CN101855235B - 保护性皮肤护理四肽 - Google Patents
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Abstract
公开的本发明提供具有氨基酸序列脯氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸-X(P-Q-E-X)的四肽,其中X可以是赖氨酸(K)或异亮氨酸(I)。这些四肽抑制紫外光(UV)诱导的由皮肤上皮细胞和成纤维细胞表达促炎细胞因子白细胞介素-6(IL-6)。此外,四肽抑制通过直接暴露于紫外线或根据UV-处理的角质形成细胞调节的介质处理而诱导的成纤维细胞的基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的上调。四肽较小的尺寸和生物活性使它们适合于涉及炎性皮肤病症的治疗和用作皮肤护理产品中的活性成分。
Description
本申请要求2007年10月29日提交的美国临时申请号61/000,815的优先权权益,其通过参考以其全部并入本文。
发明领域
本发明涉及具有生物活性和治疗活性的肽。具体而言,本发明涉及抑制皮肤中炎性过程的四肽。这样的四肽部分地通过减少响应紫外线(UV)暴露由皮肤上皮细胞和成纤维细胞表达的白细胞介素(IL)-6和基质金属蛋白酶(MMP)-1的量,来发挥该效果。本发明进一步涉及使用这些四肽来治疗影响皮肤和相关的粘膜表面的多种损伤(insult)的方法。
背景技术
过度暴露于阳光是形成急性炎症的重要的病原学因素,急性炎症的特征为红斑和水肿。这类炎症的长期结果包括加速的皮肤老化和较高的机会形成皮肤癌。已经显示由于急性暴露于紫外辐射导致的皮肤炎症的特征为释放包括神经肽、组胺、前列腺素、血清素和氧自由基在内的多种因子,以及上调促炎细胞因子例如IL-1、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。皮肤上皮细胞和角质形成细胞在UV暴露后在皮肤中通过产生数种上述因子而在所观察到的炎性过程中起重要作用。
UV诱导炎症的长期效应消极地改变皮肤功能。遭受数次炎症急性发作的皮肤中创伤愈合过程时间延迟,并可能不完美(例如增大的瘢痕)。而且,过度暴露的皮肤也更易于起皱、干燥、变薄、松弛和更易于碰伤。导致这些不良作用的皮肤中的炎性过程是复杂的并且可能包括数个途径。
紫外线由UVA和UVB射线组成。UVB是急性炎症以及非黑素瘤皮肤癌的公知原因。UVB-介导的表皮炎症由促炎细胞因子例如IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α指挥(orchestrated)。因为UVB射线穿透表皮,所以细胞因子诱导可在角质形成细胞以及存在于真皮上部中的成纤维细胞和内皮细胞中发生。然而,间质起源的这后两种细胞类型也可以从直接UV暴露以一些间接方式诱导成炎性状态。响应UV刺激上皮细胞和角质形成细胞表达的因子(即介体(mediator))可以给成纤维细胞和内皮细胞发信号以上调炎性途径。IL-6是一种这样的介体。
上皮细胞和成纤维细胞中细胞因子例如IL-6的诱导对加速皮肤光老化具有重要作用,皮肤光老化通过起皱和松弛以及其他征候显示自己。这些作用主要地由成纤维细胞响应IL-6信号表达的过量MMP-1的刺激介导(Fagot et al.Arch Dermatol Res.293:576,2002;Fagot et al.Photochem Photobiol.79:499,2004)。MMP-1过量表达可以通过降解细胞外基质(ECM)蛋白例如包含在皮肤结缔组织中的胶原蛋白,明显地改变皮肤结构完整性。此外,ECM分解提高免疫细胞到UV暴露位置的募集;这增加的细胞活动是急性症状例如红斑和水肿,以及慢性症状例如皮肤硬化的主要原因,所述皮肤硬化是由于过量纤维蛋白沉积引起的。考虑到响应UV暴露对皮肤生理的这些深远的不良作用,IL-6和MMP-1代表用于控制皮肤光老化的重要的分子标靶。
控制光老化的一个方法是局部施用已知抑制一种或更多种信号通路的蛋白质,所述信号通路在UV暴露后表现改变的活性。然而,大多数使用这类策略的尝试没有实现临床显著的结果,这部分是由于与完整蛋白质或其大的片段的应用相关的困难。该失败潜在的一个问题涉及低效递送蛋白质穿过表皮;大多数应用的蛋白质保持远离负责开始光老化途径的细胞。其他的缺点涉及在施用后大的蛋白质的高度不稳定性和差的保留。除了这些固有的消极特征以外,这些疗法的发展也受到与制备大的蛋白质相关的复杂性和高成本的困扰。因此,目前正在寻找较便宜和更有效的制剂。
短生物活性肽代表治疗和预防皮肤光老化的潜在有用的手段。除了较便宜和容易生产和操作的直接利益之外,短肽也更好地被皮肤吸收和保持。对于预防皮肤光老化,期望能抑制皮肤炎性过程的短肽(例如四肽)。
尽管其他人先前已经检测四肽对皮肤的作用,但是很少已经示出抑制皮肤中已知由紫外辐射上调的炎性过程。例如Lintner(美国专利号6,974,799)使用某些四肽-三肽混合物声称反转皮肤中的老化信号;然而,该混合物仅仅示出上调ECM生产,这是一种不能预测预防阳光的有害作用的方法。以类似的风格,Sandberg等(美国专利号6,962,904)教导应用弹性蛋白源的四肽来修复皮肤中的结缔组织。Bissett等表明具体的四肽(美国专利号6,284,802)可用于治疗起皱;该应用的唯一基础是从碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的氨基酸序列衍生肽。同样地,这些肽不能预期发挥抗炎活性,因为已知bFGF在免疫细胞募集中起积极作用(Zittermann and Issekutz Am J Pathol.168:835,2006)。Dussourd等(美国专利号6,211,155)描述的刺激表皮细胞增殖的四肽也不能预期抑制UV诱导的炎症。在另一方面,本发明提供下调皮肤中UV诱导的炎症的四肽,因此,其发挥作用以预防或处理光老化的主要病因学。
发明内容
本发明涉及包括脯氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸-X(P-Q-E-X)作为其氨基酸序列的分离的肽,其中X是赖氨酸(K)或异亮氨酸(I)残基。因此,四肽SEQ ID NO:14(PQEK)和SEQ ID NO:15(PQEI)是本发明提供的分离的肽的实例。尽管本发明肽的氨基酸序列由上述PQEX序列组成,但是肽可以包含除特异性序列以外的其他的特征。例如,本发明的具体实施方式涉及酰胺化、脂化或与载体分子辍合的肽。本发明肽的其他实施方式包括至少一个D-对映体形式的氨基酸残基或至少一个在邻近氨基酸残基之间存在的非肽键。
本发明更具体的实施方式包括具有SEQ ID NO:1(PQEK-NH2)和SEQ ID NO:2(PQEI-NH2)给出的氨基酸序列的四肽。因此,这些肽构成具有如上所述的PQEX序列的肽的修饰形式的实例。除了羧基端处的酰胺化之外,SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2给出的四肽可以具有其他修饰。
本发明也提供包含至少一种具有氨基酸序列PQEX的上述四肽连同药学上可接受载体的组合物。该组合物中的肽的浓度可以为大约0.1μg/mL到大约50μg/mL或大约0.1μg/mL到大约20μg/mL。本发明组合物的优选实施方式可以为气溶胶、乳剂、液体、洗液、霜剂、糊剂、膏剂、粉末或泡沫。该组合物的其他的优选实施方式包含至少一种具有SEQ IDNO:1、2、14或15给出的氨基酸序列的四肽。本发明的组合物可以包含多种形式的PQEX四肽,例如本文描述的那些。蛋白酶抑制剂可以包含在所有上述组合物中。
本发明也涉及使用上述本发明的肽和药物组合物的某些方法。特别地,本发明包括治疗哺乳动物中炎症的方法,所述方法包括将治疗有效量的本发明的组合物/肽施用到炎症部位持续一段有效量的时间的步骤。伴随或源自擦破、水泡、烧伤、划破、溃疡、撞伤、皮疹和瘢痕的炎症适于用本发明的方法治疗。本发明方法的优选实施方式使用至少一种上述的肽,例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2,其浓度范围从大约0.1μg/mL到大约50μg/mL或从大约0.1μg/mL到大约20μg/mL。
本发明方法的某些实施方式涉及治疗在皮肤或相关组织中例如口腔内发生的炎症。本发明方法的的另一个实施方式涉及治疗由于暴露于紫外线(UV)辐射而发生的皮肤炎症(例如晒斑)。例如,SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2给出的四肽可用于该优选实施方式。
本发明也涉及抑制细胞表达IL-6和/或MMP-1的方法。该方法包括将细胞暴露于上文所述的肽的步骤。这样暴露于肽导致这些炎性介体的一种或两种的细胞表达减少。暴露步骤可以通过将细胞与肽接触进行,其可以伴随简单的温育手段。可以单独或组合用于该方法的肽优选为SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:2。在本方法的具体的实施方式中,IL-6或MMP-1的细胞表达是将细胞暴露于紫外辐射例如UVA和/或UVB射线的结果。然而,本方法也适用于控制由于任何其他的炎症相关的事件例如创伤或烧伤而发生的IL-6和/或MMP-1的细胞表达。该方法的优选实施方式涉及源自皮肤的细胞(例如原代细胞或无限增殖细胞,体外或先体外后体内)或以其他方式存在于皮肤中的细胞(即体内);这样的细胞可以是皮肤上皮细胞、角质形成细胞和皮肤成纤维细胞。可以使用任何类型的上皮细胞或成纤维细胞应用本方法的其他的实施方式。
附图描述
图1示出UVB暴露后24小时,某些四肽(40μg/mL)对人上皮细胞IL-6表达的作用。″M1″表示未照射对照细胞培养物(没有肽处理),并因此示出皮肤上皮细胞的基础IL-6表达水平。″UVB″表示照射对照细胞培养物(没有肽处理),并因此示出UVB暴露后在上皮细胞中诱导的IL-6的水平。参考实施例3。
图2示出两种不同浓度(10和20μg/mL)的四肽P1422(SEQ ID NO:1)和P1423(SEQ ID NO:2)对用UVB处理的皮肤上皮细胞中IL-6诱导的作用。″对照″表示UVB-照射但是没有接受肽的细胞。参考实施例3。
图3示出10μg/mL的四肽P1422(SEQ ID NO:1)(A)和P1423(SEQ IDNO:2)(B)对用UVB处理的角质形成细胞中IL-6诱导的作用。″对照″表示UVB照射的但是没有接受肽的细胞。″OD450″表示通过ELISA测量的相对的IL-6表达。参考实施例4。
图4示出10μg/mL的四肽P1422(SEQ ID NO:1)(A)和P1423(SEQ IDNO:2)(B)对用UVA处理的皮肤成纤维细胞中MMP-1诱导的作用。每种培养物产生的MMP-1的相对量使用ELISA-产生的OD450吸收值测定。″对照″表示UVA照射的但是没有接受肽的细胞。参考实施例5。
图5示出10μg/mL的四肽P1422(SEQ ID NO:1)(A)和P1423(SEQ IDNO:2)(B)对根据用UVB处理的角质形成细胞调节的介质处理的皮肤成纤维细胞中MMP-1诱导的作用。使用ELISA-产生的OD450吸收值测定每种培养物产生的MMP-1的相对量。“对照”表示在根据UVB照射的角质形成细胞调节的介质中温育,但是没有接受肽的细胞。参考实施例5。
发明详述
本发明的肽是具有氨基酸序列脯氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸-X(P-Q-E-X)的四肽,其中X可以是赖氨酸(K)或异亮氨酸(I)。因此。本发明提供四肽PQEK(SEQ ID NO:14)和PQEI(SEQ ID NO:15)。SEQ ID NO:14和SEQID NO:15的非限定性实例分别是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2;后面的四肽在其各自的羧基端被酰胺化。仅仅作为参考的目的,发明肽中的氨基酸残基的三字母密码是Pro(脯氨酸,P)、Gln(谷氨酰胺,Q)、Glu(谷氨酸(glutamate)或谷氨酸(glutamic acid),E)、Lys(赖氨酸,K)和lie(异亮氨酸,I)。
上述四肽引出的生物活性是抑制UV暴露部位处的皮肤炎症。该活性部分地通过肽对皮肤上皮细胞和成纤维细胞的IL-6分泌的负作用实现(参考实施例)。在该环境中IL-6分泌是由于紫外辐射对这些细胞的作用。上述四肽对炎症的抑制性活性进一步部分由于其对成纤维细胞中MMP-1表达的负作用。
考虑到本发明的四肽PQEK(SEQ ID NO:14)和PQEI(SEQ ID NO:15)抑制IL-6产生的能力,技术人员将意识到这些肽另外可用于治疗由于UV暴露以外损伤引起的皮肤损伤形式。此外,应该承认本发明的肽可用于治疗粘膜组织的创伤。IL-6通过伤口部位处角质形成细胞和成纤维细胞释放,并且发信号用于免疫细胞渗入,这是可以实际上恶化愈合和引起瘢痕的过程。在这种情况下通过运用本发明的肽进行IL-6表达的控制将改善这些消极的伤口愈合过程。列出这些生物活性以对本发明的肽就如何在治疗上应用提供指导;然而,本发明不被以任何方式受限于肽功能的这些具体模式。
肽
本发明的四肽[例如PQEK(SEQ ID NO:14)和PQEI(SEQ ID NO:15)]的每一个可以包含L-或D-氨基酸对映体,也包含一种对映体形式或两种形式组合的残基。肽可进一步增长或修饰,如下列非限定性实例中描述的,只要它们的一级氨基酸序列没有改变;以这种方式,肽由某种氨基酸序列组成,但是可包含某些修饰。肽的羧基端可以是酸性的(-COOH)或酰胺化的(例如,-CONH2、-CONHR或-CONR2)。相比于游离酸形式,羧基端酰胺化可使本发明的肽对蛋白酶降解较不敏感,并增加它们的可溶性,因此提供增加的治疗效力。为羧基酰胺化的本发明的肽实例是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。肽也可以被脂化(lipidated),其可提供增强的皮肤穿透。一个或更多个连接每个肽的氨基酸的分子键可以是非肽键。这样的非肽键包括但不限于亚氨基、酯肼(ester hydrazine)、缩氨基脲(semicarbazoide)和偶氮键。根据以上所述的肽的其他的实例是包含具有进一步修饰的SEQ NO:1和SEQ ID NO:2的那些(注意,SEQ ID NO:1和2都已经羧基酰胺化)。
可对本发明的四肽进行多种修饰,只要保持其一级氨基酸序列。可以使用一些修饰增加肽效力,而其他的修饰可促进肽处理。典型的可以被修饰的肽功能基团包括羟基、氨基、胍盐、羧基和酰胺基团。这些基团的典型非限定性反应包括下列:通过卤代烷乙酰化羟基;羧基的酯化、酰胺化或氢化(即还原为醇);氨基(例如肽的伯胺基团或赖氨酸残基的氨基)的脱酰胺、酰化、烷化、芳基化。
肽可以与可溶的或不可溶的载体分子辍合以按需要修该它们的可溶性性质,并增加靶组织中的肽的局部浓度。可溶的载体分子的实例包括聚乙二醇(PEG)和聚乙烯吡咯烷酮的聚合物;不可溶的聚合物的实例包括硅酸酯、聚苯乙烯和纤维素。肽也可以被微囊密封以在治疗应用期间和之后增强它们的稳定性;一般地,使用聚酯和PEG微球体封装和稳定该肽。
可以使用制备用于肽封装的微球体的多种方法,这取决于待被封装的肽组合物的亲水性或疏水性。这类方法的方案的实例见于Wang等(J.Control.Release 17:23,1991)和美国专利号4,324,683,这两者都通过引用以其全部并入本文。可以进行体外肽释放研究以确定并入微球体之后肽的相对可利用性。将微球体(200mg)悬浮于2.5mL磷酸缓冲盐水中(PBS,pH 7.2)并在37℃、100rpm的环境培养箱摇动器(G-24,NewBrunswick Scientific Co.,Edison,N.J.)中搅动。在特定的采样时间(前4天每天,和其后每隔一天),完全地移出缓冲溶液并用新鲜的PBS替换。使用Bradford方法或其他的通常用于蛋白质分析的适当的定量分析测量PBS的肽内含物。
提供下列过程和参数,其仅仅作为指导目的,并且是本领域普通技术人员所公知的。所有公开的肽可以在Advanced ChemTech Apex 396Multiple Peptide Synthesizer上使用标准Fmoc(9-芴甲氧羰基)固相化学合成。Apex 396装备有40孔反应块,以0.15mmol的规格同时产生多至40个肽。可以使用标准的氨基酸,制备肽作为酰胺化序列或游离酸序列。首先洗涤树脂,并用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)预膨胀。对Rink酰胺树脂,膨胀时间为1小时。用DMF中的25%哌啶移除Fmoc保护基25分钟,在这之后,从树脂完全洗出哌啶。为了控制外消旋化过程,以0.5MDMF中等摩尔的1-羟基-苯并三唑(HOBt)或1-羟基-7-氮杂-苯并三唑(HOAt)溶液预活化Fmoc氨基酸单体。使用O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)或2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)作为活化剂和在使用受阻碱(二异丙基乙胺)的碱性条件下2.5-5.0倍摩尔过量的氨基酸,进行酰胺连接。该连接时间是1-1.5小时,然后洗涤并再结合以在生长肽链脱保护和继续之前完成两倍或三倍的连接。使用标准的Kaiser试验监控连接效率。在树脂上完成肽合成之后,如上移除最后的Fmoc基团,并且留下序列作为游离碱形式。
肽与树脂的酸-不稳定连接的切割使用95%三氟乙酸(TFA)和水以及适当加入的净化剂完成。在使切割进行大约30分钟到1小时后,立刻从切割区段移出释放的肽并将其转移至管中,以在减压下除去TFA。然后,准备通过高效液相色谱法(HPLC),使用反相C18柱和质谱,对肽进行纯化和分析。使用LC/MS/MS系统(ABI API2000)完成一级序列证实和制备纯化。
通常对于上述方案,可以使用本领域普通技术人员已知的任何方法可以产生肽,例如在Merrifield(J Am Chem Soc.85:2149,1963);Carpinoet al.(J Org Chem.51:3732,1986);Merrifield et al.(Anal Chem.38:1905,1966);或Kent et al.[High Yield Chemical Synthesis Of Biologically ActivePeptides On An Automated Peptide Synthesizer Of Novel Design,IN:PEPTIDES 1984(Ragnarsson,ed.)Almqvist and Wiksell Int.,Stockholm(Sweden),pp.185-188]中公开的那些方法,所有这些通过参考以其全部并入本文。优选地,肽通过能将氨基酸连续加入生长肽链的机械产生。然而,肽也可以使用标准溶液相方法制造,所述标准溶液相方法可用于大规模生产计划。
本发明可以包含一种或更多种蛋白酶抑制剂。可以选择蛋白酶抑制剂以特异性地靶向期望降解所选择生物活性肽的蛋白酶;这样的选择基于生物活性肽的长度和/或序列而确定。然而,蛋白酶抑制剂不必须以任何特异的方式选择;例如包含两种或更多的抑制剂的蛋白酶抑制剂混合物可用于本发明。对于本发明的某些实施方式,蛋白酶抑制剂不是特异性抑制病毒的抑制剂。下列类型的蛋白酶抑制剂可以并入本发明:丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂和苏氨酸蛋白酶抑制剂。
蛋白酶抑制剂是本领域公知的。可以并入本发明的蛋白酶抑制剂的非限定性实例包括乙酰基-胃蛋白酶抑制剂、AEBSF(4-[2-氨乙基]苯磺酰氟)盐酸盐、ALLM(N-乙酰基-Leu-Leu-Met)、ALLN(N-乙酰基-Leu-Leu-Nle-CHO)、抑氨肽酶肽(链霉菌属)、ε-氨基-n-己酸、氨肽酶N抑制剂、α1-抗胰凝乳蛋白酶、抗痛素(antipain)(盐酸盐或二盐酸盐)、α2-抗纤溶酶、抗凝血酶III、α1-抗胰蛋白酶、p-APMSF盐酸盐、抑肽酶(例如,来自牛肺)、ATBI(11-残基肽)、苄脒盐酸盐、苯丁抑制素、苯丁抑制素甲酯、钙蛋白酶抑制蛋白、calpeptin(钙蛋白酶抑制剂)、羧肽酶抑制剂、胱天蛋白酶抑制剂、组织蛋白酶B抑制剂II、组织蛋白酶G抑制剂I、组织蛋白酶抑制剂II、组织蛋白酶抑制剂III、组织蛋白酶抑制剂I、组织蛋白酶K抑制剂I、组织蛋白酶K抑制剂II、组织蛋白酶K抑制剂III、组织蛋白酶L抑制剂I、组织蛋白酶L抑制剂II、组织蛋白酶L抑制剂IV、组织蛋白酶L抑制剂V、组织蛋白酶L抑制剂VI、组织蛋白酶S抑制剂、组织蛋白酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂、胰凝乳蛋白酶抑制剂、胰凝乳蛋白酶抑制剂I、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、1,5-丹酰-glu-gly-arg-氯甲基酮二盐酸盐、3,4-二氯异香豆素、异丙基氟磷酸、二肽基肽酶II抑制剂、二肽基肽酶IV抑制剂I、二肽基肽酶IV抑制剂II、E-64蛋白酶抑制剂、大肠杆菌素(ecotin)、EDTA二钠盐二水合物、EDTA四钠盐、EGTA、弹性蛋白酶抑制剂I、弹性蛋白酶抑制剂II、弹性蛋白酶抑制剂III、弹性酶抑制剂、6-脒基-2-萘基-4-胍基苯甲酸酯二甲烷磺酸盐、glu-gly-arg-氯甲基酮、2-胍基乙基巯基琥珀酸、六癸基磺酰氯、α-碘乙酰胺、激肽原、leuhistin、亮肽素半硫酸盐、α2-巨球蛋白、DL-2-巯甲基-3-胍基乙基硫代丙酸、胃蛋白酶抑制剂A、苯甲磺酰氟、膦酰二肽二钠盐、PPack II三氟醋酸盐、PPack二盐酸盐、脯氨酰内肽酶抑制剂II、Na-甲苯磺酰-lys-氯甲基酮盐酸盐、Na-甲苯磺酰-phe-氯甲基酮、三肽基肽酶II抑制剂、胰蛋白酶抑制剂(来自玉米或大豆)、D-val-phe-lys-氯甲基酮二盐酸盐、1,3-二-(N-羧基苯甲酰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰)氨基丙酮、O-二氮杂菲、熊果酸(例如迷迭香提出物)、凝血酸(4-[氨甲基]环己烷-1-羧酸)(临床市场在美国为止血坏酸(Cyklokapron),在亚洲为氨甲环酸(Transamin))、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Arg(Pmc)、苯甲酰基-Arg-硝基苯胺(nitroanilide)、苯甲酰基-Arg-萘胺(naphthylamide)和α-2-巨球蛋白(macroglobuline)。
用于本发明的蛋白酶抑制剂可以是肽或蛋白质,例如酶。这样的抑制剂的非限定性实例是丝氨酸蛋白酶抑制剂,其包括α-1-抗胰蛋白酶、补体1-抑制剂、抗凝血酶、α-1-抗胰凝乳蛋白酶、纤溶酶原激活物抑制剂1和神经丝抑蛋白。
典型地并入皮肤护理制剂的组分是本领域公知的。除了生物活性肽组分,本发明可以包含其他的活化剂,例如烟酰胺、植烷三醇、法呢醇、没药醇和水杨酸。预期某些另外的活化剂将与生物活性肽组分协同作用,或者将增加该制剂的储存期限。
在组合物与动物或人皮肤接触的位置,应该选择适合于应用到角质组织的另外的组分(即,稳定、低毒、低变应原性的)。CTFA化妆品成分手册第二版(CTFA Cosmetic Ingredient Handbook,SecondEdition)(1992)--其通过引用以其全部并入本文,描述在皮肤护理产业中通常使用的、适合应用于本发明的组合物中的多种非限定性美容剂和药物成分。这些成分的实例包括:磨料、吸附剂、美容组分例如香精、色料、颜料/着色剂、精油、皮肤感觉剂(skin sensates)、收敛剂等(例如丁香油、薄荷醇、樟脑、桉叶油、丁子香酚、薄荷基乳酸盐、北美金缕梅蒸馏物)、抗痤疮剂(例如间苯二酚、硫、水杨酸、过氧化苯酰、红霉素、锌)、抗结块剂、消泡剂、抗微生物剂(例如丁基氨基甲酸碘代丙酯(iodopropyl butylcarbamate)、抗氧化剂、粘合剂、生物添加剂、缓冲剂、填充剂、螯合剂、化学添加剂、变性剂、外用镇痛药、聚合物(例如二十烯和乙烯基吡咯烷酮的共聚物)、不透明剂、pH调节剂、推进剂、还原剂、多价螯合剂、皮肤漂白和光亮剂(例如对苯二酚、曲酸、抗坏血酸、抗坏血酸基磷酸镁、抗坏血酸基葡糖胺)、皮肤调节剂(例如,保湿剂,包括混合的和封闭的)、皮肤舒缓剂和/或皮肤愈合剂(例如泛醇和衍生物[例如乙基泛醇]、芦荟、泛酸和其衍生物、尿囊素、没药醇、甘草酸二钾)、增稠剂、微粒材料、结构剂和维生素。这些剂的许多在美国专利号6,492,326中详细描述,其通过引用以其全部并入本文,特别是关于各种成分的描述。
本发明的组合物可包含颗粒材料,优选地为金属氧化物。这些颗粒可以是包被的或未包被的、带电荷的或不带电荷的。可用于制备本发明的颗粒材料的非限定性实例包括氯化氧铋、氧化铁、云母、硫酸钡和TiO2处理的云母、硅石、尼龙、聚乙烯、滑石、苯乙烯、聚丙烯、乙烯/丙烯酸共聚物、绢云母、氧化铝、有机硅树脂、硫酸钡、碳酸钙、醋酸纤维素、二氧化钛、聚甲基丙烯酸甲酯、和它们的混合物。无机颗粒材料例如TiO2、ZnO(氧化锌)或ZrO2是从许多来源商业上可获得的。优选地,颗粒材料以按重量计0.01%到2%的水平、更优选地以按重量计0.05%到1.5%的水平或进一步更优选的按重量计从0.1%到1%的水平存在于组合物中(所有测量为近似值)。
本发明的组合物可包含选自保湿剂、增湿剂或皮肤调节剂的调节剂。可以使用这些物质的许多种,并且每种物质可以以按组合物重量计0.01%到20%、更优选地0.1%到10%和进一步更优选地0.5%到7%的水平存在(所有剂量为近似值)。这些物质包括但不限于胍;尿素;羟基乙酸和羟乙酸盐(例如铵和季烷基铵);水杨酸;乳酸和乳酸盐(例如铵和季烷基铵);任何种类形式的芦荟(例如芦荟胶);多羟基醇例如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓醇、甘油、己三醇、丁三醇、丙二醇、丁二醇和己二醇;聚乙二醇;糖(例如蜜二糖)和淀粉;糖和淀粉衍生物(例如,烷氧化的葡萄糖、果糖、葡糖胺);透明质酸;乳酰胺单乙醇胺;乙酰胺单乙醇胺;泛醇;尿囊素;石油膏和它们的混合物。
本发明的组合物可以包含结构剂(structuring agent),其对于制备水包油型乳剂是优选的。没有被任何理论所限定,应该相信结构剂辅助给组合物提供流变特性,其有助于组合物的稳定性。例如结构剂倾向于参与液晶凝胶网络结构的形成。结构剂也可作为乳化剂或表面活性剂起作用。该发明的优选的组合物包含按组合物重量计0.1%到20%、更优选地0.1%到10%、进一步更优选地0.5%到9%的一种或更多种结构剂(所有测量为近似值)。
包括在本发明的优选的结构剂选自硬脂酸、棕榈酸、硬脂醇、鲸蜡醇、山萮醇、具有平均大约1到大约5个环氧乙烷单位的硬脂醇的聚乙二醇醚、具有平均大约1到大约5个环氧乙烷单位的鲸蜡醇的聚乙二醇醚和它们的混合物。本发明更优选的结构剂选自硬脂醇、鲸蜡醇、山萮醇、具有平均大约2个环氧乙烷单位的硬脂醇的聚乙二醇醚(硬脂醇聚醚-2)、具有平均大约2个环氧乙烷单位的鲸蜡醇的聚乙二醇醚和它们的混合物。
应用方法
本发明的另外的实施方式涉及应用以上描述的肽的方法,例如在制剂中或作为治疗剂。这些方法可包括应用单一肽或更多种肽组合。
本发明的肽可用于治疗和预防过度暴露于UV射线对皮肤的损害。同时,肽可用于治疗皮肤(表皮、真皮和皮下组织(hypodermis))和相关的粘膜组织的创伤。本发明肽对于这些状况的有益(salutary)作用部分涉及它们的抗炎性质。如在本文使用的,术语“相关的粘膜组织”涉及以与皮肤相似的方式组织并包括上皮细胞的任何组织。这样的组织的实例是口、鼻咽、耳和泌尿生殖器的表面,以及眼睛的睑结膜。相关的粘膜组织的其他实例包括消化道全部的衬(lining)(即,内腔),所述消化道包括食道、胃、小肠、大肠(结肠)和直肠。这些后面的实例可以维持创伤/损伤非常像可以影响皮肤的那些,并且同样地可以用本发明靶向。可以影响这些组织并适合本发明的肽治疗的创伤/损坏/损伤的实例是擦破、水泡、烧伤、划破、戳穿、溃疡、撞伤、皮疹和瘢痕。术后组织创伤也可用该肽治疗。尽管炎症帮助抵御在损伤部位的感染,但是提供良好的杀菌实践消除了与使用本发明的肽阻断炎症相关的任何缺点。
本发明的肽也可用于预防或反转老化对所有上述组织的影响。以相关的方式,肽可以被用于暴露于多种外部因素例如阳光而受损的组织。与老化和暴露相关的皮肤虚弱无力(skin debilitation)的实例是皮肤起皱、干燥、变薄、松弛和更易于碰伤。本发明也可用作美容剂,在这点上使皮肤表现更年轻的外观和质地,并且提供更好的功能。
使用本发明的肽有效治疗的其他的组织问题与过敏症或自身免疫性相关,这两者都具有炎性成分。这样的病包括皮炎、牛皮癣、硬皮病、天疱疮和炎性肠病。
在上述疗法方法中用于递送肽的组合物可以为气溶胶、乳剂、液体、洗液、霜剂、糊剂、膏剂、粉末、泡沫或其他的药学上可接受的制剂形式。此外,肽可以使用较少包含的制剂例如去离子水/蒸馏水、PBS或标准生理盐水溶液递送。一般而言,药学上可接受的制剂包括适合在人皮肤或粘膜表面上使用的任何载体。这样的药学上可接受的载体包括乙醇、二甲亚砜、甘油、硅石、氧化铝、淀粉和等同的载体和稀释剂。任选地,制剂可具有美容呼吁(cosmetic appeal),和/或包括其他的试剂例如类视黄醇或其他的可以作为本发明肽的治疗作用的佐剂的肽。抗生素也可加到制剂中,以便抵御感染,从而发生最佳治愈过程。在组合物中肽的浓度可以为大约0.1μg/mL到大约50μg/mL或大约0.1μg/mL到大约20μg/mL;然而,使用的最终浓度可以在这些范围外变化,这取决于伤口/组织状况的性质、本发明肽的生物活性和获得组合物吸收增加的何佐剂或技术的应用。这样的确定在本领域普通技术范围内。
可对人和动物进行本发明的肽和相关的组合物的施用,所述动物包括所有的哺乳动物(例如,猪、牛、马、绵羊、山羊、小鼠、大鼠、猫、狗、雪貂)。也可组合典型的材料和/或实验材料例如组织移植物、组织培养品、氧和敷料进行应用。一般而言,可以将组合物局部、经口、经皮、全身或通过本领域普通技术人员已知的任何其他方法施用,以用于将本发明的肽递送到炎症部位。也可在体外或以先体外后体内(exvivo)的方式将组合物例如应用到在培养物中生长的细胞或患者移植物中。
由于它们较小的尺寸,预期该肽能单独地获得一定程度的通过皮肤的渗透性;然而,可以使用某些技术来增强该移动。例如,可将亲脂(非极性)基团加入到该肽中,或者该肽可以在亲脂赋形剂中递送到皮肤,以便增强肽到达角质层以允许易位到下表皮层。以这种方式,这样的亲脂修饰可被考虑为具有前药效果。渗透增强剂例如已知的溶剂和表面活性剂可用于赋形剂中以更好地肽吸收。预期可用于增强肽到达靶组织/损伤的具体技术包括离子电渗疗法、电泳和超声。离子电渗疗法的装置由浸于电解质溶液中和置于皮肤上的两个电极组成。当运用电流通过电极时,跨越角质层产生驱动肽递送的电场。电穿孔法包括应用高压电脉冲以增加渗透通过脂双层膜。这在电流应用的持续时间和强度方面,不同于离子电渗疗法(离子电渗疗法使用相对固定低压电场)。相信电穿孔法的高压电脉冲在脂薄膜(lipid lamellae membranes)中诱导亲水孔的可逆形成,这能提供高度的透过增强。超声将具有大于16kHz频率的声波应用到皮肤,这引起声波通过的组织压缩和膨胀。所形成的压力变化引起可增加肽透过的多种作用(例如,成穴、混合、温度增加)。
本发明肽的其他特征、生产方式和应用例如在美国专利号6,974,799和5,492,894中描述。这两篇专利通过引用以其全部并入本文。
引入下列实施例来显示本发明的某些优选实施方式。
实施例
开发本发明的目标是鉴定能下调炎性过程例如紫外辐射引出的那些炎性过程的、小于500道尔顿的肽。小分子量的这类经鉴定肽将确保它们穿透皮肤上层的能力。从现有技术推断的下列理解部分地指导本发明的发展。
1.紫外辐射引起导致细胞因子产生和后续诱导有助于皮肤光老化的成分的炎症。后面过程的某些标志是由于胶原蛋白分解导致的起皱、由于过度的角质形成细胞增殖和纤维蛋白沉积导致的皮肤变厚、和由于黑色素超量生产导致的色素沉着过多(hyper-pigmentation)。启动UV诱导炎症的因子是细胞因子,例如IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α。
2.已经鉴定某些肽序列能抑制TRAF6(TNF受体-相关因子-6)与宽范围的免疫调控蛋白的结合,所述免疫调控蛋白包括人CD40、Trance和IRAK(IL-1受体-相关激酶)。这些TRAF6-相关的结合事件从TNF、IL-1和toll-样受体家族蛋白传递刺激至NF-κB,其是细胞免疫应答的中心调节子(regulator)。抑制这些TRAF6结合事件的肽具有通式Pro-X-Glu-X-X-(芳香族/酸性氨基酸)[PXQXX-(芳香族/酸性)](SEQ IDNO:16)并且位于数种TRAF6-相互作用蛋白内。
3.因为几个理由,含有序列PXQXX-(芳香族/酸性)的肽(SEQ ID NO:16)不能用于对抗光老化。一个理由为,该肽必须并入融合蛋白内以发挥其抑制作用;这类大的蛋白质不能有效地溶解跨过上皮层以达到炎性反应部位。同样,在实践水平上,具有抑制肽序列的融合肽对于局部用产品的内含物来说太大并且太昂贵。
4.NF-κB信号传导通路是直接涉及促炎细胞因子调控和应力应答的主要的通路。已经表明皮肤细胞暴露于多种NF-κB活化剂——包括TNF-α、脂多糖和紫外光——导致抑制蛋白质IκB的磷酸化和降解。释放的NF-κB随后易位进入细胞核,在此调节细胞因子表达。
5.多种类型的胶原蛋白有助于细胞外基质包含在机体不同的结缔组织中。这些不同的胶原蛋白由成纤维细胞、其他的结缔组织细胞和促炎细胞因子IL-1和TNF诱导的炎性细胞产生的特异性MMP所降解。明显地相应炎性刺激释放的IL-1、IL-6、TNF-α和干扰素(IFN-α和IFN-γ)是MMP潜在的诱导物。尽管MMP分泌的调节依赖于细胞类型和刺激,但是已经显示转录因子AP-1与在成纤维细胞中上调MMP-1直接相关。在体外和体内也已经示出AP-1活性和随后的皮肤中MMP表达通过紫外辐射诱导。
基于这些理解,断定尽管仅仅示出PXQXX-(芳香族/酸性)(SEQ IDNO:16)肽抑制非-UV-诱导的炎性过程,但是可以设计能抑制UV-诱导的炎症的相关序列,而不需要并入融合蛋白内(即,该肽为短肽)。下面实施例1-5涉及该主题。实施例6涉及包含生物活性肽的组合物中蛋白酶抑制剂的一般应用。
实施例1:设计和合成与PXQXX-(芳香族/酸性)(SEQ ID NO:16}肽相关的肽。
设计本发明肽的合理原则包括下列参数:
1.肽的长度为仅仅四个氨基酸(即小于500道尔顿的四肽)。
2.从TRAF6-结合蛋白的保守结合结构域[PXQXX-(芳香族/酸性)](SEQ ID NO:16)选择序列。
3.四肽序列在PXQXX-(芳香族/酸性)(SEQ ID NO:16)的位置1保守为脯氨酸并且在PXQXX-(芳香族/酸性)(SEQ ID NO:16)的位置3保守为谷氨酸。
4.指定位置2和4为在天然发生的PXQXX-(芳香族/酸性)(SEQ IDNO:16)的形式中这些位点处存在的氨基酸残基:
a.位置2:Q、T、L、G、E、V或P;
b.位置4:I、M、D、V、N、S或T。
5.为了产生另外的变化,也在位置4应用带正电荷的残基;这样的氨基酸安排在自然中是避免的。
肽合成:所有的肽使用标准Fmoc化学在Advanced ChemTech(Louisville,KY)Apex 396 Multiple Peptide Synthesizer上合成。首先洗涤Rink酰胺树脂,并用DMF预膨胀。用DMF中25%哌啶除去Fmoc保护基,在这之后,洗涤树脂以除去痕量的哌啶。Fmoc氨基酸单体在DMF中等摩尔的(0.5M)HOAt或HOBt溶液中预活化。在使用阻碍碱(二异丙基乙胺)的碱性条件下,使用HATU、PyBop或HBTU和2.5到5倍摩尔过量的氨基酸进行酰胺化连接。使用标准Kaiser试验监控连接效率。
肽从酸不稳定连接的切割使用95%三氟乙酸和水以及适当加入的净化剂完成。在从切割嵌段移出后,经由HPLC,使用反相C18柱和质谱,对这些肽进行纯化和分析。使用LC/MS/MS系统(ABI API2000)完成一级序列证实和制备纯化。制备的肽的序列在表1中提供。
实施例2:细胞培养物和IL-6和MMP-1的检测。
人皮肤上皮细胞(ATCC CRL-2592)、角质形成细胞(ATCC CRL-2404)和皮肤成纤维细胞(ATCC CRL-7481)用于本研究。将细胞接种于6孔平板中,并使其在被调节以包含1.5g/L碳酸氢钠并补充有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco修改的Eagle培养基(DMEM;4mM L-谷氨酰胺,4.5g/L葡萄糖)中培养至>95%汇合。对于角质形成细胞,细胞在补充有5ng/mL的人重组上皮生长因子(EGF;Invitrogen,Grand Island,NY)的角质形成细胞生长培养基(没有血清)中生长。在细胞单层达到>95%汇合时,细胞被在没有血清的完全培养基中血清饥饿或EGF饥饿24小时。使用照射波长分别设置在365或302nm的UVLMS灯(4W型,3UV组件;Upland,CA)产生UVA或UVB。UV灯被置于组织培养板上方15cm处。UV处理之前,组织培养基被替换为PBS,此之后,将细胞置于UVB灯(450μW/cm2,使用辐射计测量)下35秒(上皮细胞和成纤维细胞)或25秒(角质形成细胞)。对于成纤维细胞进行UVA处理(500μW/cm2)30秒。在UV处理后,立即用包含或不包含指定浓度的肽的完全培养基(无血清或EGF)替换PBS,并且在37℃、5%的CO2下温育平板15-24小时。然后,收集细胞培养基,并在15000rpm下离心2分钟以除去细胞碎片。分别使用人IL-6(DIACLONE,Stamford,CT)和MMP-1(Calbiochem,San Diego,CA)ELISA试剂盒,根据制造商的指示,测量培养基中IL-6和MMP-1水平。这些测量作为响应UV暴露的细胞炎性活性的指示。
实施例3:筛选抗炎活性的肽:在人皮肤上皮细胞中抑制UV-诱导的IL-6表达。
如在图1中所述,人上皮细胞响应UVB辐射上调IL-6表达。在表1中列出的所有四肽以40μg/mL进行筛选检测对该响应的有效下调(数据未示出)。在第一个实验中下调IL-6表达的那些肽在第二个实验中再次检测,其结果在图1中示出。
在皮肤上皮细胞中,40μg/mL的四肽P1422(SEQ ID NO:1)和P1423(SEQ ID NO:2)都示出对UVB-诱导的IL-6表达的可再现的抑制。如在图2中所示,这种下调对于这两种肽都是浓度依赖性的。10和20μg/mL的P1422(SEQ ID NO:1)分别减少IL-6水平的19%和25%;而10和20μg/mL的P1423(SEQ ID NO:2)分别减少IL-6水平的10%和20%。当细胞用除了P1422(SEQ ID NO:1)和P1423(SEQ ID NO:2)以外的其他四肽处理时没有观察到对IL-6表达的抑制作用,这一事实暗示新的抗炎活性在于特异性序列例如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。
实施例4:筛选抗炎活性的肽:在人皮肤角质形成细胞和成纤维细胞中抑制UV-诱导的IL-6表达。
公知地,UV-照射的表皮角质形成细胞和成纤维细胞释放促炎细胞因子。因此,除了皮肤上皮细胞外,这些细胞可有助于导致弱化光老化作用的级联事件(cascade ofevents)。出于这些原因,检测P1422(SEQ IDNO:1)和P1423(SEQ ID NO:2)对这些细胞类型中UV-诱导的IL-6表达的抑制活性。如在图3(A和B)中所示,这两种四肽下调UVB-处理的人角质形成细胞中IL-6的表达。
这样的肽-介导的IL-6下调在暴露于UVB后的人成纤维细胞中也是明显的。P1423(SEQ ID NO:2)-介导的IL-6表达的抑制是剂量依赖性的,因为与对照细胞IL-6产生(没有肽处理,数据没有示出)相比,2、5和10μg/mL的肽分别减少IL-6水平24%、30%和48%。在成纤维细胞中,与对照细胞IL-6产生相比,10μg/mL的P1422(SEQ ID NO:1)减少UV-刺激的IL-6表达30%;然而,当运用低浓度的肽时,没有观察到显著的IL-6减少。
实施例5:筛选抗炎活性的肽:在人皮肤成纤维细胞中抑制UV-诱导的MMP-1表达。
UV(UVA和UVB)辐射增加成纤维细胞中MMP-1表达和活性。响应UV暴露在人皮肤中产生的大多数MMP源自定居(resident)成纤维细胞。因为MMP产生有助于皮肤中的UV诱导的炎性反应(例如水肿)和其慢性效应(例如起皱),抑制成纤维细胞MMP-1表达将缓解阳光对皮肤的不良效果。
怀着这个目的,进行实验以确定四肽P1422(SEQ ID NO:1)和P1423(SEQ ID NO:2)对成纤维细胞中UV-诱导的MMP-1表达的作用。在UVA处理(500μW/cm2)45秒后,用或不用这些肽处理成纤维细胞。10μg/mL的P1422(SEQ ID NO:1)和P1423(SEQ ID NO:2)都能下调UVA-诱导的MMP-1表达,如在图4(A和B)中所示的。
Fagot等(2002、2004)已经示出UVB-刺激的角质形成细胞产生的细胞因子引起皮肤成纤维细胞中MMP-1的旁分泌上调。通过在培养基--根据UVB处理的角质形成细胞调节的--中温育成纤维细胞,实验模拟这种信号传导方式。尽管MMP-1在以这样处理的成纤维细胞培养物中被上调,但是用四肽P1422(SEQ ID NO:1)或P1423(SEQ ID NO:2)培养的那些表现出小得多的MMP-1诱导(图5A和5B)。
总之,这些研究表明基于TRAF6-结合结构域的某些四肽能够下调紫外辐射诱导的IL-6和MMP-1的水平。这些发现是令人惊奇的,因为紫外辐射诱导的这些炎性通路先前不知道包括TRAF6-相关的信号传导事件。这些短肽抑制的这两种主要的炎症介质(IL-6)和效应物(MMP-1)显示它们适用于预防和治疗皮肤炎症和其有害作用。
实施例6:包括蛋白酶抑制剂的本发明的实施方式
本发明也涉及含有蛋白酶抑制剂和生物活性肽组合的皮肤护理制剂。预期这样的组合物对皮肤和其他上皮表面(例如粘膜表面)表现美容和治疗活性。丝氨酸蛋白酶抑制剂是本发明的实例成分。使用含有生物活性肽和蛋白酶抑制剂的组合物以实现皮肤治疗和美容改变的方法是本发明的另一方面。
多种肽成分用于美容和皮肤护理行业以将一系列生物活性递送到皮肤上和皮肤内(表2)。已经很好地证明皮肤的外层--角质层(SC),包含一系列能降解蛋白质和肽的蛋白酶。当应用于皮肤时某些肽的生物活性在SC中发挥。因此,位于SC中的蛋白酶构成实现包含生物活性肽的局部皮肤应用的充分治疗和/或美容益处的障碍(barrier)。
SC包括至少三个蛋白酶家族:丝氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶。丝氨酸蛋白酶(SP)包括表皮特异性蛋白酶激肽释放酶-5(也称为SC胰蛋白酶,SCTE)(Brattsand and Egelrud,1999)和激肽释放酶-7(也称为SC胰凝乳蛋白酶(chymotryptic enzyme))(Hansson et al,1994)。这两种激肽释放酶都已知涉及脱皮过程(即皮肤脱落)。已在皮肤中分离的另外的丝氨酸蛋白酶是纤维蛋白溶酶和尿激酶(Voegeli et al,2007)。SC巯基蛋白酶(SCTP)和组织蛋白酶D分别是存在于SC中的半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶(Bernard et al,2003;Horikoshi et al,1998)。
SC的生物物理学特性和生物学特性的季节性变化被充分地证明。特别地,与惯常遮盖的皮肤相比,已证明冬季更严重地影响暴露的皮肤。而且,当缺乏抵抗力时,例如在干燥皮肤条件下,面部SC显示包含增加水平的促炎细胞因子和蛋白酶。Voegeli等(2007)通过分析健康白种人对象在冬季和夏季期间连续胶带剥离(consecutive tape stripping),检验在面颊和前臂的SC的不同层中主要丝氨酸蛋白酶活性(激肽释放酶-5、激肽释放酶-7、尿激酶、纤维蛋白溶酶和类胰蛋白酶样酶)的分布。与在前臂SC中观察的活性水平相比,脸上的纤维蛋白溶酶、尿激酶和类胰蛋白酶的活性水平是大约5到8倍,而面颊上激肽释放酶-5和激肽释放酶-7的活性水平是大约2到4倍。因此,与暴露于环境的那些区域相比,保护的皮肤区域示出较少的蛋白酶活性,这可能指示在暴露的皮肤中的亚临床炎症。Voegeli等(2007)也进行了下列理解:(i)在正常健康的前臂皮肤中,外部SC显示比在其更深层中具有更大的丝氨酸蛋白酶活性;(ii)与前臂相比,尿激酶样和纤维蛋白溶酶样活性在从面颊的SC剥离上升高,这证实纤维蛋白溶酶的原级联活化;和(iii)SC中类胰蛋白酶样活性在来自面颊的样品中也升高,这可能指示肥大细胞涉及屏障缺乏抵抗力皮肤和/或角质形成细胞合成新的类胰蛋白酶样酶。因为在源自临床上正常面颊的皮肤的SC中观察到尿激酶、纤维蛋白溶酶、激肽释放酶-5、激肽释放酶-7和类胰蛋白酶样酶活性升高,所以预计在表皮屏障削弱的皮肤状况下这些酶甚至存在更高的活性。
存在许多近来的研究,其将在SC中存在的蛋白酶与皮肤临床病症例如红斑痤疮和牛皮癣联系起来(Borgono et al.,2007;Yamasaki et al.,2007;Pampalakis and Sotiropoulou,2007)。在这些情况中,所讨论的蛋白酶是激肽释放酶家族的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶和胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。蛋白酶在红斑痤疮中的作用可部分地基于宿主先天免疫肽LL-37分解成促炎片段(Yamasaki et al,2007)。对于牛皮癣,对表层细胞脱落负责的激肽释放酶蛋白酶失去调控,并引起脱落增加,其导致脱皮,这发生于皮肤过度脱落。这些状况导致炎症和其他的显著的临床症状。在亚临床水平下,这些过程可导致皮肤干燥、皮肤发红、屏障功能破坏(导致皮肤水分损失)、细胞外基质破坏和过早的皮肤老化。因此,应用能通过抑制皮肤蛋白酶减慢该过程的活性成分是明显有价值的。
肽活性成分用于美容和皮肤护理产品以提供能改善皮肤外观、感觉和美学的生物活性。这样的生物活性肽也可用于治疗学目的,例如在治疗创伤或烧伤中。然而,如上所述,皮肤传递(express)能降解蛋白质和肽的蛋白酶,因此阻止某些肽发挥它们的有益效果的能力。该SC定居蛋白酶的消极效果增加了关于炎症和皮肤细胞周转(turnover)的其消极效果。这些问题被本发明的这样的方面所克服,该方面部分涉及包含生物活性肽和蛋白酶抑制剂的制剂。这样的组合使皮肤护理制剂具有三个期望的特征:(i)肽成分提供特异性生物活性(例如抗炎、细胞刺激/增殖/迁移等);(ii)蛋白酶抑制剂成分保护肽成分免于降解,这导致延长的有益肽效果;和(iii)蛋白酶抑制剂成分减少蛋白酶对皮肤的一般消极效果,例如发红和脱皮。这持久的特征(iii)部分赋予对生物活性肽的保护,所述生物活性肽对制剂应用部位是内源的;因此,蛋白酶抑制剂增加异位应用的肽和皮肤天然传递的那些肽的活性。
本发明在治疗和美容制剂中提供增强肽活性的创新方法。这样的肽功能增强通过将目的肽与适当的蛋白酶抑制剂组合而获得。不但蛋白酶抑制剂通过增加肽的半衰期来延长治疗活性,而且该抑制剂也防止从原来的皮肤蛋白质产生促炎片段。因此,这样的肽和蛋白酶抑制剂的组合提供具有三层水平效力的皮肤护理制剂。尽管每种成分--肽和蛋白酶抑制剂--递送其自己的有益效果,它们的组合协同使制剂比仅具有一种这些成分的制剂更有效得多。
本发明也提供显著的成本效益。用于具有适当的蛋白酶抑制剂的组合的肽将显示更大的半衰期。因此,这样的肽不必以当在不存在蛋白酶抑制剂情况下使用肽所需要的较高水平供应。制备本发明的生物活性肽制剂的蛋白酶抑制剂的成本明显小于生产实现制剂的活性水平所必须的较高肽数量的成本。
生物活性肽是本领域公知的;可并入在本发明的该方面那些生物活性肽的长度优选小于200个氨基酸残基,长度优选小于100个氨基酸残基,长度优选小于50个氨基酸残基,长度优选小于45个氨基酸残基,长度优选小于40个氨基酸残基,长度优选小于35个氨基酸残基,长度优选小于30个氨基酸残基,长度优选小于25个氨基酸残基,长度优选小于20个氨基酸残基,长度优选小于15个氨基酸残基,或长度优选小于10个氨基酸残基。在本发明中可以使用的其他生物活性肽的长度优选至少4、5、6、7、8或9个氨基酸残基。
可并入本发明的各种实施方式中的生物活性肽的非限定性实例是大量的,并且在下列文献中描述:美国专利号6,255,282(参见其中的附图3A/B和权利要求书)、美国专利号6,303,568(参见其中的表1)、美国专利号5,962,410(参见其中的表1)、美国专利号7,875,744(参见其中的表1和权利要求书)、美国专利号7,407,940(参见其中的表1和权利要求书)、美国申请公开号20070299015(申请系列号11/811,876)(参见其中的表1、5和权利要求书)、申请系列号12/005,653(参见其中的表1和权利要求书),美国专利号6,288,212(参见其中的表1和单个权利要求)、美国专利号6,337,317(参见其中权利要求书)、美国专利号6,172,185(参见其中的表1和权利要求书)和申请系列号61/000,815(参见其中的表1和权利要求书);这些专利和申请的每一篇,特别是所指出的其部分通过参考以其全部并入本文。在本申请公开的四肽(表1和SEQ ID NOs:14-15)也可并入本发明的该方面。一种或更多种生物活性肽可用于本发明。尽管本发明主要涉及具有固有活性的肽的结合,其可以或可以不依赖于肽位于的环境(即,肽仅仅当置于特定背景中时具有活性),不具有(或不知道具有)任何特定活性的肽也可用于本发明。
可并入本发明的各种实施方式中的生物活性肽的其他非限定性实例在表2中列出。
表2:目前市场可得的包括在皮肤护理产品中作为活性成分的某些肽a
a用于本表的缩写:ACE,血管紧张肽I转变酶;ECM,细胞外基质;HA,透明质酸;HGF,肝细胞生长因子;MMP,基质金属蛋白酶;MSH,促黑激素;SNARE,可溶的NSF附着受体(NSF,N-乙基马来酰亚胺敏感因子);TGF-β,转化生长因于-β;TIMP,MMP的组织抑制剂。
b制造商位置:Atrium Biotechnologies(Quebec City,Canada),GrantIndustries(Elmwood,NJ),Lipotec(Barcelona,Spain),Pentapharm(Basel,Switzerland),Procyte(Photomedix,Montgomeryville,PA),Sederma(LePerray en Yvelines,France)。
研究目的
在结合生物活性肽的美容和治疗皮肤护理产品中应用蛋白酶抑制剂以产生多种益处方面还没有被研究。因此,本发明目标是确定蛋白酶抑制剂是否可以保护合成的和固有来源的生物活性肽免于蛋白水解的降解。这样的蛋白酶抑制剂将为用于含有肽的皮肤护理制剂的候选物。
分析材料和方法
下列蛋白酶抑制剂被鉴定在蛋白水解的条件下抑制生物活性肽分解的能力:抑肽酶(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、氨甲环酸(Sigma-Aldrich)、过苄脒(Sigma-Aldrich)、Fmoc-lys(Boc)(Chem-Impex,Chicago,IL)、Fmoc-arg(Pmc)(Chem-Impex)、苯甲酰-arg-硝基苯胺(Sigma-Aldrich)和苯甲酰-arg-萘酰胺(Sigma-Aldrich)。
下列肽被用作代表性的皮肤护理生物活性成分肽和固有皮肤肽:寡肽-10(HB64)(Peptisyntha,Torrence,CA),其为FAKALKALLKALKAL-NH2(SEQ ID NO:17)的序列(参考美国专利号7,381,704);六肽-21(HB 168)(Neo-MPS,San Diego,CA),其为FALLKL-NH2(SEQ ID NO:18)的序列(参考美国专利号7,381,704);HB1345(Peptisyntha),其为癸酰-KFKWPW-NH2(SEQ ID NO:19)(参考美国专利号7,407,940);和LL-37(LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES,SEQ ID NO:20),其被Johansson等(1998)公开(通过引用以其全部并入)。尽管HB64、HB168和HB1 345肽具有合成源,但是LL-37最初被限定为人细胞固有表达的。
下列蛋白酶用于实施本发明:胰凝乳蛋白酶(Sigma-Aldrich),其在酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的羧基末端切割氨基酸链;胰蛋白酶(Sigma-Aldrich),其在赖氨酸和精氨酸的羧基末端切割氨基酸链,除了当其下一个氨基酸为脯氨酸时;弹性蛋白酶(Sigma-Aldrich),其为在小的、疏水氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸和缬氨酸的羧基末端切割氨基酸链的丝氨酸蛋白酶;激肽释放酶(Sigma-Aldrich),其为丝氨酸蛋白酶;纤维蛋白溶酶(Sigma-Aldrich),其为丝氨酸蛋白酶;和尿激酶,其为丝氨酸蛋白酶。
测量肽降解的方法
合成来源的肽和LL-37以在0.5M MOPS pH 8.5/0.5M NaCl终缓冲液浓度中的1-2mg/mL的浓度用于蛋白酶加工实验中。蛋白酶以0.020-0.050mg/mL的浓度使用。
实验成对进行,一个用蛋白酶抑制剂和一个不用蛋白酶抑制剂。在从将蛋白酶加入到肽的时刻(零时刻)大约1分钟、1小时、4小时和24小时时间点,收集液相色谱/质谱(LC/MS)波谱。使用开始于5%的乙腈并于25分钟逐步上升到65%的乙腈的标准反相梯度,收集LC/MS波谱。用XIC(eXtracted Ion Count)示踪,监控肽亲代离子,而用TIC(Total IonCount)示踪观察肽片段,如下所述。
该研究中使用的蛋白酶最初溶于1M NaCl溶液中,而该肽溶于pH8.5的1M MOPS缓冲液中。将溶液平衡至37℃,然后以1∶1的比率混合以开始每次实验。也使用低缓冲液浓度(0.1M MOPS pH 8.5和0.2MNaCl)。对给定蛋白酶,在数个不同的浓度下(由低至高从0.02mg/mL到40mg/mL)检测蛋白酶抑制剂。
在该研究中使用的某些质谱过程在下面讨论,用于描述表3(下面)中的数据如何产生和解释的指导目的。在监控本发明的方法中使用质谱获得三种不同的数据输出:
A.TIC示踪(Total Ion Count),其是特定时间期间内通过柱/质谱仪的所有分子量(所有分子)的读出。
B.XIC示踪(eXtracted Ion Count),其是代表从TIC示踪取出特定分子量的读出。
C.质谱,其代表选自TIC或XIC示踪的峰内的一定范围的分子实体。
因为这些过程是本领域已知的,所以下面的讨论将限于描述在质谱实验中观察的结果(即,数据没有示出)。
结果
下列实例显示上面描述的不同的质谱输出可用于监控蛋白酶介导的合成肽(例如HB64)和先天免疫肽(例如LL-37)的降解和其抑制。用于这些研究的质谱具有检测极限,在该检测极限之下,分子的特异性分子量不能从TIC示踪鉴定。在这些检测下情况中,假设检测的肽完全地降解。
获得TIC示踪以在23小时时间期间监视通过蛋白酶胰蛋白酶降解/消化寡肽-10(HB64)。具体地说,肽降解通过LC/MS在零时刻、1小时和23小时测量。显然TIC示踪中的母峰(parent peak)(代表全长的、未降解的肽)随时间减少,并且各种分解产物的峰随时间强度增加。该胰蛋白酶-介导的蛋白质水解的初级消化产品是四肽ALLK(SEQ ID NO:21)。
有趣地,TIC示踪显示在包括蛋白酶抑制剂抑肽酶的重复实验中,保护亲本肽抵抗由蛋白酶降解。该结果与生物活性肽当与蛋白酶抑制剂组合应用于皮肤时,将保持其结构并因此保持其功能一段较长的时间的预期相一致。因此,与仅含有相同浓度生物活性肽的皮肤制剂相比,本发明更有效。同样,即使选择的生物活性肽由于长度和/或序列的原因而没有经历蛋白水解的降解,包含蛋白酶抑制剂也将防止在制剂应用部位处天然表达的有益肽的降解(即,有益的内源肽将被保护)。
已经暴露于纤维蛋白溶酶仅仅1分钟的肽LL-37的TIC示踪足以使零时刻读出。在大约16分钟保留时间检测到完整LL-37肽的存在,其通过质谱读出所证实;在899.5、1123.4和1497.6amu(原子质量单位)的三个不同的峰分别代表同样肽(LL-37)的不同的电荷形式。
在与纤维蛋白溶酶温育1小时后,亲本肽LL-37的分子量不可检测,并且出现低保留时间的TIC示踪峰(11分钟到13分钟)。这些峰代表具有低至450的分子量的LL-37的分解产物。检测的LL-37的分解产物的精确序列基于在分子量上与该LL-37部分的精确匹配被测定为RIVQR.IKDFLRNLVPRTES(SEQ ID NO:22)。观测到三种不同电荷形式的SEQ ID NO:22,正如对全长LL-37所观测的。
重复利用LL-37和纤维蛋白溶酶的上述实验,但是这次在反应中包括蛋白酶抑制剂凝血酸。在1小时温育期之后获得该反应的TIC示踪。在大约16.5分钟的保留时间时获得质谱。如在TIC示踪和质谱两者中都明显的,LL-37的分解产物被产生;然而,重要地是,完全的完整亲本肽仍然可以以可感知的水平检测为三个质谱峰,给出电荷差异。该结果与使用不同肽/蛋白酶/抑制剂组合的上述分析的结果一致。因此,期望本发明的该方面适用于生物活性肽和蛋白酶抑制剂的多种组合;该期望用在下面表3中的提出的证据进一步确证。
在另一个实验中,在暴露于纤维蛋白溶酶4小时后,用TIC和XIC示踪监控寡肽-10(HB64)的降解。从该分析,显然纤维蛋白溶酶靶向并降解HB64。XIC示踪(在799.5amu处)显示尽管大多数HB64肽被降解,但是一些亲本肽仍可以被检测。当该反应包括凝血酸时,通过TIC和XIC示踪HB64肽保护纤维蛋白溶酶介导的蛋白质水解是明显的。事实上,与当肽与纤维蛋白溶酶单独温育时相比,通过XIC示踪测定的反应中亲本肽的量为其5倍大。
当考虑更宽范围的蛋白酶、肽和蛋白酶抑制剂时,使用上述方法进行一系列的实验以测定本发明的实用性。来自该工作的数据总结在表3中。在任何具体时间点,如果没有可检测的亲本肽(即,不存在未降解的肽),那么该时间点被记录为肽降解需要的时间。
表3:不同的蛋白酶抑制剂对不同的生物活性肽的保护效应
蛋白酶 | 浓度μg/mL | 肽a | MW | 蛋白酶抑制剂 | 浓度mg/mL | 存活期 | 实验编号 |
胰蛋白酶 | 25 | HB64 | 1598 | 没有 | <1hr | 4 | |
胰蛋白酶 | 25 | HB64 | 1598 | 抑肽酶 | 0.02 | >24hr | 5 |
胰蛋白酶 | 25 | HB168 | 702 | 没有 | <1hr | 6 | |
胰蛋白酶 | 25 | HB168 | 702 | 抑肽酶 | 0.02 | >24hr | 7 |
胰蛋白酶 | 25 | HB1345 | 1044 | 没有 | <1hr | 8 | |
胰蛋白酶 | 25 | HB1345 | 1044 | 抑肽酶 | 0.02 | >24hr | 9 |
胰蛋白酶 | 25 | HB64 | 1598 | 没有 | <1hr | 10 | |
胰蛋白酶 | 25 | HB64 | 1598 | 熊果酸 | 0.02 | <1hr | 11 |
胰蛋白酶 | 25 | HB64 | 1598 | 没有 | <1hr | 12 | |
胰蛋白酶 | 25 | HB64 | 1598 | 凝血酸 | 0.02 | <1hr | 13 |
胰蛋白酶 | 25 | HB64 | 1598 | Fmoc-Lys(Boc) | 0.02 | <1hr | 14 |
胰蛋白酶 | 25 | HB64 | 1598 | Fmoc-Arg(Pmc) | 0.02 | <1hr | 15 |
胰蛋白酶 | 25 | HB64 | 1598 | 过苄脒 | 0.02 | <1hr | 16 |
胰蛋白酶 | 25 | HB64 | 1598 | 过苄脒 | 0.80 | >24hr | 17 |
胰蛋白酶 | 25 | HB64 | 1598 | 凝血酸 | 0.80 | <1hr | 18 |
胰蛋白酶 | 25 | HB64 | 1598 | 苯甲酰基-Arg-硝基苯胺 | 0.80 | <1hr | 19 |
胰蛋白酶 | 25 | HB64 | 1598 | 苯甲酰基-Arg-萘胺 | 0.80 | >24hr | 20 |
胰蛋白酶 | 25 | HB64 | 1598 | 熊果酸 | 0.80 | <24hr | 21 |
弹性蛋白酶 | 25 | HB64 | 1598 | 没有 | <1hr | 22 | |
弹性蛋白酶 | 25 | HB64 | 1598 | 抑肽酶 | 0.02 | <1hr | 23 |
弹性蛋白酶 | 25 | HB64 | 1598 | 凝血酸 | 0.80 | <1hr | 24 |
纤维蛋白溶酶 | 25 | HB64 | 1598 | 没有 | <4hr | 25 | |
纤维蛋白溶酶 | 25 | HB64 | 1598 | 凝血酸 | 0.80 | <24hr | 26 |
激肽释放酶 | 25 | HB64 | 1598 | 没有 | <24hr | 27 | |
激肽释放酶 | 25 | HB64 | 1598 | 凝血酸 | 0.80 | <24hr | 28 |
纤维蛋白溶酶 | 25 | HB64 | 1598 | 凝血酸 | 0.80 | <6hr | 29 |
纤维蛋白溶酶 | 25 | HB64 | 1598 | 没有 | <6hr | 30 | |
纤维蛋白溶酶 | 50 | HB64 | 1598 | 凝血酸 | 10 | <6hr | 31 |
纤维蛋白溶酶 | 46 | HB64 | 1598 | 没有 | <4hr | 32 | |
胰蛋白酶 | 22 | HB64 | 1598 | 凝血酸 | 10 | <1hr | 33 |
胰凝乳蛋白酶 | 25 | HB64 | 1598 | 没有 | <1hr | 34 | |
胰凝乳蛋白酶 | 25 | HB64 | 1598 | 抑肽酶 | 0.02 | <24hr | 35 |
纤维蛋白溶酶 | 22 | LL-37 | 4493 | 凝血酸 | 9 | <4hr | 36 |
纤维蛋白溶酶 | 22 | LL-37 | 4493 | 没有 | <1hr | 37 | |
纤维蛋白溶酶 | 22 | LL-37 | 4493 | 没有 | <45min | 38 | |
胰凝乳蛋白酶 | 22 | LL-37 | 4493 | 没有 | <1hr | 39 | |
胰凝乳蛋白酶 | 22 | LL-37 | 4493 | 凝血酸 | 9 | <1hr | 40 |
激肽释放酶 | 22 | LL-37 | 4493 | 没有 | <4hr | 41 | |
激肽释放酶 | 22 | LL-37 | 4493 | 凝血酸 | 9 | <4hr | 42 |
纤维蛋白溶酶 | 20 | HB64 | 1598 | 没有 | NA | 43 | |
纤维蛋白溶酶 | 20 | HB64 | 1598 | 凝血酸 | 40 | NA | 44 |
纤维蛋白溶酶 | 20 | HB64 | 1598 | 没有 | <4hr | 45 | |
纤维蛋白溶酶 | 22 | HB64 | 1598 | 凝血酸 | 40 | <24hr | 46 |
激肽释放酶 | 22 | LL-37 | 4493 | 没有 | <4hr | 47 | |
激肽释放酶 | 22 | LL-37 | 4493 | 抑肽酶 | 0.02 | <24hr | 48 |
激肽释放酶 | 22 | LL-37 | 4493 | 没有 | <1hr | 49 | |
激肽释放酶 | 22 | LL-37 | 4493 | 凝血酸 | 40 | <2hr | 50 |
尿激酶 | 22 | LL-37 | 4493 | 没有 | <24hr | 51 | |
尿激酶 | 22 | LL-37 | 4493 | 抑肽酶 | 0.02 | >24hr | 52 |
尿激酶 | 22 | LL-37 | 4493 | 没有 | <24hr | 53 | |
尿激酶 | 22 | LL-37 | 4493 | 凝血酸 | 40 | >24hr | 54 |
激肽释放酶 | 22 | LL-37 | 4493 | 没有 | <1hr | 55 | |
激肽释放酶 | 22 | LL-37 | 4493 | 凝血酸+熊果酸 | 均为20 | >24hr | 56 |
激肽释放酶 | 22 | LL-37 | 4493 | 10%DMSO | <1hr | 57 |
a所有肽以1mg/mL的终浓度使用。
总结
如在该实施例中所述,关于皮肤和肽分解的一些最重要的蛋白酶是纤维蛋白溶酶、激肽释放酶和尿激酶。本发明示出针对这些蛋白酶(例如表3)进行研究。重要地,检测的蛋白酶抑制剂具有优秀的安全性特征。例如,抑肽酶和凝血酸被用作凝血疗法(clotting therapy)的全身性药物,而熊果酸用作美容和草药成分。本文的目的是鉴定能保护固有肽和合成肽免于蛋白水解降解的试剂(或复数种试剂);这样的抑制剂可在皮肤护理产品中用于与生物活性肽组合。考虑到凝血酸对大量蛋白酶的抑制性作用、以及低制造成本、安全性特征和溶解性,凝血酸是实践本发明该方面的优选蛋白酶抑制剂。
本文公开和要求保护的所有组合物或方法可以制备或执行,而根据本公开不需要大量的实验。尽管本发明的组合物和方法已经更具优选的实施方式进行描述,但是可对组合物和/或方法以及在本文描述的方法中的步骤或步骤顺序进行改变而没有背离本发明的原理、精神和范围,这是对本领域技术人员显而易见的。更具体地说,化学上和生理学上都相关的某些试剂可以替代本文描述的试剂而达到相同或相似的结果,这是显然地。对本领域普通技术人员显而易见的所有这类相似的替代和修改被认为在本发明的范围内。
在本申请鉴定的所有专利和申请通过引用以其全部并入本文。
参考文献
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<210>1
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<212>PRT
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<223>合成
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<221>MOD_RES
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Pro Xaa Glu Xaa Xaa Xaa
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<220>
<223>合成
<220>
<221>MOD_RES
<222>(15)..(15)
<223>氨基酸残基被修饰为含有氨基
<400>17
Phe Ala Lys Ala Leu Lys Ala Leu Leu Lys Ala Leu Lys Ala Leu
1 5 10 15
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<220>
<223>合成
<220>
<221>MOD_RES
<222>(6)..(6)
<223>氨基酸残基被修饰为含有氨基
<400>18
Phe Ala Leu Leu Lys Leu
1 5
<210>19
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>氨基酸残基被修饰为含有癸酰基
<220>
<221>MOD_RES
<222>(6)..(6)
<223>氨基酸残基被修饰为含有氨基
<400>19
Lys Phe Lys Trp Pro Trp
1 5
<210>20
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成
<400>20
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu
1 5 10 15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val
20 25 30
Pro Arg Thr Glu Ser
35
<210>21
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成
<400>21
Ala Leu Leu Lys
1
<210>22
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成
<400>22
Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg
1 5 10 15
Thr Glu Ser
Claims (24)
1.分离的肽,其中所述肽的氨基酸序列由脯氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸-X(P-Q-E-X)组成,其中X是赖氨酸(K)或异亮氨酸(I)。
2.权利要求1所述的肽,其中所述肽是酰胺化的、脂化的或与载体分子辍合的。
3.权利要求1所述的肽,其中所述肽具有D-对映体形式的氨基酸残基。
4.权利要求1所述的肽,其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO:14组成。
5.权利要求4所述的肽,其中所述肽是SEQ ID NO:1。
6.权利要求1所述的肽,其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO:15组成。
7.权利要求6所述的肽,其中所述肽是SEQ ID NO:2。
8.组合物,其包含根据权利要求1所述的肽和药学上可接受的载体。
9.权利要求8所述的组合物,其中所述肽以0.1μg/mL到50μg/mL范围的浓度存在。
10.权利要求8所述的组合物,其中所述组合物进一步包含蛋白酶抑制剂。
11.权利要求8所述的组合物,其中所述组合物为气溶胶、乳剂、洗液、霜剂、糊剂、膏剂、粉末或泡沫的形式。
12.权利要求8所述的组合物,其中所述肽是SEQ ID NO:1或SEQID NO:2。
13.权利要求8的组合物,其中所述组合物用于治疗哺乳动物中的炎症,所述治疗通过将治疗有效量的组合物施用到所述哺乳动物的炎症部位持续有效量的时间。
14.权利要求13所述的组合物,其中所述炎症位于所述哺乳动物的皮肤或相关粘膜组织中。
15.权利要求14所述的组合物,其中所述炎症位于皮肤中,并且由于暴露于紫外辐射。
16.权利要求15所述的组合物,其中所述组合物的肽是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
17.权利要求14所述的组合物,其中所述炎症部位是擦破、水泡、烧伤、划破、溃疡、撞伤、皮疹或瘢痕。
18.权利要求13所述的组合物,其中所述组合物的肽是SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2。
19.权利要求13所述的组合物,其中所述治疗有效量的组合物包含浓度范围为0.1μg/mL到50μg/mL的肽。
20.权利要求13所述的组合物,其中所述组合物进一步包含蛋白酶抑制剂。
21.权利要求1-7中任一项的肽在制备用于抑制细胞表达白细胞介素(IL)-6或基质金属蛋白酶(MMP)-1的药物中的用途。
22.权利要求21所述的用途,其中所述细胞表达白细胞介素(IL)-6或基质金属蛋白酶(MMP)-1源自所述细胞暴露于紫外辐射。
23.权利要求21所述的用途,其中所述细胞是上皮细胞、角质形成细胞或成纤维细胞。
24.权利要求1-7中任一项的肽在制备用于皮肤护理的药物中的用途。
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