JP2004532892A6

JP2004532892A6 - 傷治癒のための処置および組成物

Info

Publication number: JP2004532892A6
Application number: JP2003503264A
Authority: JP
Inventors: クリストファー・ジョン・ジャクソン; フィリップ・ニール・サンブルック
Original assignee: University of Sydney
Current assignee: University of Sydney
Priority date: 2001-06-13
Filing date: 2002-06-13
Publication date: 2009-12-24
Anticipated expiration: 2022-06-11

Abstract

被験者において傷治癒を増進するための方法および薬剤が開示されている。薬剤は、１つ以上の（ｉ）活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）、（ii）ＡＰＣの機能性断片、（iii）ＡＰＣ擬似化合物、および（ｉｖ）タンパク質Ｃ、を含む作用剤の有効量を含む。局所投与のための作用剤を含むゲル、スポンジ、ガーゼ、およびメッシュを含む送達システムも開示されている。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物の分野、より具体的には、傷治癒および傷治癒を増進するための方法および組成物に関する。本発明の具体的な適用において、活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）は、緩やかに治癒している傷に、例えば、局所適用によって投与される。
【背景技術】
【０００２】
傷は、構造の正常な連続性を分断する、機械的、化学的、ウィルス性、細菌性、もしくは熱的手段などの物理的手段により生じた生体内もしくは生体外の損傷もしくは傷害である。そのような生体の損傷は、打ち身、皮膚が無傷である傷、切り傷、皮膚が切断器具によって傷つけられている傷、裂傷、および皮膚が鈍いもしくは先の丸い器具によって傷つけられている傷を含む。傷は、事故または外科的処置によって生じるかもしれない。
【０００３】
傷の治癒は、多くの段階を含む複合過程である。これらは、１）損傷後、すぐに始まる凝固；２）２、３分後に始まる炎症；３）数時間から数日以内に始まる遊走および増殖過程（顆粒化段階）；および４）続いて十分な強度の皮膚に進展する再構築工程を含む（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。
【０００４】
凝固と炎症
凝固は、脱顆粒した血小板から様々な成長因子およびサイトカインを遊離することによって、止血を制御し、治癒を始める。炎症段階中では、血小板凝集および凝固により、血漿タンパク質および血液細胞を捕捉し、様々な型の細胞の流入を誘導する基質が形成される。好中球が、到達する最初の細胞であり、混入している細菌を食菌し、フィブリンクロットを消化し、そしてマクロファージを引き寄せ、繊維芽細胞とケラチン生成細胞を活性化するメディエーターを遊離する（非特許文献３）。マクロファージは、病原体を消化し、傷から異物を取り除き、そして、サイトカイン／成長因子（例えば、繊維芽細胞および内皮細胞を刺激するインターロイキン−１（ＩＬ−１）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−β）、および塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ））を分泌する。全体的に、炎症段階は、感染から守り、傷治癒の遊走および増殖段階を促進するのに重要である。
【０００５】
顆粒化と細胞外基質の再構築
これらの段階は、細胞の遊走と増殖を含む。リンパ球とマクロファージが関与するが、主な細胞の種類は、上皮細胞、繊維芽細胞、および内皮細胞である。損傷数時間内に、主にケラチン生成細胞から成る上皮被覆が、遊走を始め、表皮を覆い始める、再上皮化として知られる工程。それらが完全に傷を覆うと、それらは分化して、層を形成し、基底膜と共に新しい表皮を形成する。血管新生（すなわち、新しい血管の形成）が、この段階で生じ、残存するために発達している組織に栄養素を供給する。繊維芽細胞は、傷部位に遊走し、最終的に傷に抗張力を付与するコラーゲンとプロテオグリカンを生成する。再構築段階が進むにつれて、顆粒化組織が、瘢痕組織を形成するコラーゲンとエラスチン繊維の網状組織によって置換される。
【０００６】
不十分な傷治癒
皮膚の傷治癒の低下、および／または、皮膚潰瘍が、抹消動脈閉塞疾患、深部静脈血栓症、糖尿病、床ずれ、および、やけどの患者に生じる（非特許文献４）。徹底的な研究に関わらず、傷治癒の低下に関わる分子機序が、十分に理解されていない。
【０００７】
傷治癒は、局所因子（例えば、成長因子、浮腫、虚血、感染、動脈機能不全、静脈機能不全、または神経障害）、全身性因子（例えば、不十分な灌流および代謝疾患）、および、栄養摂取状態、放射線治療の照射、および喫煙などの他の種々雑多な因子を含む多数の因子に影響を及ぼされている。
【０００８】
白血球、特に好中球、およびマクロファージは、周囲の組織に存続し、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）類およびセリンプロテアーゼ類を含む広範囲のプロテアーゼ類を分泌する（非特許文献５）。これらの酵素の過度の蓄積は、基質の再構築を妨げる（非特許文献６）。プロテアーゼ類を阻害する作用剤は、傷治癒に役立つであろうと考えられる（非特許文献７）。いくつかの慢性的な傷の他の特徴は、血管新成の減少または欠如であり、それにより、栄養分が新たに形成された組織に到達するのが妨げられる（非特許文献８）。
【０００９】
傷治癒を増進する現在の技術
慢性的な傷は、最初に、乾燥痂皮の創面切除、適切な場合には抗生物質処置、および、通常の外傷用医薬材料等を用いた手当てを含む処置によって管理される（非特許文献２）。ヒドロゲル類、親水性コロイド類あるいはアルギナート類などの他の外傷用医薬材料も使用できる。静脈潰瘍は、加圧療法によって処置されるが、動脈あるいは糖尿病性の潰瘍は、外傷用医薬材料の通常の変更を必要とする。床ずれは、損傷部位での圧力の軽減によって治癒が促される。動脈性潰瘍のためのレーザー処置、高圧酸素および電気刺激など、いくつかの別の物理的装置も、傷治癒を促すために使用される（非特許文献２、非特許文献９、非特許文献１０）。
【００１０】
そのような介入に対して感受性の低い傷に対しては、ダーマグラフト（Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔ）またはアプリグラフト（Ａｐｌｉｇｒａｆ）などの組織工学で作られた皮膚の使用がオプションである。この治療は細菌感染を防止するように行なわれ、これにより傷が通常の修復過程によって治癒することが可能になる（非特許文献１１、非特許文献１２）。傷治癒を促進するためのそのような皮膚置換物の使用は、現存する傷における現存する血管供給の利用可能性に依存する。
【００１１】
傷治癒のための別のアプローチは、ｉｎｖｉｔｒｏで細胞増殖を促進すること、および／または、いくつかの動物モデルにおいて傷治癒を促進することが示されている成長因子／サイトカインの投与を含む。これらは、ＩＬ−１、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β、およびｂＦＧＦを含む（非特許文献２）。プロキュレン（Ｐｒｏｃｕｒｅｎ）（キューラティブ・テクノロジーズ（ＣｕｒａｔｉｖｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、自家血小板遊離物は、顆粒化組織の形成および再上皮化を促進する少なくとも５つの成長因子を含む。この自家成長因子の混合物は、潰瘍化した四肢の傷害を有するヒトの被験者において、幾らかの成功をもたらしている（非特許文献１３）。しかしながら、概して、成長因子／サイトカインを用いたほとんどの臨床試験の結果は期待外れのものである。例えば、ＥＧＦは静脈鬱帯潰瘍を治癒することができず、そして、ＩＬ−１は床ずれを効果的に治療することができなかった（非特許文献２）。同様の結果が、ｂＦＧＦを用いて報告されている（非特許文献１４）。有効性の欠如の理由は確かではないが、成長因子／サイトカインの多元的な効果、治癒にとって何らかの望ましくないもの、と関連しているかもしれない。
【非特許文献１】
Bello, Y.M. and T.J. Phillips. 2000. Recent advances in wound healing. JAMA 283:716-718.
【非特許文献２】
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【非特許文献３】
Hunt, T.K., H. Hopf, and Z. Hussain. 2000. Physiology of wound healing. Adv Skin Wound Care 13:6-11.
【非特許文献４】
Bello, Y.M. and T.J. Phillips. 2000. Therapeutic dressings. Adv Dermatol 16:253-271.
【非特許文献５】
Yager, D.R. and B.C. Nwomeh. 1999. The proteolytic environment of chronic wounds. Wound Repair Regen 7:433-441
【非特許文献６】
Trengove, N.J., M.C. Stacey, S.MacAuley, N. Bennett, J. Gibson, F. Burslem, G. Murphy, and G. Schultz. 1999. Analysis of the acute and chronic wound environments: the role of proteases and their inhibitors. Wound Repair Regen 7:442-452.
【非特許文献７】
Kahari, V.M. and U. Saarialhokere. 1997. Matrix metalloproteinases in skin. Experimental Dermatology 6:199-213.
【非特許文献８】
Singer, A.J. and R.A. Clark. 1999. Cutaneous wound healing. N Engl J Med 341:738-746.
【非特許文献９】
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【非特許文献１０】
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【非特許文献１１】
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【非特許文献１２】
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【非特許文献１３】
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【非特許文献１４】
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【非特許文献１５】
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【非特許文献１６】
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【非特許文献１７】
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【非特許文献１９】
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【非特許文献２０】
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【非特許文献２１】
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【非特許文献２２】
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【非特許文献２４】
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【非特許文献２５】
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【非特許文献２６】
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【非特許文献２７】
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【非特許文献２８】
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【非特許文献２９】
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【非特許文献３０】
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【非特許文献３１】
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【非特許文献３２】
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【非特許文献３３】
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【非特許文献３４】
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【非特許文献３６】
Maniatis, T.等、Molecular Cloning: a laboratory manual、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory出版社
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
このように、傷治癒の促進のための新たな作用剤を同定し、開発するための継続的な必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）は、生理的な抗凝血に中心的な役割を果たす約５６ｋＤの分子重量を持つセリンプロテアーゼである。不活性前駆物質、タンパク質Ｃ、は、肝臓と内皮細胞によって合成されたビタミンＫ依存糖蛋白であり、血漿中に認められる。タンパク質Ｃの活性化は内皮細胞の表面上で生じ、トロンビンとトロンボモジュリンの間で形成される複合体によって惹起される（非特許文献１５、非特許文献１６）。他の内皮細胞特異的膜タンパク質、内皮細胞タンパク質Ｃ受容体（ＥＰＣＲ）、は、この反応を１０００倍以上促進することが示されている（非特許文献１７）。内皮ＡＰＣは、内皮細胞表面上で、共同因子、タンパク質Ｓに結合し、凝固因子、因子ＶIIIａおよび因子Ｖａを不活性化させることによって、抗凝血剤として機能する。抗凝血剤としてのＡＰＣの重要性は、この分子の欠失により血栓症の家族性疾患に至ることが見出されたことに反映されている（非特許文献１８）。
【００１４】
最近、ＡＰＣが抗炎症剤として付加的に作用し、プロテアーゼ、ゼラチナーゼＡを直接活性化することも報告されている（非特許文献１７、非特許文献２０）。ゼラチナーゼＡは、平滑筋細胞、繊維芽細胞、および内皮細胞を含む多くの異なる細胞種によって分泌される。基底膜に存在するコラーゲンを分解し（非特許文献２１）、細胞が基質に浸潤することを許容することによって、ゼラチナーゼＡは、生理学的再構築および血管新生に重要な役割を果たす。また、ゼラチナーゼＡは、胸腺上皮腫瘍の浸潤を促進すること（非特許文献２３）、軟骨基質からコラーゲンを分離することによって関節炎における関節の破壊を促進すること（非特許文献２４）、および虚血後再灌流時の心臓の力学的機能傷害に寄与すること（非特許文献２５）など、多くの疾患において重要な役割を果たす。該基質を分解する性能に加えて、ゼラチナーゼＡは他の基質を標的にすることもできる。例えば、それは、大きなエンドセリン−１を分割して、強力な血管収縮物質を産出し、このことは、ゼラチナーゼＡが血管反応の調節因子であることを意味している（非特許文献２６）。また、ゼラチナーゼＡの遊離は、血小板凝集をもたらすこともできる（非特許文献２７）。
【００１５】
さらに、以後に提供される実施例において示されるように、ＡＰＣは、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、創傷後の内皮細胞の再生を促進すること、ニワトリの胚子において再上皮化、繊維芽細胞の浸潤、および血管新生を刺激すること、およびラット創傷モデルにおいて傷治癒を高めることもできる。これらの機能は、前記抗凝固性、抗炎症性、およびゼラチナーゼＡ活性化機能と共に考慮すると、ＡＰＣ、その機能性断片、およびＡＰＣの前駆体（すなわち、タンパク質Ｃ）が、傷の処置、特にゆっくりとした傷治癒に有用であることを、強く示している。
【００１６】
このように、第一の局面において、本発明は、被験者における傷治癒を促進するための方法であって、
（ｉ）ＡＰＣ、
（ii）ＡＰＣの機能性断片、
（iii）ＡＰＣ擬似化合物、および
（iv）タンパク質Ｃ、
の１つ以上を含む作用剤の有効量を、随意に、薬学的に許容可能な担体と混合して、前記被験者に投与することを含む方法を提供する。
【００１７】
第二の局面において、本発明は、被験者における傷治癒を促進するための薬剤であって、薬学的に許容可能な担体と混合した、
（ｉ）ＡＰＣ、
（ii）ＡＰＣの機能性断片、
（iii）ＡＰＣ擬似化合物、および
（iv）タンパク質Ｃ、
のうち１つ以上を含むある量の作用剤を含む薬剤を提供する。
【００１８】
第三の局面において、本発明は、
（ｉ）ＡＰＣ、
（ii）ＡＰＣの機能性断片、
（iii）ＡＰＣ擬似化合物、および
（iv）タンパク質Ｃ、
の１つ以上を含むある量の作用剤を組み込んだ送達システム（例えば、ゲル、スポンジ、ガーゼ、またはメッシュ）であって、傷への適用に適し、適用後、傷治癒を促進する送達システムを提供する。
【００１９】
第四の局面において、本発明は、
（ｉ）ＡＰＣ、
（ii）ＡＰＣの機能性断片、
（iii）ＡＰＣ擬似化合物、および
（iv）タンパク質Ｃ、
の１つ以上を含む作用剤の、被験者における傷治癒を促進するための薬剤を調製するための使用を提供する。
【００２０】
第五の局面において、本発明は、
（ｉ）ＡＰＣ、
（ii）ＡＰＣの機能性断片、
（iii）ＡＰＣ擬似化合物、および
（iv）タンパク質Ｃ、
の１つ以上を含む作用剤の、送達システムを調製するための使用であって、前記送達システムが傷への適用に適し、適用後、傷治癒を促進する使用を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明において使われるＡＰＣおよび／またはタンパク質Ｃは、適した供給源（例えば、ヒトまたは他の動物から採取した血液）からの精製によって得る、または、例えば、非特許文献３６に記載されているような標準的な組換えＤＮＡ技術によって生成することができる。組換えＡＰＣまたはタンパク質Ｃは、例えば、各タンパク質の生物学的活性または発現を増強するかもしれない修飾（例えば、アミノ酸置換、欠失、および異種アミノ酸配列の付加）を組み込んでいてもよい。しかしながら、好ましくは、本発明は、ヒトＡＰＣおよび／またはタンパク質Ｃを使う。また、ＡＰＣおよび／またはタンパク質Ｃは、当該分野においてよく知られ、酵素または非酵素手段を含むことができる方法によって、グリコシル化されていてもよい。
【００２２】
ＡＰＣの適した機能性断片は、精製された天然ＡＰＣまたは組換えＡＰＣを、トリプシンなどのよく知られたプロテアーゼその他同種類のもので切断することによって、あるいは、より好ましくは、組換えＤＮＡ技術またはペプチド／ポリペプチド合成によって、生成することができる。そのような機能性断片は、候補断片を作製し、例えば、ここに提供された実施例において記載された方法と同様の方法で、ニワトリ胚子の漿尿膜（ＣＡＭ）におけるＭＭＰ−２の活性、傷つけられた内皮単層細胞の修復の促進、および／または、血管新生について、アッセイすることにより、生物学的活性を評価することによって、同定することができる。好ましくは、機能性断片は、５から１００アミノ酸長、より好ましくは１０から３０アミノ酸長であるであろう。機能性断片は、直鎖状または環状であることができ、それらが由来する天然ＡＰＣ配列のアミノ酸配列の修飾（例えば、アミノ酸置換、欠失、および異種アミノ酸配列の付加）を含むことができる。機能性断片は、当該分野においてよく知られ、酵素または非酵素手段を含むことができる方法によって、グリコシル化されていてもよい。
【００２３】
適したＡＰＣ擬似化合物（すなわち、ＡＰＣの機能をまねた化合物）は、第二および第三の構造の情報が無い状態で、ペプチド配列に基づいてペプチドの擬似物を設計するために当該分野においてよく知られた任意の方法を用いて設計されることができる（非特許文献２８）。例えば、ペプチド擬似化合物は、限定された領域のペプチドの疎水性を増すために、アミノ酸側鎖を修飾する（例えば、ペプチドの芳香族残基における水素をメチル基で置換する）、アミノ酸側鎖を非アミノ酸側鎖に置換する（例えば、ペプチドの芳香族残基を他のアリール基に置換する）、および、アミノ−および／またはカルボキシ−末端を様々な置換基で置換する（例えば、疎水性を増すために、脂肪族基を置換する）ことによって生成することができる。あるいは、擬似化合物は、ペプチド基幹の修飾（すなわち、例えば、基幹における窒素原子を炭素原子に置換することによって、アミド結合の代わりを導入することによる）を含む、または、Ｎ−置換化グリシン残基、１つ以上のＤ−アミノ酸（Ｌ−アミノ酸に代わって）、および／または、１つ以上のα−アミノ酸（β−アミノ酸またはγ−アミノ酸に代わって）含む、いわゆるペプトイド類（すなわち、非ペプチド類）であることができる。さらに、擬似化合物の代替物は、ペプチド結合が逆方向であり、基づくペプチド配列においてＤ−アミノ酸がＬ−アミノ酸の順序と逆の順序で会合している「レトロインベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）ペプチド類」、および、ステロイド類、糖類、ベンズアゼパイン１，３，４−三置換化ピロリジノン、ピリドン類、およびピリドピラジン類などの他の非ペプチド骨格を含む。適切な擬似化合物は、天然生成物のスクリーニング、ファージ呈示ライブラリーの生成（非特許文献２９）、最小化タンパク質（非特許文献３０）、ＳＥＬＥＸ（アプタマー（Ａｐｔａｍｅｒ））選択（３１）、コンビナトリアルライブラリー、および、集束されたコンビナトリアルライブラリー、仮想スクリーニング／データベース検索（非特許文献３２）、及び当該分野でよく知られた理論的ドラッグデザイン技術（非特許文献３３）による構造上のモデリング／測定によって、設計され／同定されることもできる。
【００２４】
本発明は、一般的に傷治癒を促進するのに適しているが、緩やかに治癒する傷、そうでなければ「慢性的な傷」、「治癒が弱められた傷」、または「潰瘍」として知られている傷の促進に適用することに特に適しており、そして、上述された任意の傷のタイプに適用することができる。しかしながら、好ましくは、本発明は、
（ｉ）血圧、脈管炎、動脈および静脈の疾患を伴う皮膚潰瘍などの皮膚潰瘍（例えば、糖尿病をわずらっている患者、老齢の患者において、静脈機能不全および脳血管発作を伴い、皮膚上の直接的な圧力または剪断力および摩擦により生じる床ずれ、もしくは局所的な組織傷害の結果生じる）、
（ii）やけど、
（iii）口の傷（例えば、歯肉炎によって引き起こされる）、
（iv）眼の傷（例えば、傷害、手術またはレーザー治療により生じた角膜の傷）、
（ｖ）皮膚以外の傷（例えば、胃／食道潰瘍、膣潰瘍、および内傷、または手術（プラスチック手術を含む）、
（vi）虚血−再灌流傷害（例えば、心筋梗塞の結果生じる）、
（vii）リューマチ性関節炎および変形性関節炎など、骨格筋疾患において生じる骨および軟骨の損傷、および
（viii）ワルファリン関連皮膚壊死
からなる群から選択された傷に適用される。
【００２５】
作用剤は、ＡＰＣ、ＡＰＣの機能性断片、ＡＰＣ擬似化合物、およびタンパク質Ｃからなる群の１つ、またはいくつか、もしくは全ての混合物であることができる。
【００２６】
好ましくは、作用剤は、傷治癒の過程の凝固／炎症の段階が実質的に終わるように、創傷から十分な期間が経過した後、被験者に投与される。実際には、作用剤の投与は、創傷後、１から４８時間以内に、より好ましくは創傷後、１から１０時間以内に行なうことが好ましい。
【００２７】
作用剤は、薬剤処方として、あるいは傷に適用される送達システム（例えば、ゲルフォーム（Ｇｅｌｆｏａｍ）などのゼラチンスポンジ、細糸ガーゼ、ナイロンメッシュ、あるいはバンドエイド（Ｂａｎｄ−ａｉｄ）（商標）などの粘着性プラスチック細片）に組み込んで、経口あるいは全身経路を介して、あるいは傷への直接適用（例えば局所投与）によって、被験者に投与することができる。
【００２８】
作用剤の有効量は、処置される傷の型、部位および重傷度に依存して変動することが予想できる。最適な結果を得るために、量を適切に調節することは、十分に当業者の技術範囲内であろう。しかしながら、たいてい、作用剤の有効量は、体重１ｋｇ当たり０．０１から１００００μｇ、より好ましくは体重１ｋｇ当たり０．１から１０００μｇ、そして、最も好ましくは体重１ｋｇ当たり１から２００μｇの範囲であることが予想される。
【００２９】
本発明による薬剤は、好ましくは、薬剤１ｇ当たり０．０１から１０００μｇの範囲の量の作用剤を、薬学的に許容可能な担体（例えば、クリームまたはゲル薬剤のためのゼラチンおよび／またはコラーゲン；点滴薬のための生理食塩水、または、リン酸緩衝液など；または、乾燥粉末のためのデンプン、ゼラチン、寒天、糖、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ステアリン酸マグネシウム、およびアルギン酸ナトリウムなど）と混合して、含む。皮膚以外の傷、虚血−再灌流傷害での使用のために、本発明の薬剤は、経口または全身投与用に処方されることができる。
【００３０】
本発明による薬剤および送達システム（すなわち、ゲル、スポンジ、ガーゼおよびメッシュ）は、タンパク質Ｃの経路に関与する他の分子（例えば、タンパク質Ｓ、ＥＰＣＲ、因子Ｖ／Ｖａ、または因子ＶIII／ＶIIIａ）；クロルヘキシジン、ポビジンヨード、およびシプロフロキサシンなどの抗菌剤；ヘパリンまたは抗トロンビンIIIなどの抗凝固薬；デキサメサゾンなどのステロイド；炎症阻害剤；カルシウムチャネル遮断薬などの心血管薬；上皮成長因子などのサイトカイン／成長因子；ブピバカインなどの局所麻酔剤；タクソールなどの抗がん剤；ポリクローナル、モノクローナルもしくはキメラ抗体、または、細胞増殖を調節する抗体などのそれらの機能性誘導体または断片など、他の活性化合物もしくは物質を１つ以上含むことができる。
【００３１】
さらに、本発明による薬剤および送達システムがタンパク質Ｃを利用する場合、薬剤および送達システムは、適切な量のタンパク質を活性化するための薬剤（例えば、トロンビン、カリクレインおよび／またはトロンボモジュリン）を含むこともできる。
【００３２】
本明細書を通して、用語「含む（comprise）」、または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」などの語尾変化は、記述された要素、整数（integer）、もしくは方法、または要素、整数、もしくは方法の群を包含することを意味するが、他のいかなる要素、整数もしくは方法、または要素、整数もしくは方法の群をも除外することを意味しないと理解されるであろう。
【００３３】
本明細書に含まれている文書、法令、物質、装置、もしくは物品などのいかなる議論も、単に、本発明のための前後関係を供することを目的としたものである。これらの事柄のいくつか、もしくは全てが、従来技術の基礎の部分を形成する、または、本出願の各請求項の優先日前にオーストラリアに存在していたとして本発明に関する分野において一般に広く行き渡った知識であったことを、認めたものとして解されるべきではない。
【００３４】
本発明は、以後、以下の限定されない実施例と添付図面として記載されるであろう。
【００３５】
[実施例１]
ＡＰＣによる内皮細胞傷害の修復の促進
活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）は、以前に記載された（非特許文献１９）ように、ｉｎｖｉｔｒｏアッセイの修飾を用いて、内皮細胞の創傷の修復を促進する性能について、試験した。簡単には、新生児の包皮由来の融合性微小血管内皮細胞（ＦＳＥ）を、５日間、培養培地（５０μｇ／ｍｌヘパリン、５０μｇ／ｍｌ内皮細胞培養補助剤、および５％ヒト血清を加えたバイオリッチ（Ｂｉｏｒｉｃｈ））中、２４穴培養プレートで培養した。内皮単層細胞は、ピペットチップで穴の直径を端から端まで一なですることにより、傷つけた。次いで、培地と取り除かれた細胞を吸引し、プレートを、ハンクス（Ｈａｎｋｓ）緩衝液で洗った。新鮮な培養培地を、様々な濃度のＡＰＣ、または強力な腫瘍促進血管新生因子、ホルボールミリスタートアセタート（ＰＭＡ）（１０ｎｇ／ｍｌ）と共に、プレートに加えて、細胞を３７℃で培養した。２４時間後、傷の幅を顕微鏡的に視覚化し、ＡＰＣの異なる用量での結果は画像処理を用いて定量化し、用量応答曲線を作製した（図１）。７５ｎＭＡＰＣの存在下で培養した細胞は、２４時間以内に、ほとんど完全に傷を閉合し、ＡＰＣを用いずに培養した細胞よりも２倍以上の遊走反応を示した。１００ｎＭでは、さらには増強しなかった。ＡＰＣ（７５μＭ）は、およそＰＭＡと同程度の活性を有していた。
【００３６】
[実施例２]
ＡＰＣによる血管新生の促進
ゼラチナーゼＡを活性化し、内皮細胞創傷を促進するＡＰＣの性能に鑑みて、ＡＰＣが血管新生を促進し得るかどうかについて調べた。ＡＰＣを、ゼラチンスポンジ（Ｇｅｌｆｏａｍ）を用いたニワトリ胚子漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイに加えた。スポンジは、およそ２ｍｍ×２ｍｍに切断した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中５μｇのＡＰＣ、またはＡＰＣ単独をゼラチンスポンジに加え、次いで９日目のＣＡＭの上に、以前記載したように（非特許文献３４）置いた。ＣＡＭは、毎日視察し、１４日目に撮影し、組織学的薄切のために固定した。肉眼的には、１４日目に、ＡＰＣで処理したゼラチンスポンジは、スポーク・ホイール（ｓｐｏｋｅ−ｗｈｅｅｌ）パターンでスポンジに向かって内部に急速に成育する血管により取り囲まれた（データ省略）。これに対して、ＰＢＳで処置したゼラチンスポンジは、取り囲む血管が形成されなかった。組織学的切片により、ＡＰＣで処理されたスポンジが、多くの新しい血管に浸潤されている（血管新生）ことが示された（図２）。さらに、ＡＰＣで処理されたスポンジ中に、広範囲にわたる繊維芽細胞の遊走があった。また、顕著な上皮細胞層の増殖があり、ゼラチンスポンジ上で外胚葉が完全に成育していた。スポンジの外縁で、層化と退縮が、この再上皮化に伴った。また、内胚葉も、いくつかの切片で層化し、絨毛形成することが示され、絨毛から落ちた細胞の存在を示した（省略）。ＡＰＣで処理されたスポンジに対して、ＰＢＳ対照スポンジでは、再上皮化、内皮細胞または繊維化細胞の浸潤のいずれの証拠もほとんどなかった。
【００３７】
[実施例３]
ＡＰＣによる傷治癒の促進
血管内皮細胞の遊走を刺激し、再上皮化、繊維芽細胞の浸潤および血管新生を高めるＡＰＣの性能に鑑みて、ラットモデルにおいて傷治癒を増進する能力について、ＡＰＣを調べた。スプラーグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットを、麻酔し、８ｍｍのパンチ生検を用いて、ラットの背中に、その下にある背部側部の骨格筋膜を露出するように、４つの十分に深い傷を切開した。滅菌したガーゼで均一に圧迫することにより、止血した。ＡＰＣは、等張性、滅菌、発熱物質不含生理食塩溶液中に希釈し、各切開は、滅菌、発熱物質不含生理食塩溶液、または２０μｇのＡＰＣを含む生理食塩水５０μｌの局所塗布により、処置した。傷は、包帯をせずに開けたままにしておき、ラットは、１かご当たり１匹ずつかごに入れた。傷の閉合は、４０時間、４日および７日後に、視覚的に評価した。各時点で、傷を、ニコン・クールピクス（ＮｉｋｏｎＣｏｏｌｐｉｘ）９５０を用いて、フレームにおける距離校正目盛りと共に、デジタル方式で撮影した。傷の面積を、画像解析（ＳｃｉｏｎＩｍａｇｅ）によって算出した。４０時間後に、対照と比べて、ＡＰＣ処理された傷における傷の閉合に、顕著な視覚的向上があった。４日目において、画像解析の結果により、対照と比べて、ＡＰＣ処理された傷の大きさに有意な減少が示された（図３）。この違いは、７日目に、維持されていた（図３ｃ、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００３８】
[実施例４]
ＡＰＣによる傷治癒の促進
ラットモデルにおける傷治癒を増進する能力について、ＡＰＣをさらに調べた。スプラーグ・ドーリーラットを麻酔し、８ｍｍのパンチ生検を用いて、ラットの背中について、その下にある背部側部の骨格筋膜を露出するように、４つの十分に深い傷を切開した。滅菌したガーゼで均一に圧迫することにより、止血した。ＡＰＣは、等張性、滅菌、発熱物質不含生理食塩溶液中に希釈し、各切開は、滅菌、発熱物質不含生理食塩溶液、または以下：０μｇＡＰＣ（対照、ラット３匹、傷１２箇所）、１０μｇＡＰＣ（ラット３匹、傷１２箇所）、４０μｇＡＰＣ（ラット４匹、傷１６箇所）、７０μｇＡＰＣ（ラット３匹、傷１２箇所）、または１００μｇＡＰＣ（ラット３匹、傷１２箇所）を含む生理食塩水５０μｌの局所塗布により、直ちに処置した。傷は、包帯をせずに開けたままにしておき、ラットは、１かご当たり１匹ずつかごに入れた。傷の大きさは、１、３、５、７、および９日後に、画像解析により測定した。各時点で、傷を、ニコン・クールピクス９９５を用いて、デジタル方式で撮影した。傷の面積を、画像解析（ＳｃｉｏｎＩｍａｇｅ）によって算出した。結果を図４に示す。１日後に、１０または４０μｇＡＰＣで処置した傷の大きさに有意な減少があった。対照と７０または１００μｇＡＰＣで処置したラットとの間には、差異が無かった。傷の大きさにおける有意な減少は、４０μｇＡＰＣで最も顕著であり、１、３、７、および９日目で見られた（^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５、コスタット（Ｃｏｓｔａｔ）を用いたスチューデントのｔ検定）。
【００３９】
[実施例５]
ＡＰＣによる傷治癒の促進
ラットモデルにおける傷治癒を増進する能力について、ＡＰＣをさらに調べた。スプラーグ・ドーリーラットを、実施例４で記載したように、傷つけた。ＡＰＣは、等張性、滅菌、発熱物質不含生理食塩溶液中に希釈し、各切開は、滅菌、発熱物質不含生理食塩溶液、または、４０μｇＡＰＣを含む生理食塩水５０μｌの局所塗布により、処置した。４８時間後、傷は、４０μｇＡＰＣの２回目の塗布により処置した。傷は、包帯をせずに開けたままにしておき、ラットは、１かご当たり１匹ずつかごに入れた。傷の閉合は、１、２、３、４、５、７、および９日後に、視覚的に評価した。各時点で、傷を、ニコン・クールピクス９９５を用いて、デジタル方式で撮影した。傷の面積を、画像解析（ＳｃｉｏｎＩｍａｇｅ）によって算出した。結果を図５に示す。対照よりもＡＰＣで処置したラットの治癒が早く（ｐ＜０．０１）、１日後に、傷の大きさに有意な差異があった。この差異は、２、３、および７日においても認められた（^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５、コスタット（Ｃｏｓｔａｔ）を用いたスチューデントのｔ検定）。
【００４０】
[実施例６]
糖尿病ラットにおけるＡＰＣによる傷治癒の促進
糖尿病ラットモデルにおける傷治癒を増進する能力について、ＡＰＣをさらに調べた。糖尿病モデルは、ゆっくりと傷治癒することが十分に記載されているモデルであるため、選択した（非特許文献３５）。糖尿病は、スプラーグ・ドーリーラットにおいて、ストレプトゾトシンの腹膜内注射の標準的な方法を用いて、誘発させた。１週間後、ラットの血中グルコース濃度は、２０ｍＭより大きく、糖尿病であることを示していた。糖尿病ラットは、前記実施例４で記載したように、８ｍｍパンチ生検を用いて傷つけて、直ちに、２０μｇＡＰＣ（ラット２匹、傷７箇所）で処置し、または、試験剤で処置しなかった（対照、ラット１匹、傷４箇所）。傷は、包帯をせずに開けたままにしておき、ラットは、１かご当たり１匹ずつかごに入れた。傷の閉合は、１、２、３、４、５、７、および９日後に、視覚的に評価した。各時点で、傷を、ニコン・クールピクス９９５を用いて、デジタル方式で撮影した。傷の面積を、画像解析（ＳｃｉｏｎＩｍａｇｅ）によって算出した。結果を図６に示す。対照とＡＰＣで処置したラットとの間で、傷治癒の速度（回帰直線の傾斜）に有意な差異があり、後者がより早く治癒した（ｐ＜０．０１）。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
結果：
内皮細胞の創傷を修復するＡＰＣの性能は、ラットにおける傷治癒を促進するだけでなく、再上皮化、繊維芽細胞の浸潤および血管新生を促進し、ＡＰＣが有効な傷治癒剤であるであろうことを示す。
【００４２】
多くの変化、および／または、変更を、広く記載された本発明の精神または範囲から逸れることなく、具体的な実施態様において示されたように、本発明に施すことができることは、当業者にとって認識されるであろう。それゆえ、本実施態様は、全ての点において、例示するものであり、制限するものではないと思料されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、「傷つけられた」包皮内皮（ＦＳＥ）培養単層細胞の修復時におけるＡＰＣの効果を示す。単層細胞は、ピペットチップでこすり取り、洗浄し、様々な量のＡＰＣ、ＰＭＡを含む培地、または無処理の培地で、覆った。細胞は、実施例において記載されたように、傷の閉合について測定する前に、３７℃で２４時間培養した。示された結果は、複製された傷の選択された単位面積当たり、傷中に遊走している細胞数（平均±標準偏差）を示す。同様の結果が二つの別々の実験で得られた。
【図２】図２は、ニワトリ胚子の漿尿膜（ＣＡＭ）におけるＡＰＣの効果を示す。ニワトリ胚子は、１日目に滅菌されたウェイボート（ｗｅｉｇｈｂｏａｔ）中で、分割した。４日目に、ゼラチンスポンジを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中５μｇのＡＰＣ、またはＰＢＳ単独で処置し、次いで、ＣＡＭの表面に置いた。９日目に、胚子を、ボーイン（Ｂｏｕｉｎ’ｓ）液体で固定し、ＣＡＭの上面に対して垂直に薄切し、マッソン（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ）染料で染色し、光学顕微鏡で観察した。ＡＰＣで処置されたＣＡＭは、スポンジ上での完全な再上皮化（細い矢印）（Ａ）および多くの新しい血管（太い矢印）および繊維芽細胞の浸潤（斜め矢印）（Ｂ）を示している。ＰＢＳで処置されたスポンジでは、上皮の再成長はなく（太い矢印）、スポンジ中へのごく僅かの細胞の浸潤がある（Ｃ、Ｄ）。
【図３】図３は、ラットの傷治癒モデルにおけるＡＰＣの効果を示す。スプラーグ・ドーリーラットを、傷つけ、次いで、Ａ）生理食塩水、または、Ｂ）２０μｇのＡＰＣで処置し、４日後に撮影した。Ｃ）生理食塩水または２０μｇのＡＰＣでそれぞれ処置した２匹のラット（全部で８箇所の創傷）を用いた結果の概要。示された結果は、４０時間、４日および７日後の傷面積の平均値±標準偏差（ｍｍ^２）である。
【図４】図４は、ラットの傷治癒モデルにおける異なった用量のＡＰＣの効果を示す。正常のラットは、８ｍｍのパンチ生検を用いて傷つけ、直ちに、０μｇ（対照、ラット３匹、傷１２箇所）、１０μｇ（ラット３匹、傷１２箇所）、４０μｇ（ラット４匹、傷１６箇所）、７０μｇ（ラット３匹、傷１２箇所）、または１００μｇ（ラット３匹、傷１２箇所）のＡＰＣで処置した。傷の大きさは、１、３、５、７および９日後に画像解析によって測定し、示した結果は１、２、３、４、５、７および９日後の傷面積の平均値±標準偏差（ｍｍ^２）である。
【図５】図５は、ラットの傷治癒モデルにおけるＡＰＣの効果を示す。正常ラットを、８ｍｍのパンチ生検を用いて傷つけ、処置を行わない（対照、ラット２匹、傷７箇所）、または、２回、ＡＰＣで処置を行った（創傷直後に４０μｇＡＰＣ、次いで１日後に、４０μｇＡＰＣの２回目処置）（ラット３匹、傷１１箇所）。傷の大きさは、画像解析によって測定し、示した結果は１、２、３、４、５、７および９日後の傷面積の平均値±標準偏差（ｍｍ^２）である。
【図６】図６は、糖尿病ラットの傷治癒モデルにおけるＡＰＣの効果を示す。ストレプトゾトシン誘発糖尿病ラットを、８ｍｍパンチ生検を用いて傷つけ、直ちに、２０μｇＡＰＣを用いて（ラット２匹、傷７箇所）、または、試験作用剤を用いずに（対照；ラット１匹、傷４箇所）処置した。傷の閉合を、１、２、３、４、５、７および９日後に視覚的に評価した。対照ラットとＡＰＣ処置ラットの間で、傷治癒の速度に有意な差があり（回帰直線の傾斜）、後者の治癒の方が早かった（ｐ＜０．０１）。

Claims

被験者における傷治癒を促進するための方法であって、
（ｉ）活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）、
（ii）ＡＰＣの機能性断片、
（iii）ＡＰＣ擬似化合物、および
（iv）タンパク質Ｃ、
の１つ以上を含む作用剤の有効量を、随意に、薬学的に許容可能な担体と混合して、前記被験者に投与すること、を含む方法。
作用剤がＡＰＣである、請求項１に記載の方法。
作用剤が、ヒトＡＰＣである、請求項２に記載の方法。
作用剤が、タンパク質Ｃである、請求項１に記載の方法。
作用剤が、ヒトタンパク質Ｃである、請求項４に記載の方法。
タンパク質Ｃが、タンパク質Ｃの活性化剤と共に投与される、請求項１、４および５のいずれか一項に記載の方法。
活性化剤が、トロンビン、カリクレイン、および／または、トロンボモジュリンからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
作用剤が、ＡＰＣの機能性断片である、請求項１に記載の方法。
作用剤が、ＡＰＣ擬似化合物である、請求項１に記載の方法。
作用剤が、創傷１時間から１０時間以内に、前記被験者に投与される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
傷治癒が促進されるべき傷が、皮膚潰瘍、やけど、口の傷、眼の傷、皮膚以外の傷、虚血−再還流傷害、骨および軟骨の損傷、およびワルファリン関連皮膚壊死からなる群から選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
傷治癒が促進されるべき傷が、皮膚潰瘍である、請求項１１に記載の方法。
作用剤が、局所的に投与される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
作用剤の有効量が、体重１ｋｇ当たり０．１から１０００μｇの範囲である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
作用剤の有効量が、体重１ｋｇ当たり０．１から１０μｇの範囲である、請求項１４に記載の方法。
被験者における傷治癒を促進するための薬剤であって、薬学的に許容可能な担体と混合した、
（ｉ）活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）、
（ii）ＡＰＣの機能性断片、
（iii）ＡＰＣ擬似化合物、および
（iv）タンパク質Ｃ、
のうち１つ以上を含むある量の作用剤を含む薬剤。
作用剤が、ヒトＡＰＣである、請求項１６に記載の薬剤。
作用剤が、ヒトタンパク質Ｃである、請求項１６に記載の薬剤。
さらにタンパク質Ｃの活性化剤を含む、請求項１６または１８に記載の薬剤。
活性化剤が、トロンビン、カリクレイン、および／または、トロンボモジュリンからなる群から選択される、請求項１９に記載の薬剤。
薬剤が、皮膚潰瘍、やけど、口の傷、眼の傷、皮膚以外の傷、虚血−再灌流傷害、骨および軟骨の損傷、およびワルファリン関連皮膚壊死からなる群から選択される傷の処置用である、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の薬剤。
薬剤が、皮膚潰瘍の処置用である、請求項２１に記載の薬剤。
薬剤が、局所投与用である、請求項１６から２２のいずれか一項に記載の薬剤。
（ｉ）活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）、
（ii）ＡＰＣの機能性断片、
（iii）ＡＰＣ擬似化合物、および
（iv）タンパク質Ｃ、
の１つ以上を含むある量の作用剤を組み込んだ送達システムであって、傷への適用に適し、適用後、傷治癒を促進する送達システム。
作用剤が、ヒトＡＰＣである、請求項２４に記載の送達システム。
作用剤が、ヒトタンパク質Ｃである、請求項２４に記載の送達システム。
さらに、タンパク質Ｃの活性化剤を含む、請求項２４または２６に記載の送達システム。
活性化剤が、トロンビン、カリクレイン、および／または、トロンボモジュリンからなる群から選択される、請求項２７に記載の送達システム。
送達システムが、ゲル、スポンジ、ガーゼまたはメッシュである、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の送達システム。
（ｉ）活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）、
（ii）ＡＰＣの機能性断片、
（iii）ＡＰＣ擬似化合物、および
（iv）タンパク質Ｃ、
の１つ以上を含む作用剤の、被験者における傷治癒を促進するための薬剤を調製するための使用。
作用剤が、ヒトＡＰＣである、請求項３０に記載の使用。
作用剤が、ヒトタンパク質Ｃである、請求項３０に記載の使用。
薬剤が、タンパク質Ｃの活性化剤をさらに含む、請求項３２に記載の使用。
活性化剤が、トロンビン、カリクレイン、および／または、トロンボモジュリンからなる群から選択される、請求項３３に記載の使用。
薬剤が、皮膚潰瘍、やけど、口の傷、眼の傷、皮膚以外の傷、虚血−再灌流傷害、骨および軟骨の損傷、およびワルファリン関連皮膚壊死からなる群から選択される傷の処置用である、請求項３０から３４のいずれか一項に記載の使用。
薬剤が、皮膚潰瘍の処置用である、請求項３５に記載の使用。
薬剤が、局所投与に適している、請求項３０から３６のいずれか一項に記載の使用。
（ｉ）活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）、
（ii）ＡＰＣの機能性断片、
（iii）ＡＰＣ擬似化合物、および
（iv）タンパク質Ｃ、
の１つ以上を含む作用剤の、送達システムを調製するための使用であって、前記送達システムが傷への適用に適し、適用後、傷治癒を促進する使用。
作用剤が、ヒトＡＰＣである、請求項３８に記載の使用。
作用剤が、ヒトタンパク質Ｃである、請求項３８に記載の使用。
送達システムが、タンパク質Ｃの活性化剤をさらに含む、請求項４０に記載の使用。
活性化剤が、トロンビン、カリクレイン、および／または、トロンボモジュリンからなる群から選択される、請求項４１に記載の使用。
送達システムが、ゲル、スポンジ、ガーゼ、またはメッシュである、請求項３８から４２のいずれか一項に記載の使用。