KR20010042402A - 피부 상처의 치료를 위한 프로테아제 억제제의 용도 - Google Patents

Abstract

종아리 궤양과 같은 만성적인 상처의 치료가 PAI-2와 같은 세린 프로테아제 억제제의 국소 투여에 의해 촉진된다. 상처의 치료는 또한 PAI-2와 같은 프로테아제 억제제와 다른 세린 프로테아제 억제제 및/또는 메탈로프로네이나제, 산 프로테아제, 및 티올 프로테아제 각각의 억제제와 같은 프로테아제 억제제와의 조합을 사용하여 촉진된다.

Description

피부 상처의 치료를 위한 프로테아제 억제제의 용도{USE OF PROTEASE INHIBITORS FOR TREATING SKIN WOUNDS}

따라서, 만성 궤양과 같은 만성적인 상처의 치료를 위한 개선된 방법이 매우 바람직하다는 것이 명백하다. 특히, 신규 방법은 만성적인 상처의 치료를 촉진하기 위해 필요하다.

앞선 연구는 프로테아제 활성이 만성적인 상처로 인해 증가된다는 것을 증명했다. Palolahti et al., Exp. Derm., 2:29(1993) and Wysocki et al., J. Invest. Dermatol. 101:64(1993) 참조. 본 발명자들은 프로테아제 활성의 억제가 그러한 만성적인 상처의 치료에 사용될수 있다는 것을 밝혔다.

피부는 감염에 대한 방어의 신체 제 일선으로서 작용한다. 따라서, 피부의 병소 또는 상처는 감염을 방지하기 위해 빨리 덮여져야 한다. 그러나, 어떤 종류의 상처는 정상적인 생리 조건 하에서 치료에 대한 저항력을 가진다. 예를 들어, 만성 궤양이 치료에 실패한 상처로 정의될수 있다. 그러한 궤양은 보통 당뇨병과 같은 합병증 또는 만성 정맥 기능부전을 일으키는 다른 병리학적인 문제를 가진다. 그러한 궤양의 치료 방법은 최근 상당한 주목을 받고있다. 예를 들어, 각각의 공보가 본원에 참고자료로서 포함된, U.S. 특허 No. 5,693,332(케라티노시트 사용), No. 5,646,117(단구 화학주성 및 활성 요소, MCAF 사용), No. 5,202,118(IL-1 사용), 및 No. 5,599,788(H3 단백질 사용) 참조.

도 1은 3 시간에 걸친 상처 체액에서의 PAI-2의 안정성을 나타낸다. 인간의 산화된 PAI-2는 상처 체액에서 200IU/㎖로 인큐베이트되었다(1/10 희석). 잔여 PAI-2 활성이 나타낸 시간에서 효소분광 검정에 의해 측정되었다.

도 2는 여러 시간 간격으로 위약(다이아몬드) 또는 PAI-2(사각)를 받은 환자의 궤양 면적(cm²)을 나타낸다.

도 3은 PAI-2가 투여된 최초의 하루 동안 환자의 상처 체액에서의 구체적인 uPA 활성을 나타낸다.

도 4는 Tween 80의 존재 하에서 셀룰로스 겔로부터의 증강된 PAI-2 방출을 나타낸다.

(바람직한 구체예의 상세한 설명)

본 발명은 세린 프로테아제 억제제를 상처 또는 궤양의 표면에 국소적으로 사용하는 것에 기초한, 만성 종아리 궤양 및 다른 상처의 치료를 촉진하는 방법 및 조성물을 제공한다. 당업자는 본원에 설명된 바와 같은 궤양의 치료 방법이 또한 다른 피부 상처의 치료에도 사용될수 있다는 것을 알고있다. 바람직한 구체예로서, 유로키나제 플라즈미노겐 활성제(u-PA) 억제제가 국소 제제로서 제공된다.

본 발명은 또한 종아리 궤양의 치료를 위한 다른 프로테아제 억제제와 함께 프로테아제 억제제를 포함하는 조성물, 및 궤양 치료 방법을 포함한다. 따라서, 개선된 상처의 치료를 제공하기 위해 프로테아제 억제제가 하나 이상의 다른 프로테아제 억제제와 함께 사용된 방법 및 조성물이 궤양 및 다른 상처의 치료를 위해 제공된다.

바람직한 구체예로서, 플라즈미노겐 활성제 억제제 2(PAI-2)는 국소 제제이다. PAI-2의 성질이 본원에 참고자료로서 포함되어 있는 Kruithof et al., "Biological and Clinical Aspects of Plasminogen Activator Type Ⅱ, "Blood 86:4007(1995)에 상세하게 설명되어 있다. 간단히, PAI-2는 플라즈미노겐 활성제 (PA) 시스템의 성분이다. PA 시스템은 조직 개형, 세포 이동, 상처 치료, 및 맥관 형성과 같은 광범위한 종류의 생리적인 과정의 세포외 단백질 가수분해의 조절을 포함하는 수많은 기능을 가진다.

플라즈미노겐 활성제(PA)는 섬유소의 퇴화를 가져올 뿐아니라, 세포외 매트릭스의 퇴화 및 교체에 기여하는 트립신-모양 세린 프로테아제로서, 플라즈미노겐을 섬유소 용해 효소로 전화시키는 세린 프로테아제이다. 섬유소 용해 효소는 염증 부위에 국소적으로 형성될수 있으며, 그것의 비활성 전구체, 플라즈미노겐의 제한된 단백질 가수분해에 의해 회복될수 있고, 이것은 혈장 및 간질성 체액에서 순환한다. 플라즈미노겐은 유로키나제-형 플라즈미노겐 활성제(u-PA) 또는 조직-형 플라즈미노겐 활성제(t-PA)에 의해 활성화된다. 이들 촉매 반응은 일반적으로 혈장 맴브레인(u-PA) 또는 섬유소 표면(t-PA)에서 일어난다. 이들 활성 효소는 여러 세포분열 및 성장 인자에 반응하여 넓은 범위의 간엽, 상피 및 상피외 세포에 의해 생성된다. 활성화된 섬유소 용해 효소은 세포외 매트릭스 거대분자(콜라겐 제외) 및 섬유소를 포함하는 넓은 범위의 기질을 퇴화시킬수 있다. 섬유소 용해 효소 및 그것의 활성 프로테이나제의 활성도는 PAI-2 및 플라즈미노겐 활성제 억제제-1(PAI-1)을 포함하는 다수의 프로테아제 억제제를 통해 세포외적으로 조절된다.

본 발명자들은 PAI-2와 같은 세린 프로테아제 억제제의 범주로부터 선택되는 화합물의 국소 투여가 대조 표준과 비교하여 종아리 궤양 영역의 상당한 감소를 가져온다는 것을 밝혔다. 당업자는 이러한 방법에서, PAI-2 또는 다른 세린 프로테아제 억제제의 사용이 종아리 궤양의 치료에만 제한되는 것이 아니며, 일반적인 상처의 치료 및 특히 만성적인 피부 상처 또는 병소의 치료에까지 확대된다는 것을 알고있다. 그러한 상처의 예는 외과적인 상처 또는 외상, 찰과상, 피부 열상, 물집, 압박 궤양, 당뇨성 궤양, 정맥 궤양, 동맥 궤양, 혼합 궤양, 및 화상을 포함한다.

본 발명의 한 양태로서, 세린 프로테아제 억제제 PAI-2가 사용된다. 실질적으로 PAI-2의 아미노산 서열을 가지고 플라즈미노겐 활성제를 억제하는 PAI-2의 변이체가 또한 본 발명에 따르는 상처 치료 제제에 효과적인 성분으로서 사용될수 있다. 즉, "PAI-2 변이체"는 PAI-2의 특성적인 억제성 활성을 잃지 않는 범위에서, PAI-2 아미노산 서열의 잔기가 자연적으로 또는 인공적으로 결실, 부가 또는 치환된, 실질적으로 PAI-2의 아미노산 서열을 가지는 단백질이다. 이 점에 대해서, 당해 기술분야에 잘 알려진 PAI-2 활성도 검정이 추정된 변이체의 스크리닝에 쉽게 사용될수 있다.

따라서, 이와 관련하여, 작용받은 폴리펩티드가 치료에 비효과적이 될 정도로 활성을 감소시키지 않는 한, 보존, 반-보존, 및 다른 아미노산 치환이 본 발명에 의해 고려된다. 자연적으로 발생하는 재조합 PAI-2의 N-말단 및 C-말단 영역의 서열은 생성 조건에 따라 -다수의 아미노산 잔기의 증가 또는 감소를 일으키는- 변할수 있다. 이들 변화는 명확하게 본 발명의 범위 이내에 있다. 당업자는 PAI-2의 특성적인 프로테아제 억제 성질을 유지하는, 다른 PAI-2의 활성 변이체가 또한 본 발명에 사용될수 있다는 것을 알고있다.

또한 본 발명에 따라, 활성 성분으로서 적합한 것은 화학적 또는 생화학적으로 변형된 PAI-2 또는 PAI-2에 의해 생성될수 있는 유도체이다. 그러한 유도체의 예는 (A) 화학적으로 결합된 폴리에틸렌 글리콜 또는 그것의 유사체, (B) 포스페이트 또는 술페이트기의 부착, (C) 엔도펩티다제와 같은 펩티다제 처리, 및 (D) 당 사슬-변형 효소 또는 샬리다제(sialidase)와 같은 당-사슬 부착 효소 처리에 의해 얻어진 화합물이다. 이러한 방법으로 제조된 유도체는 당해 기술분야에 잘 알려진 방법에 의해 프로테아제 억제제 활성이 검정될수 있다. 예를 들어, Fersht, ENZYME STRUCTURE AND MECHANISM, 2d ed. W.H.Freeman and Co., 1985 및 본원 참고자료 참조.

본원에 설명된 PAI-2 또는 PAI-2 변이체 및 유도체와 같은 프로테아제 억제제(본원에서 집합적으로 "PAI-2"로 나타냄)는 어떤 적합한 치료상으로 허용되는 부형제, 예를 들어 포스페이트-완충 살린(PBS) 용액으로 환자에게 국소 투여될수 있다. 다른 부형제가 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition, Mack Publishing Company, Easton, PA (1990)에 설명되어 있다.

프로테아제 억제제는 매일, 또는 필요에 따라 더 빈번하게 또는 덜 빈번하게 상처에 사용될수 있다. 당업자는 특수 사용을 위한 최적의 투약법이 예를 들어 REMINGTON'S에 설명된 바와 같이, 당해 기술분야에 잘 알려져 있다는 것을 알고있다. 양이 변할수 있다는 것을 알고 있지만, 억제제의 전형적인 일일 용량은 상처 또는 궤양 cm²당 20㎍ 이며, 0.1-2000㎍/cm²농도가 유리하게 사용될수 있다. 예를 들어, 장기간의 궤양(일 년 이상)은 500㎍/cm²농도로, 예를 들어 매일 2, 3, 또는 4 회와 같이 하루 당 여러 회 사용될 필요가 있을수 있다. 단기간의 궤양, 또는 고 용량에 잘 반응하는 궤양에 대하여, 용량은 낮아질수 있다. 예를 들어, 프로테아제 억제제 용량은 예를 들어 100, 10, 1, 또는 0.1㎍/cm²로 실질적으로 낮아질수 있다. 여기에 더하여, 억제제의 사용이 매일 4-1 회와 같이, 덜 빈번하게 될수 있다. PAI-2는 전신성(systemic) 독성이 나타나지 않았으며, 따라서 필요한 경우 고 용량이 사용될수도 있다. 필요한 경우, PAI-2의 전신성 농도가 ELISA 시험을 사용하여 측정될수 있고, 따라서 PAI-2의 용량이 조절될수 있다. 다른 적합한 억제제의 독성 및 전신성 농도가 당업자들에게 알려진 방법에 의해 측정될수 있다.

환자에게 사용하기 위해 사용되는 부형제의 억제제 농도는 유리하게는 약 1mg/㎖ 이고, 필요한 경우 더 높거나 더 낮은 농도가 사용될수도 있다. 예를 들어 약 0.1mg 정도로 낮거나, 또는 부형제의 억제제 용해도 한계 정도로 높은 농도가 사용될수 있다.

억제제는 단기간 또는 장기간 사용에 의해 사용될수 있다. PBS와 같은 부형제가 억제제의 단기간 사용에 적합하다. 장기간 사용에 대하여, 느린 방출 부형제의 사용이 바람직하다. 예를 들면, 겔 제조물이 억제제의 효과적인 방출을 위해 사용될수 있다. 셀룰로스 유도체가 EGF, TGF-α, PDGF 및 FGF와 같은 어떤 단백질을 가지는 겔 제조물과 양립된다는 것이 이전에 설명되었다. 그러나, 이들 제조물의 단백질은 시간에 따라 응집하려는 경향이 있으며, 이는 본 발명의 사용에 해롭다. 응집은 겔의 유백광 또는 혼탁도로 나타나며, 응집체의 증가된 크기에 기인하는 활성 단백질 성분의 낮은 활성도, 및 겔로부터 느린 단백질 방출을 초래한다.

본 발명자들은 억제제/셀룰로스 중합체 겔에 소량(0.05% 까지, 및 포함하는)의 세정제를 첨가함으로서 응집 문제를 극복했다. 이것은 실질적으로 개선된 투명함을 가지는 겔을 가져온다. 이러한 겔의 이점을 아래의 실시예 3에서 더 상세히 나타냈다. Tween 80 또는 Genapol PF10과 같은 세정제가 사용될수 있다. 당업자는 다른 세정제가 또한 성공적으로 사용될수 있다는 것을 알고있다.

예상외로, 본 발명자들은 겔의 응집 감소에 더하여, 0.02% Tween 80의 사용이 억제제/Natrosol-함유 겔로부터 증강된 억제제 방출을 가져온다는 것을 밝혔다. 이들 실험을 아래의 실시예 3에 설명했다.

상처 체액의 프로테아제의 활성에 대한 여러 프로테아제 억제제의 효과가 연구되었다. 이들 데이타를 아래의 실시예 3에 더 상세히 설명했다.

본 발명자들은 세린 프로테아제 억제제만이, 특히 uPA 억제제가 상처 체액에서 높은 수준으로 프로테아제를 억제할수 있다는 것을 밝혔다. 이러한 수준의 억제를 달성하기 위해, 최소한 하나의 세린 프로테아제 억제제의 존재가 필요하다.

또한, 억제제가 상처의 치료를 촉진하는데 효과적이도록 상처 체액에서 안정해야 한다는 것이 명백하다. 본 발명과 관련하여, 억제제가 3 시간 동안 상처 체액에 노출된후, 그것의 활성의 최소한 50%를 유지하는 경우, 적합하게 안정하다. 따라서, 이 점에 대해서는, uPA를 억제하고 상처 체액에서 안정한 억제제를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같이, 상처 체액에 PAI-2 첨가는 uPA 활성 억제를 일으키고, 또한 PAI-2는 상처 체액에서 비교적 안정하다는 것이 관찰되었다.

이와 반대로, 메탈로프로테아제, 산 프로테아제 또는 티올 프로테아제의 억제제는, 단독으로 사용되는 경우, 매우 낮은 양의 억제를 준다. 예를 들어, 아래의 실시예 2 데이타 참조. 그러나 본 발명자들은 하나의 억제제의 효능이 다른 억제제의 사용에 의해 증강될수 있다는 것을 밝였다. 이들 억제제의 조합은 예를 들어 프로테아제 활성의 97% 까지 억제되는 매우 높은 수준의 억제를 달성할수 있다. 예를 들어, 본 발명자들은 PAI-2의 효능이 PAI-2와 함께 다른 프로테아제 억제제를 사용함에 의해 증강될 수 있다는 것을 밝혔다.

한 구체예로서, PAI-2는 최소한 하나의 다른 프로테아제 억제제와 함께 사용된다. 예를 들어, PAI-2는 아밀로리드, 또는 그것들의 유도체와 같은 다른 세린 프로테아제 억제제와 함께 사용될수 있다.

다른 구체예로서, PAI-2는 최소한 하나의 메탈로프로테이나제, 산 프로테아제 및/또는 티올 프로테아제 억제제와 함께 사용된다. 예를 들어, PAI-2는 하나 이상의 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA), 펩스타틴, 및 N-에틸 말레이미드(NEM)와 함께 사용될수 있다.

또 다른 구체예로서, PAI-2는 최소한 하나의 다른 프로테아제 억제제 및 최소한 하나의 다른 메탈로프로테이나제, 산 프로테아제 및/또는 티올 프로테아제 억제제와 함께 사용된다.

세린 및 티올 프로테아제, 및 산 프로테아제 및 메탈로프로테아제 억제제는 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN), Promega(Madison, WI), Calbilchem(La Jolla, CA) 및 Life Technologies(Rockville, MD)로부터 많은 것들이 상업적으로 입수가능하다. 다른 억제제가 잘 알려진 효소학 텍스트, 예를 들어 Fersht, ENZYME STRUCTURE AND MECHAMISM, 2d ed. W.H.Freeman and Co., 1985 및 본원의 참고자료에 설명되어 있다.

프로테아제 억제제는 PAI-2 처리 전 또는 후, 또는 함께 사용될수 있다. 억제제는 또한 PAI-2 보다 더 빈번하게 또는 덜 빈번하게 사용될수 있다. 특히, 더 빠르게 퇴화되는 억제제는 더 안정한 억제제 보다 더 빈번하게 사용될수 있다. 반대로, 더 안정한 억제제는 덜 빈번하게 사용될수 있다. 당업자는 억제제 안정성의 바른 검정이 억제제 투여의 빈도수를 표준화하는데 사용될수 있다는 것을 알고있다.

유리하게도, 효능을 위해 필수적이지는 않지만, 프로테아제 억제제는 PAI-2와 동일한 부형제를 사용할수 있다. 특히, 억제제는 상기 설명된 바와 같은, PAI-2에 사용될수 있는 동일한 겔 부형제를 사용할수 있다. 만약 억제제가 PAI-2와 동일한 부형제를 사용하지 않는다면, 예를 들어 REMINGTON'S에 설명된 바와 같은, 어떤 제약학적으로 허용되는 부형제를 사용할수 있다.

일반적으로 설명된 본 발명은 다음의 실시예와 관련하여 보다 쉽게 이해될 것이며, 이는 본 발명의 범위를 제한하지 않는 설명으로 제공된다.

따라서, 본 발명은 개선된 상처의 치료 방법의 제공을 목적으로 한다.

더 이상으로, 본 발명은 상처의 치료 방법에 사용하기 위한 제약학적 조성물의 제공을 목적으로 한다.

이들 목적의 달성에 있어서, 본 발명의 한 양태에 따라, 상처에 국소 투여되고, 세린 프로테아제 억제제를 포함하는 치료제의 효과적인 양을 상처의 치료를 필요로하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 상처의 치료 방법이 제공된다. 한 구체예로서, 치료제는 유로키나제 억제제를 포함한다. 다른 구체예로서, 치료제는 플라즈미노겐 활성제 억제제 2(PAI-2), 플라즈미노겐 활성 억제성을 가지는 그것들의 변이체, PAI-2의 유도체, 및 PAI-2 유도체의 변이체로 구성되는 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예로서, 세린 프로테아제 억제제는 겔 제조물로서 투여된다. 겔은 세정제를 더 포함하는 셀룰로스 겔일수 있다. 세정제는 Tween-80 일수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따라, 상처에 국소 투여되고, PAI-2, 변이체, 유도체, 또는 PAI-2 유도체의 변이체, 및 최소한 하나의 다른 세린 프로테아제 억제제를 포함하는 치료제의 효과적인 양을 상처의 치료를 필요로하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 상처의 치료 방법이 제공된다. 한 구체예로서, 다른 세린 프로테아제 억제제는 uPA 억제제이다. 다른 구체예로서, 치료제는 티올 프로테아제 억제제, 산 프로테아제 억제제, 및 메탈로프로테이나제 억제제로 구성되는 군으로부터 선택되는 프로테아제 억제제를 더 포함한다. 또 다른 구체예로서, 프로테아제 억제제는 PAI-2, 또는 변이체, 유도체, 또는 PAI-2 유도체의 변이체와 함께 투여된다. 더 이상의 구체예로서, PAI-2 또는 변이체, 유도체, 또는 PAI-2 변이체의 유도체는 상처에 0.1-2000㎍/cm²의 범위로 투여된다. 다른 구체예로서, PAI-2 또는 변이체, 유도체, 또는 PAI-2 유도체의 변이체는 최소한 5 일 동안 최소한 하루 한번 투여된다.

더 이상의 구체예로서, PAI-2의 유도체는 폴리에틸렌 글리콜과의 화학적 결합, 포스페이트기 부착, 술페이트기 부착, 펩티다제 처리, 당 사슬-변형 효소 처리, 및 당 부착 효소 처리로 구성되는 군으로부터 선택되는 PAI-2의 생화학적 변형에 의해 얻어진다. 또 다른 구체예로서, PAI-2의 변이체는 PAI-2의 아미노 말단으로부터 아미노산 잔기의 결실 또는 부가에 의해 얻어진다. 변이체는 PAI-2의 카르복시 말단으로부터 아미노산 잔기의 결실 또는 부가에 의해 얻어질수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따라, 세정제를 함유하는 겔로서, PAI-2 또는 PAI-2 유도체, 변이체 또는 유도체의 변이체를 포함하는 제약학적 조성물이 제공된다. 한 구체예로서, 세정제는 Tween 80 이고, 겔은 셀룰로스 겔이다.

본 발명의 다른 양태에 따라, PAI-2 및 최소한 하나의 다른 세린 프로테아제 억제제를 포함하는 제약학적 조성물이 제공된다. 제약학적 조성물은 티올 프로테아제 억제제, 산 프로테아제 억제제, 및 메탈로프로테이나제 억제제로 구성되는 군으로부터 선택되는 프로테아제 억제제를 더 포함할수 있다. 다른 구체예로서, 조성물은 세정제를 포함하는 셀룰로스 겔의 형태로 존재한다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점이 다음의 상세한 설명으로부터 명백하게 될 것이다. 그러나, 본 발명의 정신 및 범위 이내의 여러가지 변화 및 변형이 상세한 설명으로부터 당업자들에게 명백하게 될 것이므로, 본 발명의 특정한 구체예를 나타내는 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 단지 실례로서 주어진다는 것이 이해되어야 한다.

실시예 1: 만성 정맥 종아리 궤양의 치료를 위한 PAI-2의 사용

설계: 본 연구는 이중 블라인드 위약 조절된 무작위추출 실험이었다. 층화 무작위화를 궤양 크기에 따라 행했다. 20cm²보다 적은 그리고 20cm²보다 큰 궤양을 가지는 환자를 분리하여 무작위 추출했다. 최소 또는 최대 횟수는 환자의 현재 궤양 에피소드(episode)를 위해 조정하지 않았다. 최소 및 최대 궤양 면적은 2cm²및 50cm²이었고, 봉입(inclusion)에 대한 환자의 정지 발목 상완의 동맥압 지수는 0.80 보다 크거나 또는 같았다.

모든 환자는 압박 붕대를 받았다. 궤양 면적을 추적법(tracing)으로 측정하고, 포스페이트 완충 살린, pH 7.0 중 1.0 mg/㎖ PAI-2, 또는 완충액만의 시험 용액을 cm²당 20㎕(PAI-2의 경우 20㎍)로 사용했다. 시험 용액을 상처 표면에 사용하는 동안 환자를 실험 침상에 눕히고, 붕대를 사용하기 전 15 분 동안 침상에 있게했다.

시험 용액을 연속하여 5일 동안 같은 방법으로 사용했다. 다음에 15, 22, 및 29 일에 왕진했다(visit). 궤양 면적 측정을 1, 5, 15, 22 및 29 일에 행했고, 궤양 부피를 1, 5 및 29 일에 구조 광선 평가에 의해 측정했고, 사진찍었다. 수반되는 약물 치료에 따르는, 부작용(adverse event)을 각 왕진 때 평가했다.

여기에 더하여, 시험 용액을 첨가하기 전의 첫날에, 그리고 2 시간, 4 시간, 및 6 시간 후에 상체 체액을 수집했다. 상처 체액 수집을 또한 2, 3, 4, 및 5 일(시험 용액 첨가 전) 및 29 일에 행했다. 혈액 샘플을 시험 용액 적용 후 첫날, 0(전), 0.5 시간, 1 시간, 및 2 시간에서 취했다. 펀치생검을 5 일에 궤양 가장자리의 조직화학 실험을 위해 행했다.

모든 상처 체액 샘플을 Chromolise 검정에 의한 uPA 활성 및 Bradford 검정에 의한 총 단백질에 대해 분석했다. 충분한 상처 체액을 이용할수 있는 경우, 앞선 순서대로 다음의 검정을 또한 수행했다: (ⅰ) PAI-2 항원 수준, ELISA에 의해; (ⅱ) 완전한, 복합된, 또는 단편으로의 PAI-2 분자인지를 측정하기 위한 Western 블롯; (ⅲ) 총 프로테아제 활성, 기질로서 아조-카세인을 사용하는 색소 검정에 의해 측정, 그리고 (ⅳ) EDTA(차단 메탈로프로테아제) 또는 아프로티닌(차단 섬유소 용해 효소)의 존재 하의 총 프로테아제 활성. 여기에 더하여, 혈액 샘플을 PAI-2 ELISA(1 일에 0, 0.5, 1, 2 시간)에 의해 분석했고, 1 일(0) 및 5 일에 FBC 및 임상 화학을 위해 분석했다.

비활성 단일 사슬 uPA가 검정에서 섬유소 용해 효소의 첨가에 의해 활성 2-사슬 uPA로 전화되기 때문에, 총 uPA를 측정하기 위한 Chromolise uPA 검정(BioPool Diagnostic kits, Dade International)을 활성 2-사슬 uPA 및 비활성 단일 사슬 uPA 모두에 대해 사용했다. PAI-2에 대해 사용된 ELISA는 글리코실화 및 비-글리코실화 PAI-2, 및 복합(uPA 또는 tPA와) 및 비복합 PAI-2 모두를 검출했다. 불충분한 상처 체액이 아프로티닌 또는 EDTA의 존재 하의 총 프로테아제 검정을 위해 얻어졌다. 구조 광선 평가에 의한 궤양 부피 측정의 편차는 매우 컸다: 반복된 측정에서 20.4%. 따라서 이들 데이타는 궤양 부피의 작은 변화를 판단하는데 사용할수 없었다.

결과: 20 명의 환자에 대한 전체 실험의 소견설명서를 완성했고, 한 환자에 대해서는 계획표의 처음 반을 완성했다. 종합적으로, PAI-2 군에서 12 명의 환자를 그리고 위약 군에서 9 명의 환자를 무작위 추출했다. 비완성된 환자는 PAI-2 군에 있었고, 이들 데이타를 1-5 일에 걸친 uPA 분석에 포함시켰지만, 완전한 소견설명서에 관한 모든 다른 요소의 분석으로부터는 제외시켰다. 본 연구의 전체 과정을 통해서, 23 명에게서 부작용이 관찰됐고, 이들 중 3 명은 심각하게 고려됐다. 그러나 부작용 중 아무것도 PAI-2 치료에 관련됐다고 생각되지 않았다. 따라서, PAI-2는 만성 종아리 궤양에 국소적으로 사용하기에 안전한 것으로 나타났다.

위약 군이 더 큰 초기 궤양 크기를 가졌다는 것을 제외하고는, 두 군의 환자들의 나이, 성별, 궤양 기간 및 궤양 부피는 비슷했다.

두 군의 궤양 크기를 편차에 대한 반복 측정 분석을 사용한 본 연구의 29-일 과정에 따라 비교한 경우, 위약 군은 변화를 나타내지 않은 반면, PAI-2 군은 궤양 면적의 감소가 관찰됐다. 데이타를 아래의 표에 나타냈다.

도 2는 두 군의 환자들의 궤양의 중간 면적을 나타낸다.

처음 왕진 때, 0, 2, 4, 및 6 시간에서 취한 대부분의 환자의 상처 체액 샘플에서 PAI-2가 측정되었다. PAI-2의 수준은 약을 받은 이들 환자에게서 2 시간까지 극적으로 증가했고, 4 시간까지 거의 베이스라인으로 감소했다. 이들 샘플의 Western 블롯 분석은 2 시간까지 상당한 양의 완전한 PAI-2의 존재를 나타냈고, 이것은 PAI-2가 이 때까지 퇴화되지 않았다는 것을 나타낸다. 결론적으로, 대부분의 PAI-2는 2 시간까지는 죽지 않으며, 이후, 아마도 궤양에 흡수된다고 생각된다. 국소적으로 사용되는 PAI-2의 전신성 분포에 대한 증거는 발견되지 않았다.

uPA(상처 체액의 총 단백질 ng/mg)의 특이 활성은 위약 군과 비교하여, PAI-2를 투여한 첫날에 6 시간에 걸쳐 감소했다(도 3 참조). 그러나, 본 연구의 과정에 따르는 그후에는, 두 군 사이의 uPA 활성에 주목할만한 차이는 없었다. 이는 PAI-2에 의한 억제 후에 uPA 합성의 "반동현상"을 나타낸다.

두 군 사이의 uPA 차이는 총 단백질 mg 당 보다는, 상처 체액의 물 함량의 차이를 나타내는 상처 체액의 유니트/㎖로 표현하는 경우에 명백하지 않았다. 이것은 PAI-2 단백질 첨가의 결과는 아니며, 총 단백질 수준에 대한 주목할만한 효과를 가지지도 않았다. 평균적으로, PAI-2 100㎍을 5cm²의 궤양에 가했고, 상처 체액의 단백질 함량은 대략 30mg/㎖ 었다. 대규모 연구 집단에 대한 통계적인 평가가 이 사실을 확인하는데 사용되었지만, 상처 체액이 ng/㎖ 또는 ng/mg 단백질로서 측정되는 경우, 총 프로테아제 활성에 PAI-2의 첨가에 의한 변화는 나타나지 않았다.

조직학적 실험을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고, 5 일 후의 왕진에서 취해 생검을 수행했다. PAI-2의 국소적 사용으로부터 조직 손상의 증거는 관찰되지 않았고, 두 군 사이의 조직병리학적인 설명에 대한 매우 적은 차이만이 있었다. PAI-2로 처리된 환자로부터의 생검에 있어서 혈관 유섬유소 괴사의 다소 감소된 발생빈도가 관찰됐다. 이러한 효과는 궤양에 유리할것 같다.

실시예 2: 상처 체액의 프로테아제 활성 억제

상처 체액을 만성 정맥 종아리 궤양을 가지는 환자로부터 수집했고, 프로테아제 기질 ZGGRAMC와 함께 각 억제제의 존재 하에서 또는 억제제 없이 생체외 인큐베이트했다. 이 기질의 분할은 프로테아제 활성을 나타냈고, 이것를 460nm의 형광에 의해 검출했다. 형광의 부족은 프로테아제 활성 억제를 나타낸다.

실시예 3: PAI-2-함유 겔의 제조 및 PAI-2 방출 측정

이 실험에서, PAI-2 함유 겔을 두 개로 나누어진 용기의 상부 챔버에 두었다. 아래 챔버는 완충액을 함유하고, 두 개의 챔버는 미공성 맴브레인에 의해 분리되었다. 하부 챔버에 PAI-2의 출현은 겔로부터 PAI-2의 방출을 나타내며, PAI-2 활성 검정에 의해 모니터했다.

아래의 표는 신규 PAI-2 겔 제조물의 개선된 성질을 나타낸다. 겔로부터 증강된 PAI-2 방출을 도 4에 나타냈다.

방법:

중합체를 바람직한 농도로 용해했고, 다음에 pH 7.4-7.7로 적정했다. 세정제를 0.05%로 가하고 1mg/㎖로 PAI-2를 가했다. 나트륨 아지드(0.05%)를 방부제로 사용했다.

본 발명은 널리 개시되었고 상기 설명된 나타낸 구체예와 관련하여 설명되었다. 당업자들은 여러 변형이 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어남 없이 본 발명에 행해질수 있다는 것을 알고있다.

Claims (20)

1. 효과적인 양의 세린 프로테아제 억제제를 상처의 치료를 필요로하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 상처의 치료 방법으로서, 상기 세린 프로테아제 억제제를 상기 상처에 국소 투여하는 것을 특징으로 하는 상처의 치료 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 세린 프로테아제 억제제가 유로키나제 억제제인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 유로키나제 억제제가 PAI-2, 플라즈미노겐 활성 억제성을 가지는 그것의 변이체, PAI-2의 유도체, 및 상기 유도체의 변이체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 세린 프로테아제 억제제가 겔 제조물로서 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 겔이 세정제를 더 포함하는 셀룰로스 겔인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 세정제가 Tween 80 인 것을 특징으로 하는 방법.
7. PAI-2 및 최소한 하나의 다른 세린 프로테아제 억제제를 포함하는 효과적인 양의 치료제를 상처의 치료를 필요로하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 상처의 치료 방법으로서, 상기 치료제를 상기 상처에 국소 투여하는 것을 특징으로 하는 상처의 치료 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 다른 세린 프로테아제 억제제가 uPA 억제제인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 7 항에 있어서, 상기 치료제가 티올 프로테아제 억제제, 산 프로테아제 억제제, 및 메탈로프로테이나제 억제제로 구성된 군으로부터 선택되는 프로테아제 억제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 프로테아제 억제제가 PAI-2와 함께 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 세정제를 함유하는 겔로서 PAI-2를 포함하는 제약학적 조성물.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 세정제가 Tween 80, 그리고 상기 겔이 셀룰로스 겔인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
13. PAI-2 및 최소한 하나의 다른 세린 프로테아제 억제제를 포함하는 제약학적 조성물.
14. 제 13 항에 있어서, 티올 프로테아제 억제제, 산 프로테아제 억제제, 및 메탈로프로테이나제 억제제로 구성되는 군으로부터 선택되는 프로테아제 억제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
15. 제 13 항에 있어서, 상기 조성물이 세정제를 포함하는 셀룰로스겔의 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 3 항에 있어서, 상기 PAI-2를 상처에 0.1-2000㎍/cm²의 범위로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 16 항에 있어서, 상기 PAI-2를 최소한 5 일 동안 최소한 하루 한번 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 3 항에 있어서, 상기 유도체가 PAI-2의 생화학적 변형에 의해 얻어지고, 상기 변형이 폴리에틸렌 글리콜과의 화학적 결합, 포스페이트기 부착, 술페이트기 부착, 펩티다제 처리, 당 사슬-변형 효소 처리, 및 당 부착 효소 처리로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 3 항에 있어서, 상기 변이체가 PAI-2의 아미노 말단으로부터 아미노산 잔기의 결실 또는 부가에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 3 항에 있어서, 상기 변이체가 PAI-2의 카르복시 말단으로부터 아미노산 잔기의 결실 또는 부가에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.