TW201321509A - 靶定ｐｐ１－８７ｂ且賦予對鞘翅目害蟲抗性之核酸分子 - Google Patents

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Abstract

此揭露內容關係核酸分子及使用其等用於控制鞘翅目害蟲的方法，該者係透過RNA干擾-媒介之靶定編碼與轉錄的非編碼序列在鞘翅目害蟲中之抑制。本揭露內容亦關係用於製造基因轉殖植物的方法，該植物表現對控制鞘翅目害蟲有用的核酸分子，且關係由此獲得之該植物細胞與植物。

Description

靶定PP1-87B且賦予對鞘翅目害蟲抗性之核酸分子 相關申請案
此申請案對2011年10月6日提申之美國專利臨時申請案第61/544,211號主張優先權。
發明領域
本發明一般地有關於由鞘翅目害蟲造成的植物損害之基因控制。在特定實施例中，本發明有關於辨識靶定的編碼與非編碼序列，及使用重組DNA技術用於轉錄後壓制或抑制靶定的編碼與非編碼序列在鞘翅目害蟲細胞中的表現，以提供一植物保護效果。
發明背景
西方玉米根蟲(WCR)，Diabrotica virgifera virgifera LeConte，係為北美最具破壞性的玉米根蟲物種之一，且在美國中西方的玉米種植區係為一特別關注。北方玉米根蟲(NCR)，Diabrotica barberi Smith and Lawrence，係為一密切相關的物種，該者共棲於WCR許多相同的範圍。還有其他數種相關的葉甲類(Diabrotica)亞種在北美係為重大的害蟲：墨西哥玉米根蟲(MCR)，D.virgifera zeae Krysan and Smith；南方玉米根蟲(SCR)，D.undecimpunctata howardi Barber；巴西玉米根蟲(D.balteata LeConte)；D.undecimpunctata tenella；及黃瓜十一星葉甲(D.u.undecimpunctata Mannerheim)。美國農業部目前估計玉米根 蟲每年造成10億美元歲入損失，包括8億美元的產量損失及2億美元的處理費用。
WCR與NCR於夏季期間兩者皆以卵沈積在土壤中。貫穿冬季該等昆蟲依舊在卵的階段。這些卵係為橢圓形、白色，且長度小於0.004英吋。幼蟲在五月底或六月初孵化，卵孵化的精確時程歸因於溫度差異與位置每一年相異的。該初孵化幼蟲係為長度小於0.125英吋的白色蟲子。一旦孵化，幼蟲開始取食玉米根。玉米根蟲歷經3個幼蟲齡期。在取食數周之後，幼蟲蛻皮進入蛹的階段。它們在土壤中成蛹，且然後在七月與八月時以成蟲從土壤中出現。成蟲根蟲長度係為約0.25英吋。
玉米根蟲幼蟲在玉米與其他數種禾草物種上完成發育。在黃色狐尾草上飼養的幼蟲出現的較晚，且較諸於在玉米上飼養的幼蟲，成蟲具有一較小的頭殼尺寸。Ellsbury等人之“(2005)Environ.Entomol.34：627-34”。WCR成蟲取食玉米鬚(corn silk)、花粉及在暴露穗尖(ear tips)上的玉米粒。假若WCR成蟲在玉米生殖組織存在前出現，它們可能會取食葉組織，從而減緩植物生長，且偶爾會殺死該寄主植物。然而，成蟲將會迅速搬移到首選的鬚與花粉，當它們變得可用時。NCR成蟲亦取食玉米植株的生殖組織，但相反地，很少取食玉米葉。
在玉米中，大部分根蟲損害係由幼蟲取食造成。剛孵化的根蟲最初取食纖細的玉米根毛並鑽入根尖。當幼蟲變得更大時，它們取食並鑽入主根。當玉米根蟲大 量時，幼蟲取食常常引致根的削減，一直到玉米莖的基部。嚴重的根傷干擾了根部輸送水分與養分到植株的能力，降低植物的生長，並引致降低的穀粒生產，從而常常大大降低了整體產量。嚴重的根傷亦常常引致玉米植株的倒伏，這使得收割更為困難，並進一步減低產量。更進一步，成蟲在玉米生殖組織上的取食可以引致鬚在穗尖的消減。假若此種“鬚修剪(silk clipping)”在散粉期間係足夠嚴重的，授粉可能被中斷。
玉米根蟲的控制可能嘗試的，該者係藉由作物輪作、化學殺蟲劑、生物農藥(例如，形成孢子的革蘭氏陽性菌，蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis))，或其等之一組合。作物輪作在耕地使用上遭受到放置非所欲限定的顯著缺點。再者，一些根蟲物種的產卵可能會發生在大豆田間，從而緩解以玉米及大豆實行輪作的有效性。
化學殺蟲劑係為實現玉米根蟲控制最嚴重依賴的策略。儘管如此，化學殺蟲劑的使用係為一不完美的玉米根蟲控制策略；在美國每年因玉米根蟲可能損失超過10億美元，當化學殺蟲劑的成本係添加至可能發生的玉米根蟲損害費用時，儘管使用了殺蟲劑。高族群的幼蟲、暴雨及殺蟲劑(等)的不當施用全部可能引致不足的玉米根蟲控制。更進一步，持續使用殺蟲劑可能選擇抗殺蟲劑的根蟲種系，以及提昇顯著的環境關注，歸因於它們中許多對非標靶物種的毒性。
RNA干擾(RNAi)係為利用內源性細胞途徑之一 方法，憑此，對一靶定基因序列之適當大小的全部或任何部分係為特異性的一干擾RNA(iRNA)分子(例如，一dsRNA分子)引致從而編碼之mRNA的降解。近年來，RNAi在許多物種與實驗系統中已被使用於執行基因“抑制(knockdown)”；舉例而言，秀麗隱桿線蟲(Caenorhabitis elegans)、植物、昆蟲胚胎及組織培養中的細胞。參閱，例如，Fire等人之“(1998)Nature 391：806-11”；Martinez等人之“(2002)Cell 110：563-74；McManus及Sharp之”(2002)Nature Rev.Genetics 3：737-47”。
RNAi透過包括該DICER蛋白複合體的內源性途徑達到mRNA降解。DICER切割長的dsRNA分子為大約20個核苷酸的短片段，命名為小的干擾RNA(siRNA)。該siRNA係解開成兩個單股RNA：過客股及引導股。該過客股係降解的，而該引導股係併入該RNA誘導的沈默複合體(RISC)。微抑制核糖體核酸(miRNA)分子可能類似地併入RISC。當該引導股特異性地結合至mRNA分子的一互補序列且誘導藉由Argonaute之切割時，Argonaute為該RISC複合體的催化劑組件，轉錄後基因沈默發生。此過程已知係貫穿生物體系統性散布地，儘管在某些真核生物，諸如植物、線蟲及一些昆蟲中siRNA及/或miRNA初始臨界濃度。
僅有互補於該siRNA及/或miRNA的轉錄體係切割與降解的，且因此該mRNA表現的抑制(knockdown)係為序列特異性。在植物中，DICER基因存在著數種的官能團。該RNAi的基因沈默效應存留數天且，在實驗條件下，可以 導致該靶定轉錄體的豐度下降90%或更多，伴隨隨後在該相應蛋白質水平中的降低。
美國專利第7,612,194號及美國專利公開案第2007/0050860號與第2010/0192265號，揭露了從西方玉米根蟲之蛹分離出的9112表現序列標籤(EST)的序列庫。在美國專利第7,612,194號及美國專利公開案第2007/0050860號中，其係建議操縱地鏈接一啟動子至一核酸分子，該核酸分子係互補於於此揭露的西方玉米根蟲液泡型H+-ATPase(V-ATPase)的數個特定的部分序列之一者，用於在植物細胞中表現反義RNA。美國專利公開案第2010/0192265號建議操縱地鏈接一啟動子至一核酸分子，該核酸分子係互補於西方玉米根蟲未知且未揭露功能基因之一特定的部分序列(該部分序列係聲明為58%相似於秀麗隱桿線蟲中C56C10.3的基因產物)，用於在植物細胞中表現反義RNA。
在這些公開案中，除了V-ATPase之數個特定的部分序列及該未知功能之基因的特定部分序列之外，使用在其中列出超過9000序列之任何特定序列用於RNA干擾係沒有進一步建議提供的。更進一步，美國專利第7,612,194號與美國專利公開案2007/0050860號與第2010/0192265號對該所提供超過9000序列在玉米根蟲物種中使用做為dsRNA或siRNA時，那一者將為致命的，或甚至是有用的，係沒有提供任何引導。當使用做為dsRNA或siRNA時，這些序列在玉米根蟲物種中絕大多數為非致命的。舉例而言， Baum等人之“(2007)Nat.Biotech.25(11)：1322-6”，描述由RNAi靶定之數個WCR基因的抑制效果。這些作者記錄的是，26個他們測試的靶定基因中，8個在超過520 ng/cm2之一非常高的iRNA(例如，dsRNA)濃度時，係不能夠提供實驗顯著的鞘翅目害蟲死亡率。
發明概要
於此揭露的係為核酸分子(例如，靶定基因、DNAs、dsRNAs、siRNAs、miRNAs及hpRNAs)及其等的使用方法，用於控制鞘翅目害蟲，包括，舉例而言，D.v.virgifera LeConte(西方玉米根蟲，“WCR”)；D.barberi Smith and Lawrence(北方玉米根蟲，“NCR”)；D.u.howardi Barber(南方玉米根蟲，“SCR”)；D.v.zeae Krysan and Smith(墨西哥玉米根蟲，“MCR”)；巴西玉米根蟲(D.balteata LeConte)；D.u.tenella；及黃瓜十一星葉甲(D.u.undecimpunctata Mannerheim)。在特定例子中，示範性的核酸分子係揭露的，該者可能同源於在一鞘翅目害蟲中一或多個原生核酸序列之至少一部分。
在這些及進一步例子中，該原生核酸序列可能為一標靶基因，該者之產物可能，舉例而言但不限於：涉及代謝過程；涉及生殖過程；或涉及幼蟲發育。在一些例子中，藉由包含同源於其等之一序列的核酸分子，轉譯後抑制一靶定基因在鞘翅目害蟲中的表現可能為致命的，或引致降低的生長及/或生殖。在具體例子中，至少一基因可 能選做為用於轉錄後沈默之一靶定基因，其中該基因係選自由以下所組成之該名單：PP1-87B的全長(於此有時稱為“PP1-87B”)；片段重疊群(contig)0011_87B蛋白磷酸酶；RPA70全長(於此有時稱為“RPA70”)；D_vir_c43870_RPA70(於此有時稱為“RPA70區域1”或“RPA70 Reg1”)；D_vir_c18764_RPA70(於此有時稱為“RPA70區域2”或“RPA70 Reg2”)；D_vir_c7971_RPA70(於此有時稱為“RPA70區域3”或“RPA70 Reg3”)；及RPS6。在特定例子中，一有用的轉錄後抑制靶定基因係為於此稱為PP1-87B之該基因，該基因包含新的靶定序列。一種分離的核酸分子所以係於此揭露的，其包含選自由以下所組成該群組之一核苷酸序列：片段重疊群0011_87B蛋白磷酸酶(序列辨識編號：3)；片段重疊群0011_87B蛋白磷酸酶(序列辨識編號：3)的互補體；及前述任一者之片段。
亦揭露的係為核酸分子其包含編碼一多肽之一核苷酸序列，該多肽係至少85%相似於一靶定基因產物(舉例而言，一基因產物其選自由以下所組成之群組：PP1-87B；片段重疊群0011_87B蛋白磷酸酶；RPA70；RPA70 Reg1；RPA70 Reg2；RPA70 Reg3；及RPS6)之內的胺基酸序列。舉例而言，一核酸分子可能包含編碼一多肽之一核苷酸序列，該多肽係至少85%相似於選自由以下所組成之該群組的胺基酸序列：序列辨識編號：67(PP1-87B)；序列辨識編號：95(片段重疊群0011_87B蛋白磷酸酶)；序列辨識編號：68(RPA70)；序列辨識編號：96(RPA70 Reg1)； 序列辨識編號：97(RPA70 Reg2)；序列辨識編號：98(RPA70 Reg3)；及序列辨識編號：69(RPS6)。在特定例子中，一核酸分子包含編碼一多肽之一核苷酸序列，其中該多肽係至少85%相似於PP1-87B產物之內的胺基酸序列。進一步揭露的係為包含一核苷酸序列之核酸分子，其中該核苷酸序列係為編碼一多肽之一核苷酸序列的反向互補體，其中該多肽係至少85%相似於一靶定基因產物內的胺基酸序列。
亦揭露的係為可能使用於生成iRNA(例如，dsRNA、siRNA、miRNA及hpRNA)分子的cDNA序列，其中該iRNA係互補於一鞘翅目害蟲靶定基因的全部或部分，舉例而言：PP1-87B；RPA70；RPA70 Reg1；RPA70 Reg2；RPA70 Reg3；及/或RPS6。在特定實施例中，dsRNAs、siRNAs、miRNAs及/或hpRNAs可能藉由一基因改造生物體，諸如植物或細菌，在體外或體內製造的。在特定例子中，可能使用以製造互補於片段重疊群0011_87B蛋白磷酸酶(序列辨識編號：3)全部或部分的iRNA分子之cDNA分子係揭露的。
進一步揭露的係為用於抑制鞘翅目害蟲中一必要基因表現的手段，及用於提供鞘翅目害蟲抗性到一植物的手段。用於抑制鞘翅目害蟲中一必要基因表現的手段係為由序列辨識編號：25-28任一者，或其等之互補體，組成之一單股或雙股RNA分子。用於抑制鞘翅目害蟲中一必要基因表現的手段的功能等同物包括單股或雙股RNA分子其本質上同源於包含序列辨識編號：3、5、6及7任一者之WCR 基因的全部或部分。用於提供鞘翅目害蟲抗性到一植物的手段係為一DNA分子，該DNA分子包含操縱地鏈接至一啟動子之一核酸序列其編碼用於抑制在一鞘翅目害蟲中一必要基因表現的工具，其中該DNA分子係能夠併入到玉米植株之基因組中。
用於控制一鞘翅目害蟲族群之方法係揭露的，該方法包含提供一iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA及hpRNA)分子至一鞘翅目害蟲，該iRNA一旦被鞘翅目害蟲攝取時，作用以抑制該鞘翅目害蟲內的生物功能，其中該iRNA分子包含全部或部分的核苷酸序列其選自由以下所組成之群組：序列辨識編號：1；序列辨識編號：1之互補體；序列辨識編號：2；序列辨識編號：2之互補體；序列辨識編號：3；序列辨識編號：3之互補體；序列辨識編號：4；序列辨識編號：4之互補體；序列辨識編號：5；序列辨識編號：5之互補體；序列辨識編號：6；序列辨識編號：6之互補體；序列辨識編號：7；序列辨識編號：7之互補體；葉甲類生物(例如WCR)包含序列辨識編號：1-7任一者全部或部分之一原生編碼序列；葉甲類生物包含序列辨識編號：1-7任一者全部或部分之一原生編碼序列的互補體；葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：1-7任一者全部或部分的一原生RNA分子的原生非編碼序列；及葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：1-7任一者全部或部分之一原生RNA分子的原生非編碼序列的互補體。
在特定的例子中，用於控制一鞘翅目害蟲族群 之方法係揭露的，該方法包含提供一iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA及hpRNA)分子至一鞘翅目害蟲，該iRNA一旦被鞘翅目害蟲攝取，作用以抑制該鞘翅目害蟲內的生物功能，其中該iRNA分子包含一核苷酸序列其選自由以下所組成之群組：全部或部分的序列辨識編號：1；全部或部分的序列辨識編號：1之互補體；全部或部分的序列辨識編號：2；全部或部分的序列辨識編號：2之互補體；全部或部分的序列辨識編號：7；全部或部分的序列辨識編號：7之互補體；葉甲類生物(例如WCR)包含序列辨識編號：1之一原生編碼序列的全部或部分；葉甲類生物包含序列辨識編號：1之一原生編碼序列的全部或部分互補體；葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：1之一原生RNA分子的全部或部分原生非編碼序列；葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：1之一原生RNA分子的全部或部分原生非編碼序列的互補體；葉甲類生物(例如WCR)包含序列辨識編號：2之一原生編碼序列的全部或部分；葉甲類生物包含序列辨識編號：2之一原生編碼序列的全部或部分互補體；葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：2之一原生RNA分子的全部或部分原生非編碼序列；葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：2之一原生RNA分子的全部或部分原生非編碼序列的互補體；葉甲類生物(例如WCR)包含序列辨識編號：7之一原生編碼序列的全部或部分；葉甲類生物包含序列辨識編號：7之一原生編碼序列的全部或部分互補體；葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：7之一原生RNA分子的全部或部 分原生非編碼序列；及葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：7之一原生RNA分子的全部或部分原生非編碼序列的互補體。
於此亦揭露的方法係為在其中dsRNAs、siRNAs、miRNAs及/或hpRNAs可能在一飲食為基礎的檢測中提供到一鞘翅目害蟲，或在表現dsRNAs、siRNAs、miRNAs及/或hpRNAs的基因改造植物細胞中。在這些及進一步例子中，該dsRNAs、siRNAs、miRNAs及/或hpRNAs可能由鞘翅目害蟲幼蟲攝入的。攝入本發明的dsRNAs、siRNAs、miRNAs及/或hpRNAs然後可能引致該幼蟲中的RNAi，該者轉而可能引致對該鞘翅目害蟲活力之一必要基因的沈默，並最終導致幼蟲死亡率。因此，方法係揭露的，其中包含對鞘翅目害蟲控制有用之示範性核酸序列(等)的核酸分子係提供至一鞘翅目害蟲。在特定例子中，藉由使用本發明之核酸分子而控制的鞘翅目害蟲可能為WCR或NCR。
前述及其它特徵從下列數個實施例的詳細說明，該者藉由參照至該等伴隨圖式而著手，將變得更為明顯。
圖1包括使用以提供用於dsRNA製造之特定模板之策略的敘述。
圖2包括以靶定PP1-87B、RPA70 Reg1及RPA70 Reg2之示範性核酸分子處理之示範性鞘翅目害蟲(意即西 方玉米根蟲幼蟲)的死亡率百分比變異圖。
圖3包括以靶定RPS6之示範性核酸分子處理之示範性鞘翅目害蟲(意即西方玉米根蟲幼蟲)的死亡率百分比變異圖。
圖4包括以靶定PP1-87B、RPA70 Reg1及RPA70 Reg2之示範性核酸分子處理之示範性鞘翅目害蟲(意即西方玉米根蟲幼蟲)的生長抑制(GI)變異圖。
圖5包括以靶定RPS6之示範性核酸分子處理之示範性鞘翅目害蟲(意即西方玉米根蟲幼蟲)的生長抑制(GI)變異圖。
圖6提供由示範性鞘翅目害蟲(意即，西方玉米根蟲幼蟲)取食在T1溫室植物根上造成之根取食損害的變異圖，該T1溫室植物源自包含一PP1-87B髮夾dsRNA構建體的事件，及源自包含一RPS6髮夾dsRNA的其他事件。
圖7包括由示範性鞘翅目害蟲(意即，西方玉米根蟲幼蟲)取食在T1溫室植物根上造成之根取食損害的變異數分析(ANOVA)總結，該T1溫室植物源自包含一RPA70髮夾dsRNA構建體的事件。
較佳實施例之詳細說明 序列表
在該等伴隨序列表中列出的該核酸序列係使用核苷酸鹼基的標準字母縮寫顯示，如在37 C.F.R.§ 1.822中所界定者。每一核酸序列僅有一股係顯示的，但該互補股 藉由參照至該展現股係如含括般不言而明的。由於一初級核酸序列之互補體及反向互補體必定由該初級序列所揭露，一核酸序列之互補序列與反向互補序列藉由參照至該核酸序列係為含括的，除非其係另有明確聲明(或其從序列出現之上下文中係為清楚的)。在該等伴隨序列表中：序列辨識編號：1顯示一示範性葉甲類cDNA序列，稱為蛋白磷酸酶PP1-87B(全長)：CGCAAAAAAGTGTTGTTTGGTTTGTAGTTAAAAGGCTCTGTAAAAATCATTAAAAATCCGAGCCATCTTTTAGTTTTAAGTTTCTTAAATATTGTCAAAGAGTATCACAAGGATTTCTCAAATGGCAGAAGCAGATAAATTGAATATCGACAGTATAATAGCCCGTTTATTAGAAGTGCGTGGAGCAAGACCAGGCAAAAATGTACAACTCACAGAAAATGAAATTAGGGGGCTCTGTTTAAAATCTAGAGAGATCTTCCTTAGCCAGCCGATTTTGTTGGAACTTGAAGCTCCTCTGAAGATTTGCGGTGATATACATGGTCAGTACTATGACTTGCTTCGTCTCTTTGAATATGGAGGTTTCCCTCCCGAATCAAACTACTTATTTTTGGGAGATTATGTAGATCGTGGTAAACAATCATTGGAAACCATCTGCTTACTTCTCGCTTACAAAATTAAATACCCAGAAAACTTTTTCCTACTCAGAGGCAACCACGAATGCGCATCAATTAATCGTATATATGGATTCTATGATGAATGCAAAAGAAGGTATAACATCAAGTTGTGGAAAACTTTTACGGACTGTTTCAATTGCCTACCTGTAGCAGCCATCGTCGATGAAAAAATTTTCTGTTGCCATGGTGGTTTAAGTCC GGACCTACAATCAATGGAACAAATTAGAAGAATTATGAGACCGACTGATGTACCTGACCAAGGGCTTCTTTGTGACCTTTTATGGTCTGATCCAGACAAAGACCAGATGGGATGGGGAGAAAACGATAGAGGAGTTAGTTTTACTTTTGGTGCTGAAGTTGTAGGAAAGTTCTTGCACAAACACGATTTTGATTTGATATGTCGAGCGCATCAAGTCGTAGAAGATGGATATGAATTCTTCGCCAAAAGACAGTTAGTCACACTGTTTAGTGCGCCAAATTATTGTGGAGAGTTTGATAACGCAGGTGCGATGATGTCGGTGGATGAGACACTAATGTGTAGTTTTCAAATTTTAAAGCCAGCAGACAAGAGGAAATTCCAGTACAACATGAACGCAGGCAGACCTGTGACGCCGCCAAGAGGCGCAACGAATAAAAACAAGAAGAAGTGAATGAATAATATATTTATAAGGTTAGGTTTAGTCGCAACATAAACATGTTCAAAACATTTTAAATACTAAAATTTTCTAAAGGTTACAAAGATTCAAGATAAATTAAGATTTTCTTCATGTTTTTGTTGGTTGTTTTATAGGTTAGGATAGTAAACTATATAATAATAAAGTTCTCAATATTGTTAAAAAGAAGTGAATGTTAGTATTTAAAATGTTCGATTATTTCGGCCGTTTTACTTTATTTTATATCTGATATTACTAGAAAAGGGTGATATC TATGAACCCAGACAACTAAACGTTCGATTTGAACAAATGAAAATTTATTGAAAACATTAATCCTCACAACCTTGCTTATTTAATTAAAGAACAAGATCAGTAATACATTAAAGTCTATCATTAATAA
序列辨識編號：2顯示一示範性葉甲類cDNA序 列，稱為RPA70全長)：CAAAGGTTTCGTTTCAAACTTCACACCGATAAAGACTTGTTTGTTCTTGTCAGTGTCAGTTCTGGCGGTAAAATATTTGCGGTATACACATTTTTTACGTCGTACGTAATTTGCAGGGGTTGATTACTGATCTTTATTTGATAATTTGTTTATTTATTTTGCAACATAAGCAAAATGCGTTCGCCTCAAACCTATAACATGTCAGAAGGATCACTCCAGACAATCATGTCTGGAGGTGAATTTCCAAATCCCATTATGCAAGTTTTGGGTAGCAAAAAGATAAACGCCGGATTGGGTGATAAAGAAAGAATTCGTATTTTACTGTCAGATGGAAAATACACTATTTCTTTTGCCATGCTAACAGCCCAAATTAATGATCGACTTGGTCCAAATGGTGTGGAAACTTTTAGCATTATACAAATAGATAGATATGTTACGAGTATCATCAACAATTCTGGGAAAGGAGAAGCACGAGTACTTTTAATCCTCGATATGCATGTTGTTGTCCCTGGAACTGAAGTTACAGAAAAAGTAGGCTCTCCCATTCCCCTACCAACTGATGCTGACGCAGCTAAAGGCTCTACTGCCGCTCCAGCTACAAACAATTCCATTAAGAATGTAACTGTTGCTAAACCAAACATCAGTAATGGCAATGGCACAACTGCAATGAATGCCAGTACTAATGATGATATAGCCACACATATGATCCATCCTATTTCAAGTCTCACACCTTACCAAAACAGATGGACTATCAAAGCGAGAATTACTAATAAACCTCCAATAAGAACGTGGTCAAATTCTAGAGGGGAAGGAAAATTATTTAGTTTTGATCTGGTGGATGAAAGTGGCGAAATCCGTTGCACAGCTTTTAAAGAAATGGTTGATA AATTCTATGATTACCTGCAGGTGGATAAAGTATATTACATCAACAAATGTCAACTTAAACAAGCCAACAAACAGTACAGCACTCTAAAACATGAGTATGAAATGACTGTTACGCATGATACTGTCATTAAAGAATGCCTTGATGCAGATTCTACAATACCCACCACACAGTATAACTTTGTTCCTATAGATAAAATTGCTGATAAAGAAGTAAATTCTGTTGTAGATGTAATAGGTATTGCCAAAAGTGTCAGTGAATTACAAACATTCCAAGCAAGATCAACAGGAAGAGAATTGAAAAAGAAAGAAGTTGTCTTGGTTGATCAGTCACAAACAGCTATATCGTTAACACTTTGGGGCCAAGAAGCCGAAAATTTTGATGGTACCAATAATCCTGTCGTAGTTATAAAAAGTGCCAAAATTGGCGAGTTTGGAGGTGGCAAGAATTTAACTACTCTTGTTAGCAGCACTGTAAAAATAAATCCCGAATTAAAAGAATGTTACAGGATCAGAGGATGGTACGACAGTGAGGGTGAAAATCTGAATGCAAAGAATATTAGTGCCAGAGTTGGATCCTCGAATATGTCTGCCACTTGGATGACCTTTAAGGAAGTTAAAGATCAAAAATTAGGATCATCTGAAAAAGGTGATTATTATAAAGCTATTGCTACTGTTCTTCTTGTCAAAGCCGATAATATTGTGTATAGAGCTTGTCCCACCGCTGAATGTAATAAGAAAGTTGTTGATATGGAAAATAGTATGTACAGATGTGAAAAATGTAATAGAGAATTTCCAAATTTCAAATACAGACTGTTAGCCAGCATGAATGTTGGAGACCACACAGGAAACCAATGGGTTAGCATGTTCAGTTCAGAAGCCGAAAAAATTCTGGGGATGACTGCTGAGGAAGTAGGACAGA CCTTGGAACACAATAAAGAAGAAATAGCCAACATCGTAGATAGAGCTCATTTTAAAGTATTTAGTCTTACTTGCAGGGCAAAAATTGAGACTTACAATGATGAAGCTCGTTTAAAAACTGTTTGTATAAGAGTCGATCCAATTAATTATGAGGAGTATAGTGCATTGCTCACAGAAAAAATTCAGCAGTTAACAGGCGAATCTCATGATTAGATATACACCAACACTACAGCTATGCTATTATTTCTAGTTCTTTTTTTTTTTAGAAAATATCGTTAAGAAATCTGTGTTTTGTATTTATTTTTTATAAACAGTGAATCAGTGAATAAGATTTTATTAGAAAGGTACTGTATAAATAAAAATCTGTATGTTCACAATATTTTTATTTATTTAAATATACATTGGTACAAAATAAAATATATATTCGTAACAACTATATTATTGTTTATTATTGTTTATTCTTAAGCCCCATCATCTAAAGAGGTTCTAAATGTGCTTGTTTTCTTGCATACGCACCTAAACAAGCTAAAATTAGTATTACACTCATAAATAATCCTATTAATAAGGCTAAAGTATCTCCAAAATCAAACATTTTGCTGTATTATTGAGTGTTTAAATAATTACATCAAAATAAAATATTTTTTATTTTTTGCTTGTCTTGTATGTTTATTTACGTTTTACTTGTCAATCAGCTGTCTATTTCTTCTTTTTAATTA
序列辨識編號：3：顯示一示範性葉甲類cDNA序列，在一些地方稱為片段重疊群0011_PP1-87B：AATTCAAGCTGCCGCAAAAAAGTGTTGTTTGGTTTGTAGTTAAAAGGCTCTGTAAAAATCATTAAAAATCCGAGCCATCTTTTAGTTTTAAGTTTCTTAAATATTGTCAAAGAGTA TCACAAGGATTTCTCAAATGGCAGAAGCAGATAAATTGAATATCGACAGTATAATAGCCCGTTTATTAGAAGTGCGTGGAGCAAGACCAGGCAAAAATGTACAACTCACAGAAAATGAAATTAGGGGGCTCTGTTTAAAATCTAGAGAGATCTTCCTTAGCCAGCCGATTTTGTTGGAACTTGAAGCTCCTCTGAAGATTTGCGGTGATATACATGGTCAGTACTATGACTTGCTTCGTCTCTTTGAATATGGAGGTTTCCCTCCCGAATCAAACTACTTATTTTTGGGAGATTATGTAGATCGTGGTAAACAATCATTGGAAACCATCTGCTTACTTCTCGCTTACAAAATTAAATACCCAGAAAACTTTTTCCTACTCAGAGGCAACCACGAATGCGCATCAATTAATCGTATATATGGATTCTATGATGAATGCAAAAGAAGGTATAACATCAAGTTGTGGAAAACTTTTACGGACTGTTTCAATTGCCTACCTGTAGCAGCCATCGTCGATGAAAAAATTTTCTGTTGCCATGGTGGTTTAAGTCCGGACCTACAATCAATGGAACAAATTAGAAGRATTAATAGAGACCGACTGATGTACCTGACCAAGGSTTTCTTTGTGACCTTTTANGGTCTGATCCAGACAAAGACC
序列辨識編號：4：顯示一示範性葉甲類cDNA序列，在一些地方稱為D_vir_c43870_RPA70、RPA70區域1或RPA70 Reg1：ATAATTTGCAGGGGTTGATTACTGATCTTTATTTGATTAATTTGTTTATTTATTTTTGCAACATAAGCAAAATGCGTTCGCCTCAAACCTATAACATGTCAGAAGGATCACTCCAGA CAATCATGTCTGGAGGTGAATTTCCAAATCCCATTATGCAAGTTTTGGGTAGCAAAAAGATAAACGCCGGATTGGGTGATAAAGAAAGAATTCGTATTTTACTGTCAGATGGAAAATACACTATTTCTTTTGCCATGCTAACAGCCCAAATTAATGATCGACTTGGTCCAAATGGTGTGGAAACTTTTTAGCATTATACAAATAGATAGATATGTTACGAGTATCATCAACAATTCTGGGAAAGGAGAAGCACGAGTACTTTTAATCCTCGATATGCATGTTGTTGTCCCTGGAACTGAAGTTACAGAAAAAGTAGGCTCTCCCATTCCCCTACCAACTGATGCTGACKCAGCTAAAGGCTCTACTGCCGCTCCAGCTACAAACAATTCCATTAAGAATGTAACTGTTGCTAAACCAAACATCAGTAATGGCAATGGCACAACTGCAATGAATGCCAGTACTAATGATGATATAGCCACACATATGATCCATCCTATTTCAAGTCTCACACCTTA
序列辨識編號：5顯示一示範性葉甲類cDNA序列，在一些地方稱為D_vir_c18764_RPA70、RPA70區域2或RPA70 Reg2：ATGGTCAAATTCTAGAGGGGAAGGAAAATTATTTAGTTTTGATCTGGTGGATGAAAGTGGCGAAATCCGTTGCACAGCTTTTAAAGAAATGGTTGATAAWTTCTATGATTACCTGCAGGTGGATAAAGTATATTACATCAACAAATGTCAACTTAAACAAGCCAACAAACAGTACAGCACTCTAAAACATGAGTATGAAATGACTGTTACGCATGATACTGTCATTAAAGAATGCCTTGATGCAGATTCTACAATACCCACCACACAGT ATAACTTTGTTCCTATAGATAAAATTGCTGATAAAGAAGTAAATTCTGTTGTAGATGTAATAGGTATTGCCAAAAGTGTCAGTGAATTACAAACATTCCAAGCAAGATCAACAGGAAGAGAATTGAAAAAGAAAGAAGTTGTCTTGGTTGATCAGTCACAAACAGCTATATCGTTAACACTTTGGGGCCAAGAAGCCGAAAATTTTGATGGTACCAATAATCCTGTCGTAGTTATAAAAA
序列辨識編號：6顯示一示範性葉甲類cDNA序列，在一些地方稱為D_vir_c7971_RPA70、RPA70區域3或RPA70 Reg3：AACTCTTGTTAGCAGCAMTRTAAAAATAAATCCCGAATTAAAAGAATGTTACAGGATCAGAGGATGGTACGACAGTGAGGGTGAAAATCTGAATGCAAAGAATATTAGTGCCAGAGTTGGATCCTCGAATATGTCTGCCACTTGGATGACCTTTAAGGAAGTTAAAGATCAAAAATTAGGATCATCTGAAAAAGGTGATTATTATAAAGCTATTGCTACTGTTCTTCTTGTCAAAGCCGATAATATTGTGTATAGAGCTTGTCCCACCGCTGAATGTAATAAGAAAGTTGTTGATATGGAAAATAGTATGTACAGATGTGAAAAATGTAATAGAGAATTTCCAAATTTCAAATACAGACTGTTAGCCAGCATGAATGTTGGAGACCACACAGGAAACCAATGGGTTAGCATGTTCAGTTCAGAAGCCGAAAAAATTCTGGGGATGACTGCTGAGGAAGTAGGACAGACCTTGGAACACAATAAAGAAGAAATAGCCAACATCGTAGATAGAGCTCATTTTAAAGTATTTAGTCTTAC TTGCAGGGCAAAAATTGAGACTTACAATGATGAAGCTCGTTTAAAAACTGTTTGTATAAGAGTCGATCCAATTAATTATGAGGAGTATAGTGCATTGCTCACAGAAAAAATTCAGCAGTTAACAGGCGAATCTCATGATTAGATATACACCAACACTACAGCTATGCTATTATTTCTAG
序列辨識編號：7顯示一示範性葉甲類cDNA序列，於此稱為RPS6：ATTAATTTTCTGAAATATCCTTTTTGAAACATGGCAGTTCCATGTGCACACTAACGAGAAGTTTTTCCCGTATTTAGTGTAATTTGCCAAAAATAAAGTGTGAAATAGTAGTTTTCGAGTGCAAAATAAGTCAATATGAAGTTGAACGTATCGTACCCGGCCACGGGTTGCCAAAAACTTTTCGAAGTTGTTGACGAACACAAAATTCGTATCTTTTACGAAAAACGCATGGGTCAAGAAGTTGAGGCTGATGCTCTTGGTGACGAATGGAAGGGCTACATCTTGAAAATATCTGGAGGTAACGACAAACAAGGATTCCCCATGAAACAAGGTGTTCTTACAAACGGTAGAGTAAGACTTTTACTTTCAAAAGGTCACTCCTGCTACAGACCCAGACGTACCGGTGAACGTAAAAGGAAATCAGTTCGTGGGTGCATTGTTGATGGGAACCTCAGCGTGTTGGCCCTAGTCATTGTAAGAAAAGGAGAACAAGAAATTCCCGGACTTACTGACACCACCATCCCACGTCGCCTGGGACCCAAGAGAGCATCCAGAATCCGTAAGCTCTTCAACCTTAGCAAAGAAGACGATGTACGTCAATATGTAGTAAAGAGACCTTTGGCCCAAAAAGAAGGTAAGAAGTTA AGAACCAAGGCCCCCAAAATCCAACGTCTTATTACACCCGTTGTTTTGCAAAGAAAACGTCATCGTCTTGCTTTGAAGAAGAAGAGGTGCCTTAAACGTAAAGAACAAGAAGATGCATATGCTAAACTATTGGCTCAACGTAAGAAGGAATCCAAGGCTCGTCGTGAGATGTTGAAGAGGCGTAGGTCTGCCAGTATGCGTGATAGTAAATCCAGCACGCAGAGTGGTCAGAAGTAAATTGTAATTTTTTATATTTTAAGACAATGTATGAAATAAACGTTGTTGCTT
序列辨識編號：8顯示一T7噬菌體啟動子序列。
序列辨識編號：9-24顯示使用以藉由PCR放大示範性靶定基因之部分編碼區域的引子序列。
序列辨識編號：25顯示PP1-87B之一示範性放大片段，該者係使用做為dsRNA合成之一模板：CAAATGGCAGAAGCAGATAAATTGAATATCGACAGTATAATAGCCCGTTTATTAGAAGTGCGTGGAGCAAGACCAGGCAAAAATGTACAACTCACAGAAAATGAAATTAGGGGGCTCTGTTTAAAATCTAGAGAGATCTTCCTTAGCCAGCCGATTTTGTTGGAACTTGAAGCTCCTCTGAAGATTTGCGGTGATATACATGGTCAGTACTATGACTTGCTTCGTCTCTTTGAATATGGAGGTTTCCCTCCCGAATCAAACTACTTATTTTTGGGAGATTATGTAGATCGTGGTAAACAATCATTGGAAACCATCTGCTTACTTCTCGCTTACAAAATTAAATACCCAGAAAACTTTTTCCTACTCAGAGGCAACCACGAATGCGCATCAATTAATCGTATATATGGATTCTATGATGAATGCA AAAGAAGGTATAACATCAAGTTGTGGAAAACTTTTACGGACTGTTTCAATTGCCTACCTGTAGCAGCCATCGTCGATGAAAAAATTTTCTGTTGCCATGGTGGTTTAAGTCCGGACCTACAATCAATGGAACAAATTAG
序列辨識編號：26顯示RPA70 Reg2之一示範性放大片段，該者係使用做為dsRNA合成之一模板：ATGGTCAAATTCTAGAGGGGAAGGAAAATTATTTAGTTTTGATCTGGTGGATGAAAGTGGCGAAATCCGTTGCACAGCTTTTAAAGAAATGGTTGATAAWTTCTATGATTACCTGCAGGTGGATAAAGTATATTACATCAACAAATGTCAACTTAAACAAGCCAACAAACAGTACAGCACTCTAAAACATGAGTATGAAATGACTGTTACGCATGATACTGTCATTAAAGAATGCCTTGATGCAGATTCTACAATACCCACCACACAGTATAACTTTGTTCCTATAGATAAAATTGCTGATAAAGAAGTAAATTCTGTTGTAGATGTAATAGGTATTGCCAAAAGTGTCAGTGAATTACAAACATTCCAAGCAAGATCAACAGGAAGAGAATTGAAAAAGAAAGAAGTTGTCTTGGTTGATCAGTCACAAACAGCTATATCGTTAACACTTTGGGGCCAAGAAGCCGAAAATTTTGATGGTACCAATAATCCTGTCGTAG
序列辨識編號：27顯示RPA70 Reg3之一示範性放大片段，該者係使用做為dsRNA合成之一模板：TCCCGAATTAAAAGAATGTTACAGGATCAGAGGATGGTACGACAGTGAGGGTGAAAATCTGAATGCAAAGAATATT AGTGCCAGAGTTGGATCCTCGAATATGTCTGCCACTTGGATGACCTTTAAGGAAGTTAAAGATCAAAAATTAGGATCATCTGAAAAAGGTGATTATTATAAAGCTATTGCTACTGTTCTTCTTGTCAAAGCCGATAATATTGTGTATAGAGCTTGTCCCACCGCTGAATGTAATAAGAAAGTTGTTGATATGGAAAATAGTATGTACAGATGTGAAAAATGTAATAGAGAATTTCCAAATTTCAAATACAGACTGTTAGCCAGCATGAATGTTGGAGACCACACAGGAAACCAATGGGTTAGCATGTTCAGTTCAGAAGCCGAAAAAATTCTGGGGATGACTGCTGAGGAAGTAGGACAGACCTTGGAACACAATAAAGAAGAAATAGCCAACATCGTAGATAGAGCTCATTTTAAAGTATTTAGTCTTACTTGCAGGGCAAAAATTGAGACTTACAATGATGAAGCTCG
序列辨識編號：28顯示RPS6之一示範性放大片段，該者係使用做為dsRNA合成之一模板：TCAATATGAAGTTGAACGTATCGTACCCGGCCACGGGTTGCCAAAAACTTTTCGAAGTTGTTGACGAACACAAAATTCGTATCTTTTACGAAAAACGCATGGGTCAAGAAGTTGAGGCTGATGCTCTTGGTGACGAATGGAAGGGCTACATCTTGAAAATATCTGGAGGTAACGACAAACAAGGATTCCCCATGAAACAAGGTGTTCTTACAAACGGTAGAGTAAGACTTTTACTTTCAAAAGGTCACTCCTGCTACAGACCCAGACGTACCGGTGAACGTAAAAGGAAATCAGTTCGTGGGTGCATTGTTGATGGGAACCTCAGCGTGTTGGCCCTAGTC ATTGTAAGAAAAGGAGAACAAGAAATTCCCGGACTTACTGACACCACCATCCCACGTCGCCTGGGACCCAAGAGAGCAT
序列辨識編號：29顯示一PP1-87B髮夾RNA-形成序列其含有一ST-LS1內含子(劃底線者)：CCTCTGAAGATTTGCGGTGATATACATGGTCAGTACTATGACTTGCTTCGTCTCTTTGAATATGGAGGTTTCCCTCCCGAATCAAACTACTTATTTTTGGGAGATTATGTAGATCGTGGTAAACAATCATTGGAAACCATCTGCTTACTTCTCGCTTACAAAATTAAATACCCAGAAAACTTTTTCCTACTCAGAGGCAACCACGAATGCGCATCAATTAATCGTATATATGGATTCTATGATGAATGCAAAAGAAGGTATAACATCAAGTTGTGGAAAACTTTTACGGACTGTTTGACTAGTACCGGTTGGGAAAGGTATGTTTCTGCTTCTACCTTTGATATATATATAATAATTATCACTAATTAGTAGTAATATAGTATTTCAAGTATTTTTTTCAAAATAAAAGAATGTAGTATATAGCTATTGCTTTTCTGTAGTTTATAAGTGTGTATATTTTAATTTATAACTTTTCTAATATATGACCAAAACATGGTGATGTGCAGGTTGATCCGCGGTTAAAACAGTCCGTAAAAGTTTTCCACAACTTGATGTTATACCTTCTTTTGCATTCATCATAGAATCCATATATACGATTAATTGATGCGCATTCGTGGTTGCCTCTGAGTAGGAAAAAGTTTTCTGGGTATTTAATTTTGTAAGCGAGAAGTAAGCAGATGGTTTCCAATGATTGTTTACCACGATCTACATAATCTCCCAAAAATAAGTAGTTTGATTCGGGA GGGAAACCTCCATATTCAAAGAGACGAAGCAAGTCATAGTACTGACCATGTATATCACCGCAAATCTTCAGAGG
序列辨識編號：30顯示一RPA70 Reg2髮夾RNA-形成序列其含有一ST-LS1內含子(劃底線者)：TACCTGCAGGTGGATAAAGTATATTACATCAACAAATGTCAACTTAAACAAGCCAACAAACAGTACAGCACTCTAAAACATGAGTATGAAATGACTGTTACGCATGATACTGTCATTAAAGAATGCCTTGATGCAGATTCTACAATACCCACCACACAGTATAACTTTGTTCCTATAGATAAAATTGCTGATAAAGAAGTAAATTCTGTTGTAGATGTAATAGGTATTGCCAAAAGTGTCAGTGAATTACAAACATTCCAAGCAAGATCAACAGGAAGAGAATTGAAAAAGGACTAGTACCGGTTGGGAAAGGTATGTTTCTGCTTCTACCTTTGATATATATATAATAATTATCACTAATTAGTAGTAATATAGTATTTCAAGTATTTTTTTCAAAATAAAAGAATGTAGTATATAGCTATTGCTTTTCTGTAGTTTATAAGTGTGTATATTTTAATTTATAACTTTTCTAATATATGACCAAAACATGGTGATGTGCAGGTTGATCCGCGGTTACTTTTTCAATTCTCTTCCTGTTGATCTTGCTTGGAATGTTTGTAATTCACTGACACTTTTGGCAATACCTATTACATCTACAACAGAATTTACTTCTTTATCAGCAATTTTATCTATAGGAACAAAGTTATACTGTGTGGTGGGTATTGTAGAATCTGCATCAAGGCATTCTTTAATGACAGTATCATGCGTAACAGTCATTTCATACTCATGTTTTAGAGTGCTGTACTGTTTGTTGGCTTGTTTAAGTTGACATTTGTTGATG TAATATACTTTATCCACCTGCAGGTA
序列辨識編號：31顯示一RPS6髮夾RNA-形成序列其含有一ST-LS1內含子(劃底線者)：AACGACAAACAAGGATTCCCCATGAAACAAGGTGTTCTTACAAACGGTAGAGTAAGACTTTTACTTTCAAAAGGTCACTCCTGCTACAGACCCAGACGTACCGGTGAACGTAAAAGGAAATCAGTTCGTGGGTGCATTGTTGATGGGAACCTCAGCGTGTTGGCCCTAGTCATTGTAAGAAAAGGAGAACAAGAAATTCCCGGACTTACTGACACCACCATCCCACGTCGCCTGGGACCCAAGAGAGCATCCAGAATCCGTAAGCTCTTCAACCTTAGCAAAGAAGACGATGTACGTCAAGACTAGTACCGGTTGGGAAAGGTATGTTTCTGCTTCTACCTTTGATATATATATAATAATTATCACTAATTAGTAGTAATATAGTATTTCAAGTATTTTTTTCAAAATAAAAGAATGTAGTATATAGCTATTGCTTTTCTGTAGTTTATAAGTGTGTATATTTTAATTTATAACTTTTCTAATATATGACCAAAACATGGTGATGTGCAGGTTGATCCGCGGTTATTGACGTACATCGTCTTCTTTGCTAAGGTTGAAGAGCTTACGGATTCTGGATGCTCTCTTGGGTCCCAGGCGACGTGGGATGGTGGTGTCAGTAAGTCCGGGAATTTCTTGTTCTCCTTTTCTTACAATGACTAGGGCCAACACGCTGAGGTTCCCATCAACAATGCACCCACGAACTGATTTCCTTTTACGTTCACCGGTACGTCTGGGTCTGTAGCAGGAGTGACCTTTTGAAAGTAAAAGTCTTACTCTACCGTTTGTAAGAACACCTTGTTTCATGGGGAA TCCTTGTTTGTCGTT
序列辨識編號：32顯示膜聨蛋白(annexin)區域1之DNA序列。
序列辨識編號：33顯示膜聨蛋白區域2之DNA序列。
序列辨識編號：34顯示β-紅血球膜骨架蛋白質(spectrin)2區域1之DNA序列。
序列辨識編號：35顯示β-紅血球膜骨架蛋白質2區域2之DNA序列。
序列辨識編號：36顯示mtRP-L4區域1之DNA序列。
序列辨識編號：37顯示mtRP-L4區域2之DNA序列。
序列辨識編號：38顯示一YFP序列.
序列辨識編號：39-66顯示使用以放大用於dsRNA合成之膜聨蛋白、β-紅血球膜骨架蛋白質2、mtRP-L4及YFP基因區域的引子序列。
序列辨識編號：67顯示由一示範性葉甲類cDNA序列編碼之一蛋白質序列，在一些地方稱為87B蛋白磷酸酶：MAEADKLNIDSIIARLLEVRGARPGKNVQLTENEIRGLCLKSREIFLSQPILLELEAPLKICGDIHGQYYDLLRLFEYGGFPPESNYLFLGDYVDRGKQSLETICLLLAYKIKYPENFFLLRGNHECASINRIYGFYDECKRRYNIKLWKTFTDCFNCIPV AAIVDEKIFCCHGGLSPDLQSMEQIRRIMRPTDVPDQGLLCDLLWSDPDKDQMGWGENDRGVSFTFGAEVVGKFLHKHDFDLICRAHQVVEDGYEFFAKRQLVTLFSAPNYCGEFDNAGAMMSVDETLMCSFQILKPADKRKFQYNMNAGRPVTPPRGATNKNKKK
序列辨識編號：68顯示顯示由一示範性葉甲類cDNA序列編碼之一蛋白質序列，在一些地方稱為RPA70：MRSPQTYNMSEGSLQTIMSGGEFPNPIMQVLGSKKINAGLGDKERIRILLSDGKYTISFAMLTAQINDRLGPNGVETFSIIQIDRYVTSIINNSGKGEARVLLILDMHVVVPGTEVTEKVGSPIPLPTDADAAKGSTAAPATNNSIKNVTVAKPNISNGNGTTAMNASTNDDIATHMIHPISSLTPYQNRWTIKARITNKPPIRTWSNSRGEGKLFSFDLVDESGEIRCTAFKEMVDKFYDYLQVDKVYYINKCQLKQANKQYSTLKHEYEMTVTHDTVIKECLDADSTIPTTQYNFVPIDKIADKEVNSVVDVIGIAKSVSELQTFQARSTGRELKKKEVVLVDQSQTAISLTLWGQEAENFDGTNNPVVVIKSAKIGEFGGGKNLTTLVSSTVKINPELKECYRIRGWYDSEGENLNAKNISARVGSSNMSATWMTFKEVKDQKLGSSEKGDYYKAIATVLLVKADNIVYRACPTAECNKKVVDMENSMYRCEKCNREFPNFKYRLLASMNVGDHTGNQWVSMFSSEAEKILGMTAEEVGQTLEHNKEEIANIVDRAHFKVFSLTCRAKIETYNDEARLKTVCIRVDPINYEEYSALLTEKIQQLTGESHD
序列辨識編號：69顯示顯示由一示範性葉甲類 cDNA序列編碼之一蛋白質序列，在一些地方稱為RPS6：MKLNVSYPATGCQKLFEVVDEHKIRIFYEKRMGQEVEADALGDEWKGYILKISGGNDKQGFPMKQGVLTNGRVRLLLSKGHSCYRPRRTGERKRKSVRGCIVDGNLSVLALVIVRKGEQEIPGLTDTTIPRRLGPKRASRIRKLFNLSKEDDVRQYVVKRPLAQKEGKKLRTKAPKIQRLITPVVLQRKRHRLALKKKRCLKRKEQEDAYAKLLAQRKKESKARREMLKRRRSASMRDSKSSTQSGQK
序列辨識編號：70顯示一玉米DNA序列其編碼似TIP41之一蛋白質者。
序列辨識編號：71-74顯示使用於分子分析基因轉殖玉米中轉錄體水平的引子序列。
序列辨識編號：75顯示一玉米DNA序列其編碼一轉化酶蛋白質者。
序列辨識編號：76顯示一大腸桿菌(Escherichia coli)DNA序列其編碼一SpnR蛋白質者。
序列辨識編號：77顯示一示範性ST-L1內含子DNA序列。
序列辨識編號：78-89顯示使用於水解探針分子分析基因轉殖玉米中轉錄體水平的寡核苷酸序列。
序列辨識編號：90-94顯示使用於髮夾水解探針分子分析基因轉殖玉米中轉錄體水平的寡核苷酸序列。
序列辨識編號：95顯示由一示範性葉甲類cDNA序列編碼之一胺基酸序列，該者在一些地方稱為片段重疊 群0011_87B蛋白磷酸酶：MAEADKLNIDSIIARLLEVRGARPGKNVQLTENEIRGLCLKSREIFLSQPILLELEAPLKICGDIHGQYYDLLRLFEYGGFPPESNYLFLGDYVDRGKQSLETICLLLAYKIKYPENFFLLRGNHECASINRIYGFYDECKRRYNIKLWKTFTDCFNCLPVAAIVDEKIFCCHGGLSPDLQSMEQIRRINRDRLMYLTKXFFVTFXGLIQTKT
序列辨識編號：96顯示由一示範性葉甲類cDNA序列編碼之一胺基酸序列，該者在一些地方稱為RPA70 Reg1：MIDLVQMVWKLFSIIQIDRYVTSIINNSGKGEARVLLILDMHVVVPGTEVTEKVGSPIPLPTDADXAKGSTAAPATNNSIKNVTVAKPNISNGNGTTAMNASTNDDIATHMIHPISSLTP
序列辨識編號：97顯示由一示範性葉甲類cDNA序列編碼之一胺基酸序列，該者在一些地方稱為RPA70 Reg2：WSNSRGEGKLFSFDLVDESGEIRCTAFKEMVDXFYDYLQVDKVYYINKCQLKQANKQYSTLKHEYEMTVTHDTVIKECLDADSTIPTTQYNFVPIDKIADKEVNSVVDVIGIAKSVSELQTFQARSTGRELKKKEVVLVDQSQTAISLTLWGQEAENFDGTNNPVVVIK
序列辨識編號：98顯示由一示範性葉甲類cDNA序列編碼之一胺基酸序列，該者在一些地方稱為RPA70 Reg3： TLVSSXXKINPELKECYRIRGWYDSEGENLNAKNISARVGSSNMSATWMTFKEVKDQKLGSSEKGDYYKAIATVLLVKADNIVYRACPTAECNKKVVDMENSMYRCEKCNREFPNFKYRLLASMNVGDHTGNQWVSMFSSEAEKILGMTAEEVGQTLEHNKEEIANIVDRAHFKVFSLTCRAKIETYNDEARLKTVCIRVDPINYEEYSALLTEKIQQLTGESHD
序列辨識編號：99及100顯示葉甲類PPI-87B cDNA序列之一示範段：AATTCAAGCTGCCGCAA(序列辨識編號：99)；及TTTTCTGTTGCCATGGTGGTTTAAGTCCGGACCTACAATCAATGGAACAAATTAGAAGRATTAATAGAGACCGACTGATGTACCTGACCAAGGSTTTCTTTGTGACCTTTTANGGTCTGATCCAGACAAAGACC(序列辨識編號：100)
序列辨識編號：101顯示葉甲類RPA70 Reg1 cDNA序列之一示範段：TGGAACTGAAGTTACAGAAAAAGTAGGCTCTCCCATTCCCCTACCAACTGATGCTGACKCAGCTAAAGGCTCTACTGCCGCTCCAGCTACAAACAATTCCATTAAGAATGTAACTGTTGCTAAACCAAACATCAGTAATGGCAATGGCACAACTGCAATGAATGCCAGTACTAATGATGATATAGCCACACATATGATCCATCCTATTTCAAGTCTCACACCTTA
序列辨識編號：102顯示葉甲類RPA70 Reg3 cDNA序列之一示範段：AACTCTTGTTAGCAGCAMTRTAAAAATAAATCCCGAAT TAAAAGAATGTTACAGGATCAGAGGATGGTACGACAGTGAGGGTGAAAATCTGAATGCAAAGAATATTAGTGCCAGAGTTGGATCCTCGAATATGTCTGCCACTTGGATGACCTTTAAGGAAGTTAAAGATCAAAAATTAGGATCATCTGAAAAAGGTGATTATTATAAAGCTATTGCTACTGTTCTTCTTGTCAAAGCCGATAAT
序列辨識編號：103顯示一示範性葉甲類cDNA序列其編碼一Brahma蛋白質：ACAGTTAAATATTGAAAATGGCCTGGTGTTTTGATAAAACGGAAGAGGCGAATTTCTAGTAGCATTTTAAGGTTTCATTTGCATTTAAAACAAATTCATGTATTATAAAATGTAGGATACGTTTCCTCGTATCCATCTACTTAATTTAGGATAACAATAAAGGGTGTGAGACAGTTAAATATTGAAAATGGCCAGTGCTTCATTATTACCCAAAACTTTCACTTCTATTGGTGGCAAAGCCCTACCTACCAACTCACAACAAAACATTCAGTCAAAATTTAAAGAGATTACAGTTCCACCAGGAAATACTCCTCAAGATGTTAAAGAAGGCCCCAGTCACCAATCAAATCCAAACCATTTGGCTTCTCTTCAAAAGGCCATTGAAACTATGGAAGAGAAGGGCTTACAAGCTGATCCTAGATATTCACAGTTACTTGCATTGCGAGCTAGCATTCCTGGGGCAGAAGAAAATGGTTCTCCCTTCTCAAACAACCAAATCAAGCAATTAAGAAACCAAATAATGGCTTACAGGTGTTTGGCAAGAAATCAACCTGTTCCAAACAATTTAGTATTAGGTTTGCATGGAAAAACTCCTGAAAAAGTTCCACATAT TGTACCTCCACCGCAACCTCAAGAAGTACCTAATGGGGGCGATCCAGGACCTTCAACAAGTTCTGCTGCTGCTGTAGCTCCTAGAACACCACAAAAGCTGCCAGCAAAACCAATTGAGGCTCAGCTTGTCAACAGAGAACCAAGAGTCACTACTTTATCTAAACCATCTTCCATAGACCCTGTTGTTCTATTACAAGAACGAGAAAACAGGGTAGCAGCTCGTATAGCAGCGAGGATTGAACAAGTCAGTAATCTGCCGACTGATATGTCTGAGGCATTACGTATTCGGGCACAAATAGAACTCAGAGCTTTGAGATGTCTAAACCTCCAGAGACAACTTCGTAGTGAGGTTTTGAGCTGTATTCGACGGGACACAACATTAGAAACAGCAGTAAATGTAAAAGCGTTTAAACGGACCAAACGTCAAGGTCTTCGAGAAGCTAGAGCAACAGAAAAACTTGAGAAACAACAAAAGCTGGAAGCAGAGAGAAAGAAACGCCAGAAGAACCAAGAGTTCTTAAACAATGTGATGGCACACGCTAAAGATTTCAAAGAATTCCACAGGCAGAACCAAGCAAAACTTTCTAAACTTAATAAAGCTATTCTTACTTATCACGCTAATGCGGAGAGAGAACAAAAGAAGGAACAAGAGAGAAGAGAAAAGGAACGTATGAAGAAATTGATGGCAGAAGATGAAGAAGGTTATAGACAGTTGATCGATCAAAAGAAAGACAAACGTCTAGCGTTCTTGCTTTCGCAAACAGATGAGTATATAACTAACCTCACGGAGATGGTAAAGCAACACAAGTTGGAACAAACCAATAAAAAGAAAGAGGAGGAAAAACGCAAGAAGAAGCAGCAGAAAATGCAACAACCAGATAGGAAAGTTACAGTTCTGGAA ACTGCAACAGGTAAAAAAGTAACAGGAGAGGCTGCTCCTACACTGCGACAAGTTCAGGAATGGTTAATCCAACATCCTGGATGGGAGATGGTCGATACAGATGATGAGGATGATGAAAACGGGGAGAAGAGGGATGATGACTATGATGAAAATCAAGAAGTGGATGATGCAAAAGAAGTTATTAAAAAAGCTAAAGTTGAAGATGACGAATATCACAAAAACACAAAAGAAGAACAGACTTACTACAGTATTGCTCACACTGTTCATGAAGTGGTAACAGAACAAGCATCCATTCTGGTTAATGGAAAGCTTAAGGAATATCAAATTAGAGGGTTAGAATGGATGGTGTCTTTGTACAATAACAATCTGAATGGTATTCTAGCAGATGAGATGGGTCTAGGTAAAACCATTCAAACGATTGGCTTGTTGACCTATTTGATGGAAAAAAAGAAGATAAATGGACCGTTTTTGATCATAGTGCCACTTTCAACCATTTCTAATTGGATGTTGGAATTTCAAAAGTGGGCCCCTACTGTAGTTGTCATTTCATACAAAGGCTCTCCTGTGGTTAGAAAAGTGATCCAGAGCCAGTTAAAAGCTGCTAAATTCAATGTGCTTCTCACTACCTACGAGTACATTATTAAGGACAAGGGTGTATTAGCAAAAATCCCATTTAAATATATGATCATAGATGAGGGTCATCGTATGAAAAACCACCACTGCAAATTGACTCAAGTCCTGAATACGCACTATTTGGCGCCCTACAGACTCCTGCTTACTGGTACTCCCCTACAAAATAAATTACCAGAATTATGGGCCTTGTTGAATTTCTTGTTGCCTTCGATTTTCAAGAGTTGCTCCACTTTTGAACAATGGTTCAATGCGCCATTCGCAACAACAGGAGAAAAGGTTGAGTT AAACGAAGAAGAAACTATCCTTATCATCCGTCGTCTTCACAAAGTACTCAGGCCGTTTCTCCTGAGACGTCTCAAGAAAGAAGTCGAATCTCAGCTTCCAGACAAAGTGGAATATATCATAAAGTGTGACATGTCGGGCCTACAAAAGGTTCTCTATGCACACATGCAGAGCAAGGGTGTGTTACTTACCGATGGTTCCGAGAAGGGCAGTAAAGGAAGGGGATCTAAGGCACTGATGAACACCATTATGCAGCTGAGGAAACTGTGCAATCATCCGTTTATGTTCCAAAATATCGAAGAGAAATATTGTGATCATGTTGGTATTGCTGGTGGAGTGGTTTCTGGACCCGACACTTATAGGGTATCTGGTAAGTTTGAGCTCTTGGACAGAATATTGCCCAAAATGAAAGCAACTAACCATAGGATTCTTCTTTTCTGTCAAATGACTCAATTAATGACCATCATGGAAGATTATCTAAATTGGAGAGGATTCAAATATCTTCGTCTTGATGGTACAATCAAATCAGAAGATCGCGGGGACCTATTATCGAAATTTAATGATAAAAATAGTGAATATTTTTTGTTTTTGCTATCTACACGGGCTGGAGGTCTGGGACTTAATTTGCAGACAGCTGATACTGTGATTATCTTCGATTCCGATTGGAATCCTCATCAGGATTTACAAGCTCAGGATCGAGCTCATCGTATTGGACAGCAAAATGAGGTCCGAGTTTTGCGTTTGATGACTGTTAACTCTGTTGAGGAACGAATTTTAGCTGCAGCTAAATACAAGCTTACTATGGACGAAAAGGTCATTCAAGCTGGTATGTTCGATCAGAAGTCTACAGGCTCAGAGAGACATCAGTTTTTGCAGAGTATTTTACACCATGACGGAAGCGACGAAGAAGAGGAAAACGAA GTTCCTGATGACGAAACAGTGAACCAGATGTTGGCCCGAAGGGAAAACGAATTTCAGCTTTTCCAGAAGATGGATCAGGAAAGAAAGGAAGAAGATGAAAAGACCGGAAAGTCGCGACTTATTCAAGAAAGCGAATTGCCCGAATGGCTGTTGAAGCAAGACGATGAAATCTACTCGTGGGGCCTTGATGATCCAGATGCTGTTTTAGGAAGGGGTAGTAGGCAAAGAAAAGAAGTTGATTATGTTGACAGCCTGACGGAGAAAGAGTGGCTTAAGGCTATTGACGAAGAGGGAGAATTTGAGGAAGAACAAGAAGGTGATAAAGAAGGTCTCAGAAAGAAAAGAGGGAGGAAGAGGAAGAAGCGCGATGATGACGAAGAGGCAAGCCAAATTAAGAGAAGAAAGGTGCATCTAGCCGAGATCAAGATGAAGAAAAAGATGAAGAGGCTTATGGAAGTTGTTGTGAACTACAGGGACAGGGATGGTAGAGTATTGAGCGAACCGTTTATGAAACTTCCATCAAAGAAGGAGTTACCTGAGTATTACGATACGATTAAGAAACCTATTGATATTGAAAAAGTCGTTGCCAACGTAGAAGAAGGAAAATATTTCACGATGCACGATTTGGAAAGAGATTTCGACTTGCTGTGCCAAAACGCCCAACAATACAACGAAGAAGACTCCATGATCTACGAGGACAGCCTCGTTCTTCGACAGGTGTTTAGAAGCGCGAGGGAAAAGATCGACGGTACCTCAGACCACGACGACAACGCCGATGGACCGGCGGTGGCTCAGATCAAACGACCTCGTGGTAGACCTCGAAAACACAAGAGACCCGAAGAGATCGAGGCCGAAGCGGCGGCTCAGAAAGCTATGGAGGAGGCATCGAAGCTGAGAGC TCAAGCTGAGGCGGAAGAGCTTAGATCTAAGGTGGAGGAGGCATCTCAGAGAGCCAAAGAGGAAGCGAAAGCAAGGGAGGAAGCCAAAGCTAGGGAAGAAGCCGAAATCGAGAACATGGAGGAGATTCCCACAAGCACATGATCTATAGAGCAACCGGAAACAAAAAGGCAAAAAAGAAATATTATATAGAAAAGATGTACATGTTCAATGGAGATACATTTTCGCCGAGTTACAACGGGTAATGCTTTTACAACGGATATTTTGACGTATGAATGTTGACGTTCAGATGAAGTATATTTATAAAATAATCCAGACCTTTACGTTTTGGTTGATTTGTTTTCTGTATTGTTCAGTTTATTGAACAACCATTAATAGCAGCTTACCTAAATGATTTAGAAAAGCATCTGAGTTATTTAGATAAGTTTTGAGATTATATTTATTAACTTTAATATTACTATCTTTATTATAGCATATTGTAATTATTTTTTCCTGTCCTTCTTTCGTTGTGTGGTAGATAATCCGAGAGTCAACAGTTATAAGCAAATGAAATTCAGTTAAACCTCAAATGTACAAAATGATCAAATTAATGTTTACAATTTATTTTTTTACCACGCACATTCACTATTACTATTGTCAGTCATTGAGATATCATTTTATATAGCTCCATGTCTGTCTTCCTCAATTTACAGAGAAGCAATTAGACAAGTAATGACATAATATGGTGCTGAAATAATGTGCTTGATAGTGATGTTCACAAAGTAACTATTCGTTACAAAGTACTCGTTACTTACAAATACCGAAACTAACGATTACTATACAGAGAGGCAAATCGTTACTTTGATTACACTGATTACTTCGTATCAATCGTATCAGAGCGAGTAACGA
序列辨識編號：104顯示一示範性葉甲類cDNA 序列，該者在一些地方稱為F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707或Brahma Reg1：ATTCTGGTTAATAGGAAAGCTTAAGGAATATTCAAATTAGAGGGTTAGAATGGATGGTGTCTTTGTACAATAACAATCTGAATGGTATTCTAGCAGATGAGATGGGTCTAGGTAAACCNTTCAAACGNTTGGCTTGTTGACCTATTTGATGGAAAAAAAGAAGATAAATGGACCGTTTTTGATCATAGTGCCACTTTCAACCATTCTAATTGGATAGTTGGAATTTCAAAGTAGGGCCCTACTAGTAGTTGTCATTTCATACAAAGGCTCTCCTGTGGTTAGAAAAGTNATCCAGAGCCAGTTAAAAGCTGCTAAATTCAATGTGCTTCTCACTACCTACGAGTACATTATTAAGGCAAGGTGATTAGCAAAAAATCCCAGTTTAAATATATGATCATAGATNAGGTCATCATNAAACACACTGCAATTGAACTCAAGGCCTGAATACGCA
序列辨識編號：105顯示一示範性葉甲類cDNA序列，該者在一些地方稱為片段重疊群[0001]_brahma_949-1126或Brahma Reg2：AGTGTATTAGCAAAAATCCCATTTAAATATATGATCATAGATGAGGGTCATCGTATGAAAAACCACCACTGCAAATTGACTCAAGTCCTGAATACGCACTATTTGGCGCCCTACAGACTCCTGCTTACTGGTACTCCCCTACAAAATAAATTACCAGAATTATGGGCCTTGTTGAATTTCTTGTTGCCTTCGATTTTCAAGAGTTGCTCCACTTTTGAACAATGGTTCAATGCGCCATTCGCAACAACAGGAGAAAAGGTTGAGTTAAA CGAAGAAGAAACTATCCTTATCATCCGTCGTCTTCACAAAGTACTCAGGCCGTTTCTCCTGAGACGTCTCAAGAAAGAAGTCGAATCTCAGCTTCCAGACAAAGTGGAATATATCATAAAGTGTGACATGTCGGGCCTACAAAAGGTTCTCTATGCACACATGCAGAGCAAGGGTGTGTTACTTACCGATGGTTCCGAGAAGGGCAGTAAAGGAAGGGGATCTAAGGACAACTAGATGAACACCATTATGCAGCTGAGGAAACTGTGCT
序列辨識編號：106顯示一示範性葉甲類cDNA序列，該者在一些地方稱為F5XY5KV0ID0IM6_brahma_1237-1333或Brahma Reg3：AGGGCTGGAGGTCTGGGACTTAATTTGCAGACAGCTGATACTGTGATTATCTTCGATTCCGATTGGAATCCTCATCAGGATTTACAAGCTCAGGATCGAGCTCATCGTATTGGACAGCAAAATGAGGTCCGAGTTTTGCGTTTGATGACTGTTAACTCTGTTGAGGAACGAATTTTAGCTGCAGCTAAATACAAGCTTACTATGGACGAAAAGGTCATTCAAGCTGGTATGTTCGATCAGAAGTCTACGGGATCTGAAAGGCAGCAGTTTCTTCAGAGTATTTTACACAATGATGGTAGTGAT
序列辨識編號：107顯示葉甲類Brahma Reg3 cDNA序列之一示範段：AGGGCTGGAGGTCT
序列辨識編號：108顯示Brahma Reg2之一示範性放大片段，該者係使用做為dsRNA合成之一模板： ATGAGGGTCATCGTATGAAAAACCACCACTGCAAATTGACTCAAGTCCTGAATACGCACTATTTGGCGCCCTACAGACTCCTGCTTACTGGTACTCCCCTACAAAATAAATTACCAGAATTATGGGCCTTGTTGAATTTCTTGTTGCCTTCGATTTTCAAGAGTTGCTCCACTTTTGAACAATGGTTCAATGCGCCATTCGCAACAACAGGAGAAAAGGTTGAGTTAAACGAAGAAGAAACTATCCTTATCATCCGTCGTCTTCACAAAGTACTCAGGCCGTTTCTCCTGAGACGTCTCAAGAAAGAAGTCGAATCTCAGCTTCCAGACAAAGTGGAATATATCATAAAGTGTGACATGTCGGGCCTACAAAAGGTTCTCTATGCACACATGCAGAGCAAGGGTGTGTTACTTACCGATGGTTCCGAGAAGGGCAGTAAAGGAAGGGGATCTAAGGACA
序列辨識編號：109顯示一Brahma Reg2髮夾RNA-形成序列其含有一ST-LS1內含子(劃底線者)：GCGCCCTACAGACTCCTGCTTACTGGTACTCCCCTACAAAATAAATTACCAGAATTATGGGCCTTGTTGAATTTCTTGTTGCCTTCGATTTTCAAGAGTTGCTCCACTTTTGAACAATGGTTCAATGCGCCATTCGCAACAACAGGAGAAAAGGTTGAGTTAAACGAAGAAGAAACTATCCTTATCATCCGTCGTCTTCACAAAGTACTCAGGCCGTTTCTCCTGAGACGTCTCAAGAAAGAAGTCGAATCTCAGCTTCCAGACAAAGTGGAATATATCATAAAGTGTGACATGTGACTAGTACCGGTTGGGAAAGGTATGTTTCTGCTTCTACCTTTGATAT ATATATAATAATTATCACTAATTAGTAGTAATATAGTATTTCAAGTATTTTTTTCAAAATAAAAGAATGTAGTATATAGCTATTGCTTTTCTGTAGTTTATAAGTGTGTATATTTTAATTTATAACTTTTCTAATATATGACCAAAACATGGTGATGTGCAGGTTGATCCGCGGACATGTCACACTTTATGATATATTCCACTTTGTCTGGAAGCTGAGATTCGACTTCTTTCTTGAGACGTCTCAGGAGAAACGGCCTGAGTACTTTGTGAAGACGACGGATGATAAGGATAGTTTCTTCTTCGTTTAACTCAACCTTTTCTCCTGTTGTTGCGAATGGCGCATTGAACCATTGTTCAAAAGTGGAGCAACTCTTGAAAATCGAAGGCAACAAGAAATTCAACAAGGCCCATAATTCTGGTAATTTATTTTGTAGGGGAGTACCAGTAAGCAGGAGTCTGTAGGGCGC
序列辨識編號：110顯示由該示範性葉甲類cDNA序列編碼之一蛋白質序列，該者在一些地方稱為片段重疊群[0001]_brahma_949-1126(Brahma Reg2)：SVLAKIPFKYMIIDEGHRMKNHHCKLTQVLNTHYLAPYRLLLTGTPLQNKLPELWALLNFLLPSIFKSCSTFEQWFNAPFATTGEKVELNEEETILIIRRLHKVLRPFLLRRLKKEVESQLPDKVEYIIKCDMSGLQKVLYAHMQSKGVLLTDGSEKGSKGRGSKDN
I.數個實施例概述
於此揭露的係為用於基因控制鞘翅目害蟲侵擾的方法與組成物。用於辨識對鞘翅目害蟲生命週期必要之 一或多個基因(等)，以使用做為RNAi媒介的鞘翅目害蟲族群控制之靶定基因的方法亦提供的。編碼一RNA分子的DNA質體載體可能設計以箝制一或多個對生長、生存、發育及/或生殖必要的靶定基因(等)。在一些實施例中，該RNA分子可能能夠形成dsRNA分子。在一些實施例中，方法係提供用於一靶定基因的轉錄後表現的壓制或抑制，該者係經由互補於在一鞘翅目害蟲中之該靶定基因的編碼或非編碼序列之核酸分子。在這些及進一步實施例中，鞘翅目害蟲可能攝入一或多個dsRNA、siRNA、miRNA及/或hpRNA分子，該者係轉錄自互補於一靶定基因之編碼或非編碼序列的核酸分子之全部或一部分，從而提供了一植物保護效果。
因此，一些實施例涉及靶定基因產物表現的序列特異性抑制，該者使用互補於該(等)靶定基因之編碼及/或非編碼序列的dsRNA、siRNA、miRNA及/或hpRNA，以實現至少部分的鞘翅目害蟲控制。係為揭露的是一組分離及純化的核酸分子其包含一核苷酸序列，舉例而言，如在序列辨識編號：1-7及103-106之一者中所陳述者，及其等之片段。在一些實施例中，一穩定的dsRNA分子可能從這些序列、其等之片段、或包括這些序列中之一者的基因而表現，用於一靶定基因的轉錄後沈默或抑制。在某些實施例中，分離及純化的核酸分子包含全部或部分的序列辨識編號：3。
一些實施例涉及一重組宿主細胞(例如一植物 細胞)，該者在其基因組中具有至少一重組DNA序列其編碼至少一iRNA(例如dsRNA)分子者(等)。在特定的實施例中，當由一鞘翅目害蟲攝入時，該(等)dsRNA分子可能製造的，以轉錄後沈默或抑制一靶定基因在該鞘翅目害蟲中的表現。該重組DNA序列可能包含，舉例而言，序列辨識編號：1-7與103-106任一者、序列辨識編號：1-7與103-106任一者之片段、或包含序列辨識編號：1-7與103-106中之一者之一基因的部分序列、或其等之互補體。
特定的實施例涉及一重組宿主細胞，該者在其基因組中具有編碼至少一iRNA(例如dsRNA)分子(等)的一重組DNA序列，其中該重組DNA序列可能包含全部或部分的序列辨識編號：3。當由鞘翅目害蟲攝入時，該(等)iRNA分子可能沈默或抑制包含序列辨識編號：3之一靶定基因在鞘翅目害蟲中的表現，且從而引致該鞘翅目害蟲生長、發育、生殖及/或取食的停止。
在一些實施例中，在其基因組中具有至少一重組DNA序列其編碼至少一能夠形成dsRNA分子的RNA分子之重組宿主細胞可能為一經轉形的植物細胞。一些實施例涉及包含此種轉形植物細胞的基因轉殖植物。除了此種基因轉殖植物，任何基因轉殖植物世代的後代植株、基因轉殖種子及基因轉殖植物之產物係全部提供的，其中每一者包含重組DNA序列(等)。在特定的實施例中，能夠形成本發明dsRNA分子之一RNA分子可能在一基因轉殖植物細胞中表現。所以，在這些及其他實施例中，本發明之一dsRNA 分子可能從一基因轉殖植物細胞分離出。在特定實施例中，該基因轉殖植物係為選自由玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、及禾本科植物所組成之該群組的植物。
一些實施例涉及用於調變靶定基因在鞘翅目害蟲細胞中表現的一方法。在這些及其他實施例中，一核酸分子可能提供的，其中該核酸分子包含一核苷酸序列其編碼能夠形成dsRNA分子之一RNA分子。在特定的實施例中，一核苷酸序列其編碼能夠形成dsRNA分子之RNA分子者可能操縱地鏈接至一啟動子，且亦可能操縱地鏈接至一轉錄終止序列。在特定實施例中，用於調變靶定基因在鞘翅目害蟲細胞中表現的一方法可能包含：(a)以一載體轉形一植物細胞，其中該載體包含一核苷酸序列其編碼夠形成dsRNA分子之一RNA分子者；(b)在足以允許包含數個轉形植物細胞之植物細胞培養發展的條件下培養該經轉形的植物細胞；(c)選擇已經將該載體併入其基因組的轉形植物細胞；及(d)確定該選擇的轉形植物細胞包含由該載體的核苷酸序列所編碼、能夠形成dsRNA分子的一RNA分子。一植物可能從一植物細胞再生的，其中該細胞在其基因組中具有該併入的載體且包含由該載體核苷酸序列編碼的該dsRNA分子。
因此，亦揭露的是包含併入在其基因組中之一載體的一基因轉殖植物，其中該載體具有一核苷酸序列其編碼能夠形成dsRNA分子的一RNA分子，且其中該基因轉殖植物包含由該載體的核苷酸序列所編碼之該dsRNA分 子。在特定實施例中，在植物中表現能夠形成dsRNA分子的RNA分子，係足以調變接觸該轉形植物或植物細胞的鞘翅目害蟲之細胞中一靶定基因的表現，舉例而言，藉由取食該轉形植物、該植物的一部分(例如根)或植物細胞。於此揭露的基因轉殖植物對鞘翅目害蟲侵擾可能展現抗性及/或增強的耐受性。特定的基因轉殖植物可能會對選自由以下所組成之該群組的一或多種鞘翅目害蟲展現抗性及/或增強的耐受性：WCR；NCR；SCR；MCR；巴西玉米根蟲；D.u.tenella；及黃瓜十一星葉甲。
於此亦揭露的是用於遞送控制劑，諸如一iRNA分子，至一鞘翅目害蟲的方法。此種控制劑可能直接或間接地造成鞘翅目害蟲取食、生長、或以其它方式造成宿主損害之能力的毀損。在一些實施例中，一種方法係提供的，該方法包含遞送一穩定的dsRNA分子至一鞘翅目害蟲，以在該鞘翅目害蟲中箝制至少一靶定基因，從而降低或消除在一鞘翅目害蟲宿主中的植物損害。在一些實施例中，抑制一靶定基因在鞘翅目害蟲中表現的方法可能會引致該鞘翅目害蟲生長、發育、生殖及/或取食的停止。在一些實施例中，該方法可能最終引致該鞘翅目害蟲的死亡。
在一些實施例中，組成物(例如一外用組成物)係提供的，該者包含本發明之一iRNA(例如dsRNA)分子，用於在植物、動物及/或一植物或動物的環境中使用，以實現鞘翅目害蟲侵擾的消除或降低。在特定的實施例中，該組成物可能為餵食該鞘翅目害蟲之一營養組成物或食物來 源。一些實施例包含製成該鞘翅目害蟲可用的營養組成物或食物來源。攝入包含iRNA分子之組成物可能引致該分子被鞘翅目害蟲之一或多個細胞攝取，該者轉而可能在鞘翅目害蟲細胞(等)中引致至少一靶定基因表現的抑制。由鞘翅目害蟲攝入或損害的植物或植物細胞在任何宿主組織或環境中可能會受限或消除的，其中該鞘翅目害蟲係藉由在該鞘翅目害蟲之宿主中提供一或多個包含本發明之一iRNA分子的組成物而存在於該環境中。
於此揭露之該組成物及方法可能與其它用於控制鞘翅目害蟲損害的方法與組成物一起組合使用。舉例而言，如於此所描述用於保護植物不受鞘翅目害蟲傷害的一iRNA分子可能在一方法中使用，該方法包含以下的額外使用：一或多種對鞘翅目害蟲有效的化學藥劑、對鞘翅目害蟲有效的生物農藥、作物輪作、或重組基因技術其展示特徵不同於本發明該RNAi-媒介方法及RNAi組成物之特徵者(例如在植物中重組製造對鞘翅目害蟲有害的蛋白質(例如Bt毒素))。
II.縮寫
dsRNA 雙股核醣核酸
GI 生長抑制
NCBI (美國)國家生物技術資訊中心
gDNA 基因組DNA
iRNA 抑制性核糖核酸
ORF 開放讀取框架
RNAi 核糖核酸干擾
miRNA 微抑制性核糖核酸
siRNA 小的抑制性核糖核酸
hpRNA 髮夾核糖核酸
UTR 非轉譯區域
WCR 西方玉米根蟲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)
NCR 北方玉米根蟲(Diabrotica barberi Smith and Lawrence)
MCR 墨西哥玉米根蟲(Diabrotica virgifera zeae Krysan and Smith)
PCR 聚合酶鏈反應
RISC RNA誘導的沈默複合體
SCR 南方玉米根蟲(Diabrotica undecimpunctata howardi Barber)
III.術語
在下列之說明與圖表中，許多術語係使用的。為了提供本說明書與訴求項一清楚且一貫的理解，包括此等術語給定的範圍，下面定義係提供的：鞘翅目害蟲：如於此所使用，該術語“鞘翅目害蟲”意指該鞘翅目的害蟲昆蟲，包括在該葉甲類屬中的害蟲昆蟲，該等害蟲取食農業作物及作物產物，包括玉米及其他真草。在特定例子中，一鞘翅目害蟲係選自包含以下之一名單：西方玉米根蟲(WCR)；北方玉米根蟲(NCR)；南方 玉米根蟲(SCR)；墨西哥玉米根蟲(MCR)；巴西玉米根蟲；D.u.tenella；及黃瓜十一星葉甲。
接觸(一生物體)：如於此所使用，該術語“接觸”一生物體(例如一鞘翅目害蟲)或由一生物體“攝取”，當就一核酸分子而言時，包括將該核酸分子內化(internalization)至該生物內，舉例而言但不限於：由該生物.攝入該分子(例如藉由取食)；將該生物與包含該核酸分子之一組成物接觸；及將該生物浸泡於包含該核酸分子之一溶液。
片段重疊群：如於此所使用，該術語“片段重疊群”意指一DNA序列其係重建於一組衍自於一單一遺傳來源的重疊DNA段。
玉米植物：如於此所使用，該術語“玉米植物”意指該物種Zea mays(玉米)之植物。
編碼一dsRNA：如於此所使用，該敘詞“編碼一dsRNA”意指一DNA聚核苷酸其RNA轉錄產物係能夠形成一分子內dsRNA結構(例如一髮夾)或分子間dsRNA結構(例如藉由雜交至一靶定的RNA分子)。
表現：如於此所使用，一編碼序列(舉例而言，一基因或轉殖基因)之“表現”意指一過程，在該過程中一核酸轉錄單元(包括，例如基因組DNA或cDNA)的編碼資訊係被轉換成細胞的操縱、非操縱、或結構部分，常常包括蛋白質的合成。基因表現可以藉由外部訊號而影響；舉例而言，將細胞、組織或生物體曝露至提高或減少基因表現之一藥劑。基因表現亦可以在從DNA至RNA至蛋白質該途徑 中的任意處調控。基因表現調控發生，舉例而言，透過在轉錄、轉譯、RNA運輸及加工、中間分子諸如mRNA降解上的控制作用，或透過特定蛋白質分子在它們被製造之後的活化、去活化、分室作用(compartmentalization)或降解，或藉由其等之組合。基因表現可以藉由該項技藝中已知的任何方法在RNA水平或蛋白質水平中測量，包括但不限於，北方墨漬法、RT-PCR、西方墨漬法、或體外、原位或體內蛋白質活性檢測(等)。
遺傳物質：如於此所使用，該術語“遺傳物質”包括所有的基因及核酸分子，諸如DNA與RNA。
抑制：如於此所使用，該術語“抑制”當使用以描述在一編碼序列(舉例而言，一基因)上的效果時，意指轉錄自該編碼序列之mRNA中，及/或該編碼序列的胜肽、多肽或蛋白質產物在細胞層次中一可測量的下降。在一些例子中，一編碼序列的表現可能被抑制的，藉由此，該表現係近似消除。“特異性抑制”意指一靶定編碼序列之抑制而不必然地影響其他編碼序列(例如基因)在該細胞中的表現，在該者中，該特異性抑制係達到的。
分離的：一“分離的”的生物成分(諸如核酸或蛋白質)本質上已與生物細胞中該成份天然發生區域中的其他生物成分(意即，其他染色體及染色體外的DNA及RNA，及蛋白質)分隔、分開製造或純化開來，而同時影響該成份的化學或功能性改變(例如一核酸可能藉由打斷連結核酸至該染色體中剩餘DNA的化學鍵而從染色體分離開來)。已 經“分離的”核酸分子與蛋白質包括藉由標準純化方法純化的核酸分子及蛋白質。該術語亦含括藉由在一宿主細胞中重組表現而製備的核酸及蛋白質，以及化學合成的核酸分子、蛋白質及胜肽。
核酸分子：如於此所使用，該術語“核酸分子”可能意指核苷酸的聚合物形式，該者可能包括RNA之正義與反義股兩者、cDNA、基因組DNA，及上述的合成形式與混合聚合物。一核苷酸或核鹼基可能意指一核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、或任一類型核苷酸的修飾形式。一“核酸分子”如於此所使用係同義於“核酸”及“聚核苷酸”。一核酸分子的長度通常至少10個鹼基，除非另有指明。按照慣例，一核酸分子的核苷酸序列係從該分子的5'端讀取到3'端。一核苷酸序列的“互補體”意指可能與該核苷酸序列的核鹼基形成鹼基對(意即，A-T/U，及G-C)的核鹼基序列。
一些實施例包括核酸其包含轉錄成一RNA分子的一模板DNA者，該者係為一mRNA分子的互補體。在這些實施例中，轉錄成mRNA分子的該核苷酸序列的互補體係於5'到3'的定向中呈現，藉由此RNA聚合酶(該者在5'至3'方向中轉錄DNA)將從該互補體轉錄可以雜交至該mRNA分子之一核酸。除非另有明確聲明，或從該上下文係為清楚的，該術語“互補體”所以意指可能與一特定核苷酸序列之核鹼基形成鹼基對的核鹼基序列，從5'到3'。同樣地，除非另有明確聲明(或其從上下文係為清楚的)，否則一核酸序列之“反向互補體”意指該互補體之序列在反向定向中。前述 情況係於下列中演繹的：ATGATGATG 核苷酸序列
TACTACTAC 該核苷酸序列之“互補體”
CATCATCAT 該核苷酸序列之“反向互補體”
本發明之一些實施例可能包括形成髮夾RNA的RNAi分子。在這些RNAi分子中，由RNA干擾靶定之一核苷酸序列的互補體及該序列的反向互補體兩者皆可能在相同的分子中發現，藉由此，該單股RNA分子可能“折疊”並雜交至本身包含該互補與反向互補序列的區域上。
“核酸分子”包括單股、雙股形式的DNA；單股形式的RNA；及雙股形式的RNA(dsRNA)。該術語“核苷酸序列”或“核酸序列”意指一核酸之正義股與反義股兩者，以個別單股或在雙聯體中任一的。該術語“核糖核酸”(RNA)係包括iRNA(抑制性RNA)、dsRNA(雙股RNA)、siRNA(小干擾RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(微RNA)、hpRNA(髮夾RNA)、tRNA(轉移RNA，不論裝載或未裝載一相應的醯化胺基酸)、及cRNA(互補的RNA)。該術語“去氧核糖核酸"(DNA)係包括cDNA、基因組DNA、及DNA-RNA雜交。該術語“核酸段”及“核苷酸序列段”，或更普遍的“段”對該技藝之一般人士將理解為一功能性術語，該者包括兩基因組序列、核糖體RNA序列、轉移RNA序列、信使RNA序列、操縱子序列、及較小的遺傳工程核苷酸序列其編碼或可能適於編碼胜肽、多肽或蛋白質者。
寡核苷酸：一寡核苷酸係為一短的核酸聚合 物。寡核苷酸可能藉由切割較長的核酸段而形成，或藉由聚合個別的核苷酸前驅體。自動合成器允許長度高達數百個鹼基的寡核苷酸之合成。因為寡核苷酸可能結合至一互補的核苷酸序列，它們可能使用做為偵測DNA或RNA的探針。由DNA構成的寡核苷酸(寡去氧核醣核苷酸)可能使用於PCR中，用於放大DNA序列之一技術。在PCR中，該寡核苷酸典型地稱為一“引子”，該者允許DNA聚合酶延展該寡核苷酸並複製該互補股。
一核酸分子可能包括由天然發生及/或非天然發生核苷酸鏈結鏈接在一起的天然發生及修飾核苷酸兩者或兩者任一的。核酸分子可能化學或生物化學修飾的，或可能含有非天然或衍生的核苷酸鹼基，如熟習該項技藝者將容易體會的。此種修飾包括，舉例而言，標示、甲基化、以一類似物取代一或多個天然發生的核苷酸、核苷酸間修飾(例如不帶電荷的鏈結：舉例而言，甲基膦酸酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯(phosphoramidates)、胺基甲酸酯……等等；帶電鏈結：舉例而言，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯……等等；懸垂(pendent)部分：舉例而言，胜肽；插入劑：舉例而言，吖啶、補骨脂素……等等；螯合劑；烷化劑；及修飾鏈結：舉例而言，α-變旋異構體核酸……等等)。該術語“核酸分子”亦包括任何拓撲構形，包括單股、雙股、部分雙聯體、三聯體、髮夾形、圓形及掛鎖構形。
如於此所使用，就DNA而言，該術語“編碼序列”、“結構性核苷酸序列”或“結構性核酸分子”意指當置於 適當的調控序列控制下時，一核苷酸序列經由轉錄與mRNA最終轉譯成一多肽者。就RNA而言，該術語“編碼序列”意指一核苷酸序列其轉譯成一胜肽、多肽或蛋白質者。一編碼序列的邊界係由於5'-末端之一轉譯起始密碼子及於3'-末端之一轉譯終止密碼子確定的。編碼序列包括，但不限於：基因組DNA、cDNA、EST及重組核苷酸序列。
如於此所使用，“轉錄的非編碼序列”意指諸如5'UTR、3'UTR及內含子段不轉譯成胜肽、多肽或蛋白質的mRNA分子段。進一步，“轉錄的非編碼序列”意指一核苷酸序列其轉錄成在該細胞中作用的一RNA者，舉例而言，結構RNAs(例如核糖體RNA(rRNA)，如所列舉的5S rRNA、5.8S rRNA、16S rRNA、18S rRNA、23S rRNA及28S rRNA，及之類)；轉移RNA(tRNA)；及snRNAs，諸如U4、U5、U6及之類。轉錄的非編碼序列亦包括，舉例而言但不限於，小的RNAs(sRNA)，該術語常常用來描述小的細菌性非編碼RNAs；小的核仁RNAs(snoRNA)；微RNAs；小的干擾RNAs(siRNA)；Piwi交互作用RNAs(piRNA)；及長的非編碼RNA。還進一步，“轉錄的非編碼序列”意指一核苷酸序列其可能原生地在一生物中存在做為一基因內的“間隙子”序列，且該者係轉錄成一RNA分子。
基因組：如於此所使用，該術語“基因組”意指在一細胞之細胞核內發現的染色體DNA，且還意指在該細胞之次細胞組件內發現的胞器DNA。在本發明之一些實施例中，一DNA分子可能被引入到一植物細胞內，藉由此， 該DNA分子係併入到該植物細胞的基因組中。在這些及進一步實施例中，該DNA分子可能不是併入到該植物細胞的細胞核DNA，就是併入到該植物細胞的葉綠體或粒線體DNA。該術語“基因組”，當它適用於細菌時，意指該細菌細胞之內的染色體與質體兩者。在本發明之一些實施例中，一DNA分子可能引入至一細菌中，藉由此，該DNA分子係併入到該細菌的基因組中。在這些及進一步實施例中，該DNA分子可能不是併入到染色體，就是坐落如一穩定質體或位於一穩定的質體中。
序列相似度：該術語兩個核酸或多肽序列之“序列相似度”或“相似度”，如於此上下文中所使用，意指當跨越一特定的比較窗口針對最大相應對準時，在該兩個序列中係為相同的殘基。
如於此所使用，該術語“序列相似度百分比”可能意指藉由跨越一比較窗口上比較兩個最佳對準序列(例如核酸序列或多肽序列)而決定的值，其中在該比較窗口中的該部分序列針對該兩序列的最佳對準可能包含添加或缺失(意即，間隙)，當相較於該參考序列時(該者不包含添加或缺失)。該百分比之計算係藉由確定在該兩者序列中相似的核苷酸或胺基酸殘基發生的位置數目，以產生匹配位置的數目，將該匹配位置的數目除以該比較窗口中的位置總數，並將該結果乘以100，以產生序列相似度的百分比。一序列比較一參考序列在每一位置係相似的，稱為100%相似於該參考序列，反之亦然。
用於對準序列以比較的方法在該技藝中係眾所周知的。各種程式及比對演算法係描述的，舉例而言，於：Smith及Waterman之“(1981)Adv.Appl.Math.2：482”；Needleman及Wunsch之“(1970)J.Mol.Biol.48：443”；Pearson及Lipman之“(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444”；Higgins及Sharp之“(1988)Gene 73：237-44”；Higgins及Sharp之“(1989)CABIOS 5：151-3”；Corpet等人之“(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90”；Huang等人之“(1992)Comp.Appl.Biosci.8：155-65”；Pearson等人之“(1994)Methods Mol.Biol.24：307-31”；Tatiana等人之“(1999)FEMS Microbiol.Lett.174：247-50”。序列比對方法及同源性計算之一詳細的考量可以於，例如，Altschul等人之“(1990)J.Mol.Biol.215：403-10”中找到的。
美國國家生物技術資訊中心(NCBI)基本局部比對搜尋工具(BLASTTM；Altschul等人(1990))可從數個來源獲得，包括國家生物技術資訊中心(Bethesda,MD)，及在網際網路上，用於與數個序列分析程式聯合使用。使用此程式如何決定序列相似度之一說明係可從網際網路上在BLASTTM“help”一節上獲得。對於核酸序列之比較，BLASTTM(Blastn)程式的“Blast 2序列”功能可能採用的，該者使用預設的BLOSUM62模式設為預設參數。當藉由此方法評估時，對參考序列具更大相似性的核酸序列將顯示提高的相似度百分比。
特異性雜交/特異性互補：如於此所使用，該術 語“特異性雜交”及“特異性互補”係為術語其指出一充分程度的互補度，藉由此，穩定且特異性結合在該核酸分子與一靶定核酸分子之間發生。兩個核酸分子之間的雜交涉及在該兩個核酸分子之核酸序列之間形成一反平行對準。該兩分子然後能夠與相反股上相應的鹼基形成氫鍵，以形成一雙聯體分子，假若其係足夠穩定的，該雙聯體分子可以使用該技藝中眾所周知的方法偵測。一核酸分子不需要100%互補於其特異性雜交的靶定序列。然而，必須存在使得雜交為特異性的序列互補度的數量係為該所使用雜交條件的函數。
引致特定程度嚴格度的雜交條件將有所不同，取決於該所抉擇的雜交方法的本性及該雜交核酸序列的組成物與長度。一般地，雜交溫度及雜交緩衝液的離子強度(尤其是Na+及/或Mg++濃度)將決定雜交的嚴格度，雖然洗滌次數亦影響嚴格度。考慮要求的雜交條件、用於得到特定程度嚴格度的計算對該技藝中之一般技藝人士係為知悉的，且係討論於，舉例而言，Sambrook等人(編輯)之“Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版.，卷1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989，第9及第11章”；及Hames與Higgins(編輯)之”Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,1985”。關於核酸雜交進一步詳細的教學與引導可能發現於，舉例而言，Tijssen於“Laboratory Techni℃ues in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, 第I部，第2章，Elsevier,NY,1993”之“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”；及Ausubel等人編輯之“Current Protocols in Molecular Biology，第2章，Greene Publishing and Wiley-Interscience,NY,1995”。
如於此所使用，“嚴格條件”含括條件，在該條件下雜交將只發生於如果該雜交分子與該靶定核酸分子內的同源序列之間有小於20%的失配時。“嚴格條件”包括進一步特定級別的嚴格度。因此，如於此所使用，“中嚴格度”條件係為那些在其下具超過20%序列失配的分子將不會雜交的；“高嚴格度”的條件係為那些在其下具超過10%失配的序列將不會雜交；而“非常高嚴格度”的條件係為那些在其下超過5%失配的序列將不會雜交。
下列係為代表性、非限制性的雜交條件。
高嚴格度條件(偵測序列其共享至少90%的序列相似度)：5×SSC緩衝液中於65℃下雜交16小時；2×SSC緩衝液中於室溫下洗滌兩次，每次15分鐘；及在0.5×SSC緩衝液中於65℃下洗滌兩次，每次20分鐘。
中嚴格度條件(偵測序列其共享至少80%序列相似度)：5x-6x SSC緩衝液中，於65-70℃雜交16-20小時；2×SSC緩衝液中於室溫下洗滌兩次，每次5-20分鐘；1x SSC緩衝液於55-70℃下洗滌兩次，每次30分鐘。
非嚴格的控制條件(序列其共享至少50%序列相似度者將雜交)：6x SSC緩衝液於室溫至55℃雜交16-20小時；2x-3x SSC緩衝液於室溫至55℃至少洗滌兩次，每次20-30分鐘。
如於此所使用，當就一連續的核酸序列而言時，該術語“本質上同源”或“本質上同源性”意指包含於核酸分子之內的連續核苷酸序列，該者在嚴格條件之下雜交到具有該參考核酸序列的一核酸分子。舉例而言，核酸分子其包含本質上同源於序列辨識編號：1-7及103-106任一者之一參考核酸序列的序列者係為在嚴格條件下(例如前文陳述之該中嚴格度條件)雜交至包含序列辨識編號：1-7及103-106任一者之該參考核酸序列的一核酸分子者。本質上同源的序列可能具有至少80%的序列相似度。舉例而言，本質上同源的序列可能具有從約80%至100%之序列相似度，諸如約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約98.5%、約99%、約99.5%及約100%。該本質上同源性之性質係密切相關於特異性雜交。舉例而言，一核酸分子係特異性地雜交，當其係有一足夠程度的互補度，以避免核酸與非靶定序列在特異性結合係為所欲之條件下的非特異性結合，舉例而言，在嚴格的雜交條件下。
如於此所使用，該術語“同源基因”意指在兩種或更多物種中，一基因已經從一共同的祖先核苷酸序列演變，並可能在該兩種或更多物種中保留相同的功能。
如於此所使用，兩個核酸序列分子被認為展示出“完整的互補度”，當在5'至3'方向讀取序列之每一核苷酸 係互補於另一序列在3'至5'方向中讀取的每一核苷酸時。互補於一參考核苷酸序列的一核苷酸序列將展示一序列其相似於該參考核苷酸序列的反向互補體序列。這些術語與說明在該項技藝中係界定良好的，且對一般技藝人士將很容易理解。
操縱地鏈接：一第一核苷酸序列係與一第二核酸序列操縱地鏈接，當該第一核酸序列與該第二核酸序列係在一功能關係中時。當重組製造時，操縱鏈接的核酸序列一般係連續的，且在必要時加入兩個蛋白質編碼區域，在相同的讀取框架中(例如在一轉譯融合ORF中)。然而，核酸不需要被連續地操縱鏈接
該術語“操縱地鏈接”，當參照一調控序列及一編碼序列使用時，意味著該調控序列影響該鏈接的編碼序列的表現。“調控序列”或“控制元件”意指核苷酸序列其影響該關聯的編碼序列轉錄的時機及水平/數量、RNA加工或穩定性、或轉譯。調控序列可能包括啟動子、轉譯前導序列、內含子、增強子、莖環結構、抑制子結合序列、終止序列、聚腺苷酸識別序列……等等。特定的調控序列可能位於操縱地鏈接於此之編碼序列的上游及/或下游。還有，操縱地鏈接於一編碼序列的特定調控序列可能位於雙股核酸分子之該關聯互補股上。
啟動子：如於此所使用，該術語“啟動子”意指一DNA區域，該區域可能在轉錄起始的上游，並可能涉及識別及結合RNA聚合酶與其它蛋白質以引發轉錄。一啟動 子可能操縱地鏈接至一編碼序列，用於在細胞中表現，或一啟動子可能操縱地鏈接到編碼一訊號序列的一核苷酸序列，其中該訊號序列可能操縱地鏈接到一編碼序列，用於在一細胞中表現。一“植物啟動子”可能為能夠在植物細胞中引發轉錄的啟動子。在發育控制下的啟動子之例子包括啟動子其優先在某些組織中引發轉錄者，諸如葉、根、種子、纖維、木質部導管、管胞、或厚壁組織。此種啟動子係稱為“組織優先的”。僅在某些組織中引發轉錄的啟動子被稱為“組織特異性”。一“細胞類型特異性”啟動子主要在一或多個器官中的某些細胞類型中驅動表現，舉例而言，在根或葉中的維管束細胞。一“誘導型”啟動子可能為在環境控制之下的一啟動子。可能藉由誘導型啟動子引發轉錄之環境條件的例子包括：厭氧條件及光的存在。組織特異性、組織優先的、細胞類型特異性及誘導型啟動子構成“非持續表現”型的啟動子。一“持續表現型”啟動子係為在大多數環境條件下，或在大多數組織或細胞類型中係為活耀的一啟動子。
任何誘導型啟動子可以使用於本發明之一些實施例中。參閱Ward等人之“(1993)Plant Mol.Biol.22：361-366”。藉由一可誘導的啟動子，轉錄速率對一誘導劑的回應係提高的。示範性的誘導型啟動子包括，但不限於：源自ACEI(血管緊張素轉換酶抑制劑)系統、對銅回應的啟動子；源自玉米、對苯磺醯胺除草劑安全劑回應的In2基因；源自Tn10之Tet抑制子；及源自類固醇荷爾蒙基因的可 誘導啟動子，該者之轉錄活性可以藉由一糖皮質類固醇荷爾蒙誘導(Schena等人之“(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：0421”)。
示範性的持續表現型啟動子包括，但不限於：源自植物病毒之啟動子，諸如來自花椰菜花葉病毒(Cauliflower Mosaic Virus)(CaMV)的35S啟動子；源自水稻肌動蛋白基因的啟動子；泛素啟動子；pEMU；MAS；玉米H3組蛋白啟動子；及該ALS啟動子，Xbal/NcoI片段5'至甘藍型油菜(Brassica napus)ALS3結構基因(或類似該Xbal/NcoI片段之一核苷酸序列)(國際PCT公開案第WO96/30530號)。
此外，任何組織特異性或組織優先的啟動子可能在本發明之一些實施例中利用的。植物其以包含操縱地鏈接至一組織特異性啟動子之一編碼序列的核酸分子轉形者可能會在特定組織中專有的或優先地製造該編碼序列的產物。示範性的組織特異性或組織優先性的啟動子包括，但不限於：一種子優先啟動子，諸如源自菜豆蛋白基因；一葉特異性及光誘導的啟動子，諸如源自cab或rubisco；一花藥特異性啟動子，諸如源自LAT52；一花粉特異性啟動子，諸如源自Zm13；及一孢子優先性啟動子，諸如源自apg。
轉形：如於此所使用，該術語“轉形”或“轉導”意指一或多種核酸分子(等)進入一細胞之轉移。藉由一核酸分子轉導至該細胞，當該核酸分子變成穩定的由該細胞複製時，無論是藉由將該核酸分子併入該細胞基因組中，或 藉由游離基因體複製，一細胞係“轉形”的。如於此所使用的，該術語“轉形”含括所有的技術，藉由該等技術，一核酸分子可以引入至此一細胞中。例子包括但不限於：以病毒載體轉染；以質體載體轉形；電穿孔(Fromm等人之“(1986)Nature 319：791-3”)；脂質體轉染法(Felgner等人之“(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7”)；顯微注射(Mueller等人之“(1978)Cell 15：579-85”)；農桿菌媒介轉移(Fraley等人之“(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803-7)”；直接DNA攝取；及基因槍法(microprojectile bombardment)(Klein等人之“(1987)Nature 327：70)”。
轉殖基因：一外源性核酸序列。在一些例子中，一轉殖基因可以為一序列，該者編碼能夠形成dsRNA分子之RNA的一股或兩股，該者包含一核苷酸序列其互補於在鞘翅目害蟲中找到的一核酸分子。在進一步例子中，一轉殖基因可能為一反義核酸序列，其中該反義核酸序列的表現抑制一靶定核酸序列的表現。在仍進一步的例子中，一轉殖基因可能為一基因序列(例如一除草劑抗性基因)、一基因其編碼在工業上或藥學上有用的化合物、或一基因其編碼一所欲的農業性狀。在這些及其他例子中，一轉殖基因可能含有一調控序列其操縱地鏈接該轉殖基因的編碼序列(例如一啟動子)。
載體：一核酸分子，當其引入至一細胞時，舉例而言，以產生一轉形細胞。一載體可能包括容許其在該宿主細胞中複製的核酸序列，諸如複製起點。載體的例子 包括，但不限於：一質體；黏質體；噬菌體；或病毒其攜帶外源DNA進入一細胞中。一載體還可能包括一或多個基因，包括那些製造反義分子、及/或可選擇的標記基因及在該技藝中所知悉的其他遺傳元件。一載體可能轉導、轉形、或感染一細胞，從而造成該細胞表現由該載體所編碼的核酸分子及/或蛋白質。一載體任選地包括協助實現該核酸分子進入細胞的物質(例如脂質體、蛋白質塗層……等等)。
產量：一約100%或更大的穩定產量係相對於檢查品種(check variety)在相同生長位置於相同時間及相同條件下生長。在特定實施例中，“改良產量”或“改善產量”意味相對於檢查品種產量，具有105%或更大穩定產量之一栽培種，該者係在相同生長位置含有顯著密度傷害該作物之鞘翅目害蟲，於相同時間且在相同條件下生長。
除非具體地指出或暗示，該術語“一”、“一個”及“該”表示“至少一個”，如於此所使用。
除非另有具體解釋，於此所使用的所有技術與科學術語具有相同的含義，如此揭露內容所屬之該技藝的一般技藝人士所普遍理解者。分子生物學常用術語的定義可以找到，舉例而言，於朗文的“Genes X,Jones & Bartlett Publishers,2009(ISBN 10 0763766321)”；Krebs等人(編輯)之“The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)”；及Meyers R.A.(編輯)之“Molecular Biology and Biotechnology：A Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995 (ISBN 1-56081-569-8)”。所有的百分數係為重量份，且所有溶劑混合物比例係為體積份，除非另有說明。所有的溫度均為攝氏度。
IV.包含鞘翅目害蟲序列的核酸分子
A.概述
於此所描述係為對控制鞘翅目害蟲有用的核酸分子。該所描述的核酸分子包括靶定序列(例如，原生基因及非編碼序列)、dsRNAs、siRNA、hpRNAs及miRNAs。舉例而言，dsRNAs、siRNA、miRNA及/或hpRNA分子係於一些實施例中描述的，該等者可能特異性地互補於鞘翅目害蟲中一或多個原生核酸序列之全部或部分的。在這些及進一步實施例中，該(等)原生核酸序列可能為一或多個靶定基因(等)，該者之產物可能為，舉例而言但不限於：涉及一代謝過程；涉及一生殖過程；或涉及幼蟲發育。於此所描述之核酸分子，當引入至細胞其包含至少一與該核酸分子特異性地互補的原生核酸序列(等)時，可能引發該細胞中的RNAi，且因此降低或消除該原生核酸序列(等)的表現。在一些例子中，藉由包含特異性地互補於其等之一序列的一核酸分子，靶定基因在鞘翅目害蟲中表現的降低或消除可能為致命，或引致降低的生長及/或生殖。
在一些實施例中，在鞘翅目害蟲中至少一靶定基因可能選擇的，其中該靶定基因包含一核苷酸序列其選自包含以下之名單：蛋白磷酸酶PP1-87B(序列辨識編號：1)、D_vir_片段重疊群0011_87B(序列辨識編號：3)、RPA70 (序列辨識編號：2)、D_vir_c43870_RPA70或RPA70區域1(序列辨識編號：4)、D_vir_c18764_RPA70或RPA70區域2(序列辨識編號：5)、D_vir_c7971_RPA70或RPA70區域3(序列辨識編號：6)、RPS6(序列辨識編號：7)、Brahma(序列辨識編號：103)、F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707或Brahma Reg1(序列辨識編號：104)、D_vir_片段重疊群[0001]_brahma_949-1126或Brahma Reg2(序列辨識編號：105)、及F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333或Brahma Reg3(序列辨識編號：106)。在特定例子中，鞘翅目害蟲中一靶定基因係選擇的，其中該靶定基因包含序列辨識編號：3的核苷酸序列。
在一些實施例中，一靶定基因可能為包含一核苷酸序列之一核酸分子，其中該核苷酸序列編碼包含一連續胺基酸序列之一多肽，該胺基酸序列至少85%相似於(例如約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約100%、或100%相似於)以下一者的蛋白質產物的胺基酸序列：PP1-87B(序列辨識編號：1)、RPA70(序列辨識編號：2)、D_vir_片段重疊群0011_87B(序列辨識編號：3)、D_vir_c43870_RPA70或RPA70區域1(序列辨識編號：4)、D_vir_c18764_RPA70或RPA70區域2(序列辨識編號：5)、D_vir_c7971_RPA70或RPA70區域3(序列辨識編號：6)、RPS6(序列辨識編號：7)、Brahma(序列辨識編號：103)、F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707或Brahma Reg1(序列辨識編號：104)、D_vir_片段重疊群[0001]_brahma_ 949-1126或Brahma Reg2(序列辨識編號：105)、及F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333或Brahma Reg3(序列辨識編號：106)。
一靶定基因可能為鞘翅目害蟲中任何的核酸序列，該者之轉錄後抑制在鞘翅目害蟲上具有不利的效果，或提供植物對抗鞘翅目害蟲之一保護的益處。在特定例子中，一靶定基因係為包含一核苷酸序列之一核酸分子，其中該核苷酸序列編碼包含一連續胺基酸序列之一多肽，該胺基酸序列至少85%相似於、約90%相似於、約95%相似於、約96%相似於、約97%相似於、約98%相似於、約99%相似於、約100%相似於、或100%相似於序列辨識編號：3核苷酸序列之蛋白質產物的胺基酸序列。
根據本發明所提供的係為核苷酸序列，該者的表現將引致一RNA分子，該RNA分子包含特異性地互補於在一鞘翅目害蟲中由一編碼序列所編碼的一原生RNA分子之全部或部分的一核苷酸序列。在一些實施例中，在由鞘翅目害蟲攝入該表現的RNA分子之後，該編碼序列在鞘翅目害蟲細胞中的抑低調控可能得到的。在特定實施例中，該編碼序列在鞘翅目害蟲細胞中的抑低調控可能在鞘翅目害蟲生長、活力、增殖及/或生殖上引致不利的效果。
在一些實施例中，靶定序列包括轉錄的非編碼RNA序列，諸如5'UTRs；3'UTRs；剪接前導序列；內含子序列；末端內含子(outron)序列(例如隨後在反式剪接中修飾的5'UTR RNA)；供體子(donatron)序列(例如提供供體序列 用於反式剪接所要求的非編碼RNA)；及靶定鞘翅目害蟲基因的其他非編碼轉錄RNA。此種序列可能衍自於單順反子(mono-cistronic)與聚-順反子基因兩者。
因此，於此亦聯合一些實施例描述的係為iRNA分子(例如dsRNAs、siRNAs、miRNAs及hpRNAs)，該者包含至少一特異性互補於在鞘翅目害蟲中一靶定序列之全部或部分的核苷酸序列。在一些實施例中，一iRNA分子可能包含核苷酸序列(等)其互補於數個靶定序列之全部或部分；舉例而言，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多的靶定序列。在特定實施例中，iRNA分子可能在體外製造，或藉由一基因改造生物在體內製造，諸如一植物或一細菌。亦揭露的係為cDNA序列其可能使用於dsRNA分子、siRNA分子、miRNA及/或hpRNA分子之製造，該等者係特異性地互補於鞘翅目害蟲中之一靶定序列的全部或部分。進一步描述的係為重組DNA構建體其在實現特定標靶宿主之穩定轉形中使用的。經轉形的標靶宿主可能從該重組DNA構建體表現有效水平的dsRNA、siRNA、miRNA及/或hpRNA分子。所以，亦描述的係為一植物轉形載體，該者包含至少一操縱地鏈接至在植物細胞中作用之一異源性啟動子的核苷酸序列，其中該(等)核苷酸序列的表現引致一RNA分子其包含特異性互補於鞘翅目害蟲中一靶定序列之全部或部分的一核苷酸序列。
在一些實施例中，對控制鞘翅目害蟲有用的核酸分子可能包括：從葉甲類之D_vir_片段重疊群0011_87B 蛋白磷酸酶(序列辨識編號：3)分離的全部或部分的原生核酸序列；一核苷酸序列，該者當表現時引致一RNA分子其包含特異性互補於由D_vir_片段重疊群0011_87B蛋白磷酸酶(序列辨識編號：3)所編碼之一原生RNA分子的全部或部分的一核苷酸序列；iRNA分子(例如dsRNAs、siRNA、miRNAs及hpRNAs)其包含至少一核苷酸序列，該者係特異性互補於D_vir_片段重疊群0011_87B蛋白磷酸酶(序列辨識編號：3)的全部或部分；及在實現特定標靶宿主穩定轉形中所使用的重組DNA構建體，其中一經轉形標靶宿主包含一或多個前述的核酸分子。
在這些及進一步實施例中，使用於鞘翅目害蟲控制的額外核酸分子可能包括：PP1-87B(序列辨識編號：1)、RPA70(序列辨識編號：2)、D_vir_c43870_RPA70或RPA70區域1(序列辨識編號：4)、D_vir_c18764_RPA70或RPA70區域2(序列辨識編號：5)、D_vir_c7971_RPA70或RPA70區域3(序列辨識編號：6)、RPS6(序列辨識編號：7)、Brahma(序列辨識編號：103)、F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707或Brahma Reg1(序列辨識編號：104)、D_vir_片段重疊群[0001]_brahma_949-1126或Brahma Reg2(序列辨識編號：105)、及F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333或Brahma Reg3(序列辨識編號：106)；iRNA分子(例如dsRNAs、siRNAs、miRNAs及hpRNAs)其包含至少一核苷酸序列，該者係特異性地互補於全部或部分的PP1-87B(序列辨識編號：1)、RPA70(序列辨識編號：2)、 D_vir_c43870_RPA70或RPA70區域1(序列辨識編號：4)、D_vir_c18764_RPA70或RPA70區域2(序列辨識編號：5)、D_vir_c7971_RPA70或RPA70區域3(序列辨識編號：6)、RPS6(序列辨識編號：7)、Brahma(序列辨識編號：103)、F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707或Brahma Reg1(序列辨識編號：104)、D_vir_片段重疊群[0001]_brahma_949-1126或Brahma Reg2(序列辨識編號：105)、及F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333或Brahma Reg3(序列辨識編號：106)；核苷酸序列，該者當表現時引致一RNA分子其包含特異性地互補於由以下所編碼之一原生RNA分子的一核苷酸序列：PP1-87B(序列辨識編號：1)、RPA70(序列辨識編號：2)、D_vir_c43870_RPA70或RPA70區域1(序列辨識編號：4)、D_vir_c18764_RPA70或RPA70區域2(序列辨識編號：5)、D_vir_c7971_RPA70或RPA70區域3(序列辨識編號：6)、RPS6(序列辨識編號：7)、Brahma(序列辨識編號：103)、F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707或Brahma Reg1(序列辨識編號：104)、D_vir_片段重疊群[0001]_brahma_949-1126或Brahma Reg2(序列辨識編號：105)、及F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333或Brahma Reg3(序列辨識編號：106)；iRNA分子(例如dsRNAs、siRNAs、miRNAs及hpRNAs)其包含至少一核苷酸序列，該者係特異性地互補於全部或部分的PP1-87B(序列辨識編號：1)、RPA70(序列辨識編號：2)、D_vir_c43870_RPA70或RPA70區域1(序列辨識編號：4)、D_vir_c18764_RPA70或RPA70區域2(序列辨識編號：5)、 D_vir_c7971_RPA70或RPA70區域3(序列辨識編號：6)、RPS6(序列辨識編號：7)、Brahma(序列辨識編號：103)、F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707或Brahma Reg1(序列辨識編號：104)、D_vir_片段重疊群[0001]_brahma_949-1126或Brahma Reg2(序列辨識編號：105)、及F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333或Brahma Reg3(序列辨識編號：106)；iRNA分子(例如dsRNAs、siRNAs、miRNAs及hpRNAs)其包含至少一核苷酸序列，該者係特異性地互補於PP1-87B(序列辨識編號：1)、RPA70(序列辨識編號：2)、D_vir_c43870_RPA70或RPA70區域1(序列辨識編號：4)、D_vir_c18764_RPA70或RPA70區域2(序列辨識編號：5)、D_vir_c7971_RPA70或RPA70區域3(序列辨識編號：6)、RPS6(序列辨識編號：7)、Brahma(序列辨識編號：103)、F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707或Brahma Reg1(序列辨識編號：104)、D_vir_片段重疊群[0001]_brahma_949-1126或Brahma Reg2(序列辨識編號：105)、及F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333或Brahma Reg3(序列辨識編號：106)；iRNA分子(例如dsRNAs、siRNAs、miRNAs及hpRNAs)其包含至少一核苷酸序列，該者係特異性地互補於全部或部分的PP1-87B(序列辨識編號：1)、RPA70(序列辨識編號：2)、D_vir_c43870_RPA70或RPA70區域1(序列辨識編號：4)、D_vir_c18764_RPA70或RPA70區域2(序列辨識編號：5)、D_vir_c7971_RPA70或RPA70區域3(序列辨識編號：6)、RPS6(序列辨識編號：7)、Brahma(序列辨識編號：103)、 F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707或Brahma Reg1(序列辨識編號：104)、D_vir_片段重疊群[0001]_brahma_949-1126或Brahma Reg2(序列辨識編號：105)、及F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333或Brahma Reg3(序列辨識編號：106)；cDNA序列其可能使用於dsRNA分子、siRNA分子、miRNA及/或hpRNA分子的製造，該者係特異性地互補於PP1-87B(序列辨識編號：1)、RPA70(序列辨識編號：2)、D_vir_c43870_RPA70或RPA70區域1(序列辨識編號：4)、D_vir_c18764_RPA70或RPA70區域2(序列辨識編號：5)、D_vir_c7971_RPA70或RPA70區域3(序列辨識編號：6)、RPS6(序列辨識編號：7)、Brahma(序列辨識編號：103)、F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707或Brahma Reg1(序列辨識編號：104)、D_vir_片段重疊群[0001]_brahma_949-1126或Brahma Reg2(序列辨識編號：105)、及F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333或Brahma Reg3(序列辨識編號：106)；iRNA分子(例如dsRNAs、siRNAs、miRNAs及hpRNAs)其包含至少一核苷酸序列，該者係特異性地互補於全部或部分的PP1-87B(序列辨識編號：1)、RPA70(序列辨識編號：2)、D_vir_c43870_RPA70或RPA70區域1(序列辨識編號：4)、D_vir_c18764_RPA70或RPA70區域2(序列辨識編號：5)、D_vir_c7971_RPA70或RPA70區域3(序列辨識編號：6)、RPS6(序列辨識編號：7)、Brahma(序列辨識編號：103)、F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707或Brahma Reg1(序列辨識編號：104)、D_vir_片段重疊群[0001]_brahma_949-1126 或Brahma Reg2(序列辨識編號：105)、及F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333或Brahma Reg3(序列辨識編號：106)；及在實現特定標靶宿主穩定轉形中所使用的重組DNA構建體，其中一經轉形標靶宿主包含一或多個前述的核酸分子。
B.核酸分子
本發明提供，在其他事物之外，iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA及hpRNA)分子，該者抑制靶定基因在鞘翅目害蟲之一細胞、組織或器官中的表現；及一DNA分子，該者能夠在一細胞或微生物中表現為一iRNA分子，以抑制靶定基因在鞘翅目害蟲之一細胞、組織或器官中的表現。
本發明之一些實施例提供一分離的核酸分子，該者包含以下之核苷酸序列：序列辨識編號：3、序列辨識編號：3之互補體、至少19個連續的序列辨識編號：3核苷酸之一片段、至少19個連續的序列辨識編號：3核苷酸之片段的互補體、葉甲類生物(例如WCR)之一原生編碼序列其包含序列辨識編號：3者、葉甲類生物包含序列辨識編號：3的原生編碼序列的互補體、葉甲類生物的原生非編碼序列其轉錄成包含序列辨識編號：3之一原生的RNA分子者、葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：3之一原生RNA分子的原生非編碼序列的互補體、葉甲類生物包含序列辨識編號：3之一原生編碼序列的至少19個連續的核苷酸片段、葉甲類生物包含序列辨識編號：3之一原生編碼序列的至少19個連續的核苷酸片段之互補體、葉甲類生物轉錄成包含序 列辨識編號：3之一原生RNA分子的原生非編碼序列之至少19個連續的核苷酸片段、及葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：3之一原生RNA分子的原生非編碼序列之至少19個連續的核苷酸片段的互補體。在特定實施例中，由一鞘翅目害蟲接觸或攝取該分離的核酸序列抑制了該鞘翅目害蟲的生長、發育、生殖及/或取食。
在一些實施例中，本發明之分離的核酸分子可能包含至少一(例如一、二、三或更多)核苷酸序列(等)其選自由以下所組成之該群組：序列辨識編號：1；序列辨識編號：1之互補體；序列辨識編號：2；序列辨識編號：2之互補體；序列辨識編號：4；序列辨識編號：4之互補體；序列辨識編號：5；序列辨識編號：5之互補體；序列辨識編號：6；序列辨識編號：6之互補體；序列辨識編號：7；序列辨識編號：7之互補體；序列辨識編號：103；序列辨識編號：103之互補體；序列辨識編號：104；序列辨識編號：104之互補體；序列辨識編號：105；序列辨識編號：105之互補體；序列辨識編號：106；序列辨識編號：106之互補體；序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之至少19個連續的核苷酸的一片段；序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之至少19個連續的核苷酸片段之互補體；葉甲類生物包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之一原生編碼序列；葉甲類生物包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之一原生編碼序列的互補體；葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者的 一原生RNA分子的原生非編碼序列；葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之一原生RNA分子的原生非編碼序列的互補體；葉甲類生物包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之一原生編碼序列的至少19個連續的核苷酸片段、葉甲類生物包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之一原生編碼序列的至少19個連續的核苷酸片段之互補體、葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之一原生RNA分子的原生非編碼序列之至少19個連續的核苷酸片段、及葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之一原生RNA分子的原生非編碼序列之至少19個連續的核苷酸片段的互補體。在特定實施例中，由一鞘翅目害蟲接觸或攝取該分離的核酸序列抑制了該鞘翅目害蟲的生長、發育、生殖及/或取食。
在特定的例子中，本發明之一分離的核酸分子可能包含至少一(例如一、二、三、或更多)段的序列辨識編號：1-7、103、及/或106(例如一核苷酸序列其選自由序列辨識編號：99-102及107所組成之該群組，其中序列辨識編號：99-102及107可以發現為序列辨識編號：3-6及106之片段)。
在一些實施例中，本發明之核酸分子可能包含至少一(例如一、二、三、或更多)DNA序列(等)，該者能夠在一細胞或微生物中表現為iRNA分子以抑制靶定基因在鞘翅目害蟲之細胞、組織或器官中的表現。此(等)DNA序 列可能操縱地鏈接到在包含該DNA分子之一細胞中作用的一啟動子序列，以引發或增強能夠形成dsRNA分子(等)之該編碼RNA的轉錄。在一實施例中，至少一(例如一、二、三、或更多)DNA序列(等)可能衍自於序列辨識編號：3的核苷酸序列。序列辨識編號：3的衍生物包括序列辨識編號：3的片段。在一些實施例中，此種片段可能包含，舉例而言，至少約19個連續的序列辨識編號：3核苷酸，或其等之互補體。因此，此種片段可能包含，舉例而言，19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30個連續的序列辨識編號：3核苷酸，或其等之互補體。在這些及進一步實施例中，此一片段可能包含，舉例而言，超過約19個連續的序列辨識編號：3核苷酸，或其等之互補體。因此，序列辨識編號：3之片段可能包含，舉例而言，19、20、21、25、30、40、50、60、70、80、90、100、或更多個連續的序列辨識編號：3核苷酸，或其等之互補體。
在特定實施例中，至少一能夠在一細胞或微生物中表現為iRNA分子以抑制靶定基因在鞘翅目害蟲之細胞、組織或器官中表現的DNA序列(等)可能包含DNA序列(等)其係衍自於選自由序列辨識編號：1、2、4-7及103-106所組成之該群組之一核苷酸序列。選自由序列辨識編號：1、2、4-7及103-106所組成之該群組之一核苷酸序列的衍生物包括序列辨識編號：1、2、4-7及/或103-106之片段。在一些實施例中，此一片段可能包含，舉例而言，至少約19個連續的序列辨識編號：1、2、4-7及/或103-106核苷酸， 或其等之互補體。因此，此一片段可能包含，舉例而言，19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30個連續的序列辨識編號：1、2、4-7及/或103-106核苷酸，或其等之互補體。在這些及進一步實施例中，此一片段可能包含，舉例而言，超過約19個連續的序列辨識編號：1、2、4-7及/或103-106核苷酸，或其等之互補體。因此，選自由序列辨識編號：1、2、4-7及103-106所組成之該群組之一核苷酸序列之片段可能包含，舉例而言，19、20、21、25、30、40、50、60、70、80、90、100、或更多個連續的序列辨識編號：1、2、4-7及103-106核苷酸，或其等之互補體。在一些特定實施例中，該片段可能包含，舉例而言，超過約19個選自由序列辨識編號：99-102所組成之該群組的核苷酸序列的連續核苷酸，或其等之互補體。在某些實施例中，該片段可能包含，舉例而言，序列辨識編號：107之14個連續的核苷酸，或其等之一互補體。
一些實施例包含引入部分或完全穩定的dsRNA分子到一鞘翅目害蟲中，以抑制一靶定基因在該鞘翅目害蟲之細胞、組織或器官中的表現。當表現為一iRNA分子(例如dsRNA、siRNA、miRNA及hpRNA)，並由一鞘翅目害蟲攝取時，核酸序列其包含序列辨識編號：1-7任一者之一或多個片段可能造成鞘翅目害蟲死亡、生長抑制、性別比例變化、降低卵的大小、停止感染及/或停止取食之一或多者。舉例而言，在一些實施例中，一dsRNA分子係提供的，該者包含一核苷酸序列其包括約19至約300核苷酸，該核苷 酸序列本質上同源於一鞘翅目害蟲靶定基因序列且包含序列辨識編號：3核苷酸序列之一或多個片段。這些及進一步的dsRNA分子可能進一步包含一或多個核苷酸序列片段其選自由1、2、4-7及103-106所組成之該群組。此種dsRNA分子的表現可能，舉例而言，導致攝取該dsRNA分子之鞘翅目害蟲的死亡率及/或生長抑制。
在某些實施例中，本發明所提供的dsRNA分子包含核苷酸序列其互補於包含序列辨識編號：3之一靶定基因，及/或核苷酸序列其互補於序列辨識編號：3之一片段，該靶定基因在鞘翅目害蟲中的抑制引致對該鞘翅目害蟲生長、發育、或其他生物功能必要的蛋白質或核苷酸序列劑的降低或移除。一選擇的核苷酸序列可能對序列辨識編號：3、序列辨識編號：3所陳述之核苷酸序列之一連續片段、或前述任一者之互補體展示從約80%至約100%的序列相似度。舉例而言，一選定的核苷酸序列可能對序列辨識編號：3、序列辨識編號：3所陳述之核苷酸序列之一連續片段、或前述任一者之互補體展示約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約98.5%、約99%、約99.5%及約100%的序列相似度。在特定實施例中，本發明所提供的dsRNA分子可能進一步包含一或多個核苷酸序列其互補於包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106之一者的一靶定基因，該靶定基因在鞘翅目害蟲中的抑制引致對該鞘翅目害蟲生長、發育、 或其他生物功能必要的蛋白質或核苷酸序列劑的降低或移除。
在一些實施例中，能夠在細胞或微生物中表現如一iRNA分子以抑制靶定基因表現的DNA分子可能包含一單一核苷酸序列其係特異性地互補於在一或多種靶定鞘翅目害蟲物種中發現之一原生核酸序列的全部或部分，或該DNA分子可以從數個這種特異性地互補序列構建為一嵌合體(chimera)。
在一些實施例中，一核酸分子可能包含由一“間隙子序列”分隔的一第一及一第二核苷酸序列。一間隙子序列可能為一區域其包含當所欲時在該第一及第二核苷酸序列之間促進二級結構形成的任何核苷酸序列。在一實施例中，該間隙子序列係為mRNA的正義或反義編碼序列的一部分。該間隙子序列或者可能包含能夠共價鏈接至一核酸分子的核苷酸或其等之同源的任何組合。
舉例而言，在一些實施例中，該DNA分子可能包含一核苷酸序列其編碼一或多個不同的RNA分子，其中該不同的RNA分子每一者包含一第一核苷酸序列及一第二核苷酸序列，其中該第一及第二核苷酸序列係彼此互補的。該第一及第二核苷酸序列可能藉由一間隙子序列在一RNA分子內連接的。該間隙子序列可能構成該第一核苷酸序列或該第二核苷酸序列的一部分。包含該第一及第二核苷酸序列之一RNA分子的表現可能導致本發明之dsRNA分子的形成，藉由該第一及第二核苷酸序列之特異性分子內 鹼基配對。該第一核苷酸序列或該第二核苷酸序列本質上可能相似於原生於鞘翅目害蟲的一核酸序列(例如一靶定基因，或轉錄的非編碼序列)、其等之衍生物或互補於此的序列。
dsRNA核酸分子包含雙股的聚合核糖核苷酸序列，且可能包括對該磷酸糖骨幹或核苷任一的修飾。RNA結構中的修飾可能打造以允許特定的抑制。在一實施例中，dsRNA分子可能透過無處不在的酶促過程修飾，以致於siRNA分子可能生成的。此酶促過程可能利用一種RNAseIII酶，諸如真核生物中之DICER，在體外或體內任一的。參閱Elbashir等人之“(2001)Nature 411：494-8”；及Hamilton與Baulcombe之“(1999)Science 286(5441)：950-2”。DICER或功能等同的RNAse III酶切割較大的dsRNA股及/或hpRNA分子成為較小的寡核苷酸(例如siRNA)，其中每一者的長度係為約19-25核苷酸。由這些酶所產生之該siRNA分子具有2至3個核苷酸之3'突出端，及5'磷酸酯末端與3'羥基末端。藉由RNAse III酶生成之該siRNA分子在細胞中係解開並分開為單股RNA。該siRNA分子然後與從一靶定基因轉錄的RNA序列特異性地雜交，而兩個RNA分子隨後係藉由一固有的細胞RNA降解機制降解的。此過程可能引致由該靶定基因在該靶定生物中編碼之該RNA序列的有效降解或移除。其結果係為該靶定基因的轉錄後沈默。在一些實施例中，由內源性RNAse III酶從異源性核酸分子產生的siRNA分子可能有效地媒介鞘翅目害蟲中靶定基因的抑低 調控。
在一些實施例中，本發明之核酸分子可能包括至少一非天然發生的核苷酸序列，該者可以轉錄成能夠透過分子間雜交在體內形成dsRNA分子的一單股RNA分子。此種dsRNA序列典型地自組裝，且可以在一鞘翅目害蟲營養源中提供，以實現一靶定基因的轉錄後抑制。在這些及進一步實施例中，本發明之核酸分子可能包含兩種不同的非天然發生的核苷酸序列，其中每一者係特異性地互補於在一鞘翅目害蟲中之一不同的靶定基因。當此一核酸分子係以一dsRNA分子提供至一鞘翅目害蟲時，該dsRNA分子抑制鞘翅目害蟲中至少兩種不同靶定基因的表現。
C.獲得核酸分子
各種在鞘翅目害蟲中的原生序列可能使用做為用於設計本發明之核酸分子的靶定序列，諸如iRNAs及編碼iRNA之DNA分子。然而，原生序列之選擇係非一直接順向過程。在該鞘翅目害蟲中僅有少數目的原生序列將為有效的標靶。舉例而言，其係無法確實的預測一特定的原生序列是否可以藉由本發明之核酸分子有效地抑低調控，或一特定原生序列的抑低調控是否將在該鞘翅目害蟲之生長、活力、增生及/或生殖上具有一不利的效果。絕大多數的原生鞘翅目害蟲序列，諸如由此分離的EST序列(舉例而言，如美國專利第7,612,194號中所列出者)，在諸如WCR或NCR之鞘翅目害蟲的生長、活力、增生及/或生殖上不具有一不利的效果。該等原生序列何者可能在鞘翅目害蟲具有一不 利的效果，能夠在重組技術中使用用於在宿主植物中表現互補於此種原生序列的核酸分子，並依靠餵食在鞘翅目害蟲上提供不利的效果而不會對該宿主植物造成危害，兩者皆為不可預測的。
在一些實施例中，本發明之核酸分子(例如在鞘翅目害蟲之宿主植物中提供的dsRNA分子)係選擇以靶定cDNA序列其編碼對鞘翅目害蟲生存必要之蛋白質或部分的蛋白質，諸如胺基酸序列其涉及代謝或分解生化途徑、細胞分裂、生殖、能量代謝、消化、寄主植物識別、及之類。如於此所描述，由一靶定生物攝入含有一或多個dsRNA的組成物，其中該一或多個dsRNA中至少一段係特異性地互補於在該靶定害蟲生物細胞中製造的至少本質上相似的RNA段，可以引致該標靶的死亡或其他抑制。衍自於鞘翅目害蟲之一核苷酸序列，DNA或RNA任一的，可以使用以構建抗鞘翅目害蟲侵擾的植物細胞。該鞘翅目害蟲的宿主植物(例如玉米或大豆)，舉例而言，可以經轉形以含有如於此所提供、衍自鞘翅目害蟲的一或多個核苷酸序列。轉形到該宿主的核苷酸序列可能編碼一或多個RNA其在該轉形宿主之內的細胞或生物液中形成一dsRNA序列，因此假若/當該鞘翅目害蟲與該基因轉殖宿主形成一種營養關係時，使得該dsRNA變得可獲得的。此可能引致在該鞘翅目害蟲細胞中一或多個基因表現的箝制，及最終死亡或抑制其之生長或發育。
因此，在一些實施例中，本質上涉及一鞘翅目 害蟲生長、發育及生殖之一基因係為靶定的。其他在本發明中使用的靶定基因可能包括，舉例而言，那些在鞘翅目害蟲活力、移動、遷移、生長、發育、感染性、取食部位建立及生殖中扮演重要角色者。一靶定基因所以可能為一常務基因或一轉錄因子。此外，在本發明中使用之一原生鞘翅目害蟲核苷酸序列亦可能衍自於一植物、病毒、細菌或昆蟲基因的同源物(例如一同源基因)，該者之功能對熟習該項技藝者係為知悉的，且該者之核苷酸序列係特異性地與在該靶定鞘翅目害蟲之基因組中的一靶定基因雜交的。藉由雜交辨識具已知核苷酸序列的基因之同源物的方法對熟習該項技藝人士係知悉的。
在一些實施例中，本發明提供用於獲得一核酸分子的方法，該核酸分子包含用於製造iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA及hpRNA)分子之一核苷酸序列。一個這樣的實施例包含：(a)依靠dsRNA-媒介基因箝制，分析一或多個靶定基因(等)在鞘翅目害蟲中的表現、功能及表型；(b)以一探針探測cDNA或gDNA庫，其中該探針包含源自在dsRNA-媒介的箝制分析中展示改變(例如降低)的生長或發育表型之靶定鞘翅目害蟲之一核苷酸序列的全部或部分，或其等之同源物，且；(c)辨識與該探針特異性雜交之一DNA選殖體；(d)分離在步驟(b)中辨識之該DNA選殖體；(e)定序包含在步驟(d)中分離之該選殖體的cDNA或gDNA片段，其中該經定序的核酸分子包含全部或大部分的RNA序列或其等的同源物；及(f)化學合成一基因序列或siRNA或miRNA 或hpRNA或mRNA或dsRNA的全部或大部分。
在進一步實施例中，用於獲得一核酸片段其包含用於製造大部分iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA及hpRNA)分子的一核苷酸序列的方法包括：(a)合成第一及第二寡核苷酸引子其特異性地互補於源自一靶定編鞘翅目害蟲的一原生核苷酸序列之一部分；及(b)使用步驟(a)之該第一及第二寡核苷酸引子放大在一選殖載體中存在的cDNA或gDNA嵌入，其中該經放大的核酸分子包含大部分的siRNA或miRNA或hpRNA或mRNA或dsRNA分子。
本發明之核酸可以藉由許多方法分離、放大或產生的。舉例而言，一iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA及hpRNA)分子可能藉由PCR放大衍自一gDNA或cDNA庫的一靶定核酸序列(例如一靶定基因或一靶定轉錄的非編碼序列)，或其等之部分而獲得。DNA或RNA可能從一靶定生物提取，且核酸庫可能使用該技藝一般技藝人士所知悉的方法由此而製備。從一靶定生物生成之該gDNA或cDNA庫可能使用於PCR放大及靶定基因之定序。已確認的PCR產物可能使用做為一模板，用於以最小啟動子(minimal promoter)在體外轉錄以生成正義及反義RNA。或者，核酸分子可能藉由許多技術任一者合成的(參閱，例如Ozaki等人之“(1992)Nucleic Acids Research,20：5205-5214”；及Agrawal等人之“(1990)Nucleic Acids Research,18：5419-5423”)，包括使用一自動DNA合成儀(舉例而言，P.E.Biosystems公司(加州福斯特城)之一392或394型DNA/RNA 合成儀)，使用標準化學，諸如亞磷醯胺(phosphoramidite)化學。參閱，例如Beaucage等人之“(1992)Tetrahedron,48：2223-2311”；美國專利第4,980,460號、第4,725,677號、第4,415,732號、第4,458,066號及第4,973,679號。或者引致非天然骨幹基團的化學，諸如硫代磷酸酯(phosphorothioate)、胺基磷酸酯(phosphoramidate)、及之類，亦可以採用。
本發明之一RNA、dsRNA、siRNA、miRNA或hpRNA分子可能由熟習該項技藝者透過手動或自動反應化學或酶促製造的，或在體內在包含一核酸分子其包含編碼該RNA、dsRNA、siRNA、miRNA或hpRNA分子之序列的一細胞中製造的。RNA亦可能藉由部分或總有機合成製造的-任何修飾的核糖核苷酸可以藉由體外酶促或有機合成引入。RNA分子可能藉由一細胞RNA聚合酶或一噬菌體RNA聚合酶(例如T3 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶及SP6 RNA聚合酶)合成。對選殖及核苷酸序列表現有用的表現構建體在該技藝中係為已知的。參閱，例如國際PCT公開案第WO97/32016號；及美國專利第5,593,874號、第5,698,425號、第5,712,135號、第5,789,214號及第5,804,693號。化學合成或藉由體外酶促合成的RNA分子可能在引入到一細胞之前純化。舉例而言，RNA分子可以藉由以一溶劑或樹脂提取、沈澱、電泳法、色層分析法，或其等之一組合，而從一混合物中純化。或者，化學合成或藉由體外酶促合成的RNA分子可能沒有純化或最小純化而使用的，舉例而言，以避免歸因於樣品處理的損失。該RNA分子可能乾燥 用於儲存，或溶解在一水溶液中。該溶液可能含有緩衝液或鹽類以促進dsRNA分子雙聯體股的黏合，及/或穩定。
在實施例中，一dsRNA分子可能由一單一的自我互補RNA股或從兩個互補的RNA股形成。dsRNA分子可能在體內或在體外任一中合成。一種細胞內源性RNA聚合酶可能媒介該一或兩個RNA股在體內的轉錄，或選殖的RNA聚合酶可能使用以媒介體內或體外的轉錄。在一鞘翅目害蟲中一靶定基因的轉錄後抑制可能為宿主靶定的，藉由在該宿主之一器官、組織或細胞類型中的特異性轉錄(例如藉由使用一組織特異性啟動子)；該宿主中一環境條件的刺激(例如藉由使用對感染、壓力、溫度及/或化學誘導劑回應的一誘導型啟動子)；及/或於該宿主之發育階段或年齡的遺傳工程轉錄(例如藉由使用一發育階段特異性啟動子)。無論在體外或體內轉錄，形成dsRNA分子的RNA股可能或可能不能夠被聚腺苷酸化，且可能或可能不能夠藉由細胞的轉譯裝置被轉譯成多肽。
D.重組載體及宿主細胞轉形
在一些實施例中，本發明亦提供一DNA分子，用於引入至一細胞中(例如一細菌細胞、酵母細胞或植物細胞)，其中該DNA分子包含一核苷酸序列，該核苷酸序列一旦表現成RNA且由鞘翅目害蟲攝入，實現一靶定基因在該鞘翅目害蟲之細胞、組織或器官中的箝制。因此，一些實施例提供重組核酸分子其包含能夠在一植物細胞中表現為一iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA及hpRNA)分子的一 核酸序列，以抑制靶定基因在鞘翅目害蟲中的表現。為了引發或增強表現，此種重組的核酸分子可能包含一或多個調控序列，該調控序列可能操縱地鏈接到能夠表現為iRNA之該核酸序列。在植物中表現一基因箝制分子的方法係為已知的，且可能使用以表現本發明之一核苷酸序列。參閱，例如國際PCT公開案第WO06/073727號；及美國專利公開案第2006/0200878號)。
在具體實施例中，本發明之一重組DNA分子可能包含一核酸序列其編碼可能形成一dsRNA分子的RNA者。此種重組DNA分子可能編碼RNAs，該者一旦攝入，可能形成能夠抑制鞘翅目害蟲細胞中內源性靶定基因(等)表現的dsRNA分子。在許多實施例中，一轉錄的RNA可能形成可在一穩定形式中提供的一dsRNA分子；例如以一髮夾及莖環結構。
在這些及進一步實施例中，dsRNA分子之一股可能藉由從一核苷酸序列轉錄而形成，該核苷酸序列本質上係同源於以下之一核苷酸序列：序列辨識編號：3、序列辨識編號：3之互補體、至少19個連續的序列辨識編號：3核苷酸之一片段、至少19個連續的序列辨識編號：3核苷酸之片段的互補體、葉甲類生物(例如WCR)之一原生編碼序列其包含序列辨識編號：3者、葉甲類生物包含序列辨識編號：3的原生編碼序列的互補體、葉甲類生物的原生非編碼序列其係轉錄成包含序列辨識編號：3之一原生的RNA分子者、葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：3之一原生RNA 分子的原生非編碼序列的互補體、葉甲類生物(例如WCR)包含序列辨識編號：3之一原生編碼序列的至少19個連續的核苷酸片段；葉甲類生物包含序列辨識編號：3之一原生編碼序列的至少19個連續的核苷酸片段之互補體、葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：3之一原生RNA分子的原生非編碼序列之至少19個連續的核苷酸片段、及葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：3之一原生RNA分子的原生非編碼序列之至少19個連續的核苷酸片段的互補體。
dsRNA分子之一股亦可能藉由從一核苷酸序列轉錄而形成，該核苷酸序本質上係同源於一核苷酸序列其選自由以下所組成之群組：序列辨識編號：1；序列辨識編號：1之互補體；序列辨識編號：2；序列辨識編號：2之互補體；序列辨識編號：4；序列辨識編號：4之互補體；序列辨識編號：5；序列辨識編號：5之互補體；序列辨識編號：6；序列辨識編號：6之互補體；序列辨識編號：7；序列辨識編號：7之互補體；序列辨識編號：103；序列辨識編號：103之互補體；序列辨識編號：104；序列辨識編號：104之互補體；序列辨識編號：105；序列辨識編號：105之互補體；序列辨識編號：106；序列辨識編號：106之互補體；序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之至少19個連續的核苷酸的一片段；序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之至少19個連續的核苷酸片段之互補體；葉甲類生物(例如WCR)包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之一原生編碼序列；葉甲類生物(例如WCR)包含序 列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之一原生編碼序列的互補體；葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者的一原生RNA分子的原生非編碼序列；葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之一原生RNA分子的原生非編碼序列的互補體；葉甲類生物(例如WCR)包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之一原生編碼序列的至少19個連續的核苷酸片段、葉甲類生物包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之一原生編碼序列的至少19個連續的核苷酸片段之互補體、葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之一原生RNA分子的原生非編碼序列之至少19個連續的核苷酸片段、及葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之一原生RNA分子的原生非編碼序列之至少19個連續的核苷酸片段的互補體。
在特定實施例中，編碼dsRNA分子的一重組DNA分子可能在一轉錄序列之內包含至少兩個核苷酸序列，其中該序列係配置的，藉由此，該轉錄序列相對於至少一啟動子，包含一個在正義定向中的核苷酸序列，及另一個在反義定向中的核苷酸序列(包含該第一核苷酸序列的互補體)，其中該正義核苷酸序列與該反義核苷酸序列係藉由從約五(~5)至約一千(~1000)個核苷酸的間隙子序列鏈接或連接的。該間隙子序列可能在該dsRNA分子中的正義及反義序列之間形成一個環。該正義核苷酸序列或該反義 核苷酸序列可能本質上同源於一靶定基因(例如一基因其包含序列辨識編號：1-7及103-106之一者)的核苷酸序列，或其等之片段。在一些實施例中，然而，一重組DNA分子可能編碼一RNA其可能形成一dsRNA分子但不具間隙子序列者。在實施例中，一正義編碼序列及一反義編碼序列長度可能為不同。
序列其辨識在鞘翅目害蟲上具有不利影響或就鞘翅目害蟲具有一植物保護效果者可能透過在本發明的重組核酸分子中創造適當的表現卡匣(expression cassette)而輕易地併入被表現的dsRNA分子。舉例而言，此種序列可能表現為具有一莖環結構之髮夾，藉由取相應於一靶定基因序列(例如序列辨識編號：1-7及103-106任一者，及其等之片段)的一第一段；鏈接此序列至不同源或不互補於該第一段的一第二段間隙子區域；及鏈接此至一第三段，其中至少部分的該第三段本質上係互補於該第一段。此一構建體藉由第一段與該三段的分子內鹼基對形成一莖環結構，其中該環結構形成且包含該第二段。參閱，例如美國專利公開案第2002/0048814號及第2003/0018993號；及國際PCT專利公開案第WO94/01550號及第WO98/05770號。一dsRNA分子可能生成的，舉例而言，在諸如莖環結構(例如髮夾)之雙股結構形式中，從而對一原生鞘翅目害蟲序列靶定的siRNA之製造係藉由共同表現片段的靶定基因而增強，譬如在一額外的植物表現卡匣，該者導致增強的siRNA生產，或降低的甲基化，以防止該dsRNA髮夾啟動子的轉錄基因沈 默。
本發明之實施例包括引入本發明之一重組核酸分子到一植物內(意即，轉形)，以實現一或多個iRNA分子表現的鞘翅目害蟲抑制水平。一重組DNA分子可能為，舉例而言，一載體，諸如一線形或一環狀閉合質體。該載體系統可能為一單一載體或質體，或二或多個一起含有引入宿主基因組內該總DNA的載體或質體。此外，載體可能為一表現載體。本發明之核酸序列可以，舉例而言，適當地嵌入到在一合適啟動子控制下的一載體中，其中該啟動子係在一或多個宿主中作用以驅動一鏈接編碼序列或其它DNA序列的表現。針對此目的，許多載體係可用的，而適當載體之選擇主要將取決於嵌入到該載體的核酸大小，及由該載體轉形的特定宿主細胞。每一載體取決其功能(例如放大DNA或表現DNA)及其相容的特定宿主細胞，含有各種組件。
為了傳遞鞘翅目害蟲抗性至一基因轉殖植物，一重組DNA可能在一重組植物的組織或流體內，舉例而言，轉錄成一iRNA分子(例如形成一dsRNA分子的一RNA分子)。一iRNA分子可能包含一核苷酸序列，該序列本質上同源且特異性地雜交至可能會造成宿主植物物種損害之鞘翅目害蟲之內的一相應的轉錄核苷酸序列。該鞘翅目害蟲可能接觸在該基因轉殖宿主植物細胞中轉錄的該iRNA分子，舉例而言，藉由攝入包含該iRNA分子之該基因轉殖宿主植物的細胞或流體。因此，侵擾該基因轉殖宿主植物之 鞘翅目害蟲內的一靶定基因表現係藉由iRNA分子箝制的。在一些實施例中，靶定基因在該靶定鞘翅目害蟲中表現的箝制可能引致該植物對該害蟲攻擊的抗性。
為了使遞送iRNA分子到鞘翅目害蟲能夠與該經本發明重組核酸分子轉形之一植物細胞在一營養關係中，在該植物細胞中表現(意即，轉錄)iRNA分子係為要求的。因此，重組核酸分子可能包含本發明操縱地鏈接到一或多個調控序列的一核苷酸序列，諸如在宿主細胞作用之一異源性啟動子序列，諸如細菌細胞其中該核酸分子係放大者，及一植物細胞其中該核酸分子係被表現者。
適合在本發明之核酸分子中使用的啟動子包括那些誘導型、病毒、合成、或持續表現型，在該技藝中全部係為眾所周知的。說明此種啟動子的非限制性例子包括美國專利第6,437,217號(玉米RS81啟動子)；第5,641,876號(水稻肌動蛋白啟動子)；第6,426,446號(玉米RS324啟動子)；第6,429,362號(玉米PR-1啟動子)；第6,232,526號(玉米A3啟動子)；第6,177,611號(持續表現型玉米啟動子)；第5,322,938號、第5,352,605號、第5,359,142號、及第5,530,196號(CaMV 35S啟動子)；第6,433,252號(玉米L3油膜蛋白啟動子)；第6,429,357號(水稻肌動蛋白2啟動子及水稻肌動蛋白2內含子)；第6,294,714號(光誘導型啟動子)；第6,140,078號(鹽誘導型啟動子)；第6,252,138號(病原誘導型啟動子)；第6,175,060號(缺磷誘導型啟動子)；第6,388,170號(雙向啟動子)；第6,635,806號(γ-醇溶蛋白(coixin)啟動子)；及美國 專利公開案第2009/757,089號(玉米葉綠體醛醇縮酶啟動子)。額外的啟動子包括胭脂鹼合成酶(NOS)啟動子(Ebert等人之“(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(16)：5745-9)及章魚鹼合成酶(OCS)啟動子(該等係於農桿腫瘤菌之腫瘤誘導質體上實行)；花椰菜嵌紋病毒屬啟動子諸如花椰菜嵌紋病毒(CaMV)19S啟動子(Lawton等人之“(1987)Plant Mol.Biol.9：315-24”)；該CaMV 35S啟動子(Odell等人之“(1985)Nature 313：810-2)；玄參花嵌紋病毒35S-啟動子(Walker等人之“(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(19)：6624-8”)；蔗糖合成酶啟動子(Yang及Russell之“(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：4144-8”)；R基因複合體啟動子(Chandler等人之“(1989)Plant Cell 1：1175-83”)；葉綠素a/b結合蛋白基因啟動子；CaMV 35S啟動子(美國專利第5,322,938號、第5,352,605號、第5,359,142號及第5,530,196號)；FMV 35S(美國專利第6,051,753號及第5,378,619號)；PC1SV啟動子(美國專利第5,850,019號)：SCP1啟動子(美國專利第6,677,503號)；及AGRtu.nos啟動子(GenBankTM登錄號V00087；Depicker等人之“(1982)J.Mol.Appl.Genet.1：561-73”；Bevan等人之“(1983)Nature 304：184-7”)。
在特定實施例中，本發明之核酸分子包含一組織特異性啟動子，諸如一根特異性啟動子。根特異性啟動子驅動操縱鏈接編碼序列專門或優先地在根組織中的表現。根特異性啟動子的例子在該技藝中係為已知的。參閱，例如美國專利第5,110,732號；第5,459,252號及第5,837,848 號；及Opperman等人之“(1994)Science 263：221-3”；及Hirel等人之“(1992)Plant Mol.Biol.20：207-18”。在一些實施例中，根據本發明用於鞘翅目害蟲控制之一核苷酸序列或片段可能選殖在兩個根特異性啟動子之間，其中該兩啟動子相對於該核苷酸序列或片段係定向在相反的轉錄方向，且該核苷酸序列或片段在基因轉殖植物細胞中係為可操縱的並在其中表現以在該基因轉殖植物細胞中製造隨後可能形成dsRNA分子的RNA分子，如前文所描述。在植物組織中表現之該iRNA分子可能由一鞘翅目害蟲攝入的，藉由此，靶定基因表現之箝制係實現的。
可能任選地操縱鏈接至一感興趣核酸分子的額外調控序列包括位於一啟動子序列及一編碼序列之間、作用為一轉譯前導序列的5'UTRs。該轉譯前導序列係存在於完全加工的mRNA中，且其可能影響該初級轉錄體的加工，及/或RNA的穩定性。轉譯前導序列的例子包括玉米及矮牽牛熱休克蛋白質前導(美國專利第5,362,865號)、植物病毒外殼蛋白質前導、植物核酮糖雙磷酸羧化酶前導、及其他。參閱，例如Turner及Foster之“(1995)Molecular Biotech.3(3)：225-36”。5'UTRs之非限制性例子包括GmHsp(美國專利第5,659,122號)；PhDnaK(美國專利第5,362,865號)；AtAnt1；TEV(Carrington及Freed之“(1990)J.Virol.64：1590-7”)；及AGRtunos(GenBankTM登錄號V00087；及Beva等人之“(1983)Nature 304：184-7”)。
可能任選地操縱鏈接至一感興趣核酸分子的額 外調控序列包括3'非轉譯序列、3'轉錄終止區域，或聚腺苷酸化區域。這些係為位於一核苷酸序列下游的遺傳元件，且包括聚核苷酸其提供聚腺苷酸化訊號，及/或其他能夠影響轉錄或mRNA加工的調控訊號。該聚腺苷酸化訊號在植物中作用以造成該mRNA前驅體3'端聚腺苷酸核苷酸的添加。該聚腺苷酸化序列可以衍自於各種植物基因，或衍自T-DNA基因。3'轉錄終止區域之一非限制性例子係為胭脂鹼合成酶3'區域(nos 3'；Fraley等人之“(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803-7”)。不同的3'非轉譯區域之使用的一個例子係提供於Ingelbrecht等人之“(1989)Plant Cell 1：671-80”。聚腺苷酸化訊號的非限制性例子包括一者其源自豌豆(Pisum sativum)RbcS2基因(Ps.RbcS2-E9；Coruzz等人之“(1984)EMBO J.3：1671-9”)及AGRtu.nos(GenBankTM登錄號E01312)。
一些實施例可能包括包含一分離及純化之DNA分子的一植物轉形載體，該DNA分子包含至少一個上文描述、操縱地鏈接到本發明之一或多個核苷酸序列的調控序列。當表現時，該一或多個核苷酸序列引致一或多個RNA分子(等)其包含特異性地互補於在鞘翅目害蟲中一原生RNA分子之全部或部分的一核苷酸序列。因此，該(等)核苷酸序列可能包含一段其編碼存在於一靶定鞘翅目害蟲RNA轉錄體中之一核糖核苷酸序列之全部或一部分，一個存在於，且可能包含一靶定鞘翅目害蟲轉錄體全部或一部分的反向重複。一植物轉形載體可能含有序列其特異性地互補 於超過一個的靶定序列，從而允許製造超過一個的dsRNA，用於抑制靶定鞘翅目害蟲一或多個族群或物種之細胞中二或多個基因的表現。特異性地互補於存在不同基因中之核苷酸序列的核苷酸序列段可以組合成一單一複合核酸分子，用於在一基因轉殖植物中表現。此種段可能為連續的或由間隙子序列分隔。
在一些實施例中，已經含有本發明至少一核苷酸序列(等)的本發明質體可以藉由在相同質體中依序嵌入額外的核苷酸序列(等)而修飾，其中該(等)額外的核苷酸序列係如該初始的至少一核苷酸序列(等)操縱地鏈接到相同的調控元件。在一些實施例中，一核酸分子可能設計用於抑制多重靶定基因。在一些實施例中，該被抑制的多重基因可以從相同的鞘翅目害蟲物種獲得，該者可能增強該核酸分子的有效性。在其他實施例中，該基因可以衍自不同的鞘翅目害蟲，該者可能擴大該(等)藥劑係為有效的鞘翅目害蟲範圍。當多重基因係靶定用於箝制或表現及箝制之組合時，一多順反子DNA元件可以製造的。
本發明之一重組核酸分子或載體可能包含一個可選擇的標記，該者賦予轉形細胞上，諸如一植物細胞，一可選擇的表型。可選擇的標記亦可以使用以選擇包含本發明重組核酸分子的植物或植物細胞。該標記可能編碼殺生物劑抗性、抗生素抗性(例如卡那黴素等、Geneticin(G418)、博來黴素、潮黴素……等等)、或除草劑抗性(例如草甘膦(glyphosate)……等等)。可選擇標記之例 子包括，但不限於：neo基因，該者編碼卡那黴素抗性且可以使用卡那黴素、G418……等等選擇；bar基因，該者編碼雙丙胺膦(bialaphos)抗性；一突變的EPSP合成酶基因，該者編碼草甘膦抗性；腈合成酶(nitrilase)基因，該者賦予對溴苯腈(bromoxynil)的抗性；一突變乙醯乳酸合成酶(ALS)基因，該者賦予咪唑啉酮(imidazolinone)或磺醯脲素抗性；及一抗胺甲基葉酸(methotrexate)DHFR基因。多重可選標記係為可用的，該者賦予對以下之抗性：胺芐青黴素、博萊黴素、氯黴素、建他黴素(gentamycin)、潮黴素、卡那黴素、林可黴素、胺甲基葉酸、草胺膦(phosphinothricin)、嘌呤黴素、觀黴素、利福平、鏈黴素及四環黴素、及之類。此種可選擇標記之例子係例示於，例如美國專利第5,550,318號；第5,633,435號；第5,780,708號及第6,118,047號。
本發明之重組核酸分子或載體亦可能包括一可篩選標記。可篩選標記可能使用以監控表現。示範性的可篩選標記包括β-葡萄糖醛酸苷酶或uidA基因(GUS)，該者編碼各種顯色基質係為已知的酶(Jefferson等人之“(1987)Plant Mol.Biol.Rep.5：387-405”)；R-基因座基因，該者編碼一產物其調控植物組織中花青素色素(紅色)的製造(Dellaporta等人之“(1988)"Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac."在P.Gustafson及R.Appels編輯之18th Stadler Genetics Symposium中，(New York：Plenum),pp.263-82”)；β-內醯胺酶基因(Sutcliffe等人之“(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：3737-41”)；一 基因其編碼各種顯色基質係為已知的酶(例如PADAC，顯色頭孢菌素)；一螢光素酶基因(Ow等人之“(1986)Science 234：856-9”)；xylE基因其編碼可以轉換顯色兒茶酚的兒茶酚雙加氧酶(Zukowski等人之“(1983)Gene 46(2-3)：247-55”)；澱粉酶基因(Ikatu等人之“(1990)Bio/Technol.8：241-2”)；酪胺酸酶基因，該者編碼能夠氧化酪氨酸成為DOPA及多巴醌之酶，後者轉而縮合成黑色素(Katz等人之“(1983)J.Gen.Microbiol.129：2703-14”)；及α-半乳糖苷酶。
在一些實施例中，重組核酸分子，如前文所描述，可能在用於創造基因轉殖植物及在植物中表現異源性核酸的方法中使用的，以製備基因轉殖植物其對鞘翅目害蟲展示降低的易感性。植物轉形載體可以製備，舉例而言，藉由將編碼iRNA分子的核酸分子嵌入到植物轉形載體並將它們引入到植物內。
適合用於轉形宿主細胞的方法包括DNA可以被引入到一細胞中的任何方法，諸如藉由原生質的轉形(參閱，例如美國專利第5,508,184號)，藉由乾燥/抑制(desiccation/inhibition)媒介的DNA攝入(參閱，例如Potrykus等人之“(1985)Mol.Gen.Genet.199：183-8”)，藉由電穿孔(參閱，例如美國專利第5,384,253號)，藉由以碳化矽纖維攪拌(參閱，例如美國專利第5,302,523號及第5,464,765)，藉由農桿菌媒介轉形(參閱，例如美國專利第5,563,055號；第5,591,616號；第5,693,512號；第5,824,877號；第5,981,840號；及第6,384,301號)及藉由加速的DNA包覆顆粒(參閱， 例如美國專利第5,015,580號；第5,550,318號；第5,538,880號；第6,160,208號；第6,399,861號；及第6,403,865號)……等等。對轉形玉米特別有用的技術係描述的，舉例而言，於美國專利第7,060,876號及第5,591,616號；及國際PCT公開案第WO95/06722號。透過諸如這些技術的應用，幾乎任何物種的細胞可能被穩定地轉形。在一些實施例中，轉形DNA係併入到宿主細胞的基因組中。在多細胞物種的情況下，基因轉殖細胞可能再生成一基因轉殖生物。這些技術任一者可能使用以製造基因轉殖植物，舉例而言，在該基因轉殖植物之基因組中包含一或多個編碼一或多個iRNA分子的核酸序列。
用於引入一表現載體至一植物內知最廣泛利用的方法係為奠基於農桿菌的天然轉形系統。農桿腫瘤菌(A.tumefaciens)及農桿根毛菌(A.rhizogenes)係為基因轉形植物細胞的植物病原土壤細菌。農桿腫瘤菌及農桿根毛菌的Ti及Ri質體係分別攜帶負責植物基因轉形的基因。該Ti(腫瘤誘導)-質體含有被稱為T-DNA的一大段，該者係轉移到經轉形的植物中。該Ti質體之另一段，Vir區域，係負責T-DNA的轉移。該T-DNA區域係藉由末端重複接壤的。在修飾的雙元載體中，該腫瘤誘導基因已被刪除，而該Vir區域之功能係利用，以轉移由該T-DNA交界序列接壤的外來DNA。該T-區域亦可能含有用於有效地回收基因轉殖細胞及植物之一可選擇的標記，及一多重選殖位點用於嵌入轉移的序列，諸如編碼dsRNA之一核酸。
因此，在一些實施例中，一植物轉形載體係衍自於農桿腫瘤菌的Ti質體(參閱，例如美國專利第4,536,475號、第4,693,977號、第4,886,937號及第5,501,967號；及歐洲專利第EP 0 122 791號)，或衍自農桿根毛菌的Ri質體。額外的植物轉形載體包括，舉例而言但不限於，那些由以下所描述者：Herrera-Estrella等人之“(1983)Nature 303：209-13”；Bevan等人之“(1983)Nature 304：184-7”；Klee等人之“(1985)Bio/Technol.3：637-42”；及歐洲專利第EP0 120 516號，及那些衍自於前述任一者的。其他與植物自然交互作用的細菌，諸如中華根瘤菌(Sinorhizobium)、根瘤菌(Rhizobium)及中慢生根瘤菌(Mesorhizobium)，可以修飾以媒介許多歧異植物的基因轉移。這些植物關聯的共生細菌可以藉由取得無害的Ti質體及一合適的雙元載體兩者而對基因轉移變成勝任的。
在提供外源DNA至接受細胞之後，轉形細胞係基因辨識的用於進一步培養及植物再生。為了改良辨識轉形細胞的能力，可能欲採用一可選擇或可篩選的標記基因，如先前所陳述，伴隨該使用以製造轉形體的轉形載體。在使用一可選擇標記的情況下，轉形細胞係藉由曝露該細胞到一選擇性藥劑或藥劑等在該潛在轉形細胞族群之內辨識的。在使用一可篩選記的情況下，細胞可能針對該所欲的標記基因性狀被篩選。
細胞其從該選擇性藥劑曝露存活者，或細胞其在一篩選檢測已做記號為陽性者，可能在支持植物再生的 培養基中培養。在一些實施例中，任何合適的植物組織培養培養基(例如MS及N6培養基)可能藉由包括進一步的物質而改質的，諸如生長調控劑。組織可能保持在具有生長調控劑之一基本培養基上，直到足夠的組織可用於開始植物再生工作，或繼之手動選擇的重複回合，直到該組織的形態係適合用於再生(例如至少2個星期)，然後轉移到有益小芽形成的培養基。培養體係週期性地轉移，直到足夠的小芽形成已發生。一旦小芽形成，它們係轉移到有益根形成的培養基。一旦足夠的根形成，植物可以轉移到土壤用於進一步生長及成熟。
為了確認在該再生植物中一感興趣核酸分子(舉例而言，一DNA序列其編碼抑制靶定基因在鞘翅目害蟲中表現之一或多個iRNA分子者)的存在，各式各樣的檢測可能執行。此種檢測包括，舉例而言：分子生物學檢測，諸如南方及北方墨漬法、PCR及核酸定序；生化檢測，諸如偵測一蛋白質產物的存在，例如藉由免疫學手段(ELISA及/或西方墨漬法)，或藉由酶的功能；植物部分的檢測，諸如葉或根檢測；及分析該整個再生植物的表型。
併入事件可能分析的，舉例而言，藉由PCR放大，例如使用對感興趣核酸分子特異性的寡核苷酸引子。PCR基因分型係理解為包括，但不限於，聚合酶鏈反應(PCR)放大衍自分離的宿主植物癒傷組織的基因組DNA，其中該癒傷組織係預測含有一併入到該基因組中之一感興趣核酸分子，繼之標準選殖及定序分析PCR放大產物。PCR基因分 型方法已清楚描述的(舉例而言，Rios,G等人之“(2002)Plant J.32：243-53”)，且可能應用到基因組DNA其衍自於任何植物物種(例如玉米或大豆)或組織類型者，包括細胞培養。
使用依賴農桿菌轉形方法形成的基因轉殖植物典型地含有嵌入到一染色體內的一單一重組DNA序列。該單一重組DNA序列係稱為一“基因轉殖事件”或“併入事件”。此種基因轉殖植物因為該嵌入的外源性序列係為異型合子。在一些實施例中，就基因轉殖而言，一基因轉殖植物同型合子可能藉由有性交配(自交)含有一單一外源性基因序列之獨立分離體基因轉殖植物到自身而獲得的，舉例而言一T0植物，以產生T1種子。該所產生的四分之一T1種子就該轉殖基因而言將為同型合子。發芽的T1種子引致植物其可以用於異型合子歧異度測試者，典型地使用允許區別異型合子與同型合子之間(意即，接合子(zygosity)檢測)的SNP檢測或熱放大檢測。
在特定實施例中，在具有一鞘翅目害蟲抑制效果的植物細胞中，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多個不同的iRNA分子係產生的。該iRNA分子(例如dsRNA分子)可能從在不同轉形事件中引入之多重核酸序列表現的，或從在一單一轉形事件中引入之一單一核酸序列表現的。在一些實施例中，數個iRNA分子係於一單一啟動子控制下表現的。在其他實施例中，數個iRNA分子係於多重啟動子控制下表現的。單一iRNA分子可能表現的，該者包含多重核酸序列其每一者係同源於在一或多個鞘翅目害蟲之 內的不同基因座(舉例而言，由序列辨識編號：3、及序列辨識編號：1、2、4-7及103-106中一或多個所界定的基因座)，無論是在相同鞘翅目害蟲物種中的不同族群，或在不同物種的鞘翅目害蟲中。
除了以重組核酸分子直接轉形一植物之外，基因轉殖植物可以藉由將具有至少一基因轉殖事件的第一植物與缺乏此種事件的第二植物雜交而製備的。舉例而言，包含編碼一iRNA分子之一核苷酸序列的重組核酸分子可能引入至一第一植物品系其順應於轉形以產生一基因轉殖植物者，該基因轉殖植物可能與一第二植物品系雜交以滲入(introgress)編碼該iRNA分子之該核苷酸序列到該第二植物品系內。
本發明亦包括含有本發明該一或多個序列的商品產物。特定實施例包括商品產物其產自於含有本發明該一或多個核苷酸序列的一重組植物或種子。含有本發明該一或多個序列的一種商品產物係意欲包括，但不僅於，一植物之膳食、油、粉碎或全穀物或種子，或任何食品產品其包含一重組植物或種子的任何膳食、油或粉碎或全穀物，其中該重組植物或種子含有本發明之該一或多個序列。在於此所思量之一或多個商品或商品產物中偵測本發明之該一或多個序列係為一事實上的證據，該者表明該商品或商品產物係產自於設計以表現本發明之一或多個核苷酸序列的一基因轉殖植物，為了達到使用dsRNA媒介基因箝制方法控制植物疾病的目的。
在一些觀點中，由衍自轉形植物細胞的基因轉殖植物產生的種子及商品產物係為包括的，其中該種子或商品產物包含可檢測數量的本發明之一核酸序列。在一些實施例中，此種商品產物可能製造的，舉例而言，藉由獲得基因轉殖植物並從該者製備食物或飼料。包含本發明該一或多個核酸序列之商品產物包括，舉例而言但不限於：一植物之膳食、油、粉碎或全穀物或種子，及任何食品產物其包含一重組植物或種子的任何膳食、油或粉碎或全穀物，其中該重組植物或種子含有本發明之該一或多個序列。在一或多個商品或商品產物中偵測本發明之該一或多個序列係為一事實上的證據，該者表明該商品或商品產物係產自於設計以表現本發明之一或多個核苷酸序列的一基因轉殖植物，為了達到使用dsRNA媒介基因箝制方法控制植物疾病的目的。
在一些實施例中，包含本發明之一核酸分子的一基因轉殖植物種子亦可能在其基因組中包含至少一其他的基因轉殖事件，包括但不限於：一基因轉殖事件，該者轉錄一iRNA分子其在鞘翅目害蟲中靶定非由序列辨識編號：1-7及103-106一者中所界定的一基因座(舉例而言但不限於，CAF1-180(2011年12月30號提申之PCT國際申請案第PCT/US2011/068062號)、VatpaseC(2011年12月30號提申之PCT國際申請案第PCT/US2011/068144號、VatpaseH(2011年12月30號提申之PCT國際申請案第PCT/US2011/068162號及Rho1(2011年12月30號提申之PCT國際申請案第 PCT/US2011/068188號))；一基因轉殖事件，該者轉錄一iRNA分子其在非鞘翅目害蟲之一生物中靶定一基因(例如一植物寄生線蟲)；一基因其編碼殺蟲蛋白質(例如蘇雲金芽孢桿菌的殺蟲蛋白質，諸如舉例而言，Cry34Ab1(美國專利第6,127,180號、第6,624,145號及第6,340,593號)、Cry35Ab1(美國專利第6,083,499號、第6,548,291號及第6,340,593號)、在一單一事件中一“Cry34/35Ab1”組合(例如玉米事件DAS-59122-7；美國專利第7,323,556號)、Cry3A(例如美國專利第7,230,167號)、Cry3B(例如PCT國際申請案第PCT/US1999/018883號)、Cry6A(例如美國專利第6,831,062號)及其等之組合(例如2011年4月15日提申之PCT國際申請案第PCT/US11/033618號、2011年4月22號提申之第PCT/US11/033618號及2011年4月22號提申之第PCT/US11/033617))；除草劑耐受性基因(例如一基因其提供對草甘膦、固殺草、麥草畏dicamba或2,4-D之耐受性(例如美國專利第7,838,733號))；及一基因其促成該基因轉殖植物一所欲的表型，諸如提高的產量、改變的脂肪酸代謝、或細胞質雄性不育的修復)。在特定實施例中，本發明編碼iRNA分子的序列可能與在一植物中的其他昆蟲控制及疾病性狀組合的，以實現所欲的性狀，用於增強植物疾病及昆蟲損害的控制。組合的昆蟲控制性狀其採用區別的作用模式者可能提供受保護的基因轉殖植物優越的耐久力，超越植物其懷有一單一的控制性狀者，舉例而言，因為在田間對該(等)性狀抗性之發展的機率將會降低。
V.鞘翅目害蟲中靶定基因的箝制
A.概述
在本發明之一些實施例中，至少一個對鞘翅目害蟲控制有用的核酸分子可能提供至一鞘翅目害蟲，其中該核酸分子在鞘翅目害蟲中導致RNAi媒介的基因沈默。在特定實施例中，一iRNA分子(例如dsRNA、siRNA、miRNA及hpRNA)可能提供至該鞘翅目宿主。在一些實施例中，對鞘翅目害蟲控制有用之一核酸分子可能藉由將該核酸分子與該鞘翅目害蟲接觸而提供至一鞘翅目害蟲。在這些及進一步實施例中，對鞘翅目害蟲控制有用之一核酸分子可能在該鞘翅目害蟲的飼料基質中提供的，舉例而言，一營養組成物。在這些及進一步實施例中，對鞘翅目害蟲控制有用之一核酸分子可能透過攝入包含該核酸分子的植物材料而提供的，其中該核酸分子係由該鞘翅目害蟲攝入的。在某些實施例中，該核酸分子係透過表現引入到該植物材料內之一重組核酸序列而存在於該植物材料中，舉例而言，藉由以包含該重組核酸序列之一載體轉形一植物細胞，並從該轉形植物細胞再生一植物材料或整個植物。
B. RNAi-媒介之靶定基因箝制
在實施例中，本發明提供iRNA分子(例如dsRNA、siRNA、miRNA及hpRNA)其可能設計以靶定在一鞘翅目害蟲(例如WCR或NCR)轉錄體學(transcriptome)中必要的原生核苷酸序列(例如必要基因)，舉例而言，藉由設計一iRNA分子，其中該iRNA分子包含至少一股其包含特異性 地互補於該靶定序列的一核苷酸序列。如此設計的iRNA分子序列可能相似於該靶定序列，或可能併入不會防止該iRNA分子與其靶定序列之間特異性雜交的失配。
本發明之iRNA分子可能在一鞘翅目害蟲之基因箝制之方法中使用的，由此降低由該害蟲在一植物上所造成之損害的水平或發病率(舉例而言，一受保護轉形植物包含一iRNA分子)。如於此所使用，該術語“基因箝制”意指用於降低從基因轉錄為mRNA及隨後該mRNA轉譯之結果所製造的蛋白質水平之任何眾所周知的方法，包括降低蛋白質從一基因或一編碼序列的表現，包括轉錄後表現抑制及轉錄箝制。轉錄後抑制係藉由從用於箝制之一靶定基因轉錄之mRNA的全部或部分與該相應使用於箝制的iRNA分子之間特異性同源而媒介的。此外，轉錄後抑制意指在該細胞中可用於核糖體結合的mRNA數量之一大量與可測量的降低。
在iRNA分子係為一dsRNA分子的實施例中，該dsRNA分子可能由該酶，DICER，切割成短的siRNA分子(長度大約20個核苷酸)。藉由DICER活性在該dsRNA分子上生成之該雙股siRNA分子可能分開成兩個單股的siRNA；該“過客股”與該“引導股”。該過客股可能被降解，而該引導股可能併入到RISC中。轉錄後抑制藉由該引導股與一mRNA分子之特異性互補序列的特異性雜交而發生，且隨後由該酶，Argonaute(該RISC複合體之催化劑組件)切割。
在本發明之實施例中，任何形式的iRNA分子可 能使用的。熟習該項技藝者將理解的是，較諸單股RNA分子，dsRNA分子在製備期間及在提供該iRNA分子至一細胞之該步驟期間典型的係更穩定的。因此，雖然siRNA及miRNA分子，舉例而言，在一些實施例中可能同樣有效的，dsRNA分子歸因其穩定性可能被擇取。
在特定實施例中，包含一核苷酸序列之一核酸分子係提供的，該核苷酸序列可能在體外表現以產生一iRNA分子，該iRNA分子本質上係同源於由一鞘翅目害蟲之基因組內的一核苷酸序列所編碼的一核酸分子。在某些實施例中，該體外轉錄的iRNA分子可能為包含一莖環結構的一穩定dsRNA分子。在一鞘翅目害蟲接觸該體外轉錄之iRNA分子之後，靶定基因(舉例而言，一必要基因)在該鞘翅目害蟲中的轉錄後抑制可能發生。
在本發明之一些實施例中，包含一核苷酸序列之至少19個連續核苷酸的一核酸分子的表現可能在用於轉錄後抑制鞘翅目害蟲之一靶定基因的方法中使用的，其中該核苷酸序列係選自由以下所組成的群組：序列辨識編號：3、序列辨識編號：3之互補體、至少19個連續的序列辨識編號：3核苷酸之一片段、至少19個連續的序列辨識編號：3核苷酸之片段的互補體、葉甲類生物(例如WCR)之一原生編碼序列其包含序列辨識編號：3者、葉甲類生物包含序列辨識編號：3的原生編碼序列的互補體、葉甲類生物的原生非編碼序列其係轉錄成包含序列辨識編號：3之一原生的RNA分子者、葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：3 之一原生RNA分子的原生非編碼序列的互補體、葉甲類生物(例如WCR)包含序列辨識編號：3之一原生編碼序列的至少19個連續的核苷酸片段；葉甲類生物包含序列辨識編號：3之一原生編碼序列的至少19個連續的核苷酸片段之互補體、葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：3之一原生RNA分子的原生非編碼序列之至少19個連續的核苷酸片段、及葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：3之一原生RNA分子的原生非編碼序列之至少19個連續的核苷酸片段的互補體。在某些實施例中，一核酸分子之表現係至少80%相似於(例如80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約100%及100%)可能被使用的前述任一者。在這些及進一步實施例中，核酸分子其特異性地雜交到存在於鞘翅目害蟲至少一細胞中之一RNA分子者可能被表現的。
在一些實施例中，包含一核苷酸序列之至少19個連續核苷酸的至少一種核酸分子的表現可能在用於轉錄後抑制鞘翅目害蟲之一靶定基因的方法中使用的，其中該核苷酸序列係選自由以下所組成的群組：序列辨識編號：1；序列辨識編號：1之互補體；序列辨識編號：2；序列辨識編號：2之互補體；序列辨識編號：4；序列辨識編號：4之互補體；序列辨識編號：5；序列辨識編號：5之互補體；序列辨識編號：6；序列辨識編號：6之互補體；序列辨識編號：7；序列辨識編號：7之互補體；序列辨識編號：103； 序列辨識編號：103之互補體；序列辨識編號：104；序列辨識編號：104之互補體；序列辨識編號：105；序列辨識編號：105之互補體；序列辨識編號：106；序列辨識編號：106之互補體；序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之至少19個連續的核苷酸的一片段；序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之至少19個連續的核苷酸片段之互補體；葉甲類生物(例如WCR)包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之一原生編碼序列；葉甲類生物(例如WCR)包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之一原生編碼序列的互補體；葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者的一原生RNA分子的原生非編碼序列；葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之一原生RNA分子的原生非編碼序列的互補體；葉甲類生物(例如WCR)包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之一原生編碼序列的至少19個連續的核苷酸片段；葉甲類生物包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之一原生編碼序列的至少19個連續的核苷酸片段之互補體、葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之一原生RNA分子的原生非編碼序列之至少19個連續的核苷酸片段、及葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：1、2、4-7及103-106任一者之一原生RNA分子的原生非編碼序列之至少19個連續的核苷酸片段的互補體。在某些實施例中，一核酸分子之表現係至少80%相似於(例如80%、約81%、約82%、約83%、約84%、 約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約100%及100%)可能被使用的前述任一者。在這些及進一步實施例中，核酸分子其特異性地雜交到存在於鞘翅目害蟲至少一細胞中之一RNA分子者可能被表現的。在特定實施例中，此一核酸分子可能包含一核苷酸序列其選自由序列辨識編號：99-102及107所組成之群組。
本發明一些實施例之一重要特徵係為，該RNAi轉錄後抑制系統係能夠容忍靶定基因中的序列變化，該者歸因於基因突變、品種多型性(strain polymorphism)或演化分歧係為可預期的。該所引入的核酸分子可能不需要絕對同源於一靶定基因之初級轉錄產物或完全加工的mRNA任一的，只要該引入的核酸分子係特異性地雜交至該靶定基因之初級轉錄產物或完全加工的mRNA任一的。再者，該引入的核酸分子可能不需要為全長，相對於該靶定基因之初級轉錄產物或完全加工的mRNA任一而言。
使用本發明之該iRNA技術抑制一靶定基因係為序列特異性；意即核苷酸序列其本質上同源於該(等)iRNA分子者係靶定用於基因抑制。在一些實施例中，一RNA分子其包含相似於部分的靶定基因序列之一核苷酸序列可能使用於抑制。在這些及進一步實施例中，一RNA分子其包含相對於一靶定基因序列具一或多個嵌入、缺失及/或點突變的一核苷酸序列者可能被使用的。在特定實施例中，一iRNA分子與一靶定基因之一部分可能共享，舉例 而言，至少從約80%、至少從約81%、至少從約82%、至少從約83%、至少從約84%、至少從約85%、至少從約86%、至少從約87%、至少從約88%、至少從約89%、至少從約90%、至少從約91%、至少從約92%、至少從約93%、至少從約94%、至少從約95%、至少從約96%、至少從約97%、至少從約98%、至少從約99%、至少從約100%、及100%的序列相似度。或者，一dsRNA分子之雙聯體區域可能與一靶定基因轉錄體的一部分特異性地雜交。在特異性雜交的分子中，展示較大同源性之一小於全長的序列補償一較長、較不同源的序列。dsRNA分子相似於部分的靶定基因轉錄體之該雙聯體區域的核苷酸序列長度可能至少約25、50、100、200、300、400、500、或至少約1000個鹼基。在一些實施例中，大於20-100核苷酸之一序列可能使用的。在特定實施例中，大於約200-300核苷酸之一序列可能使用的。在特定實施例中，大於約500-1000核苷酸之一序列可能使用的，取決於該靶定基因的大小。
在某些實施例中，靶定基因在鞘翅目害蟲中的表現可能在該鞘翅目害蟲之細胞內抑制至少10%；至少33%；至少50%；或至少80%，藉由此，一顯著的抑制發生。顯著的抑制意指抑制超過一閾值其引致一可偵測的表型(例如生長、取食、發育的停止、死亡率……等等)，或相應於該被抑制的靶定基因，在RNA及/或基因產物中一可偵測的下降。雖然在本發明之某些實施例中，抑制本質上發生在鞘翅目害蟲的所有細胞中，在其他實施例中抑制只發生 在表現該靶定基因之一子集細胞中。
在一些實施例中，轉錄箝制係藉由對一啟動子DNA序列或其等之互補體展示大幅序列相似度之一dsRNA分子在細胞中的存而媒介，以招致稱為“啟動子反向箝制(promoter trans suppression)“。基因箝制對可能攝入或接觸此種dsRNA分子之鞘翅目害蟲中的靶定基因可能為有效的，舉例而言，藉由攝入或接觸含有該dsRNA分子的植物材料。在啟動子反向箝制中使用的dsRNA分子可能特異性地設計，以抑制或箝制在該鞘翅目害蟲細胞中一或多個同源或互補序列的表現。藉由反義或正義定向之RNA的轉錄後基因箝制以調控植物細胞中的基因表現係揭露於美國專利第5,107,065號；第5,759,829號；第5,283,184號；及第5,231,020號。
C.表現提供至鞘翅目害蟲的iRNA分子
表現iRNA分子用於在一鞘翅目害蟲中RNAi媒介基因抑制，可能在許多體外或體內格式之任一者中實行。該iRNA分子然後可能提供至一鞘翅目害蟲，舉例而言，藉由將該iRNA分子與該害蟲接觸，或藉由造成該害蟲攝入或其他方式內化該iRNA分子。本發明之一些實施例包括鞘翅目害蟲經轉形之宿主植物、經轉形植物細胞、及轉形植物的後代。該轉形植物細胞及轉形植物可以遺傳工程以表現一或多個iRNA分子，舉例而言，在一異源性啟動子控制下，以提供一害蟲保護效果。因此，當一基因轉殖植物或植物細胞係由一鞘翅目害蟲在取食期間消耗的，該害 蟲可能攝入在該基因轉殖植物或細胞中表現的iRNA分子。本發明之核苷酸序列亦可能引入至廣泛的原核及真核微生物宿主，以製造iRNA分子。該術語“微生物”包括原核及真核物種，諸如細菌及真菌。
基因表現調變可能包括此種表現的部分或完全箝制。在另一實施例中，一種用於箝制鞘翅目害蟲中基因表現的方法包含：在該害蟲宿主之組織中提供一基因箝制數量的至少一dsRNA分子，其中該dsRNA分子係在如此所描述之一核苷酸序列轉錄之後形成，且該核苷酸序列之至少一段係互補於在該鞘翅目害蟲細胞內的一mRNA序列。根據本發明，由鞘翅目害蟲攝入的一dsRNA分子，包括其改質形式諸如一siRNA、miRNA、或hpRNA分子，可能至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或約100%相似於從一核酸分子轉錄的一RNA分子，其中該核酸分子包含一核苷酸序列其選自由序列辨識編號：1-7及103-106所組成的群組。分離且本質上純化的核酸分子所以係提供，包括但不限於，非天然發生的核苷酸序列及用於提供本發明dsRNA分子的重組DNA構建體，該者當引入其中時，箝制或抑制鞘翅目害蟲中一內源性編碼序列或靶定編碼序列的表現。
特定實施例提供一種遞送系統，該者遞送用於轉錄後抑制在一鞘翅目植物害蟲中之一或多個靶定基因(等)並控制該鞘翅目植物害蟲族群的iRNA分子。在一些實 施例中，該遞送系統包含攝入一宿主基因轉殖植物細胞或攝入包含在該宿主細胞中轉錄之RNA分子的該宿主細胞內含物。在這些及進一步實施例中，一基因轉殖植物細胞或一基因轉殖植物係創造的，該者含有提供本發明之一穩定dsRNA分子的一重組DNA構建體。包含核酸序列其編碼一特定iRNA分子的基因轉殖植物細胞及基因轉殖植物可能產生的，藉由採用重組DNA技術(該者之基本技術在該技藝中係為眾所周知的)，以構建一植物轉形載體其包含編碼本發明之一iRNA分子(例如一穩定的dsRNA分子)的一核苷酸序列；轉形一植物細胞或植物；及再生含有該轉錄iRNA分子的基因轉殖植物細胞或基因轉殖植物。
為了賦予鞘翅目害蟲抗性至一基因轉殖植物，一重組DNA分子可能，舉例而言，轉錄成iRN分子，諸如一dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子或hpRNA分子。在一些實施例中，從一重組DNA分子轉錄的一RNA分子可能在該重組植物之組織或流體內形成dsRNA分子。此一dsRNA分子可能包含在一核苷酸序列的一部分，該核苷酸序列係相似於一相應的核苷酸序列，該者係從可能侵擾該宿主植物之鞘翅目害蟲類型之內的一DNA序列轉錄的。靶定基因在該鞘翅目害蟲內的表現係藉由該攝入或以其他方式接觸之dsRNA分子而箝制的，且該靶定基因在鞘翅目害蟲中表現之箝制引致了，舉例而言，鞘翅目害蟲取食的停止，而最終的結果係為，舉例而言，該基因轉殖植物係免受該鞘翅目害蟲的進一步損害。dsRNA分子的調變效果已 顯示適用於在害蟲中表現的各種基因，包括，舉例而言，內源性基因其負責細胞代謝或細胞轉形者，包括內務基因；轉錄因子；蛻皮相關基因；及其他基因其編碼涉及細胞代謝或正常生長及發育之多肽者。
對於從體內轉殖基因或一表現構建體轉錄，一調控區域(例如啟動子、增強子、沈默子及聚腺苷酸化訊號)可能在一些實施例中使用以轉錄該RNA股(或股等)。所以，在一些實施例中，如前文所陳述，為了在製造iRNA中使用，一核苷酸序列可能操縱地鏈接到一或多個在植物宿主細胞中作用的啟動子序列。該啟動子可能為一內源性啟動子，通常駐留在宿主基因組中。本發明之該核苷酸序列，在該操縱鏈接之啟動子序列的控制下，可能進一步被有利地影響其轉錄及/或該所得到轉錄體穩定性的額外序列側接的。此種序列可能位於該操縱鏈接啟動子的上游，該表現構建體3'端的下游，且可能發生於該啟動子上游與該表現構建體3'端下游兩者。
一些實施例提供方法，用於降低由取食該植物之一鞘翅目害蟲所造成的宿主植物(例如玉米植物)損害，其中該方法包含在該宿主植物中提供一轉形植物細胞其表現本發明至少一種的核酸分子，其中該(等)核酸分子一但由該鞘翅目害蟲取用，作用以抑制在該鞘翅目害蟲內一靶定序列的表現，該表現抑制引致該鞘翅目害蟲的死亡率、降低生長、及/或降低的生殖，從而降低由該鞘翅目害蟲對該宿主植物造成的損害。在一些實施例中，該(等)核酸分子包含 dsRNA分子。在這些及進一步實施例中，該(等)核酸分子包含dsRNA分子，其中該dsRNA分子每一者包含超過一個特異性地雜交到在鞘翅目害蟲細胞中表現之一核酸分子的核苷酸序列。在一些實施例中，該(等)核酸分子係由一核苷酸序列組成，其中該核苷酸序列係特異性地雜交至在鞘翅目害蟲細胞中表現的一核酸分子。
在一些實施例中，用於提高玉米作物產量之一方法係提供，其中該方法包含引入本發明至少一種的核酸分子到玉米植物；培育該玉米植物以允許包含該核酸序列的一iRNA分子之表現，其中包含該核酸序列的iRNA分子之表現抑制鞘翅目害蟲損害及/或生長，從而降低或消除歸因於鞘翅目害蟲侵擾的產量損失。在一些實施例中，該iRNA分子係為dsRNA分子。在這些及進一步實施例中，該(等)核酸分子包含dsRNA分子，其中該dsRNA分子每一者包含超過一個特異性地雜交到在鞘翅目害蟲細胞中表現之一核酸分子的核苷酸序列。在一些實施例中，該核酸分子(等)係由一核苷酸序列組成，其中該核苷酸序列係特異性地雜交至在鞘翅目害蟲細胞中表現的一核酸分子。
在一些實施例中，用於調變一靶定基因在一鞘翅目害蟲中之表現的一方法係提供，該方法包含：以包含一核酸序列的一載體轉形植物細胞，其中該核酸序列編碼本發明至少一核酸分子，且其中該核苷酸序列係操縱地鏈接至一啟動子及一轉錄終止序列；在足以允許包含數個轉形植物細胞之植物細胞培養發展的條件下培養該轉形的植 物細胞；選擇已經將該核酸分子併入其基因組的轉形植物細胞；篩選該轉形植物細胞其表現由該併入核酸分子所編碼之一iRNA分子；選擇一基因轉殖植物細胞其表現該iRNA分子者；及餵食該經選擇的基因轉殖植物細胞至該鞘翅目害蟲。植物亦可能從表現由該併入核酸分子所編碼之iRNA分子的轉形植物細胞再生的。在一些實施例中，該iRNA分子係為dsRNA分子。在這些及進一步實施例中，該(等)核酸分子包含dsRNA分子，其中該dsRNA分子每一者包含超過一個特異性地雜交到在鞘翅目害蟲細胞中表現之一核酸分子的核苷酸序列。在一些實施例中，該(等)核酸分子係由一核苷酸序列組成，其中該核苷酸序列係特異性地雜交至在鞘翅目害蟲細胞中表現的一核酸分子。
本發明之iRNA分子可以併入於一植物物種(例如玉米)之種子內，無論是做為源自併入植物細胞基因組中之一重組基因的產物表現，或是併入至種植之前施加到種子的塗料或種子處理。包含重組基因之一植物細胞係視為一基因轉殖事件。亦包括在本發明實施例中的係為用於遞送iRNA分子到鞘翅目害蟲的遞送系統。舉例而言，本發明之iRNA分子可能直接引入鞘翅目害蟲的細胞。引入的方法可能包括將iRNA與源自一鞘翅目害蟲宿主的植物組織直接混合，以及施用包含本發明iRNA分子的組成物至宿主植物組織。舉例而言，iRNA分子可能噴灑到植物表面。或者，iRNA分子可能由微生物表現，且該微生物可能施用到該植物表面，或藉由諸如注射之物理手段，引入到根或莖中。 如前文所討論，一基因轉殖植物亦可能遺傳工程以表現至少一iRNA分子，在一數量其足以殺死已知侵擾該植物的鞘翅目害蟲。藉由化學或酶促合成製造的iRNA分子亦可能在一致於普遍農業做法的方式中配製，並使用做為用於控制鞘翅目害蟲植物損害的噴霧產品。該調配物可能包括針對有效葉面覆蓋(foliar coverage)所需的適當展著劑(stickers)及增濕劑，以及UV防護劑以保護iRNA分子(例如dsRNA分子)免受紫外線損害。此種添加劑在生物殺蟲劑工業係為普遍的，且對熟習該項技藝者係為眾所周知的。此種應用可能與其他噴霧殺蟲劑應用(基於生物學或其他方式)組合，以增強對鞘翅目害蟲的植物保護。
於此列出的所有參考文獻，包括公開案、專利及專利申請案，係併入於此以做為參考，倘若它們與此揭露內容之明確細節係不一致的，且亦併入的，倘若每一參考文獻如果個別且特異性地指出係併入以做為參考且於此以其整體陳述的。於此所討論之該等參考文獻係純粹因為它們的揭露內容係先於本申請案的申請日之前而提供的。於此任何信息不解釋為承認本發明者無資格憑藉以往的發明給此揭露內容寫上比實際書寫日期早的日期。
下列之例子係提供以例示某些特定的特徵及/或觀點。這些例子不應解釋為限制揭露內容至所描述的特定特徵或觀點。
例子
例子1：材料與方法
樣品製備及生物檢測.
許多dsRNA分子(包括那些相應於PP1-87B、RPA70 Reg1、RPA70 Reg2、RPA70 Reg3、及RPS6)係使用MEGAscript® RNAi套組合成及純化。該純化的dsRNA分子係於TE緩衝液中製備，且所有生物檢測含有由此緩衝液組成之一對照處理，該者擔任WCR死亡率或生長抑制的背景檢查。dsRNA分子在該生物檢測緩衝液中之濃度係使用NanoDropTM 8000分光光度計測量(賽默飛科技，威爾明頓，特拉華州)。
樣品係針對昆蟲活性在生物檢測中測試的，該生物檢測係以新生的昆蟲幼蟲在人工昆蟲飲食上進行的。WCR卵係從Crop Characteristics公司(明尼蘇達州法明頓)獲得。
該生物檢測係於特異性地針對昆蟲生物檢測設計的128孔塑膠盤中進行(C-D國際，皮特曼，新澤西州)。每孔含有大約1.0 mL針對鞘翅目昆蟲生長設計的飲食。一60 μL等分試樣的dsRNA樣品係藉由移液管遞送至每一孔1.5 cm2的飲食表面積(diet surface)上(40 μL/cm2)。dsRNA樣品濃度係計算為該孔中每平方公分表面積dsRNA的數量(ng/cm2)。該經處理的孔盤係維持在通風櫥中，直到該飲食表面積上的液體蒸發或吸收到該飲食內。
在羽化幾個小時之內，個別幼蟲係以沾濕的駝毛刷挑起並放置在該經處理的飲食上(每孔一或二隻幼蟲)。該128孔塑膠盤之受侵擾孔然後係以透明塑膠黏接片 密封的，並開孔以讓氣體交換。生物檢測盤係維持在受控的環境條件下(28℃，~40%相對濕度，16：8(光：暗))達9天，在那之後，曝露到每個樣品的昆蟲總數、死亡的昆蟲數、及存活昆蟲的重量係記錄的。對每一處理，死亡率百分比、平均活體重及生長抑制係計算。發育遲緩(Stunting)係界定為在平均活體重中的下降。生長抑制(GI)係如以下計算：GI=[1-(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]
其中TWIT係為該處理中活蟲的總重量；TNIT係為該處理中昆蟲的總數；TWIBC係為在該背景檢查(緩衝液對照)中活蟲的總重量；及TNIBC係為在該背景檢查(緩衝液對照)中昆蟲的總數。
GI50係確定為GI值是50%時樣品在該飲食中的濃度。LC50(50%致死濃度)係記錄為50%測試昆蟲被殺死時樣品在該飲食中的濃度。統計分析係使用JMPTM軟體(SAS，北卡羅來納州卡里)進行。
重複的生物檢測證明，攝入特定樣品引致一令人驚訝且非預期的玉米根蟲幼蟲死亡率及生長抑制。
例子2：候選靶定基因的辨識
WCR(西方玉米根蟲)的多階段發育係選定用於匯集的轉錄體學分析，以提供候選的靶定基因序列，用於藉由RNAi基因轉殖植物昆蟲抗性技術控制。
總RNA係從約0.9克整隻的一齡WCR幼蟲(西方 玉米根蟲；孵化後4至5天，維持在16℃)分離，並使用下列苯酚/TRI REAGENT®為基礎的方法(分子研究中心，俄亥俄州辛辛那提市；目錄號TR 118)純化：幼蟲係於室溫下在15 mL的均化器中以10 mL TRI REAGENT®均化，直至獲得一均勻的懸浮液為止。繼5分鐘室溫中培育之後，該均質物係分配至1.5 mL微量離心管中(每管1 mL)，加入200 μL的氯仿，並將該混合物劇烈震盪15秒。在允許該提取於室溫靜置10 min之後，該等相係藉由12,000x g於4℃下離心而分開。上層相(包含約0.6 mL)係小心地轉移到另一個無菌的1.5 mL管子中，且一等體積(0.6 mL)的室溫異丙醇係加入。在室溫中培育5至10 min之後，該混合物係於12,000x g離心8 min(4℃或25℃下)。
該上清液係小心地移除並丟棄，而該RNA沈澱物係藉由以75%乙醇渦漩洗滌兩次，且在每次洗滌之後藉由7,500x g離心5min(4℃或25℃)回收。該乙醇係小心地移除，該沈澱物係允許空氣乾燥計3至5 min，且然後溶解於無核酸酶的無菌水中。RNA濃度係藉由測量260 nm及280 nm處的吸光度(A)而確定。一典型的提取從約0.9 g幼蟲中產出高於1 mg的總RNA，伴隨A260/A280比值為1.9。由此提取的RNA係儲存於-80℃，直到進一步加工。
RNA品質係藉由將等分試樣通過一1%瓊脂糖凝膠展開而確定。該瓊脂糖凝膠溶液係使用經滅菌的10x TAE緩衝液(Tris-乙酸EDTA，1x濃度為0.04 M Tris-乙酸、1mM的EDTA(乙二胺四乙酸的鈉鹽)，pH為8.0)以DEPC(焦 碳酸二乙酯)-處理的水在一滅菌容器中稀釋製成。1x TAE係使用做為該展開緩衝液。在使用之前，該電泳槽及該孔形成梳係以RNAseAwayTM(英傑生命技術(Invitrogen)公司，加州卡爾斯巴德)清洗。兩μL的RNA樣品係與8 μL的TE緩衝液(10 mM的Tris HCl，pH為7.0；1 mM EDTA)及10 μL的RNA樣品緩衝液(Novagen®目錄號70606；EMD4生命科學，新澤西州吉布鎮(Gibbstown))混合。該樣品係於70℃加熱3 min，冷卻至室溫，且每孔係加載5 μL(含1 μg至2 μg的RNA)。市售的RNA分子量標記係同時在分隔的孔中展開，用於分子大小比較。該凝膠係於60 v中展開2小時。
一標準化的cDNA庫係由商業服務提供商(Eurofins MWG Operon，阿拉巴馬州亨茨維爾)從幼蟲總RNA製備的，使用隨機引子。
該標準化幼蟲cDNA庫係於1/2底片尺度(plate scale)，藉由GS FLX 454 TitaniumTM系列化學於Eurofins MWG Operon定序，該者引致超過600,000的讀取伴隨348 bp之一平均讀取長度。350,000讀取係組裝成高於50,000的片段重疊群。該未組裝讀取及該片段重疊群兩者皆使用公開可用的程式FORMATDB(可從NCBI獲得)轉換成BLASTable數據庫。
總RNA及標準化cDNA庫同樣從來自其他WCR發育階段收穫的材料製備。一用於靶定基因篩選的匯集轉錄體學庫係藉由組合代表各種發育階段的cDNA庫成員而構建的。
RNAi靶定的候選基因係使用資訊其考慮特定基因在諸如果蠅(Drosophila)及穀蛀蟲(Tribolium)其他昆蟲中的致命RNAi效果而選擇。這些基因係假設為對鞘翅目昆蟲之生存與生長為必要的。選定的靶定基因同源物係如下文所描述般在該轉錄體學序列數據庫中辨識的。該等靶定基因之全長或部分序列係藉由PCR放大，以製備用於雙股RNA(dsRNA)製造的模板。
使用候選蛋白質編碼序列的TBLASTN搜尋係對含有該未組裝葉甲類序列讀取或該經組裝重疊群的BLASTable數據庫展開。對葉甲類序列之顯著命中(對片段重疊群同源物界定為比e-20更好，且對未組裝序列讀取同源物為比e-10更好)係使用BLASTX對NCBI非冗餘數據庫(non-redundant database)確認。此BLASTX搜尋的結果確認的是，在該TBLASTN搜尋中辨識的葉甲類同源物候選基因序列的確包含葉甲類基因，或係為在該葉甲類序列對該非葉甲類候選基因序列可獲得之最加命中。在大多數情況下，穀蛀蟲註解為編碼一蛋白質的候選基因對在該葉甲類轉錄體學序列中之一序列或序列等給予一明白的序列同源性。在少數情況下，其係明顯的是，藉由同源至一非葉甲類候選基因而選定的該葉甲類片段重疊群或未組裝序列讀取中之一些係重疊的，而該片段重疊群之總成在加入這些重疊上已經失敗了。在這些情況下，Se℃uencherTM 4.9版(基因編碼公司，密西根州安阿伯)係使用以組裝該等序列成較長的片段重疊群。
數個候選靶定基因係辨識為可能導致鞘翅目害蟲在WCR中死亡率或生長、發育、或生殖抑制的基因，包括序列辨識編號：1-7。葉甲類候選基因同源物之全長或部分的選殖序列係使用以生成PCR擴增子(amplicon)，用於dsRNA的合成。
序列辨識編號：1包含一序列其編碼一蛋白質磷酸酶蛋白(於此稱為PP1-87B)，該者相應於一金屬依賴、絲胺酸/蘇胺酸特異性蛋白磷酸酶催化次單元。
序列辨識編號：2包含一序列其編碼一RPA70蛋白(於此稱為RPA70)，該者相應於複製蛋白A-70，單股DNA結合蛋白之次單元。
序列辨識編號：3代表片段重疊群0011_87B，為PP1-87B蛋白磷酸酶編碼區域之一片段。
序列辨識編號：4代表D_vir_c43870_RPA70，為RPA70蛋白編碼區域之一片段，且於此稱為RPA70區域1，或RPA70 Reg1。
序列辨識編號：5代表D_vir_c18764_RPA70，為RPA70蛋白編碼區域之一片段，且於此稱為RPA70 Reg2。
序列辨識編號：6代表D_vir_c7971_RPA70，為RPA70蛋白編碼區域之一片段，且於此稱為RPA70 Reg3。
序列辨識編號：7包含一序列其編碼一RPS6蛋白質，該者係為核糖體蛋白S-6。
例子3：靶定基因之放大
引子係設計以藉由PCR放大每一靶定基因之部 分的編碼區域。參閱表1。如果適當的話，一T7噬菌體啟動子序列(TTAATACGACTCACTATAGGGAGA(序列辨識編號：8))係併入該放大的正義或反義股的5'端。參閱表1。總RNA係從WCR提取，且第一股cDNA係使用作為PCR反應的模板，該者使用相反定位引子以放大該原生靶定基因序列的全部或部分。
例子4：RNAi構建體
藉由PCR製備模板及dsRNA合成
使用以提供用於dsRNA製造之特異性模板的策略係顯示於圖1中。意欲在dsRNA合成中使用的模板DNA係 藉由PCR、使用在表1中之該等引子對製備的，而(做為PCR模板)第一股cDNA係從WCR第一齡幼蟲分離之該總RNA製備的。對於每一選定的靶定基因區域，兩個分開的PCR放大係執行。該第一PCR放大在該被放大正義股的5'端引入了一T7啟動子序列。該第二反應在該反義股的5'端併入該T7啟動子序列。對該靶定基因每一區域之該兩個PCR放大片段然後係以大約相等的數量混合，且該混合物係使用做為dsRNA製造的轉錄模板。圖1。以該特定引子放大之該dsRNA模板之序列為：序列辨識編號：25(PP1-87B)、序列辨識編號：26(RPA70 Reg2)、序列辨識編號：27(RPA70 Reg3)、及序列辨識編號：28(RPS6)。雙股RNA係使用Ambion® MEGAscript® RNAi套組遵照製造商(英傑生命技術)的說明合成及純化。dsRNA濃度係使用NanoDropTM 8000分光光度計(賽默飛科技，特拉華州威爾明頓)測量。
植物轉形載體之構建
兩種類型的髮夾RNA表現載體，一組為WHISKERSTM媒介玉米細胞轉形，而第二組為常規農桿菌媒介轉形，係使用標準Gateway®(英傑生命技術)選殖方法組裝。對於包含PP1-87B段(序列辨識編號：1；序列辨識編號：3段)、RPA70(序列辨識編號：2；序列辨識編號：5段)及RPS6(序列辨識編號：7)之髮夾形成的靶定基因構建體係使用化學合成片段(DNA2.0,Menlo Park,CA)及標準分子選殖方法之一組合組裝的。RNA初級轉錄體之分子內髮夾形成係藉由(在一單一轉錄單元內)將靶定基因片段之兩個拷貝 在彼此相反之定向中配置而促進的，該兩個片段係由一ST-LS1內含子序列分隔的(Vancanneyt等人之“(1990)Mol.Gen.Genet.220(2)：245-50”)。含有PP1-87B、RPA70區域2及RPS6之髮夾構建體的表現卡匣的進入載體係使用Gateway®選殖方法及標準選殖方法組裝。初級mRNA轉錄體之製造係藉由玉米泛素1啟動子(美國專利第5,510,474號)之拷貝驅動。因此，該初級mRNA轉錄體含有該兩個基因片段序列，由該內含子序列分隔，做為彼此大的反向重複。包含源自玉米過氧化酶5基因的3'非轉譯區域(ZmPer5 3'UTR v2；美國專利第6,699,984號)之一片段係使用以終止該靶定基因的轉錄。
相同組進入載體組係使用於Gateway®選殖至兩個起始目標載體(destination vector)以構建兩種類型的髮夾RNA表現轉形載體；一組為WHISKERSTM媒介玉米細胞轉形，且一第二組為農桿菌媒介轉形。對WHISKERSTM媒介轉形，所有的髮夾RNA表現載體係使用一起始目標載體(pDAB108916)構建，且該構建的進入載體之一者係藉助於一標準的Gateway®重組反應。該目標載體包含兩種標記基因：一黃色螢光蛋白基因(YFP；Shagin等人之“(2004)Mol.Biol.Evol.21(5)：841-50”)，及一除草劑耐受性基因(草胺膦乙醯基轉移酶(PAT)；Wehrmann等人之“(1996)Nat.Biotechnol.14(10)：1274-8”)。YFP及PAT的表現皆分別由一強大的甘蔗桿狀病毒(ScBV)啟動子拷貝驅動(Schenk等人之“(1999)Plant Molec.Biol.39：1221-30”)。包含源自玉 米脂肪酶基因的3'非轉譯區域(ZmLip 3'UTR；美國專利第7,179,902號)之一片段係使用以終止該YFP的轉錄，而PAT基因之轉錄終止係由含有馬鈴薯pinll基因3'UTR(StPinll 3'UTR；本質上GenBankTM登錄號X04118.1)之一片段控制。
對農桿菌媒介玉米胚胎轉形，所有髮夾RNA表現轉形載體係使用一典型的雙元目標載體(pDAB101847)構建，且如上所述該進入載體之一者係透過使用一標準的Gateway®重組反應。該雙元目標載體包含在ScBV啟動子及ZmLip 3'UTR終止子調控下的另一種除草劑抗性基因(芳亞基鏈烷酸酯雙加氧酶(aryloxyalknoate dioxygenase)；AAD-1 v3)(Wright等人之“(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107：20240-5”)。該雙元載體質體係為pDAB109818(包含該RPA70髮夾構建體)、pDAB109822(包含該PP1-87B髮夾構建體及pDAB109823(包含該RPS6髮夾構建體)。
序列辨識編號：29呈現一PP1-87B髮夾形成序列，序列辨識編號：30呈現一RPA70 Reg2髮夾形成序列，及序列辨識編號：31呈現一RPS6髮夾形成序列。
對WHISKERSTM媒介轉形，片段純化係藉由高壓液相層析法(HPLC)在製備規模上達到，在該YFP/hpRNA/PAT表現載體DNA已用適當的限制內切酶消化，以移除存在該載體骨幹中之一細菌觀黴素抗性基因之後。
例子5：候選靶定基因之篩選
合成dsRNA其係設計以抑制一些，但不是所有在例子2中辨識之靶定基因序列者造成死亡率及生長抑 制，當在以飲食為基礎的檢測中投藥至WCR時。PP1-87B、RPA70 Reg2、RPA70 Reg3、及RPS6在此檢測中超越其他篩選的dsRNAs展示大大提高的有效性。
重複的生物檢測證明，攝入衍自於PP1-87B、RPA70 Reg2、RPA70 Reg3、及RPS6的dsRNA製備物，每一者引致西方玉米根蟲幼蟲的死亡率及/或生長抑制。表2及表3顯示WCR幼蟲繼之9天曝露至這些dsRNA之後，飲食為基礎的餵食生物檢測的結果。圖2及圖3顯示死亡率數據的變異圖，而圖4及圖5顯示經示範性核酸分子處理之鞘翅目害蟲的生長抑制數據的變異圖。
先前已有人建議，葉甲類物種的某些基因可能利用於RNAi媒介昆蟲控制。參閱美國專利公開案第 2007/0124836號，該者揭露了906序列，及美國專利第7,614,924號，該者揭露了9112序列。然而，其係確定的是，許多建議對RNAi-媒介之昆蟲控制具有用途的基因在控制葉甲類係非有效的。其係亦確定的是，PP1-87B、RPA70 Reg2、RPA70 Reg3、及RPS6每一者提供令人驚訝且非預期的葉甲類優越控制，相較於其他建議對RNAi-媒介之昆蟲控制具有用途的基因而言。
舉例而言，膜聯蛋白、β-紅血球膜骨架蛋白質2、及mtRP-L4每一者於美國專利第7,614,924號中係建議在RNAi媒介的昆蟲控制中為有效的。序列辨識編號：32係為膜聨蛋白區域1的DNA序列，而序列辨識編號：33係為膜聯蛋白區域2的DNA序列。序列辨識編號：34係為β-紅血球膜骨架蛋白質2區域1的DNA序列，而序列辨識編號：35係為β-紅血球膜骨架蛋白質2區域2的DNA序列。序列辨識編號：36係為mtRP-L4區域1的DNA序列，而序列辨識編號：37係為mtRP-L4區域2的DNA序列。一YFP序列(序列辨識編號：38)亦使用做為生成dsRNA的陰性對照組。
前述提及序列每一者係藉由例子4之方法使用以製造dsRNA，且該dsRNA每一者係藉由上文描述該相同的飲食為基礎的生物檢測方法測試。表4列出使用以製造該膜聯蛋白、β-紅血球膜骨架蛋白質2及mtRP-L4 dsRNA分子的引子序列。表5呈現WCR幼蟲繼之9天曝露至這些dsRNA之後，飲食為基礎的餵食生物檢測的結果。重複的生物檢測證明，這些dsRNA之攝入不引致超過在以TE緩衝液、YFP 或水之對照樣品上看到之西方玉米根蟲幼蟲死亡率或生長抑制。
例子6：製造包含殺蟲性髮夾dsRNA之基因轉殖玉米組織
植物其透過表現穩定併入至該植物基因組的一嵌合基因產生一或多種殺蟲性dsRNA分子者(舉例而言，至少一dsRNA分子其包括靶定包含序列辨識編號：1-7基因的一dsRNA分子)係製造的。本質上如例子4中所描述般製備的植物轉形DNA分子製備物係經由WHISKERSTM媒介轉形遞送至玉米的Hi-II懸浮細胞培養中(本質上如描述於美國專利第5,302,523號及5,302,523號；美國專利公開案第2008/0182332號；及Petolino與Arnold之“(2009)Methods Mol.Biol.526：59-67”，該等者係以其整體併入於此以做為參考)。轉形組織係藉由其等在BASTATM或含合氯氟(haloxyfop)培養基上生長的能力而選擇，且適當的係針對YFP產生而篩選。部分的此種轉形組織培養可能為了生物檢測而呈現給新生的玉米根蟲幼蟲，本質上如在例子7中所描述。
農桿菌媒介轉形。或者，透過表現穩定併入至該植物基因組的一嵌合基因產生一或多種殺蟲性dsRNA分子(舉例而言，至少一dsRNA分子其包括靶定包含序列辨識編號：1-7基因的一dsRNA分子)的基因轉殖玉米細胞、組織及植物係繼之農桿菌媒介轉形後產生的。採用超級雙元(superbinary)或雙元轉形載體之玉米轉形方法在該技藝中係為知悉的，舉例而言，如描述於國際PCT公開案第WO2010/120452號。轉形組織係藉由其在含合氯氟培養基上生長的能力而選擇，且適當的係針對dsRNA製造而篩選。部分的此種轉形組織培養可能呈現給新生的玉米根蟲幼蟲用於生物檢測，本質上如在例子7中所描述。
穗消毒及玉米胚胎分離。玉米未成熟胚胎係從在溫室中生長、且自花或近緣授粉(sib-pollinated)以產生穗的玉米(Zea mays)自交品系B104植物獲得。該等穗係於授粉後大約9至12天收穫的。在實驗當天，去外皮的穗係藉由浸漬在20%的次氯酸鈉溶液(6.15%)並震盪20至30分鐘，繼之在滅菌水中漂洗三次而表面消毒的。消毒之後，未成熟合子胚(1.5至2.4 mm)係從每個穗無菌地剝離，且隨機地分配到含有液體接種培養基的微量離心管中。接種培養基中含有：2.2 gm/L之MS鹽類及1X ISU改質MS維生素(Frame等人之(2011)“Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos”，在T.A.Thorpe及E.C.Yeung編輯之“Plant Embryo Culture Methods and Protocols：Methods in Molecular Biology,Springer Science and Business Media, LLC.,pp 327-341)”；68.4 gm/L蔗糖；36 gm/L葡萄糖；115 mg/L之L-脯氨酸；100 mg/L之肌肌醇；及200 μM的乙醯丁香酮(acetosyringone)(在DMSO中製備的)；pH為5.4。對於一給定的實驗組中，源自匯集穗之胚胎係使用於每一轉形。
農桿菌培養引發。含有雙元轉形載體，諸如pDAB109818、pDAB109822或pDAB109823之農桿菌種系DAt13192的甘油保存種(stocks)係劃線於含有適當抗生素的AB基本培養基平板上(Watson等人之“(1975)J.Bacteriol.123：255-64”)，並於20℃中生長達3至4天。單一菌落係挑起並劃線於含相同抗生素的YEP平板(10 gm/L之酵母提取物；10 gm/L之蛋白腖；5 gm/L之NaCl)，且該平板係於20℃中培育1-2天。
農桿菌培養及共培植。農桿菌菌落係從YEP平板取出，懸浮在50 mL拋棄式管子中的10 mL接種培養基中，且細胞密度係使用分光光度計調整至OD550為0.2至0.4(550 nm處的光密度測量，一間接的細胞濃度測量)。該農桿菌培養物係在一旋轉震盪器上於125 rpm中培養(室溫)，而同時胚胎剝離係執行的。未成熟合子胚胎(先前從該消毒的玉米粒分離並置於1 mL接種培養基中)係於相同培養基中洗滌一次。
兩mL的農桿菌懸浮液係加入到每一管的胚胎中，且該管係置於一震盪器平台上計10至15分鐘。該胚胎係轉移至共培植培養基上，以子葉盤(scutellum)朝上定向，並在25℃中培養，在24小時50 μEm-2 sec-1光強度的光線下 達3天。共培植培養基中含有4.33 gm/L之MS鹽類；1X ISU改質MS維生素；30 gm/L蔗糖；700 mg/L之L-脯氨酸；在KOH中之3.3 mg/L的麥草畏(3,6-二氯-鄰-大茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)；100 mg/L之肌肌醇；100 mg/L之酪蛋白酶解液；15 mg/L的AgNO3；在DMSO中之100 μM的乙醯丁香酮；及3 gm/L之GELZANTM(西格瑪奧瑞奇集團(SIGMA-ALDRICH))；pH值為5.8。
癒傷組織選擇及假定事件之再生。繼該共同培植期之後，胚胎係轉移至休息培養基(Resting Medium)並於25℃下培養，在24小時50 μEm-2sec-1光強度的光線下達3天。休息培養基含有4.33 gm/L之MS鹽類；1X ISU改質MS維生素；30 gm/L之蔗糖；700 mg/L的L-脯氨酸；在KOH中之3.3 mg/L的麥草畏；100 mg/L之肌肌醇；100 mg/L之酪蛋白酶解液；15 mg/L的AgNO3；0.5 gm/L的MES(2-(N-嗎啉)乙磺酸單水合物；植物技術實驗室；堪薩斯州列涅薩)；250 mg/L之卡本西林(Carbenicillin)；及2.3 gm/L之GELZANTM；pH為5.8。胚胎係轉移至選擇培養基1上(該者係由(上文)該休息培養基與100 nM的R-合氯氟酸(0.0362 mg/L)組成)，並於黑暗中及/或24小時50 μEm-2sec-1光強度的光線下任一者中在28℃培養達7至14天。
增殖胚性癒傷組織係轉移至選擇培養基2上(該者係由(上文)休息培養基與500 nM的R-合氯氟酸(0.1810 mg/L)組成)，並於24小時50 μEm-2sec-1光強度之光線下在28℃培育達14至21天。此選擇步驟允許基因轉殖癒傷組織進 一步增殖及分化。
增殖胚性癒傷組織係轉移至再生前培養基上，並於24小時50 μEm-2sec-1光強度之光線下在28℃培養達7天。再生前培養基中含有4.33 gm/L之MS鹽類；1X ISU改質MS維生素；45 gm/L之蔗糖；350 mg/L的L-脯氨酸；100 mg/L之肌肌醇；50 mg/L之酪蛋白酶解液；1.0 mg/L的AgNO3；0.25 gm/L的MES；在NaOH中0.5 mg/L之萘乙酸；在乙醇中2.5 mg/L之離層酸(abscisic acid)；1 mg/L之6-芐基腺嘌呤(6-benzylaminopurine)；250 mg/L之卡本西林；2.5 gm/L之GELZANTM；及500 nM的R-合氯氟酸；pH為5.8。
具芽狀萌芽的胚性癒傷組織係轉移至再生培養基上並在24小時50 μEm-2 sec-1光強度的光線下培養達7天。再生培養基I含有4.33 gm/L之MS鹽類；1X ISU改質MS維生素；60 gm/L之蔗糖；100 mg/L之肌肌醇；125 mg/L之卡本西林；3.0 gm/L之GELZANTM；及500 nM的R-合氯氟酸；pH為5.8。
具初生根之小芽係轉移至在PhytatraysTM(植物技術實驗室；堪薩斯州列涅薩)中之一芽/根培養基，並於16：8 hr.的光：暗在140至190μEm-2 sec-1光強度下於27℃培養達7天。芽/根培養基含有4.33 gm/L之MS鹽類；1X ISU改質MS維生素；30 gm/L之蔗糖；100 mg/L之肌肌醇；3.5 gm/L之GELZANTM；pH為5.8。
假定的基因轉殖小苗係藉由即時定量PCR檢測、使用設計以偵測該ZmPer5 3' UTR(使用以終止該連環 蛋白(reptin)髮夾RNA表現基因的轉錄)相對拷貝數的引子，針對轉殖基因拷貝數分析的，並轉移至土壤。
在溫室中轉移並建立T0植物，用於生物檢測及種子生產。藉由其等在含有500 nM之R-合氯氟酸培養基上生長的能力而選擇的轉形植物組織係分派獨特的標識，移植至METRO-MIXTM 360無土生長培養基(聖果園藝(SUN GRO HORTICULTURE))，並在一生長室中變得堅強(白天溫度~28℃/夜間溫度~24℃/16：8補充光線)。植物然後係在溫室中移植到SUNSHINE CUSTOM BLENDTM 160土壤混合物並生長以開花。
用於昆蟲生物檢測的植物係從小花盆移植到TINUSTM 350-4 ROOTRAINERS®(斯賓塞-勒梅爾工業，加拿大阿爾伯塔省艾奇遜)(每一ROOTRAINERS®一個植物一個事件)。大約移植到ROOTRAINERS®四天後，T0植物係侵擾用於生物檢測。
T1世代的植物係藉由以從非基因轉殖原種(elite)自交品系B104植物收集的花粉授粉T0基因轉殖植物之鬚並種植該所得到的種子而獲得。
例子7：昆蟲生物檢測
植物其產生一殺蟲性dsRNA者係於溫室中針對根取食損害生物檢測。西方玉米根蟲(WCR,Diabrotica virgifera virgifera LeConte)的卵係從Crop Characteristics(明尼蘇達州法明頓)的土壤中接收，且該卵係於28℃培養達10-11天。卵係從該土壤掏出，放進0.15%之一瓊脂溶液， 且該濃度係調整為每0.25 mL等分試樣大約75至100卵。一孵化平板係在具一等分試樣卵懸浮液的培養皿中建立的，以監測孵化率。
該玉米植物周圍的土壤係以150至200 WCR卵侵擾。該昆蟲係允許取食達2週，在該時間之後，對每一植物係給予一“根等級”。一節點損害量表係利用於分級，本質上根據Oleson等人之“(2005)J.Econ.Entomol.98(1)：1-8”。通過這種生物檢測的植物係立刻移植至5加侖花盆用於人工授粉及種子生產。由這些植物製造的種子係保存的，用於T1及後續植物世代的評估。
用於生物檢測陰性對照植物係由非轉形B104植物組成，該者係產自於以雙元載體轉形的種子或植物，其中該雙元載體懷有在玉米衍生型泛素1啟動子及Per5 3'UTR表現控制下的YFP編碼區域，及在玉米衍生型泛素1啟動子及Lip 3'UTR表現控制下的AAD1編碼區域。該陰性對照雙元載體不包含編碼dsRNA之一構建體。
再生的T0世代植物係如描述般在溫室中生物檢測，該植物源自利用雙元載體其包含以下者而轉形：一構建體其編碼RPA70髮夾dsRNA(表14)；一構建體其編碼PP1-87B髮夾dsRNA(表12)；及一構建體其編碼RPS6髮夾dsRNA(表13)。一些測試的PP1-87B及RPS6T0事件證明保護免受西方玉米根蟲取食損害的證據。表12及13。
T1世代的種子係藉由以從非基因轉殖原種自交品系B104植物收集的花粉授粉T0植物之鬚而產生的。選定 事件的植物係如描述般在生物檢測中以西方玉米根蟲幼蟲考驗的。圖6及7顯示了T1植物其包含編碼PP1-87B、RPS6或RPA70髮夾dsRNA構建體的平均根等級損害分數的變異數據。在該等圖式中所顯示的數據係進一步提供於表6及7。
例子9：體外昆蟲生物檢測
本主體發明在植物細胞中產生的dsRNA的生物活性係藉由生物檢測方法證明。參閱，例如Baum等人之“(2007)Nat.Biotechnol.25(11)：1322-6”。一者係能夠證明 有效性的，舉例而言，藉由在一受控制的餵食環境中餵食衍自於製造一殺蟲性dsRNA植物的各種植物組織或組織塊至靶定昆蟲。或者，提取物係從衍自於製造該殺蟲性dsRNA植物的各種植物組織製備的，且該經提取的核酸係如於此先前所描述般分配到用於生物檢測的人工飲食的頂部。此種餵食檢測結果係與採用源自不製造殺蟲性dsRNA宿主植物的適當控制組織，或其他控制樣品而類似地進行生物檢測者比較的。
例子10：基因轉殖玉米組織的分子分析
髮夾RNA轉錄體表現水平：Per 5 3'UTR qPCR。癒傷細胞事件或基因轉殖植物係藉由該Per 5 3'UTR序列之即時定量PCR(qPCR)分析，以確定該全長髮夾轉錄體的相對表現水平，相較於一內部玉米基因(序列辨識編號：70；GENBANK登錄號BT069734)的轉錄水平，後者編碼似TIP41蛋白質(意即，GENBANK登錄號AT4G34270之一玉米同源物；tBLASTX分數74%相似度)。
RNA係使用RNAEASYTM 96套組(凱杰，加州瓦倫西亞)分離。在該第一次洗滌(RW1)之後，該等管柱係以在緩衝液RDDTM中之凱杰無RNase的DNase處理(根據該套組建議的替代實驗計劃)。第一股cDNA係使用一高容量cDNA合成套組(英傑生命技術)在10 μL反應體積中以5 μL的變性RNA製備的，本質上根據製造商推薦的實驗計劃。該實驗計劃係稍微修改，以包括添加10 μL的100 μMT20VN寡核苷酸(IDT)到該隨機引子存料混合物的1 mL管 子中，以為了製備隨機引子與寡dT組合的工作存料。
繼之cDNA合成後，樣品係以無核酸酶的水1：3稀釋的，並儲存在-20℃，直到檢測。即時PCR係於LIGHTCYCLERTM 480(羅氏醫療診斷，印第安納州印第安納波利斯)上，在10 μL反應體積中執行。所有檢測包括無模板(僅混合)的陰性對照組。對於標準曲線，一空白試樣(在源孔中的水)亦包括在該源板上，以檢查樣品交叉污染。反應係以0.5 μM的ROCHE UNIVERSAL PROBETM及10 μM用於該靶定及參考基因的引子下展開。該等引子序列係於表8中陳述。PCR反應條件係如下列：(1)於95℃標靶活化達10 min；(2)43個循環(在95℃下變性10 sec並在60℃下延展)；(3)在72℃下養成(acquire)達1 sec；及(4)在40℃下冷卻達10 sec。
數據係使用LIGHTCYCLERTM軟體1.5版藉由相對定量分析的，該者係使用一二階導數的最大演算法用於計算Cq值，根據供應商的建議。對於表現分析，表現值係使用該△Cq方法(意即，2-(Cq標靶-Cq參考))計算，該者依賴於兩個標靶Cq值與在對優化PCR反應該產物每一週期加倍之該假設之下而選定的基準值2之間差異的比較。
髮夾轉錄體大小及完整性：北方墨漬法檢測。該基因轉殖植物之一些額外的分子表徵係藉由使用北方墨漬法(RNA墨漬法)分析而執行的，以確定在表現連環蛋白髮夾dsRNA的基因轉殖植物中該連環蛋白髮夾RNA的分子大小。一全長的新生轉錄體係預期具有約900 bp的分子大小，取決於該RNA之聚腺苷酸化作用的數量。
所有的材料及設備在使用之前係以RNAZAPTM(AMBION/英傑生命技術)處理的。組織樣品(100 mg至500 mg)係收集於2 ml SAFELOCKTM EPPENDORF管子中，以KLECKOTM組織粉碎機(加西亞製造，加州維塞利亞)藉由三個鎢珠在1 ml TRIZOLTM(英傑生命技術)中破壞達5分鐘，然後於室溫(RT)培育達10分鐘。任選地，該等樣品係於4℃下以11,000 rpm離心10分鐘，且該上清液係轉移至一新的2 ml SAFELOCKTM EPPENDORF管子中。
在200 μL的氯仿添加至該均質物之後，該管子係藉由反轉達2至5分鐘而混合，於RT培育達10分鐘，並於4℃下以12,000x g離心達15分鐘。該頂部相係轉移到無菌的1.5 mL EPPENDORF管子中，且600 μL之100%異丙醇係加入，繼之在RT下培育達10分鐘與2小時之間，然後在從4℃至25℃下以12,000x g離心達10分鐘。該上清液係丟棄，且該RNA沈澱物係以1 ml的70%乙醇洗滌兩次，伴隨洗滌之間從4℃至25℃以7,500x g離心達10分鐘。該乙醇係被丟棄，且該沈澱物在懸浮於50 μL的無核酸酶水中之前係簡短地空氣乾燥3至5分鐘。
總RNA係使用NANODROP® 8000(賽默飛世爾)定量，且樣品係標準化至5 μg/10 μL。10 μL的乙二醛(AMBION/英傑生命技術)然後係加入到每個樣品。5至14 ng的DIG RNA標記混合物標準品(羅氏應用科學，印第安納州印第安納波利斯)係分配的，並加入等體積的乙二醛。樣品及標記RNA係於50℃下變性45分鐘，並儲存在冰上，直至加載在NORTHERNMAXTM 10X乙二醛展開緩衝液(AMBION/英傑生命技術)中的1.25% SEAKEM®黃金瓊脂糖(龍沙，新澤西州艾倫代爾)凝膠中。RNAs係藉由於65伏特/30mA電泳達2小時15分鐘而分開的。
繼之電泳之後，該凝膠係於2X SSC中漂洗5分鐘並於一GEL DOCTM站(伯瑞，加州海克力斯)上成像。然後，該RNA係於室溫下隔夜被動轉移至一尼龍膜(MILLIPORE)上，使用10X SSC做為轉移緩衝液(20X SSC由3 M的NaCl及300 mM的檸檬酸三鈉組成，pH=7.0)。繼轉移之後，該膜係於2X SSC中漂洗5分鐘，該RNA係UV交聯至該膜(安捷倫/Stratagene)，且該膜係允許在室溫下乾燥高達2天。
該膜係於ULTRAHYBTM緩衝液(AMBION/英傑生命技術)中預雜交1至2小時。該探針由含有感興趣序列的PCR放大產物組成，(舉例而言，序列辨識編號：29-31之一者的反義序列部分)，係藉助於羅氏應用科學DIG程序以地高辛(digoxygenin)標示。在推薦的緩衝液中，雜交係於60℃之一溫度下在一雜交管中執行隔夜。繼雜交之後，該墨 漬係經受DIG洗滌、包裹、暴露於軟片達1至30分鐘，且然後該軟片係顯影，全部藉由該DIG套組供應商所推薦的方法。
髮夾轉錄體大小及完整性：ST-LS1內含子水解探針檢測。靶定該髮夾RNA(序列辨識編號：29-31)中之該ST-LS1內含子間隙子序列(序列辨識編號：77)之一水解探針檢測(如下文所描述，“水解探針檢測”)係發展以測量該dsRNA轉錄體的完整性。該所使用的寡核苷酸係於表7中列出的。
水解探針基因轉殖拷貝數檢測。基因轉殖玉米植物之組織係經由一水解探針檢測篩選，以確認該aad-1編碼區域(經農桿菌轉形的B104事件)。該數據係使用以估計基因轉殖拷貝數，相較於在類似偵測兩拷貝原生染色體轉化酶基因(序列辨識編號：75)檢測中所獲得的結果。該所使用的寡核苷酸係於表9中列出的。
組織樣品係於凱杰RLTTM緩衝液中以KLECOTM組織粉碎機及不銹鋼珠(胡佛精密產品，喬治亞州卡明)離解。基因組DNA係使用一BIOSPRINTTM 96植物套組(凱杰)、根據製造商建議的實驗計劃在高輸出量格式中分離的，並藉由QUANT-ITTM PICO GREEN DNA檢測套組(分子探針/英傑生命技術)定量的。DNA濃度係使用BIOROBOTTM 3000自動液體處理器(凱杰)調整至約2 ng/μL，用於水解探針檢測。轉殖基因拷貝數確定係藉由使用該LIGHTCYCLER® 480系統(羅氏應用科學，印第安納州印第 安納波利斯)的即時PCR執行。
針對aad-1及內部參考轉化酶基因(序列辨識編號：75；GENBANK登錄號：U16123.1)，檢測係使用該LIGHTCYCLER®探針設計軟體2.0版設計的。對於放大，LIGHTCYCLER® 480 Probes Master混合物係於1X最終濃度在10 μL體積多重反應中製備的，該者含有0.4 μM的每個aad-1引子及0.2 μM的每個探針(表9)。一個兩步驟的放大反應係執行，該者在60℃延展達40秒鐘伴隨螢光探測(fluorescence acquisition)。所有樣品係展開，且該平均循環臨界(Ct)值係使用於每個樣品的分析。即時PCR數據分析係使用LIGHTCYCLER®軟體發布版1.5執行，使用該相對定量模組，並奠基於△△Ct方法。對照組包括源自單拷貝校準線之一基因組DNA樣品，且兩拷貝檢查係知悉包括在每次展開中。
載體骨幹水解探針檢測。基因轉殖組織係藉助於設計以偵測在該轉形質體上懷有的該SpnR(細菌觀黴素抗性)基因(序列辨識編號：76)的水解探針檢測而分析，以確定是否已有任何載體骨幹DNA被併入到該玉米基因組內。該所使用的寡核苷酸係於表9中列出的。
髮夾環水解探針檢測。基因轉殖組織係針對髮夾環存在分析的，該者係在構建體其包含在序列辨識編號：29-31所陳述之該等髮夾序列者中提供的。該等髮夾構建體係設計的，藉由此，該髮夾環包含一ST-L1內含子序列(序列辨識編號：77)。該髮夾環水解探針檢測之成分及反應條件係於表10中給定的，且該等寡核苷酸序列係呈現於表11中。在表10中給定的成分與反應參數對其他水解探針檢測係為標準的。
包含髮夾構建體之T0植物係如上文所描述分析，且該等結果係於表12；13及14中給定的。
包含髮夾構建體之T1植物係如上文所描述般分析，且該等結果係於表15；16及17中給定。
前述數據顯示某些鞘翅目害蟲，尤其是植物的葉甲類害蟲，可能藉由靶定該害蟲中產生的某些轉錄體而控制的，該者係透過將該害蟲與雜交(意即，同源的)至該等靶定轉錄體的有效數量dsRNA接觸。
例子9：包含鞘翅目害蟲序列的基因轉殖玉米
10至20基因轉殖T0玉米植物係如例子6中所描述般生成的。進一步的，10-20表現如序列辨識編號：1-7中所陳述之RNAi構建體的髮夾dsRNA之T1玉米獨立品系係獲得的，用於玉米根蟲的考驗。這些係透過RT-PCR證實。源自選定的獨立T1品系的總RNA係任選地使用於RT-PCR，伴隨著設計以結合在每一RNAi構建體中之該髮夾卡匣的ST-LS1內含子的引子。此外，針對在RNAi構建體中每一靶定基因的特定引子係任選使用以放大並確認對siRNA製造所要求之該加工前mRNA在植物中的生產。對每一靶定基因，該所欲之帶紋的放大證實了該髮夾RNA在每一基因轉殖玉米中的表現。加工該等靶定基因之dsRNA髮夾成為siRNA係隨後任選地獨立的基因轉殖品系中使用RNA墨漬法雜交證實。
基因轉殖RNAi品系及野生型玉米的表型比較
選定用於創造髮夾dsRNA的靶定鞘翅目害蟲基因或序列對任何已知的植物基因或序列係不具有相似度。因此，其係非預期的是，藉由靶定這些基因或序列的構建體而製造或活化的(系統性)RNAi將在基因轉殖植物將具有任何不利影響。然而，基因轉殖品系的發育與形態特徵係與野生型植物進行比較，以及那些以一空的髮夾載體轉形 的基因轉殖品系。植物的根、小芽、葉羣及生殖特徵係比較的。在基因轉殖及野生型植物之根長度與生長模式中，其係沒有可觀察到的差異。植物的小芽特徵，諸如高度、葉片數及大小，開花時間，花的大小及外觀都是類似的。一般而言，當在體外及在溫室土壤中培養時，在基因轉殖品系及那些沒有表現靶定iRNA分子者之間係沒有可觀察到的形態差異。
例子10：基因轉殖玉米其包含一鞘翅目害蟲序列及額外的RNAi構建體
在其基因組包含一異源性編碼序列其轉錄成靶定鞘翅目害蟲以外之一生物的一iRNA分子的一基因轉殖玉米植物係經由WHISKERSTM轉形，以產生一或多種殺蟲的dsRNA分子(舉例而言，至少一dsRNA分子其包括靶定包含序列辨識編號：1-7之一者的一基因的一dsRNA分子)。WHISKERSTM-媒介轉形係採用以製造植物轉形DNA分子的製備，該者本質上係如所例子4所描述般製備，且係遞送至從一基因轉殖玉米植物獲得的玉米Hi-II懸浮液細胞培養中，其中該基因轉殖玉米植物在其基因組包含一異源性編碼序列，該者轉錄成靶定鞘翅目害蟲以外之一生物的一iRNA分子。
例子11：基因轉殖鞘翅目害蟲抗性植物
在植物界遞送相應於靶定基因的dsRNA、siRNA或miRNA，且隨後由鞘翅目害蟲透過取食攝取引致該靶定基因透過RNA媒介基因沈默的抑低調控。當一靶定基因之功能為重要時，該鞘翅目害蟲的生長、發育及生殖係影響 的，且在WCR、NCR、SCR、MCR、巴西玉米根蟲；D.u.tenella；及黃瓜十一星葉甲中至少一者的情況下導致成功侵擾、取食、發育及/或生殖的失敗，或導致該鞘翅目害蟲在一或多個發育階段(等)的死亡。抉擇標靶基因並成功應用RNAi然後係使用以控制鞘翅目害蟲。對每一RNAi構建體，10-20獨立T1玉米基因轉殖品系之五至十重複係以一玉米根蟲物種考驗。對每一玉米根蟲物種，該考驗係二重複的。RNAi品系之T1種子係發芽的，且抗性植物在發芽後10-15天係轉移至改質的Knop’s培養基。野生型對照組玉米種子係於相同時間發芽，並使用於玉米根蟲感染。
在對照組上其係有顯著較多的(>50%)存活的玉米根蟲，較諸在懷有一或多個RNAi構建體的基因轉殖玉米品系上。取食野生型及基因轉殖植物根之玉米根蟲中的iRNA豐度係使用即時定量RT-PCR測量。在懷有一或多個RNAi構建體的基因轉殖玉米品系中，其較諸對照植物係發現有顯著較多的iRNA分子。這些結果指出，該基因轉殖品系加工相應於靶定基因的siRNA，且這些siRNA對取食的玉米根蟲係可用於攝取的。更重要的是，這些結果指出，RNAi媒介的全部靶定基因之抑制影響該靶定玉米根蟲之生長、發育及活力。再者，具失配序列之RNAi分子其對靶定基因具超過80%的序列相似度者在類似於野生型序列的一方式中影響玉米根蟲。該失配序列與原生序列之配對在該相同的RNAi構建體中形成一髮夾dsRNA，其中該構建體遞送能夠影響取食鞘翅目害蟲之生長、發育及活力、並經植物加工的siRNA。
<110> 陶氏農業科學公司(Dow AgroSciences LLC) Narva,Kenneth E. Li,Huarong Geng,Chaoxian Larrinua,Ignacio Olson,Monica B, Elango,Navin B,
<120> 賦予鞘翅目害蟲抗性之RPA70核酸分子
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<141> 2011-10-06
<160> 110
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 1508
<212> DNA
<213> 西方玉米根蟲
<400> 1
<210> 2
<211> 2519
<212> DNA
<213> 西方玉米根蟲
<400> 2
<210> 3
<211> 772
<212> DNA
<213> 西方玉米根蟲
<220>
<221> 不能用任何其它的特徵關鍵詞表述的具有生物學意義的區域
<222> (751)..(751)
<223> n係為a、c、g或t
<400> 3
<210> 4
<211> 632
<212> DNA
<213> 西方玉米根蟲
<400> 4
<210> 5
<211> 509
<212> DNA
<213> 西方玉米根蟲
<400> 5
<210> 6
<211> 716
<212> DNA
<213> 西方玉米根蟲
<400> 6
<210> 7
<211> 933
<212> DNA
<213> 西方玉米根蟲
<400> 7
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大腸桿菌T7噬菌體
<400> 8
<210> 9
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 9
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 10
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PDR引子
<400> 11
<210> 12
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 12
<210> 13
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 13
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 14
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 15
<210> 16
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 16
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 17
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 18
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 19
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 20
<210> 21
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 22
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 23
<210> 24
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 24
<210> 25
<211> 563
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 放大片段
<400> 25
<210> 26
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 放大片段
<400> 26
<210> 27
<211> 546
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 放大片段
<400> 27
<210> 28
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 放大片段
<400> 28
<210> 29
<211> 817
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 髮夾
<400> 29
<210> 30
<211> 807
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 髮夾
<400> 30
<210> 31
<211> 825
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 髮夾
<400> 31
<210> 32
<211> 218
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 放大片段
<400> 32
<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 放大片段
<220>
<221> 不能用任何其它的特徵關鍵詞表述的具有生物學意義的區域
<222> (393)..(395)
<223> n係為a、c、g或t
<400> 33
<210> 34
<211> 397
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 放大片段
<400> 34
<210> 35
<211> 490
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 放大片段
<400> 35
<210> 36
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 放大片段
<400> 36
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<211> 320
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 放大片段
<400> 37
<210> 38
<211> 503
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 放大片段
<400> 38
<210> 39
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 39
<210> 40
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 40
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 41
<210> 42
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 42
<210> 43
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 43
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
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<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 45
<210> 46
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 46
<210> 47
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 47
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 48
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 49
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 50
<210> 51
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 51
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 52
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 53
<210> 54
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 54
<210> 55
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 55
<210> 56
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 56
<210> 57
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 57
<210> 58
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 58
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 59
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 60
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
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<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 62
<210> 63
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 63
<210> 64
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 64
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 65
<210> 66
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 66
<210> 67
<211> 327
<212> PRT
<213> 西方玉米根蟲
<400> 67
<210> 68
<211> 613
<212> PRT
<213> 西方玉米根蟲
<400> 68
<210> 69
<211> 248
<212> PRT
<213> 西方玉米根蟲
<400> 69
<210> 70
<211> 1150
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 70
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 71
<210> 72
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 72
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 73
<210> 74
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 74
<210> 75
<211> 2013
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 75
<210> 76
<211> 786
<212> DNA
<213> 大腸桿菌
<400> 76
<210> 77
<211> 189
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 放大片段
<400> 77
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 78
<210> 79
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 79
<210> 80
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針寡核苷酸
<400> 80
<210> 81
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 81
<210> 82
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 82
<210> 83
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針寡核苷酸
<400> 83
<210> 84
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 84
<210> 85
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 85
<210> 86
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針寡核苷酸
<400> 86
<210> 87
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 87
<210> 88
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 88
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針寡核苷酸
<400> 89
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 90
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 91
<210> 92
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 92
<210> 93
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引子
<400> 93
<210> 94
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針寡核苷酸
<400> 94
<210> 95
<211> 213
<212> PRT
<213> 西方玉米根蟲
<220>
<221> 不能用任何其它的特徵關鍵詞表述的具有生物學意義的區域
<222> (200)..(200)
<223> Xaa可以為任何天然發生的胺基酸
<220>
<221> 不能用任何其它的特徵關鍵詞表述的具有生物學意義的區域
<222> (206)..(206)
<223> Xaa可以為任何天然發生的胺基酸
<400> 95
<210> 96
<211> 120
<212> PRT
<213> 西方玉米根蟲
<220>
<221> 不能用任何其它的特徵關鍵詞表述的具有生物學意義的區域
<222> (66)..(66)
<223> Xaa可以為任何天然發生的胺基酸
<400> 96
<210> 97
<211> 169
<212> PRT
<213> 西方玉米根蟲
<220>
<221> 不能用任何其它的特徵關鍵詞表述的具有生物學意義的區域
<222> (33)..(33)
<223> Xaa可以為任何天然發生的胺基酸
<400> 97
<210> 98
<211> 225
<212> PRT
<213> 西方玉米根蟲
<220>
<221> 不能用任何其它的特徵關鍵詞表述的具有生物學意義的區域
<222> (6)..(7)
<223> Xaa可以為任何天然發生的胺基酸
<400> 98
<210> 99
<211> 17
<212> DNA
<213> 西方玉米根蟲
<400> 99
<210> 100
<211> 134
<212> DNA
<213> 西方玉米根蟲
<220>
<221> 不能用任何其它的特徵關鍵詞表述的具有生物學意義的區域
<222> (113)..(113)
<223> n係為a、c、g或t
<400> 100
<210> 101
<211> 225
<212> DNA
<213> 西方玉米根蟲
<400> 101
<210> 102
<211> 244
<212> DNA
<213> 西方玉米根蟲
<400> 102
<210> 103
<211> 5134
<212> DNA
<213> 西方玉米根蟲
<400> 103
<210> 104
<211> 451
<212> DNA
<213> 西方玉米根蟲
<220>
<221> 不能用任何其它的特徵關鍵詞表述的具有生物學意義的區域
<222> (119)..(119)
<223> n係為a、c、g或t
<220>
<221> 不能用任何其它的特徵關鍵詞表述的具有生物學意義的區域
<222> (128)..(128)
<223> n係為a、c、g或t
<220>
<221> 不能用任何其它的特徵關鍵詞表述的具有生物學意義的區域
<222> (289)..(289)
<223> n係為a、c、g或t
<220>
<221> 不能用任何其它的特徵關鍵詞表述的具有生物學意義的區域
<222> (403)..(403)
<223> n係為a、c、g或t
<220>
<221> 不能用任何其它的特徵關鍵詞表述的具有生物學意義的區域
<222> (414)..(414)
<223> n係為a、c、g或t
<400> 104
<210> 105
<211> 538
<212> DNA
<213> 西方玉米根蟲
<400> 105
<210> 106
<211> 303
<212> DNA
<213> 西方玉米根蟲
<400> 106
<210> 107
<211> 14
<212> DNA
<213> 西方玉米根蟲
<400> 107
<210> 108
<211> 459
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 放大片段
<400> 108
<210> 109
<211> 812
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 髮夾
<400> 109
<210> 110
<211> 167
<212> PRT
<213> 西方玉米根蟲
<400> 110

Claims (41)

  1. 一種分離的聚核苷酸，該者包含至少一核苷酸序列，其選自由以下所組成之群組：I)序列辨識編號：3、序列辨識編號：3之互補體、葉甲類(Diabrotica)生物原生的編碼序列其包含序列辨識編號：3者、葉甲類生物包含序列辨識編號：3的原生編碼序列的互補體、葉甲類生物的原生非編碼序列其係轉錄成包含序列辨識編號：3之一原生的RNA分子者、及葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：3之一原生RNA分子的原生非編碼序列的互補體；II)序列辨識編號：99、序列辨識編號：99之互補體、葉甲類生物原生的編碼序列其包含序列辨識編號：99者、葉甲類生物包含序列辨識編號：99的原生編碼序列的互補體、葉甲類生物的原生非編碼序列其係轉錄成包含序列辨識編號：99之一原生的RNA分子者、及葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：99之一原生RNA分子的原生非編碼序列的互補體；及III)序列辨識編號：100、序列辨識編號：100之互補體、序列辨識編號：100之至少19個連續的核苷酸之一片段、序列辨識編號：100之至少19個連續的核苷酸之片段的互補體、葉甲類生物之一原生編碼序列其包含序列辨識編號：100者、葉甲類生物包含序列辨識編號：100的原生編碼序列的互補體、葉甲類生物的原生非編碼序列其係轉錄成包含序列辨識編號：100之一原生的 RNA分子者、及葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：100之一原生RNA分子的原生非編碼序列的互補體。
  2. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含至少一核苷酸序列，其選自由序列辨識編號：1及3所組成之該群組。
  3. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸進一步包含至少一核苷酸序列，其選自由以下所組成之該群組：(IV)序列辨識編號：1、序列辨識編號：1之互補體、序列辨識編號：1之至少19個連續的核苷酸之一片段、序列辨識編號：1之至少19個連續的核苷酸之片段的互補體、葉甲類生物之一原生編碼序列其包含序列辨識編號：1者、葉甲類生物包含序列辨識編號：1的原生編碼序列的互補體、葉甲類生物的原生非編碼序列其係轉錄成包含序列辨識編號：1之一原生的RNA分子者、葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：1之一原生RNA分子的原生非編碼序列的互補體、葉甲類生物包含序列辨識編號：1之一原生編碼序列的至少19個連續的核苷酸片段、葉甲類生物包含序列辨識編號：1之一原生編碼序列的至少19個連續的核苷酸片段之互補體、葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：1之一原生RNA分子的原生非編碼序列之至少19個連續的核苷酸片段、及葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：1之一原生RNA分子的原生非編碼序列之至少19個連續的核苷酸片段的互補體； (V)序列辨識編號：2、序列辨識編號：2之互補體、序列辨識編號：2之至少19個連續的核苷酸之一片段、序列辨識編號：2之至少19個連續的核苷酸之片段的互補體、葉甲類生物之一原生編碼序列其包含序列辨識編號：2者、葉甲類生物包含序列辨識編號：2的原生編碼序列的互補體、葉甲類生物的原生非編碼序列其係轉錄成包含序列辨識編號：2之一原生的RNA分子者、葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：2之一原生RNA分子的原生非編碼序列的互補體、葉甲類生物包含序列辨識編號：2之一原生編碼序列的至少19個連續的核苷酸片段、葉甲類生物包含序列辨識編號：2之一原生編碼序列的至少19個連續的核苷酸片段之互補體、葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：2之一原生RNA分子的原生非編碼序列之至少19個連續的核苷酸片段、及葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：2之一原生RNA分子的原生非編碼序列之至少19個連續的核苷酸片段的互補體；及(VI)序列辨識編號：7、序列辨識編號：7之互補體、序列辨識編號：7之至少19個連續的核苷酸之一片段、序列辨識編號：7之至少19個連續的核苷酸之片段的互補體、葉甲類生物之一原生編碼序列其包含序列辨識編號：7者、葉甲類生物包含序列辨識編號：7的原生編碼序列的互補體、葉甲類生物的原生非編碼序列其係轉錄成包含序列辨識編號：7之一原生的RNA分子者、葉甲 類生物轉錄成包含序列辨識編號：7之一原生RNA分子的原生非編碼序列的互補體、葉甲類生物包含序列辨識編號：7之一原生編碼序列的至少19個連續的核苷酸片段、葉甲類生物包含序列辨識編號：7之一原生編碼序列的至少19個連續的核苷酸片段之互補體、葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：7之一原生RNA分子的原生非編碼序列之至少19個連續的核苷酸片段、及葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：7之一原生RNA分子的原生非編碼序列之至少19個連續的核苷酸片段的互補體；
  4. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該至少一核苷酸序列係操縱地鏈接至一異源性啟動子.
  5. 一種植物轉形載體，其包含如申請專利範圍第1項之聚核苷酸。
  6. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該葉甲類生物係選自由以下所組成之該群組：西方玉米根蟲(D.v.virgifera LeConte)；北方玉米根蟲(D.barberi Smith and Lawrence)；南方玉米根蟲(D.u.howardi)；墨西哥玉米根蟲(D.v.zeae)；巴西玉米根蟲(D.balteata LeConte)；D.u.tenella；及黃瓜十一星葉甲(D.u.undecimpunctata Mannerheim)。
  7. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸係為一核醣核酸(RNA)分子。
  8. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸係為一去氧核醣核酸(DNA)分子。
  9. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，進一步包含至少一核苷酸序列，其編碼源自蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)之一多肽。
  10. 如申請專利範圍第9項之聚核苷酸，其中該源自蘇雲金芽孢桿菌的多肽係選自由Cry3、Cry34及Cry35所組成之群組。
  11. 一種雙股核醣核酸分子，其係產自於如申請專利範圍第8項之該聚核苷酸的表現。
  12. 如申請專利範圍第11項之雙股核醣核酸分子，其中將該分子與該鞘翅目害蟲接觸可抑制一內源性核酸的表現，其中該內源性核酸包含一核苷酸序列，其特異性地互補於如申請專利範圍第1項之核苷酸序列。
  13. 如申請專利範圍第12項之雙股核醣核酸分子，其中將該分子與一鞘翅目害蟲接觸可殺死或抑制該鞘翅目害蟲的生長、生殖及/或取食。
  14. 如申請專利範圍第11項之雙股核醣核酸分子，其包含一第一、第二及第三核苷酸序列，其中該第一核苷酸序列包含如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該第三核苷酸序列係藉由該第二核苷酸序列鏈接至該第一核苷酸序列，且其中該第三核苷酸序列本質上係為該第一核苷酸序列的反向互補體，致使包含該第一與第三核苷酸序列每一者的該核醣核酸分子部分係在該雙股核醣核苷酸 分子中彼此雜交。
  15. 如申請專利範圍第7項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸係選自由長度介於約19與約30個核苷酸之間的一雙股核糖核酸分子及一單股核糖核酸分子所組成之群組。
  16. 一種核糖核酸分子，其係產自於如申請專利範圍第8項之該聚核苷酸的表現，其中該核糖核酸分子係選自由長度介於約19與約30個核苷酸之間的一雙股核糖核酸分子及一單股核糖核酸分子所組成之群組。
  17. 一種植物轉形載體，其包含如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，其中該至少一核苷酸序列係操縱地鏈接至在一植物細胞中作用的一異源性啟動子。
  18. 一種細胞，其係以如申請專利範圍第1項之聚核苷酸轉形。
  19. 如申請專利範圍第18項之細胞，其中該細胞係為一原核細胞。
  20. 如申請專利範圍第18項之細胞，其中該細胞係為一真核細胞。
  21. 如申請專利範圍第20項之細胞，其中該細胞係為一植物細胞。
  22. 一種植物，該者係以如申請專利範圍第1項之該聚核苷酸轉形。
  23. 一種如申請專利範圍第22項之植物的種子，其中該種子包含該聚核苷酸。
  24. 如申請專利範圍第22項之植物，其中該至少一核苷酸序 列在該植物中係表現為一雙股核醣核酸分子。
  25. 如申請專利範圍第21項之細胞，其中該細胞係為一玉米(Zea mays)細胞。
  26. 如申請專利範圍第22項之植物，其中該植物係為玉米。
  27. 如申請專利範圍第22項之植物，其中該至少一核苷酸序列在該植物中係表現為一核醣核酸分子，且當該鞘翅目害蟲攝入一部分該植物時，該核醣核酸分子抑制特異性地互補於該至少一核苷酸序列的一內源性鞘翅目害蟲核苷酸序列的表現。
  28. 如申請專利範圍第1項之聚核苷酸，進一步包含超過一核苷酸序列，其選自由以下所組成之群組：序列辨識編號：1；序列辨識編號：1之互補體；序列辨識編號：2；序列辨識編號：2之互補體；序列辨識編號：4；序列辨識編號：4之互補體；序列辨識編號：5；序列辨識編號：5之互補體；序列辨識編號：6；序列辨識編號：6之互補體；序列辨識編號：7；序列辨識編號：7之互補體；序列辨識編號：1、2及4-7任一者之至少19個連續的核苷酸的一片段；序列辨識編號：1、2及4-7任一者之至少19個連續的核苷酸片段之互補體；葉甲類生物包含序列辨識編號：1、2及4-7任一者之一原生編碼序列；葉甲類生物包含序列辨識編號：1、2及4-7任一者之一原生編碼序列的互補體；葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：1、2及4-7任一者的一原生RNA分子的原生非編碼序列；及葉甲類生物轉錄成包含序列辨識編號：1、2 及4-7任一者之一原生RNA分子的原生非編碼序列的互補體。
  29. 一種商品產物，其係產自於如申請專利範圍第22項之一植物，其中該商品產物包含可偵測數量的如申請專利範圍第1項之聚核苷酸。
  30. 一種用於控制一鞘翅目害蟲族群的方法，該方法包含提供包含一雙股核醣核酸分子的藥劑，其一旦與該鞘翅目害蟲接觸，可抑制該鞘翅目害蟲內的一生物功能，其中該藥劑包含如申請專利範圍第1項之聚核苷酸。
  31. 一種用於控制一鞘翅目害蟲族群的方法，該方法包含：提供包含一第一與一第二聚核苷酸序列之一藥劑，其一旦與該鞘翅目害蟲接觸，可抑制該鞘翅目害蟲內的一生物功能，其中該第一聚核苷酸序列包含一區域，其對序列辨識編號：1從約19至約30個連續的核苷酸展示從約90%至約100%的序列相似度，且其中該第一聚核苷酸序列係特異性地雜交至該第二聚核苷酸序列。
  32. 如申請專利範圍第31項之方法，其中該第一及/或第二聚核苷酸序列進一步包含一區域，其對選自由RPA70與RPS6所組成之群組的鞘翅目害蟲基因從約19至約30個連續的核苷酸展示從約90%至約100%的序列相似度。
  33. 一種用於控制一鞘翅目害蟲族群的方法，該方法包含：在鞘翅目害蟲之一宿主植物中提供包含如申請專利範圍第1項之聚核苷酸的一轉形植物細胞，其中該聚核苷酸係表現以產生一核糖核酸分子，其一旦與屬於該 族群之一鞘翅目害蟲接觸後，可抑制一靶定序列在該鞘翅目害蟲內的表現，且引致該鞘翅目害蟲或鞘翅目害蟲族群下降的生長，相對於在相同物種但缺乏該轉形植物細胞之一宿主植物上的生長。
  34. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該核醣核酸分子係為一雙股核醣核酸分子。
  35. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該鞘翅目害蟲族群係降低的，相對於鞘翅目害蟲族群其侵擾相同物種但缺乏該轉形植物細胞之一宿主植物者。
  36. 一種控制植物鞘翅目害蟲在一植物中侵擾的方法，該方法包含在一鞘翅目害蟲飲食中提供如申請專利範圍第1項之聚核苷酸。
  37. 如申請專利範圍第36項之該方法，其中該飲食包含經轉形以表現如申請專利範圍第1項之聚核苷酸的植物細胞。
  38. 一種用於改良一玉米作物產量的方法，該方法包含：引入如申請專利範圍第1項之聚核苷酸至一玉米植株，以製造一基因轉殖玉米植株；及培植該玉米植株以允許包含該至少一核苷酸序列的一核酸分子之表現；其中該核酸分子的表現抑制鞘翅目害蟲感染或生長，及歸因於鞘翅目害蟲感染的產量損失。
  39. 如申請專利範圍第38項之該方法，其中該核酸分子係為一RNA分子，該RNA分子在已經接觸部分該玉米植株的 鞘翅目害蟲中抑制至少一第一標靶基因。
  40. 一種用於製造一基因轉殖植物細胞的方法，該方法包含：以包含如申請專利範圍第1項之聚核苷酸的一載體轉形一植物細胞，其中該聚核苷酸係操縱地鏈接至一啟動子與一轉錄終止序列；在足以允許包含數個轉形植物細胞之植物細胞培養發展的條件下培養該轉形的植物細胞；選擇已經將該至少一核苷酸序列併入其基因組的轉形植物細胞；篩選該轉形植物細胞其表現由該至少一核苷酸序列所編碼之一核醣核酸分子者；及選擇一植物細胞其表現該核醣核酸分子者。
  41. 一種用於產生一抗鞘翅目害蟲基因轉殖植物的方法，該方法包含：提供藉由如申請專利範圍第40項之方法所製造的該基因轉殖植物細胞；及從該基因轉殖植物細胞再生一基因轉殖植物，其中由該至少一核苷酸序列所編碼之該核醣核酸分子的表現係足以調變接觸該基因轉殖植物的鞘翅目害蟲中一標靶基因的表現。
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