KR101668803B1 - 보호용 피부 관리 테트라펩티드 - Google Patents

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Abstract

개시된 발명은 아미노산 서열 프롤린-글루타민-글루타메이트-X (P-Q-E-X)를 가지는 테트라펩티드를 제공하며, X는 리신(K) 또는 이소류신(I) 중 하나일 수 있다. 이들 테트라펩티드는 피부 상피 세포 및 섬유아세포에 의해 전염증 사이토카인 인터류킨-6(IL-6)의 자외선 광(UV)-유발된 발현을 억제한다. 더 나아가, 테트라펩티드는 UV 광에 직접 노출 또는 UV-처리된 각질세포에 의한 조건에 의하는 배지에 의한 처리로써 유발된 피부 섬유아세포에 의한 매트릭스 메탈로프로테이나아제-1(MMP-1)의 상향조절을 억제한다. 테트라펩티드의 작은 크기 및 생체-활성은 염증 피부 장애와 관련된 치료제 및 피부 관리 제품에서 활성 성분으로서 사용에 적당한 것들을 제공한다.

Description

보호용 피부 관리 테트라펩티드{PROTECTIVE SKIN CARE TETRAPEPTIDES}
이 출원은 전체가 참고로써 본원에 포함되는 2007년 10월 29일 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/000,815에 의거하여 우선권의 이익을 주장한다.
본 발명은 생물학적 및 치료적 활성을 가지는 펩티드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 피부에서 염증 과정을 억제하는 테트라펩티드에 관한 것이다. 이러한 테트라펩티드는 자외선(UV) 노출에 반응하여 피부 상피 및 섬유아세포에 의해 발현되는 인터류킨(IL)-6 및 매트릭스 메탈로프로테이나아제의 양을 감소시킴으로써 부분적으로 이런 효과를 발휘한다. 본 발명은 추가로 피부 및 관련된 점막 표면에 영향을 미치는 다양한 상해를 치료하기 위한 이들 테트라펩티드를 사용하는 방법에 관한 것이다.
홍반 및 부종을 특징으로 하는 급성 염증의 발생에서 과도한 태양 광에의 노출은 중요한 병인적 인자이다. 이러한 염증의 장기간 결과는 가속화된 피부 노화 및 피부 암을 발생시키는 더 높은 가능성을 포함한다. UV 선에 의한 급성 노출로 인한 피부 염증은 신경펩티드, 히스타민, 프로스타글란딘, 세로토닌 및 산소 라디칼 뿐만 아니라 IL-1, IL-6 및 종양괴사인자 알파(TNF-α)와 같은 전염증 사이토카인의 상향조절을 포함하는 다양한 인자의 방출을 특징으로 하는 것으로 나타났다. 피부 상피 세포 및 각질세포는 몇몇의 상기 인자를 생성함으로써 UV 노출 후 피부에서 관찰되는 염증 과정에서 중요한 역할을 한다.
UV-유발된 염증의 장기간 효과는 피부 기능을 부정적으로 바꾼다. 염증의 다양한 에피소드로 고통받은 피부의 상처 치유 과정은 결국에는 확장되며 불완전할 수 있다(예를 들어, 증가된 흉터). 게다가, 과-노출된 피부는 또한 더 주름형성, 건조함, 피부약화, 처짐 및 훨씬 더 멍이 들기 쉬운 경향이 있다. 이런 부정적 효과을 유발하는 피부의 염증 과정은 복잡하며 몇몇의 경로를 포함할 가능성이 있다.
UV 광은 UVA와 UVB 광선 둘 다로 구성된다. UVB는 비흑색종 피부암뿐만 아니라 급성 염증의 원인으로 잘 알려져 있다. UVB-매개 상피 염증은 IL-1, IL-6, IL-8 및 TNF-α와 같은 전염증 사이토카인에 의해 조정된다. UVB 광선은 표피를 통해 침투하기 때문에, 사이토카인 유발은 각질세포 뿐만 아니라 상층진피에 있는 섬유아세포 및 내피세포에서도 일어날 수 있다. 그러나, 중간엽 기원의 이들 후자 2가지의 세포 종류는 직접적인 UV 노출로부터 다소 간접적인 방법으로 염증 상태로 유발될 수 있다. UV 자극에 대응하여 상피 세포 및 각질세포에 의해 발현되는 인자들(즉, 매개자들)은 염증 경로를 상향조절하기 위해 섬유아세포 및 내피 세포에 신호를 전달할 수 있다. IL-6은 이러한 매개자 중 하나이다.
상피 세포 및 섬유아세포에서 IL-6와 같은 사이토카인의 유발은 다른 증상들 중에서도 주름형성 및 처짐을 통해 그 자체로 명백한 피부 광피부노화의 가속화에 상당한 영향을 미친다. 이런 효과는 IL-6 신호화에 대응하여 섬유아세포에 의한 과잉의 MMI-1의 자극에 의해 우선 매개된다 (Fagot et al. Arch Dermatol Res . 293:576, 2002; Fagot et al. Photochem Photobiol. 79:499, 2004). MMP-1 과발현은 피부의 결합조직에 포함되는 콜라겐과 같은 세포외 매트릭스(ECM)를 분해함으로써 피부의 구조적 무결함을 상당히 바꿀 수 있다. 게다가, ECM 파괴는 UV 노출의 자리에 면역 세포의 보충을 향상시키며; 이 고조된 세포 활성은 과량의 섬유 침착으로부터 초래되는 피부 경화와 같은 만성 증상뿐만 아니라 홍반 및 부종과 같은 급성 증상의 주요 원인이다. UV 노출에 반응하여 피부 생리학에 이런 부정적인 영향을 미치는, IL-6 및 MMP-1은 피부 광노화를 조절하기 위한 중요한 분자 표적을 나타낸다.
광노화를 조절하기 위한 한 수단은 UV 노출 후 변경된 활성을 나타내는 하나 이상의 신호 경로를 억제하는 것으로 알려진 단백질의 국부 투여이다. 그러나, 이러한 전략을 사용하는 대부분의 시도는 전체 단백질 또는 그것의 거대 단편의 사용과 관련된 어려움에 부분적으로 기인하여 임상적으로 중요한 결과를 이루지 못하였다. 이런 실패 하의 한 문제는 표피를 가로지르는 단백질의 비효율적 전달에 관한 것이며, 사용된 단백질의 대부분은 광노화 경로를 시작하도록 초래하는 세포로부터 멀리 떨어진 채로 남아있다. 다른 약점은 투여 후 거대 단백질의 높은 가변성 및 불량한 정체와 관련되어 있다. 이런 고유의 부정적인 특징을 제외하고, 이들 치료제의 개발은 거대 단백질의 제조와 관련된 복잡성 및 고비용을 겪고 있다. 따라서, 저비용 및 더 효과적인 제조가 현재 추구되고 있다.
짧은 생체-활성 펩티드는 피부 광노화를 치료 및 예방하는데 잠재적으로 유용한 수단을 나타낸다. 덜 비싸고 더 쉽게 생산되고 제조되는 즉시의 이점에 더하여, 짧은 펩티드는 또한 피부에 의해 더 잘 흡수되고 계속 유지된다. 피부에서 광노화의 예방에 관하여, 피부 염증 처리를 억제할 수 있는 짧은 펩티드(예를 들어, 테트라펩티드)가 요망된다.
다른 사람들은 이전에 피부에 대한 테트라펩티드의 효과를 시험하였지만, 몇몇은 UV선에 의해 피부에서 상향조절되는 것으로 알려진 염증 과정을 억제하는 것으로 거의 나타나지 않았다. 예를 들어, Lintner(미국 특허 번호 6,974,799)는 피부에서 이른바 역노화 신호로 특정의 테트라펩티드-트리펩티드 혼합을 사용하였지만; 그러나, 이 혼합은 단지 ECM 생성을 상향조절하는 것으로 나타났고, 이 과정은 태양광의 유해한 효과를 예방하는 것으로 예측되지 않았다. 유사한 맥락으로, Sandberg et al. (미국 특허 번호 6,962,904)은 피부에서 결합조직을 복구하기 위해 엘라스틴-유발된 테트라펩티드의 사용을 교시한다. 특정의 테트라펩티드는 주름을 치료하는데 유용한 것으로 Bissett et al. (미국 특허 번호 6,284,802)에 의해 주장되며; 이 유용성에 대한 유일한 근거는 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)의 아미노산 서열로부터 펩티드의 유도이다. 이와 같이, 이들 펩티드는 항-염증 활성을 사용하지 않은 것으로 기대되지 않을 수 있는데, bFGF가 면역 세포 보충에 긍정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있기 때문이다(Zittermann and Issekutz Am J Pathol. 168:835, 2006). 상피 세포 증식을 자극하는 Dussourd et al. (미국 특허 번호 6,211,155)에 의해 기술된 테트라펩티드는 또한 UV-유발된 염증을 억제하는 것으로 예상되지 않았다. 반면에, 본 발명은 피부에서 UV-유발된 염증을 하향조절하는 테트라펩티드를 제공하며, 따라서 광노화의 주요 원인을 예방 또는 치료하는 것으로 작용한다.
Bernard D et al. (2003), Analysis of proteins with caseinolytic activity in a human stratum corneum extract revealed a yet unidentified cysteine protease and identified the co-called "stratum corneum thiol protease" as cathepsin L2, J. Invest. Dermatol. 120:592-600. Borgono CA et al. (2007), A potential role for multiple tissue kallikrein serine proteases in epidermal desquamation, J. Biol. Chem. 282: 3640-3652. Brattsand M and Egelrud T (1999), Purification, molecular cloning, and expression of a human stratum corneum trypsin-like serine protease with possible function in desquamation, J. Biol. Chem. 274:30033-30040. Hansson L et al. (1994), Cloning, expression, and characterization of stratum corneum chymotryptic enzyme. A skin-specific human serine proteinase, J. Biol. Chem. 269:19420-19426. Horikoshi T et al. (1998), Isoforms of cathepsin D and human epidermal differentiation, Biochimie 80:605-612. Johansson J et al. (1998), Conformation-dependent antibacterial activity of the naturally occurring human peptide LL-37, J. Biol. Chem. 273:3718-3724. Pampalakis and Sotiropoulou (2007), Tissue kallikrein proteolytic cascade pathways in normal physiology and cancer, Biochim. Biophys. Acta. 1776:22-31. Voegeli R et al. (2007), Profiling of serine protease activities in human stratum comeum and detection of a stratum corneum tryptase-like enzyme, Int. J. Cosmet. Sci. 29:191-200. Yamasaki K et al. (2007), Increased serine protease activity and cathelicidin promotes skin inflammation in rosacea, Nat. Med. 13:975-980.
본 발명은 아미노산 서열로서 프롤린-글루타민-글루타메이트-X(P-Q-E-X)를 포함되는 분리된 펩티드에 관한 것이며, X는 리신(K) 또는 이소류신(I) 잔기 중 하나이다. 따라서, 테트라펩티드 SEQ ID NO: 14 (PQEK) 및 SEQ ID NO: 15 (PQEI)는 본 발명에 의해 제공되는 분리된 펩티드의 예이다. 본 발명의 펩티드의 아미노산 서열이 상기 PQEX 서열로 구성됨에도 불구하고, 펩티드는 특정 서열은 별도로 하고 다른 특징들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 특정 구체예는 담체 분자에 아미드화, 지질화 또는 콘쥬게이트된 펩티드가 도출된다. 본 발명의 펩티드의 다른 구체예는 D-거울상체 형태로 적어도 하나의 아미노산 잔기, 또는 인접한 아미노산 잔기 사이에 존재하는 적어도 하나의 비-펩티드 결합을 포함한다.
본 발명의 더 구체적인 구체예는 SEQ ID NO:1 (PQEK-NH2) 및 SEQ ID NO:2 (PQEI-NH2)에 의해 주어지는 아미노산 서열을 가지는 테트라펩티드를 포함한다. 따라서 이들 펩티드는 상기 기술된 바와 같은 PQEX 서열을 가지는 펩티드의 변형된 형태의 예를 구성한다. SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2에 의해 주어지는 테트라펩티드는 카르복시 말단에서 아미드화에 추가로 다른 변형을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 아미노산 서열 PQEX를 가지는 상기 테트라펩티드 중 적어도 하나를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물에서 펩티드의 농도는 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL 또는 약 0.1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL일 수 있다. 본 조성물의 바람직한 구체예는 에어로졸, 에멀젼, 액체, 로션, 크림, 페이스트, 연고, 분말, 또는 폼(foam)의 형태로 있을 수 있다. 본 조성물의 또 다른 바람직한 구체예는 SEQ ID NO:1, 2, 14 또는 15에 의해 주어지는 아미노산 서열을 가지는 테트라펩티드 중 적어도 하나를 포함한다. 본 발명의 조성물은 본원에 기술되는 것과 같은 PQEX 테트라펩티드의 다양한 다른 형태를 포함할 수 있다. 프로테아제 억제제는 모든 상기-기술된 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 언급된 본 발명의 펩티드 및 약학 조성물을 사용하는 특정 방법으로 도출된다. 특히, 본 발명은 유효한 시간 동안 염증 자리에 본 발명의 조성물/펩티드의 치료적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서 염증을 치료하는 방법을 포함한다. 찰과상, 수포, 화상, 열상, 궤양, 타박상, 발진 및 흉터로부터 수반 또는 초래되는 염증은 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있다. 본 발명의 방법의 바람직한 구체예는 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL 또는 약 0.1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL의 범위에 이르는 농도로 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2와 같은 상기 펩티드 중 적어도 하나를 사용한다.
본 발명의 방법의 특정 구체예는 구강내와 같은 피부 또는 관련된 조직에서 일어나는 염증을 치료하는 것과 관련된다. 본 발명의 방법의 또 다른 구체예는 자외선 (UV)에 노출의 결과로서 발생하는 피부 염증(예를 들어, 선번)을 치료하는 것으로 도출된다. SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2로써 주어지는 테트라펩티드는 예를 들어, 이런 바람직한 구체예에서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 세포에 의한 IL-6 및/또는 MMP-1의 발현을 억제하는 방법으로 도출된다. 이 방법은 상기 문맥에서 기술된 바와 같은 펩티드에 세포를 노출시키는 단계를 포함한다. 펩티드에의 이러한 노출은 이들 염증 중재자 중 하나 또는 둘 다의 세포에 의해 감소된 발현을 초래한다. 노출 단계는 세포를 펩티드와 접촉함으로써 수행될 수 있고, 이는 단순 배양 수단에 의해 달성될 수 있다. 개개로 또는 조합 중 하나로 이 방법으로 사용될 수 있는 펩티드는 바람직하게는 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 15 및 SEQ ID NO:2이다. 본 방법의 특정 구체예에서, IL-6 또는 MMP-1의 세포 발현은 UVA 및/또는 UVB 광선과 같은 자외선에 세포 노출의 결과이다. 그러나, 본 방법은 또한 외상 또는 화상과 같은 어떤 다른 염증-관련 사건의 결과로서 발생하는 IL-6 및/또는 MMP-1의 세포 발현을 조절하는 것에 적용할 수 있다. 이 방법의 바람직한 구체예는 피부로부터 유도되거나(예를 들어, 시험관 내 또는 생체 밖 일차 또는 영생 세포) 아니면 달리 피부(즉, 생체 내)에 존재하는 세포와 관련되며; 이러한 세포는 피부 상피 세포, 각질세포, 및 피부 섬유아세포일 수 있다. 본 방법의 다른 구체예는 상피 또는 섬유아세포 중 어떤 종류를 사용하여 사용될 수 있다.
도 1은 UVB 노출 24시간 후 인간 상피 세포에 의한 IL-6에서 특정 테트라펩티드(40 μg/mL)의 효과를 보여준다. "M1"은 비-조사된 대조군 세포 배양물(펩티드 처리 없음)을 나타내며, 따라서 피부 상피 세포의 기본적 IL-6 발현 수준을 보여준다. "UVB"는 조사된 대조군 세포 배양물(펩티드 처리 없음)을 나타내며 따라서 UVB 노출시 상피 세포에서 유발된 IL-6의 수준을 보여준다. 실시예 3과 관련된다.
도 2는 UVB로 처리된 피부 상피 세포의 IL-6 유발에서 2가지의 다른 농도(10 및 20 μg/mL)에서 테트라펩티드 P1422 (SEQ ID NO: 1) 및 P1423 (SEQ ID NO:2)의 효과를 보여준다. "대조군"은 UVB-조사된 세포를 나타내지만, 펩티드를 수용하지는 않았다. 실시예 3과 관련된다.
도 3은 UVB로 처리된 각질세포에서 IL-6 유발의 10 μg/mL에서 테트라펩티드 P1422 (SEQ ID NO:1) (A) 및 P1423 (SEQ ID NO:2) (B)의 효과를 나타낸다. "대조군"은 UVB-조사된 세포를 나타내지만, 펩티드를 수용하지는 않는다. "OD450"은 ELISA에 의해 측정되는 바와 같은 상대적 IL-6 발현을 나타낸다. 실시예 4와 관련된다.
도 4는 UVA로 처리된 피부 섬유아세포에서 MMP-1 유발의 10 μg/mL에서 테트라펩티드 P1422 (SEQ ID NO: 1) (A) 및 P1423 (SEQ ID NO:2) (B)의 효과를 보여준다. 각각의 배양물에 의해 생성된 MMP-1의 상대적 양은 ELISA-발생된 OD450 흡수 값을 사용하여 결정된다. "대조군"은 UVA-조사된 세포를 나타내지만, 펩티드를 수용하지는 않는다. 실시예 5와 관련된다.
도 5는 UVB-처리된 각질세포에 의한 배지 조건으로 처리된 피부 섬유아세포에서 MMP-1 유발의 10 μg/mL에서 테트라펩티드 P1422 (SEQ ID NO:1) (A) 및 P1423 (SEQ ID NO:2) (B) 효과를 보여준다. 각 배양물에 의해 생성되는 MMP-1의 상대적 양은 ELISA-발생된 OD450 흡수 값을 사용하여 결정된다. "대조군"은 UVB-조사된 각질세포에 의한 배지 조건에서 배양되었지만, 이는 펩티드를 수용하지 않는다. 실시예 5와 관련된다.
본 발명의 펩티드는 아미노산 서열 프롤린-글루타민-글루타메이트-X(P-Q-E-X)를 가지는 테트라펩티드이며, X는 리신(K) 또는 이소류신(I) 중 하나일 수 있다. 따라서, 테트라펩티드 PQEK (SEQ ID NO: 14) 및 PQEI (SEQ ID NO: 15)는 본 발명에 의해 제공된다. SEQ ID NO: 14 및 SEQ ID NO: 15의 비-제한적 예는 각각 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2이며; 이들 후자의 테트라펩티드는 그것들 각각의 카르복시 말단에서 아미드화된다. 단지 참고 목적으로, 본 발명의 펩티드에서 아미노산 잔기의 3레터 코드는 Pro (프롤린, P), Gln (글루타민, Q), Glu (글루타메이트 또는 글루탐산, E), Lys(리신, K) 및 Ile (이소류신, I)이다.
상기 테트라펩티드에 의해 유도되는 생물학적 활성은 UV 노출 자리에서 피부 염증의 억제이다. 이 활성은 피부 상피 세포 및 섬유아세포에 의한 IL-6의 분비에서 펩티드의 부정적인 효과를 통해 부분적으로 달성된다(실시예와 관련됨). 이 환경에서 IL-6 분비는 이들 세포에서 UV선의 효과에 기인한다. 염증에서 상기 테트라펩티드의 억제 활성은 추가로 섬유아세포에서 MMP-1 발현에서 그것의 부정적 효과에 부분적으로 기인한다.
당업자는 IL-6 생성을 억제하기 위한 본 발명의 테트라펩티드 PQEK (SEQ ID NO: 14) 및 PQEI (SEQ ID NO: 15)의 능력이 주어짐을 인식할 것이며, 이 펩티드들은 추가적으로 UV 노출 이외의 상해로부터 초래되는 피부 손상의 형태를 치료하는데 유용할 것이다. 게다가, 본 발명의 펩티드는 점막 조직에 대한 상처를 치료하는데 유용할 것으로 인정되었다. IL-6는 상처 자리에서 각질세포 및 섬유아세포에 의해 방출되고, 면역 세포 침투를 신호화하는데, 이 과정은 실질적으로 치유를 악화시킬 수 있고 흉터의 원인이 된다. 본 발명의 펩티드의 용도에 의한 이러한 환경 하에서 IL-6 발현의 조절은 이런 부정적 상처 치유 과정을 개선할 것이다. 이들 생물학적 활성은 본 발명의 펩티드가 치료적으로 사용될 수 있는 방법에 대한 지침을 제공하도록 열거되지만; 그러나, 본 발명은 펩티드 기능의 이런 특정 방식에 의한 어떤 형식으로 제한되는 것은 아니다.
펩티드
본 발명의 테트라펩티드[예를 들어, PQEK (SEQ ID NO: 14) 및 PQEI (SEQ ID NO: 15)] 각각은 하나의 거울상체 형태 또는 두 형태의 조합의 잔기를 함유하여 L- 또는 D-아미노산 거울상체를 포함한다. 단지, 그것의 첫번째 아미노산 서열이 바뀌지 않는 한 펩티드는 다음의 비-제한적 실시예로 기술되는 바와 같이 증가 또는 변형될 수 있고; 이 방법에서, 펩티드는 특정 아미노산 서열로 구성되지만, 특정 변형을 포함할 수 있다. 펩티드의 카르복시-말단은 산성(-COOH)일 수 있고 또는 아미드화될 수 있다(예를 들어, -CONH2, -CONHR, 또는 -CONR2). 카르복시-말단의 아미드화는 프로테아제 분해에 덜 민감한 본 발명의 펩티드를 제공할 수 있으며, 그것의 유리산 형태와 비교하여 그것의 용해도를 증가시키고, 따라서, 높아진 치료 효능을 제공한다. 카르복시-아미드화된 본 발명의 펩티드의 예는 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2이다. 펩티드는 또한 지질화될 수 있고, 이는 향상된 피부 침투를 제공한다. 각 펩티드의 아미노산을 연결하는 하나 이상의 분자 결합은 비-펩티드 결합일 수 있다. 이러한 비-펩티드 결합은, 제한되는 것은 아니지만, 이미도, 에스테르 히드라진, 세미카르바조이드 및 아조 결합을 포함한다. 상기 기술에 따르는 펩티드의 다른 예는 추가 변형과 함께 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2를 포함하는 것이다(SEQ ID NO:1 및 2는 둘 다 이미 카르복시-아미드화 되었음을 주의).
일차 아미노산 서열이 유지되는 한 다양한 변형이 본 발명의 테트라펩티드로 만들어질 수 있다. 일부 변형은 펩티드의 효능을 증가시키는데 사용될 수 있는 반면, 다른 변형은 펩티드 조작을 용이하게 할 수 있다. 전형적으로 변형될 수 있는 펩티드 작용기는 히드록실, 아미노, 구아니디늄, 카르복실 및 아미드기를 포함한다. 이들 기의 전형적인, 비-제한적 반응은, 알킬 할로겐화물에 의한 히드록실기의 아세틸화; 카르복실기의 에스테르화, 아미드화 또는 수소첨가(즉, 알코올로 환원); 아미노기의 탈아미드화, 아실화, 알킬화, 아릴화(예를 들어, 펩티드의 1차 아미노기 또는 리신 잔기의 아미노기)를 포함한다.
펩티드는 가용성 또는 불용성 담체 분자와 콘쥬게이트되어 필요하다면 그것의 용해도 특성을 변형시키고 표적 조직에서 펩티드의 국부 농도를 증가시킨다. 가용성 담체 분자의 예는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 폴리비닐피롤리돈의 폴리머를 포함하며; 불용성 폴리머의 예는 규산염, 폴리스티렌, 및 셀룰로오스를 포함한다. 펩티드는 또한 마이크로-캡슐화되어 치료 적용 동안 및 후에 그것의 안정성을 향상시킬 수 있는데; 전형적으로, 폴리에스테르 및 PEG 마이크로스피어가 펩티드를 캡슐화하고 안정화하는데 사용된다.
마이크로스피어를 펩티드 캡슐화하는 다양한 방법은 캡슐화되는 펩티드 조성물의 친수성 또는 소수성에 따라서 사용될 수 있다. 이러한 방법에 대한 프로토콜의 예는 전체가 참고로써 본원에 포함되는 Wang et al. (J. Control . Release 17:23, 1991) 및 미국 특허번호 4,324,683에서 발견된다. 시험관내 펩티드 방출 연구는 마이크로스피어 안으로 포함 후 펩티드의 상대적 이용가능성을 결정하기 위해 수행될 수 있다. 마이크로스피어(200 mg)는 2.5 mL 인산-완충 식염수(PBS, pH 7.2) 중에서 현탁되고 환경 인큐베이터 진탕기(G-24, New Brunswick Scientific Co., Edison, N.J.) 내 37℃ 및 100rpm에서 교반된다. 특정 샘플링 시간에(처음 4일 동안 매일 그리고 그 후에 격일) 완충 용액이 완전히 제거되고 신선한 PBS로 대체된다. PBS의 펩티드 함량은 Bradford 방법 또는 단백질 분석에 전형적으로 사용되는 다른 적당한 정량 분석을 사용하여 측정된다.
하기 과정 및 변수는 단지 안내 목적을 위해 제공되며 모두 당업자에게 공지되어 있다. 모든 개시된 펩티드는 Advanced ChemTech Apex 396 Multiple Peptide Synthesizer에서 표준 Fmoc (9-플루오레닐메톡시카르보닐) 고체-상 화학을 사용하여 합성될 수 있다. Apex 396은 0.15 mmol의 스케일에서 동시에 40개 까지의 생성을 위한 40-웰 반응 블록이 장착된다. 펩티드는 표준 아미노산을 사용하여 아미드화 또는 유리산 서열 중 하나로서 제조될 수 있다. 수지는 우선 세척되고 N,N-디메틸 포름아미드(DMF)에 의해 미리-팽창된다. 팽창 시간은 Rink 아미드 수지에 대해 한 시간이다. 피페리딘이 수지로부터 완전히 세척된 후, Fmoc 보호기는 25분 동안 DMF 중에서 25% 피페리딘으로 제거된다. 라세미화 과정을 조절하기 위해, Fmoc 아미노산 모노머는 0.5 M DMF 중에서 1-히드록시-벤조트리아졸(HOBt) 또는 1-히드록시-7-아자-벤조트리아졸(HOAt)의 등몰 용액으로 미리-활성화된다. 아미드 커플링은 활성화 약제로서 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU) PyBop® 또는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일-)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU)를 사용하고, 장애된 염기(디이소프로필에틸아민)를 사용하는 염기성 조건하에서 2.5-5.0배 몰의 과잉의 아미노산을 사용하여 수행된다. 커플링 시간은 1-1.5 시간이며 다음에 세척 및 재-커플링에 의해 이중 또는 삼중의 커플링이 수행된 후 성장하는 펩티드 사슬의 탈보호 및 계속이 수행된다. 커플링 효능은 표준 Kaiser 테스트를 사용하여 모니터링된다. 일단 펩티드 합성이 수지에서 완료되면, 최종 Fmoc 기는 상기와 같이 제거되고 서열은 유리 염기 형태로서 남는다.
수지에 대한 펩티드의 산에 불안정한 결합의 분해는 95% 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용하여 수행되며, 적절한 스캐빈저와 함께 물이 첨가된다. 분해가 약 30분 내지 한 시간 동안 진행된 후, 방출된 펩티드는 즉시 분해 블록으로부터 제거되어 감압하에 TFA의 제거 동안 튜브로 옮겨진다. 펩티드는 그 후 역상 C18 컬럼 및 질량분석기를 사용하여 정제 및 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)를 통한 분석 동안 준비된다. 1차 서열 변환 및 예비 정제는 LC/MS/MS 시스템(ABI API2000)을 사용하여 수행된다.
상기 프로토콜에 대해 일반적으로, 펩티드는 모두 전체가 본원에 참고로써 포함되는 Merrifield (J Am Chem Soc . 85:2149, 1963); Carpino et al . (J Org Chem . 51 :3732, 1986); Merrifield et al . (Anal Chem . 38:1905, 1966); 또는 Kent et al.[High Yield Chemical Synthesis Of Biologically Active Peptides On An Automated Peptide Synthesizer Of Novel Design , IN: PEPTIDES 1984 (Ragnarsson, ed.) Almqvist and Wiksell Int., Stockholm (Sweden), pp. 185-188]에 개시된 것과 같은 당업자에게 공지된 어떤 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 바람직하게는, 펩티드는 성장하는 펩티드 사슬에 아미노산의 순차적 첨가를 할 수 있는 기계에 의해 만들어질 것이다. 그러나, 펩티드는 또한 거대-규모의 생산 활동으로 처리될 수 있는 표준 용액 상 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 프로테아제 억제제를 포함할 수 있다. 프로테아제 억제제는 구체적으로 선택된 생체활성 펩티드를 분해하는 것으로 기대되는 표적 프로테아제로부터 선택될 수 있으며; 이러한 선택은 생체활성 펩티드의 길이 및/또는 서열을 기초로 결정된다. 그러나, 프로테아제 억제제가 필수적으로 어떤 특정 방법으로 선택될 필요는 없으며; 예를 들어, 둘 이상의 억제제를 함유하는 프로테아제 억제제 칵테일이 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 프로테아제 억제제는 바이러스를 억제하는 것에 특이적인 것이 아니다. 다음의 종류의 프로테아제 억제제가 본 발명에 포함될 수 있다: 세린 프로테아제 억제제, 시스테인 프로테아제 억제제, 아스파르테이트 프로테아제 억제제, 메탈로프로테이나아제 억제제, 티올 프로테아제 억제제 및 트레오닌 프로테아제 억제제.
프로테아제 억제제는 당업계에 공지되어 있다. 본 발명에 도입될 수 있는 프로테아제 억제제의 비-제한적 예는 아세틸-펩스타틴, AEBSF (4-[2-아미노에틸] 벤젠술포닐 플루오라이드) 히드로클로라이드, ALLM (N-아세틸-Leu-Leu-Met), ALLN (N-아세틸-Leu-Leu-Nle-CHO), 아마스타틴(스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)), ε-아미노-n-카프로산, 아미노펩티다아제 N 억제제, α1-항키모트립신, 안티파인 (히드로클로라이드 또는 디히드로클로라이드), α2-항 플라스민, 항트롬빈 III, α1-항트립신, p-APMSF 히드로클로라이드, 아프로티닌(예를 들어, 소 폐), ATBI (11-잔기 펩티드), 벤즈아미딘 히드로클로라이드, 베스타틴, 베스타틴 메틸 에스테르, 칼파스타틴, 칼펩틴, 카르복시펩티다아제 억제제, 카스파아제 억제제, 카텝신 B 억제제 II, 카텝신 G 억제제 I, 카텝신 억제제 II, 카텝신 억제제 III, 카텝신 억제제 I, 카텝신 K 억제제 I, 카텝신 K 억제제 II, 카텝신 K 억제제 III, 카텝신 L 억제제 I, 카텝신 L 억제제 II, 카텝신 L 억제제 IV, 카텝신 L 억제제 V, 카텝신 L 억제제 VI, 카텝신 S 억제제, 카텝신/서브틸리신 억제제, 키모스타틴, 키모트립신 억제제 I, 시스타틴, 1,5-단실-glu-gly-arg 클로로메틸 케톤 디히드로클로라이드, 3,4-디클로로이소코우마린, 디이소프로필플루오로포스페이트, 디펩티딜펩티다아제 II 억제제, 디펩티딜펩티다아제 IV 억제제 I, 디펩티딜펩티다아제 IV 억제제 II, E-64 프로테아제 억제제, 에코틴, EDTA 디나트륨 염 디하이드레이트, EDTA 테트라나트륨 염, EGTA, 엘라스타아제 억제제 I, 엘라스타아제 억제제 II, 엘라스타아제 억제제 III, 엘라스타티날, 6-아미디노-2-나프틸-4-구아니디노벤조에이트 디메탄술포네이트, glu-gly-arg-클로로메틸 케톤, 2-구아니디노에틸머캅토숙신산, 헥사데실술포닐 플루오라이드, α-요오도아세트아미드, 키니노겐, 류히스틴, 류펩틴 헤미술페이트, α2-마크로글로불린, DL-2-머캅토메틸-3-구아니디노에틸티오프로파논산, 펩스타틴 A, 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 포스포라미돈 디나트륨 염, PPack II 트리플루오로아세테이트 염, PPack 디히드로클로라이드, 프롤릴 엔도펩티다제 억제제 II, Na-토실-lys 클로로메틸 케톤 히드로클로라이드, Na-토실-phe 클로로메틸 케톤, 트리펩티딜펩티다제 II 억제제, 트립신 억제제(옥수수 또는 대두), D-val-phe-lys 클로로메틸 케톤 디히드로클로라이드, 1,3-디-(N-카르복시벤조일-L-류실-L-류실)아미노 아세톤, o-페난트롤린, 우르솔릭산 (예를 들어, 로즈마리 추출물), 트라넥사믹산(4-[아미노메틸]시클로헥산-1-카르복실산) (미국에서 Cyklokapron으로서 임상적으로 시판되고 아시아에서 Transamin으로서 시판됨), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Arg(Pmc), 벤조일-Arg-니트로아닐리드, 벤조일-Arg-나프틸아미드, 및 α-2-마크로글로불린을 포함한다.
본 발명에 사용되는 프로테아제 억제제는 효소와 같은 펩티드 또는 단백질일 수 있다. 이러한 억제제의 비-제한적 예는 알파-1-항트립신, 보체 1-억제제, 항트롬빈, 알파-1-항 키모트립신, 플라스미노겐 활성제 억제제 1, 및 뉴로세르핀을 포함하는 세르핀이다.
피부 관리 제제에 전형적으로 포함되는 성분은 당업계에 잘 알려져 있다. 생체활성 펩티드 성분 이외에, 본 발명은 니아신아미드, 피탄트리올, 파르네솔, 비사볼롤 및 살리실산과 같은 다른 활성 약제를 함유할 수 있다. 어떤 추가 활성 약제는 생체활성 펩티드 성분과 함께 상승적으로 작용할 것이고, 또는 조제물의 반감기를 향상시킬 것으로 기대된다.
조성물이 동물 또는 인간 피부와 접촉하게 되는 경우, 추가 성분은 각질 조직에 도포하기에 적당한 것으로 선택되어야 한다(즉, 안정성, 낮은 독성, 저자극성). 전체가 참고로써 본원에 포함되는 The CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Second Edition (1992)은 본 발명의 조성물에서 사용에 적당한 피부 관리 산업에서 흔히 사용되는 매우 다양한 비-제한적 화장품 및 약학 성분을 기술한다. 이 성분의 예는 연마재, 흡착제, 향수와 같은 미적 성분, 색소, 염색/색료, 에센셜 오일, 피부 감각제, 수렴제 등(예를 들어, 클로브유, 멘톨, 장뇌, 유칼립투스 오일, 유게놀, 멘틸 락테이트, 위치헤이즐 증류액), 항-여드름제(예를 들어, 레조르시놀, 황, 살리실산, 벤조일 퍼옥사이드, 에리스로마이신, 아연), 해산제, 소포제, 항미생물제(예를 들어, 요오도프로필 부틸카르바메이트), 항산화제, 결합제, 생물학적 첨가제, 완충제, 팽화제, 킬레이트제, 화학적 첨가제, 변성제, 근육통제, 폴리머(예를 들어, 에이코센 및 비닐 피롤리돈의 공중합체), 백탁제, pH 조절제, 추진체, 환원제, 제거제, 피부 표백 및 미백제(예를 들어, 히드로퀴논, 코지산, 아스코르브산, 마그네슘 아스코르빌 포스페이트, 아스코르빌 글루코사민), 피부-조절제(예를 들어, 여러종류이고 폐색작용을 포함하는 습윤제), 피부 진정 및/또는 치료제(예를 들어, 판텐올 및 유도체[예를 들어, 에틸 판텐올], 알로에 베라, 판토텐산 및 그것의 유도체, 알란토인, 비사볼롤, 글리시리진산 디칼륨), 농후제, 미립자 재료, 구조화제 및 비타민을 포함한다. 대다수의 이들 약제는 특히 다양한 성분 기술에 대하여, 전체가 본원에서 참고로써 포함되는 미국 특허 번호 6,492,326에서 상세하게 기술된다.
본 발명의 조성물은 미립자 재료, 바람직하게는 산화금속을 함유할 수 있다. 이들 미립자는 코팅 또는 미코팅, 하전 또는 비하전될 수 있다. 본 발명을 제조하는데 유용한 미립자 재료의 비-제한적 예는 옥시염화 비스머스, 산화철, 운모, 황산바륨 및 TiO2로 처리된 운모, 실리카, 나일론, 폴리에틸렌, 활석, 스티렌, 폴리프로필렌, 에틸렌/아크릴산 공중합체, 견운모, 산화알루미늄, 실리콘 수지, 황산 바륨, 탄산칼슘, 아세테이트 셀룰로오스, 이산화티타늄, 폴리메틸 메타크릴레이트, 및 그것의 혼합물을 포함한다. TiO2, ZnO (산화아연), 또는 ZrO2와 같은 무기 미립자 재료는 다수의 공급원으로부터 상업적으로 이용가능하다. 바람직하게는, 미립자 재료는 0.01중량% 내지 2중량%, 더 바람직하게는 0.05중량% 내지 1.5중량%, 또는 훨씬 더 바람직하게는 0.1중량% 내지 1중량%의 수준의 조성물로 존재한다(모두 근사치로 측정).
본 발명의 조성물은 습윤제, 보습제, 또는 피부 조절제로부터 선택되는 조절제를 함유할 수 있다. 다양한 이들 재료가 사용될 수 있고 각각은 0.01중량% 내지 20중량%, 더 바람직하게는 0.1중량% 내지 10중량%, 및 훨씬 더 바람직하게는 0.5중량% 내지 7중량%의 조성물(모두 근사치로서 측정)의 수준에서 존재될 수 있다. 이들 재료는, 제한되는 것은 아니지만, 구아니딘; 우레아; 글리콜산 및 글리콜레이트염(예를 들어, 암모늄 및 4가 알킬 암모늄); 살리실산; 락트산 및 락테이트 염(예를 들어, 암모늄 및 4가 알킬 암모늄); 그것의 다양한 형태 중 어떤 것에서 알로에 베라(예를 들어, 알로에 베라 겔); 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 글리세롤, 헥산트리올, 부탄트리올, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜 및 헥실렌 글리콜과 같은 폴리히드록시 알코올; 폴리에틸렌 글리콜; 당(예를 들어, 멜리비오스) 및 전분; 당 및 전분 유도체(예를 들어, 알콕시화된 글루코오스, 프럭토오스, 글루코사민); 히알루론산; 락타미드 모노에탄올아민; 아세타미드 모노에탄올아민; 판텐올; 알란토인; 페트롤리움 젤리; 및 그것의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 조성물은 수중유 에멀젼을 제조하는데 바람직한 구조화제를 함유할 수 있다. 어떤 이론에 의해 제한되는 것 없이, 구조화제는 조성물의 안정성에 기여하는 조성물의 유동적 특성을 제공하는데 도움을 주는 것으로 믿어진다. 예를 들어, 구조화제는 액체 결정 겔 네트워크 구조의 형성에 도움을 주는 경향이 있다. 구조화제는 또한 에멀젼화제 또는 계면활성제로서 작용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 조성물은 조성물의 하나 이상의 구조화제의 0.1중량% 내지 20중량%, 더 바람직하게는 0.1중량% 내지 10중량%, 훨씬 더 바람직하게는 0.5중량% 내지 9중량%를 함유한다(모두 근사치로 측정한다).
본 발명에 포함을 위한 바람직한 구조화제는 스테아린산, 팔미트산, 스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 베헤닐 알코올, 약 1 내지 약 5개 평균의 에틸렌 옥사이드 단위를 가지는 스테아릴 알코올의 폴리에틸렌 글리콜 에테르, 약 1 내지 약 5개 평균의 에틸렌 옥사이드 단위를 가지는 세틸 알코올의 폴리에틸렌 글리콜 에테르, 및 그것의 혼합물로부터 선택된다. 본 발명의 더 바람직한 구조화제는 스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 베헤닐 알코올, 약 2개 평균의 에틸렌 옥사이드 단위를 가지는 스테아릴 알코올의 폴리에틸렌 글리콜 에테르(스테아레스-2), 약 2개 평균의 에틸렌 옥사이드 단위를 가지는 세틸 알코올의 폴리에틸렌 글리콜 에테르, 및 그것의 혼합물로부터 선택된다.
사용 방법
본 발명의 추가적인 구체예는 조제물에서 또는 치료제로서 상기-기술한 펩티드를 사용하는 방법에 관한 것이다. 이들 방법은 단일 펩티드, 또는 조합에서 다중 펩티드의 사용을 수반할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 UV 광선에 과-노출에 의한 피부의 손상을 치료 및 예방하는데 사용될 수 있다. 또한, 펩티드는 피부(표피, 진피 및 하피) 및 관련된 점막조직의 상처를 치료하는데 사용될 수 있다. 이들 질환에 대한 본 발명 펩티드의 유익한 효과는 그것의 항-염증 특성에 대한 부분과 관련된다. 본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "관련된 점막 조직"은 피부에 유사한 방법으로 조직화된 어떤 조직에 관한 것이며, 상피 세포를 함유한다. 이러한 조직의 예는, 구강, 코인두, 귀 및 비뇨 생식기의 표면뿐만 아니라 눈의 눈꺼풀결막이다. 관련된 점막 조직의 다른 예는 식도, 위, 소장, 대장(결장), 및 직장을 포함하는 소화관의 전체 내벽(즉, 내강)을 포함한다. 이런 후자의 예는 피부에 영향을 미칠 수 있는 것과 같은 상처/병소를 입을 수 있고, 그 자체로 본 발명의 표적이 될 수 있다. 이들 조직에 영향을 미칠 수 있고 본 발명의 펩티드로 치료가 잘 받아들여지는 상처/병소/상해의 예는 찰과상, 수포, 화상, 열상, 천자상, 궤양, 자반, 발진 및 흉터이다. 수술 후 조직 외상은 펩티드로 치료될 수 있다. 염증이 상처 자리에 감염을 막는데 도움을 주지만, 양호한 소독의 실행의 제공은 본 발명의 펩티드를 사용하여 염증을 차단하는 것과 관련될 수 있는 어떤 결점을 무효화 한다.
본 발명의 펩티드는 또한 모든 상기 언급한 조직에서 노화 효과를 예방 또는 반전시키는데 사용될 수 있다. 관련된 방법에서, 펩티드는 태양광과 같은 다양한 외부 작용제에 대한 노출에 의해 손상된 조직에 사용될 수 있었다. 노화 및 노출과 관련된 피부 쇠약의 예는 피부 주름형성, 건조함, 피부약화, 처짐 및 훨씬 더 멍이 들기 쉬운 경향이다. 본 발명은 또한 피부에 더 젊은 외관 및 감촉을 제공하고, 더 나은 기능을 제공하는 것과 관련된 화장품으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 펩티드를 사용하여 효과적으로 치료되는 다른 조직 문제는 알레르기 또는 자가면역, 염증 성분 요소를 가지는 이것 둘 다와 관련되어 있다. 이러한 병은 피부염, 건선, 경피증, 천포창 및 대장염을 포함한다.
상기 치료 방법에서 펩티드를 전달하는데 사용되는 조성물은 에어로졸, 에멀젼, 액체, 로션, 크림, 페이스트, 연고, 분말, 폼(foam), 또는 다른 약학적으로 허용가능한 조제물의 형태일 수 있다. 추가로, 펩티드는 탈이온/증류수, PBS 또는 표준 의료 식염수 용액과 같은 덜 관련된 조제물을 사용하여 전달될 수 있다. 일반적으로, 약학적으로 허용가능한 조제물은 인간 피부 또는 점막 표면에서 사용에 적당한 어떤 담체를 포함한다. 이러한 약학적으로 허용가능한 담체는 에탄올, 디메틸 술폭시드, 글리세롤, 실리카, 알루미나, 전분 및 동등한 담체 및 희석제를 포함한다. 조제물은 선택적으로 화장품의 어필을 가질 수 있고, 및/또는 본 발명의 펩티드의 치료 작용을 위한 보조제로서 작용할 수 있는 레티노이드 또는 다른 펩티드와 같은 다른 약제를 함유할 수 있다. 항생제는 또한 감염을 막기 위해 조제물에 첨가될 수 있고, 이에 의해 최대 치료 과정이 일어나도록 허용한다. 조성물에서 펩티드의 농도는 약 0.1 μg/mL 내지 약 50 μg/mL 또는 약 0.1 μg/mL 내지 약 20 μg/mL일 수 있지만; 그러나, 사용되는 궁극적 농도는 상처/조직 상태의 특성, 본 발명의 펩티드의 생체-활성 및 향상된 조성물 흡수를 얻기 위한 어떤 보조제의 사용 또는 기술에 따라서 이들 범위 밖에서 다양할 수 있다. 이러한 결정은 당업계의 통상적인 기술 내에 있다.
본 발명의 펩티드 및 관련된 조성물의 투여는 인간 및 모든 동물(예를 들어, 돼지, 암소, 말, 양, 염소, 마우스, 래트, 고양이, 개, 페럿)을 포함하는 동물을 위해 만들어질 수 있다. 적용은 또한 조직 이식, 조직 배양 생성물, 산소 및 드레싱과 같은 전형적 및/또는 실험적 재료와 조합될 수 있다. 일반적으로, 조성물은 국부, 경구, 경피, 전신으로, 또는 염증 자리에 본 발명의 펩티드를 전달하는데 유용한 당업자에게 알려진 어떤 다른 방법에 의해 투여될 수 있다. 조성물은 또한 시험관내 또는 시험관 외 방법, 예를 들어, 배양물에서 성장하는 세포 또는 환자 이식물로 적용될 수 있다.
그것의 작은 크기 때문에, 펩티드는 피부를 통한 일정 수준의 투과성을 단독으로 얻을 수 있는 것으로 기대되지만; 그러나, 특정 기술이 이 움직임을 확대하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 친유성(비-극성)기가 펩티드에 첨가될 수 있고, 또는 펩티드는 더 낮은 상피층으로 자리 옮김을 허용하는 각질층에 펩티드 접근성을 향상시키기 위해 친유성 부형제로 피부에 전달될 수 있다. 이 방법에서, 이러한 친유성 변형은 프로-드러그 효과를 가지는 것으로 고려될 수 있다. 공지된 용매 및 계면활성제와 같은 침투 향상제는 더 양호한 펩티드 흡수를 허용하기 위한 부형제로 사용될 수 있다. 표적화된 조직/상해에 펩티드 접근을 향상시키는데 유용한 것으로 기대되는 구체적 기술은 이온영동법, 전기영동법 및 초음파를 포함한다. 이온영동 기기는 전해질 용액에 담그어진 2개의 전극으로 이루어지며 피부에 위치된다. 전류가 전극을 가로질러 사용될 때, 전기장은 펩티드의 전달을 추진시키는 각질층을 가로질러 만들어진다. 전기천공법은 액체 이중층을 통한 침투를 증가시키기 위한 고전압 전기 펄스의 적용을 수반한다. 이는 지속기간 및 전류의 적용의 강도가 이온영동과 다르다(이온영동은 상대적으로 일정한 저-전압 전기장을 사용한다). 전기천공법의 고전압 전기펄스는 높은 정도의 침투 향상을 제공할 수 있는 지질막에서 친수성 기공의 가역적 형성을 유발하는 것으로 믿어진다. 초음파는 음파 이동을 통해 조직의 수축 및 팽창을 야기하는 피부에서 16 kHz보다 큰 주파수를 가지는 음파를 사용한다. 결과된 압력 변화는 펩티드의 침투를 향상시킬 수 있는 다수의 방법(예를 들어, 공동현상, 혼합, 온도의 증가)의 원인이 된다.
본 발명 펩티드의 추가적 특징, 생성 방법 및 사용은, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,974,799 및 5,492,894에서 기술된다. 이들 특허는 둘 다 전체가 참고로써 본원에 포함된다.
하기의 실시예는 본 발명의 특정의 바람직한 구체예를 증명하도록 포함된다.
실시예
본 발명을 개발하는 목적은 UV선에 의해 유발되는 것과 같은 염증 과정을 하향-조절을 하기 위한 능력을 가지는 500 달톤 미만의 펩티드를 확인하는 것이다. 소분자량의 이러한 확인된 펩티드는 피부의 상층을 가로질러 관통하는 그것의 능력을 보장한다. 하기의 통찰은 본 발명의 개발을 부분적으로 가이드 한 선행 기술로부터 추론된다.
1. UV선은 사이토카인의 생성을 이끄는 염증 및 이후의 피부 광노화의 원인이 되는 요소의 유발의 원인이 된다. 이 나중 과정의 어떤 특징은 콜라겐 파괴에 기인하는 주름형성, 과도한 각질세포 증식 및 피브린 침착에 기인하는 피부 비후 및 멜라닌 과생성에 기인하는 과다 색소침착이다. UV-유발 염증을 개시하는 인자는 IL-1, IL-6, IL-8 및 TNF-α와 같은 사이토카인이다.
2. 특정의 펩티드 서열은 인간 CD40, Trance 및 IRAK (IL-1 수용체-관련 키나아제)를 포함하는 광범위한 면역-조절 단백질에 TRAF6 (TNF 수용체-관련 인자-6)의 결합을 억제할 수 있는 것을 확인하였다. 이들 TRAF6-관련 결합 사건은 TNF, IL-1 및 톨-유사 수용체 패밀리 단백질로부터 세포 면역 반응의 중추 조절자인 NF-κB까지 자극을 전달한다. 이들 TRAF6 결합 사건을 억제하는 펩티드는 일반식 Pro-X-Glu-X-X-(방향족/산성 아미노산) [PXQXX-(방향족/산성)] (SEQ ID NO: 16)을 가지며 몇몇의 TRAF6-상호작용 단백질에 위치된다.
3. 서열 PXQXX-(방향족/산성) (SEQ ID NO: 16)를 함유하는 펩티드는 몇몇의 이유 때문에 광노화와 싸우는데 사용될 수 없다. 한 예로서, 이 펩티드는 그것의 억제 효과를 행사하기 위한 융합 단백질 내에 포함되어야 하며; 이러한 거대 단백질은 염증 반응 자리로 접근하기 위해 상부 피부층을 가로질러 유효하게 용해되지 않는다. 또한, 실행 수준에서, 억제 펩티드 서열을 가지는 융합 펩티드는 국부적 생성물에 포함을 위해서는 너무 크고 비쌀 것이다.
4. NF-κB 신호화 경로는 전염증 사이토카인 및 스트레스 반응의 조절에 직접적으로 수반되는 우세한 경로이다. TNF-α, 지질다당류를 포함하는 다양한 NF-κB 활성제 및 UV 광에 피부세포의 노출은 억제 단백질 IkappaB의 인산화반응 및 분해를 유발한다는 것을 보여주었다. 유리된 NF-κB는 그 뒤에 핵으로 이동되며, 사이토카인의 발현을 조절한다.
5. 다양한 종류의 콜라겐은 신체의 다른 결합 조직에 포함되는 세포밖 매트릭스에 기여한다. 이들 다른 콜라겐은 섬유아세포, 다른 결합 조직 세포, 및 IL-1 및 TNF와 같은 전염증 사이토카인에 의해 유발되는 염증 세포에 의해 생성되는 특정 MMP에 의해 분해된다. 염증 자극에 대한 반응에서 방출되는 IL-1, IL-6, TNF-α, 및 인터페론(IFN-α 및 IFN-γ)은 MMP의 강한 유발물질임이 분명하다. MMP 분비의 조절이 세포 종류 및 자극에 의존하지만, 전사 인자 AP-1이 섬유아세포 내 MMP-1의 상향조절에 직접 관련된다는 것이 나타났다. 또한 피부에서 AP-1 활성 및 결과 MMP 발현이 UV선에 의해 유발된다는 것이 시험관 내 및 생체 내에서 나타났다.
이들 통찰을 기초로, PXQXX-(방향족/산성) (SEQ ID NO: 16) 펩티드가 단지 비-UV-유발 염증 과정을 억제하는 것으로 나타났지만, 관련된 서열은 UV-유발된 염증을 억제할 수 있는 것으로 고안된 한편 융합 단백질 내에 포함을 필요로 하지 않도록 위치된다(즉, 펩티드는 짧은 펩티드일 것이다.). 하기 실시예 1-5는 이 주제에 관한 것이다. 실시예 6은 생체활성 펩티드를 포함하는 조성물 내 프로테아제 억제제의 일반적 사용에 관한 것이다.
실시예 1: PXQXX-(방향족/산성) (SEQ ID NO: 16) 펩티드와 관련된 펩티드의 설계 및 합성.
본 발명의 펩티드를 합리적으로 설계하기 위해 하기 변수를 수반하였다:
1. 펩티드는 길이에 있어서 단지 4개의 아미노산이다(즉, 500 달톤 미만의 테트라펩티드).
2. 서열은 TRAF6-결합 단백질의 보존된 결합 도메인[PXQXX-(방향족/산성)] (SEQ ID NO: 16)으로부터 선택된다.
3. 테트라펩티드 서열은 PXQXX-(방향족/산성) (SEQ ID NO: 16)의 위치 1에서 프롤린 및 위치 3에서 글루타메이트를 보존한다.
4. 위치 2 및 4는 PXQXX-(방향족/산성) (SEQ ID NO: 16)의 자연적으로 발생하는 형태로 이들 자리에 존재하는 아미노산이 배치된다:
a. 위치 2: Q, T, L, G, E, V 또는 P.
b. 위치 4: I, M, D, V, N, S 또는 T.
5. 추가 변형을 만들기 위해, 양으로 하전된 잔기를 또한 위치 4에서 사용하였고; 이러한 아미노산 배치는 천연에서는 회피되었다.
펩티드 합성: 모든 펩티드를 Advanced ChemTech (Louisville, KY) Apex 396 Multiple Peptide Synthesizer에서 표준 Fmoc chemistry를 사용하여 합성하였다. Rink 아미드 수지를 우선 세척하였고, DMF로 미리 팽창시켰다. Fmoc-보호기를 DMF 중에서 25% 피페리딘으로 제거하였고, 그 후에 수지를 세척하여 미량의 피페리딘을 제거하였다. Fmoc 아미노산 모노머를 DMF 중의 HOAt 또는 HOBt의 등몰(0.5 M) 용액에서 미리 활성화시켰다. 아미드 커플링을 장애된 염기(디이소프로필에틸아민)를 사용하여 염기성 조건하에서 HATU, PyBop 또는 HBTU 및 2.5- 내지 5-배 몰 과잉의 아미노산을 사용하여 수행하였다. 표준 Kaiser 시험을 사용하여 커플링 효율을 모니터링하였다.
산 불안정 링커로부터 펩티드의 분해는 적절한 스캐빈저를 첨가하면서 95% 트리플루오로아세트산 및 물을 사용하여 수행하였다. 분해 블록으로부터 제거 후, 이들 펩티드를 정제하였고 역상 C-18 컬럼 및 질량분석기를 사용하여 HPLC를 통해 분석하였다. 일차 서열 배치 및 예비적 정제를 LC/MS/MS 시스템(ABI API2000)을 사용하여 수행하였다. 제조한 펩티드의 서열을 표 1에서 제공한다.
Figure 112010031370223-pct00001
실시예 2: IL-6 및 MMP-1의 세포 배양물 및 검출.
인간 피부 상피 세포(ATCC CRL-2592), 각질세포 (ATCC CRL-2404) 및 피부 섬유아세포(ATCC CRL-7481)를 본 연구에서 사용하였다. 세포를 6-웰 플레이트에 씨딩하였고, 1.5 g/L 중탄산나트륨을 함유하도록 조절하고 10% 소 태아 혈청(FBS)으로 보충한 둘베코 변형 이글 배지(DMEM; 4 mM L-글루타민, 4.5 g/L 글루코오스)에서 >95% 합류로 성장시켰다. 각질세포에 대해, 세포를 5 ng/mL 인간 재조합 상피 성장 인자(EGF; Invitrogen, Grand Island, NY)로 보충한 각질세포 성장 배지(혈청 없음)에서 성장시켰다. 세포 단일층이 >95% 합류에 도달한 후, 세포는 혈청이 없었고, 또는 혈청이 없는 완전한 배지에서 24시간 동안 EGF가 없었다. 각각 365 또는 302 nm에서 설정한 조사 파장으로 UVLMS 램프 (4-W 모델, 3UV 어셈블리; Upland, CA)를 사용하여 UVA 또는 UVB를 발생시켰다. UV 램프를 조직 배양 플레이트 15cm 위에 두었다. UV 처리 전, 조직 배양물 배지를 PBS로 대체하였고, 그 후 세포를 35초 (상피 세포 및 섬유아세포) 또는 25 초(각질세포) 동안 UVB 램프 (450 μW/cm2, 라디오미터를 사용하여 측정) 하에 두었다. 30초 동안 섬유아세포와 함께 UVA 처리를 수행하였다(500 μW/cm2). UV 처리 후, PBS를 특정된 농도에서 펩티드를 함유하지 않거나 펩티드를 함유하는 완전 배지(혈청 또는 EGF가 없음)로 즉시 대체하였고, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 15-24시간 동안 인큐베이팅하였다. 그 후 세포 배지를 수집하였고 2분 동안 15000 rpm에서 스핀다운하여 세포 잔해를 제거하였다. 배지에서 IL-6 및 MMP-1 수준을 제조업자의 설명서에 따라서 인간 IL-6 (DIACLONE, Stamford, CT) 및 MMP-1 (Calbiochem, San Diego, CA) ELISA 키트를 사용하여 각각 측정하였다. 이들 측정은 UV 노출에 대한 세포 염증 활성의 지시자로서 역할을 하였다.
실시예 3 : 항-염증 활성에 대한 펩티드 스크리닝: 인간 피부 상피 세포에서 UV-유발된 IL-6 발현의 억제.
도 1에서 나타내는 바와 같이, 인간 상피 세포는 UVB 조사에 반응하여 IL-6 발현을 상향조절한다. 표 1에 열거된 모든 테트라펩티드는 이 반응의 잠재적 하향-조절을 위해 40 μg/mL에서 스크리닝 시험을 받았다(데이터는 제시하지 않음). 제 1 실험에서 IL-6 발현을 하향-조절한 펩티드들을 제 2 실험에서 재시험하였고, 이 결과를 도 1에 나타낸다.
40 μg/mL에서 테트라펩티드 P1422 (SEQ ID NO:1) 및 P1423 (SEQ ID NO:2)은 둘 다 피부 상피 세포에서 재생가능한 억제를 나타내었다. 도 2에서 나타낸 바와 같이, 이러한 하향 조절은 이들 펩티드 둘 다에 대해 농도-의존적이다. P1422 (SEQ ID NO:1)는 10 및 20 μg/mL에서 각각 19% 및 25%로써 IL-6 수준을 감소시켰고; P1423 (SEQ ID NO:2)은 10 및 20 μg/mL에서 각각 10% 및 20%로써 IL-6 수준을 감소시켰다. 세포가 테트라펩티드 P1422 (SEQ ID NO:1) 및 P1423 (SEQ ID NO:2)을 제외한 다른 테트라펩티드로 처리되었을 때 IL-6 발현에 대한 억제 효과가 관찰되지 않았다는 사실은 신규의 항-염증 활성이 SEQ ID NO: 14 및 SEQ ID NO: 15와 같은 특정 서열에 있다는 것을 제안한다.
실시예 4: 항-염증 활성에 대한 펩티드 스크리닝: 인간 피부 각질세포 및 섬유아세포에서 UV-유발된 IL-6 발현의 억제.
UV-조사된 상피의 각질세포 및 섬유아세포는 전염증 사이토카인을 방출하는 것으로 잘 알려져 있다. 따라서 피부 상피 세포 이외의 이들 세포는 광노화의 쇠약 효과를 초래하는 사건의 캐스캐이드에 기여할 수 있다. 이런 이유로, P1422 (SEQ ID NO:1) 및 P1423 (SEQ ID NO:2)을 이들 세포 형태로 UV-유발된 IL-6 발현에 대한 억제 활성에 대해 시험하였다. 도 3에서 나타내는 바와 같이(A 및 B), 이들 테트라펩티드는 둘 다 UVB-처리한 인간 각질세포에서 IL-6 발현을 하향-조절한다.
이러한 펩티드-매개 IL-6 하향-조절은 또한 UVB에 노출 후 인간 섬유아세포에서 분명하다. IL-6 발현의 P1423 (SEQ ID NO:2)-매개된 억제는 대조군 세포 IL-6 생성(펩티드 처리 없음, 데이터는 제시하지 않음)과 비교하여, 2, 5 및 10 μg/mL에서 펩티드가 각각 24, 30 및 48%로써 IL-6 수준을 감소시키기 때문에 용량-의존적이다. 10 μg/mL에서, P1422 (SEQ ID NO:1)는 대조군 세포 IL-6 생성과 비교하여 30%로서 섬유아세포에서 UV-자극 IL-6 발현을 감소시키지만; 그러나, 낮은 농도의 펩티드가 사용될 때 IL-6의 상당한 감소가 관찰되지 않았다.
실시예 5: 항-염증 활성에 대한 펩티드를 스크리닝: 인간 피부 섬유아세포에서 UV-유발된 MMP-1 발현의 억제.
UV (UVA 및 UVB) 조사는 섬유아세포에서 MMP-1 발현 및 활성화를 증가시킨다. UV 노출에 반응하여 인간 피부에서 생성된 대부분의 MMP는 거주 섬유아세포로부터 유발된다. MMP 생성이 피부에서 UV-유발된 염증 반응(예를 들어, 부종) 및 그것의 만성적 효과(예를 들어, 주름 형성)의 원인이 되기 때문에, 섬유아세포 MMP-1 발현의 억제는 피부에서 태양광의 부정적 효과를 완화해야 한다.
이를 염두에 두고, 섬유아세포에서 UV-유발된 MMP-1 발현에서 테트라펩티드 P1422 (SEQ ID NO:1) 및 P1423 (SEQ ID NO:2)의 효과를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 45초 동안 UVA 치료(500 μW/cm2) 후, 섬유아세포를 이들 펩티드와 함께 또는 없이 처리하였다. 10 μg/mL에서 P1422 (SEQ ID NO:1) 및 P1423 (SEQ ID NO:2)은 둘 다, 도 4에서 나타내는 바와 같이(A 및 B) UVA-유발된 MMP-1 발현을 하향 조절할 수 있었다.
Fagot et al. (2002, 2004)은 UVB-자극된 각질세포에 의해 생성된 사이토카인이 진피의 섬유아세포에서 MMP-1의 인접분비(paracrine) 상향조절을 달성한다는 것을 보여주었다. UVB-처리된 각질세포에 의해 조절되는 배지에서 섬유아세포를 인큐베이팅함으로써 이런 방식의 신호화를 실험적으로 모델링하였다. MMP-1을 이 방법으로 처리한 섬유아세포 배양물에서 상향조절하였지만, 테트라펩티드 P1422 (SEQ ID NO:1) 또는 P1423 (SEQ ID NO:2) 중 하나와 함께 배양한 것은 크게 못 미치는 MMP-1 유발을 나타내었다(도 5 A 및 B).
결론적으로, 이들 연구는 TRAF6-결합 도메인을 기초로 하는 특정 테트라펩티드가 UV선에 의해 유발되는 IL-6 및 MMP-1의 수준을 하향-조절할 수 있다는 것을 보여주었다. UV선에 의해 유발되는 바와 같은 이들 염증 경로가 TRAF6-관련 신호 사건을 수반하는 것이 이전에 알려지지 않았기 때문에, 이 발견들은 놀랍다. 이들 짧은 펩티드에 의한 주요 염증 매개자(IL-6) 및 반응기(MMP-1) 둘 다의 억제는 피부 염증 및 그것의 해로운 효과의 예방 및 치료에서 그것의 적용가능성을 증명한다.
실시예 6: 프로테아제 억제제를 포함하는 발명의 구체예
본 발명은 또한 생체활성 펩티드와 조합하여 프로테아제 억제제를 함유하는 피부 관리 조제물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 피부 및 다른 상피 표면(예를 들어, 점막 표면)에 대해 화장품 및 치료제 활성을 나타내는 것으로 기대되었다. 세린 프로테아제 억제제는 본 발명의 실시예 성분이다. 피부에서 치료제 및 화장품의 변화를 달성하기 위한 생활성 펩티드 및 프로테아제를 함유하는 조성물을 사용하는 방법은 본 발명의 다른 양태이다.
광범위한 펩티드 구성요소가 피부에 또는 피부 안으로 생체활성의 집합체를 전달하기 위해 화장품 및 피부관리 산업에서 사용된다(표 2). 피부의 바깥층, 각질층(SC)이 단백질 및 펩티드를 분해할 수 있는 프로테아제의 집합체를 함유한다는 것이 잘 기록되었다. 특정 펩티드의 생체활성은 피부에 적용될 때 SC에서 발휘된다. 따라서, SC에 위치된 프로테아제는 생체활성 펩티드를 포함하는 국부 피부 적용의 완전한 치료제 및/또는 화장품의 이점을 달성하는 장벽을 구성한다.
SC는 프로테아제의 적어도 3개의 패밀리, 세린, 시스테인 및 아스파르테이트 프로테아제를 함유한다. 세린 프로테아제(SP)는 상피-특이적 프로테아제 칼리크레인-5 (또한 SC 트립신 효소로서 알려짐, SCTE) (Brattsand and Egelrud, 1999) 및 칼리크레인-7 (SC 키모트립신 효소로서 알려짐) (Hansson et al., 1994)을 포함한다. 이들 칼리크레인은 둘 다 상피 벗음(desquamatory) 과정(즉, 피부의 허물벗음)에 수반되는 것으로 알려져 있다. 피부에서 분리한 추가의 세린 프로테아제는 플라스민 및 유로키나아제이다(Voegeli et al., 2007). SC 티올 프로테아제(SCTP) 및 카텝신 D는 각각 SC에 존재하는 시스테인 및 아스파르테이트 프로테아제의 일부이다(Bernard et al ., 2003; Horikoshi et al ., 1998).
SC의 생물리학적 및 생화학적 특성에서 계절적 변형이 잘 기록된다. 특히, 겨울철은 일상적으로 커버된 피부에 비해 노출된 피부의 특성에 더욱 심각하게 영향을 미치는 것으로 나타났다. 게다가, 예컨대 건조 피부 질환으로 위협받을 때, 얼굴의 SC는 전염증 사이토카인 및 프로테아제의 증가된 수준을 함유하는 것으로 나타났다. Voegeli et al . (2007)은 겨울 및 여름 동안 건강한 코카시안 피험자의 연이은 테이프 박리를 분석함으로써 볼 및 팔뚝의 다른 층의 SC에서 열쇠 세린 프로테아제 활성(칼리크레인-5, 칼리크레인-7, 유로키나아제, 플라스민 및 트립타아제-유사 효소)의 분포를 시험하였다. 팔뚝 SC에서 관찰한 활성 수준과 비교하여, 얼굴에서 플라스민, 유로키나아제 및 트립타제의 활성 수준은 대략 5 내지 8배 더 높았던 반면, 볼에서 칼리크레인 -5 및 -7의 활성 수준은 대략 2 내지 4배 더 높다. 따라서, 보호된 피부 영역은 환경에 노출된 그것의 영역보다 더 적은 프로테아제 활성을 나타내며, 가능하다면 노출된 피부에서 무증상 염증을 나타낸다. 하기 통찰은 또한 Voegeli et al . (2007)에 의해 만들어졌고: (i) 정상의 건강한 팔뚝 피부에서, 외부의 SC는 그것의 더 깊은 층에서보다 더 큰 세린 프로테아제 활성을 나타내고; (ii) 팔뚝과 비교하여, 유로키나아제- 및 플라스민-유사 활성이 볼로부터 SC 박리를 상승시켰고, 플라스미노겐 캐스케이드의 활성을 확인하였고; (iii) SC에서 트립타아제-유사 활성은 또한 볼로부터의 샘플에서 상승하고, 가능하다면 장벽-면역저하된 피부에서 비만 세포의 수반 및/또는 각질세포에 의한 신규의 트립타아제-유사 효소의 합성을 나타낸다. 임상적으로 정상인 볼의 피부로부터 유도된 SC에서 관찰되는 유로키나아제, 플라스민, 칼리크레인-5, 칼리크레인-7 및 트립타아제-유사 효소 활성의 상승이 있기 때문에, 상피 장벽이 손상되는 경우 이들 효소의 훨씬 더 높은 활성이 피부 조건하에서 존재할 것으로 예상된다.
주사(rosacea) 및 건선과 같은 피부의 임상적 조건에 대해 SC에서 존재하는 프로테아제를 연결하는 다수의 최근의 연구가 있었다(Borgono et al ., 2007; Yamasaki et al., 2007; Pampalakis and Sotiropoulou, 2007). 이들 경우에, 당해 프로테아제는 칼리크레인 패밀리의 트립신-유사 및 키모트립신-유사 세린이다. 주사에서 프로테아제의 역할은 숙주 선천적 면역 펩티드 LL-37의 전염증 부분으로 분해를 부분적으로 기초로 할 수 있다(Yamasaki et al ., 2007). 건선에 의해, 칼리크레인 프로테아제는 조절 없는 표면 세포층의 허물 벗음을 초래하며, 피부의 과대-허물 벗음으로부터 일어나는 낙설(scaling)을 유발하는 상피벗음 증가의 원인이 된다. 이들 질환은 염증 및 다른 상당한 임상적 증상을 일으킨다. 무증상 수준에서, 이들 과정은 피부 건조증, 홍반성 피부, 장벽 기능의 파괴(피부 수분의 손실을 유발), 세포 밖 매트릭스의 파괴 및 조기 피부 노화를 유발할 수 있다. 따라서, 피부 프로테아제를 억제함으로써 이 과정을 늦출 수 있는 활성 성분의 사용은 중요한 가치를 가진다.
펩티드 활성 성분은 화장품 및 피부 관리 제품에 사용되어 피부의 외관, 촉감 및 미학을 개선시킬 수 있는 생체활성을 제공한다. 이러한 생체활성 펩티드는 상처 또는 화상의 치료에서와 같은 치료적 목적을 위해 사용될 수 있다. 그러나, 상기 기술한 바와 같이, 피부는 단백질 및 펩티드를 분해할 수 있는 프로테아제를 발현하며, 따라서 그것의 바람직한 효과를 발휘하기 위한 특정 펩티드의 능력을 지연시킨다. 게다가 SC-거주 프로테아제의 이런 부정적 효과는 염증 및 피부 세포 턴오버(turnover)와 관련한 그것의 부정적 효과이다. 이들 문제는 생체활성 펩티드 및 프로테아제 억제제를 둘 다 포함하는 조제물의 부분으로 회수되는, 본 발명의 이런 양태에 의해 극복된다. 이러한 조합은 3개의 바람직한 특징을 가지는 피부 관리 조제물을 제공한다: (i) 펩티드 성분은 특이적 생체활성을 제공한다(예를 들어, 항-염증, 세포 자극/증식/이동 등); (ii) 프로테아제 억제제 성분은 연장된 바람직한 펩티드 효과를 초래하는 분해로부터 펩티드 성분을 보호한다; 그리고 (iii) 프로테아제 억제제 성분은 홍반 및 낙설과 같은 피부에 대한 프로테아제의 일반적인 부정적 효과를 감소시킨다. 이 마지막 특징 (iii)은 조제물의 적용 자리에 내인성인 생활성 펩티드의 보호를 수반하며; 따라서, 프로테아제 억제제는 이소성으로 적용되는 펩티드 및 피부에 의해 자연적으로 발현되는 이들 펩티드 둘다의 활성을 향상시킨다.
본 발명은 치료 및 화장품 제제에서 펩티드의 활성을 향상시키기 위한 혁명적 전략을 제공한다. 이러한 펩티드 기능의 향상은 적절한 프로테아제 억제제와 관심의 펩티드를 조합함으로써 얻어진다. 프로테아제 억제제는 펩티드 반감기를 증가시킴으로써 치료적 활성을 연장하는 것으로 작용할 뿐만 아니라, 억제제는 또한 타고난 피부 단백질로부터의 전염증 부분의 생성을 예방한다. 따라서 펩티드 및 프로테아제 억제제의 이러한 조합은 효능의 3단계 수준으로 피부 관리 조제물을 제공한다. 각 성분 - 펩티드 및 프로테아제 억제제 -이 그것 자체의 바람직한 효과를 전달하는 반면, 그것의 조합은 단지 하나의 이들 성분을 가지는 조제물 보다 훨씬 더 강한 조제물을 제공하여 상승작용한다.
본 발명은 또한 실질적인 비용의 이점을 제공한다. 적절한 프로테아제 억제제와 조합하여 사용되는 펩티드는 더 큰 반감기를 나타낼 것이다. 따라서, 펩티드가 프로테아제 억제제의 부재하에서 사용될 때, 이러한 펩티드는 요구되는 더 큰 수준에서 공급될 필요는 없다. 본 발명의 생체활성 펩티드 조제물을 제조하기 위한 프로테아제 억제제의 비용은, 조제물의 활성 수준을 달성하기 위해 필요로 되는 더 높은 양의 펩티드를 만드는 비용보다 상당히 저렴하다.
생활성 펩티드는 당업계에 공지되어 있으며; 본 발명의 이런 양태에 포함될 수 있는 것은 바람직하게는 길이에 있어서 200개 미만의 아미노산 잔기, 길이에 있어서 100개 미만의 아미노산 잔기, 길이에 있어서 50개 미만의 아미노산 잔기, 길이에 있어서 45개 미만의 아미노산 잔기, 길이에 있어서 40개 미만의 아미노산 잔기, 길이에 있어서 35개 미만의 아미노산 잔기, 길이에 있어서 30개 미만의 아미노산 잔기, 길이에 있어서 25개 미만의 아미노산 잔기, 길이에 있어서 20개 미만의 아미노산 잔기, 길이에 있어서 15개 미만의 아미노산 잔기, 또는 길이에 있어서 10개 미만의 아미노산 잔기이다. 본 발명에 사용될 수 있는 다른 생체활성 펩티드는 길이에 있어서 바람직하게는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 아미노산 잔기이다.
본 대상 발명의 다양한 구체예에 포함될 수 있는 생체활성 펩티드의 비-제한적 예는 다양하며 미국 특허 번호 6,255,282 (도 3A/B 및 그것의 청구항 참조), 미국 특허 번호 6,303,568 (그것의 표 1을 참조), 미국 특허 번호 5,962,410 (그것의 표 1을 참조), 미국 특허 번호 7,875,744 (표 1 및 그것의 청구항 참조), 미국 특허 번호 7,407,940 (표 1 및 그것의 청구항 참조), 미국 출원 공개 번호 20070299015 (출원 일련 번호 11/811,876) (표 1, 5 및 그것의 청구항 참조), 출원 일련 번호 12/005,653 (표 1 및 그것의 청구항 참조), 미국 특허 번호 6,288,212 (표 1 및 그것의 단일항 참조), 미국 특허 번호 6,337,317 (그것의 청구항 참조), 미국 특허 번호 6,172,185 (표 1 및 그것의 청구항 참조), 및 출원 일련 번호 61/000,815 (표 1 및 그것의 청구항 참조)에서 기술되며; 각각의 이들 특허 및 출원, 특히 그것의 표시된 섹션은 그것 전체가 본원에 참고로써 포함된다. 본 출원에서 개시되는 테트라펩티드(표 1 및 SEQ ID NOs: 14-15)는 본 발명의 이런 양태에 포함될 수 있다. 하나 이상의 생체활성 펩티드가 본 발명에 사용될 수 있다. 본 발명이 고유의 활성을 가지는 펩티드의 도입으로 주로 접근되었지만, 이는 펩티드가 위치된 환경에 의존할 수도 의존하지 않을 수도 있고(즉, 펩티드는 특정 문맥에 위치될 때 단지 활성이다), 어떤 특정 활성을 가지지 않는(또는 가지는 것으로 알려지지 않은) 펩티드가 또한 본 발명에 사용될 수 있다.
대상 발명의 다양한 구체예에 포함될 수 있는 생체활성 펩티드의 다른 비-제한적 예를 표 2에서 열거한다.
Figure 112010031370223-pct00002
연구 목적
다양한 이점을 만들기 위한 생체활성 펩티드와 조합한 화장품 및 치료적 피부 관리 제품에서 프로테아제 억제제의 사용은 탐구되지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 프로테아제 억제제가 생체활성 펩티드-합성적으로 및 선천적으로 유발된 것 둘 다-를 단백질 가수 분해로부터 보호할 수 있다면 결정하도록 목표된다. 이러한 프로테아제 억제제는 펩티드-함유 피부 관리 조제물의 사용에 대한 후보자일 것이다.
분석 재료 및 방법론
다음의 프로테아제 억제제는 특정 단백질 가수분해 조건 하에서 생체활성 펩티드의 파괴를 차단하는 능력을 특징으로 한다: 아프로티닌(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 트라넥사민산 (Sigma-Aldrich), 벤즈아미딘(Sigma-Aldrich), Fmoc-lys(Boc) (Chem-Impex, Chicago, IL), Fmoc-arg(Pmc) (Chem-Impex), 벤조일-arg-니트로아닐리드 (Sigma- Aldrich) 및 벤조일-arg-나프틸아미드(Sigma-Aldrich).
다음의 펩티드는 대표적인 피부 관리 생체활성 성분 펩티드 및 고유의 피부 펩티드로서 사용되었다: 올리고펩티드-10 (HB64) (Peptisyntha, Torrence, CA), 이것의 서열은 FAKALKALLKALKAL-NH2이다(SEQ ID NO: 17) (미국 특허 번호 7,381,704를 말함); 헥사펩티드-21 (HB168) (Neo-MPS, San Diego, CA), 이것의 서열은 FALLKL-NH2이다(SEQ ID NO:18) (미국 특허 번호 7,381,704를 말함); HB1345 (Peptisyntha), 이것의 서열은 데카노일-KFKWPW-NH2 (SEQ ID NO: 19) (미국 특허 번호 7,407,940를 말함)이다; 및 LL-37 (LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES, SEQ ID NO:20), 이것은 Johansson et al . (1998)(전체가 참고로써 본원에 포함됨)에 의해 개시된다. HB64, HB168 및 HB1345 펩티드가 합성 기원을 가지는 반면, LL-37은 본래 인간 세포에 의해 타고나게 발현됨을 특징으로 하였다.
하기 프로테아제를 본 발명 실행을 감소시키는데 사용하였다: 키모트립신 (Sigma-Aldrich), 이는 티로신, 트립토판, 및 페닐알라닌의 카르복실 측면에서 아미노산 사슬을 분해한다; 트립신 (Sigma-Aldrich), 이는 리신 및 아르기닌의 카르복실 사슬에서, 둘 중 하나 다음이 프롤린일 때를 제외하고 아미노산 사슬을 분해한다; 엘라스타아제 (Sigma-Aldrich), 이는 글리신, 알라닌 및 발린과 같은 작은 소수성 아미노산의 카르복시 측면에서 아미노산 사슬을 분해하는 세린 프로테아제이다; 칼리크레인 (Sigma-Aldrich), 이는 세린 프로테아제이다; 플라스민(Sigma-Aldrich), 이는 세린 프로테아제이다; 및 유로키나아제, 이는 세린 프로테아제이다.
펩티드 분해를 측정하기 위한 과정
합성 기원 및 LL-37의 펩티드를 0.5M MOPS pH 8.5/0.5M NaCl 최종 완충제 농도의 1-2 mg/mL의 농도에서 프로테아제 처리 실험에서 사용하였다. 프로테아제를 0.020-0.050 mg/mL의 농도에서 사용하였다.
실험을 하나는 프로테아제 억제제가 있고 하나는 프로테아제 억제제가 없는 쌍으로 실행하였다. 액체 크로마토그래피/질량 분석(LC/MS) 스펙트럼을 펩티드에 프로테아제를 첨가한 시점(시점 0)으로부터 대략 1-분, 1-시간, 4-시간 및 24-시간 시점에 수집하였다. LC/MS 스펙트럼을 5% 아세토니트릴에서 출발하여 25분 후 65% 아세토니트릴까지 증가하는 표준 역상 기울기를 사용하여 수집하였다. 펩티드 모 이온을 XIC (eXtracted Ion Count) 추적(trace)으로 모니터링하였고, 한편 하기 논의하는 바와 같이 펩티드 분획을 TIC (Total Ion Count) 추적으로 관찰하였다.
연구에서 사용한 프로테아제를 1M NaCl 용액에 처음으로 용해하였고, 한편 펩티드를 pH 8.5에서 1M MOPS 완충제에 용해하였다. 용액을 37℃로 평형을 유지하였고, 그 후 1:1의 비율에서 혼합하여 각 실험을 시작하였다. 또한 더 낮은 완충제 농도를 사용하였다(0.1 M MOPS pH 8.5 및 0.2M NaCl). 프로테아제 억제제를 주어진 프로테아제에 대해 몇몇의 다른 농도(0.02 mg/mL 내지 40 mg/mL로 높고 낮음)에서 시험하였다.
이 연구에 사용되는 특정 질량 분석법 과정은 표 3의 데이터(하기)가 산출되고 이해되는 방법을 기술하기 위한 설명적 목적을 위해 하기 논의한다. 3개의 다른 데이터 산출량을 본 발명의 방법을 모니터링하는 질량 분석법을 사용하여 얻었다:
A. TIC 추적 (Total Ion Count), 이는 특정 시간 기간에 컬럼/질량 분석기를 통해 통과하는 모든 분자량(모든 분자)의 판독이다.
B. XIC 추적 (eXtracted Ion Count), 이는 TIC 추적으로부터 특정 분자량의 끌어당김을 나타내는 판독이다.
C. 질량 스펙트럼, 이는 TIC 또는 XIC 추적으로부터 선택되는 피크 내에서 분자 전체의 범위를 나타낸다.
이들 과정이 당업계에 잘 알려져 있기 때문에, 하기 논의는 질량 스펙트럼 실험에서 관찰되는 결과를 기술하는 것으로 제한될 것이다(즉, 데이터는 제시하지 않음).
결과
하기 실시예는 상기 기술한 다른 질량 스펙트럼 산출량이 합성(예를 들어, HB64) 및 선천성 면역 펩티드(예를 들어, LL-37)의 프로테아제-매개 분해, 및 그것의 억제를 모니터링하는데 사용될 수 있는 방법을 증명한다. 이들 연구에 사용되는 질량 분석기는 분자의 특정 분자량을 TIC 추적으로부터 확인할 수 없는 하기 검출의 제한을 가진다. 이런 하기-검출 상황에서, 시험 펩티드는 완전히 분해된 것으로 추정되었다.
TIC 추적은 23-시간 기간의 시간에 걸쳐 프로테아제 트립신에 의해 올리고펩티드-10(HB64)의 분해/소화에 따르도록 획득되었다. 구체적으로, 펩티드 분해는 LC/MS에 의해 시간 0, 1시간 및 2시간에서 측정하였다. TIC 추적에서 모 피크(전장, 미분해된 펩티드를 나타낸다)는 시간에 따라 감소하였고, 다양한 파손 생성물에 대한 피크는 시간에 따른 강도를 증가시켰음이 명백하였다. 이 트립신-매개 단백질 가수분해의 일차 소화 생성물은 테트라펩티드 ALLK (SEQ ID NO:21)이다.
흥미롭게도, TIC 추적은 프로테아제 억제제 아프로티닌을 포함하는 반복실험에서 나탔났고, 모 펩티드는 프로테아제에 의한 분해에 대해 보호되었다. 이 결과는 프로테아제 억제제와 조합하여 피부에 도포되었을 때 더 오랜 기간 동안, 생체활성 펩티드가 그것의 구조 및 그에 따른 그것의 기능을 보유하는 것과 일치한다. 본 발명은 따라서 동일 농도에서 생체활성 펩티드를 단독으로 함유하는 피부 조제물과 비교하여 더 효과적일 것이다. 또한, 선택한 생체활성 펩티드가 길이 및/또는 서열의 이유로 단백질 가수분해를 받지 않더라도, 프로테아제 억제제의 포함은 조제물 적용 자리에서 자연적으로 발현되는 바람직한 펩티드의 분해를 예방한다(즉, 유리한 내인성 펩티드가 보호될 것이다).
단 1분 동안 플라스민에 노출된 펩티드 LL-37의 TIC 추적은 시간 0 판독을 제공하는 역할을 하였다. 무결함 LL-37 펩티드의 존재는 질량 스펙트럼 판독에 의해 확인되는 바와 같은 대략 16-분 체류 시간에서 검출되며; 899.5, 1123.4 및 1497.6 amu (원자량 단위(atomic mass unit))에서 3개의 별개의 피크는 각각 동일한 펩티드(LL-37)의 다른 전하 형태를 나타내었다.
플라스민과 함께 1시간 배양한 후, 모 펩티드 LL-37의 분자량을 검출할 수 없었고, 더 낮은 체류 시간(11분 내지 13분)을 가지는 TIC 추적 피크가 나타났다. 이들 피크는 450만큼 낮은 분자량을 가지는 LL-37의 파괴 생성물을 나타낸다. 검출된 LL-37의 파괴 생성물 중 하나의 정확한 서열은 이 LL-37 부분에 대한 분자량의 독특한 매치를 기초로 RIVQRIKDFLRNLVPRTES (SEQ ID NO:22)가 되도록 결정하였다. 전장 LL-37로 관찰한 것처럼 SEQ ID NO:22의 3가지의 다른 전하 형태를 관찰하였다.
LL-37 및 플라스민에 의한 상기 실험을 반복하였지만, 이 시간은 반응에서 프로테아제 억제제 트라넥사민산을 포함하였다. 1시간 배양 기간 후 이 반응의 TIC 추적을 얻었다. 질량 스펙트럼은 대략 16.5분의 체류 시간에 얻었다. TIC 추적 및 질량 스펙트럼 둘 다에서 명확한 바와 같이, LL-37의 생성물의 파괴를 만들었고; 그러나 중요하게는, 완전, 무결함, 모 펩티드가 3개의 질량 스펙트럼 피크, 주어진 전하 차이로서 인식가능한 수준에서 여전히 검출가능하였다. 이 결과는 다른 펩티드/프로테아제/억제제 세트를 사용하는 상기 분석의 결과와 일치한다. 따라서, 본 발명의 이런 양태는 생체활성 펩티드 및 프로테아제 억제제의 다양한 조합에 적용가능한 것으로 기대되며; 이 기대는 추가로 표 3에서 하기-존재하는 증거와 함께 제공된다.
다른 실험에서, 플라스민에 4-시간 노출 후 올리고펩티드-10(HB64)의 분해를 TIC 및 XIC 추적으로 모니터링하였다. 이 분석으로부터, 플라스민은 HB64를 표적화하였고 분해하였음이 명백하였다. XIC 추적은(799.5 amu에서), 대부분의 HB64 펩티드가 분해된 한편, 일부 모 펩티드가 여전히 검출될 수 있음을 나타내었다. 이 반응이 트라넥사민산을 포함하였을 때, HB64 펩티드가 플라스민-매개 단백질 가수분해로부터 보호된다는 것은 TIC 및 XIC 추적으로부터 명백하였다. 사실, XIC 추적에 의해 결정되는 바와 같이 반응에서 모 펩티드의 양은 펩티드를 플라스민 단독과 함께 배양할 때와 비교하여 5-배 더 컸다.
일련의 실험을 상기 기술한 방법을 사용하여 수행하여 넓은 범위의 프로테아제, 펩티드 및 프로테아제 억제제에 관한 본 발명의 유용성을 결정하였다. 이 작업으로부터의 데이터를 표 3에 요약한다. 어떤 특정 시점에, 검출가능한 모 펩티드가 없다면(즉, 비-분해 펩티드의 부재), 펩티드 분해에 대해 요구되는 시간으로서 시점을 기록하였다.
Figure 112010031370223-pct00003
Figure 112010031370223-pct00004
요약
이 실시예에서 주목한 바와 같이, 피부 및 펩티드 파괴와 관련한 가장 중요한 프로테아제의 일부는 플라스민, 칼리크레인 및 유로키나아제이다. 본 발명은 이들 프로테아제에 대한 작업을 나타내었다(예를 들어, 표 3). 중요하게는, 시험 프로테아제 억제제는 우수한 안전성 프로파일을 가진다. 예를 들어, 아프로티닌 및 트라넥사민산이 응고 치료법을 위한 전신 약물로서 사용되는 반면, 울소르산은 화장품 및 허브 성분으로서 사용된다. 본원의 목표는 단백질 가수분해로부터 천연 및 합성 펩티드를 보호할 수 있는 약제(또는 약제들)를 확인하는 것이며; 이러한 억제제는 피부 관리 제품에서 생체활성 펩티드와 조합하는데 유용할 것이다. 프로테아제의 넓은 스펙트럼에 대해 트라넥사민산의 주어진 억제 활성은 그것의 낮은 제조 비용, 안전성 프로파일 및 용해도와 커플링되며, 트라넥사민산은 본 발명의 이런 양태를 실행하기 위한 바람직한 프로테아제 억제제이다.
본원에서 개시되고 청구된 모든 조성물 또는 방법은 본 명세서에 비추어 과도한 실험 없이 만들어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 구체예에 관하여 기술된 한편, 변형이 조성물 및/또는 방법 및 본 발명의 개념, 정신 및 범주로부터 벗어남이 없이 본원에 기술되는 방법의 단계 또는 단계의 순서에서 사용될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 더 구체적으로는, 동일 또는 유사한 결과가 달성되는 동안 화학적으로 및 생리학적으로 관련된 특정 약제는 본원에 기술되는 약제와 치환될 수 있음이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 이러한 치환 및 변형은 본 발명의 범주 내인 것으로 생각된다.
이 용도에서 확인되는 모든 특허 및 간행물은 전체가 참고로써 본원에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Zhang, Lijuan Harris, Scott M. Falla, Timothy J. <120> Protective Skin Care Peptides <130> 11181.0039.00PC00 <150> 61/000,815 <151> 2007-10-29 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Amino acid residue is modified to contain an amino group <400> 1 Pro Gln Glu Lys 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Amino acid residue is modified to contain an amino group <400> 2 Pro Gln Glu Ile 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Amino acid residue is modified to contain an amino group <400> 3 Pro Gln Glu Met 1 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Amino acid residue is modified to contain an amino group <400> 4 Pro Thr Glu Asp 1 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Amino acid residue is modified to contain an amino group <400> 5 Pro Gly Glu Asp 1 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Amino acid residue is modified to contain an amino group <400> 6 Pro Leu Glu Val 1 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Amino acid residue is modified to contain an amino group <400> 7 Pro Gln Glu Asn 1 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Amino acid residue is modified to contain an amino group <400> 8 Pro Val Glu Ser 1 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Amino acid residue is modified to contain an amino group <400> 9 Pro Glu Glu Ser 1 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Amino acid residue is modified to contain an amino group <400> 10 Pro Val Glu Thr 1 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Amino acid residue is modified to contain an amino group <400> 11 Pro Glu Glu Thr 1 <210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> PPEN <400> 12 Pro Pro Glu Asn 1 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Amino acid residue is modified to contain an amino group <400> 13 Pro Thr Glu Asn 1 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 Pro Gln Glu Lys 1 <210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 Pro Gln Glu Ile 1 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(5) <223> X = any amino acid residue <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> X = aromatic or acidic amino acid residue <400> 16 Pro Xaa Glu Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Amino acid residue is modified to contain an amino group <400> 17 Phe Ala Lys Ala Leu Lys Ala Leu Leu Lys Ala Leu Lys Ala Leu 1 5 10 15 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Amino acid residue is modified to contain an amino group <400> 18 Phe Ala Leu Leu Lys Leu 1 5 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Amino acid residue is modified to contain a decanoyl group <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Amino acid residue is modified to contain an amino group <400> 19 Lys Phe Lys Trp Pro Trp 1 5 <210> 20 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 20 Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu 1 5 10 15 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val 20 25 30 Pro Arg Thr Glu Ser 35 <210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 21 Ala Leu Leu Lys 1 <210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg 1 5 10 15 Thr Glu Ser

Claims (24)

  1. 아미노산 서열이 프롤린-글루타민-글루타메이트-X(P-Q-E-X)로 구성되며, X는 리신(K) 또는 이소류신(I)인 분리된 펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서, 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 15로 구성되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  3. 제 2 항에 있어서, 펩티드는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  4. 제 1 항에 있어서, 펩티드는 아미드화, 지질화, 담체 분자에 콘쥬게이트되거나, 또는 D-거울상체 형태로 아미노산 잔기를 가지는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 펩티드, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 찰과상, 화상, 열상, 천자상, 궤양, 자반, 발진, 흉터, 피부염, 건선, 경피증, 천포창 또는 대장염과 관련된 피부 염증 과정을 감소시키기 위하여 UVB 노출된 피부에서 IL-6 발현을 억제하는데 사용하기 위한 치료용 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 펩티드는 0.1 μg/mL 내지 50 μg/mL의 범위에 이르는 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서, 조성물은 프로테아제 억제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 5 항에 있어서, 조성물은, 에어로졸, 에멀젼, 액체, 로션, 크림, 페이스트, 연고, 분말, 또는 폼의 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 유효한 시간 동안 조성물의 치료적으로 유효한 양을 포유동물의 염증 자리에 투여함으로써 포유동물의 피부 또는 관련된 점막 조직에 위치된 염증을 치료하는데 유용한 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 염증은 찰과상, 수포, 화상, 열상, 궤양, 타박상, 발진 또는 흉터이거나, 또는 자외선에의 노출로 인한 것임을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따르는 펩티드를 피부 관리용 약제를 제조하는데 사용하는 방법.
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