TWI784298B - 生物活性物質用於製備促進肌膚膠原蛋白質生成及提升肌膚膠原蛋白質密度的組合物的用途 - Google Patents
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Abstract
一種生物活性物質用於製備改善皮膚狀態的組合物的用途。生物活性物質為胜肽,包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一胺基酸序列。各胺基酸序列為魚皮的胜肽片段。
Description
本發明涉及一種生物活性物質的用途,特別是關於一種作為生物活性物質的胜肽用於製備改善皮膚狀態的組合物的用途。
羅非魚,或稱吳郭魚,學名為Oreochromis mossambicus。其肉質鮮嫩,小刺少,且因養殖容易、價格便宜、營養成分高等因素,現今羅非魚已成為社會大眾食物蛋白質攝取的重要來源。
羅非魚被大量加工成食用魚片,而每產生一千噸的魚片會伴隨產生二百噸的廢棄物,例如魚頭、魚皮、魚鱗、魚尾、魚骨及內臟等副產品。
近年來,為減少資源浪費及避免汙染環境,這些相關的副產品也逐漸被重視。在這些副產品中,魚皮富含膠原蛋白,且因其組成結構與人體接近而常被用以進行二次加工製作成加工食品、明膠、燙傷繃帶等。
膠原蛋白為人體一種非常重要的蛋白質,廣泛存在於結締組織中。膠原蛋白作為人體韌帶、眼睛角膜等組織的主要成分。並且,膠原蛋白更是細胞外基質的主要組成成分。膠原蛋白可使肌膚保持彈性,而隨著膠原蛋白的流失,肌膚會出現皺紋。
然而,膠原蛋白無法被人體直接吸收。
有鑑於此,本發明提供一種以作為生物活性物質的胜肽製備改善皮膚狀態的組合物的用途。
在一些實施例中,一種生物活性物質用於製備改善皮膚狀態的組合物的用途,其中生物活性物質為胜肽,且胜肽包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一胺基酸序列。各胺基酸序列為魚皮的胜肽片段。
綜上,任一實施例的作為生物活性物質的胜肽,其可製備改善皮膚狀態的組合物。並且,胜肽包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一胺基酸序列,且各胺基酸序列為魚皮的胜肽片段。在一些實施例中,作為生物活性物質的胜肽可用以調節FBN1基因、LOX基因、TIMP1基因及MMP2基因中至少一基因的表現。在一些實施例中,所製備的組合物包括用以調節FBN1、LOX、TIMP1、COL4A1、HAS2、ELN及MMP2其中的至少一項基因的胜肽,且所製備的組合物可用於促進肌膚膠原蛋白質生成、提升肌膚膠原蛋白質密度、避免肌膚膠原蛋白質流失、降低肌膚水分流失、提升肌膚彈性、改善皺紋或其組合。
WK-0:皺紋
WK-4:皺紋
Collagen-0:膠原蛋白密度
Collagen-4:膠原蛋白密度
圖1係本發明一些實施例中胜肽處理人類細胞後的FBN1基因表現的倍數結果圖;圖2係本發明一些實施例中胜肽處理人類細胞後的LOX基因表現的倍
數結果圖;圖3係本發明一些實施例中胜肽處理人類細胞後的TIMP1基因表現的結果圖;圖4係本發明一些實施例中胜肽處理人類細胞後的MMP2基因表現的百分比結果圖;圖5係本發明一些實施例中實驗組及對照組的COL4A1基因的相對表現結果圖;圖6係本發明一些實施例中實驗組及對照組的HAS2基因的相對表現結果圖;圖7係本發明一些實施例中實驗組及對照組的TIMP1基因的相對表現結果圖;圖8本發明一些實施例中實驗組及對照組的ELN基因及LOX基因的相對表現結果圖;圖9係本發明一些實施例中實驗組及對照組於第0周及第4周之皺紋百分比結果圖;圖10係本發明一些實施例中實驗組於第0周肌膚皺紋照片;圖11係本發明一些實施例中實驗組於第4周肌膚皺紋照片;圖12係本發明一些實施例中實驗組及對照組於第0周及第4周之水分流失百分比結果圖;圖13係本發明一些實施例中實驗組及對照組於第0周及第4周之彈性百分比結果圖;圖14係本發明一些實施例中實驗組及對照組於第0周及第4周之膠原
蛋白密度百分比結果圖;圖15係本發明一些實施例中實驗組於第0周肌膚膠原蛋白密度分析圖;以及圖16係本發明一些實施例中實驗組於第4周肌膚膠原蛋白密度分析圖。
在一些實施例中,作為生物活性物質的胜肽能用於製備改善皮膚狀態的組合物。其中,胜肽包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一胺基酸序列,且各胺基酸序列為魚皮的胜肽片段。
應理解,「胜肽」為介於胺基酸和蛋白質之間的物質,係由多個胺基酸組成。並且,作為生物活性物質的胜肽可為「經分離的胜肽」或「經合成的胜肽」。其中,「經分離的胜肽」是指從生物體或生物體衍生物中分離出來的胜肽片段,且此胜肽片段具有生物活性。「經合成的胜肽」是指藉由儀器或人工實驗操作依照欲得到的胺基酸序列合成的胜肽片段,且此胜肽片段具有生物活性。並且,本文所述及的用語「經分離的胜肽」等同於「分離的胜肽」或「分離胜肽」,且用語「經合成的胜肽」等同於「合成的胜肽」或「合成胜肽」。
應可理解,本文所述及的用語「蛋白」等同於「蛋白質」,例如用語「膠原蛋白」等同「膠原蛋白質」。
在一些實施例中,作為生物活性物質的胜肽可分離自魚皮的胜肽片段或藉由儀器或人工實驗合成得之。舉例來說,魚皮的胜肽片段的來源包括魚皮細胞、膠原蛋白(下稱魚皮膠原蛋白)及魚肉細胞。由於魚
皮中主要的成分為膠原蛋白,且從魚皮中提取魚皮膠原蛋白的過程中,除了主要提取的魚皮膠原蛋白,更會包含魚皮細胞中的蛋白質(即,魚皮細胞蛋白)以及殘留在魚皮上魚肉細胞的蛋白質(即,魚肉細胞蛋白)。應可理解,本文所述及的用語「魚皮的胜肽片段」是指以膠原蛋白為主的胜肽片段,且同時含有魚皮細胞蛋白及魚肉細胞蛋白的胜肽片段。
在一些實施例中,魚皮為羅非魚的魚皮,因此作為生物活性物質的胜肽是羅非魚的魚皮的胜肽片段。其中,羅非魚的魚皮的胜肽片段可包含至少一種膠原蛋白、前膠原蛋白、魚皮細胞蛋白、魚肉細胞蛋白或其組合的胜肽片段。舉例來說,膠原蛋白可為第一型膠原蛋白、第四型膠原蛋白、第五型膠原蛋白、第六型膠原蛋白、第七型膠原蛋白、第十二型膠原蛋白、或第十八型膠原蛋白等,且前膠原蛋白可為第一型前膠原蛋白。
並且,在一些實施例中,作為生物活性物質的胜肽可以為SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11所示的11種胺基酸序列中的任意多種胺基酸序列藉由化學(如,酵素水解處理等)或/及物理外力(如,純化、分離、親疏水引力、極性非極性溶劑等)混合在一起的胜肽群組。
舉例來說,可將羅非魚魚皮的膠原蛋白胜肽原料進行分離以得到SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一胺基酸序列,且此膠原蛋白胜肽原料包括魚皮膠原蛋白的胜肽片段、魚皮細胞蛋白的胜肽片段及/或魚肉細胞蛋白的胜肽片段。在一實施例中,膠原蛋白胜肽原料可以為市售羅非魚魚皮膠原蛋白胜肽粉(購自LAPI,Italy),或是將羅非魚魚皮提取出的膠原蛋白經由酵素水解處理後並乾燥形成的膠原蛋白胜肽粉。
在一些示範例中,作為生物活性物質的胜肽可藉由儀器
(如,快速蛋白質液性層析儀及高效液相層析系統)自羅非魚魚皮膠原蛋白胜肽粉分離得之。並且,上述分離步驟是利用胜肽性質(例如分子量、親疏水性、極性非極性等物理或化學特性)分離出的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一胺基酸序列。
於此,當胜肽包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的多種胺基酸序列時,此些胺基酸序列可為由相同蛋白質所分離出的胜肽片段,或者由不同蛋白質所分離出的胜肽片段。舉例來說,胺基酸序列為SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3的二胜肽皆來自第四型膠原蛋白。
在一些實施例中,各胺基酸序列的分子量介於700道爾吞(Da)至1900Da之間。在一些實施例中,各胺基酸序列的胺基酸數量為7至21個。
在一些實施例中,作為生物活性物質的胜肽能用於調節至少一基因表現的表現。其中,至少一基因包括FBN1、LOX、TIMP1及MMP2中至少一項基因。換言之,胜肽能用於調節FBN1、LOX、TIMP1及MMP2中至少一項基因。
由於組合物是藉由可調節FBN1、LOX、TIMP1及MMP2中至少一項基因的胜肽所製備,因此組合物可用以調節FBN1、LOX、TIMP1及MMP2中至少一項基因的能力。
在一些實施例中,當胜肽包括SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:11中所示的至少一胺基酸序列時,此胜肽能調節FBN1基因,且所製備的組合物可用以提升FBN1基因的表現。舉例來說,選用SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:11中所示的任一種或多種胺基酸序列來製備組合物時,此
組合物可用以提升FBN1基因的表現,進而維持細胞外基質。
在一些實施例中,當胜肽包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:11中所示的至少一胺基酸序列時,此胜肽能調節LOX基因,且所製備的組合物可用以提升LOX基因的表現。舉例來說,選用SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:11所示的任一種或多種胺基酸序列來製備組合物時,此組合物可用以提升LOX基因的表現,進而維持胞外基質的硬性及結構的穩定性。
在一些實施例中,當胜肽包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:11中所示的至少一胺基酸序列時,此胜肽能調節TIMP1基因,且所製備的組合物可用以提升TIMP1基因的表現。舉例來說,選用SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:11所示的任一種或多種胺基酸序列來製備組合物時,此組合物可用以提升TIMP1基因的表現。
在一些實施例中,當胜肽包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:10中所示的至少一胺基酸序列,此胜肽能調節MMP2基因,且所製備的組合物可用以抑制MMP2基因的表現,進而避免分解膠原蛋白。舉例來說,選用SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:10所示的任一種或多種胺基酸序列來製備組合物時,此組合物可用以抑制MMP2基因的表現。
在一些實施例中,當胜肽包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11所示的胺基酸序列時,此胜肽能調節FBN1、LOX、TIMP1、COL4A1、HAS2、ELN及MMP2中至少一項基因,且所製備的組合物可用
以提升FBN1、LOX、TIMP1、COL4A1、HAS2及ELN中至少一項基因,及/或抑制MMP2基因。
在一些實施例中,以具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一胺基酸序列的胜肽所製備的組合物能用以改善肌膚狀況。舉例來說,以具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一胺基酸序列的胜肽所製備的組合物可具有下列至少一種功用:促進肌膚膠原蛋白質生成、提升肌膚膠原蛋白質密度、避免肌膚膠原蛋白質流失、降低肌膚水分流失、提升肌膚彈性及改善皺紋。
舉例來說,當組合物包括用以調節FBN1及COL4A1中至少一項基因的胜肽,此組合物可用以促進肌膚膠原蛋白質生成並提升肌膚膠原蛋白質密度。當組合物包括用以調節TIMP1及MMP2中至少一項基因的胜肽,此組合物可用以避免肌膚膠原蛋白質流失。當組合物包括用以調節HAS2基因的胜肽,此組合物可用以降低肌膚水分流失。當組合物包括用以調節FBN1、LOX及ELN中至少一項基因的胜肽,此組合物可用以提升肌膚彈性。當組合物包括用以調節FBN1、LOX、TIMP1、COL4A1、HAS2、ELN及MMP2中至少一項基因的胜肽,此組合物可用以改善皺紋。
在一些實施例中,以具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一胺基酸序列的胜肽所製備的組合物可以為食品組合物、保健食品組合物、或醫藥組合物等。舉例來說,以具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一胺基酸序列的胜肽所製備的組合物可為口服型的膠原胜肽粉。因此,藉由服用組合物可使其內包含的胜肽調節肌膚細胞的基因表現,進而改善肌膚細胞狀況。
範例一:經分離的胜肽的製備
首先,稱取100毫克羅非魚的魚皮膠原蛋白胜肽粉(購自LAPI,Italy),並將其溶解於5毫升的緩衝液A,以得到膠原蛋白胜肽液。其中,緩衝液A係以50毫莫耳濃度(mM)的Tris/HCl緩衝液(pH 8.0)及100mM氯化鈉(NaCl)配置。
接著,使用快速蛋白質液性層析儀(FPLC純化儀,廠牌ÄKTA GE Healthcare Life Sciences,以下稱為純化儀器)進行膠原胜肽液的粗略分離,以得到初分離胜肽混合物。其中,純化儀器內裝設的分離管柱為分子篩膠體純化管柱(sephadex G-25,2.6cm×10cm,53毫升)。純化儀器的流速設定為每分鐘流一毫升(1mL/min)且用以觀察的紫外光波長為220奈米(nm)及280奈米。並且,將波峰測量值為5kDa以下的初分離胜肽混合物於-80℃下進行冷凍抽乾(儀器廠牌EYELA;型號:FD-1000)12小時,以得到固態的初分離胜肽混合物。
取30毫克固態的初分離胜肽混合物溶解於2毫升含有0.1%三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)的二次去離子水中,以得到預分離胜肽混合物。接著,以高效液相層析(HPLC)系統(機型Hitachi Chromaster HPLC system,廠牌Hitachi,Tokyo,Japan)(下稱HPLC系統)將預分離胜肽混合物進行次分離,以得到多組分離胜肽。其中,HPLC系統內裝設分子篩C18高壓管柱(型號TSKgel G2000SWXL,廠牌Tosoh,30cm×7.8mm,5μm)。HPLC系統的設定值中,以緩衝溶液A(0.1% TFA溶於100%去離子水)及緩衝溶液B(0.1% TFA溶於100%ACN)依照分離梯度進行混合,且分離梯度為5%乙腈(Acetonitrile,ACN)/0.1%TFA
到100%乙腈/0.1%TFA(即,於0.1%TFA溶液環境中將ACN的濃度由5%拉梯度至100%)、流速設定為每分鐘流一毫升(1mL/min)及管柱溫度設定為40℃。
於此,初分離胜肽混合物中的胜肽會隨不同極性及分子量的HPLC溶液沖提出來,進而得到多組分離胜肽。並且,將多組分離胜肽於-80℃下進行冷凍抽乾(儀器廠牌EYELA;型號:FD-1000)12小時,以得到多組固態的分離胜肽。
範例二:胜肽鑑定
將範例一的多組分離胜肽進行蛋白質身分鑑定。首先,多組固態的分離胜肽以去離子水配置為20mg/ml的濃度後,以液相層析質譜儀(LC-MS/MS)進行蛋白質鑑定。並且,液相層析質譜儀(LC-MS/MS)為四級棒-飛行時間式串聯質譜儀系統(Q-TOF),其中液相層析系統(LC system)的型號為UltiMate 3000 RSLCnano LC Systems(廠牌Thermo Fisher Scientific),且質譜儀(Mass Spectrometer)的型號為TripleTOF® 6600 System(廠牌Applied Biosystems Sciex)。
液相層析系統內裝設的分離管柱號為C18分離管柱(Acclaim PepMap C18,75μm I.D.x 25cm nanoViper,2μm,100Å(Thermo Fisher Scientific))。液相層析質譜儀所使用的溶液系統為緩衝溶液A(0.1% TFA溶於100%去離子水)及緩衝溶液B(0.1% TFA溶於100%ACN)。液相層析質譜儀設定的分離梯度為5%緩衝溶液B到拉梯度到90%緩衝溶液B、流速設定為每分鐘流300奈升(300nl/min)及拉梯度30分鐘。
於質譜儀的設定值中,檢視質譜掃描(survey scan)設定為掃描在400m/z(質荷比)至1200m/z範圍內的所有離子化的分離胜肽。在資料依靠收集模式(information dependent acquisition,CID)中,設定胜肽的偵測範圍是100-5000道爾頓(dalton,Da)。接著,分析這些分離胜肽並對應產生多個MS/MS圖譜,並利用Mascot分析程式將這些MS/MS圖譜於資料庫(NCBI及UniProt)中進行檢索,進而得到這些分離胜肽的胺基酸序列及身分鑑定資訊,如表1及表2所示。
由表1可知,分離胜肽的胺基酸序列的分子量介於700Da至1900Da之間,且分離胜肽的胺基酸序列的胺基酸數量介於7至21個。
並且,由表2可知,分離胜肽的胺基酸序列為羅非魚的魚皮的胜肽片段。其中,SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:11為羅非魚魚皮的至少一種膠原蛋白(Collagen)的胜肽片段、SEQ ID NO:9為細胞酵素的胜肽片段,而SEQ ID NO:10為細胞內蛋白質。舉例來說,SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8為膠原蛋白的胜肽片段、SEQ ID NO:11為前膠原蛋白(Procollagen)的胜肽片段、SEQ ID NO:9為N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉移酶次單元α/β(N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase subunits alpha/beta)的胜肽片段,而SEQ ID NO:10為網格蛋白(Plectin b)的胜肽片段。於此可知,羅非魚的魚皮膠原蛋白胜肽原料包含上述分
離出來的11種胜肽的胺基酸序列,即SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11。
範例三:胜肽合成
為驗證範例二所鑑定到的11種分離胜肽的胺基酸序列對於肌膚細胞的功效,於範例三中依據前述範例二鑑定所得的胺基酸序列(即SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11)的胺基酸排列順序製備合成胜肽。使用合成方法為固相合成法(Fmoc-Solid Phase Peptide Synthesis),且使用的儀器為胜肽合成儀(型號Focus XC III 0,美國,廠牌AAPPTEC)。
以下以SEQ ID NO:2的胺基酸序列為例,已知SEQ ID NO:2的胺基酸序列為Gly-Leu-Pro-Gly-Val-Gln-Gly-Asn-Ile。
步驟(1):首先,於反應管中置入樹脂,並依照每1公克樹脂加入15毫升的二氯甲烷(DCM),將樹脂浸泡在二氯甲烷中30分鐘以使樹脂於溶液中膨脹。
步驟(2):去除反應管內的二氯甲烷,並依照每1公克樹脂加入15毫升的20%呱啶二甲基甲醯胺(呱啶DME)溶液至反應管中與樹脂反應5分鐘,接著去除反應管內溶液。再次依照每1公克樹脂加入15毫升的20%呱啶二甲基甲醯胺溶液至反應管中再次與樹脂反應15分鐘,以去除樹脂上保護基,得到去保護基的樹脂。
步驟(3):於再次去除反應管內的溶液後,從反應管內取出十幾粒樹脂進行檢測。首先,將樹脂以乙醇清洗三次,並加入茚三酮、苯酚溶液各一滴。於105℃至110℃加熱5分鐘,當茚三酮及苯酚溶液和樹脂反應皆變成深藍色時,為陽性反應,代表此時反應管內的樹脂為去保護基的樹脂,並可與胺基酸結合。
步驟(4):將去保護基的樹脂依照每1公克樹脂加入10毫升的二甲基甲醯胺至反應管內重複清洗6次。
步驟(5):將三倍過量的保護甘胺酸(Fmoc-Gly)及三倍過量的羥基苯並三唑(HOBt)以少量的二甲基甲醯胺溶解後,加入裝有去保護基的樹脂的反應管內反應90分鐘。
步驟(6):於90分鐘反應後,依照每1公克樹脂加入10毫升的二甲基甲醯胺至反應管內重複清洗3次接有胺基酸的樹脂。
接著,重複上述步驟(2)至(6),直到將其餘胺基酸(Leu、Pro、Gly、Val、Gln、Gly、Asn、Ile)依序接起以形成胺基酸序列為SEQ ID NO:2的初合成胜肽。
步驟(7):依照每1公克樹脂加入10毫升的二甲基甲醯胺至反應管內重複清初合成胜肽3次、接著依照每1公克樹脂加入10毫升的二氯甲烷至反應管內清洗初合成胜肽3次,以及最後依照每1公克樹脂加入10毫升的乙醇至反應管內清洗初合成胜肽3次。
步驟(8):將清洗後的初合成胜肽以10克裂解液(86%三氟乙酸、4%苯甲硫醚、3%水、5%乙二硫醇(EDT)及2%苯酚)反應120分鐘,以分離初合成胜肽與樹脂。
步驟(9):藉由砂芯漏斗將含有初合成胜肽之裂解液與樹脂分離,接著將含有初合成胜肽之裂解液中加入相對前述裂解液八倍體積的乙醚中以進行反應。接著,以布氏漏斗進行抽濾分離以獲得初合成胜肽及裂解液,並於抽乾含有裂解液的乙醚後以乙醚清洗初合成胜肽三次,此時初合成胜肽為固體。並且,於常溫中待乙醚揮發後得到乾燥的初合成胜
肽。
步驟(10):取1毫克的乾燥的初合成胜肽以0.5毫升去離子水回溶後,取20毫升回溶後的初合成胜肽以HPLC系統(機型Hitachi Chromaster HPLC system,廠牌Hitachi,Tokyo,Japan)進行分離並純化,以得到純合成胜肽。其中。於HPLC系統中設置C18管柱(廠牌Gemini-NX)並設定檢測長為220nm,並且HPLC系統中以緩衝溶液A(0.1% TFA溶於100%去離子水)及緩衝溶液B(0.1% TFA溶於100%ACN)依照線分離梯度進行混合以沖提並分離出合成胜肽。分離梯度的設定值從為10%緩衝溶液B拉線性梯度到90% ACN(溶於0.1%TFA)、流速設定為每分鐘流一毫升(1mL/min)且分離時間設定為30分鐘。並且,依據HPLC色譜圖中計算各合成胜肽的峰面積可得出合成胜肽之純度皆達95%以上。於此,可得到胺基酸序列為SEQ ID NO:2的合成胜肽。
同理,其餘胺基酸序列(即,SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3~SEQ ID NO:11)亦可依照前述流程,於步驟(1)後,重複進行上述步驟(2)至步驟(6)直到胺基酸接起形成對應的胺基酸序列。接著再進行步驟(7)至步驟(10)進行清洗、純化以得到乾淨(純度高達95%)的合成胜肽(即,SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3~SEQ ID NO:11)。
為進一步確認個別胺基酸序列對於細胞基因表現的影響,以人類纖維母細胞(CCD-966SK)與個別胜肽共同培養後分析細胞的基因表現。將11種合成胜肽分別進行細胞實驗,且11種合成胜肽的胺基酸序列分別為SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11。於下文以序列編號SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11作為組別稱呼,以便於說明。
(一)實驗材料及實驗組別
細胞基因表現測試係將人類纖維母細胞(購自食工所)與待測物(如胜肽或組合物)進行共培養後,再收取細胞內的RNA進行分析。請參閱表3,細胞基因表現測試的組別分為13組,其中11組為胜肽實驗組(實驗組A至實驗組K)、1組為組合物實驗組(實驗組L),以及1組為控制組。並且,每一個組別係與1X105個人類纖維母細胞共培養於裝有2毫升細胞培養基(X-VIVOTM 10)的細胞培養盤中。實驗組A至實驗組K分別對應11組各自加入範例三製成之11種合成胜肽(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11)的11組胜肽實驗組。實驗組L為加入組合物的組合物實驗組,且此組合物是經範例二鑑定出含有11種胜肽(即SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11)的羅非魚的魚皮膠原胜肽粉(購自LAPI,Italy)。控制組則不添加胜肽或組合物。
(二)實驗設計
胜肽實驗組(對應實驗組A至實驗組K)每一組依照每一毫升細胞培養基中加入12.5(μg)合成胜肽的比例於37℃下培養人類纖維母細胞24小時、組合物實驗組(對應實驗組L)為每一毫升細胞培養基中加入100毫克(mg)的組合物的比例培養人類纖維母細胞24小時,而控制組不添加胜肽並以純細胞培養基培養人類纖維母細胞24小時。並且,於培養24小時後,各組去除含有胜肽的細胞培養基或純培養基,並以磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗各組細胞以去除殘餘的培養基。取下清洗後的細胞並以細胞裂解液(購自Geanaid公司,臺灣)破細胞後,再以RNA萃取試劑套組
(購自Geneaid公司,台灣)萃取各組細胞內的RNA,接著以cDNA合成試劑(購自Geneaid公司,台灣)將萃取後的RNA翻轉錄成cDNA,並以聚合酶連鎖反應(PCR)儀器配合不同的引子(Primer)(如表3所示)觀察細胞內基因的表現。此外,引子先以SYBR green Dye綠色螢光染劑(Applied Biosystem)反應,並使用2-△△Ct方法進行基因定量。需要特別說明的是,實驗對應的圖式中的基因表現是以相對倍數或百分比呈現,其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差,並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗(Student t-test)分析是否具有統計上的顯著差異。圖式中「*」代表p值小於0.05,「**」代表p值小於0.01,以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時,代表統計上的差異越顯著。
首先,將11組胜肽實驗組(即實驗組A至實驗組K)與對照組(即控制組)進行FBN1基因(GeneID:2200)、LOX基因(GeneID:4015)、TIMP1基因(GeneID:7076)及MMP2基因(GeneID:4313)的基因表現分析,如圖1至圖4所示。
應理解,如表3所列,於圖式中標示為SEQ ID NO:1的等同於下文中所示的實驗組A,並以此類推,圖式中標示為SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11分別對應等同於下文中標示的實驗組A至實驗組K。
(三)胜肽實驗組及控制組的FBN1基因表現分析
FBN1基因是人類纖維母細胞原纖維蛋白質(Fibrillin-1,FBN1)的編碼基因,透過觀察FBN1基因的表現,可分析FBN1蛋白質的表現。當FBN1基因提升時,其轉錄的RNA的量提升,亦代表此RNA轉譯的蛋白質含量的提升。FBN1蛋白質是一種存在於細胞外基質的醣蛋白,會形成微絲使得締結組織具有彈性。當FBN1蛋白質在真皮層的表現減少時,會影響真皮層的微絲數量。並且,由於微絲會提供軌道主導彈性纖維的集合,因此當FBN1蛋白質的含量減少時,會影響彈性纖維的集合與合成,進而影響肌膚彈性。
請參閱圖1。以FBN1-F(SEQ ID NO:12)及FBN1-R(SEQ ID NO:13)引子測試胜肽實驗組(圖式以序列編號代表各胜肽實驗組)與控制組對於FBN1基因表現。實驗發現實驗組B(SEQ ID NO:2)、實驗組C(SEQ ID NO:3)、實驗組D(SEQ ID NO:4)、實驗組E(SEQ ID NO:5)、實驗組F(SEQ ID NO:6)、實驗組G(SEQ ID NO:7)、實驗組H(SEQ ID NO:8)、實驗組I(SEQ ID NO:9)、實驗組J(SEQ ID NO:10)及實驗組K(SEQ ID NO:11)的10組胜肽實驗組,相較於控制組的FBN1基因有明顯的提升。舉例來說,實驗組B的FBN1基因表現量為控制組的FBN1基因表現量6倍左右、實驗組C的FBN1基因表現量為控制組的FBN1基因表現量3倍左右、實驗組D的FBN1基因表現量為控制組的FBN1基因表現量16倍左右、實驗組E的FBN1基因表現量為控制組的FBN1基因表現量6倍左右、實驗組F的FBN1基因表現量為控制組的FBN1基因表現量5倍左右、實驗組G的FBN1基因表現量為控制組的FBN1基因表現量5倍左右但略高於實驗組F、實驗組H的FBN1基因表現量為控制組的FBN1基因表現量9倍左右、實驗組I的FBN1基因表現量為控制組的FBN1基因表現量4倍左右、實驗組J的FBN1基因表現量為控制組的FBN1基因表現量6倍左右以及實驗組K的FBN1基因表現量為控制組的FBN1基因表現量5倍左右。因此,當胜肽包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或其組合時,可提高FBN1基因表現,進而提高肌膚彈性。
由於SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:11中所示的10種胺基酸序
列皆具有提高FBN1基因表現的能力,因此以其中至少一種胺基酸序列製備的組合物亦可用以提高FBN1基因表現。並且,所製備的組合物可用以促進肌膚膠原蛋白質生成、提升肌膚膠原蛋白質密度、提升肌膚彈性、改善皺紋或其組合。
(四)胜肽實驗組及控制組的LOX基因表現分析
LOX基因為離胺基氧化酶(LOX,Lysyl Oxidase)的編碼基因,透過觀察LOX基因的表現,可分析LOX蛋白質的表現。當LOX基因提升時,其轉錄的RNA的量提升,亦代表此RNA轉譯的蛋白質含量的提升。彈性蛋白在彈性纖維中的含量達90%,且是以可溶性彈性蛋白原單體的形式合成並分泌至細胞外。當彈性蛋白與彈性蛋白綁定蛋白結合後,會轉移到微纖維的骨架上,並透過LOX蛋白質或類LOX蛋白酶進行醣化反應。藉由糖化反應,彈性蛋白單體間的相互凝聚和交聯成線狀或球狀,最終形成不溶性彈性蛋白多聚體,並轉變為交聯形式。於此,此多聚體具有良好的順應性和回彈性,賦予彈性纖維的彈性特質,進而影響肌膚彈性。
請參閱圖2。以LOX-F(SEQ ID NO:14)及LOX-R(SEQ ID NO:15)引子測試胜肽實驗組(圖式以序列編號代表各胜肽實驗組)與控制組對於LOX基因表現。實驗發現實驗組B(SEQ ID NO:2)、實驗組E(SEQ ID NO:5)、實驗組I(SEQ ID NO:9)及實驗組K(SEQ ID NO:11)的4組胜肽實驗組,相較於控制組的LOX基因有明顯的提升。舉例來說,實驗組B的LOX基因表現量為控制組的LOX基因表現量5.7倍左右、實驗組E的LOX基因表現量為控制組的LOX基因表現量2.5倍左右、實驗組I實驗組的LOX基因表現量為控制組的LOX基因表現量2.5倍左右且略高於實驗
組E,以及實驗組K的LOX基因表現量為控制組的LOX基因表現量3倍左右。因此,當胜肽包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或其組合時,可提高LOX基因表現,進而提高肌膚彈性。
由於SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:11中所示的4種胺基酸序列皆具有提高LOX基因表現的能力,因此以其中至少一種胺基酸序列製備的組合物亦可用以提高LOX基因表現。並且,所製備的組合物可用以促進肌膚膠原蛋白質生成、提升肌膚膠原蛋白質密度、提升肌膚彈性、改善皺紋或其組合。
(五)胜肽實驗組及控制組的TIMP1基因表現分析
TIMP1基因為基質金屬蛋白酶組織抑制劑(Tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP1)的基因,透過觀察TIMP1基因的表現,可分析TIMP1蛋白質的表現。當TIMP1基因提升時,其轉錄的RNA的量提升,亦代表此RNA轉譯的蛋白質含量的提升。TIMP1蛋白質具有抗膠原蛋白酶的作用,因此具有保護肌膚膠原蛋白被降解的效果。
請參閱圖3。以TIMP1-F(SEQ ID NO:16)及TIMP1-R(SEQ ID NO:17)引子測試胜肽實驗組(圖式以序列編號代表各胜肽實驗組)與控制組對於TIMP1基因表現。實驗發現實驗組B(SEQ ID NO:2)、實驗組F(SEQ ID NO:6)、實驗組H(SEQ ID NO:8)、實驗組I(SEQ ID NO:9)及實驗組K(SEQ ID NO:11)的5組胜肽實驗組,相較於控制組的TIMP1基因有明顯的提升。舉例來說,實驗組B的TIMP1基因表現量為控制組的TIMP1基因表現量7.8倍左右、實驗組F的TIMP1基因表現量為控制組的TIMP1基因表現量3倍左右、實驗組H的TIMP1基因表現量為控制
組的TIMP1基因表現量5倍左右、實驗組I的TIMP1基因表現量為控制組的TIMP1基因表現量3倍左右以及實驗組K的TIMP1基因表現量為控制組的TIMP1基因表現量5倍左右。因此,當胜肽包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或其組合時,可提高TIMP1基因表現,進而避免肌膚膠原蛋白流失。
由於SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:11中所示5種胺基酸序列皆具有提高TIMP1基因表現的能力,因此以其中至少一種胺基酸序列製備的組合物亦可用以提高TIMP1基因表現。並且,所製備的組合物可用以避免肌膚膠原蛋白質流失、用以改善皺紋或其組合。
(六)胜肽實驗組及控制組的MMP2基因表現分析
MMP2基因為基質金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteinase-2,MMP2)的基因,透過觀察MMP2基因的表現,可分析MMP2蛋白質的表現。當MMP2基因下降時,其轉錄的RNA的量下降,亦代表此RNA轉譯的蛋白質含量的下降。由於細胞外基質結構的改變與維持的動態平衡受到鋅依賴的肽鏈內切酶的影響,而相關的肽鏈內切酶即為基質金屬蛋白酶(MMP)及MMP組織抑制劑。並且,MMP蛋白質可降解彈性纖維蛋白。舉例來說,已知的MMP蛋白質有8種(如,MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、MMP10、MMP12、MMP13及MMP14),其中MMP2、MMP7、MMP9、MMP10、MMP12及MMP14蛋白質均能降解不溶性的彈性蛋白為可溶性的胜肽片段;MMP2、MMP3、MMP9、MMP12及MMP13蛋白質均能分解代謝原纖維蛋白微纖維和縮胺酸。因此。抑制
MMP2蛋白質的表現可避免彈性纖維蛋白被降解,進而避免膠原蛋白流失。
請參閱圖4。以MMP2-F(SEQ ID NO:18)及MMP2-R(SEQ ID NO:19)引子測試胜肽實驗組(圖式以序列編號代表各胜肽實驗組)與控制組對於MMP2基因表現。實驗發現實驗組B(SEQ ID NO:2)、實驗組C(SEQ ID NO:3)、實驗組E(SEQ ID NO:5)及實驗組J(SEQ ID NO:10)的4組胜肽實驗組,相較於控制組的MMP2基因有明顯的下降。舉例來說,實驗組B、實驗組E及實驗組J的MMP2基因表現百分比相較於控制組的MMP2基因表現百分比(控制組視為100%表現)均下降至10%以下。換言之,實驗組B、實驗組E及實驗組J抑制MMP2基因表現達90%以上。再者,實驗組C相較於控制組的MMP2基因表現百分比(控制組視為100%表現)下降至40%左右。換言之,實驗組C抑制MMP2基因表現達60%左右。因此,當胜肽包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10或其組合時,可抑制MMP2基因表現,進而避免肌膚膠原蛋白流失。
由於SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:10中所示的4種胺基酸序列皆具有抑制MMP2基因表現的能力,因此以其中至少一種胺基酸序列製備的組合物亦可用以抑制MMP2基因表現。並且,所製備的組合物可用以降低肌膚膠原蛋白質流失、降低肌膚水分流失、用以改善皺紋或其組合。
接著,對組合物實驗組(即實驗組L,圖式以實驗組表示)及控制組(即對照組,圖式以對照組表示,後稱對照組)進行COL4A1基
因(GeneID:1282)、HAS2基因(GeneID:3037)、TIMP1基因(GeneID:7076)、ELN基因(GeneID:2006)及LOX基因(GeneID:4015)的基因表現分析,如圖5至圖8所示。
(七)組合物實驗組及對照組的COL4A1基因表現分析
COL4A1基因為第四型膠原蛋白(Collagen Type IV Alpha 1 Chain)的基因。因此,當COL4A1基因的基因表現提升,代表第四型膠原蛋白的含量提升,進而能提高肌膚中的膠原蛋白含量。
請參閱圖5。以COL4A1-F(SEQ ID NO:20)及COL4A1-R(SEQ ID NO:21)引子測試即實驗組L與對照組對於COL4A1基因表現。實驗發現實驗組L相對於對照組的基因表現明顯提高。舉例來說,實驗組L的COL4A1基因表現量為對照組的COL4A1基因現量的11倍。於此,組合物可提高COL4A1基因表現,並用以促進肌膚膠原蛋白質生成及提升肌膚膠原蛋白質密度,進而提升肌膚彈性。藉此,組合物可用以改善皺紋。
(八)組合物實驗組及對照組的HAS2基因表現分析
HAS2基因為玻尿酸合成酶(Hyaluronan synthase 2,HAS2)的基因,透過觀察HAS2基因的表現,可分析HAS2蛋白質的表現。當HAS2基因提升時,其轉錄的RNA的量提升,亦代表此RNA轉譯的蛋白質含量的提升。HAS2蛋白質用以合成玻尿酸,可提高肌膚的含水量及維持肌膚細胞結構,進而改善皺紋。
請參閱圖6。以HAS2-F(SEQ ID NO:22)及HAS2-R(SEQ ID NO:23)引子測試實驗組L與對照組對於HAS2基因表現。實驗發現實驗組L相對於對照組的基因表現明顯提高。舉例來說,實驗組L的HAS2基
因表現量為對照組的HAS2基因現量的5倍。於此,組合物可提高HAS2基因表現,並用以提高肌膚含水量。藉此,組合物可用以改善皺紋。
(九)組合物實驗組及對照組的TIMP1基因表現分析
請參閱圖7。以TIMP1-F(SEQ ID NO:16)及TIMP1-R(SEQ ID NO:17)引子測試實驗組L與對照組對於TIMP1基因表現。實驗發現實驗組L相對於對照組的基因表現明顯提高。舉例來說,實驗組L的TIMP1基因表現量為對照組的TIMP1基因現量的3倍。於此,組合物可提高TIMP1基因表現,並用以避免肌膚膠原蛋白流失。藉此,組合物可用以改善皺紋。
(十)組合物實驗組及對照組的ELN基因及LOX基因表現分析
ELN基因為彈力蛋白(Elastin,ELN)的基因,而LOX基因為離胺基氧化酶(LOX,Lysyl Oxidase)的基因。其中,彈力蛋白(ELN蛋白)可與彈性蛋白結合,而LOX蛋白可與膠原蛋白及彈性纖維結合。因此,透過觀察ELN基因及LOX基因的表現,可觀察二蛋白質在肌膚的表現量。並且,當二蛋白質的含量提高,皆有利於提高肌膚的彈性。
請參閱圖8。以ELN-F(SEQ ID NO:24)及ELN-R(SEQ ID NO:25)引子測試實驗組L及對照組的ELN基因的表現,並透過LOX-F(SEQ ID NO:14)及LOX-R(SEQ ID NO:15)引子測試實驗組L及對照組的LOX基因的表現。實驗發現實驗組L相對於對照組的ELN基因及LOX基因的基因表現均上升。舉例來說,當對照組的ELN基因表現量為100%時,實驗組L的ELN基因表現量116%。當對照組的LOX基因表現量為100%時,實驗組L的LOX基因表現量112%。於此,組合物可提高ELN基因及LOX
基因的基因表現,並可用以促進膠原蛋白質生成、提升肌膚膠原蛋白質密度、提升肌膚彈性、用以改善皺或其組合。
為進一步確認以組合物對於人類肌膚的影響。以包括11種胺基酸序列(即SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11)的胜肽製備組合物。並且,以下測試人體功效的實驗所使用的組合物是經由範例一及範例二鑑定包含有11種胺基酸序列(即SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11)的胜肽的羅非魚的魚皮膠原胜肽粉(購自LAPI,Italy)。
(十一)實驗組別與實驗設計
透過受試者每日服用組合物或市售魚膠原蛋白,並於服用4周後,以儀器(VISIA Complexion Analysis(Canfield Scientific,Inc.,USA)及DermaLab® Combo膠原蛋白探頭儀器)觀察受試者的肌膚狀況(皺紋、水分流失、肌膚彈性及膠原蛋白密度),進而觀察組合物或市售魚膠原蛋白對於肌膚的影響。
受試者有15人,分為服用組合物的實驗組(8人)及服用市售魚膠原蛋白的對照組(7人)。並且,受試者須每日服用3g的組合物或市售魚膠原蛋白並連續服用4周。此外,需要特別說明的是,所稱「市售魚膠原蛋白」並非以羅非魚的魚皮製備。
(十二)人體功效
測試結果以第0周及第4周的數值一起比較。第0周係為測試前量測的數值,代表受試者所有人均未服用組合物或市售魚膠原蛋白的肌膚狀態,並將第0周量測的數值視為100%。第4周係為連續服用四周後的數值。需要說明的是,實驗對應的圖式中的肌膚狀況是以相對百分比呈
現,其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差,並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗(Student t-test)分析是否具有統計上的顯著差異。圖式中「*」代表p值小於0.05,「**」代表p值小於0.01,以及「***」代表p值小於0.001。當p值小於0.05代表具有統計上的差異。
請參閱圖9。實驗發現對照組在連續服用4周的市售魚膠原蛋白皺紋並未減少,而實驗組在連續服用組合物後相較於第0周時肌膚皺紋顯著下降11%(為89%)。接著,請參閱圖10及圖11,在第0周時,實驗組的受試者眼下的皺紋WK-0較多且分布較密集,如圖10所示。在第4周時,實驗組的受試者眼下的皺紋WK-4減少且分布較稀疏,如圖11所示。於此,相較於對照組,服用實驗組的組合物可有效改善皺紋(如,減少皺紋)。
此外,進一步比較實驗組及對照組的數值,如水分流失百分比(如圖12所示)、肌膚彈性百分比(如圖13所示)及肌膚膠原蛋白密度(如圖14至圖16所示)。
請參閱圖12,藉由比較實驗組的第0周及第4周的水分流失百分比,可發現數值從100%下降到71.7%,代表8位受試者的肌膚水分流失情形改善28.9%。相反地,比較對照組的第0周及第4周的水分流失百分比時發現數值從100%下降到90.4%,則代表7位受試者的肌膚水分流失情形未有顯著改善。
請參閱圖13,藉由比較實驗組的第0周及第4周的肌膚彈性百分比,可發現第4周的數值相較於第0周提高了8.6%,代表8位受試者的肌膚彈性提高。並且,比較對照組的第0周及第4周的肌膚彈性百分比時發
現第4周的數值相較於第0周提高了5.7%。換言之,組合物改善肌膚彈性的情形高於市售魚膠原蛋白。
請參閱圖14至圖16,藉由比較實驗組及對照組的第0周及第4周肌膚膠原蛋白密度,可發現實驗組的第4周的數值相較於其第0周的數值提高37.6%,而對照組第4周的數值相較於其第0周的數值提高32.5%,代表組合物改善肌膚膠原蛋白密度的效果較市售魚膠原蛋白明顯。接著,請參閱圖15及圖16,圖式中各顏色色塊分別代表膠原蛋白密度的高低,其中依照膠原蛋白密度由高至低的顏色色塊排序為白色、黃色、橘色、紅色、紫色、藍色、綠色及黑色。在第0周時,實驗組的受試者檢測到的代表肌膚膠原蛋白密度Collagen-0普遍為綠色,黃色色塊分布稀疏,如圖15所示。在第4周時,實驗組的受試者檢測到的代表肌膚膠原蛋白密度Collagen-4的黃色色塊增加且分布較密集,如圖16所示。於此,相較於對照組,服用組合物的實驗組可有效提高受試者的膠原蛋白密度。
於此,藉由包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一胺基酸序列的胜肽製備組合物,此組合物至少具有調節FBN1基因、LOX基因、TIMP1基因及MMP2基因中至少一項基因表現的能力。並且,當組合物以包括11種胜肽(胺基酸序列分別為SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11)的胜肽製備時,此組合物更具有調節COL4A1基因、HAS2基因、TIMP1基因、ELN基因及LOX基因中至少一項基因表現的能力。並且,以具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一胺基酸序列的胜肽所製備的組合物可具有下列至少一種功用:促進肌膚膠原蛋白質生成、提升肌膚膠原蛋白質密度、避免肌膚膠原蛋白質流失、降低肌膚水分流失、提
升肌膚彈性及改善皺紋。
綜上,根據本發明任一實施例之作為生物活性物質的胜肽,其可製備改善皮膚狀態的組合物,且胜肽包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一胺基酸序列。在一些實施例中,胜肽可調節FBN1基因、LOX基因、TIMP1基因及MMP2基因中至少一基因的表現,且其所製備的組合物亦可調節FBN1基因、LOX基因、TIMP1基因及MMP2基因中至少一基因的表現的組合物。在一些實施例中,所製備組合物更可用於調節COL4A1基因、HAS2基因及ELN基因的表現。在一些實施例中,所製備的組合物可用於促進肌膚膠原蛋白質生成、提升肌膚膠原蛋白質密度、避免肌膚膠原蛋白質流失、降低肌膚水分流失、提升肌膚彈性、改善皺紋或其組合。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上,然其並非用以限定本發明,任何熟習此技藝者,在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾,皆應涵蓋於本發明的範疇內,因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
Claims (6)
- 一種生物活性物質用於製備促進肌膚膠原蛋白質生成及提升肌膚膠原蛋白質密度的組合物的用途,其中該生物活性物質為一魚皮的胜肽片段,並用以調控FBN1基因,且該魚皮的胜肽片段為SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:11中所示的該至少一胺基酸序列。
- 如請求項1所述之用途,其中該魚皮的胜肽片段為該SEQ ID NO:2、該SEQ ID NO:5、該SEQ ID NO:9及該SEQ ID NO:11中所示的該至少一胺基酸序列時,該組合物更用以調控LOX基因的表現。
- 如請求項1所述之用途,其中該組合物用以提升肌膚彈性。
- 如請求項1所述之用途,其中該組合物用以改善皺紋。
- 如請求項1所述之用途,其中該魚皮為羅非魚魚皮。
- 如請求項1所述之用途,其中該魚皮的胜肽片段的來源包括魚皮細胞、魚皮膠原蛋白或魚肉細胞。
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CA2762011C (en) * | 2004-04-09 | 2019-05-07 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for control of insect infestations in plants |
AU2013243950A1 (en) * | 2012-04-02 | 2014-10-30 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides |
SG11201602012RA (en) * | 2013-09-25 | 2016-04-28 | Pronutria Inc | Compositions and formulations for maintaining and increasing muscle mass, strength, and performance and methods of production and use thereof |
EP3138576B1 (en) * | 2014-04-30 | 2020-09-30 | Kinki University | Composition for inducing differentiation |
US10435457B2 (en) * | 2015-08-06 | 2019-10-08 | President And Fellows Of Harvard College | Microbe-binding molecules and uses thereof |
-
2020
- 2020-08-06 TW TW109126750A patent/TWI784298B/zh active
- 2020-11-17 US US17/099,784 patent/US11400138B2/en active Active
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
期刊 Kang et al., Oral Intake of Collagen Peptide Attenuates Ultraviolet B Irradiation-Induced Skin Dehydration In Vivo by Regulating Hyaluronic Acid Synthesis", International Journal of Molecular Sciences, Vol. 19, Issue 11, 2018 Nov 11, 3551. * |
期刊 Venkatesan, Jayachandran, et al. "Marine fish proteins and peptides for cosmeceuticals: A review." Marine drugs 15.5 18 May 2017, 143.; * |
期刊 Yamada et al., "Effects of fish collagen peptides on collagen post-translational modifications and mineralization in an osteoblastic cell culture system", Dental Materials Journal, Vol. 32, Issue 1, 2013 Sep 23, 88-95; * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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TW202206445A (zh) | 2022-02-16 |
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