KR101999283B1 - 이관능성 펩티드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 콜라겐의 합성을 활성화하고 매트릭스 메탈로-프로테이나아제의 생성을 억제할 수 있는 이관능성 펩티드로서, 하기 3개의 펩티드 부분 A, B 및 C를 포함하는 서열을 갖는 이관능성 펩티드에 관한 것이다:
- 3회 이상 반복되는 헥사펩티드에 상응하는 제1의 펩티드 부분 A, 상기 부분 A는 콜라겐 합성을 촉진하기 위해 수용체 엘라스틴-결합 단백질에 결합할 수 있음,
- 유로키나아제 프로테아제의 경쟁적 억제제로서 작용할 수 있고 상기 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 테트라펩티드에 상응하는 제2의 펩티드 부분 B, 및
- 매트릭스 메탈로-프로테이나아제의 억제를 허용하기 위해 매트릭스 메탈로-프로테이나아제의 하나 이상의 활성 부위를 점유하는 트리펩티드에 상응하는 제3의 펩티드 부분 C. 본 발명은 추가로 상기 이관능성 펩티드를 포함하는 화장용 및/또는 약학 조성물에 관한 것이다.
- 3회 이상 반복되는 헥사펩티드에 상응하는 제1의 펩티드 부분 A, 상기 부분 A는 콜라겐 합성을 촉진하기 위해 수용체 엘라스틴-결합 단백질에 결합할 수 있음,
- 유로키나아제 프로테아제의 경쟁적 억제제로서 작용할 수 있고 상기 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 테트라펩티드에 상응하는 제2의 펩티드 부분 B, 및
- 매트릭스 메탈로-프로테이나아제의 억제를 허용하기 위해 매트릭스 메탈로-프로테이나아제의 하나 이상의 활성 부위를 점유하는 트리펩티드에 상응하는 제3의 펩티드 부분 C. 본 발명은 추가로 상기 이관능성 펩티드를 포함하는 화장용 및/또는 약학 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 화장 및 약학 분야에 적용할 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 특히 피부 노화에 의해 영향을 받은 진피 조직의 복구 또는 재생 분야에 주로 적용할 수 있다.
피부 노화는 피부의 최내부 층을 구성하는 진피의 세포외부 매트릭스의 성분의 합성 통제 매카니즘 및 분해 사이의 다소 큰 불균형으로 인한 것이다. 그러므로, 피부 노화가 진피의 세포외부 매트릭스에서 관찰되는 동안, 한편으로는 특정 거대분자, 즉 콜라겐 및 엘라스틴의 합성은 감소하고 다른 한편으로는, 매트릭스 메탈로-프로테이나아제 또는 MMP와 같은 특정 효소의 발현은 증가한다. MMP는 콜라겐분해 및 엘라스틴분해 활성을 나타내며, 따라서, 진피 매트릭스의 거대분자의 분해에 기여한다. 그 결과, 진피는 탄력을 잃고, 피부가 늘어져서, 주름의 형성을 야기한다. 상기 현상은 또한 외부 인자, 예컨대 자외선, 오염물질, 스트레스 또는 또한 담배에 대한 노출에 의해 증폭될 수 있다.
종래에는, 주름 형성을 늦추게 하는 것을 목표로 하는 전략들이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 전략은 즉, 하기로 이루어진다:
- 필링 또는 박피, 이는 피부의 두께를 감소시키기 위한 피부에 대한 공격적인 치료에 해당함;
- 히알루론산 또는 보툴리늄 독소의 주름방지 주사, 이들은 각각, 주름-메움 효과 및 일시적으로 주름을 감소시키는 표적화된 근육 마비를 가짐; 그러나 상기 기술은 비싸고 오직 단기간의 효과만 나타냄;
- 보습제, 주름방지 또는 완화 크림과 같은 표면 처리의 적용, 이는 주름의 형성을 늦추나 이미 형성된 주름을 교정하지는 못함;
- 자가 줄기 세포 기반의 요법, 이는 아직 여전히 거의 통제되지 않음.
수년 전부터, 피부 노화 영향에 대항하기 위해 실험실에서 다른 전략들이 수행되고 있다.
특히, 화학적 화합물, 예컨대 N-아실아미노아미드 유도체의 사용이 유럽 특허 출원 EP 1 275 372에 제공된다. 더욱 구체적으로는, 상기 문헌은 상기 언급된 N-아실아미노아미드 외에, 메탈로프로테이나아제 억제 단백질(이는 콜라겐의 분해에 관여함)이 도입된 조성물을 기재하고 있다.
그러나, 이러한 해법은 최적의 것이 아닌데, 특히 이것이 한편으로는 여러 화합물의 조합을 필요로 하는 반면, 다른 한편으로는 콜라겐의 합성에 대해 긍정적으로 작용하는 것을 가능하게 하지 않기 때문이다.
특정 펩티드 유도체의 용도도 또한 피부 노화 증상을 방지하기 위해 개발되었다.
그러므로, 예를 들어, FR 285489로부터 펩티드 유도체(이것은 엘라스틴 단백질로부터 기인함)를 포함하는 화장 조성물이 공지되었다. 더욱 특히, 펩티드 유도체는 하기 서열 R1-(AA)n-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-OR2를 가질 수 있다:
- R1은 H 또는 2 내지 22개의 탄소를 포함하는 알킬 사슬에 상응하고,
- (AA)n은 임의의 아미노산 또는 아미노산 유도체로 이루어진 AA를 갖는 펩티드 사슬에 상응하고, 이때 n은 0 내지 3이고,
- R2는 H 또는 1 내지 24개의 탄소를 포함하는 알킬 사슬에 상응함.
이러한 펩티드 유도체를 포함하는 화장 조성물은 퍼밍(firming) 및 재건 효과를 가능하게 한다.
그러나, 이러한 펩티드 유도체 또는 상기 유도체를 포함하는 조성물은 콜라겐(이것은 신체의 조직, 및 즉 진피의 세포외부 매트릭스의 주요 단백질을 구성함)의 분해에 관여하는 MMP 프로테이나아제의 활성 및/또는 발현을 억제하지 못한다. 콜라겐은 조직에 인장력에 대한 저항성을 부여할 수 있다. 그러므로, 상기 언급된 문헌에 기재된 펩티드는 피부 탄력을 보호하기 위해 필수적인 상기 단백질의 분해를 방지할 수 없다.
WO 2006053688로부터 또한 여러 펩티드를 포함하는 조성물이 공지되어 있고 주름방지 처리에 사용된다. 특히, 상기 조합의 상기 펩티드는 콜라겐 및/또는 피브로넥틴의 합성 과정의 여러 단계에 관여한다(즉, 상기 합성을 촉진함으로써).
DE 10 2004 055 541에는 차례로 성장 인자 TGF-β(이것은 콜라겐의 합성을 유도할 수 있음)의 분비를 촉진하기 위해 펩티드의 조합을 포함하는 조성물이 기재되어 있다.
그러나, 상기 특허 문헌에 기재된 펩티드는 상기 언급된 바와 동일한 단점, 즉, 그곳에 제안된 서열이 세포외부 매트릭스의 단백질, 및 특히 콜라겐의 분해를 담당하는 효소의 발현을 감소시키지 못한다는 사실을 갖는다.
본 발명은 콜라겐의 합성의 촉진 특성 및 콜라겐의 분해 케스케이드에 관여하는 프로테이나아제의 억제 특성을 모두 갖는 이관능성 펩티드를 제공함으로써 종래 기술의 다양한 단점을 극복하는 가능성을 제공한다.
이를 위해, 본 발명은 콜라겐의 합성을 활성화하고 매트릭스 메탈로-프로테이나아제의 생성을 억제할 수 있는 이관능성 펩티드로서, 하기 3개의 펩티드 부분 A, B 및 C를 포함하는 서열을 갖는 이관능성 펩티드에 관한 것이다:
- 3회 이상 반복되는 헥사펩티드에 상응하는 제1의 펩티드 부분 A, 상기 부분 A는 콜라겐 합성을 촉진하기 위해 엘라스틴-결합 수용체 단백질에 결합할 수 있음,
- 유로키나아제 프로테아제의 경쟁적 억제제로서 작용할 수 있고 상기 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 테트라펩티드에 상응하는 제2의 펩티드 부분 B, 및
- 매트릭스 메탈로-프로테이나아제의 억제를 허용하기 위해 매트릭스 메탈로-프로테이나아제의 하나 이상의 활성 부위를 점유하는 트리펩티드에 상응하는 제3의 펩티드 부분 C.
유리하게는, 콜라겐 합성을 촉진하는 제1의 펩티드 부분 A는 X1-Gly-X2-X3-Pro-Gly 서열을 가지며, 상기 서열이 다음과 같고, 3회 이상 반복된다:
- 임의의 아미노산에 상응하는 X1,
- Val, Thr, Gln, Ala, Leu로부터 선택되는 아미노산에 상응하는 X2,
- Ala, Leu, Ile로부터 선택되는 아미노산에 상응하는 X3.
더욱 유리하게는, 상기 펩티드의 제1의 펩티드 부분 A는 Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly 서열을 갖는다.
바람직하게는, 프로테아제에 의해 절단 가능한 제2의 펩티드 부분 B는 Arg-Y1-Arg-Y2 서열을 갖고, 상기 Y1 및 Y2는 각각 Ser, Tyr, Gly, Ala, Arg, Val, Leu로부터 선택되는 아미노산에 상응한다.
더욱 바람직하게는, 상기 펩티드의 제2의 펩티드 부분 B는 Arg-Val-Arg-Leu 서열을 갖는다.
관심있는 구현예에 따르면, 매트릭스 메탈로-프로테이나아제의 억제를 허용하는 제3의 부분 C는 하기의, Z1-Ile-Z2 서열을 갖는다:
- Gly, Ile, Leu로부터 선택되는 아미노산에 상응하는 Z1, 및
- Leu, Phe, Ala, Ile, Val로부터 선택되는 아미노산에 상응하는 Z2.
더 더욱 유리하게는, 상기 펩티드의 제3의 펩티드 부분 C는 Gly-Ile-Leu 서열을 갖는다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 펩티드는 서열번호 1에 상응하는 하기 S1 서열을 갖는다:
S1: N-(Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)n-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu-OH,
이 때 N 및 OH는 각각 상기 펩티드의 N-말단 및 C-말단에 상응하고,
n = 3임.
그러나, 본 발명에 따른 이관능성 펩티드의 서열은 또한 서열번호 2 내지 서열번호 26 중 하나에 상응할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 이관능성 펩티드는 화학적 합성에 의해 수득된다. 또한, 상기 펩티드는 유리하게는 동결건조 형태로 보존될 수 있다.
유리하게는, 본 발명에 따른 이관능성 펩티드는 만성 흉터 질환의 치료, 즉 욕창 또는 궤양의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 이관능성 펩티드는 또한 진피 조직의 복구 및/또는 재생을 위해, 즉 피부 노화의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 이관능성 펩티드를 포함하는 화장용 및/또는 약학 조성물에 관한 것이다.
바람직하게는, 화장 조성물 중의 이관능성 펩티드의 농도는 10μg/mL 내지 lmg/mL, 바람직하게는 실질적으로 100μg/mL이다.
본 발명에 따른 이관능성 펩티드는 많은 장점을 갖는다. 한편으로는, 이것은 콜라겐 단백질의, 즉 유형 I 및 유형 III 콜라겐의 합성의 촉진을 허용한다. 상기 유형 III의 콜라겐의 생성 증가가 특히 흥미롭다; 실제로, 상기 유형의 콜라겐은 "태아" 유형 콜라겐으로서 불리는데, 이것이 태아 단계 및 어린 시절 동안 주로 합성되기 때문이다. 상기 유형의 콜라겐은 특히, "완벽한" 치료로서 불리는, 조직의 최적 치유를 가능하게 한다. 한편, 상기 펩티드는 프로테아제에 의한 콜라겐분해를 감소시키게 한다. 게다가, 콜라겐 합성의 촉진 및 메탈로-프로테이나아제의 억제가 이관능성 펩티드의 펩티드 부분 A 및 C(부가적으로, 2개의 다른 부분을 연결하고 유로키나아제에 의해 절단될 수 있는 펩티드 부분 B를 포함함) 각각 덕분에, 동시에 수득된다. 그 결과, 본 발명에 따른 펩티드는 약 25개의 아미노산의 짧은 서열을 가질 수 있고, 이것은 펩티드의 화학적 합성을 용이하게 한다.
본 발명의 추가의 특징 및 장점은 하기와 같은, 첨부된 도면을 참조로 하여, 본 발명의 비제한적인 구현예의 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다:
- 도 1은 본 발명에 따른 펩티드의 작용 메커니즘의 도식 표현이다.
- 도 2는 플라즈미노겐/플라즈민 시스템의 효소 케스케이드의 도식 표현이다.
- 도 3a 및 3b는 100μg/ml의 농도의 본 발명에 따른 펩티드 또는 동일 펩티드의 분절로 처리된 섬유아세포에 의한, 유형 I 및 유형 III 콜라겐 각각의 합성을 나타내는 막대그래프에 해당한다.
- 도 4는 본 발명에 따른 펩티드 또는 동일 펩티드의 분절로 처리된 진피 섬유아세포의 배양물 내에서, 유형 I 및 유형 III 콜라겐을 각각 코딩하는 COL1A1 및 COL3A1 유전자의 유전자 발현을 막대그래프 형태로 제시한다.
- 도 5는 환자의 연령(35, 42 및 53세)에 따른, 상기 환자로부터의 진피 섬유아세포로부터 유형 I 및 III 콜라겐 각각의 단백질 발현에 대한 본 발명에 따른 이관능성 펩티드의 효과를 나타낸다.
- 도 6a 및 6b는 합성 기질에 관해 유로키나아제 활성에 대한 이관능성 펩티드의 효과를 나타낸다.
- 도 7a 및 7b는 합성 기질에 관해 MMP-1의 활성에 대한 이관능성 펩티드의 효과를 나타낸다.
- 도 8a 및 8b는 유로키나아제를 이용한 치료와 함께 및 치료 없이 각각 본 발명에 따른 펩티드의 용리 프로파일을 나타낸다.
- 도 1은 본 발명에 따른 펩티드의 작용 메커니즘의 도식 표현이다.
- 도 2는 플라즈미노겐/플라즈민 시스템의 효소 케스케이드의 도식 표현이다.
- 도 3a 및 3b는 100μg/ml의 농도의 본 발명에 따른 펩티드 또는 동일 펩티드의 분절로 처리된 섬유아세포에 의한, 유형 I 및 유형 III 콜라겐 각각의 합성을 나타내는 막대그래프에 해당한다.
- 도 4는 본 발명에 따른 펩티드 또는 동일 펩티드의 분절로 처리된 진피 섬유아세포의 배양물 내에서, 유형 I 및 유형 III 콜라겐을 각각 코딩하는 COL1A1 및 COL3A1 유전자의 유전자 발현을 막대그래프 형태로 제시한다.
- 도 5는 환자의 연령(35, 42 및 53세)에 따른, 상기 환자로부터의 진피 섬유아세포로부터 유형 I 및 III 콜라겐 각각의 단백질 발현에 대한 본 발명에 따른 이관능성 펩티드의 효과를 나타낸다.
- 도 6a 및 6b는 합성 기질에 관해 유로키나아제 활성에 대한 이관능성 펩티드의 효과를 나타낸다.
- 도 7a 및 7b는 합성 기질에 관해 MMP-1의 활성에 대한 이관능성 펩티드의 효과를 나타낸다.
- 도 8a 및 8b는 유로키나아제를 이용한 치료와 함께 및 치료 없이 각각 본 발명에 따른 펩티드의 용리 프로파일을 나타낸다.
예비적이고 정보적인 지시에 의해, 본 명세서는 아미노산을 지칭하기 위해 국제적인 3자리 문자 코드를 사용한다. 그러므로, Ala은 알라닌(A), Cys는 시스테인(C), Asp는 아스파르트산(D), Glu는 글루탐산(E), Phe는 페닐알라닌(F), Gly는 글리신(G), His는 히스티딘(H), Ile은 이소류신(I), Lys은 리신(K), Leu는 류신(L), Met는 메티오닌(M), Asn은 아스파라긴(N), Pro는 프롤린(P), Gln는 글루타민(Q), Arg은 아르기닌(R), Ser은 세린(S), Thr은 트레오닌(T), Val은 발린(V), Trp은 트립토판(W), 및 Tyr은 티로신(Y)에 해당한다.
피부 노화 및 그로부터의 주름 형성은 세포 및 분자 수준에서, 콜라겐 또는 엘라스틴과 같은 세포외부 매트릭스의 조성물 내로 들어가는 거대분자의 합성을 담당하는 유전자의 발현의 감소를 특징으로 한다. 또한, 상기 매트릭스 단백질의 생성 감소는 통상 매트릭스 단백질의 분해를 담당하는 효소의 과-발현을 동반하는데; 상기 효소인 매트릭스 메탈로-프로테이나아제 또는 MMP는 그러므로 부분적으로 진피의 수준에서 탄력의 감소, 피부의 늘어짐을 담당하고, 결국에는 주름의 형성을 야기한다.
콜라겐 단백질은 신체 조직의 세포외부 매트릭스의 구성에 있어 두드러진 단백질이다. 특히, 콜라겐은 피부의 고체 지지체를 구성하고 영양분 및 온도-조절 역할, 및 병원성 미생물에 대항하는 방어의 역할을 모두 수행하며, 진피의 수준에서 약 90% 존재한다. 진피는 주로 소위 섬유아세포라 불리는 세포로 형성되며, 이는 즉 콜라겐의 합성 뿐만 아니라, 세포외부 매트릭스의 조직에도 역할을 한다.
그러므로, 세포외부 매트릭스의 구성은 콜라겐, 또한 엘라스틴, 구조적 당단백질 및 프로테오글리칸으로 형성된다. 더욱 특히, 진피 매트릭스에는 유형 I 및 III 콜라겐의 피브릴 및 유형 V 콜라겐의 코어가 포함된다.
상기 콜라겐은 소위 MMP 단백질에 의해 분해되는 것 같고, 그 계열에는 적어도 26개의 일원이 포함된다. 더욱 특히, 상기 단백질은 엔도펩티다아제(즉, 단백질 내의 펩티드 결합을 절단시킴)에 해당한다.
과학자에 의해 수행된 연구(Voorhes et al., Hornebeck et al., 2009)는 피부 세포, 섬유아세포의 노화는, 상기 엔도펩티다아제(즉 MMP-1과 관련하여)의 증가된 발현을 특징으로 한다는 것을 입증할 수 있었다. MMP-1은 세포간 콜라게나아제의 그룹에 속하며, 유형 I 및 III 콜라겐의 단백질의 절단을 담당한다. MMP-1은 이것이 연령순이든 광유도성이든 관계 없이, 피부 노화에 관여하는 주요 콜라게나아제인 것으로 고려된다.
그러므로, 분해 효소, 즉 MMP-1의 증가와 연관된 진피 매트릭스 단백질, 즉 콜라겐의 감소는 피부 노화에 관연하는 중요한 요소이고, 이것이 피부 탄력의 감소와 가시적인 주름의 형성을 야기한다.
그러므로, 진보성과 관련하여, 본 출원인은 복합 기능을 갖고, 콜라겐 분자의 합성 과정 수준 뿐만 아니라 상기 많은 분자의 분해의 케스케이드의 상이한 수준에서 모두 작용하는 것을 가능하게 하는 펩티드를 개발하였다.
그리고, 특히 유리한 방식으로, 본 발명에 따른 이관능성 펩티드는 세포외부, 즉 진피 패트릭스의 동화작용(합성) 및 이화작용(분해) 과정 사이의 균형 복구를 촉진하는 특징을 갖는다.
특히 바람직한 방식으로, 본 발명에 따른 펩티드는 이관능성이고, 하기 3가지 부분으로 나뉠 수 있는 서열을 포함한다:
- 부분 A라고 언급되는 제1의 펩티드 부분, 이것은 유리하게는 콜라겐 합성을 증가시키는 능력을 가짐;
- 부분 B라고 언급되는 제2의 펩티드 부분, 이것은 바람직하게는 프로테아제, 유로키나아제에 의해 인지되는 서열을 갖고, 따라서 상기 펩티드 부분 B는 상기 프로테아제에 의해 절단될 수 있음;
- 부분 C라고 언급되는 제3의 펩티드 부분, 이것은 MMP의 억제를 가능하게 함.
그러므로 본 발명에 따른 펩티드는 한편으로는 콜라겐 합성을 촉진하고 다른 한편으로는 유로키나아제 및 MMP 프로테아제, 즉 MMP-1을 억제함으로써 상기 콜라겐의 분해를 감소시킬 수 있다.
더욱 특히, 콜라겐 합성 증가를 가능하게 하는 펩티드 부분 A는 헥사펩티드, 즉, 6개의 아미노산 잔기의 연속으로 이루어진다. 유리하게는, 상기 헥사펩티드는 본 발명에 따른 이관능성 펩티드 내에서 3회 이상 반복된다.
더욱 바람직하게는, 이관능성 펩티드의 펩티드 부분 A는 하기 서열을 갖는다: X1-Gly-X2-X3-Pro-Gly(상기 X1, X2 및 X3은 아미노산에 상응함). 상기에서 언급된 바와 같이, 본 헥사펩티드 서열 Xl-Gly-X2-X3-Pro-Gly는 본 발명에 따른 펩티드 내에서 3회 이상 반복된다. 실제로, 일부 연구는 상기 서열의 3회 이상 반복이 서열의 활성이라는 측면에서 상이한, 심지어 더욱 흥미로운 결과를 제공하였다는 것을 보여주었다(Alix 2001).
흥미로운 구현예에 따르면, 펩티드 부분 A의 X1 잔기는 임의의 아미노산에 상응한다. 차례로 잔기 X2는 유리하게는 Val, Thr, Gln, Ala 및 Leu로부터 선택되는 아미노산에 상응한다. 마지막으로, X3 잔기는 바람직하게는 Ala, Leu 및 Ile로부터 선택되는 아미노산에 상응한다.
더 더욱 바람직하게는, X1 및 X2는 Val에 상응하고, X3은 Ala에 상응한다. 따라서, 이관능성 펩티드의 부분 A에 상응하는 헥사펩티드는 바람직하게는 서열 Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly을 갖는다.
3회 이상 반복되고 펩티드 부분 B 및 C와 연관된 이러한 서열은, 첨부된 도 3a 및 3b 및 하기 실시예 1에서 설명되고 예증되듯이 콜라겐, 즉 유형 III 콜라겐의 단백질 발현의 유의한 촉진을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 펩티드는 또한 도 4에서 예증되듯이, 각각 유형 I 콜라겐 및 유형 III 콜라겐을 코딩하는, COL1A1 및 COL3A1 유전자의 유전자 발현의 증가를 가능하게 한다. 유형 III 콜라겐의 합성에 대한 이관능성 펩티드의 작용이 특히 흥미롭다; 실제로, 유형 III 콜라겐은 태아 수준에서 주요 콜라겐으로서 알려져 있고 이의 생성은 어린 시절 동안, 어른에서 매우 낮은 생성 수준에 도달할 때까지 점차적으로 감소한다. 예를 들어, 유형 III 콜라겐은 유형 I 콜라겐보다 어른에서 6배 덜 풍부하다(Melissopoulos 1998 ; Herbage, 1997). 유형 III 콜라겐은 손상된 조직을 대체하기 위해, 치유 동안 주로 근섬유아세포에 의해 합성된다. 태아 수준에서, 유형 III 콜라겐은 소위 "완벽한" 치유를 가능하게 한다(Lorena et al, 2002. Ferguson & O'Kane, 2004).
본 발명에 따른 이관능성 펩티드의 Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly 서열은 탄성 섬유의 분해로부터 산출되는 엘라스틴 펩티드 또는 엘라스토킨으로부터 개념화된다. 이러한 서열은 상기 X1-Gly-X2-X3-Pro-Gly 서열 내에 프롤린 및 글리신 잔기의 존재로 인해, 유형 VIII β-엘보우 형상(elbow shape)을 채택한다(Floquet et al. 2004). 상기 구조적 패턴은 그의 영어 명칭, 엘라스틴 결합 단백질(Elastin Binding Protein)로 통상적으로 불리고 EBP로서 약칭되는 엘라스틴 수용체 단백질에 의해 인지된다. 엘라스틴 결합 단백질은 하기 2개의 다른 서브유닛과 함께 세포 표면 상에 고정된다: 보호 단백질 또는 카텝신(Protection Protein or Cathepsin A: PPCA) 및 뉴라미니다아제(Neuraminidase: Neu-1)(이들은 세포막에 결합되어 있음). 도 1에서 제시되는 바와 같이 이관능성 펩티드의 펩티드 부분 A에 의한 EBP 수용체 단백질의 점유는 분자 단위의 활성화를 야기하여, 이것이 즉, 유형 I 및 유형 III 콜라겐의 합성을 야기한다.
이러한 분자 단위의 활성화는 또한 주화성, 증식, 섬유아세포의 부착 및 생존 및 또한 혈관신생에 작용할 수 있으며, 혈관신생은 욕창 또는 궤양과 같은 만성 상처의 혈관재생 과정에 필수적이다.
펩티드 부분 B와 관련해서는, 이것은 바람직하게는 테트라펩티드, 즉, 4개의 아미노산을 포함하는 서열로 이루어진다.
더욱 특히, 상기 테트라펩티드는 기질 또는 경쟁적 억제제로서, 세린 프로테아제인 유로키나아제와 상호작용할 수 있는 분지를 나타낸다. 그러므로, 이것은 세포 근처에서 다른 2가지 펩티드 부분 A 및 C의 방출을 허용할 수 있다.
유로키나아제는 바람직하게는 2개의 Arg 아미노산을 갖는 서열을 절단한다. 그러므로, 펩티드 부분 B는 유리하게는 서열 Arg-Y1-Arg-Y2(식 중, Y1 및 Y2는 아미노산에 상응함)를 갖는다.
특히 예시적인 구현예에 따르면, Y1 및 Y2는 각각 Ser, Tyr, Gly, Ala, Arg, Leu 및 Val로부터 선택되는 아미노산에 상응한다. 절단 가능한 Arg 부위와 연합된 상기 아미노산은 바람직하게는 유로키나아제 프로테아제에 의해 절단된다.
더 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 이관능성 펩티드의 펩티드 부분 B는 Arg-Val-Leu-Arg 서열을 포함한다.
유로키나아제 프로테아제는 플라즈미노겐-플라즈민 시스템의 활성화제 중 하나이다. 플라즈미노겐은 유로키나아제의 생리학적 기질로서, 이것을 플라스민의 형태로 활성화시킬 것이다. 상기 활성화는 단백질분해 케스케이드를 촉발시키고, 이것은 즉 MMP-1 및 MMP-3의 활성화로 종결된다. 유로키나아제 프로테아제에 의해 촉발된 플라즈미노겐/플라즈민 시스템의 효소 케스케이드는 첨부된 도 2에 제시된다.
그러므로, 플라즈미노겐에 대한 유로키나아제 활성은 콜라겐, 즉 유형 I 및 유형 III 콜라겐의 분해를 간접적으로 담당한다. 그러므로, 본 발명에 따른 이관능성 펩티드 내의 펩티드 부분 B의 존재는 유로키나아제의 기질 또는 경쟁적 억제제로서 작용할 것이다. 그 결과, 유로키나아제는 펩티드 부분 B 상에 존재하는 Arg 부위를 절단할 것이고 플라스민 중의 플라즈미노겐의 억제를 야기하는 것이 덜 가능할 것이며; 그러므로 콜라겐 분자의 분해가 감소할 것이다. 유로키나아제의 활성에 대한 본 발명에 따른 펩티드의 영향은 도 6a 및 6b에 예증된다.
이제 이관능성 펩티드의 펩티드 부분 C와 관련해서는, 이것은 유리하게는 트리펩티드로 이루어지고, 이것은 3개의 아미노산을 포함하는 서열이다.
바람직하게는, 펩티드 부분 C는 Z1-Ile-Z2 서열(식 중, Z1 및 Z2 각각은 아미노산 잔기에 상응함)을 갖는다.
흥미로운 예시적인 구현예에 따르면, Z1은 Gly, Leu 및 Ile로부터 선택되는 아미노산인 반면, Z2는 Leu, Phe, Ala, Ile, Val로부터 선택된다.
더 더욱 바람직하게는, Z1은 Gly에 상응하고, Z2는 Leu에 상응한다. 그러므로, 이관능성 펩티드의 펩티드 부분 C는 유리하게는 Gly-Ile-Leu 서열을 갖는다. 실제로 트리펩티드 Gly-Ile-Leu는 MMP-1의 활성 부위의 일부를 점유하고 상기 효소의 경쟁적 억제제로서 작용하는 것 같다.
실제로, 상기 아미노산은 유형 I MMP의 포켓 중 3개인 P'1, P'2 및 P'3 포켓을 가지는 것 같아서 특히 흥미롭다. 그 결과, 유형 I 콜라게나아제의 활성 부위는 더이상 Zn2 + 이온(이것은 상기 콜라게나아제의 활성에 필수적임)을 킬레이팅시킬 수 없다. 그러므로 MMP-1에 의한 콜라겐 분자의 분해는 본 발명에 따른 이관능성 펩티드 덕분에 감소한다. 이것은 특히 첨부된 도 7a 및 7b에 예증된다.
그러므로, 콜라겐 합성 및 MMP, 특히 MMP-1의 억제에 관해 흥미로운 결과를 수득할 수 있게 하는 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 이관능성 펩티드는 서열 S1로서 지칭되고, 서열번호 1에 상응하는 하기 서열을 갖는다:
S1: N-(Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)n-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu-OH.
바람직하게는, Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly 서열은 3회 반복된다; 다른 말로는, n은 바람직하게는 3과 동일하다. 그러나, 서열은 또한 3 초과의 횟수로 반복될 수 있다.
본 발명에 따른 펩티드는 또한 예를 들어 서열번호 2 내지 서열번호 26로서 확인된 서열을 가질 수 있다.
그러나 상기 서열 목록은 완전하지 않으므로 본 발명을 제한하지 않는다.
즉, 서열번호 1 내지 서열번호 26의 아미노산은 예를 들어, 화학적으로 등가인, 즉, 등가의 물리적 화학적 특성을 갖는 아미노산에 의해 치환될 수 있다; 등가의 아미노산 사이의 치환이 수행된다: 예를 들어 무극성 지방족 아미노산 Ala, Val, Ile, Leu 사이의, 또는 히드록실기를 가지는 극성 아미노산 Ser 및 Thr 사이의, 아미노산 Asn 및 Gln 중에서, 2개의 산 작용기를 가지는 아미노산 Asp 및 Glu 등 사이의 치환. 상기 정보는 프로테아제에 대한 데이터베이스, Merops(http://merops.sanger.ac.uk/)에 나열된다.
본 발명에 따른 이관능성 펩티드는 바람직하게는 화학적 합성에 의해 수득된다.
유리하게는, 플루오레닐메톡시카르보닐 기법(Fmoc)/tert-부틸(tBu)은 Fmoc-Leu-Wang PS 수지 상에서 펩티드 사슬의 신장을 수득하기 위해 실행된다.
그러나, 이러한 구현예는 본 발명을 제한하는 것은 아니고, 이관능성 펩티드의 화학적 합성은 상기 목적을 위한 임의의 기타 적합한 기법에 의해 수득될 수 있고 당업자에게 공지되어 있다.
유리하게는, 본 발명에 따른 펩티드는 이의 최적의 보존을 확보하기 위해 동결건조된다.
본 발명에 따른 이관능성 펩티드가 진피 조직의 복구 및/또는 재생을 촉진하려는 목적으로 화장 조성물의 제조에 사용하기에 특히 흥미롭다. 실제로, 콜라겐의 생성에 대한 이의 작용을 통해, 상기 펩티드는 주로 주름의 형성을 제한할 수 있다.
게다가, 콜라겐의 생성에 대한 본 발명에 따른 이관능성 펩티드의 효과는 환자의 연령에 따라 다른 것 같다는 것이 본 출원인에 의해 입증되었다. 실제로, 도 5와 함께, 하기 실시예 3에 제시된 결과는, 유형 I 콜라겐의 발현, 특히 유형 III 콜라겐의 발현이 나이든 환자에서 더 크다는 것을 보여준다. 그러므로 이러한 결과는 피부 노화에 대항하기 위한 화장 조성물에서의 이의 용도를 위한 상기 펩티드의 관심을 확인시켜준다.
그러나, 이러한 구현예는 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명에 따른 이관능성 펩티드는 또한 약학 조성물의 제조에도 사용될 수 있다.
실제로, 매트릭스 단백질, 예컨대 콜라겐의 합성과 상기 동일 단백질의 분해 사이의 균형의 파괴는 만성 상처(또한 만성 흉터 질환으로 불림, 예컨대 욕창, 궤양, 또는 또한 심각한 화상을 입은 사람)의 발달을 야기할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 상기 질환은 특히 매트릭스 프로테아제 MMP의 과-발현을 특징으로 하고, 일반적으로 당뇨병 또는 혈관 질환과 같은 질환과 연관된다.
상기 만성 흉터 질환은, 주로 집단의 노령화 때문에 선진국에서 꾸준히 증가하고 있다. 그러므로, 상기 질환의 치료 및 관리가 무시할 수 없는 비용을 나타낸다.
세포 수준에서, 다량의 프로테아제, 즉 MMP-1 유형 메탈로-프로테이나아제가 욕창 유형의 상기 만성 상처 부근에서 방출되었다는 것이 제시되었다. 또한 연구는 유형 I 콜라게나아제, 또는 MMP-1의 활성이 만성 상처의 삼출물에서 유의하게 증가하였다는 증거를 제시할 수 있었다. 이러한 증가는 상기 상처 부근에 존재하는 유형 I 및 유형 III 콜라겐의 분자의 분해에 이유가 있다(Barone et al, 1998. Shi et al, 2006.).
이제 특히 궤양과 관련하여, 또한 다량의 프로테아제가 상기 상처 근처에서 발견되었다는 것이 입증되었다. 특히, 연구는 정상보다 65배 높은 MMP-1의 비를 확인하였고, 상기 MMP는 이후 세포외부 매트릭스의 단백질 및 또한 성장 인자의 과도하고 연장된 분해를 야기하여, 치유의 지체로 이어진다는 것을 알 수 있었다(Fischer et al. 2009).
마지막으로, 도 2에서 시각적으로 제시되고, 간접적으로 특정 MMP의 활성화를 담당하는 플라즈미노겐/플라즈민 시스템의 유로키나아제 활성제의 농도가, 다리 궤양 뿐만 아니라 욕창 수준에서도 크게 증가되었다는 것이 입증되었다(Werckroth et al. 2004).
그러므로, MMP 프로테아제의 활성 감소 및 매트릭스 단백질의 합성 증가 모두를 가능하게 하는 본 발명에 따른 펩티드는, 상기 만성 상처의 치료를 용이하게 하는 데 기여할 것이고, 거창하고, 값비싸고 비효율적인 현행의 의료적 치료를 대체할 수 있을 것으로 보인다.
특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 이관능성 펩티드는 만성 상처에 영향을 받은 신체 영역에 부착시키고자 하는 목적의 패치 내에 도입된다.
그러나, 이러한 구현예는 본 발명을 제한하는 경우는 아니고, 치료하고자 하는 상처 상에 적용될 수 있는 크림, 연고, 젤 등과 같은 제제 내에 본 발명에 따른 이관능성 펩티드를 도입하는 것을 쉽게 고려할 수 있다.
구현예에 따르면, 이관능성 펩티드는 바람직하게는 실질적으로 10μg/ml 내지 1mg/ml의 농도로 사용된다. 실제로, 본 발명에 따른 펩티드의 무 독성은 1mg/ml 까지의 펩티드 농도로 치료된 진피 섬유아세포 상에서 관찰되었다. 게다가, SAM (Significance Analysis of Microarrays) 통계적 접근을 통해 독성 유전자를 발견하기 위해 수행된 연구는 세포 사멸, 결합 조직의 붕괴 및 종양 침윤이 1mg/ml 초과의, 높은 농도의 이관능성 펩티드로부터만 유도된다는 것을 보여주었다.
더 더욱 바람직하게는, 펩티드의 사용을 위한, 즉, 약학 및/또는 화장 조성물에서의 사용을 위한 권고되는 농도는 실질적으로 100μg/ml이다.
본 발명의 추가의 특징 및 장점은 설명으로 제시되고 비-제한적인 하기 실시예를 판독할때 더욱 명백해질 것이다.
실시예 1: 콜라겐 합성에 대한 이관능성 펩티드의 효과 - 단백질 분석
진피 섬유아세포를 35 내지 75세 사이의 건강한 환자에게 수행한 수술 동안 수득된 복부 피부 생검으로부터 단리하였다.
표피를 제거한 후, 섬유아세포를 효소 소화에 의해 회수한 다음, 37℃에서, 10% 우태 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지에서 배양하였다.
이후 섬유아세포를 S1 서열 또는 상기 서열의 다양한 단편을 갖는 펩티드로, 100μg/ml의 농도로 처리하였다. 시험된 다양한 단편은 하기와 같다:
- 펩티드 1(pept 1) : S1 서열을 갖는 펩티드
- 펩티드 2(pept 2) : 서열 N-(Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)3 Arg-Val-Arg-Leu-OH
- 펩티드 3(pept 3) : N-(Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)3-OH
- 펩티드 4(pept 4) : N-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu-OH
- 펩티드 5(pept 5) : N-Gly-Ile-Leu-OH
유형 I 콜라겐 및 유형 III 콜라겐의 단백질 발현은 Western Blot에 의해 제시하고, ImageJ에 의해 정량하였다. 결과를 각각 첨부된 도 3a 및 3b에 제시한다. 대조군(Ctrl)은 펩티드를 처리하지 않은 세포의 수준에서 유형 I 및 III 콜라겐의 발현에 상응한다. 실험을 삼중으로 수행하였다.
도 3a에서의 가시적인 결과는 본 발명에 따른 펩티드(pept 1) 뿐만 아니라 본 발명에 따른 펩티드의 부분 A에 상응하는 Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly 서열을 도입한 단편(pept 2 및 pept 3)이 유형 I 콜라겐의 단백질 발현을 30% 촉진하는 것을 보여준다. 본 발명에 따른 펩티드의 부분 A이 포함되지 않은 펩티드 단편(pept 4 및 pept 5)은 유형 I 콜라겐의 합성의 촉진을 허용하지 않았고; 반대로, 섬유아세포가 pept 4 및 pept 5과 접촉하고 있을 때 합성된 콜라겐의 비율이 적은 것 같았다. 그러므로 Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly 서열은 실제로 유형 I 콜라겐의 합성을 촉진하는 것을 담당한다.
도 3b는 S1 서열을 갖는 본 발명에 따른 펩티드가 실제로 막대그래프에서 볼 수 있듯이 유형 III 콜라겐의 합성을 증가시킬 수 있고; 유형 III 콜라겐의 생성은 섬유아세포가 S1 서열을 갖는 펩티드로 처리되었을 때 2배 이상이 되었다는 것을 보여준다.
S1 서열을 가진 펩티드(pept 1)로의 섬유아세포의 처리는 (Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)3 서열만을 가진 펩티드(pept 3)로 처리된 섬유아세포에 비해, 유형 III 콜라겐의 합성을 36% 증가시킬 수 있다는 것이 또한 흥미롭다. 그러므로 본 발명에 따른 펩티드의 다른 부분도 유형 III 콜라겐의 합성 증가에 역할을 할 수 있다.
그러므로 본 발명에 따른 펩티드가 특히 흥미롭다; 실제로, 유형 I 콜라겐의 합성 증가를 가능하게 하는 것 외에도, 이것은 또한 유형 III 콜라겐의 생성을 촉진시킨다.
실시예 2: 콜라겐 합성에 대한 이관능성 펩티드의 효과 - 유전자 발현 분석
섬유아세포의 배양물 내의 유형 I 및 III 콜라겐의 유전자 발현을 또한 100μg/ml의 농도의 상이한 펩티드(pept 1 내지 pept 5)의 존재 하에 시험하였다.
상이한 펩티드로의 24시간의 처리 후, RNA를 RNeasy® 키트(QIAGEN)를 사용하여 배양물로부터 추출한 다음, SABiosciences™의 RT2 First Strand Kit를 사용하여 상보적 DNA(cDNA)로 재전사하였다.
이후 실시간 PCR 분석을 96-웰 플레이트에서 Stratagene의 Mx3000p 써모사이클러를 사용하여 수행하였다. 각각의 샘플을 삼중으로 분석하였다. CDNA는 RT2 SYBR® Green/ROX™ qPCR Master Mix 시약(SABiosciences™) 및 증폭시키고자 하는 유전자에 특이적인 센스 및 안티센트 프라이머를 함유하는 반응 혼합물에서 매트릭스로서 담당한다. MxPro 소프트웨어(Stratagene)에 의해 각각의 사이클 종료시에 형광의 판독을 수행하고, 분석하였다. 유형 I 및 유형 III 콜라겐을 코딩하는 관심의 COL1A1 및 COL3A1 유전자의 상대적 발현은 "내부(domestic)" 유전자(이 경우, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디히드로게나아제(GAPDH)를 코딩하는 유전자의 RNA)로부터 증폭된 DNA의 양에 의해 연구되는 유전자를 증폭시키기 위한 생성물의 양을 정규화함으로써 수득되었다. 100% 효율로의 증폭에 상응하는 사이클 수로부터, 연구된 cDNA의 상대적 양을 2-ΔΔ CT 방법(Livak & Schmittgen, 2001)을 사용하여 계산하였다.
도 4에 가시화된 결과는, 단백질 발현의 연구에서 수득된 것을 확인시켜준다. 본 발명에 따른 이관능성 펩티드 뿐만 아니라 (Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)3 서열을 포함하는 펩티드 단편 pept 2 및 pept 3은 유형 I 및 III 콜라겐의 유전자 발현을 촉진한다. 유형 III 콜라겐의 합성 증가는 또한 (Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)3 서열만을 함유하는 펩티드 3의 존재 하의 세포에 비해, 섬유아세포를 S1 서열을 갖는 펩티드(pept 1)에 의해 처리하였을 때 관찰되었다.
Gly-Ile-Leu 서열을 함유하는 유도체 펩티드 pept 4 및 pept 5는 유형 I 및 III 콜라겐을 코딩하는 유전자의 발현에 영향이 없다.
대조군(Ctrl)은 섬유아세포가 처리되지 않았을 때 두 유형의 콜라겐을 코딩하는 유전자의 발현에 상응한다.
실시예 3: 콜라겐 합성에 대한 이관능성 펩티드의 효과 - 환자의 연령에 따른 단백질 및 유전자 발현 시험
젊은 또는 나이든 환자(35, 42 및 53세)로부터의 진피 섬유아세포를 배양하고, S1 서열을 갖는 본 발명에 따른 이관능성 펩티드를 유형 I 및 유형 III 콜라겐의 단백질 및 유전자 발현에 대해 시험하였다. 2가지 유형의 콜라겐의 단백질 발현과 관련하여 수득된 결과를 도 5에 가시화한다. 콜라겐의 합성에 대한 본 발명에 따른 펩티드의 작용이 섬유아세포가 나이든 환자로부터 유래된 경우 더 큰것으로 나타난다.
실시예 4: 이관능성 펩티드에 의한 유로키나아제의 경쟁적 억제
MMP-1 프로테이나아제의 활성화 케스케이드의 업스트림 효소인 유로키나아제에 대한 본 발명에 따른 이관능성 펩티드의 작용을 평가하였다.
그의 합성 기질, D-Glu-Gly-Arg+NHPhNO2(S2444)에 대한 유로키나아제의 활성을 상이한 농도의 본 발명에 따른 펩티드의 존재 및 부재 하에서 시험하였다.
결과를 첨부된 도 6a 및 6b에 제시한다.
유로키나아제(9.25*10-6mM)에 의한 기질 S2444(0.3nM)의 가수분해 동적반응을 S1 서열을 갖는 이관능성 펩티드의 존재 하에 10-3, 10-4 및 10-5 M의 농도로 1시간 동안 수행하였다. 대조군은 펩티드의 부재 하의 동적반응에 상응한다. 효소 활성을 35분의 기간 동안 매 5분마다 405nm에서의 흡광도(DO)를 측정함으로써 평가하였다. 결과를 도 6a에 제시한다.
도 6b는 시간 15분에 사용된 이관능성 펩티드의 농도 및 유로키나아제의 활성 사이의 용량/효과 관련성의 그래프적 묘사이다. 도에서의 점선은 IC50, 즉, 유로키나아제의 활성을 50% 감소시키는데 필요한 펩티드 농도를 측정하게 할 수 있다. IC50은 0.83*10-5 M의 펩티드, 즉 19μg/ml의 펩티드 질량 농도에 상응한다.
그러므로, 본 발명에 따른 이관능성 펩티드가 유로키나아제의 경쟁적 억제제로서 행동하는 것으로 보인다.
실시예 5: MMP-1 프로테아제의 활성에 대한 이관능성 펩티드의 효과
이후 본 발명에 따른 이관능성 펩티드의 효과를 유로키나아제에 의해 활성화되는 케스케이드의 다운스트림 효소인 MMP-1의 활성에 대해 직접적으로 평가하였다.
펩티드의 존재 하에 이의 활성을 시험하기 위해 사용되었던 MMP-1의 기질은 합성 기질, DNP-Pro-Cha-Gly-Cys (Me)-His-Ala-Lys (N-Me-Abz)-NH2이다.
80ng/μl의 농도의 MMP-1을 0.4ng/μl의 합성 기질의 존재 하에, 10-3, 10-4 및 10-5 M의 농도로의 이관능성 펩티드의 존재 또는 부재 하에 1시간 동안 투입하였다. 결과를 도 7a 및 7b에 제시한다.
더욱 특히, 도 7a는 상이한 농도의 펩티드의 존재 또는 부재(대조군) 하에서의 MMP-1의 합성 기질의 가수분해 동적반응을 나타낸다. MMP-1의 효소 활성을 35분의 기간 동안 매 5분마다 465nm에서의 흡광도(DO)를 측정함으로써 평가하였다.
도 7b는 시간 15분에 사용된 이관능성 펩티드의 농도 및 MMP-1의 활성 사이의 용량-효과 관련성의 그래프적 묘사이다. 도에서의 점선은 IC50을 측정하게 할 수 있으며, 여기서 IC50은 0.4*10-4 M, 즉 91μg/ml의 이관능성 펩티드의 농도에 상응한다.
본 발명에 따른 펩티드의 효과는 또한 이의 천연 기질, 즉, 인간 진피의 콜라겐 섬유의 존재 하에 MMP-1의 활성에 대해 시험하였다.
이를 위해, MMP-1을 1시간 30분 동안 37℃에서 20mM의 APMA(4-아미노페닐머큐릭 아세테이트)에 의해 미리 활성화시켰다. 이후 그렇게 활성화된 MMP-1을 본 발명에 따른 펩티드(100μg/ml)의 존재 또는 부재 하에, 5μ의 두께를 가진 피부의 절개부 상에 침전시켰다. 3시간 후, 유형 I 및 III 콜라겐의 존재를 노출시키기 위해 피부의 절개부를 면역염색한 다음, 공초점 현미경으로 관찰하여다. 결과는(제시되지 않음), 펩티드로 처리되지 않은 절개부의 수준에서, 콜라겐 I 및 III은 MMP-1에 의해 완전히 분해되었다는 것을 보여준다. 다른 한편, 이관능성 펩티드의 존재 하에서는, 상기 MMP-1의 작용이 억제되었다; 실제로, 콜라겐 I 및 III이 검출되었다.
본 발명에 따른 이관능성 펩티드는 MMP-1의 활성을 그 자리에서 억제시킴으로써 콜라겐의 분해를 억제한다.
실시예 6: 유로키나아제에 의한 이관능성 펩티드의 절단
세포주변 수준에서, 약 10-4M의, 과량의 유로키나아제가 관찰되었다. 그러므로 펩티드는 유로키나아제(이것은 특히 본 발명에 따른 펩티드의 부분 B의 아르기닌 잔기(Arg)의 수준에서 작용함)에 의해 절단될 수 있을 것이다.
Chromolith Jupiter C18 컬럼(50 x 4.6 mm) 상에, 100분 동안 0에서 100%, 0.1% TFA의 물 중의 0.1% TFA의 아세토니트릴의 선형 구배를 적용하는 HPLC에 의해 연구를 실시하였다. 결과는 11.75분에서의 스펙트럼 피크(이것은 이관능성 펩티드의 특징임)의 존재를 보여주었다(도 8a). 그러나, 이관능성 펩티드에 대한 과량의 유로키나아제(0.45mM)의 작용 후, 스펙트럼 피크가 상이하였다; 실제로, 새로운 피크가 20분에서 용리되었으며, 따라서 유로키나아제에 의한 이관능성 펩티드의 절단의 특징을 나타내었다(도 8b).
그러므로, 피부 노화의 조건 하에, 다량의 유로키나아제의 존재 하에서, 본 발명에 따른 이관능성 펩티드가 절단되어, Gly-Ile-Leu 서열을 포함하는 상기 펩티드의 C-말단을 방출한다.
실시예 7: MMP-1의 활성에 대한 Gly-Ile-Leu 서열의 효과
유형 I 콜라게나아제, MMP-1의 P'1, P'2 및 P'3 포켓을 점유하는 능력을 위해 Gly-Ile-Leu 서열이 본 출원인에 의해 선택되었다. 10-5, 10-4 및 10-3 M의 농도의 Gly-Ile-Leu 서열을 갖는 펩티드 5의 존재 또는 부재 하에서, 합성 기질, DNP-Pro-Cha-Gly-Cys (Me)-His-Ala-Lys(N-Me-Abz)-NH2 상에서 MMP-1의 활성을 시험하였다.
결과(제시되지 않음)는 펩티드 5가 이의 합성 기질 상에서의 MMP-1의 활성을 용량-의존적인 방식으로 감소시킨다는 것을 입증한다. Gly-Ile-Leu 펩티드의 IC50을 측정하였다; 이것은 0.71*10-4 M, 즉, 21.3μg/ml의 펩티드 농도였다.
본 발명에 따른 이관능성 펩티드의 말단 부분 C, Gly-Ile-Leu는 그러므로 과량의 유로키나아제가 있는 경우 생성되고, MMP-1의 활성의 억제를 야기할 수 있다. 상기 데이터는 피부 노화에 대항하기 위한 및/또는 만성 상처의 치유를 위한 펩티드의 중요성을 확인시켜준다.
더욱 포괄적인 연구 모델에 대해 연구가 또한 수행되었다: 생체 외 피부 모델은 피부 노화 및 일부 관련 병리학을 모방할 수 있다. 수득된 결과는 제시되지 않지만, 이들은 시험관 내에서 수득된 결과를 확인시켜준다.
물론, 본 발명은 상기 제시되고 기재된 실시예에 제한되는 것은 아니고, 본 발명의 범주로부터 벗어남 없이 변형과 개질이 있을 수 있다.
참조문헌
SEQUENCE LISTING
<110> REGENTIS INTERNATIONAL
UNIVERSITE DE REIMS CHAMPAGNE-ARDENNE
CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
<120> BIFUNCTIONAL PEPTIDE
<130> IP20142530FR
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<223> Peptide bifonctionnel apte a activer la synthese de collagene et a inhiber la production de metallo-proteinases matricielles
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1 5 10
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Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Val-Arg-Arg-Gly-Ile-Leu
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Claims (17)
- 콜라겐의 합성을 활성화하고 매트릭스 메탈로-프로테이나아제의 생성을 억제할 수 있는 이관능성 펩티드로서, 하기 3개의 펩티드 부분 A, B 및 C를 갖는 서열을 갖는 이관능성 펩티드:
- 3회 이상 반복되는 헥사펩티드에 상응하는 제1의 펩티드 부분 A, 상기 부분 A는 콜라겐 합성을 촉진하기 위해 엘라스틴-결합 수용체 단백질에 결합할 수 있고, 상기 제1의 펩티드 부분 A는 X1-Gly-X2-X3-Pro-Gly 서열을 가지며, 상기 서열이 다음과 같고, 3회 이상 반복됨:
- X1은 임의의 아미노산에 상응하고,
- X2는 Val, Thr, Gln, Ala, Leu로부터 선택되는 아미노산에 상응하며,
- X3는 Ala, Leu, Ile로부터 선택되는 아미노산에 상응함,
- 유로키나아제 프로테아제의 경쟁적 억제제로서 작용할 수 있고 상기 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 테트라펩티드에 상응하는 제2의 펩티드 부분 B로, 상기 제2의 펩티드 부분 B는 Arg-Y1-Arg-Y2 서열을 갖고, 상기 Y1 및 Y2는 각각 Ser, Tyr, Gly, Ala, Arg, Val, Leu로부터 선택되는 아미노산에 상응함, 및
- 매트릭스 메탈로-프로테이나아제의 억제를 허용하기 위해 상기 매트릭스 메탈로-프로테이나아제의 하나 이상의 활성 부위를 점유하는 트리펩티드에 상응하는 제3의 펩티드 부분 C로, 상기 제3의 펩티드 부분 C는 Z1-Ile-Z2 서열을 갖고, 상기 Z1은 Gly, Ile, Leu로부터 선택되는 아미노산에 상응하고, 상기 Z2는 Leu, Phe, Ala, Ile, Val로부터 선택되는 아미노산에 상응함. - 제1항에 있어서,
상기 펩티드의 제1의 펩티드 부분 A가 Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly 서열을 갖는 이관능성 펩티드. - 제1항에 있어서,
상기 펩티드의 제2의 펩티드 부분 B가 Arg-Val-Arg-Leu 서열을 갖는 이관능성 펩티드. - 제1항에 있어서,
상기 펩티드의 제3의 펩티드 부분 C가 Gly-Ile-Leu 서열을 갖는 이관능성 펩티드. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 1에 상응하는 하기 S1 서열을 갖는 이관능성 펩티드:
S1: N-(Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)n-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu-OH,
여기서,
N 및 OH는 각각 상기 펩티드의 N-말단 및 C-말단에 상응하고,
n = 3임. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 2 내지 서열번호 26 중 어느 하나에 상응하는 이관능성 펩티드. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
화학적 합성에 의해 수득되는 이관능성 펩티드. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
동결건조 형태로 보존되는 이관능성 펩티드. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
만성 흉터 질환의 치료를 위한 이관능성 펩티드. - 제9항에 있어서,
욕창 또는 궤양의 치료를 위한 이관능성 펩티드. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
진피 조직의 복구 및/또는 재생을 위한 이관능성 펩티드. - 제11항에 있어서,
피부 노화의 치료를 위한 이관능성 펩티드. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 이관능성 펩티드를 포함하는 화장용 및/또는 약학 조성물로,
만성 흉터 질환의 치료, 욕창 또는 궤양의 치료, 진피 조직의 복구 및/또는 재생 또는 피부 노화의 치료를 위한, 화장용 및/또는 약학 조성물. - 제13항에 있어서,
이관능성 펩티드의 농도가 10μg/mL 내지 1mg/mL인 화장용 및/또는 약학 조성물. - 제14항에 있어서,
이관능성 펩티드의 농도가 100μg/mL인 화장용 및/또는 약학 조성물 - 삭제
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