CN114053165B

CN114053165B - 生物活性物质用于制备改善皮肤状态的组合物的用途

Info

Publication number: CN114053165B
Application number: CN202010782602.2A
Authority: CN
Inventors: 林咏翔; 王玉玲
Original assignee: TCI Co Ltd
Current assignee: TCI Co Ltd
Priority date: 2020-08-06
Filing date: 2020-08-06
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2040-08-06
Also published as: CN114053165A

Abstract

一种生物活性物质用于制备改善皮肤状态的组合物的用途。生物活性物质为胜肽，包括SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:11中所示的至少一氨基酸序列。各氨基酸序列为鱼皮的胜肽片段。

Description

生物活性物质用于制备改善皮肤状态的组合物的用途

技术领域

本发明涉及一种生物活性物质的用途，特别是关于一种作为生物活性物质的胜肽用于制备改善皮肤状态的组合物的用途。

背景技术

罗非鱼，或称吴郭鱼，学名为Oreochromis mossambicus。其肉质鲜嫩，小刺少，且因养殖容易、价格便宜、营养成分高等因素，现今罗非鱼已成为社会大众食物蛋白质摄取的重要来源。

罗非鱼被大量加工成食用鱼片，而每产生一千吨的鱼片会伴随产生二百吨的废弃物，例如鱼头、鱼皮、鱼鳞、鱼尾、鱼骨及内脏等副产品。

近年来，为减少资源浪费及避免污染环境，这些相关的副产品也逐渐被重视。在这些副产品中，鱼皮富含胶原蛋白，且因其组成结构与人体接近而常被用以进行二次加工制作成加工食品、明胶、烫伤绷带等。

胶原蛋白为人体一种非常重要的蛋白质，广泛存在于结缔组织中。胶原蛋白作为人体韧带、眼睛角膜等组织的主要成分。并且，胶原蛋白更是细胞外基质的主要组成成分。胶原蛋白可使肌肤保持弹性，而随着胶原蛋白的流失，肌肤会出现皱纹。

然而，胶原蛋白无法被人体直接吸收。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种以作为生物活性物质的胜肽制备改善皮肤状态的组合物的用途。

在一些实施例中，一种生物活性物质用于制备改善皮肤状态的组合物的用途，其中生物活性物质为胜肽，且胜肽包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一氨基酸序列。各氨基酸序列为鱼皮的胜肽片段。

综上，任一实施例的作为生物活性物质的胜肽，其可制备改善皮肤状态的组合物。并且，胜肽包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一氨基酸序列，且各氨基酸序列为鱼皮的胜肽片段。在一些实施例中，作为生物活性物质的胜肽可用以调节FBN1基因、LOX基因、TIMP1基因及 MMP2基因中至少一基因的表现。在一些实施例中，所制备的组合物包括用以调节FBN1、LOX、TIMP1、COL4A1、HAS2、ELN及MMP2其中的至少一项基因的胜肽，且所制备的组合物可用于促进肌肤胶原蛋白质生成、提升肌肤胶原蛋白质密度、避免肌肤胶原蛋白质流失、降低肌肤水分流失、提升肌肤弹性、改善皱纹或其组合。

附图说明

图1为本发明一些实施例中胜肽处理人类细胞后的FBN1基因表现的倍数结果图；

图2为本发明一些实施例中胜肽处理人类细胞后的LOX基因表现的倍数结果图；

图3为本发明一些实施例中胜肽处理人类细胞后的TIMP1基因表现的结果图；

图4为本发明一些实施例中胜肽处理人类细胞后的MMP2基因表现的百分比结果图；

图5为本发明一些实施例中实验组及对照组的COL4A1基因的相对表现结果图；

图6为本发明一些实施例中实验组及对照组的HAS2基因的相对表现结果图；

图7为本发明一些实施例中实验组及对照组的TIMP1基因的相对表现结果图；

图8为本发明一些实施例中实验组及对照组的ELN基因及LOX基因的相对表现结果图；

图9为本发明一些实施例中实验组及对照组于第0周及第4周的皱纹百分比结果图；

图10为本发明一些实施例中实验组于第0周肌肤皱纹照片；

图11为本发明一些实施例中实验组于第4周肌肤皱纹照片；

图12为本发明一些实施例中实验组及对照组于第0周及第4周的水分流失百分比结果图；

图13为本发明一些实施例中实验组及对照组于第0周及第4周的弹性百分比结果图；以及

图14为本发明一些实施例中实验组及对照组于第0周及第4周的胶原蛋白密度百分比结果图。

其中，附图标记：

WK-0:皱纹

WK-4:皱纹

Collagen-0:胶原蛋白密度

Collagen-4:胶原蛋白密度

具体实施方式

在一些实施例中，作为生物活性物质的胜肽能用于制备改善皮肤状态的组合物。其中，胜肽包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一氨基酸序列，且各氨基酸序列为鱼皮的胜肽片段。

应理解，「胜肽」为介于氨基酸和蛋白质之间的物质，由多个氨基酸组成。并且，作为生物活性物质的胜肽可为「经分离的胜肽」或「经合成的胜肽」。其中，「经分离的胜肽」是指从生物体或生物体衍生物中分离出来的胜肽片段，且此胜肽片段具有生物活性。「经合成的胜肽」是指借由仪器或人工实验操作依照欲得到的氨基酸序列合成的胜肽片段，且此胜肽片段具有生物活性。并且，本文所述及的用语「经分离的胜肽」等同于「分离的胜肽」或「分离胜肽」，且用语「经合成的胜肽」等同于「合成的胜肽」或「合成胜肽」。

应可理解，本文所述及的用语「蛋白」等同于「蛋白质」，例如用语「胶原蛋白」等同「胶原蛋白质」。

在一些实施例中，作为生物活性物质的胜肽可分离自鱼皮的胜肽片段或借由仪器或人工实验合成得之。举例来说，鱼皮的胜肽片段的来源包括鱼皮细胞、胶原蛋白(下称鱼皮胶原蛋白)及鱼肉细胞。由于鱼皮中主要的成分为胶原蛋白，且从鱼皮中提取鱼皮胶原蛋白的过程中，除了主要提取的鱼皮胶原蛋白，更会包含鱼皮细胞中的蛋白质(即，鱼皮细胞蛋白)以及残留在鱼皮上鱼肉细胞的蛋白质(即，鱼肉细胞蛋白)。应可理解，本文所述及的用语「鱼皮的胜肽片段」是指以胶原蛋白为主的胜肽片段，且同时含有鱼皮细胞蛋白及鱼肉细胞蛋白的胜肽片段。

在一些实施例中，鱼皮为罗非鱼的鱼皮，因此作为生物活性物质的胜肽是罗非鱼的鱼皮的胜肽片段。其中，罗非鱼的鱼皮的胜肽片段可包含至少一种胶原蛋白、前胶原蛋白、鱼皮细胞蛋白、鱼肉细胞蛋白或其组合的胜肽片段。举例来说，胶原蛋白可为第一型胶原蛋白、第四型胶原蛋白、第五型胶原蛋白、第六型胶原蛋白、第七型胶原蛋白、第十二型胶原蛋白、或第十八型胶原蛋白等，且前胶原蛋白可为第一型前胶原蛋白。

并且，在一些实施例中，作为生物活性物质的胜肽可以为SEQ ID NO:1 至SEQ IDNO:11所示的11种氨基酸序列中的任意多种氨基酸序列借由化学(如，酵素水解处理等)或/及物理外力(如，纯化、分离、亲疏水引力、极性非极性溶剂等)混合在一起的胜肽群组。

举例来说，可将罗非鱼鱼皮的胶原蛋白胜肽原料进行分离以得到SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一氨基酸序列，且此胶原蛋白胜肽原料包括鱼皮胶原蛋白的胜肽片段、鱼皮细胞蛋白的胜肽片段及/或鱼肉细胞蛋白的胜肽片段。在一实施例中，胶原蛋白胜肽原料可以为市售罗非鱼鱼皮胶原蛋白胜肽粉(购自LAPI,Italy)，或是将罗非鱼鱼皮提取出的胶原蛋白经由酵素水解处理后并干燥形成的胶原蛋白胜肽粉。

在一些示范例中，作为生物活性物质的胜肽可借由仪器(如，快速蛋白质液性层析仪及高效液相层析系统)自罗非鱼鱼皮胶原蛋白胜肽粉分离得之。并且，上述分离步骤是利用胜肽性质(例如分子量、亲疏水性、极性非极性等物理或化学特性)分离出的SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一氨基酸序列。

于此，当胜肽包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的多种氨基酸序列时，此些氨基酸序列可为由相同蛋白质所分离出的胜肽片段，或者由不同蛋白质所分离出的胜肽片段。举例来说，氨基酸序列为SEQ ID NO:2及 SEQ ID NO:3的二胜肽皆来自第四型胶原蛋白。

在一些实施例中，各氨基酸序列的分子量介于700道尔顿(Da)至 1900Da之间。在一些实施例中，各氨基酸序列的氨基酸数量为7至21个。

在一些实施例中，作为生物活性物质的胜肽能用于调节至少一基因表现的表现。其中，至少一基因包括FBN1、LOX、TIMP1及MMP2中至少一项基因。换言之，胜肽能用于调节FBN1、LOX、TIMP1及MMP2中至少一项基因。

由于组合物是借由可调节FBN1、LOX、TIMP1及MMP2中至少一项基因的胜肽所制备，因此组合物可用以调节FBN1、LOX、TIMP1及MMP2 中至少一项基因的能力。

在一些实施例中，当胜肽包括SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:11中所示的至少一氨基酸序列时，此胜肽能调节FBN1基因，且所制备的组合物可用以提升FBN1基因的表现。举例来说，选用SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:11中所示的任一种或多种氨基酸序列来制备组合物时，此组合物可用以提升 FBN1基因的表现，进而维持细胞外基质。

在一些实施例中，当胜肽包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9及SEQ IDNO:11中所示的至少一氨基酸序列时，此胜肽能调节LOX 基因，且所制备的组合物可用以提升LOX基因的表现。举例来说，选用 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:11所示的任一种或多种氨基酸序列来制备组合物时，此组合物可用以提升LOX基因的表现，进而维持胞外基质的硬性及结构的稳定性。

在一些实施例中，当胜肽包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9及SEQ ID NO:11中所示的至少一氨基酸序列时，此胜肽能调节TIMP1基因，且所制备的组合物可用以提升TIMP1基因的表现。举例来说，选用SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9 及SEQ ID NO:11所示的任一种或多种氨基酸序列来制备组合物时，此组合物可用以提升TIMP1基因的表现。

在一些实施例中，当胜肽包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5及SEQ IDNO:10中所示的至少一氨基酸序列，此胜肽能调节MMP2 基因，且所制备的组合物可用以抑制MMP2基因的表现，进而避免分解胶原蛋白。举例来说，选用SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:10所示的任一种或多种氨基酸序列来制备组合物时，此组合物可用以抑制MMP2基因的表现。

在一些实施例中，当胜肽包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列时，此胜肽能调节FBN1、LOX、TIMP1、COL4A1、HAS2、ELN 及MMP2中至少一项基因，且所制备的组合物可用以提升FBN1、LOX、 TIMP1、COL4A1、HAS2及ELN中至少一项基因，及/或抑制MMP2基因。

在一些实施例中，以具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一氨基酸序列的胜肽所制备的组合物能用以改善肌肤状况。举例来说，以具有SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:11中所示的至少一氨基酸序列的胜肽所制备的组合物可具有下列至少一种功用：促进肌肤胶原蛋白质生成、提升肌肤胶原蛋白质密度、避免肌肤胶原蛋白质流失、降低肌肤水分流失、提升肌肤弹性及改善皱纹。

举例来说，当组合物包括用以调节FBN1及COL4A1中至少一项基因的胜肽，此组合物可用以促进肌肤胶原蛋白质生成并提升肌肤胶原蛋白质密度。当组合物包括用以调节TIMP1及MMP2中至少一项基因的胜肽，此组合物可用以避免肌肤胶原蛋白质流失。当组合物包括用以调节HAS2基因的胜肽，此组合物可用以降低肌肤水分流失。当组合物包括用以调节FBN1、 LOX及ELN中至少一项基因的胜肽，此组合物可用以提升肌肤弹性。当组合物包括用以调节FBN1、LOX、TIMP1、COL4A1、HAS2、ELN及 MMP2中至少一项基因，此组合物可用以改善皱纹。

在一些实施例中，以具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一氨基酸序列的胜肽所制备的组合物可以为食品组合物、保健食品组合物、或医药组合物等。举例来说，以具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一氨基酸序列的胜肽所制备的组合物可为口服型的胶原胜肽粉。因此，借由服用组合物可使其内包含的胜肽调节肌肤细胞的基因表现，进而改善肌肤细胞状况。

范例一：经分离的胜肽的制备

首先，称取100毫克罗非鱼的鱼皮胶原蛋白胜肽粉(购自LAPI, Italy)，并将其溶解于5毫升的缓冲液A，以得到胶原蛋白胜肽液。其中，缓冲液A是以50毫摩尔浓度(mM)的Tris/HCl缓冲液(pH 8.0)及 100mM氯化钠(NaCl)配置。

接着，使用快速蛋白质液性层析仪(FPLC纯化仪，厂牌GE HealthcareLife Sciences，以下称为纯化仪器)进行胶原胜肽液的粗略分离，以得到初分离胜肽混合物。其中，纯化仪器内装设的分离管柱为分子筛胶体纯化管柱(sephadex G-25，2.6cm×10cm，53毫升)。纯化仪器的流速设定为每分钟流一毫升(1mL/min)且用以观察的紫外光波长为220纳米 (nm)及280纳米。并且，将波峰测量值为5kDa以下的初分离胜肽混合物于-80℃下进行冷冻抽干(仪器厂牌EYELA；型号：FD-1000)12小时，以得到固态的初分离胜肽混合物。

取30毫克固态的初分离胜肽混合物溶解于2毫升含有0.1％三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)的二次去离子水中，以得到预分离胜肽混合物。接着，以高效液相层析(HPLC)系统(机型Hitachi Chromaster HPLC system,厂牌Hitachi,Tokyo,Japan)(下称HPLC系统)将预分离胜肽混合物进行次分离，以得到多组分离胜肽。其中，HPLC系统内装设分子筛C18 高压管柱(型号TSKgel G2000SWXL,厂牌Tosoh,30cm×7.8mm,5μm)。HPLC系统的设定值中，以缓冲溶液A(0.1％TFA溶于100％去离子水)及缓冲溶液B(0.1％TFA溶于100％ACN)依照分离梯度进行混合，且分离梯度为5％乙腈(Acetonitrile,ACN)/0.1％TFA到100％乙腈 /0.1％TFA(即，于0.1％TFA溶液环境中将ACN的浓度由5％拉梯度至100％)、流速设定为每分钟流一毫升(1mL/min)及管柱温度设定为 40℃。

于此，初分离胜肽混合物中的胜肽会随不同极性及分子量的HPLC溶液冲提出来，进而得到多组分离胜肽。并且，将多组分离胜肽于-80℃下进行冷冻抽干(仪器厂牌EYELA；型号：FD-1000)12小时，以得到多组固态的分离胜肽。

范例二：胜肽鉴定

将范例一的多组分离胜肽进行蛋白质身分鉴定。首先，多组固态的分离胜肽以去离子水配置为20mg/ml的浓度后，以液相层析质谱仪(LC- MS/MS)进行蛋白质鉴定。并且，液相层析质谱仪(LC-MS/MS)为四级棒-飞行时间式串联质谱仪系统(Q-TOF)，其中液相层析系统(LC system) 的型号为UltiMate 3000RSLCnano LC Systems(厂牌Thermo FisherScientific)，且质谱仪(Mass Spectrometer)的型号为6600 System(厂牌Applied Biosystems Sciex)。

液相层析系统内装设的分离管柱号为C18分离管柱(Acclaim PepMap C18,75μmI.D.x25cm nanoViper,100(Thermo Fisher Scientific))。液相层析质谱仪所使用的溶液系统为缓冲溶液A(0.1％ TFA溶于100％去离子水)及缓冲溶液B(0.1％TFA溶于100％ACN)。液相层析质谱仪设定的分离梯度为5％缓冲溶液B到拉梯度到90％缓冲溶液B、流速设定为每分钟流300纳升(300nl/min)及拉梯度30分钟。

于质谱仪的设定值中，检视质谱扫描(survey scan)设定为扫描在 400m/z(质荷比)至1200m/z范围内的所有离子化的分离胜肽。在数据依靠收集模式(informationdependent aquisition,CID)中，设定胜肽的检测范围是100-5000道尔顿(dalton,Da)。接着，分析这些分离胜肽并对应产生多个MS/MS图谱，并利用Mascot分析程序将这些MS/MS图谱于数据库 (NCBI及UniProt)中进行检索，进而得到这些分离胜肽的氨基酸序列及身分鉴定信息，如表1及表2所示。

表1

序列编号	序列	分子量
			SEQ ID NO:1	GFDIGFI	767.39
SEQ ID NO:2	GLPGVQGNI	855.43
			SEQ ID NO:3	IGIFGQTGPPGE	1171.59
SEQ ID NO:4	PGPMGPMGINGA	1097.5
			SEQ ID NO:5	AVNGLTLAGGRGLNTGAALT	1826
SEQ ID NO:6	ALVQNREGP	984.5
			SEQ ID NO:7	NGLPGSPGLP GRQGE	1435.71
SEQ ID NO:8	PGQPGLSGVPGADGKPGLPGP	1853.96
			SEQ ID NO:9	MFGKDVW	881.41
SEQ ID NO:10	DQGIRLL	814.45
			SEQ ID NO:11	QRGEPGPNGAV	1082.5

由表1可知，分离胜肽的氨基酸序列的分子量介于700Da至1900Da之间，且分离胜肽的氨基酸序列的氨基酸数量介于7至21个。

表2

并且，由表2可知，分离胜肽的氨基酸序列为罗非鱼的鱼皮的胜肽片段。其中，SEQID NO:1至SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:11为罗非鱼鱼皮的至少一种胶原蛋白(Collagen)的胜肽片段、SEQ ID NO:9为细胞酵素的胜肽片段，而SEQ ID NO:10为细胞内蛋白质。举例来说，SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:8为胶原蛋白的胜肽片段、SEQ ID NO:11为前胶原蛋白(Procollagen)的胜肽片段、SEQ ID NO:9为N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶次单元α/β(N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase subunits alpha/beta)的胜肽片段，而SEQID NO:10为网格蛋白(Plectin b)的胜肽片段。于此可知，罗非鱼的鱼皮胶原蛋白胜肽原料包含上述分离出来的11种胜肽的氨基酸序列，即SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11。

范例三：胜肽合成

为验证范例二所鉴定到的11种分离胜肽的氨基酸序列对于肌肤细胞的功效，于范例三中依据前述范例二鉴定所得的氨基酸序列(即SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11)的氨基酸排列顺序制备合成胜肽。使用合成方法为固相合成法(Fmoc-Solid Phase PeptideSynthesis)，且使用的仪器为胜肽合成仪 (型号Focus XC III 0，美国，厂牌AAPPTEC)。

以下以SEQ ID NO:2的氨基酸序列为例，已知SEQ ID NO:2的氨基酸序列为Gly-Leu-Pro-Gly-Val-Gln-Gly-Asn-Ile。

步骤(1)：首先，于反应管中置入树脂，并依照每1公克树脂加入15 毫升的二氯甲烷(DCM)，将树脂浸泡在二氯甲烷中30分钟以使树脂于溶液中膨胀。

步骤(2)：去除反应管内的二氯甲烷，并依照每1公克树脂加入15毫升的20％呱啶二甲基甲酰胺(呱啶DMF)溶液至反应管中与树脂反应5分钟，接着去除反应管内溶液。再次依照每1公克树脂加入15毫升的20％呱啶二甲基甲酰胺溶液至反应管中再次与树脂反应15分钟，以去除树脂上保护基，得到去保护基的树脂。

步骤(3)：于再次去除反应管内的溶液后，从反应管内取出十几粒树脂进行检测。首先，将树脂以乙醇清洗三次，并加入茚三酮、苯酚溶液各一滴。于105℃至110℃加热5分钟，当茚三酮及苯酚溶液和树脂反应皆变成深蓝色时，为阳性反应，代表此时反应管内的树脂为去保护基的树脂，并可与氨基酸结合。

步骤(4)：将去保护基的树脂依照每1公克树脂加入10毫升的二甲基甲酰胺至反应管内重复清洗6次。

步骤(5)：将三倍过量的保护甘胺酸(Fmoc-Gly)及三倍过量的羟基苯并三唑(HOBt)以少量的二甲基甲酰胺溶解后，加入装有去保护基的树脂的反应管内反应90分钟。

步骤(6)：于90分钟反应后，依照每1公克树脂加入10毫升的二甲基甲酰胺至反应管内重复清洗3次接有氨基酸的树脂。

接着，重复上述步骤(2)至(6)，直到将其余氨基酸(Leu、Pro、 Gly、Val、Gln、Gly、Asn、Ile)依序接起以形成氨基酸序列为SEQ ID NO:2的初合成胜肽。

步骤(7)：依照每1公克树脂加入10毫升的二甲基甲酰胺至反应管内重复清初合成胜肽3次、接着依照每1公克树脂加入10毫升的二氯甲烷至反应管内清洗初合成胜肽3次，以及最后依照每1公克树脂加入10毫升的乙醇至反应管内清洗初合成胜肽3次。

步骤(8)：将清洗后的初合成胜肽以10克裂解液(86％三氟乙酸、 4％苯甲硫醚、3％水、5％乙二硫醇(EDT)及2％苯酚)反应120分钟，以分离初合成胜肽与树脂。

步骤(9)：借由砂芯漏斗将含有初合成胜肽的裂解液与树脂分离，接着将含有初合成胜肽的裂解液中加入相对前述裂解液八倍体积的乙醚中以进行反应。接着，以布氏漏斗进行抽滤分离以初合成胜肽及裂解液，并于抽干含有裂解液的乙醚后以乙醚清洗初合成胜肽三次，此时初合成胜肽为固体。并且，于常温中待乙醚挥发后得到干燥的初合成胜肽。

步骤(10)：取1毫克的干燥的初合成胜肽以0.5毫升去离子水回溶后，取20毫升回溶后的初合成胜肽以HPLC系统(机型Hitachi Chromaster HPLC system,厂牌Hitachi,Tokyo,Japan)进行分离并纯化，以得到纯合成胜肽。其中。于HPLC系统中设置C18管柱(厂牌Gemini-NX)并设定检测长为220nm，并且HPLC系统中以缓冲溶液A(0.1％TFA溶于100％去离子水)及缓冲溶液B(0.1％TFA溶于100％ACN)依照线分离梯度进行混合以冲堤并分离出合成胜肽。分离梯度的设定值从为10％缓冲溶液B拉线性梯度到90％ACN(溶于0.1％TFA)、流速设定为每分钟流一毫升(1 mL/min)且分离时间设定为30分钟。并且，依据HPLC色谱图中计算各合成胜肽的峰面积可得出合成胜肽的纯度皆达95％以上。于此，可得到氨基酸序列为SEQ ID NO:2的合成胜肽。

同理，其余氨基酸序列(即，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:11)亦可依照前述流程，于步骤(1)后，重复进行上述步骤(2)至步骤(6)直到氨基酸接起形成对应的氨基酸序列。接着再进行步骤(7)至步骤(10)进行清洗、纯化以得到干净(纯度高达95％)的合成胜肽(即， SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:11)。

为进一步确认个别氨基酸序列对于细胞基因表现的影响，以人类纤维母细胞(CCD-966SK)与个别胜肽共同培养后分析细胞的基因表现。将11种合成胜肽分别进行细胞实验，且11种合成胜肽的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10及 SEQ ID NO:11。于下文以序列编号SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11作为组别称呼，以便于说明。

(一)实验材料及实验组别

细胞基因表现测试是将人类纤维母细胞(购自食工所)与待测物(如胜肽或组合物)进行共培养后，再收取细胞内的RNA进行分析。请参阅表 3，细胞基因表现测试的组别分为13组，其中11组为胜肽实验组(实验组 A至实验组K)、1组为组合物实验组(实验组L)，以及1组为控制组。并且，每一个组别是与1X10⁵个人类纤维母细胞共培养于装有2毫升细胞培养基(X-VIVOTM 10)的细胞培养盘中。实验组A至实验组K分别对应11 组各自加入范例三制成的11种合成胜肽(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11)的 11组胜肽实验组。实验组L为加入组合物的组合物实验组，且此组合物是经范例二鉴定出含有11种胜肽(即SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5及SEQ ID NO:6)的罗非鱼的鱼皮胶原胜肽粉(购自LAPI,Italy)。控制组则不添加胜肽或组合物。

表3

(二)实验设计

胜肽实验组(对应实验组A至实验组K)每一组依照每一毫升细胞培养基中加入12.5(μg)合成胜肽的比例于37℃下培养人类纤维母细胞24小时、组合物实验组(对应实验组L)为每一毫升细胞培养基中加入100毫克 (mg)的组合物的比例培养人类纤维母细胞24小时，而控制组不添加胜肽并以纯细胞培养基培养人类纤维母细胞24小时。并且，于培养24小时后，各组去除含有胜肽的细胞培养基或纯培养基，并以磷酸盐缓冲液(PBS)清洗各组细胞以去除残余的培养基。取下清洗后的细胞并以细胞裂解液(购自Geanaid公司，中国台湾)破细胞后，再以RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾)萃取各组细胞内的RNA，接着以cDNA合成试剂 (购自Geneaid公司，中国台湾)将萃取后的RNA翻转录成cDNA，并以聚合酶连锁反应(PCR)仪器配合不同的引子(Primer)(如表3所示)观察细胞内基因的表现。此外，引子先以SYBR green Dye绿色荧光染剂 (Applied Biosystem)反应，并使用2-ΔΔCt方法进行基因定量。需要特别说明的是，实验对应的图式中的基因表现是以相对倍数或百分比呈现，其中使用Excel软件的STDEV公式计算标准偏差，并在Excel软件中以单尾学生t检验(Student t-test)分析是否具有统计上的显著差异。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于 0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。

表4

引子名称	序列编号	序列
			FBN1-F	SEQ ID NO:12	TTTAGCGTCCTACACGAGCC
FBN1-R	SEQ ID NO:13	CCATCCAGGGCAACAGTAAGC
			LOX-F	SEQ ID NO:14	CGGCGGAGGAAAACTGTCT
LOX-R	SEQ ID NO:15	TCGGCTGGGTAAGAAATCTGA
			TIMP1-F	SEQ ID NO:16	AGAGTGTCTGCGGATACTTCC
TIMP1-R	SEQ ID NO:17	CCAACAGTGTAGGTCTTGGTG
			MMP2-F	SEQ ID NO:18	GATACCCCTTTGACGGTAAGGA
MMP2-R	SEQ ID NO:19	CCTTCTCCCAAGGTCCATAGC
			COL4A4-F	SEQ ID NO:20	CTGGGTGCTGTGTGTTTTGA
COL4A4-R	SEQ ID NO:21	TGAGTCTTGTTTTGCCCTGC
			HAS2-F	SEQ ID NO:22	CGGTGCTCCAAAAAGGCAAA
HAS2-R	SEQ ID NO:23	ACACAATGAGTTGGGCGAGA
			ELN-F	SEQ ID NO:24	GCTAAGGCAGCCAAGTATGG
ELN-R	SEQ ID NO:25	CACCTGGGACAACTGGAATC

首先，将11组胜肽实验组(即实验组A至实验组K)与对照组(即控制组)进行FBN1基因(GeneID：2200)、LOX基因(GeneID：4015)、 TIMP1基因(GeneID：7076)及MMP2基因(GeneID：4313)的基因表现分析，如图1至图4所示。

应理解，如表3所列，于图式中标示为SEQ ID NO:1的等同于下文中所示的实验组A，并以此类推，图式中标示为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ IDNO:11分别对应等同于下文中标示的实验组A至实验组K。

(三)胜肽实验组及控制组的FBN1基因表现分析

FBN1基因是人类纤维母细胞原纤维蛋白质(Fibrillin-1，FBN1)的编码基因，透过观察FBN1基因的表现，可分析FBN1蛋白质的表现。当 FBN1基因提升时，其转录的RNA的量提升，亦代表此RNA转译的蛋白质含量的提升。FBN1蛋白质是一种存在于细胞外基质的醣蛋白，会形成微丝使得缔结组织具有弹性。当FBN1蛋白质在真皮层的表现减少时，会影响真皮层的微丝数量。并且，由于微丝会提供轨道主导弹性纤维的集合，因此当 FBN1蛋白质的含量减少时，会影响弹性纤维的集合与合成，进而影响肌肤弹性。

请参阅图1。以FBN1-F(SEQ ID NO:12)及FBN1-R(SEQ ID NO:13)引子测试胜肽实验组(图式以序列编号代表各胜肽实验组)与控制组对于FBN1基因表现。实验发现实验组B(SEQ ID NO:2)、实验组C (SEQ ID NO:3)、实验组D(SEQ ID NO:4)、实验组E(SEQ ID NO:5)、实验组F(SEQ ID NO:6)、实验组G(SEQ ID NO:7)、实验组 H(SEQ ID NO:8)、实验组I(SEQ ID NO:9)、实验组J(SEQ ID NO:10)及实验组K(SEQ ID NO:11)的10组胜肽实验组，相较于控制组的FBN1基因有明显的提升。举例来说，实验组B的FBN1基因表现量为控制组的FBN1基因表现量6倍左右、实验组C的FBN1基因表现量为控制组的FBN1基因表现量3倍左右、实验组D的FBN1基因表现量为控制组的 FBN1基因表现量16倍左右、实验组E的FBN1基因表现量为控制组的 FBN1基因表现量6倍左右、实验组F的FBN1基因表现量为控制组的 FBN1基因表现量5倍左右、实验组G的FBN1基因表现量为控制组的 FBN1基因表现量5倍左右但略高于实验组F、实验组H的FBN1基因表现量为控制组的FBN1基因表现量9倍左右、实验组I的FBN1基因表现量为控制组的FBN1基因表现量4倍左右、实验组J的FBN1基因表现量为控制组的FBN1基因表现量6倍左右以及实验组K的FBN1基因表现量为控制组的FBN1基因表现量5倍左右。因此，当胜肽包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或其组合时，可提高FBN1基因表现，进而提高肌肤弹性。

由于SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:11中所示的10种氨基酸序列皆具有提高FBN1基因表现的能力，因此以其中至少一种氨基酸序列制备的组合物亦可用以提高FBN1基因表现。并且，所制备的组合物可用以促进肌肤胶原蛋白质生成、提升肌肤胶原蛋白质密度、提升肌肤弹性、改善皱纹或其组合。

(四)胜肽实验组及控制组的LOX基因表现分析

LOX基因为离胺基氧化酶(LOX,Lysyl Oxidase)的编码基因，透过观察LOX基因的表现，可分析LOX蛋白质的表现。当LOX基因提升时，其转录的RNA的量提升，亦代表此RNA转译的蛋白质含量的提升。弹性蛋白在弹性纤维中的含量达90％，且是以可溶性弹性蛋白原单体的形式合成并分泌至细胞外。当弹性蛋白与弹性蛋白绑定蛋白结合后，会转移到微纤维的骨架上，并透过LOX蛋白质或类LOX蛋白酶进行醣化反应。借由糖化反应，弹性蛋白单体间的相互凝聚和交联成线状或球状，最终形成不溶性弹性蛋白多聚体，并转变为交联形式。于此，此多聚体具有良好的顺应性和回弹性，赋予弹性纤维的弹性特质，进而影响肌肤弹性。

请参阅图2。以LOX-F(SEQ ID NO:14)及LOX-R(SEQ ID NO:15) 引子测试胜肽实验组(图式以序列编号代表各胜肽实验组)与控制组对于 LOX基因表现。实验发现实验组B(SEQ ID NO:2)、实验组E(SEQ ID NO:5)、实验组I(SEQ ID NO:9)及实验组K(SEQ ID NO:11)的4组胜肽实验组，相较于控制组的LOX基因有明显的提升。举例来说，实验组B 的LOX基因表现量为控制组的LOX基因表现量5.7倍左右、实验组E的 LOX基因表现量为控制组的LOX基因表现量2.5倍左右、实验组I实验组的LOX基因表现量为控制组的LOX基因表现量2.5倍左右且略高于实验组 E，以及实验组K的LOX基因表现量为控制组的LOX基因表现量3倍左右。因此，当胜肽包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或其组合时，可提高LOX基因表现，进而提高肌肤弹性。

由于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:11中所示的4种氨基酸序列皆具有提高LOX基因表现的能力，因此以其中至少一种氨基酸序列制备的组合物亦可用以提高LOX基因表现。并且，所制备的组合物可用以促进肌肤胶原蛋白质生成、提升肌肤胶原蛋白质密度、提升肌肤弹性、改善皱纹或其组合。

(五)胜肽实验组及控制组的TIMP1基因表现分析

TIMP1基因为基质金属蛋白酶组织抑制剂(Tissue inhibitor ofmetalloproteinases 1,TIMP1)的基因，透过观察TIMP1基因的表现，可分析 TIMP1蛋白质的表现。当TIMP1基因提升时，其转录的RNA的量提升，亦代表此RNA转译的蛋白质含量的提升。TIMP1蛋白质具有抗胶原蛋白酶的作用，因此具有保护肌肤胶原蛋白被降解的效果。

请参阅图3。以TIMP1-F(SEQ ID NO:16)及TIMP1-R(SEQ ID NO:17)引子测试胜肽实验组(图式以序列编号代表各胜肽实验组)与控制组对于TIMP1基因表现。实验发现实验组B(SEQ ID NO:2)、实验组F (SEQ ID NO:6)、实验组H(SEQ ID NO:8)、实验组I(SEQ IDNO:9) 及实验组K(SEQ ID NO:11)的5组胜肽实验组，相较于控制组的TIMP1 基因有明显的提升。举例来说，实验组B的TIMP1基因表现量为控制组的TIMP1基因表现量7.8倍左右、实验组F的TIMP1基因表现量为控制组的 TIMP1基因表现量3倍左右、实验组H的TIMP1基因表现量为控制组的 TIMP1基因表现量5倍左右、实验组I的TIMP1基因表现量为控制组的 TIMP1基因表现量3倍左右以及实验组K的TIMP1基因表现量为控制组的 TIMP1基因表现量5倍左右。因此，当胜肽包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或其组合时，可提高 TIMP1基因表现，进而避免肌肤胶原蛋白流失。

由于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及 SEQ ID NO:11中所示5种氨基酸序列皆具有提高TIMP1基因表现的能力，因此以其中至少一种氨基酸序列制备的组合物亦可用以提高TIMP1基因表现。并且，所制备的组合物可用以避免肌肤胶原蛋白质流失、用以改善皱纹或其组合。

(六)胜肽实验组及控制组的MMP2基因表现分析

MMP2基因为基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinase-2,MMP2)的基因，透过观察MMP2基因的表现，可分析MMP2蛋白质的表现。当 MMP2基因下降时，其转录的RNA的量下降，亦代表此RNA转译的蛋白质含量的下降。由于细胞外基质结构的改变与维持的动态平衡受到锌依赖的肽链内切酶的影响，而相关的肽链内切酶即为基质金属蛋白酶(MMP)及MMP组织抑制剂。并且，MMP蛋白质可降解弹性纤维蛋白。举例来说，已知的MMP蛋白质有8种(如，MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、 MMP10、MMP12、MMP13及MMP14)，其中MMP2、MMP7、MMP9、 MMP10、MMP12及MMP14蛋白质均能降解不溶性的弹性蛋白为可溶性的胜肽片段；MMP2、MMP3、MMP9、MMP12及MMP13蛋白质均能分解代谢原纤维蛋白微纤维和缩胺酸。因此。抑制MMP2蛋白质的表现可避免弹性纤维蛋白被降解，进而避免胶原蛋白流失。

请参阅图4。以MMP2-F(SEQ ID NO:18)及MMP2-R(SEQ ID NO:19)引子测试胜肽实验组(图式以序列编号代表各胜肽实验组)与控制组对于MMP2基因表现。实验发现实验组B(SEQ ID NO:2)、实验组C (SEQ ID NO:3)、实验组E(SEQ ID NO:5)及实验组J(SEQ ID NO:10) 的4组胜肽实验组，相较于控制组的MMP2基因有明显的下降。举例来说，实验组B、实验组E及实验组J的TIMP1基因表现百分比相较于控制组的MMP2基因表现百分比(控制组视为100％表现)均下降至10％以下。换言之，实验组B、实验组E及实验组J抑制MMP2基因表现达90％以上。再者，实验组C相较于控制组的MMP2基因表现百分比(控制组视为 100％表现)下降至40％左右。换言之，实验组C抑制MMP2基因表现达 60％左右。因此，当胜肽包括SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10或其组合时，可抑制MMP2基因表现，进而避免肌肤胶原蛋白流失。

由于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:10中所示的4种氨基酸序列皆具有抑制MMP2基因表现的能力，因此以其中至少一种氨基酸序列制备的组合物亦可用以抑制MMP2基因表现。并且，所制备的组合物可用以降低肌肤胶原蛋白质、降低肌肤水分流失、用以改善皱纹或其组合。

接着，对组合物实验组(即实验组L，图式以实验组表示)及控制组 (即对照组，图式以对照组表示，后称对照组)进行COL4A1基因 (GeneID：1282)、HAS2基因(GeneID：3037)、TIMP1基因 (GeneID：7076)、ELN基因(GeneID：2006)及LOX基因(GeneID： 4015)的基因表现分析，如图5至图8所示。

(七)组合物实验组及对照组的COL4A1基因表现分析

COL4A1基因为第四型胶原蛋白(Collagen Type IV Alpha 1Chain)的基因。因此，当COL4A1基因的基因表现提升，代表第四型胶原蛋白的含量提升，进而能提高肌肤中的胶原蛋白含量。

请参阅图5。以COL4A1-F(SEQ ID NO:20)及COL4A1-R(SEQ ID NO:21)引子测试即实验组L与对照组对于COL4A1基因表现。实验发现实验组L相对于对照组的基因表现明显提高。举例来说，实验组L的 COL4A1基因表现量为对照组的COL4A1基因现量的11倍。于此，组合物可提高COL4A1基因表现，并用以促进肌肤胶原蛋白质生成及提升肌肤胶原蛋白质密度，进而提升肌肤弹性。由此，组合物可用以改善皱纹。

(八)组合物实验组及对照组的HAS2基因表现分析

HAS2基因为玻尿酸合成酶(Hyaluronan synthase 2,HAS2)的基因，透过观察HAS2基因的表现，可分析HAS2蛋白质的表现。当HAS2基因提升时，其转录的RNA的量提升，亦代表此RNA转译的蛋白质含量的提升。 HAS2蛋白质用以合成玻尿酸，可提高肌肤的含水量及维持肌肤细胞结构，进而改善皱纹。

请参阅图6。以HAS2-F(SEQ ID NO:22)及HAS2-R(SEQ ID NO:23)引子测试实验组L与对照组对于HAS2基因表现。实验发现实验组 L相对于对照组的基因表现明显提高。举例来说，实验组L的HAS2基因表现量为对照组的HAS2基因现量的5倍。于此，组合物可提高HAS2基因表现，并用以提高肌肤含水量。由此，组合物可用以改善皱纹。

(九)组合物实验组及对照组的TIMP1基因表现分析

请参阅图7。以TIMP1-F(SEQ ID NO:16)及TIMP1-R(SEQ ID NO:17)引子测试实验组L与对照组对于TIMP1基因表现。实验发现实验组L相对于对照组的基因表现明显提高。举例来说，实验组L的TIMP1基因表现量为对照组的TIMP1基因现量的3倍。于此，组合物可提高TIMP1 基因表现，并用以避免肌肤胶原蛋白流失。由此，组合物可用以改善皱纹。

(十)组合物实验组及对照组的ELN基因及LOX基因表现分析

ELN基因为弹力蛋白(Elastin,ELN)的基因，而LOX基因为离胺基氧化酶(LOX,Lysyl Oxidase)的基因。其中，弹力蛋白(ELN蛋白)可与弹性蛋白结合，而LOX蛋白可与胶原蛋白及弹性纤维结合。因此，透过观察 ELN基因及LOX基因的表现，可观察二蛋白质在肌肤的表现量。并且，当二蛋白质的含量提高，皆有利于提高肌肤的弹性。

请参阅图8。以ELN-F(SEQ ID NO:24)及ELN-R(SEQ ID NO:25) 引子测试实验组L及对照组的ELN基因的表现，并透过LOX-F(SEQ ID NO:14)及LOX-R(SEQ ID NO:15)引子测试实验组L及对照组的LOX基因的表现。实验发现实验组L相对于对照组的ELN基因及LOX基因的基因表现均上升。举例来说，当对照组的ELN基因表现量为100％时，实验组L 的ELN基因表现量116％。当对照组的LOX基因表现量为100％时，实验组L的LOX基因表现量112％。于此，组合物可提高ELN基因及LOX基因的基因表现，并可用以促进胶原蛋白质生成、提升肌肤胶原蛋白质密度、提升肌肤弹性、用以改善皱或其组合。

为进一步确认以组合物对于人类肌肤的影响。以包括11种氨基酸序列 (即SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:11)的胜肽制备组合物。并且，以下测试人体功效的实验所使用的组合物是经由范例一及范例二鉴定包含有11种氨基酸序列(即SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11)的胜肽的罗非鱼的鱼皮胶原胜肽粉(购自LAPI,Italy)。

(十一)实验组别与实验设计

透过受试者每日服用组合物或市售鱼胶原蛋白，并于服用4周后，以仪器(VISIAComplexion Analysis(Canfield Scientific,Inc.,USA)及Combo胶原蛋白探头仪器)观察受试者的肌肤状况(皱纹、水分流失、肌肤弹性及胶原蛋白密度)，进而观察组合物或市售鱼胶原蛋白对于肌肤的影响。

受试者有15人，分为服用组合物的实验组(8人)及服用市售鱼胶原蛋白的对照组(7人)。并且，受试者须每日服用3g的组合物或市售鱼胶原蛋白并连续服用4周。此外，需要特别说明的是，所称「市售鱼胶原蛋白」并非以罗非鱼的鱼皮制备。

(十二)人体功效

测试结果以第0周及第4周的数值一起比较。第0周为测试前量测的数值，代表受试者所有人均未服用组合物或市售鱼胶原蛋白的肌肤状态，并将第0周量测的数值视为100％。第4周为连续服用四周后的数值。需要说明的是，实验对应的图式中的肌肤状况是以相对百分比呈现，其中使用Excel 软件的STDEV公式计算标准偏差，并在Excel软件中以单尾学生t检验(Student t-test)分析是否具有统计上的显着差异。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当p 值小于0.05代表具有统计上的差异。

请参阅图9。实验发现对照组在连续服用4周的市售鱼胶原蛋白皱纹并未减少，而实验组在连续服用组合物后相较于第0周时肌肤皱纹显着下降 11％(为89％)。接着，请参阅图10及图11，在第0周时，实验组的受试者眼下的皱纹WK-0较多且分布较密集，如图10所示。在第4周时，实验组的受试者眼下的皱纹WK-4减少且分布较稀疏，如图11所示。于此，相较于对照组，服用实验组的组合物可有效改善皱纹(如，减少皱纹)。

此外，进一步比较实验组及对照组的数值，如水分流失百分比(如图 12所示)、肌肤弹性百分比(如图13所示)及肌肤胶原蛋白密度(如图14 所示)。

请参阅图12，借由比较实验组的第0周及第4周的水分流失百分比，可发现数值从100％下降到71.7％，代表8位受试者的肌肤水分流失情形改善28.9％。相反地，比较比较对照组的第0周及第4周的水分流失百分比时发现数值从100％下降到90.4，则代表7位受试者的肌肤水分流失情形未有显着改善。

请参阅图13，借由比较实验组的第0周及第4周的肌肤弹性百分比，可发现第4周的数值相较于第0周提高了8.6％，代表8位受试者的肌肤弹性提高。并且，比较对照组的第0周及第4周的肌肤弹性百分比时发现第4 周的数值相较于第0周提高了5.7％。换言之，组合物改善肌肤弹性的情形高于市售鱼胶原蛋白。

请参阅图14，借由比较实验组及对照组的第0周及第4周肌肤胶原蛋白密度，可发现实验组的第4周的数值相较于其第0周的数值提高37.6％，而对照组第4周的数值相较于其第0周的数值提高32.5％，代表组合物改善肌肤胶原蛋白密度的效果较市售鱼胶原蛋白明显。于此，相较于对照组，服用组合物的实验组可有效提高受试者的胶原蛋白密度。

于此，借由包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一氨基酸序列的胜肽制备组合物，此组合物至少具有调节FBN1基因、LOX基因、 TIMP1基因及MMP2基因中至少一项基因表现的能力。并且，当组合物以包括11种胜肽(氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11)的胜肽制备时，此组合物更具有调节COL4A1基因、HAS2基因、TIMP1基因、ELN基因及LOX基因中至少一项基因表现的能力。并且，以具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一氨基酸序列的胜肽所制备的组合物可具有下列至少一种功用：促进肌肤胶原蛋白质生成、提升肌肤胶原蛋白质密度、避免肌肤胶原蛋白质流失、降低肌肤水分流失、提升肌肤弹性及改善皱纹。

综上，根据本发明任一实施例的作为生物活性物质的胜肽，其可制备改善皮肤状态的组合物，且胜肽包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11中所示的至少一氨基酸序列。在一些实施例中，胜肽可调节FBN1基因、LOX基因、TIMP1基因及MMP2基因中至少一基因的表现，且其所制备的组合物亦可调节FBN1基因、LOX基因、TIMP1基因及MMP2基因中至少一基因的表现的组合物。在一些实施例中，所制备组合物更可用于调节COL4A1 基因、HAS2基因及ELN基因的表现。在一些实施例中，所制备的组合物可用于促进肌肤胶原蛋白质生成、提升肌肤胶原蛋白质密度、避免肌肤胶原蛋白质流失、降低肌肤水分流失、提升肌肤弹性、改善皱纹或其组合。

虽然本发明的技术内容已经以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神所作些许的更动与润饰，皆应涵盖于本发明的范畴内，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

【序列表】

<110>大江生医股份有限公司

<120>生物活性物质用于制备改善皮肤状态的组合物的用途

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212>PRT

<213> Oreochromis mossambicus

<400> 1

Gly Phe Asp Ile Gly Phe Ile

1 5

<210> 2

<211> 9

<212>PRT

<213> Oreochromis mossambicus

<400> 2

Gly Leu Pro Gly Val Gln Gly Asn Ile

1 5

<210> 3

<211> 12

<212>PRT

<213> Oreochromis mossambicus

<400> 3

Ile Gly Ile Phe Gly Gln Thr Gly Pro Pro Gly Glu

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212>PRT

<213> Oreochromis mossambicus

<400> 4

Pro Gly Pro Met Gly Pro Met Gly Ile Asn Gly Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 20

<212>PRT

<213> Oreochromis mossambicus

<400> 5

Ala Val Asn Gly Leu Thr Leu Ala Gly Gly Arg Gly Leu Asn Thr Gly

1 5 10 15

Ala Ala Leu Thr

20

<210> 6

<211> 9

<212>PRT

<213> Oreochromis mossambicus

<400> 6

Ala Leu Val Gln Asn Arg Glu Gly Pro

1 5

<210> 7

<211> 15

<212>PRT

<213> Oreochromis mossambicus

<400> 7

Asn Gly Leu Pro Gly Ser Pro Gly Leu Pro Gly Arg Gln Gly Glu

1 5 10 15

<210> 8

<211> 21

<212>PRT

<213> Oreochromis mossambicus

<400> 8

Pro Gly Gln Pro Gly Leu Ser Gly Val Pro Gly Ala Asp Gly Lys Pro

1 5 10 15

Gly Leu Pro Gly Pro

20

<210> 9

<211> 7

<212>PRT

<213> Oreochromis mossambicus

<400> 9

Met Phe Gly Lys Asp Val Trp

1 5

<210> 10

<211> 7

<212>PRT

<213> Oreochromis mossambicus

<400> 10

Asp Gln Gly Ile Arg Leu Leu

1 5

<210> 11

<211> 11

<212>PRT

<213> Oreochromis mossambicus

<400> 11

Gln Arg Gly Glu Pro Gly Pro Asn Gly Ala Val

1 5 10

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220> primer

<223> FBN1-F

<400> 12

tttagcgtcc tacacgagcc 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220> primer

<223> FBN1-R

<400> 13

ccatccaggg caacagtaag c 21

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220> primer

<223> LOX-F

<400> 14

cggcggagga aaactgtct 19

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220> primer

<223> LOX-R

<400> 15

tcggctgggt aagaaatctg a 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220> primer

<223> TIMP1-F

<400> 16

agagtgtctg cggatacttc c 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220> primer

<223> TIMP1-R

<400> 17

ccaacagtgt aggtcttggt g 21

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220> primer

<223> MMP2-F

<400> 18

gatacccctt tgacggtaag ga 22

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220> primer

<223> MMP2-R

<400> 19

ccttctccca aggtccatag c 21

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220> primer

<223> COL4A4-F

<400> 20

ctgggtgctg tgtgttttga 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220> primer

<223> COL4A4-R

<400> 21

tgagtcttgt tttgccctgc 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220> primer

<223> HAS2-F

<400> 22

cggtgctcca aaaaggcaaa 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220> primer

<223> HAS2-R

<400> 23

acacaatgag ttgggcgaga 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220> primer

<223> ELN-F

<400> 24

gctaaggcag ccaagtatgg 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220> primer

<223> ELN-R

<400> 25

cacctgggac aactggaatc 20

Claims

1.一种生物活性物质用于制备改善皮肤状态的组合物的用途，其中生物活性物质为一胜肽，该胜肽是SEQ ID NO:10至SEQ ID NO:11中所示的至少一氨基酸序列，其中各该氨基酸序列为一鱼皮的胜肽片段，其中该组合物包括用以调节至少一基因的该胜肽，该至少一基因包括HAS2、FBN1、LOX及ELN中至少一项基因，且该组合物用以降低肌肤水分流失及提升肌肤弹性；其中，提升该LOX基因的表现的该胜肽是该SEQ ID NO:11所示的该氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的用途，其中该至少一基因更包括该FBN1及COL4A1中至少一项基因，且该组合物更用以促进肌肤胶原蛋白质生成并提升肌肤胶原蛋白质密度；其中，提升该FBN1基因的表现的该胜肽是该SEQ ID NO:10至该SEQ ID NO:11中所示的该至少一氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的用途，其中该至少一基因更包括TIMP1及MMP2中至少一项基因，且该组合物更用以避免肌肤胶原蛋白质流失；其中，提升该TIMP1基因的表现的该胜肽是该SEQ ID NO:11所示的该氨基酸序列；其中，抑制该MMP2基因的表现的该胜肽是该SEQ IDNO:10所示的该氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的用途，其中该至少一基因更包括TIMP1、COL4A1、及MMP2中至少一项基因，且该组合物更用以改善皱纹；其中，该胜肽是该SEQ ID NO:10至该SEQ ID NO:11中所示的该至少一氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的用途，其中该鱼皮为罗非鱼鱼皮。

6.如权利要求1所述的用途，其中该鱼皮的胜肽片段的来源包括鱼皮细胞、鱼皮胶原蛋白或鱼肉细胞。