación óptima del producto de la PCR. El producto confirmado de la PCR puede utilizarse como una plantilla para la transcripción in vitro para generar ARN sentido y antisentido con los promotores mínimos incluidos. Los presentes inventores contemplan que las secuencias de ácidos nucleicos identificadas y aisladas de cualesquier especies de insectos pueden utilizarse en la presente invención para controlar el WCR y otros insectos seleccionados. En un aspecto de la presente invención, el ácido nucleico puede derivarse de una especie de las especies de coleópteros. De manera específica, el ácido nucleico puede derivarse de los escarabajos de las hojas que pertenecen al género Diabrotica (Coleóptero, Chrysomelidae), y de manera más específica, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden derivarse de las especies del grupo virgifera. De manera más específica, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden derivarse de Diabrotica virgifera virgifera LeConte, que se refiere normalmente como WCR. Los ácidos nucleicos aislados pueden ser útiles, por ejemplo, para identificar un gen objetivo y para construir un vector recombinante que produce los ARNds o ARNsi estabilizados de la presente invención para proteger las plantas de las infestaciones de insectos WCR. Por lo tanto, en una modalidad, la presente invención comprende secuencias nucieotídicas aisladas y purificadas de WCR o Lygus, que pueden utilizarse como los agentes para el control de los insectos. Las secuencias nucieotídicas aisladas y purificadas comprenden aquéllas expuestas en la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 o en la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, expuestas en el listado de las secuencias. Los ácidos nucleicos de WCR u otros insectos que pueden utilizarse en la presente invención también pueden comprender Unigenes y moléculas de ácidos nucleicos EST o moléculas de fragmentos de ácidos nucleicos de los mismos aislados y sustancialmente purificados. Las moléculas de ácidos nucleicos de EST pueden codificar porciones significativas de, o en realidad la mayoría de los polipéptidos. De manera alterna, los fragmentos pueden comprender oligonucleótidos más pequeños que tienen de aproximadamente 15 a aproximadamente 250 residuos nucleotídicos, y de manera más preferida, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 residuos nucleotídicos. De manera alterna, las moléculas de ácido nucleico para utilizarse en la presente invención pueden ser de bibliotecas de ADNc de WCR, de Lygus, o de cualquier otra especie de plagas invertebradas. Como se utiliza en la presente, la frase "un ácido nucleico sustancíalmente purificado", "una secuencia artificial", "un ácido nucleico aislado y sustancíalmente purificado", o "una secuencia nucleotídica aislada y sustancíalmente purificada", se refiere a un ácido nucleico que ya no está acompañado por algunos materiales con los cuales está asociado en su estado natural o a un ácido nucleico, la estructura del cual no es idéntica a aquélla de cualquiera de los ácidos nucleicos naturales. Los ejemplos de un ácido nucleico sustancíalmente purificado incluyen: (1 ) ADN que tienen la secuencia de una parte de moléculas de ADN genómico natural pero que no están flanqueados por dos secuencias codificantes, que flanquean esa parte de la molécula en el genoma del organismo en el cual ocurre naturalmente; (2) un ácido nucleico incorporado en un vector o en el ADN genómico de un procariote o un eucariote en una manera tal que la molécula resultante no es idéntica a ningún vector o ADN genómico natural; (3) una molécula separada tal como un ADNc, un fragmento genómico, un fragmento producido por una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o un fragmento de restricción; (4) ADN recombinantes; y (5) ADN sintéticos. Un ácido nucleico sustancíalmente purificado también puede estar comprendido de uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

Las moléculas de ácido nucleico y los fragmentos de las mismas de WCR, Lygus, u otras especies de plagas invertebradas pueden emplearse para obtener otras moléculas de ácido nucleico de otras especies para utilizarse en la presente invención para producir las moléculas de ARNds y ARNsi deseadas. Tales moléculas de ácido nucleico incluyen las moléculas de ácido nucleico que codifican la secuencia codificante completa de una proteína y promotores y las secuencias flanqueantes de tales moléculas. Además, tales moléculas de ácido nucleico incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican para los miembros de la familia del gen. Tales moléculas pueden obtenerse fácilmente utilizando las moléculas de ácidos nucleicos descritas anteriormente o fragmentos de las mismas para seleccionar bibliotecas de ADNc o ADNg obtenidos de D. v. virgifera o de Lygus hesperus. Los métodos para formar tales bibliotecas son bien conocidos en la técnica. Las moléculas de ácido nucleico y los fragmentos de las mismas de WCR o Lygus pueden también emplearse para obtener otras moléculas de ácido nucleico tales como homólogos de ácidos nucleicos para utilizarse en la presente invención, para producir las moléculas de ARNds y ARNsi deseadas. Tales homólogos incluyen las moléculas de ácido nucleico que codifican, todo o en parte, los homólogos de proteínas de otras especies, plantas u otros organismos. Tales moléculas pueden obtenerse fácilmente utilizando las moléculas de ácidos nucleicos descritas anteriormente o fragmentos de las mismas, para seleccionar bibliotecas EST, de ADNc o de ADNg. Los métodos para formar tales bibliotecas son bien conocidos en la técnica. Tales moléculas homologas pueden diferir en sus secuencias nucleotídicas de aquéllas encontradas en uno o más de la SEQ ID ??. hasta la SEQ ID NO:143 o en la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, como se expone en el listado de las secuencias o en los complementos de las mismas descritos en la presente, debido a que no se requiere la complementariedad completa para la hibridación estable. Estas moléculas de ácido nucleico también incluyen moléculas que, aunque son capaces de hibridarse de manera específica con las moléculas de ácido nucleico, pueden carecer de complementariedad completa. En una modalidad particular, los métodos para una RACE 3' o 5' pueden utilizarse para obtener tales secuencias (Frohman, M.A. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:8998-9002 (1988); Ohara, O. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:5673-5677 (1989)). En general, cualquiera de las moléculas o fragmentos de ácidos nucleicos descritos anteriormente, pueden utilizarse para generar ARNds o ARNsi que son adecuados para utilizarse en una dieta, en un mezclador para rociarse encima o en un constructo de ADN recombinante de la presente invención. Como se utiliza en la presente, la frase "secuencia codificante", "secuencia nucleotídica estructural" o "molécula de ácido nucleico estructural", se refiere a una secuencia nucleotídica que se traduce en un polipéptido, usualmente vía ARNm, cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por el codón de inicio de la traducción en el término 5' y un codón de paro de la traducción en el término 3'. Una secuencia codificante puede incluir, de manera no exclusiva, ADN genómico, ADNc, EST y secuencias nucleotídicas recombinantes. El término "ADN recombinante" o "secuencia nucleotídica recombinante", se refiere al ADN que contiene una modificación diseñada genéticamente a través de la manipulación vía mutagénesis, enzimas de restricción y lo similar. Las moléculas de ácido nucleico o el fragmento de las moléculas de ácido nucleico u otras moléculas de ácido nucleico para el WCR, son capaces de hibridarse de manera específica a otras moléculas de ácido nucleico bajo ciertas circunstancias. Como se utiliza en la presente, se dice que dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridarse de manera específica una con otra si las dos moléculas son capaces de formar una estructura de ácido nucleico antiparalela, de doble hebra. Se dice que una molécula de ácido nucleico es el complemento de otra molécula de ácido nucleico si exhibe una complementariedad completa. Se dice que dos moléculas son "mínimamente complementarias" si se pueden hibridar una con otra con suficiente estabilidad para permitirles permanecer recocidas una con otra bajo al menos condiciones de "bajo rigor" convencionales. De manera similar, se dice que las moléculas son complementarias si pueden hibridarse una con otra con suficiente estabilidad para permitirles permanecer recocidas una con otra bajo condiciones de "alto rigor" convencionales. Las condiciones de rigor convencionales se describen por Sambrook, et al., y por Haymes, et al. En: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, 1RL Press, Washington, DC (1985). La separación de la complementariedad completa es por lo tanto permisible, siempre que tales separaciones no excluyan completamente la capacidad de las moléculas para formar una estructura de doble hebra. Así, con el fin de que una molécula de ácido nucleico o un fragmento de una molécula de ácido nucleico sirva como un cebador o sonda, necesita sólo ser suficientemente complementario en secuencia para ser capaz de formar una estructura estable de doble hebra bajo el solvente particular y las concentraciones de la sal empleadas. . Las condiciones de rigor apropiadas que fomentan la hibridación del ADN son, por ejemplo, 6.0 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por un lavado de 2.0 x SSC a 50°C, se conocen por aquellos con experiencia en la técnica o pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1 -6.3.6. Por ejemplo, la concentración de la sal en el paso de lavado puede seleccionarse de un bajo rigor de aproximadamente 2.0 x SSC a 50°C a un alto rigor de aproximadamente 0.2 x SSC a 50°C. Además, la temperatura en el paso de lavado puede incrementarse de condiciones de bajo rigor a temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, a condiciones de alto rigor a aproximadamente 65°C. Tanto la temperatura como la sal pueden variarse, o la temperatura o la concentración de la sal pueden mantenerse constantes mientras que la otra variable se cambia.

Un ácido nucleico para utilizarse en la presente invención puede hibridarse de manera específica a una o más de las moléculas de ácido nucleico de WCR o complementos de las mismas bajo condiciones de rigor moderado, por ejemplo, a aproximadamente 2.0 x SSC y aproximadamente 65°C. Un ácido nucleico para utilizarse en la presente invención incluirá aquellas moléculas de ácido nucleico que se hibridan de manera específica a una o más de las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente como se expone en la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 o en la SEQ ID NO: 169 hasta la SEQ ID NO: 174, como se expone en el listado de las secuencias o los complementos de las mismas bajo condiciones de alto rigor. De manera preferida, un ácido nucleico para utilizarse en la presente invención, exhibirá al menos de aproximadamente 80%, o al menos de aproximadamente 90%, o al menos de aproximadamente 95%, o al menos de aproximadamente 98% o incluso aproximadamente 100% de identidad de la secuencia con una o más moléculas de ácido nucleico como se expone en la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 o en la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, como se expone en el listado de las secuencias, o como se describe en la presente; o un ácido nucleico para utilizarse en la presente invención exhibirá de aproximadamente 80%, o al menos de aproximadamente 90%, o al menos de aproximadamente 95%, o al menos de aproximadamente 98% o incluso aproximadamente 100% de identidad de la secuencia con una o más moléculas de ácido nucleico como se expone en la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 o en la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, como se expone en el listado de las secuencias aislado del ADN genómico de una plaga de insectos. Todos o una porción sustancial de los ácidos nucleicos de WCR pueden utilizarse para aislar los ADNc, ADNg y los ácidos nucleicos que codifican los homólogos de la proteína Diabrotica o fragmentos de los mismos para la misma u otras especies. Las descripciones detalladas de las técnicas de aislamiento e identificación de los ácidos nucleicos de la presente invención de las bibliotecas de ADNc o ADNg, se describen en los ejemplos. Los ácidos nucleicos de la presente invención también pueden sintetizarse, ya sea de manera completa o en parte, especialmente en donde es deseable proporcionar secuencias preferidas por la planta, mediante métodos conocidos en la técnica. Así, toda una porción de los ácidos nucleicos de la presente invención pueden sintetizarse utilizando codones preferidos por un hospedero seleccionado. Los codones preferidos de las especies pueden determinarse, por ejemplo, de los codones utilizados más frecuentemente en las proteínas expresadas en las especies de hospederos particulares. Otras modificaciones de las secuencias nucleotídicas pueden resultar en mutantes que tienen una actividad ligeramente alterada. La presente invención proporciona en parte un sistema de suministro para el suministro de agentes para el control de los insectos a los insectos. Las moléculas de ARNds o ARNsi estabilizado de la presente invención, pueden introducirse directamente en las células de un insecto, o introducirse en una cavidad extracelular, espacio intersticial, sistema linfático, sistema digestivo, en la circulación del insecto a través de la ingestión oral u otros medios que alguien con experiencia en la técnica puede emplear. Los métodos para la introducción oral pueden incluir el mezclado directo del ARN con el alimento del insecto, así como procedimientos diseñados en los cuales una especie que se utiliza como alimentos se diseña para expresar los ARNds o los ARNsi, a continuación se alimenta al insecto a ser afectado. En una modalidad, por ejemplo, las moléculas de ARNds o ARNsi pueden incorporarse en o superponerse en la parte superior de la dieta del insecto. En otra modalidad, el ARN puede rociarse en una superficie de la planta. En aún otra modalidad, los ARNds o ARNsi pueden expresarse mediante microorganismos y los microorganismos pueden aplicarse en la superficie de la planta o introducirse en una raíz, tallo, por medios físicos tales como una inyección. En aún otra modalidad, una planta puede diseñarse genéticamente para expresar el ARNds o el ARNsi en una cantidad suficiente para matar los insectos conocidos como que infectan la planta. De manera específica, en la práctica de la presente invención en el WCR, el ARNds o el ARNsi estabilizado pueden introducirse en el intestino medio dentro del insecto, y lograr la inhibición deseada de los genes seleccionados. Las moléculas de ARNds o de ARNsi pueden incorporarse en una dieta o superponerse en la dieta como se discutió anteriormente, y pueden ingerirse por los insectos. En cualquier caso, los ARNds de la presente invención, se proporcionan en la dieta de la plaga objetivo. La plaga objetivo de la presente invención exhibirá un pH del tracto digestivo de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 9.5, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.5, o de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, o de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.7, o aproximadamente 7.0. El tracto digestivo de la plaga objetivo se define en la presente como la ubicación dentro de la plaga en que el alimento que se ingiere por la plaga objetivo se expone a un medio que es favorable para la captación de las moléculas de ARNds de la presente invención sin sufrir un pH tan extremo que los enlaces de hidrógeno entre las dobles hebras del ARNds se disocien y formen moléculas de una sola hebra. Además, para el propósito de controlar las infestaciones de insectos en plantas, el suministro de los ARNds para el control de los insectos a las superficies de una planta vía la aplicación por rociado, proporciona otro medio para proteger las plantas. En este caso, una bacteria diseñada para producir y acumular ARNds, puede fermentarse y los productos de la fermentación formularse en un producto para rociarse, compatible con las prácticas agrícolas comunes. Las formulaciones pueden incluir los aglutinantes y humectantes apropiados requeridos para la cobertura foliar eficiente, así como protectores UV para proteger los ARNds del daño UV. Tales aditivos se utilizan comúnmente en la industria bioinsecticida y son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. De igual manera, las formulaciones para la aplicación al suelo pueden incluir formulaciones granulares que sirven como un cebo para las larvas de las plagas de insectos del suelo, tales como el gusano de la raíz del maíz. También se anticipa que los ARNds producidos mediante síntesis química o enzimática puedan formularse de una manera consistente con las prácticas agrícolas comunes y utilizarse en productos para rociarse para controlar las infestaciones de insectos. Las formulaciones pueden incluir los aglutinantes y humectantes apropiados requeridos para la cobertura foliar eficiente, así como protectores UV para proteger los ARNds del daño UV. Tales aditivos se utilizan comúnmente en la industria bioinsecticida y son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Tales aplicaciones pueden combinarse con otras aplicaciones insecticidas para rociarse, basadas biológicamente o no, para mejorar la protección de las plantas del daño por la alimentación de los insectos. Los presentes inventores contemplan que las cepas bacterianas que producen proteínas insecticidas pueden utilizarse para producir los ARNds para propósitos de controlar los insectos. Estas cepas pueden exhibir propiedades para el control de los insectos mejoradas. Una variedad de diferentes hospederos bacterianos puede utilizarse para producir los ARNds para el control de los insectos. Las bacterias ejemplares pueden incluir E. coli, B. thuríngiensis, Pseudomonas sp., Photorhabdus sp., Xenorhabdus sp., Serratia entomophila y Serratia sp. relacionadas, B. sphaericus, B. cereus, B. laterosponts, B. popilliae, Clostridium bifennentans y otras especies de Clostridiumn, u otras bacterias gram positivas que forman esporas.

La presente invención también se relaciona con constructos de ADN recombinantes para la expresión en un microorganismo. Los ácidos nucleicos exógenos de los cuales se transcribe un ARN de interés, pueden introducirse en una célula hospedera microbiana, tal como una célula bacteriana o una célula de hongo, utilizando métodos conocidos en la técnica. Las secuencias nucleotídicas de la presente invención pueden introducirse en una amplia variedad de hospederos de microorganismos procarióticos o eucarióticos para producir las moléculas de ARNds o ARNsi estabilizadas. El término "microorganismo" incluye especies microbianas procarióticas y eucarióticas tales como bacterias y hongos. Los hongos incluyen levaduras y hongos filamentosos, entre otros. Los procariotes ilustrativos, tanto Gram negativos como Gram positivos, incluyen Enterobacteriaceae, tales como Escheríchia, Erwinia, Shigella, Salmonella y Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, tales como Rhizobium; Spiríllaceae, tales como fotobacterias, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tales como Pseudomonas y Acetobacter, Azotobacteraceae, Actinomycetales y Nitrobacteraceae. Entre los eucariotes están los hongos, tales como Phycomycetes y Ascomycetes, que incluyen levaduras, tales como Saccharomyces y Schizosaccharomyces; y levaduras Basidiomycetes, tales como Rhodotorula, Aureobasidiurn, Sporobolomyces, y lo similar. Para el propósito de la protección de la planta contra los insectos, un gran número de microorganismos conocidos por habitar el filoplano (la superficie de las hojas de la planta) y/o la rizosfera (el suelo que rodea las raíces de la planta) de una amplia variedad de cosechas importantes, también pueden ser células hospederas deseables para la manipulación, propagación, almacenamiento, suministro y/o mutagénesis de los constructos recombinantes descritos. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. De interés particular son los microorganismos, tales como bacterias, por ejemplo, del género Bacillus (incluyendo las especies y subespecies B. thuringiensis kurstaki HD-1, B. thuringiensis kurstaki HD-73, B. thuringiensis sotto, B. thuringiensis berliner, B. thuringiensis thuringiensis, B. thuringiensis tolworthi, B. thuringiensis dendrolimus, B. thuringiensis alesti, B. thuringiensis galleriae, B. thuringiensis aizawai, B. thuringiensis subtoxicus, B. thuringiensis entomocidus, B. thuringiensis tenebrionis y B. thuringiensis san diego); Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Zanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc y Alcaligenes; hongos, particularmente levaduras, por ejemplo, los géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula y Aureobasidium. De particular interés son las especies bacterianas de la fitosfera tales como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumtefaciens, Rhodobacter sphaeroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes eutrophus y Azotobacter vinlandii; y especies de levaduras de la fitosfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. adorus, Kluyveromyces veronae y Aureobasidium pollulans. Una vector de ADN recombinante bacteriano puede ser un plásmido lineal o circular cerrado. El sistema del vector puede ser un solo vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que contienen juntos el ADN total a ser introducido en el genoma del hospedero bacteriano. Además, el vector bacteriano puede ser un vector de expresión. Las moléculas de ácido nucleico como se expone en la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 o en la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, como se expone en el listado de las secuencias o los fragmentos de las mismas pueden, por ejemplo, insertarse de manera adecuada en un vector bajo el control de un promotor adecuado que funciona en uno o más hospederos microbianos para accionar la expresión de una secuencia codificante enlazada u otra secuencia de ADN. Muchos vectores están disponibles para este propósito, y la selección del vector apropiado dependerá principalmente del tamaño del ácido nucleico a ser insertado en el vector y la célula hospedera particular a ser transformada con el vector. Cada vector contiene varios componentes dependiendo de su función (amplificación del ADN o expresión del ADN) y la célula hospedera particular con la cual es compatible. Los componentes del vector para la transformación bacteriana incluyen generalmente, de manera no exclusiva, uno o más de lo siguiente: una secuencia de la señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores seleccionantes y un promotor inducible que permite la expresión del ADN exógeno. Los vectores de expresión y clonación contienen generalmente un gen de selección, también referido como un marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de las células hospederas transformadas que crecen en un medio de cultivo selectivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) deficiencias auxotróficas del complemento, o (c) suministra nutrientes críticos no disponibles del medio del complejo, por ejemplo, el gen que codifica la racemasa D-alanina para Bacilli. Estas células que son transformadas de manera exitosa con una proteína heteróloga o un fragmento de la misma, producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y por lo tanto sobreviven al régimen de selección. Un vector de expresión para producir un ARNm también puede contener un promotor inducible que es reconocido por el organismo bacteriano hospedero y está enlazado de manera operable al ácido nucleico que codifica, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico que codifica el ARNm de D. v. virgifera o el fragmento del mismo de interés. Los promotores inducibles adecuados para utilizarse con los hospederos bacteriano incluyen el promotor de ß-lactamasa, los promotores PL y PR de fago ? de E. coli y el promotor de galactosa de E. coli, el promotor de arabinosa, el promotor de fosfatasa alcalina, el promotor de triptófano (trp), y el promotor del operón de lactosa y variantes de los mismos y promotores híbridos tales como el promotor tac. Sin embargo, otros promotores inducibles bacterianos conocidos son adecuados. El término "enlazado de manera operable", como se utiliza con referencia a una secuencia reguladora y a una secuencia nucleotídica estructural, significa que la secuencia reguladora causa la expresión regulada de la secuencia nucleotídica estructural enlazada. "Secuencias reguladoras" o "elementos de control", se refieren a secuencias nucleotídicas localizadas corriente arriba (secuencias no codificantes 5'), dentro o corriente abajo (secuencias no traducidas 3') de una secuencia nucleotídica estructural, y que influencian la sincronización y el nivel o cantidad de la transcripción, el procesamiento o estabilidad del ARN, o la traducción de la secuencia nucleotídica estructural asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líderes de traducción, intrones, mejoradores, estructuras de tallo-espira, secuencias que se unen al represor, y secuencias de reconocimiento de la poliadenilación y lo similar. De manera alterna, los constructos de la expresión pueden integrarse en el genoma bacteriano con un vector integrante. Los vectores integrantes contienen típicamente al menos una secuencia homologa al cromosoma bacteriano que permite que el vector se integre. Las integraciones parecen resultar de las recombinaciones entre el ADN homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano. Por ejemplo, los vectores integrantes construidos con el ADN de varias cepas de Bacillus se integran en el cromosoma de Bacillus (EP 0 127,328). Los vectores integrantes también pueden estar comprendidos de secuencias de bacteriófago o de transposón. Los vectores suicidas también son conocidos en la técnica. La construcción de los vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes listados anteriormente, emplea técnicas de ADN recombinante estándar. Los plásmidos aislados o los fragmentos de ADN se escinden, ajustan y vuelven a ligar en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos. Los ejemplos de vectores de expresión bacteriana disponibles incluyen, de manera no exclusiva, los vectores de clonación y expresión de E. coli con múltiples funciones tales como Bluescript™ (Stratagene, La Jolla, CA), en los cuales, por ejemplo, una proteína de D. v. virgifera o fragmento de la misma, puede ligarse en el vector en el marco con secuencias para el Met amino terminal y los 7 residuos posteriores de ß-galactosidasa de manera que se produce una proteína híbrida; vectores pIN (Van Heeke y Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509); y lo similar. Un constructo recombinante de levadura puede incluir típicamente uno o más de lo siguiente: una secuencia promotora, una secuencia asociada de fusión, una secuencia líder, una secuencia de terminación de la transcripción, un marcador seleccionable. Estos elementos pueden combinarse en un cásete de expresión, el cual puede mantenerse en un replicón, tal como un elemento extracromosomal (por ejemplo, plásmidos), capaces del mantenimiento estable en un hospedero, tal como una levadura o bacteria. El replicón puede tener dos sistemas de replícación, permitiendo así que se mantenga, por ejemplo, en las levaduras para la expresión y en un hospedero procariótico para la clonación y la amplificación. Los ejemplos de tales vectores lanzadera de levadura-bacteria incluyen YEp24 (Botstein et al., 1979, Gene, 8:17-24), pCI/1 (Brake et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sci USA, 81:4642-4646), y Y p17 (Stinchcomb et al., 1982, J. Mol. Biol., 158:157). Además, un replicón puede ser un plásmido con un número de copias alto o bajo. Un plásmido con un número de copias alto generalmente tendrá un número de copias que varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 200, y típicamente de aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Un hospedero que contiene un plásmido con un número de copias alto de manera preferida tendrá al menos aproximadamente 10, y de manera más preferida al menos aproximadamente 20. Las secuencias del promotor de levadura útiles pueden derivarse de genes que codifican enzimas en la trayectoria metabolica. Los ejemplos de tales genes incluyen la alcohol deshidrogenasa (ADH) (EP 0 284044), enolasa, glucocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, gliceraldehío-3-fosfato-deshidrogenasa (GAP o GAPDH), hexocinasa, fosfofructocinasa, 3-fosfoglicerato mutasa y piruvato cinasa (PyK) (EP 0 3215447). El gen PHO5 de levadura, la fosfatasa ácida codificante, también proporciona secuencias promotoras útiles (Myanohara et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80:1 , 1983). Además, los promotores sintéticos que no son naturales, también funcionan como promotores de levadura. Los ejemplos de tales promotores híbridos incluyen la secuencia reguladora ADH enlazada a la región de activación de la trascripción GAP (Patente de E.U.A., No. 4,876,197 y 4,880,734). Otros ejemplos de promotores híbridos, incluyen promotores que consisten de las secuencias reguladoras de los genes ADH2, GAL4, GAL10 o PHO5, combinados con la región de activación transcripcional de un gen de la enzima glucolítica tal como GAP o PyK (EP 0 164556). Además, un promotor de levadura puede incluir promotores naturales de origen que no es de levadura, que tienen la capacidad de unirse a la ARN polimerasa de levadura e iniciar la transcripción. Los ejemplos de las secuencias terminadoras de la transcripción y otras secuencias de terminación reconocidas por la levadura, tales como aquéllas que codifican las enzimas glucolíticas, se conocen por aquellos con experiencia en la técnica. De manera alterna, los constructos de expresión pueden integrarse en el genoma de la levadura con un vector integrante. Los vectores integrantes contienen típicamente ai menos una secuencia homologa a un cromosoma de la levadura que permite que el vector se integre, y de manera preferida, contienen dos secuencias homologas que flanquean el constructo de expresión. Las integraciones parecen resultar de las recombinaciones entre el ADN homólogo en el vector y el cromosoma de la levadura (Orr-Weaver et al., 1983, Methods in Enzymol., 101 :228-245). Un vector integrante puede estar dirigido a un sitio específico en la levadura seleccionando la secuencia homologa apropiada para la inclusión en el vector. Véase Orr-Weaver et al., supra. Uno o más constructos de expresión pueden integrarse, posiblemente afectando niveles de la proteína recombinante producida (Riñe et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80:6750). Las secuencias cromosomales incluidas en el vector pueden ocurrir ya sea como un segmento único en el vector, que resulta en la integración de todo el vector, o como dos segmentos homólogos a segmentos adyacentes en el cromosoma y que flanquean el constructo de expresión en el vector, que resulta en la integración estable de solo el constructo de expresión. La presente invención también contempla la transformación de una secuencia nucleotídica de la presente invención en una planta para lograr niveles de expresión inhibidores de plaga de una o más moléculas de ARNds. Un vector de transformación puede prepararse fácilmente utilizando métodos disponibles en la técnica. El vector de transformación comprende una o más secuencias nucleotídicas que son capaces de ser transcritas a una molécula de ARN y que son sustancialmente homologas y/o complementarias a una o más secuencias nucleotídicas codificadas por un genoma del insecto, de manera que tras la captación del ARN transcrito de la una o más moléculas de las secuencias nucleotídicas por el insecto, hay una desregulación de la expresión de al menos una de las secuencias nucleotídicas respectivas del genoma del insecto. El vector de transformación puede significar además un constructo de ADNds y puede también considerarse ínter alia, como una molécula recombinante, un agente para el control de los insectos, una molécula genética o un constructo genético quimérico. Un constructo genético quimérico de la presente invención puede comprender, por ejemplo, secuencias nucleotídicas que codifican uno o más transcriptos antisentido, uno o más transcriptos sentido, uno o más de cada uno de lo mencionado anteriormente, en donde todo o parte de un transcripto del mismo es homólogo a toda o parte de una molécula de ARN que comprende una secuencia de ARN codificada por una secuencia nucleotídica dentro del genoma de un insecto. En una modalidad, el vector de transformación de la planta es una molécula de ADN aislada y purificada que comprende un promotor enlazado de manera operable a una o más secuencias nucleotídicas de la presente invención. La secuencia nucleotídica se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 y la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, como se expone en el listado de las secuencias. La secuencia nucleotídica incluye un segmento que codifica todo o parte de un ARN presente dentro de un transcripto de ARN de la plaga seleccionada y puede comprender repeticiones invertidas de todo o parte de un ARN de la plaga seleccionada. La molécula de ADN que comprende el vector de expresión también puede contener una secuencia de intrón funcional colocada ya sea corriente arriba de la secuencia codificante o incluso dentro de la secuencia codificante, y también puede contener una secuencia líder no traducida cinco prima (5') (es decir, una UTR o 5'-UTR), colocada entre el promotor y el punto de inicio de la traducción.

Un vector de transformación de la planta puede contener secuencias de más de un gen, permitiendo así la producción de más de un ARNds para inhibir la expresión de dos o más genes en las células de una plaga objetivo. Alguien con experiencia en la técnica apreciará fácilmente que los segmentos de ADN cuyas secuencias corresponden a aquéllas que están presentes en diferentes genes, puede combinarse en un solo segmento de ADN compuesto para la expresión en una planta transgénica. De manera alterna, un plásmido de la presente invención que ya contiene al menos un segmento de ADN, puede modificarse por la inserción secuencial de segmentos de ADN adicionales entre las secuencias mejoradoras y promotoras y terminadoras. En el agente para el control de los insectos de la presente invención diseñado para la inhibición de múltiples genes, los genes a ser inhibidos pueden obtenerse de la misma especie de insectos con el fin de mejorar la efectividad del agente para el control de los insectos. En ciertas modalidades, los genes pueden derivarse de diferentes insectos con el fin de ampliar la gama de insectos contra la cual el agente es efectivo. Cuando múltiples genes se seleccionan para la supresión o una combinación de expresión y supresión, un elemento de ADN policistrónico puede fabricarse como se ¡lustra y describe en Fillatti, Publicación de la Solicitud No. US 2004-0029283. En donde una secuencia nucleotídica de la presente invención se va a utilizar para transformar una planta, se selecciona un promotor que exhibe la capacidad de dirigir la expresión de la secuencia codificante en esa especie particular de la planta. Los promotores que funcionan en diferentes especies de plantas, también son bien conocidos en la técnica. Los promotores útiles para la expresión de los polipéptidos en plantas son aquéllos que son inducibles, virales, sintéticos o constitutivos, como se describe en Odell et al. (1985, Nature 313:810-812), y/o promotores que están regulados temporalmente, regulados espacialmente y regulados espaciotemporalmente. Los promotores preferidos incluyen los promotores CaMV35S mejorados y el promotor FMV35S. Para el propósito de la presente invención, por ejemplo, para el control óptimo de las especies que se alimentan de las raíces, es preferible lograr los niveles de expresión más altos de estos genes dentro de las raíces de las plantas. Se han identificado varios de los promotores mejorados en al raíz y se conocen en la técnica. (Lu et al., 2000, J. Plant Phys., 156(2):277-283; Patente de E.U.A. No. 5,837,848 y 6,489,542). Un vector o constructo de ADN recombinante de la presente invención comprenderá típicamente un marcador seleccionable que confiere un fenotipo seleccionable en las células de las plantas. Los marcadores seleccionables también pueden utilizarse para seleccionar las plantas o las células de plantas que contienen los ácidos nucleicos exógenos que codifican los polipéptidos o las proteínas de la presente invención. El marcador puede codificar la resistencia a un biocida, la resistencia a un antibiótico (por ejemplo, canamicina, bleomicina G418, higromicina, etc.), o resistencia a un herbicida (por ejemplo, glifosato, etc.). Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, de manera no exclusiva, un gen neo que codifica la resistencia a la canamicina y que puede seleccionarse para utilizar canamicina, G418, etc.; un gen bar que codifica para la resistencia al bialafos; un gen de la EPSP sintasa muíante que codifica la resistencia al glifosato; un gen de nitrilasa que confiere resistencia al bromoxinilo; un gen de la acetolactato sintasa muíante (ALS), que confiere resistencia a la imidazolinona o a la sulfonilurea; y un gen DHFR resistente al metotrexato. Un vector o constructo recombinante de la presente invención puede incluir también un marcador seleccionable. Los marcadores seleccionares pueden utilizarse para verificar la expresión. Los marcadores seleccionabas ejemplares incluyen una ß-glucuronidasa o un gen uidA (GUS), que codifica una enzima para la cual se conocen varios sustratos cromogénicos (Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol, Rep. 5:387-405; Jefferson et al., 987, EMBO J. 6:3901-3907); un gen del sitio R, que codifica un producto que regula la producción de los pigmentos de antocianina (color rojo) en los tejidos de las plantas (Dellaporta et al., 1988, Stadler Symposium 11 :263-282); un gen de ß-lactamasa (Sutcliffe et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. 75:3737-3741 ), un gen que codifica una enzima para la cual se conocen varios sustratos cromogénicos (por ejemplo, PADAC, una cefalosporina cromogénica); un gen de luciferasa (Ow et al., 1986, Science 234:856-859), gen xyE (Zukowsky et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. 80:1101-1105), que codifica una catecol dloxigenasa que puede convertir los catecoles cromogénicos; un gen de a-amilasa (Ikatu et al., 1990, Bio/Technol. 8:241-242); un gen de tirosinasa (Katz et al., 1983, J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714), que codifica una enzima capaz de oxidar la tirosina a DOPA y dopaquinona que a su vez se condensa a melanina; una a-galactosidasa, que cataliza un sustrato de a-galactosa cromogénica. En general, se prefiere introducir un ADN recombinante funcional en una ubicación no específica en un genoma de la planta. En casos especiales, puede ser útil insertar un constructo de ADN recombinante mediante integración específica del sitio. Existen varios sistemas de recombinación específica del sitio que se conocen que funcionan como implantes, que incluyen cre-lox como se describe en la Patente de E.U.A. 4,959,317 y FLP-FRT como se describe en la Patente de E.U.A. 5,527,695. En la práctica, el ADN se introduce sólo en un pequeño porcentaje de las células objetivo en cualquier experimento de transformación único. Los genes que codifican los marcadores seleccionabas se utilizan para proporcionar un sistema eficiente para la identificación de esas células que se transforman de manera estable, recibiendo e integrando un constructo de ADN transgénico en sus genomas. Los genes marcadores preferidos proporcionan marcadores selectivos que confieren resistencia a un agente selectivo, tal como un antibiótico o un herbicida. Cualquiera de los herbicidas a los cuales las plantas de esta invención pueden ser resistentes, son agentes útiles para marcadores selectivos. Las células transformadas potencialmente se exponen al agente selectivo. En la población de células supervivientes estarán aquellas células en donde generalmente, el gen que confiere resistencia se integra y expresa a niveles suficientes para permitir la supervivencia de la célula. Las células pueden probarse además para confirmar la integración estable del ADN exógeno. Los genes marcadores selectivos utilizados comúnmente, incluyen aquéllos que confieren resistencia a los antibióticos tales como canamicina (nptil), higromicina B (aph IV) y gentamicina (aac3 y aacC4) o resistencia/tolerancia a herbicidas tales como glufosinato (bar o pat), glifosato (EPSPS), y AMPA (phnO). Los ejemplos de tales marcadores selecciona as se ilustran en las Patente de E.U.A. 5,550,318; 5,633,435; 5,780,708 y 6,1 8,047. Los marcadores seleccionabas que proporcionan una capacidad para identificar visualmente los transformantes, también pueden emplearse, por ejemplo, un gen que exprese una proteína coloreada o fluorescente, tal como luciferasa o la proteína fluorescente verde (GFP) o un gen que exprese una beta-glucuronidasa o un gen uidA (GUS) para el cual se conocen varios sustratos cromogénicos. Los vectores de transformación de las plantas preferidos incluyen aquéllos derivados del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens (por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 4,536,475, 4,693,977, 4,886,937, 5,501 ,967 y EP 0 122 791 ). Los plásmidos de Agrobacterium rhizogenes (o "R¡"), también son útiles y conocidos en la técnica. Otros vectores de transformación de la planta preferidos incluyen aquéllos descritos, por ejemplo, por Herrera-Estrella (1983, Nature 303:209-213), Bevan (1983, Nature 304:184-187), Klee (1985, Bio/Technol. 3:637-642) y EP 0 120 516. Los métodos y composiciones para transformar las plantas introduciendo un constructo de ADN recombinante en un genoma de una planta, incluyen cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Un método para construir plantas transformadas es el bombardeo con microproyectiles como se ilustra en las Patentes de E.U.A. 5,015,580, 5,550,318, 5,538,880, 6,153,812, 6,160,208, 6,288,312 y 6,399,861. Otro método para construir plantas transformadas, es la transformación mediada por Agrobacterium, como se ilustra en las Patentes de E.U.A. 5,159,135, 5,824,877, 5,591 ,616 y 6,384,301. De manera alterna, pueden utilizarse otras especies que no sean Agrobacterium, tales como por ejemplo, Rhizobium y otras células procarióticas que exhiban la capacidad para la infección de las células de las plantas y la introducción de las secuencias nucleotídicas heterólogas en el genoma de la célula de la planta infectada. Los constructos de ADN de la presente invención pueden introducirse en el genoma de un hospedero de una planta deseada mediante una variedad de técnicas de transformación convencionales, que son bien conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. Los vectores de transformación de plantas adecuados para el propósito de transformación mediada por Agrobacterium incluyen aquéllos derivados de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. Además de los vectores de transformación de las plantas mediada por Agrobacterium, pueden utilizarse métodos alternos para insertar los constructos de ADN de la presente invención en las células de la planta. Tales métodos pueden involucrar, de manera no exclusiva, por ejemplo, el uso de liposomas, electroporación, químicos que incrementan la captación de ADN libre, suministro de ADN libre vía bombardeo de microproyectiles y transformación utilizando virus o polen. Cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aislado de la presente invención puede introducirse en una célula de planta de una manera permanente o transitoria en combinación con otros elementos genéticos tales como promotores, intrones, mejoradores y secuencias líder no traducidas, etc. Cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que codifiquen un ARN de especies de coleópteros o un ARN de especies de insectos perforadores y succionadores, o de manera preferida un ARN de D. v. virgifera o un ARN de Lygus hesperus, puede fabricarse e introducirse en una planta de una manera que permita la producción de las moléculas de ARNds dentro de la célula de la planta, proporcionando una cantidad insecticida de uno o más ARNds particulares en la dieta de la plaga de insectos objetivo. El término "célula de planta transgénica" o "planta transgénica", se refiere a una célula de planta o una planta que contiene un ácido nucleico exógeno, que puede derivarse de WCR, o de una especie de insecto diferente, o cualquier otra especie de insecto. Las plantas transgénicas también pretenden comprender la progenie (muertos, descendencia, etc.) de cualquier generación de tal planta transgénica o una semilla de cualquier generación de todas de tales plantas transgénicas, en donde la progenie o semilla comprende una secuencia de ADN que codifica el ARN, ARNs, ARNds, ARNsi, o un fragmento del mismo de la presente invención, es también un aspecto importante de la invención.

Una planta transgénica formada utilizando los métodos de transformación de Agrobacterium contiene típicamente una sola secuencia de ADN recombinante simple insertada en un cromosoma y se refiere como un evento transgénico. Tales plantas transgénicas pueden referirse como que son heterocigotas para la secuencia exógena insertada. Una planta transgénica homocigótica con respecto a un transgen puede obtenerse mediante apareamiento sexual (autofecundación) de una planta transgénica segregante independiente, que contiene una sola secuencia del gen exógeno consigo misma, por ejemplo, una planta FO, para producir una semilla F1 . Un cuarto de la semilla F1 producida será heterocigota con respecto al transgen. La germinación de la semilla F1 resulta en plantas que pueden probarse para la heterocigosidad, utilizando típicamente un ensayo SNP o un ensayo de amplificación térmica que permite la distinción entre los heterocigotos y los homocigotos (es decir, un ensayo de cigosidad). El cruce de una planta heterocigota con ella misma u otra planta heterocigota resulta en sólo progenie heterocigota. Además de la transformación directa de una planta con un constructo de ADN recombinante, las plantas transgénicas pueden prepararse cruzando una primera planta que tiene un constructo de ADN recombinante con una segunda planta que carece del constructo. Por ejemplo, el ADN recombinante para la supresión del gen puede introducirse en una primera línea de la planta que es propicia para la transformación para producir una planta transgénica que puede cruzarse con una segunda línea de planta para introgresar el ADN recombinante para la supresión del gen en la segunda línea de la planta. Las plantas transgénicas que pueden generarse mediante la práctica de la presente invención, incluyen de manera no exclusiva alfalfa, eneldo, manzana, albaricoque, alcachofa, arúgula, espárrago, aguacate, plátano, cebada, frijoles, remolacha, zarzamora, arándano, brócoli, coles de Bruselas, coles, colza, cantalupo, zanahoria, mandioca, coliflor, apio, cereza, cilantro, cítricos, clementina, café, maíz, algodón, pepino, abeto Douglas, berenjena, endivia, escarola, eucalipto, hinojo, higos, calabaza, uva, toronja, ligamaza, jicama, klwi, lechuga, puerros, limón, lima, pino del incienso, mango, melón, hongos, nueces, avena, quimbombó, cebolla, naranja, una planta ornamental, papaya, perejil, chícharos, duraznos, cacahuate, pera, pimienta, placaminero, pino, pina, plátano, ciruelo, granada, álamo, papa, calabaza, membrillo, pino radiata, achicoria roja, rábano, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, pino Sureño, soya, espinaca, calabaza, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, papa dulce, liquidámbar, tangerina, té, tabaco, jitomate, césped, un vino, sandía, trigo, ñames y calabacines. La presente invención puede, en la práctica, combinarse con otros rasgos para el control de los insectos en una planta para lograr los rasgos deseados para el control mejorado de la infestación por los insectos. La combinación de rasgos para el control de los insectos que emplean diferentes modos de acción, pueden proporcionar plantas transgénicas protegidas contra los insectos con durabilidad superior con respecto a las plantas que alojan un solo rasgo para el control de los insectos debido a la probabilidad reducida de que la resistencia se desarrollará en el campo. El mecanismo de actividad insecticida de las proteínas del cristal de B. thuringiensis se ha estudiado de manera extensa en la década pasada. Se ha mostrado que las proteínas del cristal son tóxicas para la forma larvaria del insecto sólo después de la ingestión de la proteína. En las larvas de los lepidópteros, un pH alcalino y las enzimas proteolíticas en el intestino medio del insecto solubilizan las proteínas, permitiendo por lo tanto la liberación de los componentes que son tóxicos al insecto. Estos componentes tóxicos rompen las células del intestino medio, causan que el insecto deje de alimentarse y finalmente, provocan que el insecto muera. Por esta razón, las toxinas de B. thuringiensis han probado por sí mismas, ser insecticidas efectivos y ambientalmente seguros para tratar con varias plagas de insectos. Los insectos coleópteros y hemípteros, y probablemente los dípteros, lygus y otros insectos perforadores y succionadores exhiben un pH del intestino que es ligeramente ácido, y por lo tanto las toxinas Bt que son efectivas contra las larvas de lepidópteros son inefectivas contra estas plagas. También se cree que el pH ligeramente ácido del intestino de estos insectos es más hospitalario para las composiciones de la presente invención, y sin pretender estar limitado a una teoría particular, es probable que el pH alcalino del intestino de las larvas de lepidópteros sea la razón de que los intentos anteriores para exhibir la eficacia del ARNds haya fallado (Fire et al., Patente de E.U.A. No. 6,506,559; Mesa et al., Publicación de la Patente No.

US2003/0150017; Rajagopal et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:46849-46851 ; Tabara et al., 1998, Science 282:430-431 ). Por lo tanto, se cree que los métodos de ARNds descritos en la presente, deben utilizarse de manera preferida en composiciones y plantas para controlar coleópteros, dípteros, hemípteros, lygus, e insectos perforadores y succionadores. Los métodos y composiciones expuestos en la presente son particularmente útiles para seleccionar genes para la supresión de insectos que exhiben un pH del intestino de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 9.5, o de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 9.0, o de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 8.5, o de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0, o de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.7, o de aproximadamente 6.8 a aproximadamente 7.6, o aproximadamente 7.0. Sin embargo, los insectos y otras especies de plagas que exhiben un pH del intestino de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 11.5, o de aproximadamente 8.0 a aproximadamente 11.0, o de aproximadamente 9.0 a aproximadamente 10.0, tales como las larvas de insectos lepidópteros, también están pretendidos por estar dentro del alcance de la presente invención. Esto es particularmente cierto cuando el ARNds específico por inhibir un gen es una larva de lepidóptero se proporciona en la dieta de la larva junto con una o más proteínas Bt, que con respecto a la proteína Bt, de manera ordinaria, sería tóxica a esa larva de lepidóptero cuando se proporciona en o por encima de un nivel umbral. La presencia de una o más toxinas Bt tóxicas en la misma especie de insectos, reduciría de manera efectiva el pH del intestino, proporcionando un medio estable para que las moléculas de ARN de doble hebra ejerzan sus efectos para suprimir un gen objetivo en la plaga del insecto. Sería útil combinar uno o más constructos de ARNds estabilizado produciendo moléculas de ARNds de la presente invención en la dieta de una plaga del insecto objetivo junto con una o más proteínas insecticidas, de manera que la ARNds y la proteína insecticida sean tóxicos a la misma plaga de insectos. La proteína insecticida puede derivarse de B. thuríngiensis, pero también de otros organismos conocidos en la técnica por producir proteínas insecticidas tales como simbiontes bacterianos de nemátodos entomopatogénicos (por ejemplo, Photorhabdus sp., Xenorhabdus sp.), Serratia entomophila y Serratia sp., B. sphaericus, B. cereus, B. laterosporus, B. popilliae, Clostridium bifementans relacionadas, u otras bacterias gram positivas que forman esporas que exhiben propiedades insecticidas. De igual manera, se considera que dos o más constructos de ARNds estabilizado que producen moléculas de ARNds de la presente invención, pueden proporcionarse junto con una sola planta para asegurar la durabilidad del fenotipo para el control de los insectos. Estas moléculas de ARNds pueden seleccionar el mismo gen para el silenciamiento o, de manera alterna, seleccionar diferentes genes para el silenciamiento. Dos o más ARNds diferentes pueden combinarse juntos en la misma planta, cada ARNds es tóxico a una plaga de insecto diferente, ninguno de los ARNds es tóxico para la misma especie de insecto.

Se anticipa que la construcción de ciertos constructos de ARNds estabilizado con uno o más genes de la proteína para el control de los insectos resultará en sinergias que mejorarán el fenotipo para el control de los insectos de una planta transgénica. Pueden utilizarse bioensayos en insectos que emplean una dieta artificial o un tejido de planta completo para definir la dosis-respuesta para la mortalidad de las larvas o la inhibición del crecimiento, utilizando ambos de los ARNds y las proteínas para el control de los insectos. Alguien con experiencia en la técnica puede probar mezclas de moléculas de ARNds y proteínas para el control de los insectos en bioensayos para identificar combinaciones de activos que son sinergísticos y deseables para el despliegue en plantas protegidas contra los insectos (Tabashnik, 992). La sinergia para destruir las plagas de insectos se ha reportado entre diferentes proteínas para el control de los insectos (para una revisión, véase Schnepf et al., 1998). Se anticipa que existirán sinergias entre ciertos ARNds y entre ciertos ARNds y ciertas proteínas para el control de los insectos. También se anticipa que las combinaciones de ARNds revelarán una toxicidad inesperada hacia ciertas plagas de insectos. Rajagopol et al (2002, J Biol Chem. 277:46849-46851 ), reportaron que la alimentación de los ARNds a las larvas de la plaga de lepidópteros S. litura fue inefectiva en silenciar un gen que codifica una aminopeptidasa del intestino medio. Vale la pena notar que el medio del pH alcalino del intestino medio del lepidóptero típico puede ser un medio hostil para los ARNds, puesto que se esperaría que la desnaturalización de los dúplex de ARN al pH alcalino conduzca a una rápida degradación. Los poros formados por las proteínas de la toxina de B. thuringiensis insertados en la membrana epitelial del intestino medio, resultan en una neutralización del pH del intestino medio (revisado en Gilí, 1995, Mem. Inst. Osaldo Cruz, Río de Janeiro, 90:69-74). En consecuencia, las proteínas de la toxina de B. thuringiensis que son solo capaces de formar canales iónicos transitorios en la membrana epitelial del intestino medio del lepidóptero sin causar mortalidad, pueden ser suficientes para reducir el pH del intestino medio a niveles más favorables para la captación del ARNds por las células epiteliales del intestino medio. Como un ejemplo, se sabe que la proteína CryIAc no es una toxina efectiva contra el gusano guerrero de la remolacha, Spodoptera exigua (Chambers et al., 1991 , J. Bacteriol. 173:3966-3976). Sin embargo, ambas reducciones transitorias en el pH del intestino medio causadas por la proteína CryIAc servirían para estabilizar los ARNds coingeridos y volverlos efectivos para silenciar los genes objetivo de S. exigua, proporcionando por lo tanto un medio inesperado para controlar esta plaga de insectos. Este efecto podría observarse con cualquier proteína, insecticida o no, que rompa la regulación iónica de las células del intestino medio de los insectos lepidópteros, y puede también ser efectiva en coleópteros, dípteros, hemípteros, insectos lygus y otras especies de insectos perforadores y succionadores, y lo similar. Algunas proteínas insecticidas de B. thuringiensis, tales como las proteínas Cyt, pueden causar aberturas transitorias en la membrana epitelial del intestino medio de las larvas de insectos sensibles, debido a la formación de poros estructurados o a la actividad general similar a un detergente de la proteína (Butko, 2003, Appl. Environ. Microbio!. 69:2415-2422). Tales aberturas podrían facilitar el pasaje de las moléculas de ARNds en las células epiteliales del intestino medio incluso a concentraciones de la proteína que son subóptimas para causar mortalidad. Se anticipa que cualquier proteína, insecticida o no que cause aberturas transitorias en las membranas epiteliales de los insectos, podría facilitar el pasaje de las moléculas de ARNds en las células de los insectos y fomentar el silenciamiento del gen. Las secuencias nucleotídicas proporcionadas como se expone en la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143 o en la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, como se expone en el listado de las secuencias o fragmentos de las mismas, o complementos de las mismas, pueden "proporcionarse" en una variedad de medios para facilitar el uso. Tal medio también puede proporcionar un subconjunto de los mismos en una forma que permite a un experto con experiencia examinar las secuencias. Los productos de mercancías que contienen una o más secuencias de la presente invención, y producidos de una planta o semilla recombinante que contiene una o más de las secuencias nucleotídicas de la presente invención, están contemplados de manera específica como modalidades de la presente invención. Un producto de mercancía que contiene una o más de las secuencias de la presente invención, pretende incluir, de manera no exclusiva, harinas, aceites, granos triturados o completos o semillas de una planta, o cualquier producto alimenticio que comprenda cualquier harina, aceite o grano triturado o entero de una planta o semilla recombinante que contenga una o más de las secuencias de la presente invención. La detección de una o más de las secuencias de la presente invención en una o más mercancías o productos de mercancías contempladas en la presente defacto, evidencia que la mercancía o los productos de mercancías están compuestos de una planta transgénica diseñada para expresar una o más de las secuencias nucleotídicas de la presente invención con el propósito de controlar la infestación de insectos utilizando métodos de supresión de genes mediados por ARNds. En una aplicación de esta modalidad, una secuencia nucleotídica de la presente invención puede registrarse en un medio legible por computadora. Como se utiliza en la presente, "medio legible por computadora", se refiere a cualquier medio tangible de expresión que pueda leerse y accesarse directamente por una computadora. Tal medio incluye, de manera no exclusiva: medios de almacenamiento magnético, tal como discos flexibles, disco duro, medios de almacenamiento y cinta magnética: medio de almacenamiento óptico, tal como un CD-ROM; medio de almacenamiento eléctrico tal como una RAM y ROM; archivos para computadora formateados para el reconocimiento de caracteres ópticos e híbridos de estas categorías tales como medios de almacenamiento magnéticos/ópticos. Alguien con experiencia en la técnica puede apreciar fácilmente que cualquiera de los medios legibles por computadora actualmente conocidos puede utilizarse para crear una manufactura que comprende un medio legible por computadora que tiene registrado en el mismo una secuencia nucleotídica de la presente invención. Como se utiliza en la presente, "registrado", se refiere a un procedimiento para almacenar información en un medio legible por computadora. Un experto con experiencia puede adoptar fácilmente cualquiera de los métodos actualmente conocidos para registrar información en un medio legible por computadora para generar un medio que comprende la información de la secuencia nucleotídica de la presente invención. Una variedad de estructuras de almacenamiento de datos, está disponible a un técnico con experiencia para crear un medio legible por computadora que tenga registrado en el mismo una secuencia nucleotídica de la presente invención. La elección de la estructura del almacenamiento de datos se basará generalmente en los medios elegidos para tener acceso a la información almacenada. Además, pueden utilizarse una variedad de programas de procesamiento de datos y formatos para almacenar la información de la secuencia nucleotídica de la presente invención en el medio legible por computadora. La información de la secuencia puede representarse en un archivo de texto de procesamiento de palabras, formateado en un programa comercialmente disponible tal como WordPerfect y Microsoft Word, o representarse en la forma de un archivo de texto ASCII, almacenado en una aplicación de base de datos, tal como DB2, Sybase, Oracle, o lo similar. El experto con experiencia puede adaptar fácilmente cualquier número de formatos que estructuren el procesador de datos (por ejemplo, archivo de texto o base de datos), con el fin de obtener el medio legible por computadora que tenga registrado en el mismo la información de la secuencia nucleotídica de la presente invención. Un programa para computadora está disponible al público, el cual permite a un experto con experiencia, tener acceso a la información de la secuencia proporcionada en el medió legible por computadora. El programa que implementa los algoritmos de búsqueda BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)) y BLAZE (Brutlag, et al., Comp. Chem. 17:203-207 (1993)) en un sistema Sybase, puede utilizarse para identificar los marcos de lectura abiertos (ORF) dentro de las secuencias tales como los Unigenes y EST que se proporcionan en la presente, y que contienen la homología a los ORF o las proteínas de otros organismos. Tales ORF son fragmentos que codifican una proteína dentro de las secuencias de la presente invención y son útiles para producir proteínas comercialmente importantes, tales como enzimas utilizadas en la biosíntesis de aminoácidos, metabolismo, transcripción, traducción, procesamiento de ARN, degradación de ácidos nucleicos y proteínas, modificación de una proteína y replicación, restricción, modificación, recombinación y reparación del ADN. La presente invención proporciona además sistemas, particularmente sistemas basados en computadora que contienen la información de la secuencia descrita en la presente. Tales sistemas se diseñan para identificar fragmentos comercialmente importantes de la molécula de ácido nucleico de la presente invención. Como se utiliza en la presente, "un sistema basado en computadora", se refiere a los medios de elementos físicos, medios de elementos de programación y medios de almacenamiento de datos utilizados para analizar la información de la secuencia nucleotídica de la presente invención. Los medios de elementos físicos mínimos de los sistemas basados en computadora de la presente invención comprenden una unidad de procesamiento central (CPU), medios de entrada, medios de salida y medios de almacenamiento de datos. Un experto con experiencia puede apreciar fácilmente que cualquiera de los sistemas basados en computadora actualmente disponibles son adecuados para utilizarse en la presente invención. La longitud de la secuencia más preferida de una secuencia objetivo es de aproximadamente 10 a aproximadamente 00 aminoácidos o de aproximadamente 23 a aproximadamente 300 residuos nucleotídicos. Como se utiliza en la presente, "un motivo estructural objetivo" o "motivo objetivo" se refiere a cualquier secuencia o combinación de secuencias en las cuales la secuencia o secuencias se eligen basándose en una configuración tridimensional que se forma tras el pliegue del motivo objetivo. Existe una variedad de motivos objetivo conocidos en la técnica. Los motivos objetivo de proteína incluyen de manera no exclusiva, sitios activos enzimáticos y secuencias de señal. Los motivos objetivos de ácidos nucleicos incluyen de manera no exclusiva, secuencias promotoras, elementos cis, estructuras de horquilla y elementos de expresión inducibles (secuencias que se unen a la proteína).

EJEMPLOS Los inventores de la presente han identificado medios para controlar la infestación de plagas invertebradas proporcionando una molécula de ácido ribonucleico de doble hebra en la dieta de la plaga. De manera sorprendente, los inventores han descubierto que una molécula de ácido nucleico de doble hebra funciona tras la ingestión por la plaga para inhibir una función biológica en la plaga, resultando en uno o más de los siguientes atributos: reducción en la alimentación por la plaga, reducción en la viabilidad de la plaga, muerte de la plaga, inhibición de la diferenciación y el desarrollo de la plaga, ausencia de o capacidad reducida para la reproducción sexual por la plaga, formación de músculos, formación de la hormona juvenil, regulación de la hormona juvenil, regulación y transporte iónico, mantenimiento del potencial de la membrana celular, biosíntesis de aminoácidos, degradación de aminoácidos, formación de esperma, síntesis de feromonas, detección de feromonas, formación de antenas, formación de alas, formación de piernas, desarrollo y diferenciación, formación de huevos, maduración de las larvas, formación de la enzima digestiva, síntesis de hemolinfa, mantenimiento de hemolinfa, neurotransmisión, división celular, metabolismo de la energía, respiración, apoptosis, y cualquier componente de una estructura citoesquelética de las células eucarióticas tales como por ejemplo, actinas y tubulinas. Cualquiera o cualquier combinación de estos atributos puede resultar en una inhibición de la infestación de la plaga, y en el caso de una plaga de plantas, la inhibición de la infestación de la plaga. Por ejemplo, cuando se utiliza como una composición de dieta que tiene una cantidad inhibidora suficiente de la plaga de una o más moléculas de ácido nucleico de doble hebra proporcionada tópicamente a una planta, como un tratamiento en la semilla, como una aplicación en el suelo alrededor de una planta o cuando se produce por una planta de una molécula de ADN recombinante presente dentro de las células de una planta, la infestación de la plaga de la planta se reduce dramáticamente de manera inesperada. Los ejemplos expuestos en la presente a continuación son ilustrativos de la invención cuando se aplican a una sola plaga. Sin embargo, el experto con experiencia reconocerá que los métodos, fórmulas, e ¡deas presentados en los ejemplos no pretenden ser limitantes, y que son aplicables a todas las especies de plagas invertebradas que pueden consumir fuentes de alimento que pueden formularse para contener una cantidad suficiente de un agente inhibidor de la plaga, que consiste de al menos una o más moléculas de ARN de doble hebra ejemplificadas en la presente, pretendidas para suprimir alguna característica esencial o función dentro de la plaga.

EJEMPLO 1 Este ejemplo ilustra la identificación de las secuencias nucleotídicas que cuando se proporciona en la forma de moléculas de ARN de doble hebra en la dieta de un gusano de la raíz del maíz, son útiles para controlar los gusanos de la raíz del maíz. Se construyeron bibliotecas de ADNc del gusano de la raíz del maíz (LIB149, LIB150, LIB3027, LIB3373) de larvas completas y de secciones disecadas del intestino medio, y se obtuvo la información de la secuencia nucleotídica (véase Andersen et al., Solicitud de Patente No. de Serie 10/205,189 presentada en Julio 24 del 2002 incorporada de la presente de manera específica como referencia en su totalidad. Además, se construyeron bibliotecas de ADNc de larvas completas de diferentes etapas de desarrollo y en diferentes tiempos dentro de cada etapa de desarrollo, con el fin de maximizar el número de diferentes secuencias EST de las especies de Diabrotica. Se construyeron bibliotecas LIB5444 y LIB5462 respectivamente de recolecciones de ARNm obtenidas de larvas del gusano de la Raíz del Maíz Occidental de la primera instar (1 gramo) y la tercera instar (2.9 gramos). Los insectos recolectados se congelaron rápidamente mediante inserción en nitrógeno líquido. Los insectos se trituraron en un mortero con mano y se mantuvieron a o debajo de -20°C enfriando en hielo seco y/o con adición de nitrógeno líquido al mortero hasta que el tejido se trituró en un polvo fino. El ARN se extrajo utilizando el reactivo TRIzol® (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El Poly A+ se aisló de la preparación de ARN total utilizando Dynabeads Oligo dT (Dynal Inc., NY) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se construyó una biblioteca de ADNc del Poly A+ ARN utilizando el Sistema de Plásmido SuperScriptMR (Invitrogen). El ADNc se dimensionó fraccionado utilizando cromatografía. La cuarta y quinta fracciones se recolectaron y ligaron en el vector pSPORTI (Life Technologies Inc., Gaithersburg MD) entre los sitios de reconocimiento de las endonucleasas de restricción Sa/1 y ?/?? , y se transformaron en células electrocompetentes DH10B de E. coli mediante electroporación. La biblioteca de las larvas de la primera instar proporciona aproximadamente 420,000 unidades que forman colonia. La biblioteca de la larva de la tercera instar proporciona aproximadamente 2.78 x 106 unidades que forman colonia. Las colonias de LIB149, LIB150 se lavaron de las placas, se mezclaron hasta uniformidad sometiendo a vórtice brevemente, y se reunieron en un amortiguador de Tris-EDTA. La mitad de lavado se llevó a glicerol al 10%, se tomaron alícuotas en crioviales, y se almacenó a -70°C. La otra mitad se utilizó para producir el ADN del plásmido utilizando una columna de purificación midiprep de Quiagen o su equivalente. Se tomaron alícuotas del ADN del plásmido purificado en tubos de microcentrífuga y se almacenaron a -20°C. Las colonias de las bibliotecas de ADNc de Diabrotica virgifera LIB5444 y LIB5462 se amplificaron de manera individual en un medio de alta viscosidad. Aproximadamente 200,000 unidades que forman colonia de LIB5444 y 600,000 unidades que forman colonia de LIB5462 se mezclaron en una placa agitada de manera separada en 500 mi de medio LB que contiene agarosa® SeaPrep al 0.3% y 50 mg/l de carbenecilina a 37°C, y a continuación se enfriaron rápidamente en un baño de agua/hielo de 1 hora, dejando una suspensión uniforme de las colonias bacterianas. Las bibliotecas inoculadas se dejaron crecer a 30°C durante 42 horas. Después de la incubación, las células se mezclaron durante 5 minutos en una placa agitada. El medio se transfirió entonces a dos botellas de centrífuga de 250 mi. Las células bacterianas se granularon a 10,000 x g durante 10 minutos. El medio se retiró de las botellas y las células se resuspendieron en un total de 20 mi del medio LB con 50 mg/l carbenecilina. Se agregó sulfóxido de dimetilo al 10% para preservar las células en congelación. Ambas bibliotecas se amplificaron a un título final de 108 unidades que forman colonia por mililitro. Las muestras de las bibliotecas de ADNc de LIB5444 y LIB5462 se combinaron y ajustaron a una concentración de ADN de aproximadamente 1.25 microgramos por microlitro en agua destilada y desionizada estéril y se tomaron alícuotas en 25 crioviales, cada criovial contiene aproximadamente 8.75 microgramos de ADN. Estas muestras se depositaron por las solicitantes/inventores con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) localizada en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, EUA ZIP 20110-2209 en Junio 10 del 2004 y se refirieron como LIB5444/62. La ATCC proporcionó a la Solicitante un recibo de depósito, asignando el Acceso de Depósito de la ATCC No. PTA-6072.

Se prepararon bibliotecas de ADNc de alto peso molecular de gusano de raíz de maíz, es decir, LIB5496 y LIB5498, esencialmente como se describió anteriormente, para la producción de bibliotecas de ADNc de gusano de raíz de maíz. Se construyeron bibliotecas LIB5496 y LIB5498 respectivamente de recolecciones de ARNm obtenidas de las larvas del Gusano de la Raíz del Maíz Occidental de la primera instar (1 gramo) y la segunda y tercera instar (1 gramos). Brevemente, los insectos se enfriaron rápidamente en nitrógeno líquido. Los insectos congelados se redujeron a un polvo fino triturando en un mortero con mano. El ARN se extrajo utilizando reactivo TRIzol® (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El Poly A+ ARN se aisló de la preparación de ARN total utilizando Dynabeads Oligo dT (Dynal Inc., NY). Se hizo una biblioteca de ADNc de alto peso molecular de 20 microgramos de Poly A+ ARN utilizando el Sistema de Plásmido SuperScriptMR (Invitrogen). El ADNc se dimensionó fraccionado en un gel de agarosa al 1 % en TAE y el ADNc entre el intervalo de 1 Kb a 10 Kb se recolectó y se ligó en el vector pSPORTI entre los sitios de restricción Sa/1 y ?/?? , y se transformó en células electrocompetentes DH10B de E. coli mediante electroporación. LIB5496 proporcionó un título total de aproximadamente 3.5 x 106 unidades que forman colonia. LIB5498 proporcionó un título total de aproximadamente 1.0 x 106 unidades que forman colonia. Las colonias de las bibliotecas de ADNc de alto peso molecular del gusano de la raíz del maíz LIB5496 y LIB5498, se amplificaron de manera individual en un medio de alta viscosidad. Aproximadamente 600,000 unidades que forman colonia de LIB5496 y LIB5498 se mezclaron en una placa agitada de manera separada en 500 mi de medio LB que contiene agarosa® SeaPrep al 0.3% y 50 mg/l de carbenecilina a 37°C, y a continuación se enfriaron rápidamente en un baño de agua/hielo durante 1 hora, permitiendo una suspensión uniforme de las colonias bacterianas. Las bibliotecas se dejaron crecer a continuación a 30°C durante 42 horas. Después de la incubación, las células se mezclaron durante 5 minutos en una placa agitada. El medio se transfirió a continuación a dos botellas de centrífuga de 250 mi. Las células bacterianas se granularon a 10,000 x g durante 10 minutos. El medio se retiró de las botellas y las células se resuspendieron en un total de 20 mi del medio LB con 50 mg/I carbenecilina. Se agregó sulfóxido de dimetilo al 10% para preservar las células en congelación. Ambas bibliotecas se amplificaron a un título final de 108 unidades que forman colonia por mililitro. La información de la secuencia de ADNc insertada se obtuvo de las bibliotecas del plásmido específico de la especie del gusano la raíz del maíz, Las bibliotecas del gusano del maíz de Andersen et. al., junto con las secuencias adicionales de las bibliotecas LIB5444 y LIB5462 produjeron inicialmente aproximadamente 18,415 secuencias EST individuales que consisten de aproximadamente 1.0 x 107 residuos nucleotídicos. La longitud promedio de una secuencia de EST fue de aproximadamente 586 residuos nucleotídicos. Estas secuencias EST se sometieron a algoritmos de bioinformática que resultaron en el montaje de secuencias contiguas referidas en la presente como secuencias UNIGENE, y secuencias EST individuales que no pueden recopilarse mediante superposición de la identidad con otras secuencias EST, referidas en la presente como monoelementos. Las bibliotecas LIB5444 y LIB5462 se secuenciaron a continuación de manera mucho más profunda, resultando en secuencia EST individuales adicionales. Las secuencias EST obtenidas de las bibliotecas, es decir LIB149, LIB150, LIB3027, LIB3373, LIB5444, LIB5462, LIB5496 y LIB5503, se exponen en el listado de las secuencias de la SEQ ID NO: 1 hasta SEQ ID NO:143 y de la SEQ ID NO: 169 hasta la SEQ ID NO: 174. Las secuencias EST aisladas de las bibliotecas de ADNc de CRW se montaron, cuando es posible, en los conjuntos UNIGENE y estas secuencias UNIGENE montadas se listan en el listado de las secuencias. Un UNIGENE es un cúmulo orientado al gen formado de la superposición de secuencias EST individuales dentro de regiones de identidad de la secuencia para formar una secuencia mayor. Pontius et al., Nucí Acids Res 31 : 28-33 (2003). Cada secuencia nucleotídica como se expone en el listado de las secuencias se analizó para identificar la presencia de marcos de lectura abiertos. La información de la secuencia de aminoácidos deducida de los marcos de lectura abiertos se comparó con la información conocida de las secuencias de aminoácidos disponible en bases de datos públicas con el fin de reducir el grado de identidad de la secuencia de aminoácidos por la similitud con aquellas secuencias conocidas de aminoácidos. Las anotaciones proporcionaron información sugestiva de la función de una proteína que puede expresarse de un gen particular que da lugar a una secuencia de ADNc particular, pero no fue un resultado determinante. Basándose en la información de la anotación sugestiva, ciertas secuencias de ADNc se caracterizaron como aquéllas que codifican una proteína que probablemente estaba involucrada en alguna función biológica dentro de las células del gusano de la raíz del maíz que era esencial para la vida, o que era necesaria para curar la salud y vitalidad de una célula, o que probablemente estaba involucrada en la integridad celular, el mantenimiento celular, la capacidad reproductora y lo similar. Varias secuencias de ADNc se seleccionaron de este subconjunto de secuencias de ADNc que probablemente codifican proteínas, la inhibición de las cuales probablemente causa la morbilidad o mortalidad del CRW o de otras células de especies invertebradas. Estas secuencias se utilizaron a continuación en la construcción de moléculas de ARN de doble hebra para la incorporación en la dieta del CRW. Los pares de cebadores por amplificación térmica se diseñaron basándose en las secuencias de ADNc reportadas en la biblioteca de ADNc del CRW. Se construyeron pares de cebadores como un par de secuencias nucleotídicas, cada miembro de un par de cebadores exhibe una complementariedad perfecta ya sea con la secuencia sentido o con una antisentido. Algunas secuencias de pares de cebadores se construyeron de manera que cada miembro del par exhibe una secuencia que contiene un promotor de la ARN polimerasa del fago T7 en su extremo 5' como se expone, por ejemplo, en la SEQ ID NO:5, de la posición del nucleótido 1 hasta la posición del nucleótido 23. De manera preferida, se llevó a cabo una primera reacción de amplificación de fidelidad más alta utilizando un primer par de cebadores que carece de promotor T7 para generar un primer amplicón utilizando el ADN genómico de CRW como la plantilla. De manera preferida, una secuencia de ADNc o ARNm se utiliza como la plantilla para la síntesis de una molécula de ARNds para utilizarse en la presente invención, debido a que las secuencias del genoma eucariótico se reconocen en la técnica como que contienen secuencias que no están presentes dentro de la molécula de ARN maduro. Una muestra del primer amplicón generado de la primer reacción de amplificación de fidelidad más alta se utilizó a continuación como la plantilla en una segunda reacción de amplificación térmica con un segundo par de cebadores que contienen la secuencia promotora T7 para producir un segundo amplicón que contiene un promotor T7 en o incluido dentro del extremo 5' de cada hebra del segundo amplicón. La secuencia nucleotídica completa del segundo amplicón se obtuvo en ambas direcciones y se comparó a la secuencia nucleotídica reportada para el ADNc, y se notaron las discrepancias entre las dos secuencias, si las hay. Generalmente, las secuencias preparadas utilizando el ADN del genoma como plantilla son inconsistentes con el uso adicional como moléculas de ARNds para utilizarse para lograr niveles significativos de supresión, debido a las variaciones dentro de las secuencias del genonna que no están presentes dentro de la secuencia de ARNm o de ADNc. Una reacción de transcripción in vitro típicamente contiene de aproximadamente a aproximadamente 2 microgramos de la plantilla de ADN linealizado, amortiguador de la reacción de la polimerasa T7 de un concentrado 10X, ribonucleótidos ATP, CTP, GTP, y UTP a una concentración final de entre 50 y 100 miembro cada uno, y una unidad de encima de ARN polimerasa 11. La reacción de la ARN polimerasa se incubó a aproximadamente 37°C, dependiendo de la temperatura óptima de la ARN polimerasa utilizada de acuerdo con las instrucciones del fabricante, durante un periodo de tiempo que varía de varios minutos a varias horas. Generalmente, las reacciones se llevaron a cabo de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 horas para la transcripción de las secuencias de la plantilla hasta aproximadamente 400 nucleótidos de longitud, y durante hasta 20 horas para la transcripción de secuencias de plantilla mayores que aproximadamente 400 nucleótidos de longitud. El calentamiento de la reacción a 65°C durante 15 minutos termina en la transcripción del ARN. Los productos de la transcripción del ARN se precipitaron en etanol, se lavaron, se secaron con aire y se resuspendieron en ARNasa libre de agua a una concentración de aproximadamente 1 microgramo por microlitro. La mayoría de los transcriptos que toman ventaja de la estrategia de los promotores T7 opuestos, expuesta anteriormente, produjo un ARN de doble hebra en la reacción de transcripción in vitro, sin embargo, se obtuvo un rendimiento más alto del ARN de doble hebra calentando el ARN purificado a 65°C, y a continuación enfriando lentamente a temperatura ambiente para asegurar un recocido apropiado de los segmentos de ARN sentido y antisentido. Los productos de ARN de doble hebra se incubaron a continuación con AADNsa 1 y ARNasa a 37°C durante 1 hora para eliminar cualquier ADN o ARN de una sola hebra presente en la mezcla. Los productos de ARN de doble hebra se purificaron sobre una columna de acuerdo con las instrucciones del fabricante (EQUIPO RNAi MEGASCRIPT AMBION) y se resuspendieron en amortiguador Tris HCIO 10 mM (pH 7.5) o ARNasa libre de agua a una concentración de entre 0.1 y 1.0 microgramos por microlitro. Una muestra del ARN de doble hebra se agregó directamente a cada pozo que contiene la dieta del insecto como se indicó anteriormente, o se modificó antes de agregarse a la dieta del insecto. La modificación del ARN de doble hebra siguió las instrucciones para la ARNasa III (AMBION CORPORATION, Austin, Texas) o DICER (STRATAGENE, La Jolla, California) proporcionadas por el fabricante. La digestión de la ARNasa III del ARN de doble hebra produjo dúplex de 21 y 22 nucleotidos que contienen extremos 5' fosforilados y extremos 3' hidroxilo con salientes de 2-3 bases, similares a los fragmentos de ARN corto interfiriente (ARNsi) duplexado de aproximadamente 21-26 pares de bases producidos por la enzima dicer en la trayectoria eucariótica identificada por Hamilton et. al. (Science, 1999,286:950-952) y Elbashir et. al. (Genes & Development, 2001 ,15:188-200). Esta colección de dúplex de ARN cortos interfirientes se purificó además y una muestra se caracterizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida para determinar la integridad y eficiencia de la formación del dúplex. La pureza y cantidad de la muestra se determinó a continuación mediante espectrofotometría a una longitud de onda de 250 nanómetros, y la mezcla no utilizada se mantuvo para uso adicional mediante almacenamiento a -20°C. Las muestras de ARNsi o el ARN de doble hebra de longitud completa (ARNds) se sometieron a bioensayo con un número seleccionado de plagas objetivo. Dosis variables de ARNds o ARNsi se aplicaron como un recubrimiento para una dieta artificial del gusano de la raíz del maíz de acuerdo con el siguiente procedimiento. Los huevos de Diabrotica virgifera virgifera (WCR) se obtuvieron de Crop Characteristics, Inc., Farmington, Minnesota. Los huevos de WCR sin letargo se incubaron en tierra durante aproximadamente 13 días a 24°C, 60% de humedad relativa, en oscuridad completa. En el día 13 la tierra que contiene los huevos de WCR se colocó entre tamices de malla #30 y #60 y los huevos se lavaron de la tierra utilizando una manguera de jardín a alta presión. Los huevos se desinfectaron superficialmente remojándolos en LYSOL durante 3 minutos, se enjuagaron tres veces con agua estéril, se levaron una vez con una solución de formalina al 10% y a continuación se enjuagaron tres veces adicionales en agua estéril. Los huevos tratados de esta manera se distribuyeron en filtros para café estériles y se ocultaron durante la noche a 27°C, 60% de humedad relativa, en oscuridad completa.

La dieta del insecto se preparó esencialmente de acuerdo con Pleau et al. (Entomología Experimental^ et Applícata, 2002, 105:1- 1), con las siguientes modificaciones. 9.4 gramos de agar SERVA se distribuyeron en 540 mi de agua purificada y se agitaron hasta que el agar se distribuyó completamente. La mezcla de agua/agar se calentó a ebullición para disolver completamente el agar, y a continuación se vertió en un mezclador WARING. El mezclador se mantuvo a baja velocidad mientras que 62.7 gramos de mezcla de BIO-SERV DIET (F9757), 3.75 gramos de raíz de maíz liofilizada, 1.25 mi de colorante alimenticio verde y 0.6 mi de formalina se agregaron a la mezcla de agar caliente. La mezcla se ajustó a continuación a pH 9.0 con la adición de una solución patrón de hidróxido de potasio al 10%. El volumen de aproximadamente 600 mi de la dieta líquida se mezcló continuamente a alta velocidad y se mantuvo de aproximadamente 48°C a aproximadamente 60°C, utilizando una barra de agitación magnética recubierta con NALGENE esterilizado, o una placa caliente con agitación magnética, mientras que se distribuyen alícuotas de 200 microlitros en cada pozo de placas de microtitulación de fondo redondo de 96 pozos FALCON. La dieta en las placas se dejo solidificar y se secó al aire en una biocampana estéril durante aproximadamente 0 minutos. Volúmenes de treinta (30) microlitros de las muestras de prueba que contienen los reactivos de control o el ARN de doble hebra en cantidades variables, se superpusieron en la superficie de la dieta del insecto en cada pozo, utilizando un repetidor micropipeteador. La dieta del insecto se dejó reposar en una biocampana estéril hasta media hora después de la aplicación de las muestras de prueba para permitir que los reactivos se difundan en la dieta y permitir que se seque la superficie de la dieta. Una larva neonata de WCR se depositó en cada pozo con un pincel fino. Las placas se sellaron a continuación con MYLAR y ventilaron utilizando un alfiler para insectos. Se probaron 12-72 larvas de insectos por dosis dependiendo del diseño del ensayo. Las placas de bioensayo se incubaron a 27°C, 60% de humedad relativa en oscuridad completa durante 12-14 días. El número de larvas sobrevivientes por dosis se registró al punto de medición de 12-14 días. La masa de las larvas se determinó utilizando una microbalanza adecuada para cada larva superviviente. Los datos se analizaron utilizando el programa estadístico JMP®4 (SAS Institute, 1995) y se realizó una ANOVA factorial completa con una prueba de Dunnet para buscar los efectos del tratamiento en comparación con el control no tratado (P<0.05). Se realizó una prueba post hoc de Tukey-Kramer para comparar todos los pares de los tratamientos (P<0.05). La siguiente secuencias nucleotídicas se derivaron primero como secuencias de ADNc identificadas en una biblioteca de ADNc del intestino medio del gusano de la raíz del maíz (Andersen et al., ibid), y se adaptaron para utilizarse para construir moléculas de ARN de doble hebra para utilizarse para probar la eficacia de la inhibición de una función biológica en una plaga alimentando las moléculas de ARN de doble hebra en la dieta de la plaga.

Una Secuencia Homologa a Chd3 Los genes CHD se han identificado en numerosos eucariotes, y las proteínas correspondientes se proponen como que funcionan como factores que remodelan la cromatina. El termino CHD se deriva de los tres dominios de la homología de la secuencia encontrados en las proteínas CHD: un dominio cromo (modificador de la organización) de la cromatina, un dominio de helicasa relacionado con SNF-2/ATPasa y un dominio que se une al ADN, se cree que cada uno de los cuales confiere una actividad distinta relacionada con la cromatina. Las proteínas de CHD se separaron en dos categorías basadas en la presencia o ausencia de otro dominio de homología de la secuencia, un dominio de dedos de zinc PHD, asociado típicamente con la actividad relacionada con la cromatina. Las proteínas relacionadas con CHD3 poseen un dominio de dedo de zinc PHD, pero las proteínas relacionadas con CHD1 no. Las observaciones experimentales han sugerido un papel de las proteínas CHD3 en la represión de la transcripción, y en algunas especies han mostrado ser un componente de un complejo que contiene histon diacetilasa como una subunidad. La desacetilación de las histonas se correlaciona con la inactivación transcripcional, y por lo tanto las proteínas CHD3 se han implicado como que funcionan como represores de la transcripción en virtud de ser un componente de un complejo de histon desacetilasa (Ogas et al., 1999, PNAS 96: 13839-13844). Así, la supresión de la síntesis de la proteína CHD3 puede ser un objetivo útil para la inhibición mediada por el ARN de doble hebra de las plagas invertebradas.

La SEQ ID NO:4 corresponde a una secuencia nucleotídica de ADNc del intestino medio de CRW, la traducción de la secuencia de aminoácido de la cual se indicó como homologa a la secuencia de aminoácidos CHD3 de Drosophila melanogangster (No. de Acceso de GenBank AF007780). La SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 40609 corresponden respectivamente a los cebadores de amplificación del genoma hacia delante e inversos (es decir, un par de cebadores), para utilizarse en producir un amplicón del ADN genómico de CRW, de las recolecciones de ARNm de CRW, o del ADNc producido de tales recolecciones. La secuencia de tal amplicón corresponde a una parte del gen de CRW que codifica un homólogo de la secuencia de aminoácido CHD3 de D. melanogangster. La SEQ ID NO:5 contiene una secuencia promotora de la polimerasa T7 en su extremo 5' (nucleótidos 1-23) enlazada a la secuencia del cebador del genoma CRW (asignada de manera arbitraria como la secuencia del cebador hacia delante) descrita como se expone en la SEQ ID NO:5 de la posición del nucleótido 24-45, que corresponde a la posición del nucleótido 31 hasta la posición del nucleótido 32, como se expone en la SEQ ID NO:4. La SEQ ID NO:6 contiene una secuencia promotora de la polimerasa T7 en su extremo 5' como se expone de la posición del nucleótido 1-23. La secuencia del promotor T7 está enlazada en su extremo 3' a una secuencia del cebador del genoma inverso asignado de manera arbitraria que corresponde a la posición del nucleótido 24-44 como se expone en la SEQ ID NO:6, el complemento inverso de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:4 de la posición del nucleótido 298-319. Utilizando el par de cebadores que consiste de la SEQ ID NO:5 y la SEQ ID NO:6 en una reacción de amplificación con el ADN genómico de CRW como una plantilla, se produce una amplicón de 335 pares de bases que comprende la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO:7, que corresponde a una parte del genoma CRW que codifica una proteína que exhibe aproximadamente 66% de identidad con la secuencia de aminoácido CHD 3 de Drosophila melanogangster. Los nucleótidos en la posición 1 -23 y el complemento inverso de los nucleótidos en la posición 314-335 como se expone en la SEQ ID NO:7, corresponden a las secuencias promotoras T7 en cualquier extremo del amplicón. La secuencia nucleotídica genómica amplificada que se expone en la SEQ ID NO:7 del nucleótido 24 hasta el nucleótido 313, corresponde sustancialmente con la secuencia nucleotídica de ADNc reportada como se expone en la SEQ ID NO:4 del nucleótido 31 hasta el nucleótido 319, excepto que los nucleótidos en las posiciones 63, 87, 1 17, 177, 198, 213, 219-220, 246, 249 y 261 como se expone en la SEQ ID NO:4 se reportaron como T, T, G, G, G, T, T, T, C, C, y A respectivamente, mientras que las posiciones correspondientes en la alineación con la SEQ ID NO:7 contuvo C, C, A, A, A, C, A, C, G A, y G en las posiciones nucleotídicas 56, 80, 1 10, 170, 191 , 206, 212-213, 239, 242, y 254. Esta diferencia corresponde a aproximadamente una diferencia del 4% en la composición de la secuencia nucleotídica entre la secuencia de ADNc reportada previamente y la secuencia del amplicón producida de la plantilla del ADN genómico, consistente con el reporte anterior de que la secuencia de ADNc es probablemente menor que 99% exacta (Andersen et al., ibid.). Un amplicón que exhibe la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO:7 se clonó en un vector plasmídico capaz de replicación en E. coli y se recuperaron cantidades suficientes del ADN plasmídico para permitir la transcripción del ARN polimerasa T7 in vitro de los promotores T7 convergentes incluidos en cualquier extremo del fragmento clonado. El ARN de doble hebra se produjo y sometió a un ensayo, un segmento de ARN que consiste de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:7 de aproximadamente la posición del nucleótido 24 a al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 313, excepto que un residuo de uridina está presente en cada posición en la cual un residuo de timidina se muestra en la SEQ ID NO:7, el otro segmento de ARN es sustancialmente el complemento inverso de la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:7, de aproximadamente la posición del nucleótido 313 a al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 24, las uridinas están colocadas de manera apropiada en lugar de las timidinas. Una muestra del ARN de doble hebra (ARNds) se trató con DICER o con ARNasa III para producir suficientes cantidades de ARN pequeños interfirientes (ARNsi). Las muestras que contienen 0.5 partes por millón de ARNsi o ARNds se superpusieron en un bioensayo de la dieta del CRW como se describió anteriormente, y las larvas se dejaron alimentar durante tres días. Las larvas de CRW que se alimentan con la dieta que contiene los ARNds que corresponden a toda o parte de la secuencia como se exponen en la SEQ ID NO:4, exhibieron una inhibición del crecimiento y mortalidad significativas en comparación con los controles. Otras secuencias nucleotídicas derivadas de CRW también se probaron en un bioensayo en paralelo con la secuencia CHD3 que incluyen las secuencias nucleotídicas indicadas como que probablemente codifican los equivalentes de las proteínas de CRW tales como la proteína de beta tubulina, la proteína de la subunidad de V-ATPasa de 40 kDa, las proteínas del factor de elongación EF1 y EF1 48D, la proteína P28 de la subunidad del proteosoma 26S, la proteína de la epóxido hidrolasa de la hormona juvenil, la proteína del canal del cloruro dependiente del aumento del tamaño, proteína glucosa 6 fosfato 1 deshidrogenasa, proteína actina 42a, proteína del factor 1 de ADP ribosilación, factor 2b de transcripción, proteínas de quitinasa y una enzima que conjuga la ubiquitina.

Una secuencia homologa a beta-tubulina Las proteínas de tubulina son componentes estructurales importantes de muchas estructuras celulares en todas las células eucarióticas y principalmente en la formación de microtúbulos. La inhibición de la formación de microtúbulos en las células resulta en efectos catastróficos, incluyendo la interferencia con la formación de los husos mitóticos, el bloqueo de la división celular y lo similar. Por lo tanto, la supresión de la formación de la proteína tubulina puede ser un objetivo útil para la inhibición mediada por el ARN de doble hebra. Una secuencia relacionada con la beta tubulina derivada de CRW se identificó para utilizarse en la presente invención. La SEQ ID NO:18 corresponde a una secuencia nucleotídica de ADNc del intestino medio de CRW, la traducción de la célula de aminoácido de la cual se indicó como homologa en parte a una secuencia de aminoácido de beta 1 tubulina de Manduca sexta y en parte a una secuencia de aminoácido de beta 1 tubulina de Drosophila melanogaster (No. de Acceso de GenBank AF030547 y M20419, respectivamente). La SEQ ID NO:19 y la SEQ ID NO:20 corresponden respectivamente a los cebadores de amplificación del genoma hacia adelante e inverso (es decir, un par de cebadores) para utilizarse en la producción de un amplicón del ADN genómico de CRW, de recolecciones de ARNm de CRW o del ADNc producido de tales recolecciones. La secuencia de tal amplicón corresponde a todo o parte de un gen de CRW que codifica una proteína de beta tubulina. La SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO:20 contienen cada una secuencia promotora T7 de 23 nucleótidos de las posiciones nucleotídicas 1-23 respectivamente. Los nucleótidos 24-44 como se exponen en la SEQ ID NO:19, corresponden a los nucleótidos 96-116 como se exponen en la SEQ ID NO: 18. Los nucleótidos 24-44 como se expone en la SEQ ID NO:20, corresponden al complemento inverso de la secuencia como se exponen en la SEQ ID NO:18 de los nucleótidos 418-448. Utilizando el par de cebadores que consisten de la SEQ ID NO:19 y la SEQ ID NO:20 y una reacción de amplificación con el ADN genómico de CRW como una plantilla, se produce un amplicón de 399 pares de bases que comprende la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:21 , que corresponde sustancialmente a una parte del genoma de CRW que codifica a una proteína que exhibe una identidad sustancial con una proteína de beta tubulina homologa presente en Drosophila melanogaster y Manduca sexta. La secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:21 corresponde sustancialmente a la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO: 18 de los nucleótidos 96-448. No se observaron diferencias en la secuencia entre la secuencia del amplicón del genoma y la secuencia correspondiente de la secuencia de ADNc. Un amplicón que exhibe la secuencia que corresponde a la secuencia SEQ ID NO:21 se clonó en un vector plasmídico, y se recuperaron cantidades suficientes del plásmido de ADN para permitir la transcripción del ARN polimerasa T7 in vitro de los promotores T7 incluidos que convergen en cualquier extremo del amplicón clonado. El ARN de doble hebra se produjo y una muestra se sometió a bioensayo, un segmento de ARN, la hebra sentido, que consiste de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:21 , de aproximadamente la posición del nucleótido 24 a al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 376, excepto que un residuo de uridina está presente en cada posición en la cual un residuo de timidina se muestra en la SEQ ID NO:21 , el segmento de ARN del complemento inverso, o la hebra antisentido, es sustancialmente el complemento inverso de la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:21 , de aproximadamente la posición del nucieótido 376 al menos hasta la posición del nucieótido 24, las uridinas están colocadas de manera apropiada en el lugar de las timidinas. Una muestra del ARN de doble hebra (ARNds) se trató con DICER o con ARNasa III para producir suficientes cantidades de ARN interfiriente pequeño (ARNsi). Las muestras que contienen 0.15 partes por millón de ARNsi o ARNds se superpusieron en un ensayo de la dieta de CRW como se describió anteriormente y las larvas se dejaron alimentar durante 13 días. Las larvas de CRW que se alimentan con la dieta que contiene los ARNds que corresponden a toda o parte de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:18, exhibieron una inhibición del crecimiento y mortalidad significativas en comparación con los controles.

Una secuencia homologa a la V-ATPasa de 40 kDa El metabolismo de la energía dentro de los organelos subcelulares en los sistemas eucarióticos es una función esencial. Las ATP sintasas vacuolares están involucradas en el mantenimiento de niveles suficientes de ATP dentro de las vacuolas. Por lo tanto, las ATP sintasas vacuolares pueden ser un objetivo útil para la inhibición mediada por el ARN de doble hebra. Una secuencia nucleotídica que codifica una proteína que muestra una similitud con una V-ATPasa de 40 kDa se derivó de CRW. Una traducción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:32 exhibió homología con una secuencia de aminoácidos de la sububidad de V-ATPasa de 40 kDa de Manduca sexta (No. de Acceso de GenBank X98825). La SEQ ID NO:33 y SEQ ID NO:34 corresponden respectivamente, a los cebadores de la amplificación del genoma hacia delante e inverso (es decir, un par de cebadores) para utilizarse en la producción de un amplicón del ADN genómico de CRW, recolecciones de ARNm de CRW o un ADNc de CRW derivado de tales recolecciones. La secuencia de tal amplicón debe corresponder a todo o parte de un gen de CRW que codifica una proteína homologa de V-ATPasa de 40 kDa. Sin embargo, la secuencia nucleotídica de un amplicón derivado utilizando el ADN genómico de CRW como una plantilla, fue inconsistente con la secuencia de ADNc reportada como se expone en la SEQ ID NO:32. La SEQ ID NO:33 y la SEQ ID NO:34 representan cebadores de amplificación térmica. Cada cebador contiene una secuencia promotora T7 de 23 nucleótidos de las posiciones de nucleótidos 1-23 respectivamente. Los nucleótidos 24-44 como se exponen en la SEQ ID NO:33, corresponden a los nucleótidos 95-111 como se exponen en la SEQ ID NO:32. los nucleótidos 24-43 como se expone en la SEQ ID NO:34, corresponden al complemento inverso de la secuencia como se expone en las SEQ ID NO:32 de los nucleótidos 362-381. Utilizando el par de cebadores que consisten de la SEQ ID NO:33 y la SEQ ID NO:34 en una reacción de amplificación con la plantilla de ADN genómico de CRW, se produjo un amplicón de 291 pares de bases que comprende la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:35. La SEQ ID NO:35 del nucleótido 24 hasta el nucleótido 268 exhibió sólo aproximadamente 50% de homología con la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO:32, basándose en la alineación de ADN de Martinez/Needleman-Wunsh. La secuencia del amplicón derivado utilizando el par de cebadores de la amplificación térmica seleccionada, fue inconsistente con la secuencia reportada como se expone en la SEQ ID NO:32. De manera preferida, se produce un amplicón utilizando una recolección de ARNm de CRW o un ADNc derivado de tal recolección. Se produjo un amplicón que exhibe la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO:32 de aproximadamente la posición del nucleótido 95 hasta aproximadamente la posición del nucleótido 381 , y se clonó en el vector del plasmídico, y se recuperaron cantidades suficientes del plásmido de ADN para permitir la transcripción de la ARN polimerasa 11 in vitro de los promotores T7 incluidos que convergen, en cualquier extremo del amplicón clonado. El ARN de doble hebra se produjo y la muestra se sometió a bioensayo; un segmento de ARN, la hebra sentido, que consiste de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:32, desde aproximadamente la posición del nucleótido 95 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 381 , excepto que un residuo de uridina está presente en cada posición en la cual un residuo de timidina se muestra en la SEQ ID NO:32, y el segmento de ARN del complemento inverso, o la hebra antisentido, es sustancialmente el complemento inverso de la secuencia nucleotídica, como se expone en la SEQ ID NO:32, de aproximadamente la posición del nucleótido 381 a al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 95, las uridinas están colocadas de manera apropiada en el lugar de las timidinas. Una muestra del ARN de doble hebra (ARNds) se trató con DICER o con ARNasa III para producir suficientes cantidades de ARN interfirientes pequeños (ARNsi). Las muestras que contienen 0.15 partes por millón de ARNsi o ARNds se superpusieron en un bioensayo de la dieta de CRW como se describió anteriormente, y las larvas se dejaron alimentar durante 13 días. Las larvas de CRW que se alimentan con la dieta que contiene el ARNds que corresponden a toda o parte de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:32, exhibieron una inhibición del crecimiento y mortalidad significativas en comparación con los controles.

Una secuencia homologa a EF1 a Los factores de elonganción de la trascripción y terminación de la transcripción son esenciales para el metabolismo y pueden ser objetivos ventajosos para la inhibición mediada por el ARN de doble hebra. Al menos dos secuencias de ADNc de CRW se identificaron para utilizarse en la presente invención, que se predijo codificaban los homólogos del factor 1 alfa de la elongación (EF1 ). La traducción de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de ADNc de CRW de monoelemento como se expone en la SEQ ID NO:36, exhibió homología con la secuencia de aminoácidos EF-1-alfa de Drosophila melanogaster (No. de Acceso de GenBank X06870). Otras secuencias predichas para codificar las proteínas homologas de EF1 también se identificaron dentro de la biblioteca del intestino medio de ADNc de CRW. Estas secuencias se alinearon para producir una secuencia UNIGENE como se expone en la SEQ ID NO:40, la cual se predijo que codifican un homólogo de la proteína EF1 a referida en la presente como 48D. Se predijo que varias de las secuencias comprendidas dentro del monoelemento codifican secuencias de aminoácidos que exhiben homología con varias secuencias de proteína homologa EF1 a incluyendo, de manera no exclusiva, EF1 a de Bombyx morí (No. de Acceso de GenBank D13338), EF1a de especies Alternia (No. de Acceso de GenBank X03704), EF1a de Spragueia leo (No. de Acceso de GenBank U85680), EF1 de Apis mellifera (No. de Acceso de GenBank AF015267), EF1a de Anisakis simplex (No. de Acceso de GenBank AJ250539), EF1 a de especies Papaipema (No. de Acceso de GenBank AF151628), EF1a de Ephedrus persicae (No. de Acceso de GenBank Z83663), EF1 de Papilio garamas (No. de Acceso de GenBank AF044833), EF1 a de Alysia lucicola (No. de Acceso de GenBank Z83667), EF1 a de especies Bracon (No. de Acceso de GenBank Z83669), EF1 de Histeromerus mystacinus (No. de Acceso de GenBank Z83666), y EF1 oc de Caenorhabditis elegans (No. de Acceso de GenBank U41534). Una secuencia de ADNc de CRW predicha por codificar una parte de un homólogo de EF1 a, se refiere en la presente como la secuencia B2 y se expone en la SEQ ID NO:36. La SEQ ID NO:37 y la SEQ ID NO:38 corresponden respectivamente a los cebadores de amplificación del genoma hacia delante e inverso (es decir, un par de cebadores, con referencia a las secuencias complementarias correspondientes o inversas como se expone en la SEQ ID NO:36), para utilizarse en la producción de un amplicón del ADN genómico de CRW, recolecciones de ARNm de CRW, o de ADNc derivado de tales recolecciones de ARNm. La secuencia de tal amplicón debe corresponder a todo o parte de un gen de CRW que codifica una proteína homologa de EF1a. Sin embargo, la secuencia nucleotídica de un amplicón derivado cuando el ADN genómico de CRW se utilizó como plantilla, fue inconsistente con la secuencia de ADNc reportada como se expone en la SEQ ID NO:36. La SEQ ID NO:37 y la SEQ ID NO:38 representan secuencias para los cebadores de la amplificación térmica. Cada cebador contiene una secuencia promotora T7 de 23 nucleótidos de las posiciones de los nucleótidos 1-23, respectivamente. Los nucleótidos 24-44, como se expone en la SEQ ID NO:37, corresponde a los nucleótidos 8-29 como se expone en la SEQ ID NO:36. Los nucleótidos 24-42 como se expone en la SEQ ID NO:38, corresponden al complemento inverso de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:36 de los nucleótidos 310-328. Utilizando el par de cebadores que consiste de la SEQ ID NO:37 y la SEQ ID NO:38 en la reacción de amplificación con el ADN genómico de CRW como una plantilla, se produjo un amplicón de 933 pares de bases que comprende la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:39. La secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:39, fue inconsistente con la secuencia nucleotídica de la posición del nucleotido 8 a la posición 328 de nucleótidos como se expone en la SEQ 1 D NO:36. De manera preferida, se produce un amplicón utilizando una recolección de ARNm de CRW o un ADNc derivado de tal recolección, tal como por ejemplo, la SEQ ID NO:36. Se produjo un amplicón que exhibe la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO:36 de aproximadamente la posición del nucleotido 8 hasta aproximadamente la posición del nucleotido 328, utilizando las recolecciones de ARNm de CRW o ADNc preparado de tales recolecciones, y se clonó en un vector plasmídico. Se recuperaron cantidades suficientes del ADN plasmídico para permitir la transcripción de la ARN polimerasa T7 in vitro de los promotores T7 convergentes incluidos en cualquier extremo del amplicón clonado. Se produjo un ARN de doble hebra y la muestra se sometió a un bioensayo; un segmento de ARN, ia hebra sentido, que consiste de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:36, de aproximadamente la posición del nucleotido 8 a al menos hasta aproximadamente la posición del nucleotido 328 excepto que un residuo de uridina está presente en cada posición en la cual un residuo de timidina se muestra en la SEQ ID NO:36, y el segmento de ARN del complemento inverso, o la hebra antisentido, es sustancialmente el complemento inverso de la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:36, de aproximadamente la posición del nucleotido 328 a al menos hasta aproximadamente la posición del nucleotido 8, las uridinas están colocadas de manera apropiada en lugar de las timidinas. Se trató una muestra de ARN de doble hebra (ARNds) con DICER o con ARNasa III para producir suficientes cantidades de ARN interfiriente pequeño (ARNsi). Las muestras que contienen 0.15 partes por millón de ARNsi o ARNds se superpusieron en un bioensayo de la dieta de CRW como se describió anteriormente, y las larvas se dejaron alimentar durante 13 días. Las larvas de CRW que se alimentan con la dieta que contiene el ARNds que corresponde a toda o una parte de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:36, exhibieron inhibición del crecimiento y mortalidad significativas en comparación con los controles. La secuencia como se expone en la SEQ ID NO:40 se utilizó para diseñar un par de cebadores para utilizarse en amplificar una secuencia de ADN genómico de CRW que codifica una secuencia de proteína homologa EF1 a 48D. La SEQ ID NO:41 y la SEQ ID NO:42 corresponden respectivamente a los cebadores de la amplificación del genoma hacia delante e inverso (es decir, un par de cebadores). La SEQ ID NO:41 y la SEQ ID NO:42, contienen cada una, una secuencia promotora T7 de 23 nucleótidos de las posiciones de los nucleótidos 1-23, respectivamente. Los nucleótidos 24-41 como se expone en la SEQ ID NO:41 , corresponden a los nucleótidos 61-79 como se expone en la SEQ ID NO:40. Los nucleótidos 24-45 como se expone en la SEQ ID NO:42, corresponden al complemento inverso de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:40 de los nucleótidos 562-583. Utilizando el par de cebadores que consiste de la SEQ ID NO:41 y la SEQ ID NO:42 en una reacción de amplificación con el ADN genómico de CRW como una plantilla, se produce un amplicón de 569 pares de bases que comprende la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:43, que corresponde sustancialmente a parte del genoma de CRW que codifica una proteína que exhibe una identidad sustancial con la proteína EF1 a también presente en Drosophila melanogaster. La secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:43 de aproximadamente el nucleótido 24 hasta aproximadamente el nucleótido 546, corresponde sustancialmente a la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:40, de aproximadamente los nucleótidos 61-583. No se observaron diferencias de la secuencia entre la secuencia del amplicon del genoma y la secuencia correspondiente con la secuencia de ADNc. El amplicon que exhibe la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO:43, se clonó en un vector plasmídico, y se recuperaron cantidades suficientes de ADN plasmídico para permitir una transcripción de la ARN polimerasa T7 in vitro de los promotores T7 convergentes incluidos en cualquier extremo del amplicon clonado. Se produjo un ARN de doble hebra y la muestra se sometió a un bioensayo; un segmento de ARN, la hebra sentido, que consiste de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:43 de aproximadamente la posición del nucleótido 24 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 546, excepto que un residuo de uridina está presente en cada posición en la cual un residuo de timidina se muestra en la SEQ ID NO:43, y el segmento de ARN del complemento inverso, o la hebra antisentido, es sustancialmente el complemento inverso de la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:43, de aproximadamente la posición del nucleótido 546 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 24, las uridinas están colocadas de manera apropiada en lugar de las timidinas. Se trató una muestra de ARN de doble hebra (ARNds) con DICER o con ARNasa III para producir suficientes cantidades de ARN interfiriente pequeño (ARNsi). Las muestras que contienen 0.15 partes por millón de ARNsi o ARNds se superpusieron en un bioensayo de la dieta de CRW como se describió anteriormente, y las larvas se dejaron alimentar durante 13 días. Las larvas de CRW que se alimentan con la dieta que contiene el ARNds que corresponde a toda o una parte de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:43, exhibieron una inhibición del crecimiento y mortalidad significativas en comparación con los controles.

Una secuencia homologa a la subunidad p28 del proteosoma 26S El proteosoma 26S es una proteasa de múltiples subunidades, dependiente del ATP, grande, que está altamente conservada en todos los eucariotes. Tiene la función general del retiro selectivo de varias proteínas de vida corta que se enlazan primero covalentemente a la ubiquitina, y a continuación se degradan posteriormente por el complejo del proteosoma 26S. La trayectoria de la ubiquitina juega un papel importante en el control del ciclo celular mediante la degradación específica de varias proteínas reguladoras incluyendo las ciclinas mitóticas y los inhibidores de las cinasas dependientes de la ciclina, tales como p27 de las células de mamíferos. Así, la supresión de la síntesis del proteosoma 26S y la supresión de la síntesis de sus subunidades componentes pueden ser objetivos preferidos para la inhibición mediada por ARN de doble hebra. (Smith et al., Plant Phys. 1997, 113:281-291 ). Una secuencia de ADNc derivada de la biblioteca del intestino medio de CRW se identificó como que es parcialmente homologa a una secuencia de aminoácidos de la subunidad del proteosoma 26S y se utiliza en la presente invención. La SEQ ID NO:44 corresponde sustancialmente a la secuencia nucleotídica de ADNc del intestino medio de CRW. Una traducción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:414 exhibió homología con la proteína p28 de la subunidad del proteosoma 26S (No. de Acceso de GenBank AB009619). La SEQ ID NO:45 y la SEQ ID NO:46 corresponden respectivamente a los cebadores de la amplificación del genoma hacia delante e inverso (es decir, un par de cebadores), para utilizarse en la producción de un amplicón del ADN genómico de CRW, de recolecciones de ARNm de CRW, y del ADNc producido de tales recolecciones. Un amplicón producido de esta manera debe exhibir una secuencia que codifica toda o parte de un gen de CRW que codifica un homólogo de una proteína de la subunidad del proteosoma 26S. La SEQ ID NO:45 y la SEQ ID NO:46 contienen cada una, una secuencia promotora T7 de 23 nucleótidos de las posiciones de los nucleótidos 1-23 respectivamente. Los nucleótidos 24-46 como se expone en la SEQ ID NO:45, corresponden a los nucleótidos 130-152 como se expone en la SEQ ID NO:34. Los nucleótidos 24-41 como se expone en la SEQ ID NO:46 corresponden al complemento inverso de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:44 de los nucleótidos 423-440. Utilizando el par de cebadores que consiste de la SEQ ID NO:44 y la SEQ ID NO:46 en una reacción de amplificación con el ADN genómico de CRW como una plantilla, se produjo un amplicón de 3 pares de bases que comprende la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:47. La secuencia como se expone en la SEQ ID NO:47, no corresponde a la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:44, y por lo tanto, fue inconsistente con la secuencia de ADNc reportada como se expone en la SEQ ID NO:44. Se prefiere que se produzca un amplicón utilizando la recolección de ARNm de CRW o un ADNc derivado de tal recolección. Se produjo un amplicón que exhibe la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO:44 de aproximadamente el nucleótido 130 hasta aproximadamente el nucleótido 440 y se clonó en un vector plasmídico, y se recuperaron cantidades suficientes de ADN plasmídico para permitir la transcripción de la ARN polimerasa T7 in vitro de los promotores T7 convergentes incluidos en cualquier extremo del amplicón clonado. Se produjo un ARN de doble hebra y la muestra se sometió a un bioensayo; un segmento de ARN, la hebra sentido, que consiste de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:44 de aproximadamente la posición del nucleótido 130 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 440, excepto que un residuo de uridina está presente en cada posición en la cual un residuo de timidina se muestra en la SEQ ID NO:44, y el segmento de ARN del complemento inverso, o la hebra antisentido, es sustancialmente el complemento inverso de la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:44, de aproximadamente la posición del nucleótido 440 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 110, las uridinas están colocadas de manera apropiada en lugar de las timidinas. Se trató una muestra de ARN de doble hebra (ARNds) con DICER o con ARNasa III para producir suficientes cantidades de ARN interfiriente pequeño (ARNsi). Las muestras que contienen 0. 5 partes por millón de ARNsi o ARNds se superpusieron en un bioensayo de la dieta de CRW como se describió anteriormente, y las larvas se dejaron alimentar durante 13 días. Las larvas de CRW que se alimentan con la dieta que contiene el ARNds que corresponde a toda o una parte de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:44, exhibieron una inhibición del crecimiento y mortalidad significativas en comparación con los controles.

Una secuencia homologa a la epóxido hidrolasa de la hormona juvenil La hormona juvenil de los insectos controla y regula una variedad de procesos biológicos necesarios dentro del ciclo de vida del insecto, incluyendo, de manera no exclusiva, la metamorfosis, reproducción y el letargo. Se requieren concentraciones de la hormona juvenil (JH) para alcanzar un máximo en momentos apropiados dentro de la hemolinfa de la forma larvaria de una plaga de insecto, en particular las larvas de lepidópteros y coleópteros, y a continuación debe degradarse con el fin de terminar los efectos de la respuesta de la hormona. Las enzimas involucradas en la disminución de la concentración de la hormona juvenil son efectivas a través de dos trayectorias principales de degradación metabólica. Una trayectoria involucra la esterasa de la hormona juvenil (JHE), que hidroliza el éster metílico que proporciona el ácido correspondiente. La segunda trayectoria utiliza la epóxido hidrolasa de la hormona juvenil (JHEH) para lograr la hidrólisis del epóxido, resultando en la formación del diol. La contribución de la JHE en la degradación de la JH es bien entendida, y se ha encontrado que es invariable entre las especies de lepidópteros y coleópteros. La inhibición de la esterasa de JH se ha asociado con cambios morfológicos severos, incluyendo de manera no exclusiva, larvas aberrantes, pupación diferida y desarrollo de intermediarios mal formados. En contraste, la contribución de la JHEH en el metabolismo de la JH está menos entendido, y ha mostrado variar entre las especies, pero los estudios recientes indican hacia evidencia que sugiere que la JHEH puede ser la ruta primaria del metabolismo de la JH (Brandon J. Fetterolf, Doctoral Dissertation, Universidad del Estado de Carolina del Norte (Feb. 10, 2002) Synthesis and Analysis of Mechanism Based Inhibitors of Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase from Insect Trichoplusia ni). En cualquier caso, la interrupción de cualquier trayectoria de degradación de la JH utilizando la tecnología de supresión del gen puede ser un objetivo efectivo para la inhibición de las plagas mediada por el ARN de doble hebra. Una secuencia homologa de la epóxido hidrolasa de la hormona juvenil de insectos derivada de CRW se identificó para utilizarse en la presente invención. La SEQ ID NO:48 corresponde sustancialmente a la secuencia nucleotídica de ADNc del intestino medio de CRW. Una traducción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:48 predijo homología con la epóxido hidrolasa de la hormona juvenil (JHEH) en Manduca Sexta (No. de Acceso de GenBank U46682). La SEQ ID NO:49 y la SEQ ID NO:50 corresponden respectivamente a los cebadores de amplificación hacia delante e inversa (es decir, un par de cebadores) para utilizarse en la producción de un amplicón del ADN genómico de CRW, recolecciones de ARNm de CRW, o un ADNc de CRW derivado de tales recolecciones. La secuencia de tal amplicón debe corresponder a todo o parte de un gen de CRW que codifica una proteína homologa a JHEH. La SEQ ID NO:49 y la SEQ ID NO:50 contienen cada una, una secuencia promotora 17 de 23 nucleótidos de las posiciones de los nucleótidos 1-23 respectivamente. Los nucleótidos 24-42 como se expone en la SEQ ID NO:49, corresponden a los nucleótidos 7-26 como se expone en la SEQ ID NO:48. Los nucleótidos 24-44 como se expone en la SEQ ID NO:50, corresponden al complemento inverso de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:48 de los nucleótidos 360-380. Utilizando el par de cebadores que consiste de la SEQ ID NO:49 y la SEQ ID NO:50 en una reacción de amplificación con el ADN genómico de CRW como una plantilla, se produjo un amplicón de 95 pares de bases que comprende la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:52. La secuencia del amplicón no corresponde con la secuencia de ADNc como se expone en la SEQ ID NO:48. De manera preferida, se produce un amplicón utilizando una recolección de ARNm de CRW o un ADNc derivado de tal recolección como la secuencia nucleotídica patrón en la reacción de amplificación. Un amplicón que exhibe la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO:48 se clonó en un vector plasmídico, y se recuperan cantidades suficientes del ADN plasmídico para permitir la transcripción de la ARN polimerasa T7 in vitro de los promotores T7 convergentes incluidos en cualquier extremo del amplicón clonado. Se produce el ARN de doble hebra y una muestra se somete a un bioensayo; un segmento de ARN, la hebra sentido, que consiste de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:48 de aproximadamente la posición del nucleótido 7 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 380, excepto que un residuo de uridina está presente en cada posición en la cual un residuo de timidina se muestra en la SEQ ID NO:48, y el segmento de ARN del complemento inverso, o la hebra antisentido, es sustancialmente el complemento inverso de la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:48 de aproximadamente la posición del nucleótido 380 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 7, las uridinas están colocadas de manera apropiada en lugar de las timidinas. Se trató una muestra de ARN de doble hebra (ARNds) con DICER o con ARNasa III para producir suficientes cantidades de ARN interfiriente pequeño (ARNsi). Las muestras que contienen 0.15 partes por millón de ARNsi o ARNds se superponen en un bioensayo de la dieta de CRW como se describió anteriormente y las larvas se dejan alimentar durante 13 días. Las larvas de CRW que se alimentan con la dieta que contiene el ARNds que corresponde a toda o una parte de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:48, exhiben una inhibición del crecimiento y mortalidad significativas en comparación con los controles.

Una secuencia homologa a la proteína del canal del cloruro que depende del aumento del tamaño Las proteínas del canal del cloruro que dependen del tamaño se han postulado como que juegan un papel crítico en la osmorregulación en los sistemas celulares de los animales eucarióticos. Por lo tanto, una secuencia nucleotídica que exhibe la capacidad para expresar una secuencia de aminoácidos que exhibe homología con las proteínas del canal de cloruro dependientes del aumento del tamaño identificadas previamente, pueden ser un objetivo útil para la inhibición del ARN en una plaga. Un homólogo de la secuencia de aminoácido del canal del cloruro que depende del aumento del tamaño (SDCC) se dedujo de una biblioteca de ADNc de CRW y se utilizó en la presente invención. La SEQ ID NO:53 corresponde sustancialmente a una secuencia nucleotídica de ADNc del intestino medio de CRW. La traducción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:53 se determinó como homologa a la proteína SDCC en el pez cebra Danlo rerio (No. de Acceso de GenBank Y08484). La SEQ ID NO:54 y la SEQ ID NO:55 corresponden respectivamente a los cebadores de la amplificación térmica hacia delante e inverso (es decir, un par de cebadores), para utilizarse en la producción de un amplicón del ADN genómico de CRW, de recolecciones de ARNm de CRW, o de ADNc derivado de tales recolecciones. La secuencia de tal amplicón debe corresponder a todo o parte de un gen de CRW que codifica una proteína homologa SDCC. La SEQ ID NO:54 y la SEQ ID NO:55, contienen cada una, una secuencia promotora T7 de 23 nucleótidos de las posiciones de los nucleótidos 1-23 respectivamente. Los nucleótidos 24-43 como se exponen en la SEQ ID NO:54, corresponden a los nucleótidos 78-97 como se exponen en la SEQ ID NO:53. Los nucleótidos 24-41 como se exponen en la SEQ ID NO:55. La SEQ ID NO:55 corresponde al complemento inverso de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:53 de los nucleótidos 332-349. Utilizando el par de cebadores que consiste de la SEQ ID NO:54 y la SEQ ID NO:55 en una reacción de amplificación con el ADN genómico de CRW como una plantilla, se produjo un amplicón de 318 pares de bases que comprende la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:56, que corresponde sustancialmente a una parte del genoma de CRW que codifica una proteína que exhibe identidad sustancial con una proteína SDCC. La secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:56 de aproximadamente el nucleótido 24 hasta aproximadamente el nucleótido 295 corresponde sustancialmente a ía secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:53 de los nucleótidos 78-349. El ampVicón que exhibe la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO:56 se clonó en un vector plasmídico, y se recuperan cantidades suficientes del ADN plasmídico para permitir la transcripción de la ARN polimerasa T7 in vitro de los promotores T7 convergentes incluidos en cualquier extremo del amplicón clonado. Se produjo un ARN de doble hebra y una muestra se sometió a un bioensayo; un segmento de ARN, la hebra sentido, que consiste de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:56 de aproximadamente la posición del nucleótido 24 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 295, excepto que un residuo de uridina está presente en cada posición en la cual un residuo de timidina se muestra en la SEQ ID NO:56, y el segmento de ARN del complemento inverso, o la hebra antisentido, es sustancialmente el complemento inverso de la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:56 de aproximadamente la posición del nucleótido 295 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 24, las uridinas están colocadas de manera apropiada en lugar de las timidinas. Se trató una muestra de ARN de doble hebra (ARNds) con DICER o con ARNasa III para producir suficientes cantidades de ARN ¡nterfiriente pequeño (ARNsi). Las muestras que contienen 0.15 partes por millón de ARNsi o ARNds se superponen en un bioensayo de la dieta de CRW como se describió anteriormente y las larvas se dejan alimentar durante 13 días. Las larvas de CRW que se alimentan con la dieta que contiene el ARNds que corresponde a toda o una parte de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:56, exhiben una inhibición del crecimiento y mortalidad significativas en comparación con los controles.

Una secuencia homologa a la proteina glucosa-6-fosfato 1-deshidroqenasa La proteína glucosa-6-fosfato -deshidrogenasa (G6PD) cataliza la oxidación del glucosa-6-fosfato al 6-fosfogluconato mientras reduce de manera concomitante la forma oxidada del fosfato dinucleotídico de la nicotinamida adenina (NADP+) a NADPH. El NADPH es conocido en la técnica como un cofactor requerido en muchas reacciones biosintéticas eucarióticas, y es conocido por mantener la glutationa en su forma reducida. La glutationa reducida actúa como un depurador de los metabolitos oxidantes peligrosos en las células eucarióticas, y con la asistencia de la enzima glutationa peroxidasa, convierte el peróxido de hidrógeno dañino en agua (Beutler et al., 1991 , N. Engl. J. Med. 324:169- 74). Por lo tanto, la G6PD puede ser un objetivo preferido para la inhibición mediada por el ARN de doble hebra en una plaga invertebrada. Una secuencia de aminoácidos homologa a la proteína glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa (G6PD) de dedujo de una biblioteca de ADNc de CRW y se utiliza en la presente invención. La SEQ ID NO:57 corresponde sustancialmente a una secuencia nucleotídica de ADNc de CRW del intestino medio. Se determinó que la traducción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:57 exhibe homología con una proteína G6PD en una especie de pez mantarraya (No. de Acceso de GenBank U72484). La SEQ ID NO:58 y la SEQ ID NO:59 corresponden respectivamente a los cebadores de la amplificación del genoma hacia delante e inverso (es decir, un par de cebadores), para utilizarse en la producción de un amplicón del ADN genómico de CRW, de recolecciones de ARNm de CRW, o de ADNc derivado de tales recolecciones. La secuencia de tal amplicón debe corresponder a todo o parte de un gen de CRW que codifica una secuencia homologa a G6PD. La SEQ ID NO:58 y la SEQ ID NO:59 contienen cada una, una secuencia promotora T7 de 23 nucleótidos de las posiciones de los nucleótidos 1-23, respectivamente. Los nucleótidos 24-46 como se exponen en la SEQ ID NO:58, corresponden a los nucleótidos 113-136 como se exponen en la SEQ ID NO:57. Los nucleótidos 24-45 como se exponen en la SEQ ID NO:59 corresponden al complemento inverso de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:57 de los nucleótidos 373-394. Utilizando el par de cebadores que consiste de la SEQ ID NO:58 y la SEQ ID NO:59 en una reacción de amplificación con el ADN genómico de CRW como una plantilla, se produce un amplicón de 328 pares de bases que comprende la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:60, que corresponden sustancialmente a una parte del genoma de CRW que codifica una proteína que exhibe homología para una proteína G6PD. La secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:60 de aproximadamente el nucleótido 24 hasta aproximadamente el nucleótido 305, corresponde sustancialmente a la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:57 de los nucleótidos 1 13-394. Un amplicón que exhibe la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO:60 se clonó en un vector plasmídico, y se recuperan cantidades suficientes del ADN plasmídico para permitir la transcripción de la ARN polimerasa T7 in vitro de los promotores T7 convergentes incluidos en cualquier extremo del amplicón clonado. Se produjo un ARN de doble hebra y una muestra se sometió a un bioensayo; un segmento de ARN, la hebra sentido, que consiste de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:60 de aproximadamente la posición del nucleótido 24 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 305, excepto que un residuo de uridina está presente en cada posición en la cual un residuo de timidina se muestra en la SEQ ID NO:60, y el segmento de ARN del complemento inverso, o la hebra antisentido, es sustancialmente el complemento inverso de la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:60 de aproximadamente la posición del nucleótido 305 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 24, las uridinas están colocadas de manera apropiada en lugar de las timidinas. Se trató una muestra de ARN de doble hebra (ARNds) con DICER o con ARNasa III para producir suficientes cantidades de ARN interfiriente pequeño (ARNsi). Las muestras que contienen 0.15 partes por millón de ARNsi o ARNds se superponen en un bioensayo de la dieta de CRW como se describió anteriormente y las larvas se dejan alimentar durante 13 días. Las larvas de CRW que se alimentan con la dieta que contiene el ARNds que corresponde a toda o una parte de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:60 exhiben una inhibición del crecimiento y mortalidad significativas en comparación con los controles.

Una secuencia homologa a la proteína Act42A La actina es una proteína eucariótica ubicua y altamente conservada requerida para la motilidad y locomoción celular (Lovato et al., 2001 , Insect Mol. Biol. 20:333-340). Se identificaron varias secuencias de ADNc de CRW que se predijo que probablemente codificarían la actina o las proteínas que exhiben una estructura de aminoácidos relacionada con las proteínas de la actina. Por lo tanto, los genes que codifican los homólogos de la actina en una célula de la plaga pueden ser objetivos útiles para la inhibición mediada por el ARN de doble hebra. Un cúmulo UNIGENE identificado dentro de la biblioteca de ADNc del intestino medio del gusano de la raíz del maíz (Cúmulo 156_1 ) consiste de varias secuencias de monoelementos EST que se predijeron que codifican todas o parte de las proteínas homologas a la actina. Tras la alineación de estos monoelementos en el cúmulo, se derivó una secuencia de consenso como se expone en la SEQ ID NO:61 que se predijo que codifica un homólogo de la proteína actina. Las secuencias homologas a la proteína actina dentro del grupo de la anotación incluyen, de manera no exclusiva fragmentos de la actina 3 de Drosophila melanogaster, una atina A3a de citoplasmina de Helicoverpa armígera (No. de Acceso de GenBank X97614), una actina de Drosophila melanogaster (No. de Acceso de GenBank X06383), una secuencia de ARN mensajero de la actina del semicordado Saccoglossus kowalevskii y una actina de Strongylocentrotus purpuratus (No. de Acceso de GenBank X05739). La SEQ ID NO:62 y la SEQ ID NO:63 corresponden respectivamente a los cebadores de la amplificación del genoma hacia delante e inverso (es decir, un par de cebadores), para utilizarse en la producción de un amplicón del ADN genómico de CRW, recolecciones de ARNm de CRW, ó de un derivado de ADNc de tales recolecciones. La secuencia de tal amplicón debe corresponder a todo o parte de un gen de CRW que codifica una proteína homologa de actina. La SEQ ID NO:62 y la SEQ ID NO:63 contienen cada una, una secuencia promotora T7 de 23 nucleótidos de las posiciones de los nucleótidos 1-23 respectivamente. Los nucleótidos 24-45 como se expone en la SEQ ID NO:62, corresponden a los nucleótidos 14-35 como se expone en la SEQ ID NO:61. Los nucleótidos 24-45 como se expone en la SEQ ID NO:63 corresponden al complemento inverso de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:61 de los nucleótidos 449-470. Utilizando el par de cebadores que consiste de la SEQ ID NO:62 y la SEQ ID NO:63 en una reacción de amplificación con el ADN genómico de CRW como una plantilla, se produjo un amplicón de 503 pares de bases que comprende la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:64, que corresponde sustancialmente con una parte del genoma de CRW que codifica una proteína que exhibe homología con una proteína de actina. La secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:64 de aproximadamente el nucleótido 24 hasta aproximadamente el nucleótido 480 corresponde sustancialmente a la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:61 de los nucleótidos 4-470. Se clonó un amplicón que exhibe la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO:64 en un vector plasmídico, y se recuperaron cantidades suficientes de ADN plasmídico para permitir la transcripción de la ARN polimerasa T7 in vitro de los promotores T7 convergentes incluidos en cualquier extremo del amplicón clonado. Se produjo un ARN de doble hebra y una muestra se sometió a un bioensayo; un segmento de ARN, la hebra sentido, que consiste de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:64 de aproximadamente la posición del nucleótido 24 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 480, excepto que un residuo de uridina está presente en cada posición en la cual un residuo de timidina se muestra en la SEQ ID NO:64, y el segmento de ARN del complemento inverso, o la hebra antisentido, es sustancialmente el complemento inverso de la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:64 de aproximadamente la posición del nucleótido 480 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 24, las uridinas están colocadas de manera apropiada en lugar de las timidinas. Se trató una muestra de ARN de doble hebra (ARNds) con DICER o con ARNasa III para producir suficientes cantidades de ARN interfiriente pequeño (ARNsi). Las muestras que contienen 0.15 partes por millón de ARNsi o ARNds se superponen en un bioensayo de la dieta de CRW como se describió anteriormente y las larvas se dejan alimentar durante 13 días. Las larvas de CRW que se alimentan con la dieta que contiene el ARNds que corresponde a toda o una parte de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:64 exhiben una inhibición del crecimiento y mortalidad significativas en comparación con los controles.

Una secuencia homologa del factor 1 de la ADP-ribosilación Se ha demostrado que los factores de la ADP ribosilación son esenciales en la función celular en que juegan papeles integrales en los procedimientos de reparación del daño del ADN, carcinogénesis, muerte celular y estabilidad genómica. Así, sería útil ser capaces de interrumpir de manera selectiva la transcripción de los factores de ADP-ribosilación en especies de plagas invertebradas utilizando la inhibición mediada por el ARN de doble hebra. Se identificaron varias secuencias de ADNc de CRW que se predijeron que codifican las secuencias de aminoácidos que exhiben homología con las proteínas del factor de la ADP-ribosilación. Un cúmulo UNIGENE en particular (Cúmulo 88_1) estaba compuesto de aproximadamente treinta (30) monoelementos EST, cada uno de los cuales se predijo que codifican todas o una parte de las proteínas homologas de la actina. Tras la alineación de estos monoelementos en un cúmulo, se derivó una secuencia de consenso como se expone en la SEQ ID NO:65. La traducción de una secuencia de aminoácido de la secuencia de ADNc de CRW del monoelemento que comprende este cúmulo, predijo una secuencia de aminoácidos que exhibe homología con los homólogos del factor de la ADP-ribosilación. Las secuencias de la proteína del factor de ADP-ribosilación que exhiben una homología significativa con la secuencia de aminoácidos deducida del ORF dentro de la SEQ ID NO:65 incluyen, de manera no exclusiva, un factor de ADP-ribosilación de Drosophila melanogaster (No. de Acceso de GenBank Y10618), un factor de ADP-ribosilación de Drosophila obscura (No. de Acceso de GenBank AF025798), un factor de ADP-ribosilación de Anopheles gambiae (No. de Acceso de GenBank L116 7), y un factor de ADP-ribosilación de la mosca azul de las ovejas Australina (Lucilia cuprina) (No. de Acceso de GenBank AF218587). La SEQ ID NO:66 y la SEQ ID NO:67 corresponden respectivamente a los cebadores de amplificación hacia delante e inversa (es decir, un par de cebadores), para utilizarse en la producción de un amplicón del ADN genómico de CRW, recolecciones de ARNm de CRW, o de las secuencias de ADNc derivadas de tales recolecciones. La secuencia de tal amplicón debe corresponder a todo o parte de un gen de CRW que codifica una proteína homologa del factor de la ADP-ribosilación. La SEQ ID NO:66 y la SEQ ID NO:67 contienen cada una, una secuencia promotora T7 de 23 nucleótidos de las posiciones de los nucleótidos 1-23 respectivamente. Los nucleótidos 24-42 como se expone en la SEQ ID NO:66, corresponden a los nucleótidos 70-88 como se expone en la SEQ ID NO:65. Los nucleótidos 24-40 como se expone en la SEQ ID NO:67 corresponden al complemento inverso de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:65 de los nucleótidos 352-368. Utilizando el par de cebadores que consiste de la SEQ ID NO:66 y la SEQ ID NO:67 en una reacción de amplificación con el ADN genómico de CRW como una plantilla, se produjo un amplicón de 345 pares de bases que comprende la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:68, que corresponde sustancialmente a una parte del genoma de CRW que codifica una proteína que exhibe homología a una proteína del factor de la ADP-ribosilación. La secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:68 de aproximadamente el nucleótido 24 hasta aproximadamente el nucleótido 322 corresponde sustancialmente a la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:65 de los nucleótidos 70-368. Se clonó un amplicón que exhibe la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO:68 en un vector plasmídico, y se recuperaron cantidades suficientes de ADN plasmídico para permitir la transcripción de la ARN polimerasa T7 in vitro de los promotores T7 convergentes incluidos en cualquier extremo del amplicón clonado. Se produjo un ARN de doble hebra y una muestra se sometió a un bioensayo; un segmento de ARN, la hebra sentido, que consiste de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:68 de aproximadamente la posición del nucleótido 24 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 322, excepto que un residuo de uridina está presente en cada posición en la cual un residuo de timidina se muestra en la SEQ ID NO:68, y el segmento de ARN del complemento inverso, o la hebra antisentido, es sustancialmente el complemento inverso de la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:68, de aproximadamente la posición del nucleótido 322 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 24, las uridinas están colocadas de manera apropiada en lugar de las timidinas. Se trató una muestra de ARN de doble hebra (ARNds) con DICER o con ARNasa III para producir suficientes cantidades dé ARN interfiriente pequeño (ARNsi). Las muestras que contienen 0.15 partes por millón de ARNsi o ARNds se superponen en un bioensayo de la dieta de CRW como se describió anteriormente y las larvas se dejan alimentar durante 13 días. Las larvas de CRW que se alimentan con la dieta que contiene el ARNds que corresponde a toda o una parte de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:68, exhiben una inhibición del crecimiento y mortalidad significativas en comparación con los controles.

Una secuencia homologa a la proteína de transcripción del Factor IIB Los factores de elongación de la transcripción y de terminación de la transcripción, como se indicó anteriormente, son esenciales para el metabolismo y pueden ser objetivos ventajosos para la inhibición mediada por el ARN de doble hebra para controlar o eliminar la infestación de plagas invertebradas. Se identificó una secuencia de ADNc de CRW que se predice que codifica una secuencia de aminoácidos que exhibe homología para una proteína del factor de transcripción LB. La SEQ ID NO:69 sirve como una base para la construcción de un par de cebadores para utilizarse en la amplificación de una secuencia dentro del genoma de CRW que codifica el ARNm que forma la base para esta secuencia de ADNc. La SEQ ID NO:70 y la SEQ ID NO:71 corresponden respectivamente a los cebadores de la amplificación térmica hacia delante e inverso (es decir, un par de cebadores), para utilizarse en la producción de un amplicón del ADN genómico de CRW, de recolecciones de ARNm de CRW, o de ADNc derivado de tales recolecciones. La secuencia de tal amplicón debe corresponder a todo o parte de un . gen de CRW que codifica la proteína homologa del factor de transcripción HB. La SEQ ID NO:70 y la SEQ ID NO:71 contienen cada una, una secuencia promotora T7 de 23 nucleótidos de las posiciones de los nucleótidos 1-23, respectivamente. Los nucleótidos 24-44 como se expone en la SEQ ID NO:70, corresponden a los nucleótidos 4-24 como se expone en la SEQ ID NO:69. Los nucleótidos 24-44 como se expone en la SEQ ID NO:71 , corresponden al complemento inverso de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:69 de los nucleótidos 409-429. Utilizando el par de cebadores que consiste de la SEQ ID NO:70 y la SEQ ID NO:71 en una reacción de amplificación con el ADN genómico de CRW como una plantilla, se produjo un amplicón de 472 pares de bases que comprende la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:72, que corresponde sustancialmente a una parte del genoma de CRW que codifica una proteína que exhibe homología por una proteína del factor de transcripción IIB. La secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:72 de aproximadamente el nucleótido 24 hasta aproximadamente el nucleótido 449 corresponde sustancialmente a la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:69 de los nucleótidos 4-429. Se clonó un amplicón que exhibe la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO:72 en un vector plasmídico, y se recuperaron cantidades suficientes de ADN plasmídico para permitir la transcripción de la ARN polimerasa T7 in vitro de los promotores T7 convergentes incluidos en cualquier extremo del amplicón clonado. Se produjo un ARN de doble hebra y una muestra se sometió a un bioensayo; un segmento de ARN, la hebra sentido, que consiste de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:72 de aproximadamente la posición del nucleótido 24 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 449, excepto que un residuo de uridina está presente en cada posición en la cual un residuo de timidina se muestra en la SEQ ID NO:72, y el segmento de ARN del complemento inverso, o la hebra antisentido, es sustancialmente el complemento inverso de la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:72, de aproximadamente la posición del nucleótido 449 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 24, las uridinas están colocadas de manera apropiada en lugar de las timidinas. Se trató una muestra de ARN de doble hebra (ARNds) con DICER o con ARNasa III para producir suficientes cantidades de ARN interfiriente pequeño (ARNsi). Las muestras que contienen 0.15 partes por millón de ARNsi o ARNds se superponen en un bioensayo de la dieta de CRW como se describió anteriormente y las larvas se dejan alimentar durante 13 días. Las larvas de CRW que se alimentan con la dieta que contiene el ARNds que corresponde a toda o una parte de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:72 exhiben una inhibición del crecimiento y mortalidad significativas en comparación con los controles.

Secuencias homologas a la quitinasa La quitina es un p(1? )homopolímero de la N-acetilglucosamina y se encuentra en los exoesqueletos de los insectos. La quitina se forma a partir de la UDP-N-acetilglucosamina en una reacción catalizada por la quitina sintasa. La quitina es un homopolímero de polisacárido estructural, y hay muchos pasos enzimáticos involucrados en la construcción de esta estructura altamente ramificada y réticulada. La quitina da forma, rigidez y soporte a los insectos y proporciona estructuras a las cuales los órganos internos tales como los músculos están unidos. La quitina también debe degradarse a un grado para mediar los pasos involucrados en el proceso de muda del insecto. Por lo tanto, se cree que la inhibición mediada por el ARN de doble hebra de las proteínas en estas trayectorias sería útil como un medio para controlar la infestación por plagas invertebradas. La información de la secuencia de aminoácidos se identificó de la traducción de las secuencias de la biblioteca del ADNc del intestino medio del gusano de la raíz del maíz que exhiben homología con las proteínas de la quitinasa. Una secuencia de consenso de la quitinasa (UNIGENE Cúmulo No. 716_1 ; SEQ ID NO:73), se generó a partir de la alineación de dos secuencias EST de monoelementos. Una segunda secuencia de consenso de la quitinasa (UNIGENE Cúmulo No. 1238_1 ; SEQ ID NO:77), se generó a partir de la alineación de cuatro secuencias de monoelementos. Las traducciones de la secuencia de aminoácidos derivadas de los ORF dentro de estos UNIGENE se indicaron para una secuencia de aminoácidos de la quitinasa de un escarabajo de la mostaza (Phaedon cochleariae) (No. de Acceso de GenBank Y1801 1 ). La SEQ ID NO:73 y la SEQ ID NO:77 sirvieron como la base para construir los pares de cebadores para utilizarse en la amplificación de dos secuencias dentro del genoma de CRW genoma, de recolecciones de ARNm de CRW, de de las secuencias de ADNc derivadas de tales recolecciones de ARNm. La secuencia nucleotídica de tales amplicones debe corresponder a todo o parte de un gen que codifica una proteína homologa a la quitinasa. La SEQ ID NO:74 y la SEQ ID NO:75 corresponden respectivamente a los cebadores de la amplificación térmica hacia delante e inverso (es decir, un par de cebadores) para utilizarse en la producción de un amplicón del secuencias nucleotídicas derivado de un gusano de la raíz del maíz. La secuencia de tal amplicón debe corresponder a todo o parte de un gen de CRW como se expone en la SEQ ID NO:73, que codifica una proteína homologa de la quitinasa. La SEQ ID NO:74 y la SEQ ID NO:75 contienen cada una, una secuencia promotora T7 de 23 nucleótidos de las posiciones de los nucleótidos 1-23 respectivamente. Los nucleótidos 24-42 como se expone en la SEQ ID NO:74, corresponden a los nucleótidos 1-19 como se expone en la SEQ ID NO:73. Los nucleótidos 24-47 como se expone en la SEQ ID NO:75 corresponden al complemento inverso de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:73 de los nucleótidos 470-493. Utilizando el par de cebadores que consiste de la SEQ ID NO:74 y la SEQ ID NO:75 en una reacción de amplificación con el ADN genómico de CRW como una plantilla, se produjo un amplicón de 472 pares de bases que comprende la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:76, que corresponde sustancialmente a una parte del genoma de CRW que codifica una proteína que exhibe homología con una proteína de quitinasa. La secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:76 de aproximadamente el nucleótido 24 hasta aproximadamente el nucleótido 516 corresponde sustancialmente a la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO: 76 de los nucleótidos 1-493. Se clonó un amplicón que exhibe la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO:76 en un vector plasmídico, y se recuperaron cantidades suficientes de ADN plasmídico para permitir la transcripción de la ARN polimerasa 11 in vitro de los promotores T7 convergentes incluidos en cualquier extremo del amplicón clonado. Se produjo un ARN de doble hebra y una muestra se sometió a un bioensayo; un segmento de ARN, la hebra sentido, que consiste de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:76 de aproximadamente la posición del nucleótido 24 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 516, excepto que un residuo de uridina está presente en cada posición en la cual un residuo de timidina se muestra en la SEQ ID NO:76, y el segmento de ARN del complemento inverso, o la hebra antisentido, es sustanciaimente el complemento inverso de la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:76, de aproximadamente la posición del nucleótido 516 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 24, las uridinas están colocadas de manera apropiada en lugar de las timidinas. Se trató una muestra de ARN de doble hebra (ARNds) con DICER o con ARNasa III para producir suficientes cantidades de ARN interfiriente pequeño (ARNsi). Las muestras que contienen 0.15 partes por millón de ARNsi o ARNds se superponen en un bioensayo de la dieta de CRW como se describió anteriormente y las larvas se dejan alimentar durante 13 días. Las larvas de CRW que se alimentan con la dieta que contiene el ARNds que corresponde a toda o una parte de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:76, exhiben una inhibición del crecimiento y mortalidad significativas en comparación con los controles. La SEQ ID NO:78 y la SEQ ID NO:79 corresponden respectivamente a los cebadores de la amplificación del genoma hacia delante e inverso (es decir, un par de cebadores) para utilizarse en la producción de un amplicón del ADN genómico de CRW, recolecciones de ARNm de CRW, o de las secuencias de ADNc derivadas de tales recolecciones de ARNm. La secuencia de tal amplicón debe corresponder a todo o parte de un gen de CRW como se expone en la SEQ ID NO:77, que codifica una proteína homologa de la quitinasa. La SEQ ID NO:78 y la SEQ ID NO:79 contienen cada una, una secuencia promotora T7 de 23 nucleotidos de las posiciones de los nucleotidos 1-23 respectivamente. Los nucleotidos 24-44 como se expone en la SEQ ID NO:78, corresponden a los nucleotidos 64-84 como se expone en la SEQ ID NO:77. Los nucleotidos 24-44 como se expone en la SEQ ID NO:79 corresponden al complemento inverso de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:77 de los nucleotidos 779-799. Utilizando el par de cebadores que consiste de la SEQ ID NO:78 y la SEQ ID NO:79 en una reacción de amplificación con el ADN genómico de CRW como una plantilla, se produjo un amplicón de 912 pares de bases que comprende la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:80. Una alineación de la secuencia de ADNc como se expone en la SEQ ID NO:77 y la secuencia del amplicón revelan que no hubo similitud sustancial entre las dos secuencias, resultando únicamente en aproximadamente 32% de identidad de la secuencia. De manera preferida, se produjo un amplicón utilizando un par de cebadores tales como aquéllos expuestos en las SEQ ID NO: 78 y 79 y el ARNm o el ADNc como una plantilla con el fin de evitar tales inconsistencias. Se clonó un amplicón que exhibe la secuencia que corresponde sustancialmente a la SEQ ID NO:77 en un vector plasmídico, y se recuperan cantidades suficientes del ADN plasmídico para permitir la transcripción de la ARN polimerasa T7 in vitro de los promotores T7 convergentes incluidos en cualquier extremo del amplicón clonado. Se produce el ARN de doble hebra y una muestra se somete a un bioensayo; un segmento de ARN, la hebra sentido, que consiste de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:77 de aproximadamente la posición del nucleótido 64 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 799, excepto que un residuo de uridina está presente en cada posición en la cual un residuo de timidina se muestra en la SEQ ID NO:77, y el segmento de ARN del complemento inverso, o la hebra antisentido, es sustancialmente el complemento inverso de la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:77, de aproximadamente la posición del nucleótido 799 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 64, las uridinas están colocadas de manera apropiada en lugar de las timidinas. Se trató una muestra de ARN de doble hebra (ARNds) con DICER o con ARNasa III para producir suficientes cantidades de ARN interfiriente pequeño (ARNsi). Las muestras que contienen 0.15 partes por millón de ARNsi o ARNds se superponen en un bioensayo de la dieta de CRW como se describió anteriormente y las larvas se dejan alimentar durante 13 días. Las larvas de CRW que se alimentan con la dieta que contiene el ARNds que corresponde a toda o una parte de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:77, exhiben una inhibición del crecimiento y mortalidad significativos en comparación con los controles.

Una secuencia homologa de la enzima ubiquitina conjugada La trayectoria de la ubiquitina juega un papel importante en el control del ciclo celular mediante la degradación específica de varias proteínas reguladoras incluyendo ciclinas mitóticas e inhibidores de las cinasas dependientes de la ciclina tales como p27 de células de mamíferos. Así, los genes que codifican la ubiquitina y los componentes asociados pueden ser un objetivo preferido para la inhibición mediada por el ARN de doble hebra. (Smith et al., Plant Phys. 1997, 113:281-291 ). La trayectoria proteolítica dependiente de la ubiquitina es una de las principales rutas mediante las cuales las proteínas intracelulares se destruyen en los eucariotes. La conjugación de la ubiquitina a las proteínas del sustrato está mediada por un arreglo notablemente diverso de enzimas. La selección proteolítica también puede regularse en los pasos entre la ubiquitinización del sustrato y su degradación a los péptidos por la proteasa de múltiples subunidades 26S. La complejidad del sistema de la ubiquitina sugiere un papel centra para el recambio de la proteína en la regulación de las células eucarióticas, e implica otras proteínas en la trayectoria, incluyendo la enzima que activa la ubiquitina, la enzima que conjuga la ubiquitina, la ligasa de la proteína ubiquitina y los componentes de la subunidad del proteosoma 26S. Por lo tanto, se cree que la inhibición de las proteínas mediada por el ARN de doble hebra en esta trayectoria podría ser útil como un medio para el control de la infestación de plagas invertebradas. Se identificó una secuencia de la biblioteca de ADNc de CRW que se predijo que codifica una secuencia de aminoácidos que exhibe homología con una enzima que conjuga la ubiquitina. La SEQ ID NO:81 sirve como la base para la construcción de un par de cebadores para utilizarse en la producción de un amplicón que comprende todo o parte de una enzima que conjuga la ubiquitina del gusano de la raíz del maíz.

La SEQ ID NO:82 y la SEQ ID NO:83 corresponden respectivamente a los cebadores de la amplificación del genoma hacia delante e inverso (es decir, un par de cebadores) para utilizarse en la producción de un amplicón del ADN genómico de CRW, de recolecciones de ARNm de CRW, o de un ADNc derivado de tales recolecciones de ARNm. La secuencia de tal amplicón puede corresponde a todo o parte de la un gen de CRW que codifica una proteína homologa de la enzima que conjuga la ubiquitina. La SEQ ID NO:82 y la SEQ ID NO:83 contienen cada una, una secuencia promotora T7 de 23 nucleótidos de las posiciones de los nucleótidos 1-23 respectivamente. Los nucleótidos 24-42 como se expone en la SEQ ID NO:82, corresponden a los nucleótidos 16-34 como se expone en la SEQ ID NO:81. Los nucleótidos 24-42 como se expone en la SEQ ID NO:83 corresponden al complemento inverso de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:81 de los nucleótidos 295-313. Utilizando el par de cebadores que consiste de la SEQ ID NO:82 y la SEQ ID NO:83 en una reacción de amplificación con el ADN genómico de CRW como una plantilla, se produjo un amplicón de 344 pares de bases que comprende la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:84, que corresponde sustancialmente a una parte del genoma de CRW que codifica una proteína que exhibe homología para una enzima que conjuga la ubiquitina. La secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:84 de aproximadamente el nucleótido 24 hasta aproximadamente el nucleótido 321 corresponde sustancialmente a la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:81 de los nucleótidos 16-313. Se clonó un amplicón que exhibe la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO:84 en un vector plasmídico, y se recuperan cantidades suficientes del ADN plasmídico para permitir la transcripción de la ARN polimerasa 11 in vitro de los promotores T7 convergentes incluidos en cualquier extremo del amplicón clonado. Se produjo un ARN de doble hebra y una muestra se sometió a un bioensayo; un segmento de ARN, la hebra sentido, que consiste de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:84 de aproximadamente la posición del nucleótido 24 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 253, excepto que un residuo de uridina está presente en cada posición en la cual un residuo de timidina se muestra en la SEQ ID NO:84, y el segmento de ARN del complemento inverso, o la hebra antisentido, es sustancialmente el complemento inverso de la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:84, de aproximadamente la posición del nucleótido 253 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 24, las uridinas están colocadas de manera apropiada en lugar de las timidinas. Se trató una muestra de ARN de doble hebra (ARNds) con DICER o con ARNasa III para producir suficientes cantidades de ARN interfiriente pequeño (ARNsi). Las muestras que contienen 0.15 partes por millón de ARNsi o ARNds se superponen en un bioensayo de la dieta de CRW como se describió anteriormente y las larvas se dejan alimentar durante 13 días. Las larvas de CRW que se alimentan con la dieta que contiene el ARNds que corresponde a toda o una parte de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:84, exhiben una inhibición del crecimiento y mortalidad significativas en comparación con los controles.

Una secuencia homologa de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa La trayectoria glucolítica es una trayectoria esencial en la mayoría de los organismos y está involucrada en la producción de la energía metabólica de la degradación de la glucosa. Una enzima importante en la segunda etapa de la trayectoria glucolítica es la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH), la cual, en la presencia de un NAD-t- y de fosfato inorgánico, cataliza la oxidación del 3-fosfo-gliceraldehído a 3-fosfogliceroil-fosfato junto con la formación de NADH. Los componentes importantes de esta reacción es el almacenamiento de la energía a través de la formación de NADH. Los genes que codifican las enzimas asociadas con la trayectoria glucolítica, y en particular los genes que codifican las enzimas involucradas en los pasos útiles en la formación de las reservas de energía pueden ser objetivos particularmente útiles para la inhibición mediada por el ARN de doble hebra en las especies de plagas invertebradas. Se identificó una secuencia de la biblioteca del ADNc de CRW que se predijo que codifica una secuencia de aminoácidos que exhibe homología con una proteína de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH). La secuencia de consenso para el cúmulo expuesto en la SEQ ID NO:85 se montó de las secuencias superpuestas de tres secuencias EST de monoelemento. Una traducción de la secuencia de aminoácidos de un ORF dentro de esta secuencia nucleotídica SEQ ID NO:85 exhibió homología con una secuencia de aminoácidos de G3PDH derivada de un gen de G3PDH de Crytococcus curvatus (No. de Acceso de GenBank AF126158) y con una secuencia de aminoácidos de la proteína de G3PDH del organismo Drosophila pseudoobscura (No. de Acceso de GenBank AF025809). Así, se predijo que una traducción de la secuencia de- aminoácidos de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:85 es parte de de una proteína de la enzima G3PDH de CRW. La secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:85 sirvió como la base para construir un par de cebadores para la amplificación térmica para utilizarse en la amplificación de una secuencia que codifica una secuencia de la enzima G3PDH de CRW. La SEQ ID NO:86 y la SEQ ID NO:87 corresponden respectivamente a los cebadores de la amplificación térmica hacia delante e inverso (es decir, un par de cebadores) para utilizarse en la producción de un amplicón de las secuencias nucleotídicas de CRW, ya sea un genoma de ADN, recolecciones de ARNm, o de secuencias de ADNc derivadas de tales recolecciones de ARNm. La secuencia de tal amplicón debe corresponder a todo o parte de un gen de CRW que codifica una proteína homologa de G3PDH. La SEQ ID NO:86 y la SEQ ID NO:87 contienen cada una, una secuencia promotora T7 de 23 nucleótidos de las posiciones de los nucleótidos 1-23 respectivamente. Los nucleótidos 24-45 como se expone en la SEQ ID NO:86, corresponden a los nucleótldos 103-124 como se expone en la SEQ ID NO:85. Los nucleótidos 24-45 como se expone en la SEQ ID NO:87 corresponden al complemento inverso de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:85 de los nucleótidos 573-594. Utilizando el par de cebadores que consiste de la SEQ ID NO:86 y la SEQ ID NO:87 en la técnica de reacción de amplificación con el ADN genómico de CRW como una plantilla, se produjo un amplicón de 538 pares de bases que comprende la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:88, que corresponde sustanciaimente a una parte del genoma de CRW que codifica una proteína que exhibe homología con una enzima G3PDH. La secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:88 de aproximadamente el nucleótido 24 hasta aproximadamente el nucleótido 515 corresponde sustanciaimente a la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:85 de los nucleótidos 103-594. Se clonó un amplicón que exhibe la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO:88 en un vector plasmídico, y se recuperan cantidades suficientes del ADN plasmídico para permitir la transcripción de la ARN polimerasa T7 in vitro de los promotores T7 convergentes incluidos en cualquier extremo del amplicón clonado. Se produjo un ARN de doble hebra y una muestra se sometió a un bioensayo; un segmento de ARN, la hebra sentido, que consiste de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:88 de aproximadamente la posición del nucleótido 24 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 515, excepto que un residuo de uridina está presente en cada posición en la cual un residuo de timidina se muestra en la SEQ ID NO:88, y el segmento de ARN del complemento inverso, o la hebra antisentido, es sustancialmente el complemento inverso de la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:88, de aproximadamente la posición del nucleótido 515 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 24, las uridinas están colocadas de manera apropiada en lugar de las timidinas. Se trató una muestra de ARN de doble hebra (ARNds) con DICER o con ARNasa III para producir suficientes cantidades de ARN interfiriente pequeño (ARNsi). Las muestras que contienen 0.15 partes por millón de ARNsi o ARNds se superponen en un bioensayo de la dieta de CRW como se describió anteriormente y las larvas se dejan alimentar durante 13 días. Las larvas de CRW que se alimentan con la dieta que contiene el ARNds que corresponde a toda o una parte de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:88 exhiben una inhibición del crecimiento y mortalidad significativos en comparación con los controles.

Una secuencia homologa a la ubiquitina B Como se describió anteriormente, la trayectoria de degradación de la proteína de ubiquitina juega un papel importante en el control del ciclo celular mediante la degradación específica de varias proteínas reguladoras, incluyendo las ciclinas mitóticas y los inhibidores de las cinasas dependientes de las ciclinas tales como p27 de las células de los mamíferos. Así, los genes que codifican la ubiquitina y los componentes asociados pueden ser un objetivo preferido para la inhibición mediada por un ARN de doble hebra. (Smith et al., Plant Phys. 1997, 1 13:281-291 ). Se identificó una secuencia de la biblioteca del ADNc de CRW que se predijo que codifica una secuencia de aminoácido que exhibe homología con una proteína designada en la presente como ubiquitina B. La secuencia de consenso para el cúmulo UNIGENE expuesto en la SEQ ID NO:89 se montó de las secuencias superpuestas de cuatro secuencias EST de monoelemento. Una traducción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:89 exhibió homología con una secuencia de aminoácidos de poliubiquitina de Amoeba proteus (No. de Acceso de GenBank AF034789) y con una secuencia de proteína de la ubiquitina de Drosophila melanogaster (No. de Acceso de GenBank M22428). Así, se cree que la traducción de la secuencia de aminoácidos de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:89 codifica una ubiquitina B. La SEQ ID NO:89 sirvió como la base para construir un par de cebadores para utilizarse en una reacción de amplificación térmica para amplificar una secuencia nucfeotídica que codifica toda o parte de una secuencia de aminoácidos de la ubiquitina B del gusano de la raíz del maíz. La SEQ ID NO:90 y la SEQ ID NO:91 corresponden respectivamente a los cebadores de la amplificación térmica hacia delante e inverso (es decir, un par de cebadores) para utilizarse en la producción de un amplicón del secuencias nucleotídicas derivado de CRW, de ADN genómico, recolecciones de ARNm o ADNc derivado de tales recolecciones de ARNm.

La secuencia de tal amplicón debe corresponder a todo o parte de un gen de CRW que codifica una proteína homologa a la ubiquitina B. La SEQ ID NO:90 y la SEQ ID NO:91 contienen cada una secuencia promotora T7 de 23 nucleótidos de las posiciones de los nucleótidos 1-23 respectivamente. Los nucleótidos 24-40 como se expone en la SEQ ID NO:90, corresponden a los nucleótidos 62-78 como se expone en la SEQ ID NO:89. Los nucleótidos 24-47 como se expone en la SEQ ID NO:91 corresponden al complemento inverso de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:89 de los nucleótidos 399-422. Utilizando el par de cebadores que consiste de la SEQ ID NO:90 y la SEQ ID NO:91 en una reacción de amplificación con el ADN genómico de CRW como una plantilla, se produjo un amplicón de 407 pares de bases que comprende la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:92, que corresponde sustancialmente a una parte del genoma de CRW que codifica una proteína que exhibe homología con una enzima que conjuga la ubiquitina. La secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:92 de aproximadamente el nucleótido 24 hasta aproximadamente el nucleótido 384 corresponde sustancialmente a la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:89 de los nucleótidos 62-422. El amplicón que exhibe la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO:92 se clona en un vector plasmídico, y se recuperaron cantidades suficientes de ADN plasmídico para permitir la transcripción de la ARN polimerasa T7 in vitro de los promotores T7 convergentes incluidos en cualquier extremo del amplicón clonado. Se produjo un ARN de doble hebra y una muestra se sometió a un bioensayo; un segmento de ARN, la hebra sentido, que consiste de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:92 de aproximadamente la posición del nucleótido 24 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 384, excepto que un residuo de uridina está presente en cada posición en la cual un residuo de timidina se muestra en la SEQ ID NO:92, y él segmento de ARN del complemento inverso, o la hebra antisentido, es sustancialmente el complemento inverso de la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:92, de aproximadamente la posición del nucleótido 384 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 24, las uridinas están colocadas de manera apropiada en lugar de las timidinas. Se trató una muestra de ARN de doble hebra (ARNds) con DICER o con ARNasa III para producir suficientes cantidades de ARN interfiriente pequeño (ARNsi). Las muestras que contienen 0.15 partes por millón de ARNsi o ARNds se superponen en un bioensayo de la dieta de CRW como se describió anteriormente y las larvas se dejan alimentar durante 13 días. Las larvas de CRW que se alimentan con la dieta que contiene el ARNds que corresponde a toda o una parte de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:92 exhiben una inhibición del crecimiento y mortalidad significativas en comparación con los controles.

Un homólogo de la esterasa de la hormona juvenil Como se indicó anteriormente, la hormona juvenil del insecto controla y regula una variedad de procesos biológicos necesarios dentro del ciclo de vida del insecto, incluyendo, de manera no exclusiva la metamorfosis, la reproducción y el letargo. La interrupción de la síntesis de la JH o las trayectorias de degradación utilizando la tecnología de supresión del gen puede ser un objetivo efectivo para la inhibición de la plaga mediada por el ARN de doble hebra. Se identificó una secuencia del homólogo de la esterasa de la hormona juvenil de un insecto derivada de CRW, para utilizarse en la presente invención. La SEQ ID NO:93 corresponde sustancialmente a la secuencia nucleotídica de ADNc del intestino medio de CRW. Una traducción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:93 predice homología con la esterasa de la hormona juvenil (JHE). La SEQ ID NO:94 y la SEQ ID NO:95 corresponden respectivamente a los cebadores de amplificación hacia delante e inversa (es decir, un par de cebadores) para utilizarse en la producción de un amplicón del ADN genómico de CRW, recolecciones de ARNm de CRW, o un ADNc de CRW derivado de tales recolecciones. La secuencia de tal amplicón debe corresponder a todo o parte de un gen de CRW que codifica una proteína homologa a la JHE. La SEQ ID NO:94 y la SEQ ID NO:95 contienen cada una, una secuencia promotora T7 de 23 nucleótidos de las posiciones de los nucleótidos 1-23 respectivamente. Los nucleótidos 24-45 como se expone en la SEQ ID NO:94, corresponden a los nucleótidos 58-79 como se expone en la SEQ ID NO:93. Los nucleótidos 24-46 como se expone en la SEQ ID NO:95 corresponden al complemento inverso de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:93 de los nucleótidos 338-360. Utilizando el par de cebadores que consiste de la SEQ ID NO:94 y la SEQ ID NO:95 en una reacción de amplificación con el ADN genómico de CRW como una plantilla, se produjo un ampiicón de 48 pares de bases que comprende la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO: 96. De manera preferida, se produce un ampiicón utilizando una recolección de ARNm de CRW o un ADNc derivado de tal recolección como la secuencia nucleotídica plantilla en la reacción de amplificación. Se clonó un ampiicón que exhibe la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO:96 en un vector plasmídico, y se recuperan cantidades suficientes del ADN plasmídico para permitir la transcripción de la ARN polimerasa T7 in vitro de los promotores T7 convergentes incluidos en cualquier extremo del ampiicón clonado. Se produce el ARN de doble hebra y una muestra se somete a un bioensayo; un segmento de ARN, la hebra sentido, que consiste de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:96 de aproximadamente la posición del nucleótido 45 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 302, excepto que un residuo de uridina está presente en cada posición en la cual un residuo de timidina se muestra en la SEQ ID NO:96, y el segmento de ARN del complemento inverso, o la hebra antisentido, es sustancialmente el complemento inverso de la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:96 de aproximadamente la posición del nucleótido 302 al menos hasta aproximadamente la posición del nucleótido 45, las uridinas están colocadas de manera apropiada en lugar de las timidinas. Se trató una muestra de ARN de doble hebra (ARNds) con DICER o con ARNasa III para producir suficientes cantidades de ARN interfiriente pequeño (ARNsi). Las muestras que contienen 0.15 partes por millón de ARNsi o ARNds se superponen en un bioensayo de la dieta de CRW como se describió anteriormente y las larvas se dejan alimentar durante 13 días. Las larvas de CRW que se alimentan con la dieta que contiene el ARNds que corresponde a toda o una parte de la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:96 exhiben una inhibición del crecimiento y mortalidad significativas en comparación con los controles. Diez de las moléculas de ARN de doble hebras listadas anteriormente se probaron en un bioensayo en paralelo con ARN interfirientes pequeños generados de las moléculas de ARN de doble hebra. Las muestras de la secuencia de ARN de doble hebra o las muestras del ARN interfiriente pequeño preparadas de las muestras de la secuencia de ARN de doble hebra, cada una que corresponde a las secuencias de aminoácidos indicadas para los homólogos de un gen objetivo seleccionado, incluyendo un homólogo de V-ATPasa de 40 kDa, un homólogo de EF-1-alfa, un homólogo de la subunidad p28 del proteosoma 26S, un homólogo de la epóxido hidrolasa de la hormona juvenil, un homólogo de CHD3, un homólogo de beta-tubulina, dos homólogos de quitinasa, un homólogo del factor de transcripción IIB y un homólogo de la esterasa de la hormona juvenil (que corresponden respectivamente a las SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:21 , SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:72 y la SEQ ID NO:96) se aplicaron a una dieta de un insecto a una concentración de aproximadamente diez partes por millón (30 microlitros de una solución que contiene una muestra de ARN de doble hebra ajustada a una concentración apropiada se agregó a los pozos de placas de microtítulo que contienen 200 microlitros de dieta para insecto por pozo). Se utilizó un total de dieciocho pozos para cada muestra. Una sola larva de la primera instar se agregó a cada pozo después de que las muestras de ARN se han difundido en la dieta. Los bioensayos se incubaron como se indicó anteriormente durante aproximadamente 13 días y se verificaron diariamente para la morbilidad y la mortalidad. Una variante de la secuencia de aminoácidos de la proteína de cristal insecticida Cry3Bb1 designada como la proteína insecticida 11231 en English et al. (Patente de E.U.A. No. 6,642,030) se utilizó como un control positivo para observar la bioactividad insecticida específica para la plaga del gusano de la raíz. La Cry3Bb se aplicó a la dieta como se expone en English et al., excepto que la concentración de Cry3Bb en la dieta se ajustó para se aproximadamente 200-300 partes por millón. Una muestra de control separada que se trató sólo con amortiguador o agua también se incluyó en el ensayo. Una muestra de control del ARN de doble hebra y una muestra de control del ARN interfiriente pequeño producida de las muestras de control del ARN de doble hebra también se incluyeron como controles negativos adicionales (Equipo ARNi MEGAscript®, AMBION, Austin, Texas). Una evaluación inicial utilizando moléculas de ARN de doble hebra derivadas de estas diez secuencias indicó que las larvas que se dejaron alimentar con la dieta que contiene el ARN de doble hebra que corresponde al homólogo de V-ATPasa de 40 kDa (SEQ ID NO:35), el homólogo de CHD3 (SEQ ID NO:7), y un homólogo de beta-tubulina (SEQ ID NO:31) exhibieron una mortalidad significativa en comparación con los controles. Basándose en estos resultados, se realizaron bioensayos adicionales para probar si las partículas de ARN interfiriente pequeño de doble hebra serían más efectivas que las moléculas de ARN de doble hebra de longitud completa.

Una secuencia homologa a la alfa tubulina Las células eucarióticas generalmente utilizan elementos estructurales del citoesqueleto que son importantes, no sólo como una estructura mecánica, sino también para sustentar la forma de la célula. Los microfilamentos semiflexibles hacen móviles a las células, las ayudan a dividirse en la mitosis (citoquinesis) y en los animales vertebrados e invertebrados, son responsables de la contracción muscular. Los microtúbulos relativamente rígidos que están constituidos de las proteínas de alfa y beta tubulina, juegan un papel importante al actuar como una especie de autopista para el transporte de las vesículas y los organelos y en la separación de los cromosomas durante la mitosis (carioquinesis). Los filamentos intermedios flexibles proporcionan al menos resistencia adicional a la estructura total de la célula. También se sabe que el citoesqueleto está involucrado en la señalización a través del citoplasma de la célula. Tomando en cuenta estas funciones, se cree que cualquier interrupción del citoesqueleto o incluso cambios sutiles de su integridad pueden causar consecuencias patológicas a una célula. Al menos una secuencia de la biblioteca de ADNc de CRW se identificó como que se predice que codifica una secuencia de aminoácido que exhibe homología con una proteína designada en la presente como alfa tubulina, y de manera más específica, referida en la presente como la SEQ ID NO:163, como se expone en el listado de secuencias. Se cree que una traducción de la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 163 codifica una proteína de alfa tubulina o un fragmento de la misma. La SEQ ID NO: 163 sirvió como la base para construir una secuencia que se predice que forma un ARN de doble hebra cuando se expresa en E. coli del promotor T7 o en una planta de un promotor funcional de la planta. Una secuencia que sirve como la base para tal secuencia que codifica tal ARN de doble hebra es la SEQ ID NO:97, como se expone en el listado de secuencias, de la posición del nucleótido 58 hasta la posición del nucleótido 1010. Esta secuencia puede expresarse como una molécula de ARN y purificarse y probarse en ensayos de alimentación in vitro para determinar la inhibición del gusano de la raíz del maíz. Un promotor de la ARN polimerasa T7 se introdujo corriente arriba de una secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:97 de la posición del nucleótido 58 hasta la posición del nucleótido 1010, y se produjo el ARN de este constructo (plC17527). Tal ARN se probó por triplicado en un ensayo de alimentación in vitro contra los gusanos de la raíz del maíz contra un control positivo de beta tubulina (descrito aquí anteriormente), 200 ppm de Cry3Bb, y un control no tratado y se determinó la mortalidad media. Las muestras del control no tratado exhibieron menos que aproximadamente 3-5% de mortalidad, mientras que todas las otras muestras de prueba exhibieron de aproximadamente 20 a aproximadamente 55% de mortalidad. Las muestras de Cry3Bb exhibieron de aproximadamente 20 a aproximadamente 36% de mortalidad, mientras que las muestras de plC17527 (a 15 ppm) exhibieron de aproximadamente 38 a aproximadamente 45% de mortalidad. Las muestras de D8 (beta tubulina como se expone aquí anteriormente), también a aproximadamente 15 ppm, exhibieron de aproximadamente 38 a aproximadamente 52% de mortalidad. Basándose en estos resultados, el constructo de alfa tubulina se colocó bajo el control de un promotor funcional de la planta, utilizado para transformar plantas de maíz, y los eventos de transformación que surgen de la transformación se probaron por su capacidad para resistir la infestación con el gusano de la raíz del maíz. Las raíces de las plantas de maíz R0 se transformaron con una secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:97. Brevemente, la secuencia que codifica un constructo de ARNds en la SEQ ID NO:97 como se describió anteriormente, se enlazó en el extremo 5' a una secuencia que consistió de un promotor e35S enlazado de manera operable a un intrón hsp70 de maíz y en el extremo 3' a una secuencia de terminación de la transcripción y de poliadenilación NOS3'. Este cásete de expresión se colocó corriente debajo de un cásete de selección del glifosato. Estos casetes enlazados se colocaron en un vector funcional de transformación de la planta de Agrobacterium tumefaciens y el nuevo vector se designó como pMON72829 (el constructo de ARNds de alfa tubulina), utilizado para transformar tejido de maíz para la tolerancia al glifosato, y los eventos se seleccionaron y transfirieron al suelo. Las raíces de las plantas R0 se alimentaron a las larvas del gusano de la raíz del maíz occidental (WCR, Diabrotica virifera). Las raíces del maíz transgénico se colocaron en cajas de Petri con medio MSOD que contiene los antibióticos y el glifosato para la selección in vitro. Dos larvas de WCR se infestaron por raíz en cada caja con un pincel de punta fina. Las cajas se sellaron con Parafilm para evitar que las larvas escapen. Los ensayos se colocaron en una incubadora Percival a 27°C, 60% de RH en la oscuridad completa. Se verificó la contaminación y la calidad de las larvas. Después de seis días de alimentarse con el tejido de la raíz, las larvas se transfirieron a una dieta de WCR en una placa de 96 pozos. Las larvas se dejaron alimentar con la dieta durante ocho días, haciendo el ensayo completo de catorce días de largo. La masa de las larvas y la supervivencia se registraron para el análisis. Se realizó un análisis de una vía en los datos de la masa de la larva y una prueba de Dunnet para buscar significancia estadística en comparación con LH244, un control negativo no transformado. Las larvas de WCR estaban atrofiadas de manera significativa (a = 0.05) después de alimentarse de los dos eventos, ZM_S 125922 y ZM_S 25938, y se compararon en crecimiento con las larvas alimentadas con las plantas del control negativo (p<0.02). Las larvas que se alimentan con las plantas del control negativo exhibieron una masa media de la larva de aproximadamente 0.6 a aproximadamente 0.8 mg, mientras que las larvas que se alimentaron de las raíces transgénicas exhibieron una masa media de la larva de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.2 mg. Las plantas de maíz transgénicas (R0) generadas utilizando pMON72829 se plantaron en tiestos de 25 cm (10 pulgadas) que contienen suelo Metromix después de alcanzar un tamaño apropiado. Cuando las plantas alcanzaron la etapa de crecimiento V4, aproximadamente 1000 huevos de gusano de la raíz del maíz Occidental (WCR, Diabrotica virifera) se infestaron en la zona de la raíz. El maíz no transgénico del mismo genotipo se infestó a una etapa de crecimiento similar para servir como un control negativo. Los huevos se preincubaron de manera que la eclosión ocurriría en el transcurso de 24 horas de la infestación. Las larvas se dejaron alimentar en los sistemas de la raíz durante 3 semanas. Las plantas se retiraron del suelo y se lavaron de manera que las raíces pudieron evaluarse para la alimentación de las larvas. El daño a la raíz se calificó utilizando una Escala de Lesión del Nodo (NIS), para calificar el nivel de daño, en donde 0 indica ningún daño, un 1 indica que un nodo de las raíces estaba cortado dentro de 3.175 cm (1.5 pulgadas), un 2 indica que 2 nodos estaban cortados, mientras que un 3 indica que 3 nodos estaban cortados. Debido a que las plantas utilizadas para la evaluación estuvieron directamente fuera del cultivo del tejido después de la transformación y debido a que los eventos de transformación son únicos, únicamente una sola planta se evaluó por evento en este momento y no están disponibles estadísticas. Todas las plantas en el ensayo presentaron síntomas de alimentación de las larvas, indicando que se obtuvo una infestación exitosa. Las raíces de la planta del control negativo estaban dañadas de manera moderada a severa, promediando aproximadamente 1.9 en la Escala de Lesión del Nodo. Se probaron plantas únicas de ocho diferentes eventos transgénicos. Las raíces de tres de estas plantas transgénicas proporcionaron un control excelente de la alimentación de la larva, promediando aproximadamente 0.2 o menos en la Escala de Lesión del Nodo. Las raíces de dos de las plantas transgénicas exhibieron daño moderado por la alimentación y otras tres plantas transgénicas exhibieron ningún control de la alimentación de las larvas. Estos datos indicaron que la secuencia nucleotídica doble que codifica una secuencia de ARN que puede formarse en un ARNds es completamente capaz de proporcionar protección de la infestación de la plaga del gusano de la raíz cuando se expresa en una planta transgénica y esa planta se proporciona en la dieta de la plaga del gusano de la raíz. Una explicación de la falta de mortalidad observable consistente u otros efectos con las secuencias seleccionadas para la supresión del gen, incluyendo EFIalfa, subunidad del proteosoma 26S y varias otras secuencias de ADNc podría ser que para esos genes, se expresan homólogos presentes dentro de la población de genes que codifican las proteínas que tienen funciones similares, pero exhiben suficientes diferencias de la secuencia, de modo que la trayectoria del ARNi no actúa para suprimir el homólogo, utilizando las secuencias seleccionadas para la supresión.

EJEMPLO 2 Este ejemplo ilustra la inhibición significativa de la plaga obtenida alimentando una plaga invertebrada con una dieta que contiene las secuencias de ARN de doble hebra derivadas de esa plaga. Se preparó una dieta artificial suficiente para criar larvas del gusano de la raíz del maíz aplicando muestras de las secuencias de ARN de doble hebra de seis diferentes secuencias de la biblioteca de ADNc del gusano de la raíz del maíz. Las larvas del gusano de la raíz del maíz se dejaron alimentar con la dieta durante varios días, y la mortalidad, morbilidad y atrofia se verificaron en comparación con los gusanos de la raíz que se dejaron alimentar sólo con una dieta de control. Las secuencias nucleotídicas que se utilizaron en la dieta se derivaron de las secuencias como se expone en la SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:7 y la SEQ ID NO:31 , cada una que corresponde a las secuencias nucleotídicas derivadas de una biblioteca de ADNc del gusano de la raíz del maíz, la traducción de la secuencia de aminoácidos deducida de las cuales corresponde respectivamente a las proteínas indicadas como un homólogo de la V-ATPasa de 40 kDa, un homólogo de EF1a, un homólogo de la subunidad del proteosoma 26S, un homólogo de la epóxido hidroxilasa de la hormona juvenil, un homólogo de CHD3 y un homólogo de ß-tubulina. Se produjeron ARN de doble hebra (ARNds) que corresponden a estas secuencias, como se indicó anteriormente. Los ARNsi se generaron mediante escisión de los ARNds correspondientes utilizando la enzima ARNasa III, que se sabe que escinde el ARNds en fragmentos de ARNds de 12-15 pb que contienen salientes de 2 a 3 nucleótidos 3' y términos fosfato 5' e hidroxilo 3'. Se espera que el ARNsi producido de esta manera exhiba las mismas propiedades que la ARNsi que se produciría por la enzima Dicer involucrada en la trayectoria del ARNi eucariótico. Se tomaron muestras del ARNds y el ARNsi en la dieta del CRW como se indicó anteriormente a aproximadamente 0.15 ppm. Se probaron 12 larvas del gusano de la raíz del maíz de manera separada contra cada muestra de ARNds o ARNsi como se indicó anteriormente, y los resultados se calificaron después de 13 días. Se observó una reducción significativa en la masa de la larva (p<0.05) para las larvas que se alimentan con la dieta que contiene 0.15 ppm de las secuencias de ARNds como se expone en la SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:7 y la SEQ ID NO:31 , en comparación con el control no tratado (UTC). El ARNsi que corresponde a las secuencias como se expone en la SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:47 y la SEQ ID NO:7, también proporcionaron una reducción significativa en la masa de la larva (p<0.05). Sin embargo, el tamaño de la muestra de las larvas fue insuficiente para establecer con certeza que las moléculas de ARNds o de ARNsi que resultaron en la disminución más grande en la masa de la larva en comparación con los controles, fue un resultado de una variación aleatoria o claramente un resultado basado en la inhibición mediada por el ARN de doble hebra de alguna función biológica dentro de las larvas del gusano de la raíz. Por lo tanto, basándose en estos resultados, las secuencias de ARN que corresponden a la SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:7 y la SEQ ID NO:31 , se reevaluaron con un tamaño de muestra de larvas más grande. Las muestras de ARNds o ARNsi se aplicaron a cada uno de 72 pozos para cada una de las cuatro secuencias de ARN en la evaluación. Cada pozo se cargó con 0.15 ppm de ARNds o ARNsi como se indicó anteriormente, aplicando un volumen de 30 microlitros que contiene el ARN a la superficie de la dieta, y dejando que la muestra se infunda y la superficie de la dieta se seque. Una sola larva se agregó a cada pozo, y se incubó durante trece días. La mortalidad y morbilidad de las larvas se evaluó, y la masa de las larvas sobrevivientes se determinó. Los resultados del bioensayo se muestran en el Cuadro 1.

CUADRO 1 Resultados del Bioensayo Todas las muestras de ARNsi a 0.15 ppm por pozo UTC - TrisHCI 10 mM pH 7.5 STE - error estándar 1 - ARNds del fago ?, EPICENTER TECHNOLOGIES, Madison, Wisconsin en el bioensayo de ARNds; Equipo ARNi MEGAscript®, AMBION, Austin, Texas en el bioensayo de ARNsi 2 - Variante 11231 de Cry3Bb a 300 ppm en el bioensayo de ARNds, 200 ppm en el Bioensayo de ARNsi Todas las muestras se compararon unas con otras utilizando el método de HSD de Tukey más que cualquier otro control único. Se observó una atrofia significativa de las larvas para cada ARNds o ARNsi probado, juzgada por la reducción de la masa promedio de las larvas sobrevivientes en comparación con el control no tratado. De manera más importante, las muestras de ARN interfiriente pequeño de doble hebra demostraron una capacidad para causar mortalidad y morbilidad (basándose en la masa reducida de la larva) a un nivel que fue al menos tan efectivo como la muestra del control positivo de la variante 11231 de Cry3Bb. Estos resultados sugieren que cualquier molécula de ARN de doble hebra derivada de una secuencia de ARN mensajero presente en las células del gusano de la raíz del maíz puede ser efectiva cuando se proporciona a los gusanos de la raíz del maíz en su dieta para inhibir la infestación de la plaga del gusano de la raíz de una especie de plantas.

EJEMPLO 3 Este ejemplo ilustra las secuencias nucleotídicas para la expresión en una célula de planta, y el efecto de proporcionar tales secuencias nucleotídicas en la dieta de un gusano de la raíz deí maíz. Una secuencia que codifica CHD3 derivada de una biblioteca de ADNc del gusano de la raíz del maíz se utilizó para construir una secuencia nucleotídica que codifica un ARN de doble hebra estabilizado. Una secuencia de ADNc como se expone en la SEQ ID NO:171 , que codifica una parte de un ortólogo o un homólogo de una secuencia de aminoácidos de CHD3 se utilizó para construir un par de cebadores para utilizarse en una reacción de amplificación térmica utilizando el ADN plantilla genómico del gusano de la raíz del maíz. El par de cebadores como se expone en la SEQ ID NO:5 y la SEQ ID NO:6, permitió la amplificación de un amplicón del genoma de doble hebra, una hebra del cual exhibió la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:7. Se produjeron tres segmentos de la secuencia nucleotídica de la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:7. Se produjo un primer segmento nucleotídico (SEQ ID NO:174) utilizando una secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:7 como la plantilla en una reacción de amplificación térmica junto con el par de cebadores para la amplificación térmica que exhiben las secuencias como se expone en la SEQ ID NO:8 y la SEQ ID NO:9. Se produjo un segundo segmento nucleotídico (SEQ ID NO:13) utilizando una secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:7 como la plantilla en una reacción de amplificación térmica junto con el par de cebadores para la amplificación térmica que exhiben las secuencias como se expone en la SEQ ID NO:11 y la SEQ ID NO:12. Se produjo un tercer segmento nucleotídico (SEQ ID NO:16), utilizando una secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:7 como la plantilla en una reacción de amplificación térmica junto con el par de cebadores para la amplificación térmica que exhiben las secuencias como se expone en la SEQ ID NO:14 y la SEQ ID NO:15. El extremo 3' de una de las hebras del primer segmento es complementario al extremo 3' de una de las hebras del segundo segmento, de manera que en una reacción de amplificación térmica que contiene ambos de estos segmentos, estos extremos complementarios se hibridan y permiten la extensión mediada por la polimerasa de ambas hebras de sus extremos 3' respectivos. El extremo 3' de la otra hebra del segundo segmento es complementario con el extremo 3' de una de las hebras del tercer segmento, de manera que en una reacción de amplificación térmica que contiene ambos de estos segmentos, estos extremos complementarios se hibridan y permiten la extensión mediada por la polimerasa de ambas hebras desde sus extremos 3' respectivos. En una reacción de amplificación térmica que contiene los tres segmentos y sus secuencias complementarias, es decir, el primer, el segundo y el tercer segmento, junto con las secuencias del cebador para la amplificación térmica como se expone en la SEQ ID NO:8 y la SEQ ID NO: 15, se produce una nueva secuencia como se expone en la SEQ ID NO:17, que se colocó bajo el control de un promotor que funcione en plantas, puede producir una secuencia nucleotídica de ARN sustancialmente idéntica a la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:17, excepto que los residuos de uridina están presentes en lugar de los residuos de timidina. Esta secuencia nucleotídica de ARN puede formar una molécula de ARN estabilizada en virtud de la complementaried'ad inversa del tercer segmento al primer segmento, en el cual la porción de la SEQ ID NO:17 que corresponde al tercer segmento de aproximadamente la posición del nucleótido 303 a aproximadamente la posición del nucleótido 473, se híbrida a la porción de la SEQ ID NO:17, que corresponde al primer segmento de aproximadamente la posición del nucleótido 1 hasta aproximadamente la posición del nucleótido 171 , y el primer y el tercer segmentos se enlazan mediante un segundo segmento de la secuencia nucleotídica, que en este ejemplo, se representa por la porción de la SEQ ID NO: 17 que corresponde al segundo segmento de aproximadamente la posición del nucleótido 172 hasta aproximadamente la posición del nucleótido 302. La expresión de una secuencia nucleotídica que corresponde a la SEQ ID NO:17 en las células de la planta, resulta en la síntesis de una molécula de ARN estabilizada. Las células de la planta que transcriben una secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:17 en una secuencia de ARN, pueden proporcionarse en la dieta de un gusano de la raíz del maíz. Un gusano de la raíz del maíz que se alimenta con tales células de la planta, dejan de alimentarse, se evita su desarrollo en un escarabajo adulto, se evita su reproducción, muere o sufre de cualquiera o todos de estos efectos como resultado de la inhibición de la síntesis de la proteína homologa a CHD3. Una secuencia que codifica la ß-tubulina derivada de una biblioteca de ADNc del gusano de la raíz del maíz, se utilizó para construir una secuencia nucleotídica que codifica un ARN de doble hebra estabilizado. Una secuencia de ADNc como se expone en la SEQ ID NO:18 que codifica una parte de un ortólogo o un homólogo de una secuencia de aminoácidos de ß-tubulina, se utilizó para construir un par de cebadores para utilizarse en una reacción de amplificación térmica, utilizando el ADN plantilla genómico del gusano de la raíz del maíz. El par de cebadores como se expone en la SEQ ID NO:19 y la SEQ ID NO:20, permiten la amplificación de un amplicón del genoma de doble hebra, una hebra del cual exhibe la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:21. Se produjeron tres segmentos de la secuencia nucleotídica de la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:21. Se produjo un primer segmento nucleotídico (SEQ ID NO:173) utilizando una secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:21 como la plantilla en una reacción de amplificación térmica, junto con el par de cebadores para la amplificación térmica que exhiben las secuencias como se expone en la SEQ ID NO:22 y la SEQ ID NO:23. Se produjo un segundo segmento nucleotídico (SEQ ID NO:27), utilizando una secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:21 como la plantilla en una reacción de amplificación térmica, junto con el par de cebadores para la amplificación térmica que exhiben las secuencias como se expone en la SEQ JD NO:25 y la SEQ ID NO:26. Se produjo un tercer segmento nucleotídico (SEQ ID NO:36) utilizando una secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:21 como la plantilla en una reacción de amplificación térmica, junto con el par de cebadores para la amplificación térmica que exhiben las secuencias como se expone en la SEQ ID NO:28 y la SEQ ID NO:29. El extremo 3' de una de las hebras del primer segmento es complementario con el extremo 3' de una de las hebras del segundo segmento, de manera que en una reacción de amplificación térmica que contiene estos segmentos, estos extremos complementarios se hibridan y permiten la extensión mediada por la polimerasa de ambas hebras de sus extremos 3' respectivos. El extremo 3' de otra hebra del segundo segmento es complementaria con el extremo 3' de una de las hebras del tercer segmento, de manera que en una reacción de amplificación térmica que contiene ambos de estos segmentos, estos extremos complementarios se hibridan y permiten la extensión mediada por la polimerasa de ambas hebras de sus extremos 3' respectivos. En una reacción de amplificación térmica que contiene los tres segmentos y sus secuencias complementarias, es decir, el primer, el segundo y el tercer segmento, junto con sus secuencias del cebador para la amplificación térmica como se expone en la SEQ ID NO:22 y la SEQ ID NO:29, se produce una nueva secuencia como se expone en la SEQ ID NO:31 , que cuando se coloca bajo el control de un promotor que funciona en plantas, puede producir una secuencia nucleotídica de ARN sustancialmente idéntica a la secuencia como se expone en la SEQ ID NO:31 , excepto que los residuos de uridina están presentes en lugar de los residuos de timidina. Esta secuencia nucleotídica de ARN puede formar una molécula de ARN estabilizada en virtud de la complementariedad inversa del tercer segmento al primer segmento, en el cual la porción de la SEQ ID NO:31 que corresponde al tercer segmento de aproximadamente la posición del nucleótido 358 a aproximadamente la posición del nucleótido 577, se híbrida a la porción de la SEQ ID NO:31 que corresponde al primer segmento de aproximadamente la posición del nucleótido 31 hasta aproximadamente la posición del nucleótido 250, y el primer y tercer segmentos se enlazan por un segundo segmento de la secuencia nucleotídica, que en este ejemplo se representa por una porción de la SEQ ID NO:31 que corresponde al segundo segmento de aproximadamente la posición del nucleótido 251 hasta aproximadamente la posición del nucleótido 357. La expresión de una secuencia nucleotídica que corresponde a la SEQ ID NO:31 en las células de la planta, resulta en la síntesis de una molécula de ARN estabilizada. Las células de la planta que transcriben una secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO:31 en una secuencia de ARN, pueden proporcionarse en la dieta de un gusano de la raíz del maíz. Un gusano de la raíz del maíz que se alimenta con tales células de la planta se deja de alimentar, se evita que se desarrolle en un escarabajo adulto, se evita que se reproduzca, muera o sufra de cualquiera o todos estos efectos como un resultado de la inhibición de la síntesis de la proteína de la ß tubulina.

EJEMPLO 4 Este ejemplo ilustra los efectos sinergísticos de proporcionar en la dieta de una plaga invertebrada una o más composiciones plaguicidamente efectivas junto con una o más secuencias de ARN de doble hebra derivadas de la plaga invertebrada, la una o más secuencias de ARNds han demostrado previamente un efecto plaguicida cuando se proporcionan en la dieta de la plaga. Como se indicó en el ejemplo 3, la proporción en la dieta de una plaga invertebrada de una molécula de ARN de doble hebra derivada de una plaga, resulta en la inhibición de una o más funciones biológicas en la plaga, y por lo tanto funciona para lograr un efecto plaguicida, resultando en la mortalidad de la plaga o alguna otra característica mensurable que reduce la capacidad de la plaga para infestar un medio u hospedero particular. La adición de uno o más de otros agentes plaguicidas, cada uno diferente uno del otro, y cada uno que funciona para lograr su efecto plaguicida por un medio diferente de la manera en la cual funciona el ARNds para alcanzar su efecto plaguicida, puede resultar en alcanzar una mejorar en el nivel de control de la plaga y disminuiría además la probabilidad de que la plaga desarrolle resistencia a cualquiera o más de los agentes plaguicidas o ARNds cuando se utiliza sola para lograr la inhibición de la plaga. Para probar esto, las larvas de CRW se dejaron alimentar con la dieta en la cual se incorporaron cantidades variables de una proteína inhibidora del gusano de la raíz Cry3Bb y una cantidad fija de un ARN de doble hebra formulado anteriormente como se expone en el Ejemplo 2 ó 3, tal como un ARNds que corresponde a la SEQ ID NO:17 o la SEQ ID NO:31. Se observa un efecto sinergístico de inhibición de la plaga. Como se expone en el Ejemplo 2 y 3, una cantidad LD50 de una variante de Cry3Bb se utilizó para alcanzar aproximadamente un 50% de mortalidad de las larvas del insecto con una reducción coordinada en las condiciones físicas de las larvas sobrevivientes como se juzga por los pesos reducidos de las larvas como en comparación con los controles negativos. La reducción de la cantidad de la proteína insecticida en la dieta resulta en una reducción coordinada en la proporción de mortalidad, y un incremento en los pesos medios de las larvas sobrevivientes. La adición del ARNds que corresponde a la SEQ ID NO:31 o a la SEQ ID NO:17, resulta en una mortalidad casi completa a cada concentración de Cry3Bb, y una disminución sustancial en el peso medio de cualquier sobreviviente. Esto sugiere un efecto sinergístico. La sinergia se logró a través de la perturbación en el intestino medio de la larva como resultado de la introducción de cualquier cantidad de Cry3Bb, que ha mostrado introducir poros en la membrana del intestino medio. Los poros pueden permitir que un nivel mayor de las especies de ARN de doble hebra se permeen en las células o incluso en la hemolinfa, resultando en un suministro más eficiente de las especies de ARNds en las larvas, y resultando así en una reducción más eficiente en la supresión del ARNm objetivo. Las combinaciones particulares de las composiciones que forman los poros junto con las composiciones de ARN de doble hebra, resultan en un efecto plaguicida mejorado y sinergístico debido a que el ARNds es ahora más capaz de distribuirse a través de la hemolinfa y ejerce los efectos en las células y los tejidos remotos del intestino de la plaga. Las composiciones que forman poros particulares incluyen, de manera no exclusiva, proteínas de toxinas insecticidas derivados de B. thuringiensis y especies relacionadas, ya sea que demuestren o no ser insecticidas a un insecto particular, y pueden incluir además de manera no exclusiva, dominios que forman poros de tales toxinas. Tales composiciones que forman poros pueden incluir también una o más toxinas o dominios que forman poros o combinaciones de los mismos, cada uno diferente uno del otro, cada uno que exhibe un modo diferente de acción como se juzga por las propiedades para formar un canal de cada toxina o dominio, incluyendo la cinética de la formación del canal de iones, el tamaño de los estados de conductancia, la conductancia total de la membrana, la especificidad del ion y las propiedades para recortar el canal iónico. Las combinaciones de tales composiciones que forman el poro junto con las moléculas de ARNds específicas para la supresión de uno o más genes en una especie de coleóptero, se contemplan de manera específica en la presente.

EJEMPLO 5 Este ejemplo ilustra que los fragmentos de la secuencia nucleotídica de la V-ATPasa, cuando se proporcionan en la forma del ARN de doble hebra en la dieta de una especie de CRW, son útiles para controlar la plaga de insectos. La secuencia como se expone en la SEQ ID NO:104 es una clona de ADNc que representa 1870 nucleótidos de un ARNm de 2400 nucleótidos que codifica una proteína que exhibe una identidad de la secuencia sustancial con la ATPasa Vacuolar de Drosophila melanogaster (68 kd, subunidad 2). Esta clona de ADNc se secuenció completamente en ambas hebras, utilizando cebadores diseñados de los datos de la secuencia inicial. Estos cebadores de secuenciamiento se listan como la SEQ ID NO:105 hasta la SEQ ID NO:120. La SEQ ID NO:121 y la SEQ ID NO:122 son secuencias de los cebadores utilizados para producir una copia de la SEQ ID NO:104 del ADNc en el vector de clonación pSPORT (Invitrogen). Cada cebador contiene una secuencia promotora T7 de 20 nucleótidos de las posiciones de los nucleótidos 1-20. Los nucleótidos 21-44 expuestos en la SEQ ID NO:121 y los nucleótidos 21-45 de la SEQ ID NO:122, corresponden a las secuencias dentro del vector pSPORT que flanquea el ADNc insertado. Estos cebadores permiten la amplificación de una plantilla de ADN que contiene el fragmento de ADNc flanqueado en cualquier extremo con promotores T7, permitiendo la producción in vitro del ARN de doble hebra con una ARN polimerasa T7. Cuando el ARN de doble hebra derivado de la SEQ ID NO:104 se incluyó en la dieta de CRW, se observó una mortalidad de aproximadamente 80%. Seis diferentes regiones de la SEQ ID NO: 104 se probaron utilizando los segundos conjuntos de cebadores de amplificación: SEQ ID NO: 123 y SEQ ID NO: 124, que corresponden a los nucleótidos 1 a 291 (referidos como la sección #1 , 271 pares de bases) de la SEQ ID NO:1 ; SEQ ID NO:125 y la SEQ ID NO:126, que corresponden a los nucleótidos 292 a 548 (referidos como la sección #2, 260 pares de bases); SEQ ID NO:127 y la SEQ ID NO: 128 que corresponde de 549 a 830 (referidos como la sección #3, 271 pares de bases) ; SEQ ID NO:129 y la SEQ ID NO:130 que corresponden a los nucleótidos 840 a 1345 (referidos como la sección #4, 505 pares de bases); SEQ ID NO:131 y la SEQ ID NO:132 que corresponden a los nucleótidos 1360 a 1621 (referidos como la sección #5, 261 pares de bases); SEQ ID NO:133 y la SEQ ID NO:136 que corresponden a los nucleótidos 1540 a 1870 (referidos como la sección #6, 278 pares de bases). Nótese que la sección 5 y 6 se superponen por aproximadamente 80 pares de bases. Cuando estas 6 secciones se incorporaron de manera separada en la dieta de CRW, las secciones #1 , #2, #3 y #4 mostraron una mortalidad de CRW que varía de 94% a 100%. La sección #5 y la #6 no mostraron mortalidad del CRW por encima de la base mostrada en los controles no tratados. La secuencia representada por la sección #1 se subdividió además en 3 secciones más pequeñas, cada una de estas tres secciones más pequeñas se representa por al menos de aproximadamente 50 a aproximadamente 180 nucleótidos contiguos dentro de la sección #1 , de manera que la primera subsección en la sección #1 superpuesta con la segunda subsección en la sección #1 , y la tercera subsección en la sección #1 se superpone con la segunda subsección. Cada una de estas subsecciones se probó de manera separada en el bioensayo de CRW. Se observó una mortalidad entre el 80 y el 90% utilizando estas tres secuencias más cortas. Un segundo medio para probar la bioactividad de las moléculas de ARNds derivadas de los genes de CRW es construir una molécula de ARN autocomplementaria. Combinando la misma secuencia de ADN en la orientación inversa con el promotor de la ARN polimerasa T7, puede sintetizarse una molécula de ARN única que es autocomplementaria. Una molécula de ARN tal, se construyó combinando los nucleótidos 1 hasta 345 con los nucleótidos 50 hasta 325, de la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO: 104. La secuencia resultante es como se expone en la SEQ ID NO:137, y se designó como plC17527. plC17527 se clonó en pTOPT2.1 (Invitrogen). Utilizando el promotor T7 en el vector pTOPO 2.1 , se produjo un ARNds de aproximadamente nucleotidos de 500 pares de bases y se incorporó en la dieta de CRW. La mortalidad resultante fue de entre el 80% al 100%.

EJEMPLO 6 Este ejemplo ilustra la toxicidad oral de la ARNds hacia las larvas del Escarabajo de la Papa del Colorado, Leptinotarsa decemlineata. El ARN total se aisló de las larvas del escarabajo de la papa del Colorado (CPB), Leptinotarsa decemlineata, utilizando el equipo m/rVana de Ambion (# de Catálogo 1560) y los procedimientos recomendados (Ambion Inc., Austin, TX). Las larvas de CPB que ocupan aproximadamente un volumen de 200 pL en un tubo de microcentrífuga se utilizaron para cada preparación. Se utilizaron cinco microgramos del ARN total para preparar el ADNc utilizando el sistema de RT-PCR Thermoscript™ de Invitrogen (# de Catálogo 1 1146) y los procedimientos recomendados para la síntesis del ADNc mediado por el cebador aleatorio (Invitrogen, Carlsbad, CA). Este ADNc se utilizó como una plantilla para la amplificación de las secuencias ortólogas de la subunidad 2 de la V-ATPasa A utilizando la ADN polimerasa Taq y los cebadores oligonucleotídicos pr550 (SEQ ID NO:160) y pr552 (SEQ ID NO:161 ). Estos cebadores se diseñaron alineando las secuencias nucleotídicas para los ortólogos de V-ATPasa A más cercanos de Manduca sexta (SEQ ID NO:151 ), Aedes aegypti (SEQ ID NO:152), Drosophila melanogaster (SEQ ID NO:153) y Diabrotica virgifera (WCR), y seleccionando las regiones de degeneración mínima. El cebador pr550 corresponde a los nucleótidos 230-252 en la secuencia del gen de M. sexta con el cebador pr552 que corresponde a los nucleótidos 1354-1331 en la secuencia del gen de M. sexta. La amplificación se logró utilizando un procedimiento de amplificación por contacto con los siguientes parámetros del ciclo: Paso 1. 94°C, 2 minutos; Paso 2. 94°C, 30 segundos; Paso 3. 50°C, 2 minutos; Paso 4. 72°C, 2 minutos (35 ciclos para los pasos 2-4, con un contacto de -0.3°C por ciclo para el paso 3); Paso 5. 72°C, 10 minutos; y Paso 6. 4°C. El fragmento de ADN de aproximadamente 1.2 kb amplificado del ADNc se clonó en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen), para proporcionar el plásmido recombinante plC17 05. La secuencia nucleotídica del inserto clonado (SEQ ID NO: 144), comparte únicamente 82% de identidad de la secuencia nucleotídica con la secuencia ortóloga de la subunidad 2 de la V-ATPasa del gusano de la raíz del maíz Occidental, Diabrotica virgifera, sin embargo, las secuencias de aminoácidos deducidas para las proteínas de V-ATPasa A codificadas, comparten 97% de identidad de la secuencia. La secuencia ortóloga de la V-ATPasa A en el plásmido plC17105 se amplificó utilizando los cebadores pr568 (SEQ ID NO:162) y pr569 (SEQ ID NO:163), diseñados como cebadores "universales" para generar las plantillas de ADN con las secuencias del promotor de la polimerasa T7 flanqueante de las clonas de pCR2.1-TOPO. El ADN amplificado sirvió como la plantilla para la síntesis del ARNds utilizando el equipo MEGAscript™ de Ambion (# de Catálogo 1626) y los procedimientos recomendados (Ambion Inc., Austin, TX). El ARNds purificado de la secuencia ortóloga de V-ATPasa A de L. decemlineata se alimentó a las larvas de L. decemlineata en un ensayo de alimentación de los insectos. La dieta del CPB consiste de 13.2 g/L de agar (Serva 1 1393), 140.3 g/L de premezcla Bio-Serve (F9380B), 5 ml/IL de KOH (18.3% peso/peso), y 1.25 ml/L de formalina (37%). La dieta se distribuyó en alícuotas de 200 uL en placas de 96 pozos y se secó brevemente antes de la aplicación de la muestra. Veinte pL de la muestra de prueba se aplicaron por pozo, con agua estéril que sirve como la verificación no tratada (UTC). Las placas se dejaron secar antes de agregar las larvas del insecto. Una larva neonata de CPB se agregó por pozo con un pincel fino. Las placas se sellaron con mylar y se ventilaron utilizando un alfiler para insectos. Se probaron cuarenta larvas por tratamiento. Las placas de bioensayo se incubaron a 27°C, 60% de RH, en oscuridad completa durante 10-12 días.

Las placas se calificaron para la atrofia y mortalidad de las larvas. Los datos de analizaron utilizando el programa estadístico JMP® 4 (SAS Institute, Cary, N. C, EUA).

CUADRO 2 Toxicidad oral del ARNds para las larvas de CPB Basándose en los datos del bioensayo de la toxicidad oral utilizando un ARNds de V-ATPasa específico para CPB, la infestación por CPB de las plantas puede controlarse proporcionando en la dieta de la plaga una célula de planta que expresa una o más secuencias de ARNds específicas para la supresión de uno o más genes en una plaga de CPB.

EJEMPLO 7 Este ejemplo ilustra los resultados de los bioensayos de varias larvas de lepidópteros en una dieta artificial utilizando ARNds específico del insecto. El ARN total se aisló de la 2a-3a instar de las larvas de Spodoptera frugiperda, Helicoverpa zea, Agrotis Ípsilon y Ostrinia nubilalis utilizando el equipo m/rVana de Ambion (# de Catálogo 1560) y los procedimientos recomendados (Ambion Inc., Austin, TX). Las larvas que ocupan aproximadamente 200 pl_ de volumen en un tubo de microcentrífuga se utilizaron para cada preparación. Cinco microgramos del ARn total de cada una de las especies de lepidópteros anteriores se utilizaron para preparar el ADNc utilizando el sistema de RT-PCR Thermoscript™ de Invitrogen (# de Catálogo 11 146) y los procedimientos recomendados para la síntesis del ADNc mediada por el cebador aleatorio (Invitrogen, Carlsbad, CA). Este ADNc se utilizó como una plantilla para la amplificación de una o más secuencias ortólogas de la sübunidad 2 de la V-ATPasa A específicas para una de las especies de lepidópteros, utilizando la ADN polimerasa Taq y los cebadores oligonucleotídicos pr550 (SEQ ID NO:160) y pr552 (SEQ ID NO:161 ). Estos cebadores se diseñaron alineando las secuencias nucleotídicas para los ortólogos de V-ATPasa A más cercanos de Manduca sexta, Aedes aegypti, Drosophila melanogaster y Diabrotica virgifera (WCR), y seleccionando las regiones de degeneración mínima. El cebador pr550 corresponde a los nucleótidos 230-252 en la secuencia del gen de M. sexta, mientras que el cebador pr552 que corresponde a los nucleótidos 1354-1331 en la secuencia del gen de M. sexta. La amplificación se logró utilizando un procedimiento de PCR por contacto con los parámetros del ciclo como se describe en el Ejemplo 6. Los productos de ADN amplificados se clonaron en pCR2.1-TOPO y se secuenciaron para confirmar su identidad. Los plásmidos recombinantes que contienen las secuencias del gen ortólogo se listan en el Cuadro 3.

CUADRO 3 Secuencias ortólogas de ía subunidad 2 de la V-ATPasa A de los lepidópteros Plásmido Especies de insectos SEQ ID NO: plC17088 Spodoptera frugiperda SEQ ID NO:145 plC17101 Agrofís Ípsilon SEQ ID NO:146 pIC17102 Helicoverpa zea SEQ ID NO: 147 plC17103 Ostrinia nubilalis SEQ ID NO:148 Las secuencias ortólogas a la V-ATPasa A en los plásmidos plC17088, plC17 01 , plC 7102, se amplificaron utilizando los cebadores pr555 (SEQ ID NO:164) y pr556 (SEQ ID NO:165), diseñados para generar fragmentos de ADN con promotores de la polimerasa T7 flanqueantes y opuestos para la síntesis de ARNds in vitro. Los ARN de doble hebra (ARNds) para las secuencias ortólogas FAW, BCW y CEW se sintetizaron de esas plantillas de ADN amplificado, utilizando el equipo MEGAscript™ de Ambion (# de Catálogo 1626) y ios procedimientos recomendados (Ambion Inc., Austin, TX), y se presentaron para los bioensayos en los insectos a 10 ppm. Para estos ensayos, se preparó una dieta artificial para lepidópteros (165 g/L de Dieta para Especies Múltiples Southland, 14.48 g/L de agar), y se distribuyó en charolas de 128 pozos, 500 ul por pozo. Las muestras se distribuyeron sobre la dieta y se colocaron en una cámara "secadora" a 27°C y 35% de humedad, en donde el exceso de agua se evaporó. Una vez seco, cada pozo se infestó con una sola larva neonata y se selló con un sello perforado de mylar. Las charolas se incubaron durante seis a ocho días a 27°C. Los insectos control no tratados habían terminado toda la dieta en sus pozos respectivos a los seis a ocho días. Se prepararon charolas con cincuenta pozos con 4 mi de dieta artificial por pozo, y todos los insectos que estaban en o cerca de la terminación de la dieta antes de que concluyera el ensayo, se transfirieron a las nuevas charolas. Estas charolas se sellaron y se regresaron a la incubadora, y a continuación, todos los bioensayos se evaluaron después de un total de diez a doce días. Los resultados de estos bioensayos para las especies de insectos lepidópteros no indican un efecto significativo en la mortalidad o la ganancia de la masa de la larva en comparación con la verificación no tratada (comparaciones para todos los pares utilizando HSD de Tukey-Kramer), y utilizando este régimen de ensayo, se ha observado. Los efectos en la mortalidad o la ganancia de masa de las larvas tampoco se observaron en los bioensayos que utilizan las combinaciones de ARNds y cantidades subletales de proteínas insecticidas BT que forman poros conocidas de experimentos previos por ser tóxicas para estas plagas de lepidópteros.

EJEMPLO 8 Este ejemplo ¡lustra un bioensayo para determinar la toxicidad oral del ARNds hacia las larvas del gorgojo de la vaina del algodón, Anthonomus grandis. El ARN total se aisló de las larvas del gorgojo de la vaina del algodón (BWV), Anthonomus grandis, utilizando el equipo m/rVana de Ambion (# de Catálogo 1560) y los procedimientos recomendados (Ambion Inc., Austin, TX). Las larvas de BWV que ocupan aproximadamente un volumen de 200 pL en un tubo de microcentrífuga se utilizaron para cada preparación. Se utilizaron cinco microgramos del ARN total para preparar el ADNc utilizando el sistema de RT-PCR Thermoscript™ de Invitrogen (# de Catálogo 11146) y los procedimientos recomendados para la síntesis del ADNc mediado por el cebador aleatorio (Invitrogen, Carlsbad, CA). Este ADNc se utilizó como una plantilla para la amplificación de las secuencias ortólogas de la subunidad 2 de la V-ATPasa A utilizando la ADN polimerasa Taq y los cebadores oligonucleotídicos pr550 (SEQ ID NO:160) y pr552 (SEQ ID NO:161 ). Estos cebadores se diseñaron alineando las secuencias nucleotídicas para los ortólogos de V-ATPasa A más cercanos de Manduca sexta, Aedes aegypti, Drosophila melanogaster y Diabrotica virgifera (WCR), y seleccionando las regiones de degeneración mínima. El cebador pr550 corresponde a los nucleótidos 230-252 en la secuencia del gen de M. sexta mientras que el cebador pr552 que corresponde a los nucleótidos 1354-1331 en la secuencia del gen de M. sexta. La amplificación se logró utilizando un procedimiento de amplificación por contacto con los parámetros del ciclo como se describe en el Ejemplo 6. El fragmento de ADN de aproximadamente .2 kb amplificado del ADNc se clonó en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen), y el inserto se secuenció para la confirmación. La secuencia ortóloga de la V-ATPasa A (SEQ ID NO:149) se amplificó utilizando los cebadores pr568 (SEQ ID NO:162) y pr569 (SEQ ID NO:163), diseñados como cebadores "universales" para generar las plantillas de ADN con las secuencias del promotor de la polimerasa T7 flanqueante de las clonas de pCR2.1-TOPO. Los ARN de doble hebra (ARNds) se sintetizaron de esta plantilla de ADN amplificado utilizando el equipo MEGAscript™ de Ambion (# de Catálogo 1626) y los procedimientos recomendados (Ambion Inc., Austin, TX) y se presentaron para el bioensayo de los insectos. Para los bioensayos del gorgojo de la vaina, Anthonomus grandis Boheman, se utilizó una dieta artificial para insecto basada en agar (Bioserv™ - F9247B; Gast y Davich, 1966) por las instrucciones de los fabricantes. Aproximadamente 200 ul de la dieta fundida se distribuyeron en placas de microtítulo de 96 pozos y se dejaron enfriar y solidificar. Una muestra (20 ul) que contiene aproximadamente 10 ppm de ARNds que corresponde a la secuencia ortóloga de V-ATPasa A (SEQ ID NO: 149), se superpuso entonces en la dieta y se dejo secar. Los huevos del insecto (0-14) en 25 ul de agar al 0.1 % se distribuyeron a continuación en la dieta. Las placas se sellaron a continuación con sellos perforados (Zymark #72281 ). El ensayo se incubó a 27°C durante diez a doce días y se calificó para la actividad mediante la determinación de acumulación de polvillo. No se observaron efectos en la mortalidad o la ganancia de masa de las larvas, pero esto puede ser un resultado de la fisiología de alimentación particular del gorgojo de la vaina. El esconderse en la dieta puede disminuir de manera significativa la dosis de ARNds ingerido y por lo tanto reducir de manera significativa cualesquier efectos que de otra manera se observarían con una fisiología de alimentación en la superficie. La incorporación del ARNds en la dieta de una manera uniforme, probablemente lograría una mortalidad significativa y una ganancia de la masa reducida. Otras secuencias del gen objetivo del gorgojo de la vaina pueden clonarse y utilizarse como plantillas para la síntesis in vitro de los ARNds que pueden probarse entonces en un bioensayo con insectos para valorar su eficacia. Por ejemplo, el gen de la proteína ribosomal L19 (rpl19) puede utilizarse como una plantilla para la síntesis del ARNds. Las secuencias nucleotídicas para los ortólogos de rpl19 de Bombyx morí (SEQ ID NO: 154), Drosophila melanogaster (SEQ ID NO: 155), Anopholes gambiae (SEQ ID NO:156) y Diabrotica virgifera (SEQ ID NO:157), se alinearon y las regiones de consenso de degeneración mínima se identificaron con el propósito de diseñar los cebadores oligonucleotídicos degenerados. Los cebadores pr574 (SEQ ID NO:166) y pr577 (SEQ ID NO:168), o los cebadores pr575 (SEQ ID NO:167) y pr577 (SEQ ID NO:168), pueden utilizarse para amplificar las secuencias ortólogas rpl19 putativas de muchas especies diferentes de insectos. La amplificación se logra utilizando un procedimiento de amplificación por contacto con los parámetros del ciclo como se describió en el Ejemplo 6. El fragmento de ADN de aproximadamente 0.4 kb amplificado del ADNc del gorgojo de la vaina se clonó en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen), y el inserto se secuenció para la confirmación. La secuencia ortóloga rpl19 (SEQ ID NO:158) se amplificó utilizando los cebadores pr568 (SEQ ID NO:162) y pr569 (SEQ ID NO:163), diseñados como cebadores "universales", para generar las plantillas de ADN con las secuencias del promotor de la polimerasa T7 flanqueante de las clonas de pCR2.1-TOPO.

EJEMPLO 9 Este ejemplo ilustra un bioensayo para determinar la toxicidad oral de los ARNds hacia las larvas del escarabajo rojo de la harina, Tribolium castaneum. Algunas plagas de insectos son comercialmente importantes debido a que infestan los productos de mercancías y los materiales procesados producidos de una cosecha particular. Una de tales plagas particulares es el escarabajo rojo de la harina. La presencia de una o más especies de ARNds específico para la inhibición de uno o más genes en tales plagas en el producto de las mercancías y los materiales procesados producidos de una cosecha particular, sería útil para controlar tal infestación de la plaga. El ARN total se aisló de las larvas del escarabajo rojo de la harina (RFB), Tríbolium castaneum, utilizando el equipo mirVana de Ambion (# de Catálogo 1560) y los procedimientos recomendados (Ambion Inc., Austin, TX). Las larvas de RFB que ocupan aproximadamente un volumen de 200 uL en un tubo de microcentrífuga se utilizaron para cada preparación. Se utilizaron cinco microgramos del ARN total para preparar el ADNc utilizando el sistema de RT-PCR Thermoscript™ de Invitrogen (# de Catálogo 11 46) y los procedimientos recomendados para la síntesis del ADNc mediada por el cebador aleatorio (Invitrogen, Carlsbad, CA). Este ADNc se utilizó como una plantilla para la amplificación de las secuencias ortólogas de la subunidad 2 de la V-ATPasa A utilizando la ADN polimerasa Taq y los cebadores oligonucleotídicos pr550 (SEQ ID NO:160) y pr552 (SEQ ID NO:161 ). Estos cebadores se diseñaron alineando las secuencias nucleotídicas para los ortólogos de V-ATPasa A más cercanos de Manduca sexta, Aedes aegypti, Drosophila melanogaster y Diabrotica virgifera (WCR), y seleccionando las regiones de degeneración mínima. El cebador pr550 corresponde a los nucleótidos 230-252 en la secuencia del gen de M. sexta mientras que el cebador pr552 que corresponde a los nucleótidos 354-1331 en la secuencia del gen de M. sexta.

La amplificación se logró utilizando un procedimiento de amplificación por contacto con los parámetros del ciclo como se describe en el Ejemplo 6. El fragmento de ADN de aproximadamente 1.2 kb amplificado del ADNc se clonó en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen), y el inserto se secuenció para la confirmación. La secuencia ortóloga de la V-ATPasa A (SEQ ID NO:149) se amplificó utilizando los cebadores pr568 (SEQ ID NO:162) y pr569 (SEQ ID NO:163), diseñados como cebadores "universales" para generar las plantillas de ADN con las secuencias del promotor de la polimerasa T7 flanqueante de las clonas de pCR2.1-TOPO. Los ARN de doble hebra (ARNds) se sintetizaron de esta plantilla de ADN amplificado utilizando el equipo MEGAscript™ de Ambion (# de Catálogo 1626) y los procedimientos recomendados (Ambion Inc., Austin, TX) y se presentaron para el bioensayo de los insectos. La harina de trigo se mezcla de manera uniforme con agua y el ARNds que corresponde a la secuencia ortóloga de la V-ATPasa A (SEQ ID NO: 150) y se deja secar. La composición se utiliza como un sustrato para el bioensayo junto con la larva del escarabajo rojo de la harina. Se observan efectos insecticidas después de varios días de incubación extrayendo las larvas del gorgojo de la mezcla de harina/ARNds. Otras secuencias del gen objetivo del escarabajo rojo de la harina pueden clonarse y utilizarse como plantillas para la síntesis in vitro de los ARNds que pueden probarse entonces en un bioensayo con insectos para valorar su eficacia. Por ejemplo, el gen de la proteína ribosomal L19 (rp/79) puede utilizarse como una plantilla para la síntesis del ARNds. Las secuencias nucleotídicas para los ortólogos de rpl19 de Bombyx morí, Drosophila melanogaster, Anopholes gambiae y Diabrotica virgifera, se alinearon y las regiones de consenso de degeneración mínima se identificaron con el propósito de diseñar los cebadores oíigonucleotídicos degenerados. Los cebadores pr574 (SEQ ID NO:166) y pr577 (SEQ ID NO:168), o los cebadores pr575 (SEQ ID NO:167) y pr577 (SEQ ID NO:168), pueden utilizarse para amplificar las secuencias ortólogas rpH 9 putativas de muchas especies diferentes de insectos. La amplificación se logra utilizando un procedimiento de amplificación por contacto con los parámetros del ciclo como se describió en el Ejemplo 6. El fragmento de ADN de aproximadamente 0.4 kb amplificado del ADNc del escarabajo rojo de la harina se clonó en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen), y el inserto se secuenció para la confirmación. La secuencia ortóloga de rpl19 (SEQ ID NO: 159), se amplificó utilizando los cebadores pr568 (SEQ ID NO:162) y pr569 (SEQ ID NO:163), diseñados como cebadores "universales", para generar las plantillas de ADN con las secuencias del promotor de la polimerasa T7 flanqueante de las clonas de pCR2.1 -TOPO.

EJEMPLO 10 Este ejemplo ilustra un bioensayo para determinar la toxicidad oral de los ARNds para los gusanos blancos y los ciempiés. El ARN total se aisló de las larvas de gusanos blancos de ciempiés, utilizando el equipo miA/ana de Ambion (# de Catálogo 1560) y los procedimientos recomendados (Ambion Inc., Austin, TX). Las larvas que ocupan aproximadamente un volumen de 200 uL en un tubo de microcentrífuga se utilizaron para cada preparación. Se utilizaron cinco microgramos del ARN total para preparar el ADNc utilizando el sistema de RT-PCR Thermoscript™ de Invitrogen (# de Catálogo 1146) y los procedimientos recomendados para la síntesis del ADNc mediada por el cebador aleatorio (Invitrogen, Carlsbad, CA). Este ADNc se utilizó como una plantilla para la amplificación de las secuencias ortólogas de la subunidad 2 de la V-ATPasa A utilizando la ADN polimerasa Taq y los cebadores oligonucleotídicos pr550 (SEQ ID NO:160) y pr552 (SEQ ID NO:161 ). Estos cebadores se diseñaron alineando las secuencias nucleotídicas para los ortólogos de V-ATPasa A más cercanos de Manduca sexta, Aedes aegypti, Drosophila melanogaster y Diabrotica virgifera (WCR), y seleccionando las regiones de degeneración mínima. El cebador pr550 corresponde a los nucleótidos 230-252 en la secuencia del gen de M. sexta mientras que el cebador pr552 que corresponde a los nucleótidos 1354-1331 en la secuencia del gen de M. sexta.

La amplificación se logró utilizando un procedimiento de amplificación por contacto con los parámetros del ciclo como se describe en el Ejemplo 6. El fragmento de ADN de aproximadamente 1.2 kb amplificado del ADNc se clonó en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen), y el inserto se secuenció para la confirmación. La secuencia ortóloga de la V-ATPasa A se amplificó utilizando los cebadores pr568 (SEQ ID NO:162) y pr569 (SEQ ID NO: 163), diseñados como cebadores "universales" para generar las plantillas de ADN con las secuencias del promotor de la polimerasa T7 flanqueante de las clonas de pCR2.1-TOPO. Los ARN de doble hebra (ARNds) se sintetizaron de esta plantilla de ADN amplificado utilizando el equipo MEGAscript™ de Ambion (# de Catálogo 1626) y los procedimientos recomendados (Ambion Inc., Austin, TX) y se presentaron para el bioensayo de los insectos. Los efectos de la toxicidad oral se observan después de varios días de bioensayo. Otras secuencias del gen objetivo de los gusanos blancos o los ciempiés pueden clonarse y utilizarse como plantillas para la síntesis in vitro de los ARNds que pueden probarse entonces en un bioensayo con insectos para valorar su eficacia. Por ejemplo, el gen de la proteína ribosomal L19 (rpl19) puede utilizarse como una plantilla para la síntesis del ARNds. Las secuencias nucleotídicas para los ortólogos de rpl19 de Bombyx morí, Drosophila melanogaster, Anopholes gambiae y Diabrotica virgifera, se alinearon y las regiones de consenso de degeneración mínima se identificaron con el propósito de diseñar los cebadores oligonucleotídicos degenerados.

Los cebadores pr574 (SEQ ID NO:166) y pr577 (SEQ ID ??. 68), o los cebadores pr575 (SEQ ID NO:167) y pr577 (SEQ ID NO:168), pueden utilizarse para amplificar las secuencias ortólogas rpl19 putativas de muchas especies diferentes de insectos. La amplificación se logra utilizando un procedimiento de amplificación por contacto con los parámetros del ciclo como se describió en el Ejemplo 7. El fragmento de ADN de aproximadamente 0.4 kb amplificado del ADNc se clonó en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen), y el inserto se secuenció para la confirmación. La secuencia ortóloga de rpl19, se amplificó utilizando los cebadores pr568 (SEQ ID NO:162) y pr569 (SEQ ID NO:163), diseñados como cebadores "universales", para generar las plantillas de ADN con las secuencias del promotor de la polimerasa T7 flanqueante de las clonas de pCR2.1 OPO.

EJEMPLO 11 Este ejemplo ¡lustra un bioensayo para determinar la toxicidad oral de los ARNds hacia las larvas del mosquito, Aedes aegypti. El ARN total se aisló de las larvas de Aedes aegypti, utilizando el equipo m/Wana de Ambion (# de Catálogo 1560) y los procedimientos recomendados (Ambion Inc., Austin, TX). Las larvas de Aedes aegypti que ocupan aproximadamente un volumen de 200 uL en un tubo de microcentrífuga se utilizaron para cada preparación. Se utilizaron cinco microgramos del ARN total para preparar el ADNc utilizando el sistema de RT-PCR Thermoscript™ de Invitrogen (# de Catálogo 11146) y los procedimientos recomendados para la síntesis del ADNc mediada por el cebador aleatorio (Invitrogen, Carlsbad, CA). Este ADNc se utilizó como una plantilla para la amplificación de las secuencias ortólogas de la subunidad 2 de la V-ATPasa A utilizando la ADN polimerasa Taq y los cebadores oligonucleotídicos pr550 (SEQ ID NO:160) y pr552 (SEQ ID NO:161 ). Estos cebadores se diseñaron alineando las secuencias nucleotídicas para los ortólogos de V-ATPasa A más cercanos de Manduca sexta, Aedes aegypti, Drosophila melanogaster y Dlabrotica virgifera (WCR), y seleccionando las regiones de degeneración mínima. El cebador pr550 corresponde a los nucleótidos 230-252 en la secuencia del gen de M. sexta mientras que el cebador pr552 que corresponde a los nucleótidos 1354-1331 en la secuencia del gen de M. sexta. La amplificación se logró utilizando un procedimiento de amplificación por contacto con los parámetros del ciclo como se describe en el Ejemplo 7. El fragmento de ADN de aproximadamente 1.2 kb amplificado del ADNc se clonó en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen), y el inserto se secuenció para la confirmación. La secuencia ortóloga de la V-ATPasa A se amplificó utilizando los cebadores pr568 (SEQ ID NO:162) y pr569 (SEQ ID NO: 163), diseñados como cebadores "universales" para generar las plantillas de ADN con las secuencias del promotor de la polimerasa T7 flanqueante de las clonas de pCR2.1-TOPO.

Los ARN de doble hebra (ARNds) se sintetizaron de esta plantilla de ADN amplificado utilizando el equipo MEGAscript™ de Ambion (# de Catálogo 1626) y los procedimientos recomendados (Ambion Inc., Austin, TX) y se presentaron para el bioensayo de los insectos. Los efectos en las larvas del insecto se observan después de varios días de bioensayo. Otras secuencias del gen objetivo de los mosquitos pueden clonarse y utilizarse como plantillas para la síntesis in vitro de los ARNds que pueden probarse entonces en un bioensayo con insectos para valorar su eficacia. Por ejemplo, el gen de la proteína ribosomal L19 (rpl19) puede utilizarse como una plantilla para la síntesis del ARNds. Las secuencias nucleotídicas para los ortólogos de rpl19 de Bombyx morí, Drosophila melanogaster, Anopholes gambiae y Diabrotica virgifera, se alinearon y las regiones de consenso de degeneración mínima se identificaron con el propósito de diseñar los cebadores oligonucleotídicos degenerados. Los cebadores pr574 y pr577, o los cebadores pr575 y pr577, pueden utilizarse para amplificar las secuencias ortólogas rpl19 putativas de muchas especies diferentes de insectos. La amplificación se logra utilizando un procedimiento de amplificación por contacto con los parámetros del ciclo como se describió en el Ejemplo 7. El fragmento de ADN de aproximadamente 0.4 kb amplificado del ADNc se clonó en el vector pCR2.1-TOPO (]nvitrogen), y el inserto se secuenció para la confirmación. La secuencia ortóloga de rpl19, se amplificó utilizando los cebadores pr568 (SEQ ID NO:162) y pr569 (SEQ ID NO: 63), diseñados como cebadores "universales", para generar las plantillas de ADN con las secuencias del promotor de la polimerasa T7 flanqueante de las clonas de pCR2.1-TOPO. Los ARN de doble hebra (ARNds) se sintetizaron de esta plantilla de ADN amplificado utilizando el equipo MEGAscript™ de Ambion (# de Catálogo 1626) y los procedimientos recomendados (Ambion Inc., Austin, TX) y se presentaron para el bioensayo de los insectos. Otras especies de mosquitos están contempladas dentro del alcance de esta invención. Las secuencias del gen objetivo adecuadas de Aedes, Culex y Anopholes pueden amplificarse utilizando cebadores oligonucleotídicos apropiados, clonados en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen), y el inserto se secuenció para la confirmación. Las secuencias objetivo clonadas se amplifican utilizando los cebadores pr568 (SEQ ID NO: 162) y pr569 (SEQ ID NO: 163), diseñados como cebadores "universales", para generar las plantillas de ADN con las secuencias del promotor de la polimerasa T7 flanqueante de las clonas de pCR2.1-TOPO. Los ARN de doble hebra (ARNds) se sintetizaron de esta plantilla de ADN amplificado utilizando el equipo MEGAscript™ de Ambion (# de Catálogo 1626) y los procedimientos recomendados (Ambion Inc., Austin, TX) y se presentaron para el bioensayo de los insectos.

EJEMPLO 12 Este ejemplo ilustra como el ARNds hecho de la región 3'UTR de la V-ATPasa mostró la desregulación del objetivo. Los segmentos (aproximadamente 300 pb de ARNds) de la 3' UTR de V-ATPasa de WCR se han puesto en un bioensayo de WCR, y fallaron en mostrar atrofia y mortalidad dentro de un periodo de bioensayo de 12 días. Los segmentos de tamaño comparable dentro de la región codificante de la V-ATPasa muestran una atrofia y mortalidad significativa a una gama de concentraciones. Los Northern blots que examinan el ARN total extraído de las larvas de WCR alimentadas durante 4 días con el segmento 3' UTR de la V-ATPasa (y sondeados con una sonda de la región codificante), mostraron una declinación significativa en el ARNm objetivo de la V-ATPasa con relación a las larvas del control no tratado (resumido NBP#7497215). Sin embargo, el mensaje detectable permaneció, indicando una anulación menos efectiva del objetivo con el segmento de ARNds de 3' UTR (vs utilizando un segmento de la región codificante) y/o la contribución de un segundo gen de V-ATPasa putativo que tiene una 3' UTR significativamente divergente del gen de V-ATPasa primario. Los datos del Southern blot en WCR son consistentes con más de una secuencia del gen hibridante dentro del genoma, pero el examen de las EST y una PCR de familia limitada, no han demostrado aún que un segundo gen putativo se transcribe.

Es importante mencionar que aunque es crítico determinar el potencial para atrofiar y matar las larvas, simplemente al verificar la expresión de un gen objetivo mediante Northern blot o PCR cuantitativa, puede también encontrar objetivos propicios para las estrategias del ARNi. Los resultados anteriores más otros experimentos con northern buscando el objetivo de V-ATPasa, han mostrado que el efecto del ARN en la abundancia del transcripto es discemible en insectos en el transcurso de horas de la presentación del ARNds.

EJEMPL0 13 Este ejemplo ¡lustra un procedimiento para implementar la supresión del gen de la plaga del insecto utilizando un método de silenciamiento mediado por ARNta-si. Un método alterno para silenciar los genes en una plaga de plantas utiliza la plaga recientemente descubierta de ARN interfiriente pequeño transactuante (ARNta-si) (Dalmay et al., Cell 101 :543-553, 2000; Mourrain et al., Cell 101 :533-542, 2000; Peragine et al, Genes and Development, 18:2368-2379, 2004; Vázquez et al, Mol Cell 16(1 ):69-79, 2004; Yu et al., Mol Plant Microbe Interact 16:206-216, 2003). El ARNta-si se deriva de transcriptos de ARN de una sola hebra que son seleccionados por el ARNmi natural dentro de la célula. Los métodos para utilizar el micro ARN para desencadenar el ARNta-si para el silenciamiento de genes en plantas, se describe en la Solicitud de Patente Provisional de E.U.A. No. de Serie 60/643,136 (Carrington et al. 2004), incorporada en la presente como referencia en su totalidad. Al menos un ARNmi específico de la plaga expresado en las células epiteliales del intestino de las larvas del gusano de la raíz del maíz se identifica. Este ARNmi específico de la plaga se utiliza a continuación para identificar al menos una secuencia del transcripto de ARN objetivo complementaria al ARNmi que expresa en la célula. La secuencia objetivo correspondiente es una secuencia corta de no más de 21 nucleotidos contiguos que, cuando es parte de un transcripto de ARN y se pone en contacto con su ARNmi correspondiente en un tipo celular con una trayectoria de ARNi funcional, conduce a una escisión mediada por un amplificador. Una vez que las secuencias objetivo de ARNmi se identifican, al menos una secuencia objetivo de ARNmi se fusiona a una segunda secuencia que corresponde a parte de un gen de la plaga que se va a silenciar utilizando este método. Por ejemplo, las secuencias objetivo de ARNmi se fusionan a las secuencias del gen de la ATPasa vacuolar (V-ATPasa) del gusano de la raíz del maíz. La secuencia objetivo de ARNmi puede colocarse en el extremo 5', el extremo 3', o incluirse a la mitad del gen de la V-ATPasa. Puede ser preferible utilizar múltiples secuencias objetivo de ARNmi que corresponden a múltiples genes de ARNmi, o utilizar la misma secuencia objetivo de ARNmi múltiples veces en la quimera de la secuencia objetivo de ARNmi y la secuencia de la V-ATPasa. La secuencia de la V-ATPasa puede ser de cualquier longitud, con un mínimo de 21 pb.

La quimera de la secuencia objetivo de ARNmi y la secuencia de V-ATPasa se expresa en células de planta utilizando cualquier número de elementos promotores apropiados y otros elementos regulatorios de la transcripción, siempre que la transcripción ocurra en tipos de células que se proporcionan en la dieta de la plaga, por ejemplo, las raíces del maíz para el control del gusano de la raíz del maíz. Este método puede tener la ventaja adicional de suministrar moléculas de ARN más largas a la plaga objetivo. Típicamente, los ARNds producidos en las plantas se procesan rápidamente por Dicer en ARN más corto que no puede ser efectivo cuando se alimenta de manera exógena a algunas plagas. En este método, se produce un transcripto con una sola hebra en la célula de la planta, captada por la plaga, y se convierte en un ARNds en la célula de la plaga, en donde se procesa en un ARNta-s¡ capaz de silenciar postranscrípcionalmente uno o más genes en una o más de las plagas objetivo.

EJEMPLO 14 Este ejemplo ilustra la comparación de las secuencias de ADNc de CRW con las secuencias de fuentes diferentes a CRW y la identificación de (1) secuencias en común con aquellas secuencias de otras fuentes y (2) secuencias que son únicas a CRW. Las secuencias de ADNc que se conservan entre dos organismos son candidatos potenciales de ARNi que pueden utilizarse para seleccionar la expresión del gen y la función de ambos organismos. De manera alterna, puede ser deseable seleccionar secuencias para la supresión del gen de CRW para el cual no está presente una secuencia homologa conocida en (a) otros organismos de plagas, (b) organismos que no son objetivo, y (c) el genoma de la planta seleccionado para transformación con la secuencia de la supresión de CRW. Seis secuencias de ADNc de CRW se seleccionaron para la comparación con las secuencias de otras fuentes. Las secuencias específicas incluyeron secuencias que codifican la alfa-tubulina, la beta-tubulina, CHD3, la subunidad de la bomba E del protón vacuolar, la subunidad de la V-ATPasa A y las proteínas roscadas. Las secuencias nucleotídicas son como se expone en la SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101 , SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, respectivamente. Las secuencias de ADNc de CRW se compararon con todos los ADNc públicos de varios organismos de GenBank utilizando el programa NCBI megablast (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990), los parámetros de búsqueda son como sigue: -W21 -b50 -v50 que requieren al menos una coincidencia perfecta de 21 meros y retienen únicamente las 50 mejores coincidencias y alineaciones. Los resultados se filtraron para incluir sólo organismos en el orden Insecta, y la abeja (Apis mellifera) se excluyó. Aunque el análisis se hizo únicamente en las seis secuencias de ADNc de CRW, el mismo procedimiento puede aplicarse a todo el ADNc o las secuencias unigene en CRW o en otros organismos de interés sin carga o experimentación indebida. Utilizando las seis secuencias de ADNc de CRW, se identificaron un total de 145 coincidencias de 20 distintos organismos de insecto. Estos incluyeron varias especies de plagas, tales como el áfido de los chícharos (Acyrthosiphon pisum), saltarillas Asiáticas de los cítricos {Diaphorina citrí) y piojo humano (Pediculus humanus). Los resultados se presentan en el Cuadro 4 siguiente con las coordenadas de coincidencia en la secuencia de consulta y el éxito, porcentaje de identidad de la correspondencia y las especies de los insectos de los cuales se deriva la secuencia exitosa. Por ejemplo, un segmento de la posición del nucleotido 844 a 1528 en la SEQ ID NO:98, se identificó como sustancialmente idéntico a un segmento de la posición del nucleotido 812 a 128 de la secuencia de GenBank número de acceso Gl:47521748 derivada del áfido del chícharo (Acyrthosiphon pisum). Estas dos secuencias comparten aproximadamente 85% de identidad.

CUADRO 4 Secuencias Ungen de CRW y Homólogos de la Secuencia Nucleotídica de Insectos SEQ ID Posición de la ID del Gen Posición de la % de Especies del género13 NO1 Identidad2 Identidad4 Identidad5 98 171-1529 Gl:14279671 89-1447 83% Chironomus tentans 98 175-938 Gl:60297223 69-832 88% Diaprepes abbreviatus 98 171-779 G 1:49394745 79-687 89% Drosophila melanogaster 98 769-1528 G 1:47537494 827-68 85% Acyrthosiphon pisum 98 529-1339 Gl:55814359 56-865 85% Acyrthosiphon pisum 98 729-1469 Gl:46995994 1-741 85% Acyrthosiphon pisum 98 171-740 Gl:49395093 79-652 88% Drosophila melanogaster 98 166-903 Gl:60297353 68-804 85% Diaprepes abbreviatus 98 171-875 Gl:37593891 66-769 85% Pediculus humanus 98 844-1528 Gl:47521748 812-128 85% Acyrthosiphon pisum 98 351 -1255 Gl:55798571 1-903 83% Acyrthosiphon pisum 98 862-1528 Gl:55815587 8-674 86% Acyrthosiphon pisum 98 415-1520 Gl:19773419 309-1414 81 % Bombyx morí 98 171-296 Gl:19773419 65-190 88% Bombyx mori 98 415-1520 Gl:608680 309-1414 81 % Bombyx mori 98 171-296 Gl:608680 65-190 88% Bombyx mori 98 738-1434 Gl:55811699 1 -697 85% Acyrthosiphon pisum 98 171 -899 Gl:37593910 70-799 85% Pediculus humanus 98 171-1029 Gl:55799535 53-91 83% Acyrthosiphon pisum 98 817-1492 Gl:35508998 7-681 85% Acyrthosiphon pisum 98 171-845 Gl:25959177 50-724 85% Meladema coriácea SEQ ID Posición de la ID del Gena Posición de la % de Especies del género*3 NO1 Identidad2 Identidad4 Identidad5 98 862-1528 Gl:55803725 726-60 85% Acyrthosiphon pisum 98 171-695 G 1:49394718 79-603 88% Drosophila melanogaster 98 838-1528 Gl:55813912 827-137 85% Acyrthosiphon pisum 98 171-692 G 1:49395499 54-575 88% Drosophila melanogaster 98 171-1025 G 1:46997250 92-945 83% Acyrthosiphon pisum 98 171 -1022 G 1:47533429 4-855 83% Acyrthosiphon pisum 98 171-998 Gl:34788002 122-949 83% Callosobruchus maculatus 98 171-839 Gl:25959137 50-717 85% Meladema coriácea 98 171-677 Gl:49395221 84-590 88% Drosophila melanogaster 98 171-809 Gl:25959136 50-688 86% Meladema coriácea 98 171-816 Gl:37593801 66-712 85% Pediculus humanus 98 171-816 G 1:37593472 67-712 85% Pediculus humanus 98 171-848 Gl:25959229 47-724 85% Meladema coriácea 98 171-677 G 1:49395496 75-581 88% Drosophila melanogaster 98 171-659 Gl:49395250 83-571 89% Drosophila melanogaster 98 171 -1029 Gl:46997155 98-953 83% Acyrthosiphon pisum 98 904-1528 Gl:47519891 752-128 86% Acyrthosiphon pisum 98 199-1061 Gl:55813341 8-870 83% Acyrthosiphon pisum 98 760-1430 Gl:60298750 9-679 85% Diaphorina citri 98 171-998 Gl:46997667 106-933 83% Acyrthosiphon pisum 98 171-785 Gl:25959104 69-684 85% Meladema coriácea 98 922-1528 Gl:25959369 697-91 86% Meladema coriácea 98 922-1528 Gl:25959412 698-92 86% Meladema coriácea 98 171-772 Gl:25959233 68-669 86% Meladema coriácea 98 171-677 GI:49395121 74-582 88% Drosophila melanogaster 98 199-1029 Gl:47534273 1-830 83% Acyrthosiphon pisum SEQ ID Posición de la ID del Gen Posición de la % de Especies del género" NO1 Identidad2 Identidad4 Identidad5 99 90-1385 Gl:34787982 56-1351 83% Callosobruchus maculatus 99 74-797 Gl :25958562 14-739 88% Curculio glandium 99 572-1374 Gl:60297081 25-827 86% Diaprepes abbreviatus 99 100-1425 Gl:19773425 91-1416 81 % Bombyx mori 99 100-1425 Gl:2073100 1 1 1-1436 81 % Bombyx mori 99 55-738 GL60297565 7-684 87% Diaprepes abbreviatus 99 131-1425 Gl:39842328 28-1322 81 % Laodelphax striatellus 99 688-1449 Gl:60298019 9-770 85% Diaprepes abbreviatus 99 61 -606 Gl:49394901 10-557 87% Drosophila melanogaster 99 61 -605 Gl:49395418 12-558 87% Drosophila melanogaster 99 100-1008 Gl:2613140 68-976 81 % Manduca sexta 99 1064-1416 Gl:2613140 1032-1384 83% Manduca sexta 99 61-573 Gl:49395445 15-528 87% Drosophila melanogaster 99 40-582 G 1:49395 89 4-551 86% Drosophila melanogaster 99 104-918 Gl:47518537 27-841 82% Acyrthosiphon pisum 99 104-784 GL25959017 39-719 83% Meladema coriácea 99 104-879 Gl:47538212 85-860 82% Acyrthosiphon pisum 99 104-852 Gl:47520002 32-780 82% Acyrthosiphon pisum 99 104-789 Gl:47519819 118-803 83% Acyrthosiphon pisum 99 104-789 Gl:47532797 106-791 83% Acyrthosiphon pisum 99 100-708 Gl:53910346 73-681 84% Heliconius erato petiverana 99 100-880 Gl:6902132 54-834 82% Bombyx mori 99 104-789 Gl:46999310 91-777 83% Acyrthosiphon pisum 101 113-263 Gl:41578101 124-274 90% Culicoides sonorensis 101 113-263 GL41577171 65-215 90% Culicoides sonorensis SEQ ID Posición de la ID del Gen* Posición de la % de Especies del género6 NO1 Identidad2 Identidad4 Identidad5 101 113-308 Gl: 5466250 140-335 86% Drosophila meianogaster 101 113-308 Gl:15530478 140-335 85% Drosophila meianogaster 101 112-308 Gl:15516090 140-336 85% Drosophila meianogaster 101 113-308 G 1:49393479 52-247 85% Drosophila meianogaster 101 113-263 Gl:41577256 99-249 88% Culicoides sonorensis 101 113-308 Gl:41403307 84-279 85% Drosophila meianogaster 101 113-308 Gl:41402978 79-274 85% Drosophila meianogaster 101 113-308 Gl:41401487 82-277 85% Drosophila meianogaster 101 113-308 Gl:38628155 176-371 85% Drosophila meianogaster 101 118-293 Gl:16901350 70-245 87% Ctenocephalides feiis 101 118-293 GM6900951 78-253 87% Ctenocephalides felis 101 113-308 Gl:14708726 170-365 85% Drosophila meianogaster 101 1 3-308 Gl:14707923 171-366 85% Drosophila meianogaster 101 113-308 Gl:14708035 139-334 85% Drosophila meianogaster 101 113-308 Gl: 14705944 135-330 85% Drosophila meianogaster 101 113-308 Gl:14705959 95-290 85% Drosophila meianogaster 101 113-308 GM4705165 108-303 85% Drosophila meianogaster 101 1 3-308 Gl:14703451 150-345 85% Drosophila meianogaster 101 113-308 Gl:14703188 95-290 85% Drosophila meianogaster 101 1 3-308 Gl:14700853 108-303 85% Drosophila meianogaster 101 113-308 GM4700635 136-331 85% Drosophila meianogaster 101 113-308 Gl:14699645 95-290 85% Drosophila meianogaster 101 113-308 Gl:14697887 94-289 85% Drosophila meianogaster 101 113-308 GM4697103 136-331 85% Drosophila meianogaster 101 113-308 Gl:14696099 137-332 85% Drosophila meianogaster 101 113-308 Gl:14696107 136-331 85% Drosophila meianogaster 101 113-308 Gl: 14695238 95-290 85% Drosophila meianogaster SEQ ID Posición de !a ID del Gena Posición de la % de Especies del género*5 NO1 Identidad2 Identidad4 Identidad5 101 113-308 01 :14693081 133-328 85% Drosophila melanogaster 101 113-308 Gl:14691490 138-333 85% Drosophila melanogaster 102 694-1364 G 1:2454487 811-1481 84% Aedes aegypti 102 715-1220 Gl:22039978 3-507 86% Ctenocephalides felis 102 694-1175 G 1:4734043 166-647 85% Aedes aegypti 102 895-1286 Gl:16899106 3-393 87% Ctenocephalides felis 102 895-1286 Gl:16899780 6-395 87% Ctenocephalides felis 102 895-1286 Gl:16899721 6-396 86% Ctenocephalides felis 102 961-1286 Gl:22039013 8-333 87% Ctenocephalides felis 102 874-1327 G 1:33376955 30-483 83% Glossina morsitans morsitans 102 636-1136 Gl:46997165 360-859 81 % Acyrthosiphon pisum 102 874-1220 Gl:33376948 25-371 84% Glossina morsitans morsitans 102 943-1364 Gl:3514814 74-495 82% Drosophila melanogaster 102 943-1364 G 1:24583987 1055-1476 82% Drosophila melanogaster 102 694-884 Gl:24583987 806-996 82% Drosophila melanogaster 102 943-1364 Gl:24583985 967-1388 82% Drosophila melanogaster 02 694-884 G! :24583985 7 8-908 82% Drosophila melanogaster 102 943-1364 Gl:24583983 1052-1473 82% Drosophila melanogaster 102 694-884 Gl:24583983 803-993 82% Drosophila melanogaster 102 943-1364 Gl: 18467973 1049-1470 82% Drosophila melanogaster 102 694-884 Gl: 18467973 800-990 82% Drosophila melanogaster 102 943-1364 Gl: 19527546 1052-1473 82% Drosophila melanogaster 102 694-884 Gl: 19527546 803-993 82% Drosophila melanogaster 102 1045-1365 Gl:4734199 1-321 84% Aedes aegypti 102 943-1280 Gl:51961912 81-418 83% Drosophila simulans SEQ ID Posición de la ID del Gen3 Posición de la % de Especies del género*3 NO1 Identidad2 Identidad4 Identidad5 102 734-947 Gl:22039138 73-285 87% Ctenocephalides felis 102 959-1364 Gl:24583991 1081-1486 81 % Drosophila melanogaster 102 959-1364 Gl:18467977 1081-1486 81 % Drosophila melanogaster 102 943-1340 G!:21355198 994-1391 81 % Drosophila melanogaster 102 694-884 Gl:21355198 745-935 82% Drosophila melanogaster 102 959-1364 Gl:19528270 1021-1426 81 % Drosophila melanogaster 102 959-1364 Gl:18859618 951-1356 81 % Drosophila melanogaster 102 943-1340 Gl:1373432 994-1391 81 % Drosophila melanogaster 102 694-884 Gl: 1373432 745-935 82% Drosophila melanogaster 102 959-1364 Gl:5851682 1021-1426 81 % Drosophila melanogaster 102 142-345 Gl:22039875 163-366 87% Ctenocephalides felis 102 142-345 Gl:16901137 217-420 87% Ctenocephalides felis 102 82-595 GI:34787824 112-625 79% Callosobruchus maculatus 102 142-345 Gl:16901267 156-360 87% Ctenocephalides felis 102 771-1022 Gl:22005558 58-309 84% Aedes aegypti 102 96-357 Gl:46996282 118-379 83% Acyrthosiphon pisum 102 963-1364 Gl:18898890 1 1 -412 80% Anopheles gambiae 102 967-1364 GI:18936027 25-422 80% Anopheles gambiae 102 61-344 G 1:37952369 124-407 81 % Ips pini 103 1230-1251 Gl:33371240 247-268 100% Glossina morsitans morsitans 103 1230-1251 Gl:33374947 249-270 100% Glossina morsitans morsitans 1. SEQ ID NO de WCR como se expone en el listado de secuencias; 2. La posición del nucleótido en la SEQ ID NO en la columna 1 que exhibe identidad sustancial con la ID del Gen en la columna 3 3n la misma hilera; 3. Número de acceso del gen de la secuencia coincidente correspondiente identificada dentro de la base de datos pública, que exhibe identidad sustancial con la SEQ ID NO de la columna 1 ; 4. La posición del nucleótido de la secuencia identificada en la columna 3 que coincide con los nucleotidos de CEW especificados en la misma hilera; 5. Porcentaje de identidad entre la SEQ ID NO de WCR y la ID del Gen (comparación de la identidad entre las secuencias de la columna 2 y la columna 4 en una hilera dada); y 6. Género y especie del organismo del cual se derivó la secuencia del No. de Acceso del Gen.

EJEMPLO 15 Este ejemplo ¡lustra la identificación de los dominios funcionales de la proteína y las familias de genes predichos de la traducción de las secuencias nucleotídicas descritas en la presente, utilizando coincidencias de la secuencia con secuencias conocidas y modelos de consenso del dominio existentes. Las secuencias de la proteína se produjeron primero con un programa "traductor", que traduce los Unigenes en secuencias peptídicas a través de los siguientes pasos: homología con proteínas conocidas; predicción de la estructura del gen ab initio basada en el modelo y marco de lectura abierto (ORF) más largo. Los desplazamientos del marco debido a los errores de secuenciamiento se corrigieron. Las secuencias de proteínas de investigaron entonces contra la base de datos Pfam, una gran colección de alineaciones de secuencias múltiples y modelos de Markov ocultos (HMM) que cubren muchas familias de proteínas comunes (La Base de Datos de las Familias de Proteínas Pfam, Bateman et al, Nucleic Acids Research 32:D138-D141 , 2004). Los modelos HMM de proteínas se investigaron con el programa HMMPAM (Durbin et al., Biological Sequence Analysis: Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, 1998), con los rigores predeterminados. Se hizo un filtrado adicional para mantener sólo aquellas correspondencias con un valor de esperanza de 0.1 o más pequeño como coincidencia significativas. De las 20303 secuencias peptídicas del gusano de la raíz del maíz, 4199 (21 %) se identificaron con 1317 distintos dominios y familias de proteínas.

Los resultados del análisis se presentaron en los campos de características del archivo del listado de la secuencia con estos atributos: nombre Pfam, descripción Pfam y nivel de coincidencia con la calificación HMMPFAM, valor de esperanza (valor E) y número de copias del dominio en la secuencia peptídica.

EJEMPLO 16 Este ejemplo ¡lustra un método para proporcionar una secuencia de ADN para el silenciamiento del gen mediado por el ARNds. Más específicamente, este ejemplo describe la selección de un ADN mejorado útil en el silenciamiento del gen mediado por el ARNds mediante (a) seleccionar un gen objetivo una secuencia inicial de ADN que incluye más de 21 nucleótídos contiguos; (b) identificar al menos una secuencia de ADN más corta derivada de regiones de la secuencia de ADN inicial, que consiste de regiones predichas para no generar polipéptidos indeseables; y (c) seleccionar una secuencia de ADN para el silenciamiento del gen mediado por el ARNds, que incluye al menos una secuencia de ADN más corta. Los polipéptidos indeseables incluyen, de manera no exclusiva, polipéptidos homólogos a polipéptidos alergénicos y polipéptidos homólogos a toxinas polipeptídicas conocidas. La V-ATPasa de WCR ha demostrado funcionar en los ensayos de alimentación del gusano de la raíz del maíz para probar silenciamientos mediados por ARNds como un medio para controlar el crecimiento de la larva. Una secuencia de ADNc del gen de la ATPasa vacuolar (V-ATPasa) del gusano de la raíz del maíz Occidental (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) se seleccionó para utilizarse como una secuencia de ADN inicial (SEQ ID NO. 104). Esta secuencia de ADN inicial se seleccionó para las regiones dentro de las cuales cada fragmento contiguo que incluye al menos 21 nucleotidos, coincide con menos de 21 de 21 nucleotidos contiguos de las secuencias de vertebrados conocidas. Se identificaron tres segmentos de secuencias mayores que aproximadamente 100 nucleotidos contiguos que estaban libres de tales éxitos de 21/21 ; un primer segmento de la secuencia que corresponde a la posición del nucleótido 739-839, un segundo segmento de la secuencia que corresponde a la posición del nucleótido 849-987 y un tercer segmento de la secuencia que corresponde a la posición del nucleótido 998-1166 como se expone en la SEQ ID NO:104. Estos tres segmentos de la secuencia se combinaron para construir una secuencia de ADN quimérica (SEQ ID NO: 1 ) para utilizarse en el silenciamiento del gen mediado por el ARNds de la secuencia que codifica la V-ATPasa de CRW correspondiente. La nueva secuencia de ADN quimérica se probó en el bioensayo del CRW descrito anteriormente. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes publicadas mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente como referencia, como si cada publicación o patente individual se indicara de manera especial e individual como incorporada por referencia.

Claims (45)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un método para controlar la infestación de las plagas invertebradas, que comprende proporcionar en la dieta de una plaga invertebrada un agente que comprende un ácido ribonucleico que funciona tras la ingestión por la plaga para inhibir la expresión de una secuencia objetivo dentro de la plaga, en donde el ácido ribonucleico consiste de una secuencia ribonucleotídica que es o es complementaria a la secuencia objetivo, en donde la secuencia ribonucleotídica se transcribe de una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143, de la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID ??. 74, y los complementos de las mismas.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la plaga invertebrada se selecciona del grupo que consiste de una plaga de plantas y una plaga de animales, y en donde la plaga de la planta se selecciona del grupo que consiste de plagas de insectos, plagas de ácaros y plagas de nemátodos.

3.- Un ácido ribonucleico aislado que funciona cuando se proporciona en una dieta a una plaga invertebrada para el control de la infestación de las plagas invertebradas inhibiendo la expresión de una secuencia objetivo en la plaga, el ácido ribonucleico comprende una secuencia ribonucleotídica transcrita de una secuencia de ADN que es de aproximadamente 80 a aproximadamente 100% idéntica a una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143, de la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, y los complementos de las mismas.

4. - Un método para inhibir la expresión de una secuencia nucleotídica objetivo en una plaga de plantas, que comprende proporcionar en la dieta de una plaga un agente que, tras la ingestión por la plaga, inhibe la expresión de una secuencia nucleotídica en la plaga, el agente comprende un ácido ribonucleico expresado de una secuencia de ADN que es de aproximadamente 80 a aproximadamente 100% idéntica a una secuencia que codifica al nucleótido presente en la plaga, la secuencia que codifica el nucleótido se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143, de la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, y los complementos de las mismas.

5. - Una composición polinucleotídica para utilizarse en una célula de planta que comprende un cásete de expresión que comprende un promotor funcional de la planta enlazado de manera operable a un elemento de una secuencia nucleotídica que comprende de aproximadamente 50 a aproximadamente 5000 nucleótidos contiguos que exhiben de aproximadamente 80 a aproximadamente 100% de identidad de la secuencia con una secuencia que codifica el nucleótido seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143, de la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, y los complementos de las mismas, en donde la ingestión de la composición polinucleotídica por una plaga invertebrada de plantas inhibe una función biológica esencial en la plaga.

6. - Una célula de la planta que comprende la composición polinucleotídica de conformidad con la reivindicación 5, una planta regenerada de una célula de una planta, una progenie de una planta producida de la planta regenerada, caracterizada además porque la progenie de la planta comprende la composición polinucleotídica, y una semilla producida de la progenie de la planta, en donde la semilla comprende la composición polinucleotídica.

7. - Un agente para el control de los insectos, que comprende una secuencia ribonucleotídica producida de la expresión de una secuencia de ADN seleccionado del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143, de la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, y los complementos de las mismas, en donde la secuencia ribonucleotídica funciona cuando la ingestión por una plaga invertebrada inhibe la expresión de una secuencia nucleotídica sustancialmente complementaria a la secuencia de ADN.

8. - Un método para proteger una planta de una infestación de insectos, que comprende proporcionar en la dieta del insecto una o más células de la planta que expresan una molécula de ARN de una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143, de la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, y los complementos de las mismas, en donde la ingestión de una o más células por el insecto resulta en la inhibición de una función biológica en el insecto.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque las células de planta que expresan el ARN, comprenden un agente plaguicida seleccionado del grupo que consiste de una patatina, una proteína insecticida de Bacillus thuringiensis, una proteína insecticida de Xenorhabdus, una proteína insecticida de Photorhabdus, una proteína insecticida de Bacillus laterosporous, y una proteína insecticida de Bacillus sphearicus.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la proteína insecticida de Bacillus thuringiensis se selecciona del grupo que consiste de Cry1 , Cry3, TIC851 , CryET70, Cry22, una proteína insecticida binaria CryET33 y CryET34, una proteína insecticida binaria CryET80 y CryET76, una proteína insecticida binaria TIC100 y TIC101 , y una proteína insecticida binaria PS149B1.

11.- Un método para inhibir la expresión de un producto de un gen objetivo en una o más células de una plaga de insectos, que comprende proporcionar a una o más células una cantidad supresora del gen de una molécula de ARN en la dieta del insecto, en donde la molécula de ARN supresora del gen se produce de una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143, de la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, y los complementos de las mismas, la ingestión del ARN supresor del gen resulta en una disminución en el nivel del producto del gen objetivo en las células de la plaga de insectos.

12. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la secuencia de ADN se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:17, SEQ ID ??. 8, SEQ ID NO:31 , SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61 , SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81 , SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, y los complementos de las mismas.

13. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la secuencia de ADN se selecciona del grupo que consiste de 19-21 nucleótidos contiguos como se expone en la SEQ ID NO:17 y la SEQ ID NO:31.

14. - Un cásete de expresión, caracterizado además porque comprende una secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 3.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el gen objetivo codifica una proteína, la función predicha de la cual se selecciona del grupo de funciones que consiste de formación del músculo, formación de la hormona juvenil, regulación de la hormona juvenil, regulación y transporte iónico, síntesis de la enzima digestiva, mantenimiento del potencial de la membrana celular, biosíntesis de aminoácidos, degradación de aminoácidos, formación de esperma, síntesis de feromonas, detección de feromonas, formación de antenas, formación de alas, formación de patas, desarrollo y diferenciación, formación de huevos, maduración de la larva, formación de una enzima digestiva, síntesis de la hemolinfa, mantenimiento de la hemolinfa, neurotransmisión, división celular, metabolismo de la energía, respiración y apoptosis.

16. - El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque el insecto es Dlabrotica spp., se selecciona del grupo que consiste de Diabrotica virgifera, Dlabrotica barben y Dlabrotica undecimpunctata.

17. - Un método para controlar la infestación de las plagas invertebradas, que comprende proporcionar en la dieta de una plaga invertebrada un agente que comprende una primera secuencia ribonucleotídica que funciona tras la ingestión por la plaga para inhibir una función biológica dentro de la plaga, en donde la secuencia ribonucleotídica exhibe de aproximadamente 85 a aproximadamente 100% de identidad de la secuencia nucleotídica con una secuencia codificante derivada de la plaga y se híbrida a una segunda secuencia ribonucleotídica que es complementaria a la primera secuencia ribonucleotídica, y en donde la secuencia codificante derivada de la plaga se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143, de la SEQ ID NO. 69 hasta la SEQ ID NO:174, y los complementos de las mismas.

18. - Un método para controlar la infestación de las plagas invertebradas, que comprende proporcionar en la dieta de una plaga invertebrada un agente que comprende una primera secuencia ribonucleotídica que funciona tras la ingestión por la plaga para inhibir una función biológica dentro de la plaga, en donde la secuencia ribonucleotídica exhibe de aproximadamente 95 a aproximadamente 100% de identidad de la secuencia nucleotídica a lo largo de al menos de aproximadamente 14 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos con una secuencia codificante derivada de la plaga y se híbrida a una segunda secuencia ribonucleotídica que es complementaria a la primera secuencia ribonucleotídica, y en donde la secuencia codificante derivada de la plaga se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143, de la SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, y los complementos de las mismas.

19. - Una secuencia nucleotídica que codifica una molécula de ARN que, cuando se proporciona en una cantidad inhibidora de la plaga en la dieta de una plaga, inhibe a la plaga de la alimentación de la dieta que contiene la molécula de ARN, en donde la secuencia nucleotídica se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143, y la SEQ ID ??. 69 hasta la SEQ ID ??. 74, y los complementos de las mismas.

20. - La secuencia nucleotídica de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque la dieta se selecciona del grupo que consiste de una dieta artificial, una célula de planta, una pluralidad de células de planta, un tejido de planta, una raíz de una planta, una semilla de una planta y una planta crecida de una semilla de planta, en donde la dieta comprende una cantidad inhibidora de la plaga de una molécula de ARN.

21. - La secuencia nucleotídica de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque la secuencia comprende al menos aproximadamente 19 nucleótidos contiguos como se expone en la SEQ ID NO:97.

22. - La secuencia nucleotídica de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque los aproximadamente 19 nucleótidos contiguos se seleccionan de la posición del nucleótido 58 hasta aproximadamente el nucleótido 1010 como se expone en la SEQ ID NO:97.

23.- Un método para proteger una planta de la infestación de insectos, que comprende a) proporcionar en la dieta del insecto una célula de planta que expresa un ARN que suprime un gen en el insecto y realiza una función esencial para la supervivencia del insecto, la función se selecciona del grupo que consiste de la reducción en la alimentación por la plaga, reducción en la viabilidad de la plaga, apoptosis celular de la plaga, inhibición de la diferenciación y el desarrollo de la plaga o cualquier célula de la plaga, ausencia de o capacidad o deseo para la reproducción sexual disminuido por la plaga, formación de músculos, crispamiento de los músculos, contracción del músculo, formación de la hormona juvenil, regulación de la hormona juvenil, regulación y transporte iónico, mantenimiento del potencial de la membrana celular, biosíntesis de aminoácidos, degradación de aminoácidos, formación de esperma, síntesis de feromonas, detección de feromonas, formación de antenas, formación de alas, formación de patas, formación de huevos, maduración de las larvas, formación de la enzima digestiva, síntesis de hemolinfa, mantenimiento de hemolinfa, neurotransmisión, transición de estado de la larva, pupación, emergencia de la pupación, división celular, metabolismo de la energía, respiración, y cualquier componente de una estructura citoesquelética de las células eucarióticas; y b) cultivar una planta que comprende las células de la planta.

24.- Un método para mejorar el rendimiento de una cosecha producida de una planta de cosechas sometida a infestación de plagas de insectos, el método comprende los pasos de a) cultivar la planta de cosechas utilizando una semilla que comprende una o más moléculas de ARN que suprimen uno o más genes objetivo en una plaga de insectos que ha ingerido una porción de la planta de cosechas en su dieta, en donde uno o más de los genes objetivo realiza al menos una función esencial en la fisiología y el metabolismo del insecto, la función esencial se selecciona del grupo que consiste de alimentación por la plaga, viabilidad de la plaga, apoptosis celular de la plaga, diferenciación y desarrollo de la plaga o cualquier célula de la plaga, reproducción sexual por la plaga, formación de músculos, crispamiento de los músculos, contracción de los músculos, formación y/o reducción de la hormona juvenil, regulación de la hormona juvenil, regulación y transporte iónico, mantenimiento del potencial de la membrana celular, biosíntesis de aminoácidos, degradación de aminoácidos, formación de esperma, síntesis de feromonas, detección de feromonas, formación de antenas, formación de alas, formación de patas, formación de huevos, maduración de las larvas, formación de la enzima digestiva, síntesis de hemolinfa, mantenimiento de hemolinfa, neurotransmisión, transición de estado de la larva, pupación, emergencia de la pupación, división celular, metabolismo de la energía, respiración, síntesis y mantenimiento de la estructura citoesquelética, metabolismo nucleotídico, metabolismo del nitrógeno, uso del agua, retención del agua y percepción sensorial; y b) observar una mejora en el porcentaje de rendimiento de la planta de cosechas.

25.- Una mercancía o productos de mercancías producidos de la semilla producida de una planta transgénica, en donde la planta transgénica expresa un ARN de una o más secuencias nucleotídicas contiguas seleccionadas del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1 a la SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:169 a la SEQ ID NO:174, y los complementos de las mismas, y en donde una o más secuencias nucleotídicas son detectables dentro de la mercancía o los productos de mercancías.

26.- Una secuencia nucleotídica contigua de al menos aproximadamente 21 nucleótidos de longitud, seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID ??.?-143, y 169-174, expresada como una secuencia de ARN y proporcionada en la dieta de una plaga de insectos, en donde la ingestión de una cantidad inhibidora de la plaga de insectos de ARN inhibe a la plaga de alimentarse más de la dieta.

27. - Una célula de planta transformada con una secuencia nucleotídica contigua de al menos aproximadamente 21 nucleotidos de longitud, seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1- 43 y 169- 74, en donde la secuencia nucleotídica se expresa en la célula de la planta como un segmento de ARN proporcionado en la dieta de una plaga de insectos, en donde (a) la ingestión del ARN por la plaga de insectos resulta en la supresión de un gen que codifica una proteína expresada del gen, y (b) la ingestión de una cantidad inhibidora de la plaga de insectos de ARN, inhibe a la plaga de alimentarse más de la dieta.

28. - Un método para seleccionar una secuencia nucleotídica para la expresión de un ARN para utilizarse en la inhibición de la expresión de un gen en una célula de una plaga de insectos, que comprende los pasos de (a) aislar un ARNm de una plaga de una planta; (b) producir un ARN de toda o parte de una secuencia de ADNc derivada del ARNm; (c) proporcionar el ARN en la dieta de la plaga del insecto; (d) seleccionar el ARN que inhibe la expresión del gen en la plaga del insecto; and (e) seleccionar una secuencia nucleotídica que se híbrida al ARN del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1-143, 169-174, o el complemento de las mismas.

29. - Un método para controlar una plaga de insectos, que comprende proporcionar en la dieta de la plaga de insectos dos o más agentes insecticidas, tóxicos para la misma especie de insectos, en donde el primer agente insecticida comprende una molécula de ARN expresada de una secuencia de ADN, en donde la molécula de ARN inhibe una función biológica dentro de la plaga cuando se ingiere por la plaga, en donde una porción de la secuencia de ADN que consiste de al menos aproximadamente 21 nucleótidos contiguos, exhibe de aproximadamente 85% a aproximadamente 100% de identidad de la secuencia nucleotídica con una secuencia codificante derivada de la plaga, y en donde un segundo agente insecticida se proporciona junto con el primer agente insecticida en la dieta, en donde el segundo agente insecticida es diferente del primero.

30.- El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la plaga es un gusano de la raíz del maíz y una secuencia codificante derivada de la plaga se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1-143 y 169-174.

31.- Un método para controlar una infestación de plaga de coleópteros, que comprende proporcionar en la dieta de una plaga de coleópteros, un agente que comprende un ácido ribonucleico que funciona tras la ingestión por la plaga, para inhibir la expresión de una secuencia objetivo dentro de la plaga, en donde el ácido ribonucleico consiste de una secuencia ribonucleotídica que es o es complementaria con la secuencia objetivo, en donde la secuencia ribonucleotídica se transcribe de una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143, SEQ ID NO: 69 hasta la SEQ ID NO:174, y los complementos de las mismas.

32. - El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además la plaga de coleópteros se selecciona del grupo que consiste de una plaga de Leptinotarsa spp, una plaga de Tribolium spp, una plaga de Anthonomous spp, una plaga de Cyclocephala spp y una plaga de Polyphaga spp.

33. - El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque la plaga de Leptinotarsa spp es una plaga del gusano de la raíz del maíz, seleccionado del grupo que consiste de Diabrotica virgifera virgifera (Gusano de la Raíz del Maíz Occidental, WCR), Diabrotica barberi (Gusano de la Raíz del Maíz Norteño, NCR), Diabrotica virgifera zeae (Gusano de la Raíz del Maíz Mexicano, MCR), Diabrotica balteata (Gusano de la Raíz del Maíz Brasileño (BZR), Diabrotica viridiria (Gusano de la Raíz del Maíz Brasileño (BZR), Diabrorica speciosi (Gusano de la Raíz del Maíz Brasileño (BZR)), y Diabrotica undecimpunctata howardii (Gusano de la Raíz del Maíz Sureño, SCR).

34. - Un método para inhibir la expresión de una secuencia nucleotídica objetivo en una plaga de coleópteros de plantas, que comprende proporcionar en la dieta de la plaga un agente, que tras la ingestión por la plaga, inhibe la expresión de una secuencia nucleotídica en la plaga, el agente comprende un ácido ribonucleico expresado de una secuencia de ADN que es de aproximadamente 80 a aproximadamente 100% idéntica a una secuencia que codifica un nucleótido, presente en la plaga, la secuencia que codifica el nucleótido se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID ??. 43, SEQ ID NO. 69 hasta la SEQ ID NO:174, y los complementos de las mismas.

35. - Una composición polinucleotídica para utilizarse en una célula de planta, que comprende un cásete de expresión que comprende un promotor funcional de la planta enlazado de manera operable a un elemento de una secuencia nucleotídica que comprende de aproximadamente 50 a aproximadamente 5000 nucleótidos contiguos, que exhibe de aproximadamente 80 a aproximadamente 100% de identidad de la secuencia con una secuencia que codifica el nucleotido, seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO: 143, SEQ ID 140:169 hasta la SEQ ID NO:174, y los complementos de las mismas, en donde la ingestión de la composición polinucleotídica por una plaga de coleópteros de plantas inhibe una función biológica esencial en la plaga.

36. - Una célula de planta que comprende la composición polinucleotídica de conformidad con la reivindicación 35, una planta regenerada de la célula de la planta, una planta de progenie producida de la planta regenerada, en donde la planta de progenie comprende la composición polinucleotídica, y una semilla producida de la planta de progenie, en donde la semilla comprende la composición polinucleotídica.

37.- El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque la secuencia de ADN se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:31 , SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:60SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61 , SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:80, SEQ ID N0:81 , SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, y los complementos de las mismas.

38. - Un método para inhibir la expresión de un producto de un gen objetivo en una o más células de una plaga de insectos coleópteros, que comprende proporcionar a una o más células una cantidad supresora de un gen de una molécula de ARN en la dieta del insecto, en donde la molécula de ARN supresora del gen se produce de una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143, SEQ ID NO: 169 hasta la SEQ ID ??.? 74, y los complementos de las mismas, la ingestión del ARN supresor del gen resulta en una disminución en el nivel del producto del gen objetivo en la célula de la plaga de insectos.

39. - El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque la plaga de coleópteros se selecciona del grupo que consiste de una plaga de Leptinotarsa spp, una plaga de Tribolium spp, una plaga de Anthonomous spp, una plaga de Cyclocephala spp y una plaga de Polyphaga spp.

40. - El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque la plaga de Leptinotarsa spp es una plaga del gusano de la raíz del maíz, seleccionado del grupo que consiste de Diabrotica virgifera virgifera (Gusano de la Raíz del Maíz Occidental, WCR), Diabrotica barberi (Gusano de la Raíz del Maíz Norteño, NCR), Diabrotica virgifera zeae (Gusano de la Raíz del Maíz Mexicano, MCR), Diabrotica balteata (Gusano de la Raíz del Maíz Brasileño (BZR), Diabrotica viridula (Gusano de la Raíz del Maíz Brasileño (BZR), Diabrotica speciosi (Gusano de la Raíz del Maíz Brasileño (BZR)), y Diabrotica undecimpunctata howardii (Gusano de la Raíz del Maíz Sureño, SCR).

41.- El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque la secuencia de ADN se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:31 , SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61 , SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81 , SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, y los complementos de las mismas.

42.- Un método para controlar una infestación de una plaga de coleópteros, que comprende proporcionar en la dieta de una plaga de coleópteros un agente que comprende una primera secuencia ribonucleotídica que funciona tras la ingestión por la plaga, para inhibir una función biológica dentro de la plaga, en donde la secuencia ribonucleotídica exhibe de aproximadamente 95 a aproximadamente 100% de identidad de la secuencia nucleotídica a lo largo de al menos de aproximadamente 14 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos, con una secuencia codificante derivada de la plaga y se híbrida a una segunda secuencia ribonucleotídica que es complementaria a la primera secuencia ribonucleotídica, y en donde la secuencia codificante derivada de la plaga se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO:1 hasta la SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:169 hasta la SEQ ID NO:174, y los complementos de las mismas.

43.- El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque la dieta se selecciona del grupo que consiste de una dieta artificial, una célula de una planta, una pluralidad de células de una planta, un tejido de una planta, una raíz de una planta, una semilla de una planta y una planta crecida de una semilla de la planta, en donde la dieta comprende una cantidad inhibidora de la plaga de la molécula de ARN.

44.- El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque la secuencia nucleotídica comprende al menos aproximadamente 19 nucleótidos contiguos como se expone en la SEQ ID NO:97.

45.- El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque los aproximadamente 19 nucleótidos contiguos se seleccionan de la posición del nucleótido 58 hasta aproximadamente el nucleótido 1010 como se expone en la SEQ ID NO:97.