CN114073756A

CN114073756A - 生物活性物质用于制备抗老化的组合物的用途

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Publication number: CN114073756A
Application number: CN202010853527.4A
Authority: CN
Inventors: 林咏翔; 王玉玲
Original assignee: TCI Co Ltd
Current assignee: TCI Co Ltd
Priority date: 2020-08-21
Filing date: 2020-08-21
Publication date: 2022-02-22
Anticipated expiration: 2040-08-21
Also published as: CN114073756B

Abstract

一种生物活性物质用于制备抗老化的组合物的用途。生物活性物质为胜肽，包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一氨基酸序列。各氨基酸序列为鱼皮的胜肽片段。本发明所制备的组合物具有抗老化、维持细胞健康的能力。并且，组合物更可用于增加胶原蛋白含量、提升肌肤胶原蛋白密度、提高肌肤含水量、改善毛孔或、改善皱纹或其组合。

Description

生物活性物质用于制备抗老化的组合物的用途

技术领域

本发明涉及一种生物活性物质的用途，特别是关于一种作为生物活性物质的胜肽用于制备抗老化的组合物的用途。

背景技术

博氏巨鲶，又名巴沙鱼(Pangasius bocourti)，为国际重要的食用鱼。巴沙鱼的营养丰富、养殖周期短、产量高且易于加工。但由于其皮下富含脂肪，易影响鱼肉风味。因此，作为国际上流通的食用鱼，大多会先去除鱼皮后再贩卖，进而产生大量的鱼皮废弃物。

近年来，为减少资源浪费及避免污染环境，这些相关的废弃物也逐渐被重视。并且，由于鱼皮富含胶原蛋白，常被用以进行二次加工制作加工食品、明胶等。

胶原蛋白为人体一种非常重要的蛋白质，广泛存在于结缔组织中。胶原蛋白作为人体韧带、眼睛角膜等组织的主要成分。并且，胶原蛋白更是细胞外基质的主要组成成分。胶原蛋白可使肌肤保持弹性，而随着胶原蛋白的流失，肌肤会出现皱纹。

然而，胶原蛋白无法被人体直接吸收。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种以作为生物活性物质的胜肽制备抗老化的组合物的用途。

在一些实施例中，一种生物活性物质用于抗老化的组合物的用途，其中生物活性物质为胜肽，且胜肽包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一氨基酸序列。各氨基酸序列为鱼皮的胜肽片段。

综上，任一实施例的作为生物活性物质的胜肽，其可制备抗老化的组合物。并且，胜肽包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一氨基酸序列，且各氨基酸序列为鱼皮的胜肽片段。在一些实施例中，作为生物活性物质的胜肽可用以调节抗老化基因及/或提升粒线体活性。在一些实施例中，所制备的组合物可用以调节COL3A1、COL4A4、HAS2及HAS3基因。并且，所制备的组合物可用于增加胶原蛋白含量、增加胶原蛋白密度、增加肌肤含水量、改善毛孔、改善皱纹或其组合。

附图说明

图1为本发明一些实施例中胜肽处理人类细胞后的抗老化基因群组的基因表现的倍数结果图；

图2为本发明一些实施例中胜肽处理人类细胞后的粒线体相对活性测试结果图；

图3为本发明一些实施例中实验组及对照组的COL3A1及COL4A4基因表现的相对比率结果图；

图4为本发明一些实施例中实验组及对照组的HAS2及HAS3基因表现的相对比率结果图；

图5为本发明一些实施例中实验组及对照组于第0周及第4周的皱纹百分比结果图；

图6为本发明一些实施例中实验组及对照组于第0周及第4周的毛孔百分比结果图；

图7为本发明一些实施例中实验组及对照组于第0周及第4周的肌肤含水量百分比结果图；以及

图8为本发明一些实施例中实验组及对照组于第0周及第4周的胶原蛋白密度百分比结果图。

具体实施方式

在一些实施例中，作为生物活性物质的胜肽能用于制备抗老化的组合物。其中，胜肽包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一氨基酸序列，且各氨基酸序列为鱼皮的胜肽片段。

应理解，「胜肽」为介于氨基酸和蛋白质之间的物质，由多个氨基酸组成。并且，作为生物活性物质的胜肽可为「经分离的胜肽」或「经合成的胜肽」。其中，「经分离的胜肽」是指从生物体或生物体衍生物中分离出来的胜肽片段，且此胜肽片段具有生物活性。「经合成的胜肽」是指借由仪器或人工实验操作依照欲得到的氨基酸序列合成的胜肽片段，且此胜肽片段具有生物活性。并且，本文所述及的用语「经分离的胜肽」等同于「分离的胜肽」或「分离胜肽」，且用语「经合成的胜肽」等同于「合成的胜肽」或「合成胜肽」。

应可理解，本文所述及的用语「蛋白」等同于「蛋白质」，例如用语「胶原蛋白」等同「胶原蛋白质」。

在一些实施例中，作为生物活性物质的胜肽可分离自鱼皮的胜肽片段或借由仪器或人工实验合成得之。举例来说，鱼皮的胜肽片段的来源包括鱼皮细胞、胶原蛋白(下称鱼皮胶原蛋白)及鱼肉细胞。由于鱼皮中主要的成分为胶原蛋白，且从鱼皮中提取鱼皮胶原蛋白的过程中，除了主要提取的鱼皮胶原蛋白，更会包含鱼皮细胞中的蛋白质(即，鱼皮细胞蛋白)以及残留在鱼皮上鱼肉细胞的蛋白质(即，鱼肉细胞蛋白)。应可理解，本文所述及的用语「鱼皮的胜肽片段」是指以胶原蛋白为主的胜肽片段，且同时含有鱼皮细胞蛋白及鱼肉细胞蛋白的胜肽片段。

在一些实施例中，鱼皮为巴沙鱼的鱼皮，因此作为生物活性物质的胜肽是巴沙鱼的鱼皮的胜肽片段。其中，巴沙鱼的鱼皮的胜肽片段可包含至少一种胶原蛋白、前胶原蛋白、鱼皮细胞蛋白、鱼肉细胞蛋白或其组合的胜肽片段。举例来说，胶原蛋白可为第四型胶原蛋白、第五型前胶原蛋白、第十四型胶原蛋白等。

并且，在一些实施例中，作为生物活性物质的胜肽可以为SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:11所示的6种氨基酸序列中的任意多种氨基酸序列借由化学(如，酵素水解处理等)或/及物理外力(如，纯化、分离、亲疏水引力、极性非极性溶剂等)混合在一起的胜肽群组。

举例来说，可将巴沙鱼鱼皮的胶原蛋白胜肽原料进行分离以得到SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一氨基酸序列，且此胶原蛋白胜肽原料包括鱼皮胶原蛋白的胜肽片段、鱼皮细胞蛋白的胜肽片段及/或鱼肉细胞蛋白的胜肽片段。在一实施例中，胶原蛋白胜肽原料可以为市售巴沙鱼的鱼皮胶原蛋白胜肽粉(购自Italgelatin,意大利)，或是将巴沙鱼的鱼皮提取出的胶原蛋白经由酵素水解处理后并干燥形成的胶原蛋白胜肽粉。

在一些示范例中，作为生物活性物质的胜肽可借由仪器(如，快速蛋白质液性层析仪及高效液相层析系统)自巴沙鱼鱼皮胶原蛋白胜肽粉分离得之。并且，上述分离步骤是利用胜肽性质(例如分子量、亲疏水性、极性非极性等物理或化学特性)分离出的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一氨基酸序列。

在一些实施例中，各氨基酸序列的分子量介于700道尔吞(Da)至1300Da之间。在一些实施例中，各氨基酸序列的氨基酸数量为8至13个。

在一些实施例中，当胜肽包括SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:5中所示的至少一氨基酸序列时，其能用以提升至少一抗老化基因表现，且所制备的组合物亦可用以提升至少一抗老化基因的表现，进而提高肌肤抗老化的功能。举例来说，至少一抗老化基因包括Atg8、CCT2、CCT5、CCT6A、CCT7、CCT8、Pink1、STIR1及Ubl-5其中的至少一项基因。由此，选用SEQID NO:4及SEQ ID NO:5中所示的任一种或多种氨基酸序列来制备组合物时，此组合物可用以提升至少一抗老化基因的表现。

在一些实施例中，当胜肽包括SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:6中所示的至少一氨基酸序列时，其能用以提升细胞粒线体活性，且其所制备的组合物亦可用以提升细胞粒线体活性，进而维持细胞的健康状态。举例来说，选用为SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:6所示的任一种或多种氨基酸序列来制备组合物时，此组合物可用以提升细胞粒线体活性。

在一些实施例中，当胜肽包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一氨基酸序列时，其能用于制备抗老化的组合物。并且，所制备的组合物可用以增加胶原蛋白密度、增加肌肤含水量、改善毛孔、改善皱纹或其组合。

在一些实施例中，以具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一氨基酸序列的胜肽所制备的组合物能用以改善肌肤状况。举例来说，以具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一氨基酸序列的胜肽所制备的组合物可具有下列至少一种功用：增加胶原蛋白含量、增加胶原蛋白密度、增加肌肤含水量、改善毛孔及改善皱纹。

举例来说，当组合物包括用以调节COL3A1及COL4A4基因中至少一项基因的胜肽时，此组合物可用以促进肌肤胶原蛋白质生成、提升肌肤胶原蛋白质密度、减少肌肤毛孔或其组合。当组合物包括用以调节HAS2及HAS3基因中至少一项基因的胜肽时，此组合物可用以提高肌肤含水量。当组合物包括COL3A1、COL4A4、HAS2及HAS3基因中至少一项基因时，此组合物可用以改善皱纹。

在一些实施例中，以具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一氨基酸序列的胜肽所制备的组合物可以为食品组合物、保健食品组合物、或医药组合物等。举例来说，以具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一氨基酸序列的胜肽所制备的组合物可为口服型的胶原胜肽粉。因此，借由服用组合物可使其内包含的胜肽调节肌肤细胞的基因表现，进而改善肌肤细胞状况。

范例一：经分离的胜肽的制备

首先，秤取100毫克巴沙鱼鱼皮的胶原胜肽粉(购自Italgelatin,意大利)，并将其溶解于5毫升的缓冲液A，以得到胶原胜肽液。其中，缓冲液A是以50毫摩尔浓度(mM)的Tris/HCl缓冲液(pH 8.0)及100mM氯化钠(NaCl)配置。

接着，使用快速蛋白质液性层析仪(FPLC纯化仪，厂牌

GE HealthcareLife Sciences，以下称为纯化仪器)进行胶原胜肽液的粗略分离，以得到初分离胜肽混合物。其中，纯化仪器内装设的分离管柱为分子筛胶体纯化管柱(sephadex G-25，2.6cm×10cm，53毫升)。纯化仪器的流速设定为每分钟流一毫升(1mL/min)且用以观察的紫外光波长为220纳米(nm)及280纳米。并且，将波峰测量值为5kDa以下的初分离胜肽混合物于-80℃下进行冷冻抽干(仪器厂牌EYELA；型号：FD-1000)12小时，以得到固态的初分离胜肽混合物。

取30毫克固态的初分离胜肽混合物溶解于2毫升含有0.1％三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)的二次去离子水中，以得到预分离胜肽混合物。接着，以高效液相层析(HPLC)系统(机型Hitachi Chromaster HPLC system,厂牌Hitachi,Tokyo,Japan)(下称HPLC系统)将预分离胜肽混合物进行分离，以得到多组次分离胜肽。其中，HPLC系统内装设分子筛C18高压管柱(型号TSKgel G2000SWXL,厂牌Tosoh,30cm×7.8mm,5μm)。HPLC系统的设定值中，以缓冲溶液A(0.1％TFA溶于100％去离子水)及缓冲溶液B(0.1％TFA溶于100％ACN)依照分离梯度进行混合，且分离梯度为5％乙腈(Acetonitrile,ACN)/0.1％TFA到100％乙腈/0.1％TFA(即，于0.1％TFA溶液环境中将ACN的浓度由5％拉梯度至100％)、流速设定为每分钟流一毫升(1mL/min)及管柱温度设定为40℃。

于此，初分离胜肽混合物中的胜肽会随不同极性及分子量于的HPLC溶液冲提出来，进而得到多组分离胜肽。并且，将多组分离胜肽于-80℃下进行冷冻抽干(仪器厂牌EYELA；型号：FD-1000)12小时，以得到多组固态的分离胜肽。

范例二：胜肽鉴定

将范例一的多组分离胜肽进行蛋白质身分鉴定。首先，多组固态的分离胜肽以去离子水配置为20mg/ml的浓度后，以液相层析质谱仪(LC-MS/MS)进行蛋白质鉴定。并且，液相层析质谱仪(LC-MS/MS)为四级棒-飞行时间式串联质谱仪系统(Q-TOF)，其中液相层析系统(LC system)的型号为UltiMate 3000 RSLCnano LC Systems(厂牌Thermo FisherScientific)，且质谱仪(Mass Spectrometer)的型号为

6600System(厂牌Applied Biosystems Sciex)。

液相层析系统内装设的分离管柱号为C18分离管柱(Acclaim PepMap C18,75μmI.D.x 25cm nanoViper,

100(Thermo Fisher Scientific))。液相层析质谱仪所使用的溶液系统为缓冲溶液A(0.1％TFA溶于100％去离子水)及缓冲溶液B(0.1％TFA溶于100％ACN)。液相层析质谱仪设定的分离梯度为5％缓冲溶液B到拉梯度到90％缓冲溶液B、流速设定为每分钟流300奈升(300nl/min)及拉梯度30分钟。

于质谱仪的设定值中，检视质谱扫描(survey scan)设定为扫描在400m/z(质荷比)至1200m/z范围内的所有离子化的分离的胜肽。在数据依靠收集模式(informationdependent aquisition,CID)中，设定胜肽的检测范围是100-5000道尔顿(dalton,Da)。接着，分析这些分离胜肽并对应产生多个MS/MS图谱，并利用Mascot分析程序将这些MS/MS图谱于数据库(NCBI及UniProt)中进行检索，进而得到这些分离胜肽的氨基酸序列及身分鉴定信息，如表1及表2所示。

表1

序列编号	序列	分子量
			SEQ ID NO:1	KGWPGTPG	798.40
SEQ ID NO:2	PGAPGSSGPKG	910.4509
			SEQ ID NO:3	VAEGAQGNIGPA	1083.5196
SEQ ID NO:4	NPGPHGQPGPPGP	1224.5524
			SEQ ID NO:5	DKPLIPEGP	964.5229
SEQ ID NO:6	GPLGPIGPPGLP	1070.6124

由表1可知，在一些实施例中，分离胜肽的氨基酸序列的分子量介于700Da至1300Da之间。在一些实施例中，分离胜肽的氨基酸序列的氨基酸数量为8～13个。

表2

序列编号	身分鉴定信息(中文/英文)
		SEQ ID NO:1	第四型胶原蛋白α-1链状/collagen alpha-1(IV)chain-like
SEQ ID NO:2	第十四型胶原蛋白/Collagen type XIV
		SEQ ID NO:3	致动蛋白家族成员21B/Kinesin family member 21B
SEQ ID NO:4	持续神经丛/Persistent plexus
		SEQ ID NO:5	肌原纤维蛋白，串联重复2/Titin,tandem duplicate 2
SEQ ID NO:6	α1第五型前胶原蛋白/Procollagen,type V,alpha 1

并且，由表2可知，分离胜肽的氨基酸序列为巴沙鱼鱼皮的胜肽片段。其中，SEQ IDNO:1及SEQ ID NO:2为巴沙鱼鱼皮的至少一胶原蛋白(Collagen)的胜肽片段、SEQ ID NO:6为前胶原蛋白(Procollagen)的胜肽片段、SEQ ID NO:3为致动蛋白家族成员21B(Kinesinfamily member 21B)的胜肽片段、SEQ ID NO:4为持续神经丛(Persistent plexus)的胜肽片段，以及SEQ ID NO:5为肌原纤维蛋白(Titin,tandem duplicate 2)的胜肽片段。于此可知，巴沙鱼的鱼皮胶原蛋白胜肽原料包含上述分离出来的6种胜肽的氨基酸序列，即SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:6。

范例三：胜肽合成

为验证范例二所鉴定到的6种分离胜肽的氨基酸序列对于肌肤细胞的功效，于范例三中依据前述范例二鉴定所得的氨基酸序列(即SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6)的氨基酸排列顺序制备合成胜肽。使用合成方法为固相合成法(Fmoc-Solid Phase PeptideSynthesis)，且使用的仪器为胜肽合成仪(型号Focus XC III 0，美国，厂牌AAPPTEC)。

以下以SEQ ID NO:6的氨基酸序列为例，已知SEQ ID NO:6的氨基酸序列为Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Ile-Gly-Pro-Pro-Gly-Leu-Pro。

步骤(1)：首先，于反应管中置入树脂，并依照每1公克树脂加入15毫升的二氯甲烷(DCM)，将树脂浸泡在二氯甲烷中30分钟以使树脂于溶液中膨胀。

步骤(2)：去除反应管内的二氯甲烷，并依照每1公克树脂加入15毫升的20％呱啶二甲基甲酰胺(呱啶DMF)溶液至反应管中与树脂反应5分钟，接着去除反应管内溶液。再次依照每1公克树脂加入15毫升的20％呱啶二甲基甲酰胺溶液至反应管中再次与树脂反应15分钟，以去除树脂上保护基，得到去保护基的树脂。

步骤(3)：于再次去除反应管内的溶液后，从反应管内取出十几粒树脂进行检测。首先，将树脂以乙醇清洗三次，并加入茚三酮、苯酚溶液各一滴。于105℃至110℃加热5分钟，当茚三酮及苯酚溶液和树脂反应皆变成深蓝色时，为阳性反应，代表此时反应管内的树脂为去保护基的树脂，并可与氨基酸结合。

步骤(4)：将去保护基的树脂依照每1公克树脂加入10毫升的二甲基甲酰胺至反应管内重复清洗6次。

步骤(5)：将三倍过量的保护甘氨酸(Fmoc-Gly)及三倍过量的羟基苯并三唑(HOBt)以少量的二甲基甲酰胺溶解后，加入装有去保护基的树脂的反应管内反应90分钟。

步骤(6)：于90分钟反应后，依照每1公克树脂加入10毫升的二甲基甲酰胺至反应管内重复清洗3次接有氨基酸的树脂。

接着，重复上述步骤(2)至(6)，直到将其余氨基酸(Pro、Leu、Gly、Pro、Ile、Gly、Pro、Pro、Gly、Leu、Pro)依序接起以形成氨基酸序列为SEQ ID NO:6的初合成胜肽。

步骤(7)：依照每1公克树脂加入10毫升的二甲基甲酰胺至反应管内重复清洗初合成胜肽3次、接着依照每1公克树脂加入10毫升的二氯甲烷至反应管内清洗初合成胜肽3次，以及最后依照每1公克树脂加入10毫升的乙醇至反应管内清洗初合成胜肽3次。

步骤(8)：将清洗后的初合成胜肽以10克裂解液(86％三氟乙酸、4％苯甲硫醚、3％水、5％乙二硫醇(EDT)及2％苯酚)反应120分钟，以分离初合成胜肽与树脂。

步骤(9)：借由砂芯漏斗将含有初合成胜肽的裂解液与树脂分离，接着将含有初合成胜肽的裂解液中加入相对前述裂解液八倍体积的乙醚中以进行反应。接着，以布氏漏斗进行抽滤分离以初合成胜肽及裂解液，并于抽干含有裂解液的乙醚后以乙醚清洗初合成胜肽三次，此时初合成胜肽为固体。并且，于常温中待乙醚挥发后得到干燥的初合成胜肽。

步骤(10)：取1毫克的干燥的初合成胜肽以0.5毫升去离子水回溶后，取20毫升回溶后的初合成胜肽以HPLC系统(机型Hitachi Chromaster HPLC system,厂牌Hitachi,Tokyo,Japan)进行分离并纯化，以得到纯合成胜肽。其中。于HPLC系统中设置C18管柱(厂牌Gemini-NX)并设定检测长为220nm，并且HPLC系统中以缓冲溶液A(0.1％TFA溶于100％去离子水)及缓冲溶液B(0.1％TFA溶于100％ACN)依照线分离梯度进行混合以冲堤并分离出合成胜肽。分离梯度的设定值从为10％缓冲溶液B拉线性梯度到90％ACN(溶于0.1％TFA)、流速设定为每分钟流一毫升(1mL/min)且分离时间设定为30分钟。并且，依据HPLC色谱图中计算各合成胜肽的锋面积可得出合成胜肽的纯度皆达95％以上。于此，可得到氨基酸序列为SEQ ID NO:6的合成胜肽。

同理，其余氨基酸序列(即，SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:5)亦依照前述流程，于步骤(1)后，重复上述步骤(2)至步骤(6)直到氨基酸接起形成对应的氨基酸序列。接着再进行步骤(7)至步骤(10)进行清洗、纯化以得到干净(纯度高达95％)的合成胜肽(即，SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:5)。

为进一步确认个别氨基酸序列对于细胞基因表现的影响，以人类纤维母细胞(CCD-966SK)与个别合成胜肽共同培养后分析细胞的基因表现。将6种合成胜肽分别进行细胞实验，且6种合成胜肽的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6。于图式中以序列编号SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6作为组别称呼，以便于说明。

(一)实验材料及实验组别

细胞基因表现测试是将人类纤维母细胞(购自食工所)与待测物(如胜肽或组合物)进行共培养后，再收取细胞内的RNA进行分析。请参阅表3，细胞基因表现测试的组别分为8组，其中6组为胜肽实验组(实验组A至实验组F)、1组为组合物实验组(实验组G)，以及1组为控制组。并且，每一个组别是与1X10⁵个人类纤维母细胞共培养于装有2毫升细胞培养基(X-VIVOTM 10)的细胞培养盘中。实验组A至实验组F分别对应6组各自加入范例三制成的6种合成胜肽(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQID NO:6)的6组胜肽实验组。实验组G为加入组合物的组合物实验组，且此组合物是经范例二鉴定出来的6种胜肽(即SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5及SEQ ID NO:6)的巴沙鱼的鱼皮胶原胜肽粉(购自Italgelatin,意大利)。控制组则不添加胜肽或组合物。

表3

(二)实验设计

胜肽实验组(对应实验组A至实验组F)是依照每一毫升细胞培养基中加入25微克(μg)合成胜肽的比例于37℃下培养人类纤维母细胞24小时、组合物实验组(对应实验组G)为每一毫升细胞培养基中加入100毫克(mg)的组合物的比例培养人类纤维母细胞24小时，而控制组不添加胜肽或组合物并以纯细胞培养基培养人类纤维母细胞24小时。接着，于培养24小时后，各组去除含有胜肽的细胞培养基或纯培养基，并以磷酸盐缓冲液(PBS)清洗各组细胞以去除残余的培养基。取下清洗后的细胞并以细胞裂解液(购自Geanaid公司，中国台湾)破细胞后，再以RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾)萃取各组细胞内的RNA，接着以cDNA合成试剂(购自Geneaid公司，中国台湾)将萃取后的RNA翻转录成cDNA，并以聚合酶连锁反应(PCR)仪器配合不同的引子(Primer)(如表4所示)观察细胞内基因表现。此外，引子先以SYBR green Dye绿色荧光染剂(Applied Biosystem)反应，并使用2-ΔΔCt方法进行基因定量。需要特别说明的是，图式中的基因表现以相对倍数、比率或百分比呈现，其中使用Excel软件的STDEV公式计算标准偏差，并在Excel软件中以单尾学生t检验(Student t-test)分析是否具有统计上的显著差异。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。

表4

(三)胜肽实验组对于抗老化基因的基因表现分析

首先，将6组胜肽实验组(即实验组A至实验组F)与控制组进行抗老化基因测试，如图1及表4所示。并且，肌肤的抗老化相关基因包括Atg8基因(Gene ID：11345)、CCT2基因(Gene ID：10576)、CCT5基因(Gene ID：22948)、CCT6A基因(Gene ID：908)、CCT7基因(GeneID：10574)、CCT8基因(Gene ID：10694)、Pink1基因(Gene ID：65018)、SIRT1基因(Gene ID：23411)及Ubl-5基因(Gene ID：59286)。

应理解，如表3所列，于图式中标示为SEQ ID NO:1的等同于下文中所示的实验组A，并以此类推，图式中标示为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5至SEQ ID NO:6分别对应等同于下文中标示的实验组A至实验组F。

研究发现当线虫的CCT2、CCT5、CCT6A、CCT7及CCT8基因对应的mRNA增加时，会使线虫的细胞回复成未分化的干细胞，进而延长线虫寿命。因此，当CCT2、CCT5、CCT6A、CCT7及CCT8基因的表现量增加时，代表细胞的抗老化能力增加。再者，研究发现当突变DNA累积于细胞时会加速细胞老化，而提升Atg8及Pink1基因的表现量，有利于清除突变的DNA。因此，当Atg8及Pink1基因的表现量提升，可使细胞保持年轻的状态。再者，研究发现SIRT1基因可启动粒线体的生合成并使细胞维持健康状态。研究发现动物实验证实Ubl-5基因可回复粒线体活性，使年老的小鼠回复年轻时的状态。

请参阅图1。将实验组A至实验组F及控制组制作的cDNA，分别以Atg8-F HAS2-F(SEQ ID NO:15)及Atg8-R(SEQ ID NO:16)分析细胞内的Atg8基因的表现、以CCT2-F(SEQID NO:17)及CCT2-R(SEQ ID NO:18)分析细胞内的CCT2基因的表现、以CCT5-F(SEQ ID NO:19)及CCT5-R(SEQ ID NO:20)分析细胞内的CCT5基因的表现、以CCT6A-F(SEQ ID NO:21)及CCT6A-R(SEQ ID NO:22)分析分析细胞内的CCT6A基因的表现、以CCT7-F(SEQ ID NO:23)及CCT7-R(SEQ ID NO:24)分析分析细胞内的CCT7基因的表现、以CCT8-F(SEQ ID NO:25)及CCT8-R(SEQ ID NO:26)分析分析细胞内的CCT8基因的表现、以Pink1-F(SEQ ID NO:27)及Pink1-R(SEQ ID NO:28)分析分析细胞内的Pink1基因的表现、以SIRT1-F(SEQ ID NO:29)及SIRT1-R(SEQ ID NO:30)分析分析细胞内的STIR1基因的表现，以及以Ubl-5-F(SEQ IDNO:31)及Ubl-5-R(SEQ ID NO:32)分析分析细胞内的Ubl-5基因的表现。实验发现，SEQ IDNO:5对应的实验组E及SEQ ID NO:6对应的实验组F，相较于控制组的抗老化基因有明显的提升，提升倍数如表5所示。

表5

由表5可知，实验组E及实验组F的抗老基因的基因表现量为控制组的抗老基因的基因表现量4至8倍。并且，当抗老基因的基因表现量上升时，代表胜肽具有抗老化的能力。由于实验组E及实验组F中所示的2种氨基酸序列(SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:6)皆具有提高抗老化基因的能力，因此以其中至少一种氨基酸序列制备的组合物亦可用以提高抗老化基因的表现。并且，所制备的组合物可用以改善毛孔、改善皱纹或其组合。

(四)组合物实验组对于胶原蛋白基因及玻尿酸合成酶基因的基因表现分析

接着，对组合物实验组(即实验组G)与控制组进行COL3A1基因(Gene ID：1281)、COL4A4基因(Gene ID：1286)、HAS2基因(Gene ID：3037)及HAS3基因(Gene ID：3038)的表现进行分析，如图3及图4所示。应理解，图3及图4所示的实验组代表组合物实验组(下称实验组G)。

COL3A1基因为第三型胶原蛋白的基因，而COL4A4基因为第四型胶原蛋白的基因，因此当二基因表现量提高时，代表对应的胶原蛋白含量提高。HAS2基因及HAS3基因为玻尿酸合成酶(Hyaluronan synthase)的基因，因此当二基因提升时，代表HAS含量提升，提高肌肤细胞间质抓水的能力，进而使肌肤含水量增加，达到保湿效果。

请参阅图3。将实验组G及控制组制作的cDNA，分别以COL3A1-F(SEQ ID NO:7)及COL3A1-R(SEQ ID NO:8)分析细胞内第三型胶原蛋白的基因表现，并以COL4A4-F(SEQ IDNO:9)及COL4A4-R(SEQ ID NO:10)分析细胞内第四型胶原蛋白的基因表现。实验发现，实验组G相对于控制组的比率为2，换言之，实验组G的第三型胶原蛋白及第四型胶原蛋白的基因表现为控制组的二倍。

请参阅图4。将实验组G及控制组制作的cDNA，分别以HAS2-F(SEQ ID NO:11)和HAS2-R(SEQ ID NO:12)、HAS3-F(SEQ ID NO:13)及HAS3-R(SEQ ID NO:14)的二组引子进行HAS蛋白质的基因表现的分析。实验发现，实验组G相对于控制组的比率大约在1.5至2.5之间。换言之，实验组G的HAS蛋白质基因表现高于控制组至少1.5倍。

于此，所制备的组合物可提升COL3A1基因、COL4A4基因、HAS2基因及HAS3基因的表现，并用以增加胶原蛋白含量、提升胶原蛋白密度、提升肌肤含水量，改善毛孔、改善皱纹或其组合。

接着，为进一步确认个别氨基酸序列对于细胞粒线体活性的影响，以人类纤维母细胞(CCD-966SK)与个别胜肽共同培养后分析细胞的粒线体活性。将6种合成胜肽分别进行细胞粒线体活性测试，且6种合成胜肽的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6。于图式中以序列编号SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6作为组别称呼，以便于说明。

(五)粒线体活性测试实验

粒线体活性测试是将人类纤维母细胞与待测物(如胜肽或组合物)进行共培养后，再以粒线体膜电位检测套组(含有JC-1粒线体染剂，购自BD)处理共培养后的细胞。粒线体活性测试的组别分为7组，其中6组为胜肽实验组，以及1组为控制组，如表6所示。

表6

应理解，实验组H至实验组M分别对应并等同于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6。

首先，每一个组别(实验组H至实验组M及控制组)是与1X10⁵个人类纤维母细胞共培养于装有2毫升细胞培养基(X-VIVOTM 10)的细胞培养盘中，接着依照表6中各组的待测物加入对应的培养盘中，并与人类纤维母细胞于37℃共培养24小时。控制组则以未添加胜肽的培养基于相同条件下共培养24小时。

再进行粒线体活性测试前，先配置JC-1粒线体染剂。首先，将10倍JC-1测定缓冲液以37℃预热后，以1倍磷酸盐缓冲溶液(PBS，购自Gibco)稀释为1倍JC-1测定缓冲液，并于混合均匀后保持在37℃。于干燥冷冻的JC-1试剂中加入130μl二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)以制备JC-1原液。接着，以1倍JC-1测定缓冲液将JC-1原液稀释为千分之一(1/1000)以制备JC-1工作液。

于共培养24小时后，去除培养盘内的细胞培养基，并以PBS润洗共培养后的细胞二次，以去处残留的细胞培养基。以胰蛋白酶将细胞从培养盘中切下并收集制1.5毫升的微量离心管中，以400xg离心5分钟，以形成初次上清液及初次细胞沉淀物。去除初次上清液后，以PBS重新悬浮初次细胞沉淀物形成初次细胞液并将其转移至1.5毫升离心管中。再次以400xg离心5分钟，以将初次细胞液分离为二次上清液及二次细胞沉淀物。接着，去除二次上清液后，加入100μl的JC-1工作液并与二次细胞沉淀物进行充分震荡混合形成二次细胞液，并避光室温培育二次细胞液15分钟。

于避光培育后，以400xg离心二次细胞液5分钟。接着重复以1倍JC-1测定缓冲液回溶及400xg离心5分钟二次以形成实验组H至实验组M的待测物。最后，将实验组H至实验组M的6组待测物及控制组的待测物以流式细胞仪(购自Beckman)进行粒线体活性测试分析，实验结果如图2所示。将结果以Excel软件的STDEV公式计算标准偏差，并在Excel软件中以单尾学生t检验(Student t-test)分析是否具有统计上的显著差异。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。

请参阅图2。实验发现SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6对应的实验组I至实验组M均提高细胞粒线体活性。举例来说，相对于控制组，SEQ ID NO:2提高32.7％粒线体活性、SEQ ID NO:3提高25.6％粒线体活性、SEQ ID NO:4提高32.9％粒线体活性、SEQ ID NO:5提高26.7％粒线体活性，以及SEQ ID NO:6提高68.9％粒线体活性。当粒线体活性提高时，可使细胞维持健康状态。因此，氨基酸序列为SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的胜肽皆可提高粒线体活性。因此，当组合物选用SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:6中至少一种或多种氨基酸序列的胜肽制备时，亦可提高粒线体活性。

因此，胜肽为SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:6中所示的至少一氨基酸序列时，所制备抗老化的组合物可提升细胞粒线体活性。并且，所制备的组合物可用以改善肌肤状态，如改善毛孔、改善皱纹或其组合。

为进一步确认以组合物对于人类肌肤的影响。以包括6种氨基酸序列(即SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:6的6种氨基酸序列)的胜肽制备组合物。并且，以下测试人体功效的实验所使用的组合物是经由范例一及范例二鉴定包含有6种氨基酸序列(即SEQ ID NO:1至SEQID NO:6)的胜肽的巴沙鱼的鱼皮胶原胜肽粉(购自Italgelatin,意大利)。

(六)实验组别与实验设计

透过受试者每日服用组合物或市售鱼胶原蛋白，并观察4周后，以仪器(VISIAComplexion Analysis(Canfield Scientific,Inc.,USA)及

Combo胶原蛋白探头仪器)观察受试者的肌肤状况(皱纹、肌肤含水量及胶原蛋白密度)，进而观察组合物或市售鱼胶原蛋白对于肌肤的影响。

受试者有13人，服用组合物的实验组(7人)及服用市售鱼胶原蛋白的对照组(6人)。并且，受试者须每日服用3g的组合物或市售鱼胶原蛋白并连续服用4周。此外，需要特别说明的是，所称「市售鱼胶原蛋白」并非以巴沙鱼的鱼皮制备。

(七)人体功效

测试结果以第0周及第4周的数值一起比较。第0周为测试前量测的数值，代表受试者所有人均未服用组合物市售鱼胶原蛋白前的肌肤状态。第4周为连续服用四周后的数值。需要说明的是，实验对应的图式中的肌肤状况是以相对百分比呈现，其中使用Excel软件的STDEV公式计算标准偏差，并在Excel软件中以单尾学生t检验(Student t-test)分析是否具有统计上的显著差异。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当p值小于0.05代表具有统计上的差异。

请参阅图5。实验发现对照组在连续服用4周的市售鱼胶原蛋白皱纹并未减少，而实验组在连续服用组合物后肌肤皱纹显著下降12.3％。于此，相较于对照组，服用实验组的组合物可有效改善皱纹(如，减少皱纹)。

此外，进一步比较实验组及对照组的数值，如毛孔百分比(如图6所示)、肌肤含水量百分比(如图7所示)以及肌肤胶原蛋白密度(如图8所示)。

请参阅图6，借由比较实验组的第0周及第4周的毛孔百分比，可发现实验组的数值从100％下降到83.3％，代表7位受试者的毛孔减少了16.7％。相反地，比较对照组的第0周及第4周的毛孔百分比时，发现数值从100％提高到108.9％，则代表6位受试者的毛孔百分比增加。于此，相较于对照组，服用实验组的组合物可有效改善毛孔(如，减少毛孔)。

请参阅图7，借由比较实验组的第0周及第4周的肌肤含水量百分比，可发现数值从100％提高到141.7％，代表7位受试者的肌肤含水量提高41.7％。相反地，比较对照组的第0周及第4周的肌肤含水量百分比时，则发现数值从100％提高到108.6％，则代表6位受试者的肌肤水分流失情形未有显著改善。

请参阅图8，借由比较实验组的第0周及第4周的胸部胶原蛋白密度百分比，可发现实验组的第4周的数值相较于第0周提高了5.4％，代表7位受试者的胸部胶原蛋白密度百分比提高。而比较对照组的第0周及第4周的胸部胶原蛋白密度百分比时，则发现其第4周的数值相较于第0周下降了0.9％。换言之，组合物改善肌肤胶原蛋白密度的效果较市售鱼胶原蛋白明显。于此，相较于对照组，服用实验组的组合物可有效提高胶原蛋白密度百分比。

于此，借由包含多个胜肽为SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一项的氨基酸序列的胜肽制备抗老化的组合物，此组合物可用以提高抗老化基因表现或/及提升粒线体活性。并且，当组合物以包括6种胜肽(氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6)的胜肽制备时，此组合物具有提升提升Atg8基因、CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、STIR1基因、Ubl-5基因、COL3A1基因、COL4A4基因、HAS2基因及HAS3基因中至少一项基因表现的能力。并且，以具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一氨基酸序列的胜肽所制备的组合物可具有下列至少一种功用：增加胶原蛋白含量、提升肌肤胶原蛋白密度、提高肌肤含水量、改善毛孔及改善皱纹。

综上，根据本发明任一实施例的作为生物活性物质的胜肽，其可制备抗老化的组合物，且胜肽包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一氨基酸序列。在一些实施例中，作为生物活性物质的胜肽可提升抗老化基因的表现及/或提升粒线体活性。在一些实施例中，作为生物活性物质的胜肽可用以提升Atg8基因、CCT2基因、CCT5基因、CCT6A基因、CCT7基因、CCT8基因、Pink1基因、STIR1基因、Ubl-5基因中至少一基因的表现及/或提升细胞粒线体活性。并且，所制备的组合物更可用于提升COL3A1基因、COL4A4基因、HAS2基因及HAS3基因中至少一基因的表现。并且，所制备的组合物具有抗老化、维持细胞健康的能力。并且，组合物更可用于增加胶原蛋白含量、提升肌肤胶原蛋白密度、提高肌肤含水量、改善毛孔或、改善皱纹或其组合。

虽然本发明的技术内容已经以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神所作些许之更动与润饰，皆应涵盖于本发明的范畴内，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。

【序列表】

<110>大江生医股份有限公司

<120>生物活性物质用于制备抗老化的组合物的用途

<130> N/A

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212>PRT

<213> Pangasius bocourti

<400> 1

Lys Gly Trp Pro Gly Thr Pro Gly

1 5

<210> 2

<211> 11

<212>PRT

<213> Pangasius bocourti

<400> 2

Pro Gly Ala Pro Gly Ser Ser Gly Pro Lys Gly

1 5 10

<210> 3

<211> 12

<212>PRT

<213> Pangasius bocourti

<400> 3

Val Ala Glu Gly Ala Gln Gly Asn Ile Gly Pro Ala

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212>PRT

<213> Pangasius bocourti

<400> 4

Pro Gly Pro His Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly Pro

1 5 10

<210> 5

<211> 9

<212>PRT

<213> Pangasius bocourti

<400> 5

Asp Lys Pro Leu Ile Pro Glu Gly Pro

1 5

<210> 6

<211> 12

<212>PRT

<213> Pangasius bocourti

<400> 6

Gly Pro Leu Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Leu Pro

1 5 10

<210> 7

<211> 21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>COL3A1-F

<400> 7

tggttgcacg gtaggaaaca t 21

<210> 8

<211> 20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>COL3A1-R

<400> 8

acagccttgc gtgttcgata 20

<210> 9

<211> 20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>COL4A4-F

<400> 9

ctgggtgctg tgtgttttga 20

<210> 10

<211> 20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>COL4A4-R

<400> 10

tgagtcttgt tttgccctgc 20

<210> 11

<211> 20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>HAS2-F

<400> 11

cggtgctcca aaaaggcaaa 20

<210> 12

<211> 20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>HAS2-R

<400> 12

acacaatgag ttgggcgaga 20

<210> 13

<211> 20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>HAS3-F

<400> 13

cacccatggg ggcttaactt 20

<210> 14

<211> 20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>HAS3-R

<400> 14

ctgcaggtcc cagttcacat 20

<210> 15

<211> 20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>Atg8-F

<400> 15

ccgcagtagg tggcaaagta 20

<210> 16

<211> 20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>Atg8-R

<400> 16

ggagtcggag aggattgctg 20

<210> 17

<211> 18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>CCT2-F

<400> 17

cactggtgcg attatttg 18

<210> 18

<211> 18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>CCT2-R

<400> 18

cccagcaaat atcagaag 18

<210> 19

<211> 19

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>CCT5-F

<400> 19

ataaatgtga ggctgaatc 19

<210> 20

<211> 18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>CCT5-R

<400> 20

acttgtcact tgtggcac 18

<210> 21

<211> 21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>CCT6A-F

<400> 21

tgtgtatctt aatccagact c 21

<210> 22

<211> 20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>CCT6A-R

<400> 22

cgtttcacct aagagttgtc 20

<210> 23

<211> 19

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>CCT7-F

<400> 23

gattggccat ttaagaaac 19

<210> 24

<211> 18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>CCT7-R

<400> 24

ccatacccaa acctaagc 18

<210> 25

<211>17

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>CCT8-F

<400>25

acccggaggt ggagcaa 17

<210> 26

<211> 25

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>CCT8-R

<400> 26

ggacatgtct ctccatatga tgtga 25

<210> 27

<211> 20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>Pink1-F

<400> 27

gtggaacatc tcggcaggtt 20

<210> 28

<211> 26

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>Pink1-R

<400> 28

cctctcttgg attttctgta agtgac 26

<210> 29

<211> 21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>SIRT1-F

<400> 29

tgctggccta atagagtggc a 21

<210> 30

<211> 20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>SIRT1-R

<400> 30

ctcagcgcca tggaaaatgt 20

<210> 31

<211> 20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>Ubl-5-F

<400> 31

cctcttcctc gttctaccgc 20

<210> 32

<211> 20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220> primer

<223>Ubl-5-R

<400> 32

ctagctggag ctcgaatcgc 20

Claims

1.一种生物活性物质用于制备抗老化的组合物的用途，其中生物活性物质为胜肽，该胜肽包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一氨基酸序列，其中各该氨基酸序列为鱼皮的胜肽片段。

2.如权利要求1所述的用途，其中该组合物包括用以提升至少一抗老化基因的该胜肽，该至少一抗老化基因包括Atg8、CCT2、CCT5、CCT6A、CCT7、CCT8、Pink1、STIR1及Ubl-5中至少一项基因，且该组合物用以提高肌肤抗老化的功能；其中，提升该抗老化基因的表现的该胜肽包括该SEQ ID NO:5及该SEQ ID NO:5中所示的该至少一氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的用途，其中该组合物包括用以提升细胞粒线体活性的该胜肽，该胜肽包括该SEQ ID NO:2至该SEQ ID NO:5中所示的该至少一氨基酸序列，且该组合物用以提高细胞粒线体活性及维持细胞健康状况。

4.如权利要求1所述的用途，其中该组合物包括用以调节至少一基因的该胜肽，该至少一基因包括COL3A1、COL4A4、HAS2及HAS3基因中至少一项基因，且该组合物用以增加胶原蛋白密度、增加肌肤含水量、改善毛孔、改善皱纹或其组合。

5.如权利要求1所述的用途，其中该鱼皮为巴沙鱼鱼皮。

6.如权利要求1所述的用途，其中该鱼皮的胜肽片段的来源包括鱼皮细胞、鱼皮胶原蛋白或鱼肉细胞。