BR102012025724A2

BR102012025724A2 - moléculas de ácido nucleico que se direcionam a pp1-87b e conferem resistência a pestes coleópteras

Info

Publication number: BR102012025724A2
Application number: BR102012025724A
Authority: BR
Inventors: Chaoxian Geng; Huarong Li; Ignacio Larrinua; Kenneth E Narva; Monica Britt Olson; Navin Elango
Original assignee: Dow Agrosciences Llc
Priority date: 2011-10-06
Filing date: 2012-10-08
Publication date: 2015-09-15
Also published as: WO2013052870A2; US9657308B2; US20130091600A1; WO2013052870A3; UY34373A; AR088261A1; TW201321509A

Abstract

moléculas de ácido nucleico que se direcionam a pp1-87b e conferem resistência a pestes coleópteras. a presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico e métodos para uso das mesmas para controle de pestes coleôpteras através da inibição mediada por interferência de rna de sequências-alvo de codificação e não codificação transcritas em pestes coleópteras. a invenção refere-se também a métodos para fabricação de plantas transgênicas que expressam moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pestes coleôpteras e a células de planta e plantas então obtidas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO QUE SE DIRECIONAM A PP1-87B E CONFEREM RESISTÊNCIA A PESTES COLEÓPTERAS".

Pedidos Relacionados O presente pedido reivindica prioridade para Pedido de Patente Provisório U.S. N°. 61/544.211 depositado em 6 de outubro de 2011.

Campo da Invenção A presente invenção refere-se em geral a controle genético de dano à planta causado por pestes coleópteras. Em modalidades particulares, a presente invenção refere-se à identificação de sequências de codificação e não codificação alvo e ao uso de tecnologias de DNA recombinante para reprimir ou inibir pós-transcripcionalmente expressão de sequências de codificação e não codificação alvo nas células de uma peste coleóptera para prover um efeito protetor à planta.

Antecedentes A lagarta da raiz do milho do oeste (WCR) (Western Corrí Rootworm), Diabrotica virgifera virgifera LeConte, é uma das espécies de lagarta da raiz do milho mais devastadoras na América do Norte e é uma preocupação particular em áreas de cultivo de milho do meio-oeste dos Estados Unidos. A lagarta da raiz do milho do norte (NCR) (Northern Com Rootworm), Diabrotica barberi Smith e Lawrence, é uma espécie intimamente relacionada que co-habita muito da mesma faixa que WCR. Há várias outras subespécies relacionadas de Diabrotica que são pestes signifi-cantes na América do Norte: a lagarta da raiz do milho do México (MCR) (Mexican Com Rootworm), D. virgifera zeae Krysan e Smith; a lagarta da raiz do milho do sul (SCR) (Southern Corrí Rootworm), D. undecimpuncta-ta howardi Barber; D. balteata LeConte; D. undecimpunctata tenella-, e D. u. undecimpunctata Mannerheim. O Departamento de Agricultura dos Estados Unidos estima que as lagartas da raiz do milho causem 1 bilhão de dólares em receita perdida a cada ano, incluindo 800 milhões de dólares em perda de rendimento e 200 milhões de dólares em custos de tratamento.

Ambas a WCR e a NCR são depositadas no solo como ovos durante o verão. Os insetos permanecem no estágio de ovo durante todo o inverno. Os ovos são oblongos, brancos e de menos do que 0,1 mm (0,004 polegada) de comprimento. As larvas eclodem no final de maio ou início de junho, com o momento preciso de eclosão do ovo variando de ano para ano devido a diferenças em temperatura e local. As larvas recém-eclodidas são vermes brancos que são de menos do que 3,18 mm (0,125 polegada) de comprimento. Uma vez eclodida, a larva começa a se alimentar das raízes de milho. As lagartas da raiz do milho passam por três estágios larvais. Após se alimentarem por várias semanas, as larvas mudam para o estágio pupal. Elas pupam no solo e então elas emergem do solo como adultos em julho e agosto. Lagartas da raiz adultas são de cerca de 6,35 mm (0,25 polegada) de comprimento.

As larvas da lagarta da raiz do milho completam o desenvolvimento em milho e várias outras espécies de gramíneas. As larvas cultivadas em foxtail amarela emergem mais tarde e têm um tamanho de cápsula de cabeça menor como adultos do que as larvas cultivadas em milho. Ellsbury et aI (2005) Environ. Entomol, 34:627-34. WCR adultas se alimentam do cabelo, pólen e grãos de milho nas pontas das espigas expostas. Se WCR adultas emergirem antes dos tecidos reprodutivos de milho estarem presentes, elas podem se alimentar de tecido de folha, desta maneira deixando mais lento o crescimento da planta e ocasionalmente matando a planta hospedeira. No entanto, os adultos vão rapidamente mudar para cabelos e pólen preferidos quando eles estiverem disponíveis. NCR adultas se alimentam também de tecidos reprodutores da planta de milho, mas em contraste raramente se alimentam de folhas do milho. A maioria do dano da lagarta da raiz em milho é causado por alimentação larval. Lagartas da raiz recém-eclodidas inicialmente se alimentam de pelos da raiz do milho finos e se escondem nas pontas da raiz. Conforme as larvas crescem, elas se alimentam de e se escondem em raízes primárias. Quando as lagartas da raiz do milho são abundantes, alimentação larval frequentemente resulta em corte das raízes em todo o caminho para a base do caule do milho. Dano à raiz severo interfere com a habilidade da raiz em transportar água e nutrientes para a planta, reduz o crescimento da planta e resulta em produção de grão reduzida, desta maneira reduzindo drasticamente o rendimento geral. Dano à raiz severo também resulta frequentemente em alojamento de plantas de milho, o que torna a colheita mais difícil e diminui mais o rendimento. Ainda, alimentação por adultos nos tecidos reprodutores do milho pode resultar em corte de cabelos na ponta da espiga. Se esta "redução de cabelo" for severa o suficiente durante a dispersão do pólen, polinação pode ser interrompida.

Controle de lagartas da raiz do milho pode ser tentado através de rotação de cultura, inseticidas químicos, biopesticidas (por exemplo, a bactéria gram-positiva de formação de esporo, Bacillus thuringiensis) ou uma combinação dos mesmos. Rotação de cultura sofre da desvantagem signifi-cante de imposição de restrição indesejada ao uso da terra. Além disso, ovi-posição de algumas espécies de lagarta da raiz pode ocorrer em campos de soja, desta maneira mitigando a eficácia de rotação de cultura praticada com milho e soja.

Inseticidas químicos são a estratégia mais usada para obter controle da lagarta da raiz do milho. Uso de inseticida químico, no entanto, é uma estratégia de controle da lagarta da raiz do milho imperfeita; mais de 1 bilhão de dólares pode ser perdido nos Estados Unidos a cada ano devido à lagarta da raiz do milho quando os custos dos inseticidas químicos são adicionados aos custos do dano da lagarta da raiz que pode ocorrer apesar do uso dos inseticidas. Grande número de populações de larva, chuvas fortes e aplicação imprópria do(s) inseticida(s) pode(m) resultar em controle da lagarta da raiz do milho inadequado. Ainda, o uso contínuo de inseticidas pode selecionar linhagens da lagarta da raiz do milho resistentes a inseticida, bem como criar preocupações ambientais significantes devido à toxidez de muitos deles a espécies não alvo.

Interferência de RNA (RNAi) é um processo utilizando cursos celulares endógenos, desta maneira uma molécula de RNA de interferência (iRNA) (por exemplo, uma molécula de dsRNA) que é específica para toda, ou qualquer porção de tamanho adequado, uma sequência de gene-alvo resulta na degradação do mRNA então codificado. Nos últimos anos, RNAi tem sido usado para realizar "inativação" de gene em várias espécies e sistemas experimentais; por exemplo, Caenorhabitis elegans, plantas, embriões de inseto e células em cultura de tecido. Vide, por exemplo, Fire et al (1998) Nature 391:806-11; Martinez et al (2002) Cell 110:563-74; McManus e Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-47. RNAi realiza degradação de mRNA através de um curso endó-geno incluindo o complexo de proteína DICER. DICER cliva moléculas de dsRNA longas em fragmentos curtos de aproximadamente 20 nucleotídeos, chamados RNA de interferência pequenos (siRNA). O siRNA é não espirala-do em dois RNAs de filamento simples: o filamento passageiro e o filamento guia. O filamento passageiro é degradado, e o filamento guia é incorporado ao complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) (RNA-induced si-lencing complex). Moléculas de ácido ribonucleico microinibidoras (miRNA) podem ser similarmente incorporadas a RISC. Silenciamento de gene pós-transcripcional ocorre quando o filamento guia se liga especificamente a uma sequência complementar de uma molécula de mRNA e induz divagem por Argonauta, o componente catalítico do complexo RISC. Este processo é conhecido se espalhar sistemicamente através do organismo apesar de concentrações inicialmente limitadas de siRNA e/ou miRNA em alguns eucarion-tes tais como plantas, nematoides e alguns insetos.

Apenas transcritos complementares ao siRNA e/ou miRNA são clivados e degradados, e então a inativação de expressão de mRNA é específica de sequência. Em plantas, vários grupos funcionais de genes de DICER existem. O efeito de silenciamento de gene de RNAi persiste por dias e, sob condições experimentais, pode levar a um declínio em abundância do transcrito direcionado de 90% ou mais, com redução consequente em níveis da proteína correspondente. A Patente U.S. N°. 7.612.194 e as Publicações de Patente U.S. Nos. 2007/0050860 e 2010/0192265 revelam uma biblioteca de 9112 sequências de etiqueta de sequência expressa (EST) (Expressed Sequence Tag) isoladas de pupa de D. v. virgifera LeConte. É sugerido na Patente U.S. N°. 7.612.194 e na Publicação de Patente U.S. N°. 2007/0050860 ligar ope-ravelmente a um promotor uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma de várias sequências parciais particulares de H+-ATPase tipo vacuolar de D. v. virgifera (V-ATPase) descritas nelas para a expressão de RNA de antissentido em células de planta. A Publicação de Patente U.S. N°. 2010/0192265 sugere ligar operavelmente um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência parcial particular de um gene de D. v. virgifera de função desconhecida e não descrita (a sequência parcial é declarada ser 58% idêntica ao produto de gene C56C10.3 em C. elegans) para a expressão de RNA de antissentido em células de planta.

Nenhuma sugestão adicional é provida nessas publicações de usar qualquer sequência particular das mais de nove mil sequências listadas nelas para interferência de RNA, que não as várias sequências parciais particulares de V-ATPase e a sequência parcial particular de um gene de função desconhecida. Ainda, nenhuma da Patente U.S. N°. 7.612.194 e das Publicações de Patente U.S. Ν'*. 2007/0050860 e 2010/0192265 provê qualquer orientação das quais outras das mais de nove mil sequências providas seriam letais, ou até mesmo úteis, em espécies de lagarta da raiz do milho quando usadas como dsRNA ou siRNA. A maioria esmagadora dessas sequências não é letal em espécies da lagarta da raiz do milho quando usadas como dsRNA ou siRNA. Por exemplo, Baum et al (2007) Nat. Biotech. 25(11):1322-6 descrevem os efeitos de inibição de vários alvos de gene de WCR por RNAi. Esses autores relataram que 8 de 26 genes-alvo que eles testaram não foram capazes de prover mortalidade de peste coleóptera experimentalmente significante em uma concentração de iRNA muito alta (por exemplo, dsRNA) de mais de 520 ng/cm2.

Sumário da Invenção São descritas aqui moléculas de ácido nucleico (por exemplo, genes-alvo, DNAs, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs), e métodos de uso das mesmas, para o controle de pestes coleópteras, incluindo, por exemplo, D. v. virgifera LeConte (lagarta da raiz do milho do oeste, "WCR"); D. barberí Smith e Lawrence (lagarta da raiz do milho do norte, "NCR"); D. u. howardi Barber (lagarta da raiz do milho do sul, "SCR"); D. v. zeae Krysan e Smith (lagarta da raiz do milho do México, "MCR"); D. balteata LeConte; D. u. te-nella; e D. u. undecimpunctata Mannerheim. Em exemplos particulares, moléculas de ácido nucleico exemplares são descritas, as quais podem ser homólogas a pelo menos uma porção de uma ou mais sequências de ácido nucleico nativas em uma peste coleóptera.

Nesses e em exemplos adicionais, a sequência de ácido nucleico nativa pode ser um gene-alvo, cujo produto pode estar, por exemplo, e sem limitação: envolvido em um processo metabólico; envolvido em um processo reprodutor; ou envolvido em desenvolvimento larval. Em alguns e-xemplos, inibição pós-traducional da expressão de um gene-alvo por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência homóloga ao mesmo pode ser letal em pestes coleópteras ou resultar em crescimento e/ou reprodução reduzidos. Em exemplos específicos, o pelo menos um gene selecionado da lista consistindo em comprimento integral de PP1-87B (algumas vezes referido aqui como "PP1-87B"); proteína fosfatase con-tig0011_87B; comprimento integral de RPA70 (algumas vezes referido aqui como "RPA70"); D_vir_c43870_RPA70 (algumas vezes referido aqui como "região 1 de RPA70" ou "RPA70 Reg1"); D_vir_c18764_RPA70 (algumas vezes referido aqui como "região 2 de RPA70" ou "RPA70 Reg2"); D_vir__c7971_RPA70 (algumas vezes referido aqui como "região 3 de RPA70" ou "RPA70 Reg3"); e RPS6 pode ser selecionado como um gene-alvo para silenciamento pós-traducional. Em exemplos particulares, um gene-alvo útil para inibição pós-transcripcional é o gene referido aqui como PP1-87B, gene que compreende novas sequências de direcionamento. Uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de nu-cleotídeo selecionada do grupo consistindo em proteína fosfatase con-tig0011_87B (SEQ ID N°:3); o complemento da proteína fosfatase con-tig0011_87B (SEQ ID N°:3); e fragmentos de qualquer um dos acima é então descrita aqui. São também descritas moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que é pelo menos 85% idêntico a uma sequência de aminoácido dentro de um produto de gene-alvo (por exemplo, um produto de um gene selecionado do I grupo consistindo em PP1-87B; proteína fosfatase contigOOl 1_87B; RPA70; RPA70 Regí; RPA70 Reg2; RPA70 Reg3; e RPS6). Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo que é pelo menos 85% idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID N°:67 (PP1-87B); SEQ ID N°:95 (proteína fosfatase contigOOl 1_87B); SEQ ID N°:68 (RPA70); SEQ ID N°:96 (RPA70 Regí); SEQ ID N°:97 (RPA70 Reg2); SEQ ID N°:98 (RPA70 Reg3); e SEQ ID N°:69 (RPS6). Em exemplos particulares, uma molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo que é pelo menos 85% idêntica a uma sequência de aminoácido dentro de um produto de PP1-87B. São ainda descritas moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é o complemento reverso de uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo pelo menos 85% idêntica a uma sequência de aminoácido dentro de um produto de gene-alvo. São também descritas sequências de cDNA que podem ser u-sadas para a produção de moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) que são complementares a todo ou parte de um gene-alvo de peste coleóptera, por exemplo: PP1-87B; RPA70; RPA70 Regí; RPA70 Reg2; RPA70 Reg3; e/ou RPS6. Em modalidades particulares, dsRNAs, siRNAs, miRNAs, e/ou hpRNAs podem ser produzidas in vitro ou in vivo por um organismo geneticamente modificado, tal como uma planta ou bactéria. Em exemplos particulares, moléculas de cDNA são descritas, as quais podem ser usadas para produzir moléculas de iRNA que são complementares a toda ou parte de proteína fosfatase contigOOl 1_87B (SEQ ID N°:3). São ainda descritos meios para inibição da expressão de um gene essencial em uma peste coleóptera e meios para provisão de resistência à peste coleóptera a uma planta. Um meio para inibição de expressão de um gene essencial em uma peste coleóptera é uma molécula de RNA de filamento simples ou duplo consistindo em qualquer uma de SEQ ID NoS:25-28 ou o seu complemento. Equivalentes funcionais de meios para inibição da expressão de um gene essencial em uma peste coleóptera incluem moléculas de RNA de filamento simples ou duplo que são substancialmente homólogas a todo ou parte de um gene de WCR compreendendo qualquer uma das SEQ ID Ν°*:3, 5, 6 e 7. Um meio para provisão de resistência à peste coleóptera a uma planta é uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um meio para inibição da expressão de um gene essencial em uma peste coleóptera operavelmente ligada a um promotor, onde a molécula de DNA é capaz de ser integrada ao genoma de uma planta de milho. São descritos aqui métodos para controle de uma população de uma peste coleóptera compreendendo provisão a uma peste coleóptera de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) que funciona quando sendo absorvida pela peste coleóptera para inibir uma função biológica dentro da peste coleóptera, onde a molécula de iRNA compreende toda ou parte de uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID N°:1; o complemento de SEQ ID N°:1; SEQ ID N°:2; o complemento de SEQ ID N°:2; SEQ ID N°:3; o complemento de SEQ ID N°:3; SEQ ID N°:4; o complemento de SEQ ID N°:4; SEQ ID N°:5; o complemento de SEQ ID N°:5; SEQ ID N°:6; o complemento de SEQ ID N°:6; SEQ ID N°:7; o complemento de SEQ ID N°:7; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica {por exemplo, WCR) compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NoS:1-7; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NoS:1-7; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NoS:1-7; e o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID N°s:1-7.

Em exemplos particulares, são descritos métodos para controle de uma população de uma peste coleóptera compreendendo provisão a uma peste coleóptera de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) que funciona quando sendo absorvida pela peste coleóptera para inibir uma função biológica dentro da peste coleóptera, onde a molécula de iRNA compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: toda ou parte de SEQ ID N°:1; o complemento de toda ou parte de SEQ ID N°:1; toda ou parte de SEQ ID N°:2; o complemento de toda ou parte de SEQ ID N°:2; toda ou parte de SEQ ID N°:7; o complemento de toda ou parte de SEQ ID N°:7; toda ou parte de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID N°:1; toda ou parte do complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:1; toda ou parte de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:1; toda ou parte do complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:1; toda ou parte de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por e-xemplo, WCR) compreendendo SEQ ID N°:2; toda ou parte do complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:2; toda ou parte de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:2; toda ou parte do complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:2; toda ou parte de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID N°:7; toda ou parte do complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:7; toda ou parte de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7; e toda ou parte do complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7. São também descritos aqui métodos onde dsRNAs, siRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs podem ser providos a uma peste coleóptera em um ensaio baseado em dieta ou em células de planta geneticamente modificadas expressando os dsRNAs, siRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs. Nesses e em exemplos adicionais, os dsRNAs, siRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs podem ser ingeridos por larvas de peste coleóptera. Ingestão de dsRNAs, siRNAs, miRNAs, e/ou hpRNAs da invenção pode então resultar em RNAi na larva, o que por sua vez pode resultar em silenciamento de um gene essencial para viabilidade da peste coleóptera e levando por último à mortalidade larval. Desta maneira, são descritos métodos onde moléculas de ácido nucleico compreendendo sequência(s) de ácido nucleico exemplare(s) útil/úteis para controle de pestes coleópteras são providas a uma peste coleóptera. Em exemplos particulares, a peste coleóptera controlada pelo uso de moléculas de ácido nucleico da invenção pode ser WCR ou NCR.

As características acima e outras se tornarão mais aparentes a partir da descrição detalhada que segue de várias modalidades, que prossegue com referência às figuras acompanhantes.

Breve Descrição das Fiauras A figura 1 inclui uma mostra da estratégia usada para prover moldes específicos para produção de dsRNA. A figura 2 inclui um gráfico de variabilidade para a mortalidade percentual de pestes coleópteras exemplares (isto é, larva da lagarta da raiz do milho do oeste) tratadas com moléculas de ácido nucleico exemplares se direcionando a PP1-87B, RPA70 Regí e RPA70 Reg2. A figura 3 inclui um gráfico de variabilidade para a mortalidade percentual de pestes coleópteras exemplares (isto é, larvas da lagarta da raiz do milho do oeste) tratadas com moléculas de ácido nucleico exemplares se direcionando a RPS6. A figura 4 inclui um gráfico de variabilidade para a inibição do crescimento (Gl) (Growth inhibition) de pestes coleópteras exemplares (isto é, larvas da lagarta da raiz do milho do oeste) tratadas com moléculas de ácido nucleico exemplares se direcionando a PP1-87B, RPA70 Regí e RPA70 Reg2. A figura 5 inclui um gráfico de variabilidade para inibição de crescimento (Gl) de pestes coleópteras exemplares (isto é, larvas da lagarta da raiz do milho do oeste) tratadas com moléculas de ácido nucleico exemplares se direcionando a RPS6. A figura 6 provê um gráfico de variabilidade de dano por alimentação da raiz por pestes coleópteras exemplares (isto é, larvas da lagarta da raiz do milho do oeste) em raízes de plantas de estufa Ti de eventos compreendendo construto de dsRNA grampo de cabelo PP1-87B e outros eventos compreendendo um construto de dsRNA grampo de cabelo RPS6. A figura 7 inclui um sumário de Análise de Variância (ANOVA) de dano por alimentação da raiz causado por alimentação por pestes coleópteras exemplares (isto é, larvas da lagarta da raiz do milho do oeste) em raízes de plantas de estufa Ti de eventos compreendendo um construto de dsRNA grampo de cabelo RPA70.

Listagem de Sequência As sequências de ácido nucleico listadas na listagem de sequência acompanhante são mostradas usando abreviações de letra padrão para bases de nucleotídeo, conforme definido em 37 C.F.R. § 1.822. Apenas um filamento de cada sequência de ácido nucleico é mostrado, mas o filamento complementar é compreendido como incluído por qualquer referência ao filamento exibido. Uma vez que o complemento e o complemento reverso de uma sequência de ácido nucleico primária são necessariamente descritos pela sequência primária, a sequência complementar e a sequência complementar reversa de uma sequência de ácido nucleico são incluídas por qualquer referência à sequência de ácido nucleico, a menos que seja explicitamente declarado de outra maneira (ou fique claro ser de outra maneira a partir do contexto onde a sequência aparece). Na listagem de sequência acompanhante: A SEQ ID N°:1 mostra uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida como proteína fosfatase PP1-87B (comprimento integral): CGCAAAAAAGTGTTGTTTGGTTTGTAGTTAAAAGGCTCTGTAAAAATCAT TAAAAATCCGAGCCATCTTTTAGTTTTAAGTTTCTTAAATATTGTCAAAGA GTATCACAAGGATTTCTCAAATGGCAGAAGCAGATAAATTGAATATCGAC AGTATAATAGCCCGTTTATTAGAAGTGCGTGGAGCAAGACCAGGCAAAAA T GTACAACT CACAGAAAAT GAAATTAGGGGGCT CT GTTTAAAAT CTAG AG AGAT CTT CCTTAGCCAGCCGATTTT GTTGGAACTT GAAGCTCCT CT GAAG ATTT G C GGT GATATAC AT GGT C AGTACTAT G ACTT GCTTCGT CT CTTT G AA TATGGAGGTTTCCCTCCCGAATCAAACTACTTA Í l ΓΓI GGGAGATTATGTA GAT CGTGGTAAACAAT CATT GGAAACCATCT GCTTACTT CT CGCTTACAA AATTAAATACCCAGAAAACTTTTTCCTACT CAGAGGCAACC ACGAAT GCG C AT C AATTAAT CGTATATATGG ATT CTAT GAT G AAT G C AAAAG AAG GTATA AC AT C AAGTT GT GGAAAACTTTTACGG ACT GTTT CAATTGCCTACCT GTA GCAGCCATCGTCGATGAAAAAATTTTCTGTTGCCATGGTGGTTTAAGTCC GGACCTACAATCAATGGAACAAATTAGAAGAATTATGAGACCGACTGATG TACCT GACCAAGGGCTT CTTT GT G ACCTTTTAT GGT CT GAT CCAGAC AAA GACCAGAT GGGAT GGGGAGAAAACGATAGAGGAGTTAGTTTTACTTTT G GT GCT G AAGTT GTAGGAAAGTT CTTGC AC AAAC ACGATTTT GATTT GATAT GTCGAGCGCAT CAAGTCGTAGAAGAT GGATAT G AATT CTT CGCCAAAAGA CAGTTAGTCACACT GTTTAGTGCGCCAAATTATT GTGGAGAGTTTGATAA CGCAGGT GCGAT GAT GTCGGT GGAT GAGACACT AAT GT GTAGTTTT CAA ATTTTAAAGCCAGCAGACAAGAGGAAATTCCAGTACAACATGAACGCAG GCAGACCTGTGACGCCGCCAAGAGGCGCAACGAATAAAAACAAGAAGAA GTGAAT GAATAATATATTTATAAGGTTAGGTTTAGTCGCAACATAAACAT G TT CAAAACATTTTAAATACTAAAATTTT CTAAAGGTTACAAAGATT CAAGAT AAATTAAGATTTT CTTCAT GTTTTT GTT GGTT GTTTTATAGGTTAGGATAGT AAACTATATAATAATAAAGTT CT CAATATT GTTAAAAAGAAGT GAAT GTTAG TATTTAAAATGTTCGATTATTTCGGCCGTTTTACTTTATTTTATATCTGATA TTACTAGAAAAGGGTGATATCTATGAACCCAGACAACTAAACGTTCGATT T GAACAAAT GAAAATTTATT GAAAAC ATTAATCCT CAC AACCTT GCTT ATTT AATTAAAGAACAAGATCAGTAATACATTAAAGTCTATCATTAATAA A SEQ ID N°:2 mostra uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida como RPA70 (comprimento integral): CAAAGGTTT CGTTT CAAACTT C AC ACCG ATAAAGACTT GTTT GTT CTT GT C AGT G |TCAGTTCTGGCGGTAAAATATTTGCGGTATACACA I I I I I IACGTCGTACGTAATT T GCAGG GGTT GATTACT G AT CTTTATTT GATAATTT GTTTATTTATTTT GCAAC ATA AGCAAAAT GCGTT CGCCT CAAACCTATAACAT GTCAGAAGGAT CACTCCAGACA AT CAT GT CTGGAGGT GAATTTCCAAATCCCATTATGCAAGTTTT GGGTAGCAAAA AGATAAACGCCGGATTGGGTGATAAAGAAAGAATTCGTATTTTACTGTCAGATGG AAAATACACTATTTCTTTTGCCATGCTAACAGCCCAAATTAATGATCGACTTGGTC CAAATGGT GTGGAAACTTTTAGCATTATACAAATAG ATAGATAT GTTACGAGTAT CAT CAACAATT CT G GGAAAGGAG AAG CAC GAGTACTTTTAAT CCTCGATAT G CAT GTTGTTGTCCCTGGAACTGAAGTTACAGAAAAAGTAGGCTCTCCCATTCCCCTA CCAACTGATGCTGACGCAGCTAAAGGCTCTACTGCCGCTCCAGCTACAAACAAT T C C ATTAAG AAT GTAACT GTTG CTAAAC CAAACAT C AGTAAT G G CAAT G GCAC AA CTGCAATGAAT GCCAGTACTAATGAT GATATAGCCACACATAT GATCCATCCTAT TT CAAGT CT CACACCTTACCAAAACAGAT GGACTAT CAAAGCGAGAATTACTAAT AAACCTCCAATAAGAACGTGGTCAAATTCTAGAGGGGAAGGAAAATTATTTAGTT TT GAT CT GGTGGAT GAAAGTGGCG AAAT CCGTT GCACAGCTTTTAAAGAAAT GG TT GATAAATT CTATGATTAC CT G CAGGT GGATAAAGTATATTACAT CAACAAAT GT C AACTTAAACAAG C CAACAAACAGTAC AG C ACT CTAAAAC ATGAGTAT G AAAT G A CTGTTACGCATGATACTGTCATTAAAGAATGCCTTGATGCAGATTCTACAATACC CACCACACAGTATAACTTT GTT CCTATAGATAAAATTGCT GATAAAGAAGTAAATT CT GTT GTAGAT GTAATAGGTATT GCCAAAAGTGT CAGTGAATTACAAACATT CCA AGCAAG AT CAACAGG AAGAGAATT G AAAAAG AAAG AAGTTGT CTTGGTT GAT CA GTCACAAACAGCTATAT CGTTAACACTTT GGGGCCAAGAAGCCGAAAATTTT GAT GGTACCAATAATCCTGTCGTAGTTATAAAAAGTGCCAAAATTGGCGAGTTTGGAG GTGGCAAG AATTTAACTACT CTT GTTAGC AGCACT GTAAAAATAAAT CCCGAATT AAAAGAAT GTTACAGGAT CAGAGGATGGTACGACAGT GAGGGT GAAAATCT GAA TGCAAAGAATATTAGTGCCAGAGTTGGATCCTCGAATATGTCTGCCACTTGGAT GACCTTTAAGGAAGTTAAAGAT CAAAAATTAGGAT CAT CT GAAAAAGGT GATTAT TATAAAGCTATTGCTACTGTTCTTCTTGTCAAAGCCGATAATATTGTGTATAGAGC TTGT CCCACCGCT G AAT GTAATAAGAAAGTT GTT GATAT GGAAAATAGTAT GTAC

AGAT GT GAAAAAT GTAATAGAGAATTT CCAAATTT CAAATACAGACT GTTAGCCA GCAT GAAT GTT GGAGACCACACAGGAAACCAAT GGGTTAGCAT GTTCAGTTCAG AAGCCG AAAAAATT CTGGGGAT GACTGCT GAGGAAGTAGGACAGACCTTGGAA CACAATAAAGAAG AAATAG CCAAC AT CGTAGATAG AG CT CATTTTAAAGTATTTA GT CTTACTT G CAGG GCAAAAATT G AG ACTTACAAT GAT G AAGCTCGTTTAAAAAC T GTTT GTATAAGAGT CGATCCAATTAATTAT G AGG AGTATAGT G CATT G CT CACA GAAAAAATT CAGCAGTTAACAGGCG AAT CT CAT GATTAGATATACACCAACACTA CAGCTAT G CTATTATTT CTAGTT CTTTTTTTTTTTAGAAAATAT C GTTAAG AAAT CT GT GTTTT GTATTTATTTTTTATAAACAGT GAAT CAGT GAATAAGATTTTATTAG AAA GGTACTGTATAAATAAAAATCTGTATGTTCACAATAI I I I IATTTATTTAAATATAC ATT G GTACAAAATAAAATATATATT CGTAACAACTATATTATT GTTTATTATT GTTT ATT CTTAAGCCCCAT CAT CTAAAG AG GTT CTAAAT GT GCTTGTTTT CTTGCATACG CACCTAAACAAGCTAAAATTAGTATTACACTCATAAATAATCCTATTAATAAGGCT AAAGTAT CT CCAAAAT CAAACATTTT G CT GTATTATT GAGT GTTTAAATAATTACAT CAAAATAAAATATTTTTTATTTTTT G CTT GTCTTGTAT GTTTATTTAC GTTTTACTTG T CAAT CAGCT GT CTATTT CTTC T TTT IAATTA A SEQ ID N°:3: mostra uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como contig0011_PP1-87B: AATT CAAGCTGCCGCAAAAAAGT GTT GTTT GGTTT GTAGTTAAAAGGCT C TGTAAAAAT CATTAAAAAT C C G AG C CAT CTTTTAGTTTTAAGTTT CTT AAA TATT GT CAAAGAGTAT CAC AAGGATTT CT CAAAT GGC AGAAGCAGATAAA TTGAATATCGACAGTATAATAGCCCGTTTATTAGAAGTGCGTGGAGCAA GACCAGGCAAAAATGTACAACTCACAGAAAAT GAAATTAGGGGGCT CT G TTTAAAAT CTAGAGAGATCTTCCTTAGCCAGCCGATTTT GTT GGAACTT G AAGCTCCT CT GAAGATTT GCGGTGATATACAT GGT CAGTACTATGACTT GCTTCGTCTCTTTGAATATGGAGGTTTCCCTCCCGAATCAAACTACTTA TTTTTGGGAG ATTATGT AGAT CGT GGTAAACAAT CATT GGAAACCAT CT GCTTACTT CT CGCTTAC AAAATTAAATACCCAGAAAACI ITT TCCTACT CAGAGGCAACCACGAATGCGCATCAATTAATCGTATATATGGATTCTAT GATGAATGCAAAAGAAGGTATAACATCAAGTTGTGGAAAACTTTTACGG ACTGTTTCAATTGCCTACCTGTAGCAGCCATCGTCGATGAAAAAATTTT CT GTT GCCAT GGT GGTTTAAGT CCGGACCTACAAT CAAT GGAACAAA

TTAG AAG RATTAATAG AG AC C G ACT G AT GTAC CT G AC C AAG G STTT CTTT GT GACCTTTTANGGT CT GAT CCAGAC AAAGACC A SEQ ID N°:4: mostra uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como D_vir_c43870_RPA70, região 1 de RPA70 ou RPA70 Regí: ATAATTT GCAGGGGTT GATTACT GAT CTTTATTT GATTAATTT GTTTATTT ATTTTTGCAACATAAGCAAAATGCGTTCGCCTCAAACCTATAACATGTCA G AAGG AT CACT CCAGACAATCAT GT CTGG AGGT GAATTT CCAAATCCCA TTATGCAAGTTTT GGGTAGCAAAAAGATAAACGCCGGATT GGGT GATAAA G AAAGAATT CGTATTTTACT GT C AGAT GGAAAATAC ACTATTT CTTTT GCC AT GCTAACAGCC C AAATTAAT GAT CGACTT GGT CCAAAT GGT GT GG AAAC ΤΤΪ TTAGCATTATACAAATAGATAGATAT GTTACGAGTATCATCAACAATT C T GGGAAAGGAGAAGCACGAGTACTTTTAATCCT CGATATGCAT GTT GTT G T CCCT GGAACTGAAGTTAC AGAAAAAGTAGGCT CT CCCATTCCCCTACC AACTGATGCTGACKCAGCTAAAGGCTCTACTGCCGCTCCAGCTACAAACA ATT CCATTAAGAAT GTAACT GTT GCTAAACCAAACATCAGTAAT GGCAAT G GCACAACT GCAAT GAAT GCCAGTACTAAT GAT G ATATAGCCACACATAT G ATCCATCCTATTT CAAGT CTCA CACCTTA A SEQ ID N°:5 mostra uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como D_vir_c18764_RPA70, região 2 de RPA70 ou RPA70 Reg2: AT GGTCAAATT CTAGAGGGGAAGGAAAATTATTTAGTTTT GAT CT GGT GG ATGAAAGTGGCGAAATCCGTTGCACAGCTTTTAAAGAAATGGTTGATAA WTT CTAT GATTACCTGCAGGT GGATAAAGTATATTACATCAACAAAT GT C AACTTAAAC AAG C C AAC AAAC AGTAC AG CACT CTAAAAC AT G AGTAT G AAAT GACT GTTACGCAT GATACT GTC ATTAAAGAAT GCCTT GAT GCAG A TTCT AC AATAC C C ACC AC AC AGTATAACTTT GTT C CTATAGATAAAATT GCT GATAAAG AAGTAAATT CT GTT GTAGAT GTAATAGGTATT G CC AAAA GT GT C AGT GAATTAC AAAC ATT CCAAGCAAG AT CAACAGGAAGAGAATT G AAAAAG AAAG AAGTT GTCTTG GTT GAT C AGT C ACAAAC AG CTATAT C G TTAACACTTTGGGGCCAAGAAGCCGAAAATTTTGATGGTACCAATAAT CCTGTCGTAGTTATAAAAA A SEQ ID N°:6 mostra uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como D_vir_c7971_RPA70, região 3 de RPA70 ou RPA70 Reg3: AACT CTT GTTAGCAGCAMTRTAAAAATAAATCCCGAATTAAAAG AAT GTT ACAGGAT CAGAGG AT GGTACGAC AGT GAGGGT GAAAAT CT GAATGCAA AGAATATTAGTGCCAGAGTTGGAT CCT CGAATAT GT CT GCCACTT GG A T GACCTTTAAGGAAGTTAAAGATCAAAAATTAGGATCAT CT GAAAAAGGT GATTATTATAAAGCTATTGCTACTGTTCTTCTTGTCAAAGCCGATAATATT GT GTATAGAGCTT GTCCCACCGCT GAAT GTAATAAGAAAGTT GTT GATA T GGAAAATAGTAT GTACAGATGTGAAAAAT GTAATAGAGAATTTCCAAA TTTCAAATACAGACTGTTAGCCAGCATGAATGTTGGAGACCACACAGG AAACCAAT GGGTTAGCAT GTT CAGTTCAGAAGCCGAAAAAATT CT GGGG AT G ACT GCT G AGGAAGTAGGACAGACCTTGGAACACAATAAAGAAGAAA TAGCCAACATCGTAGATAGAGCTCATTTTAAAGTATTTAGTCTTACTTGC AGGGCAAAAATTGAGACTTACAAT GAT GAAGCT CGTTTAAAAACT GTTT GTATAAGAGTCGATCC AATTAATTAT G AGG AGTATAGT GCATT GCT CACA GAAAAAATT CAGCAGTTAACAGGCGAATCTCAT GATTAGATATACACCAA C ACTAC AG CTAT G CTATTATTT CTAG A SEQ ID N°:7 mostra uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida aqui como RPS6: ATTAATTTTCTGAAATATCCTTl I I GAAACATGGCAGTTCCATGTGCACA CTAACGAGAAGTTTTTCCCGTATTTAGTGTAATTTGCCAAAAATAAAGTG T GAAATAGTAGTTTTCGAGT GCAAAATAAGT CAATAT GAAGTT GAACGT ATCGTACCCGGCCACGGGTTGCCAAAAACTTTTCGAAGTTGTTGACGAA C AC AAAATTCGTAT CTTTTACG AAAAACG C AT GGGT C AAGAAGTT G AG GCT GATGCT CTT GGT GACGAATGGAAGGGCT ACAT CTT GAAAATAT CT GGAGGTAACGACAAACAAGGATT CCCCAT GAAACAAGGT GTT CTTACA AACGGTAGAGTAAGACTTTTACTTTCAAAAGGTCACTCCTGCTACAGA CCC AGACGTACCGGT GAACGTAAAAG GAAAT C AGTT CGT GGGT GCATT GTT GAT GGGAACCT C AGCGT GTT GGC CCTAGT CATT GTAAGAAAAGGAG AACAAGAAATTCCCGGACTTACTGACACCACCATCCCACGTCGCCTGG GACCCAAGAGAGCATCCAGAATCCGTAAGCTCTTCAACCTTAGCAAAGA

AGACGAT GTACGT CAATAT GTAGTAAAGAGACCTTTGGCCCAAAAAGAA

GGTAAGAAGTTAAGAACCAAGGCCCCCAAAATCCAACGTCTTATTACAC

CCGTTGTTTTGCAAAGAAAACGTCATCGTCTTGCTTTGAAGAAGAAGAG

GTGCCTTAAACGTAAAGAACAAGAAGATGCATATGCTAAACTATTGGCT

CAACGTAAGAAGGAATCC AAGGCT CGT CGT GAGAT GTT GAAGAGGCGT

AGGTCTGCCAGTATGCGTGATAGTAAATCCAGCACGCAGAGTGGTCAG

AAGTAAATTGTAAT I I I I I ATATTTTAAGACAATGTATGAAATAAACG A SEQ ID N°:8 mostra uma sequência de promotor de fago T7.

As SEQ ID Nos:9-24 mostram sequências de iniciadores usados para amplificar porções de regiões de codificação de genes-alvo exemplares através de PCR.

A SEQ ID N°:25 mostra um fragmento amplificado exemplar de PP1-87B usado como um molde para síntese de dsRNA: CAAATGGCAGAAGCAGATAAATTGAATATCGACAGTATAATAGCCCGTTT ATTAGAAGTGCGTGGAGCAAGACCAGGCAAAAATGTACAACTCACAGA AAATGAAATTAGGGGGCTCTGTTTAAAATCTAGAGAGATCTTCCTTAGC CAGCCGATTTTGTTGGAACTTGAAGCTCCTCTGAAGATTTGCGGTGATA T AC AT GGT CAGTACTATGACTT GCTT CGT CTCTTT G AATATGGAGGTTT CCCTCCCGAATCAAACTACTTATTTTTGGGAGATTATGTAGATCGTGGT AAACAAT CATT GGAAACCAT CT GCTTACTT CTCGCTTACAAAATTAAA TACCCAGAAAACTTTTTCCTACTCAGAGGCAACCACGAATGCGCATCAA TTAATCGTATATATGGATTCTATGATGAATGCAAAAGAAGGTATAACATC AAGTTGTGGAAAACTTTTACGGACTGTTTCAATTGCCTACCTGTAGCAG CCAT CGT CGAT GAAAAAATTTT CT GTT GCCATGGTGGTTTAAGT CCGGA CCTACAAT CAAT GGAACAAATT AG A SEQ ID N°:26 mostra um fragmento amplificado exemplar de RPA70 Reg2 usado como um molde para síntese de dsRNA: AT GGT C AAATTCTAGAGGGGAAGG AAAATTATTTAGTTTT GAT CT GGT GG ATGAAAGTGGCGAAATCCGTTGCACAGCTTTTAAAGAAATGGTTGATAAW TTCTAT GATTACCT GC AGGT GG ATAAAGTATATTAC AT C AAC AAAT GT CAA CTTAAACAAGCCAACAAACAGTACAGCACT CTAAAACAT GAGTAT GAAAT GACT GTTACGCAT GATACT GT CATTAAAGAAT GCCTT GATGCAGATT CTA

C AATAC C C ACC AC AC AGTATAACTTT GTTC CTATAG ATAAAATT GCT G ATA AAG AAGTAAATT CT GTT GTAG AT GTAATAGGTATT G CC AAAAGT GT C AGT GAATTACAAAC ATT CCAAGCAAGAT CAAC AGG AAG AGAATT GAAAAAGAA AG AAGTT GT CTT G GTT G AT C AGT C AC AAACAG CTATAT CGTTAAC ACTTT G GGGCCAAGAAGCCGAAAATTTTGATGGTACCAATAATCCTGTCGTAG A SEQ ID N°:27 mostra um fragmento amplificado exemplar de RPA70 Reg3 usado como um molde para síntese de dsRNA: T CCCGAATTAAAAGAAT GTTACAGGAT CAGAGGAT GGTACGACAGT GAG GGTGAAAATCTGAATGCAAAGAATATTAGTGCCAGAGTTGGATCCTCGAA TAT GT CT GCCACTT GGATGACCTTTAAGGAAGTTAAAGATCAAAAATTAG GATCATCTGAAAAAGGTGATTATTATAAAGCTATTGCTACTGTTCTTCTTG TCAAAGCCGATAATATTGTGTATAGAGCTTGTCCCACCGCTGAATGTAAT AAGAAAGTTGTTGATATGGAAAATAGTATGTACAGATGTGAAAAATGTAA TAGAGAATTTCCAAATTT CAAATACAGACT GTTAGCCAGCAT GAAT GTT G GAGACCACACAGGAAACCAATGGGTTAGCATGTTCAGTTCAGAAGCCGA AAAAATT CT GGGG AT GACTGCT G AGGAAGTAGG AC AG AC CTT GG AACAC AATAAAGAAGAAATAGCCAACAT CGTAGATAGAGCTCATTTTAAAGTATT TAGT CTTACTTGC AGGGCAAAAATT G AGACTTACAA T GAT GAAGCT CG

A SEQ ID N°:28 mostra um fragmento amplificado exemplar de RPS6 usado como um molde para síntese de dsRNA: TCAATATGAAGTTGAACGTATCGTACCCGGCCACGGGTTGCCAAAAAC TTTTCGAAGTTGTTGACGAACACAAAATTCGTATCTTTTACGAAAAACGC ATGGGT CAAGAAGTT GAGGCT GATGCT CTT GGT GACGAAT GGAAGGGC TACATCTTGAAAATATCTGGAGGTAACGACAAACAAGGATTCCCCATGA AACAAGGTGTTCTTACAAACGGTAGAGTAAGACTTTTACTTTCAAAAGGT CACTCCTGCTACAGACCCAGACGTACCGGTGAACGTAAAAGGAAATCA GTTCGTGGGTGCATTGTTGATGGGAACCTCAGCGTGTTGGCCCTAGTC ATTGTAAGAAAAGGAGAACAAGAAATTCCCGGACTTACTGACACCACCA TCCCACGT CGCCT GGGACCCAAGAGAGCAT A SEQ ID N°:29 mostra uma sequência de formação de RNA grampo de cabelo de PP1-87B contendo um íntron ST-LS1 (sublinhado): CCT CT GAAGATTT GCGGT GAT ATACAT GGTCAGTACTAT GACTT GCTT CGTCTCTTTGAATATGGAGGTTTCCCTCCCGAATCAAACTACTTATII I Γ GGGAGATTATGTAGATCGTGGTAAACAATCATTGGAAACCATCTGCTT

ACTTCTCGCTTACAAAATTAAATACCCAGAAAACTTTTTCCTACTCAGA

GGCAACCACGAAT GCGCAT CAATTAATCGTATATAT GGATTCT AT GAT

GAATGCAAAAGAAGGTATAACATCAAGTTGTGGAAAACTTTTACGGA

CT GTTT GACTAGTACCGGTT GGGAAAGGTAT GTTT CT GCTT CTACCTTT

GATATATATATAATAATTATCACTAATTAGTAGTAATATAGTATTTCAAGTA

I I I I I I rCAAAATAAAAGAATGTAGTATATAGCTATTGCTTTTCTGTAGT

TTATAAGTGTGTATATTTTAATTTATAACTTTTCTAATATATGACCAAAAC

ATGGTGATGTGCAGGTTGATCCGCGGTTAAAACAGTCCGTAAAAGTTTT

CCACAACTT GAT GTTATACCTT CTTTTGCATTCAT CATAGAATCCATATA

TACGATTAATTGATGCGCATTCGTGGTTGCCTCTGAGTAGGAAAAAG

TTTTCTGGGTATTTAATTTTGTAAGCGAGAAGTAAGCAGATGGTTTCC

AATGATTGTTTACCACGATCTACATAATCTCCCAAAAATAAGTAGTTT

GATTCGGGAGGGAAACCTCCATATTCAAAGAGACGAAGCAAGTCATA

GTACTGACCATGTATATCACCGCAAATCTTCAGAGG

A SEQ ID N°:30 mostra uma sequência de formação de RNA grampo de cabelo de RPA70 Reg2 contendo um íntron ST-LS1 (sublinhado): TACCT GC AGGT GGATAAAGTATATTACAT CAAC AAAT GT C AACTTAAACAA GCC AACAAAC AGTACAGCACT CTAAAACATG AGTAT GAAAT GACT GTTAC GCAT GATACTGT CATTAAAGAAT GCCTTGAT GCAGATT CTACAATACCCA CCACACAGTATAACTTTGTTCCTATAGATAAAATTGCTGATAAAGAAGTAA ATT CT GTT GTAG AT GTAATAGGTATT GC G AAAAGT GT CAGT GAATTACAAA CATTCCAAGCAAGATCAACAGGAAGAGAATTGAAAAAGGACTAGTACCG GTTGGGAAAGGTATGTTTCTGCTTCTACCTTTGATATATATATAATAATTAT CACTAATTAGTAGTAATATAGTATTTCAAGTAI I I I Ι ΤΊ CAAAATAAAAGAA TGTAGTATATAGCTATTGCTTTTCTGTAGTTTATAAGTGTGTATATTTTAAT TTATAACTTTT CTAATATAT G ACC AAAACAT GGT GAT GT GC AGGTT GAT CC GCGGTTACTI ITT CAATT CT CTTCCT GTT GAT CTT GCTT GGAAT GTTT GTA ATT CACT GACACTTTT GGCAATACCTATTACAT CTACAACAGAATTTACTT CTTTATCAGCAATTTTATCTATAGGAACAAAGTTATACTGTGTGGTGGGTA TT GTAGAAT CT GCATC AAG GC ATT CTTTAAT G AC AGTAT CAT GCGTAACA

GT CATTT C ATACT CAT GTTTTAGAGTGCT GTACT GTTT GTT GGCTT GTTTA AGTT G ACATTT GTT GAT GTAATATACTTTAT CCACCTGC AGGTA

A SEQ ID N°:31 mostra uma sequência de formação de RNA grampo de cabelo de RPS6 contendo um íntron ST-LS1 (sublinhado): AACGACAAACAAGGATTCCCCATGAAACAAGGTGTTCTTACAAACGG TAG AGTAAG ACTTTTACTTT C AAAAGGT C ACTCCT GCTAC AG ACC CAGA CGTACCGGTGAACGTAAAAGGAAATCAGTTCGTGGGTGCATTGTTGAT GGGAACCTCAGCGTGTTGGCCCTAGTCATTGTAAGAAAAGGAGAACAA GAAATTCCCGGACTTACTGACACCACCATCCCACGTCGCCTGGGACCC AAGAGAGCATCCAGAATCCGTAAGCTCTTCAACCTTAGCAAAGAAGA CGATGTACGTCAAGACTAGTACCGGTTGGGAAAGGTATGTTTCTGCTTC TACCTTTGATATATATATAATAATTATCACTAATTAGTAGTAATATAGTA TTTCAAGTAT I I Γ ΤΤ I CAAAATAAAAGAATGTAGTATATAGCTATTGCTTTT CTGTAGTTTATAAGTGTGTATATTTTAATTTATAACTTTTCTAATATATGA CC AAAACAT GGT GAT GT GC AGGTT GAT CCGCGGTTATT GACGTAC AT CG T CTTCTTT GCTAAGGTT GAAGAGCTTACGGATT CT GGATGCT CT CTTGG GTCCCAGGCGACGTGGGATGGTGGTGTCAGTAAGTCCGGGAATTTCTT GTTCTCCTTTTCTTACAATGACTAGGGCCAACACGCTGAGGTTCCCATC AACAATGCACCCACGAACTGATTTCCTTTTACGTTCACCGGTACGTCT GGGTCTGTAGCAGGAGTGACCTTTTGAAAGTAAAAGTCTTACTCTACCG TTT GTAAGAACACCTT GTTT C ATGGGGAAT CCTT GTTT GT CGTT A SEQ ID N°:32 mostra uma sequência de DNA da região 1 de anexina. A SEQ ID N°:33 mostra uma sequência de DNA da região 2 de anexina. A SEQ ID N°:34 mostra uma sequência de DNA da região 1 de beta espectrina 2. A SEQ ID N°:35 mostra uma sequência de DNA da região 2 de beta espectrina 2. A SEQ ID N°:36 mostra uma sequência de DNA da região 1 de mtRP-L4. A SEQ ID N°:37 mostra uma sequência de DNA da região 2 de mtRP-L4. A SEQ ID N°:38 mostra uma sequência de YFP.

As SEQ ID NoS:39-66 mostram sequências de iniciadores usados para amplificar regiões de gene de anexina, beta espectrina 2, mtRP-L4 e YFP para síntese de dsRNA. A SEQ ID N°:67 mostra uma sequência de proteína codificada por uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como proteína fosfatase 87B.

MAEADKLNIDSIIARLLEVRGARPGKNVQLTENEIRGLCLKSREIFLSQPI

LLELEAPLKICGDIHGQYYDLLRLFEYGGFPPESNYLFLGDYVDRGKQSLE

TICLLLAYKIKYPENFFLLRGNHECASINRIYGFYDECKRRYNIKLWKTFTD

CFNCLPVAAIVDEKIFCCHGGLSPDLQSMEQIRRIMRPTDVPDQGLLCDLL

WSDPDKDQMGWGENDRGVSFTFGAEWGKFLHKHDFDLICRAHQWED

GYEFFAKRQLVTLFSAPNYCGEFDNAGAMMSVDETLMCSFQILKPADKRK

FQYNMNAGRPVTPPRGATNKNKKK A SEQ ID N°:68 mostra uma sequência de proteína codificada por uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como RPA70: MRSPQTYNMSEGSLQTIMSGGEFPNPIMQVLGSKKINAGLGDKERIRILLS dgkytisfamltaqindrlgpngvetfsiiqidryvtsiinnsgkgearvll.il DMHVWPGTEVTEKVGSPIPLPTDADAAKGSTAAPATNNSIKNVTVAKPNIS

NGNGTTAMNASTNDDIATHMIHPISSLTPYQNRWTIKARITNKPPIRTWSN

SRGEGKLFSFDLVDESGEIRCTAFKEMVDKFYDYLQVDKVYYINKCQLKQA

NKQYSTLKHEYEMTVTHDTVIKECLDADSTIPTTQYNFVPIDKIADKEVNSW

DVIGIAKSVSELQTFQARSTGRELKKKEWLVDQSQTAISLTLWGQEAENFD

GTNNPVWIKSAKIGEFGGGKNLTTLVSSTVKINPELKECYRIRGWYDSEG

EN LN AKNISARVGSSN MSATWMTFKE VKDQ KLGSSEKG DYYKAIATVLLVK

ADNIVYRACPTAECNKKWDMENSMYRCEKCNREFPNFKYRLLASMNVGD

HTGNQWVSMFSSEAEKILGMTAEEVGQTLEHNKEEIANIVDRAHFKVFSLT

CRAKIETYNDEARLKTVCIRVDPINYEEYSALLTEKIQQLTGESHD A SEQ ID N°:69 mostra uma sequência de proteína codificada por uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como RPS6: MKLNVSYPATGCQKLFEWDEHKIRIFYEKRMGQEVEADALGDEWKGYILKI

SGGNDKQGFPMKQGVLTNGRVRLLLSKGHSCYRPRRTGERKRKSVRGCI

VDGNLSVLALVIVRKGEQEIPGLTDTTIPRRLGPKRASRIRKLFNLSKEDDVR

QYWKRPLAQKEGKKLRTKAPKIQRLITPWLQRKRHRLALKKKRCLKRKEQ

EDAYAKLLAQRKKESKARREMLKRRRSASMRDSKSSTQSGQK A SEQ ID N°:70 mostra uma sequência de DNA de milho codificando uma proteína tipo TIP41.

As SEQ ID NoS::71-74 mostram sequências de iniciadores usados para análises moleculares de níveis de transcrito em milho trans-gênico. A SEQ ID N°:75 mostra uma sequência de DNA de milho codificando uma proteína invertase. A SEQ ID N°:76 mostra uma sequência de DNA de Escheríchia coli codificando uma proteína SpnR. A SEQ ID N°:77 mostra uma sequência de DNA de íntron ST-L1 exemplar.

As SEQ ID NoS:78-89 mostram sequências de oligonucleotídeos usadas para análises moleculares de sonda de hidrólise de níveis de transcrito em milho transgênico.

As SEQ ID Ν°®:90-94 mostram sequências de oligonucleotídeos usadas para análises moleculares de sonda de hidrólise de grampo de cabelo de níveis de transcrito em milho transgênico. A SEQ ID N°:95 mostra uma sequência de aminoácido codificada por uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como proteína fosfatase ContigOOl 1_87B: MAEADKLNIDSIIARLLEVRGARPGKNVQLTENEIRGLCLKSREIFLSQPILLE

LEAPLKICGDIHGQYYDLLRLFEYGGFPPESNYLFLGDYVDRGKQSLETICL

LLAYKIKYPENFFLLRGNHECASINRIYGFYDECKRRYNIKLWKTFTDCFNC

LPVAAIVDEKIFCCHGGLSPDLQSMEQIRRINRDRLMYLTKXFFVTFXGLQTKT A SEQ ID N°:96 mostra uma sequência de aminoácido codificada por uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como RPA70 Regí: MIDLVQMVWKLFSIIQIDRYVTSIINNSGKGEARVLLILDMHVWPGTEVTEK

VGSPIPLPTDADXAKGSTAAPATNNSIKNVTVAKPNISNGNGTTAMNASTND

DIATHMIHPISSLTP A SEQ ID N°:97 mostra uma sequência de aminoácido codificada por uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como RPA70 Reg2: WSNSRGEGKLFSFDLVDESGEIRCTAFKEMVDXFYDYLQVDKVYYINKCQ LKQ AN KQ YSTLKH EYEMTVTH DTVIKEC LDADSTIPTTQ YN FVPIDKIADKEV NSWDVIGIAKSVSELQTFQARSTGRELKKKEWLVDQSQTAISLTLW GQEAENFDGTNNPVWIK A SEQ ID N°:98 mostra uma sequência de aminoácido codificada por uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como RPA70 Reg3: TLVSSXXKINPELKECYRIRGWYDSEGENLNAKNISARVGSSNMSATWMTF

KEVKDQKLGSSEKGDYYKAIATVLLVKADNIVYRACPTAECNKKWDMENS

MYRCEKCNREFPNFKYRLLASMNVGDHTGNQWVSMFSSEAEKILGMTAE

EVGQTLEHNKEEIANIVDRAHFKVFSLTCRAKIETYNDEARLKTVCIRVDPIN

YEEYSALLTEKIQQLTGESHD

As SEQ ID NoS:99 e 100 mostram segmentos exemplares de uma sequência de cDNA de PP1-87B de Diabrotica; AATTCAAGCTGCCGCAA (SEQ ID N°:99); e ΤΠΤ CT GTT GCCATGGT GGTTTAAGT CCGGACCTAC AAT CAAT GGAAC AAATTAGAAGRATTAATAGAGACCGACTGATGTACCTGACCAAGGSTTT CTTTGTGACCTTTTANGGTCTGATCCAGACAAAGACC (SEQ ID N°:100) A SEQ ID N°:101 mostra um segmento exemplar de uma sequência de cDNA de RPA70 Reglde Diabrotica: TGGAACTGAAGTTACAGAAAAAGTAGGCTCTCCCATTCCCCTACCAACT GATGCTGACKCAGCTAAAGGCTCTACTGCCGCTCCAGCTACAAACAA TT CCATTAAGAAT GTAACTGTT GCTAAACCAAACAT CAGTAATGGCAAT

G GC AC AACT GC AAT G AAT GC C AGTACTAAT G AT G ATATAG C C AC AC A TAT GATCC AT CCTATTT CAAGT CT C AC ACCTTA A SEQ ID N°:102 mostra um segmento exemplar de uma sequência de cDNA de RPA70 Reg3 de Diabrotica: AACTCTTGTTAGCAGCAMTRTAAAAATAAATCCCGAATTAAAAGAATGTT ACAGGAT C AGAGGAT GGTACGACAGT GAGGGT GAAAAT CT GAAT GCAA AGAATATTAGTGCCAGAGTTGGATCCTCGAATATGTCTGCCACTTGGAT GACCTTTAAGG AAGTTAAAGAT C AAAAATTAGG AT CAT CT G AAAAAGGT GATTATTATAAAGCTATTGCTACTGTTCTTCTTGTCAAAGCCGATAAT A SEQ ID N°:103 mostra uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplar codificando uma proteína Brahma: ACAGTTAAATATTGAAAATGGCCTGGTGTTTTGATAAAACGGAAGAGGC G AATTT CTAGTAGC ΑΊΓΤΤΤAAGGTTT C ATTT GCATTTAAAAC AAATT CAT GTATTATAAAATGTAGGATACGTTTCCTCGTATCCATCTACTTAATTTA GGATAACAATAAAGGGT GT GAGACAGTTAAATATT GAAAAT GGCCAGT GCTTCATTATTACCCAAAACTTTCACTTCTATTGGTGGCAAAGCCCTA CCTACCAACT CACAACAAAACATT CAGT CAAAATTTAAAGAGATTACAG TTCCACCAGGAAATACTCCTCAAGATGTTAAAGAAGGCCCCAGTCACC AAT CAAATCCAAACCATTTGGCTT CT CTT CAAAAGGCCATT GAAACTAT GGAAG AG AAGGGCTTACAAGCT GATCCTAGATATT C AC AGTTACTT GC A TTGCGAGCTAGCATTCCTGGGGCAGAAGAAAATGGTTCTCCCTTCTCAA ACAACCAAAT CAAGCAATTAAGAAACCAAATAAT GGCTTACAGGT GTTT GGCAAGAAAT CAACCT GTT CCAAAC AATTTAGTATTAGGTTT GCAT GGA AAAACTCCTGAAAAAGTTCCACATATTGTACCTCCACCGCAACCTCAA GAAGTACCT AATGGGGGCGATCCAGGACCTT CAACAAGTT CT GCT GCT GCTGTAGCTCCTAGAACACCACAAAAGCTGCCAGCAAAACCAATTGAGG CT CAGCTT GT CAACAGAGAACCAAGAGT CACTACTTTAT CTAAACC AT C TTCCATAGACCCTGTTGTTCTATTACAAGAACGAGAAAACAGGGTAGC AGCTCGTATAGCAGCGAGGATTGAACAAGTCAGTAATCTGCCGACTGA TAT GT CT G AGGC ATTACGTATT C GGGCACAAAT AGAACT C AG AGCTTT GAGAT GT CTAAACCTCCAGAGACAACTTCGTAGT GAGGTTTT GAGCT G TATTCGACGGGACACAACATTAGAAACAGCAGTAAATGTAAAAGCG

TTTAAACGGACCAAACGTCAAGGTCTTCGAGAAGCTAGAGCAACAG AAAAACTTGAGAAACAACAAAAGCTGGAAGCAGAGAGAAAGAAACGC CAGAAGAACC AAGAGTT CTTAAACAAT GT GATGGCACACGCTAAAGA TTT C AAAG AATTCC AC AG GC AG AACC AAGC AAAACTTT CTAAACTTAA T AAAGCTATT CTTACTTAT CACGCTAAT GCGGAGAGAGAACAAAAGAA GGAACAAGAGAGAAGAGAAAAGGAACGTAT GAAGAAATT GAT GGCAGA AG AT G AAG AAGGTTATAG AC AGTT G AT C G AT C AAAAG AAAG AC AAAC GT CTAG C GTT CTT GCTTT CGC AAAC AG AT G AGTATATAACTAAC CT C ACGG AGAT GGTAAAGCAACAC AAGTT GGAACAAACCAATAAAAAGAAAG AGGA GGAAAAACGCAAGAAGAAGCAGCAGAAAATGCAACAACCAGATAGGA AAGTTAC AGTT CTGG AAACT GC AACAGGTAAAAAAGTAACAGG AG AGGC T GCT CCTACACT GCGACAAGTT CAGGAAT GGTTAATCCAACAT CCT G GATGGGAGATGGTCGATACAGATGATGAGGATGATGAAAACGGGGA GAAGAGGGAT GAT GACTAT GAT GAAAAT CAAGAAGT GGAT GAT GCAAAA GAAGTTATTAAAAAAGCT AAAGTT GAAGAT GACGAATAT CACAAAAACA CAAAAGAAGAACAGACTTACTACAGTATT GCT CACACT GTTCATGAAGT G GTAACAGAACAAGCATCCATT CTGGTTAATGGAAAGCTTAAGGAATAT CA AATTAGAGGGTTAG AAT GGAT GGT GT CTTT GTACAATAAC AAT CT G AAT GGTATTCTAGCAGATGAGATGGGTCTAGGTAAAACCATTCAAACGATT GGCTT GTT GACCTATTT GAT GGAAAAAAAGAAGATAAAT GGACCGTTTTT GAT CATAGT GCCACTTT CAACCATTT CTAATT GGAT GTT GGAATTT C AAAAGTGGGCCCCTACTGTAGTTGTCATTTCATACAAAGGCTCTCCTGT GGTTAGAAAAGTGATCCAGAGCCAGTTAAAAGCTGCTAAATTCAATGT GCTTCTCACTACCTACGAGTACATTATTAAGGACAAGGGTGTATTAGC AAAAAT CCCATTTAAATATAT GAT C AT AGAT GAGGGT CAT CGTAT G AAAA ACCACCACTGCAAATTGACTCAAGTCCTGAATACGCACTATTTGGCGC CCTACAGACTCCTGCTTACTGGTACTCCCCTACAAAATAAATTACCAGA ATTATGGGCCTTGTTGAATTTCTTGTTGCCTTCGATTTTCAAGAGTTGCT CCACTTTTGAACAATGGTTCAATGCGCCATTCGCAACAACAGGAGAAAA GGTTGAGTTAAACGAAGAAGAAACTATCCTTATCATCCGTCGTCTTCAC AAAGT ACT CAGGCCGTTT CT CCT GAG ACGT CT CAAGAAAGAAGT CGAA T CT CAGCTT CC AG ACAAAGT GGAATATAT CATAAAGT GT GAC AT GTCGG

GCCTACAAAAGGTT CT CTATGCACACATGCAGAGCAAGGGT GT GTTA CTTACCGATGGTTCCGAGAAGGGCAGTAAAGGAAGGGGATCTAAGG CACT GAT GAACACCATTATGC AGCT GAGG AAACT GTGCAATCAT CCG TTTAT GTT CC AAAATAT CG AAG AG AAATATT GT G AT C AT GTT GGTATT G CTGGTGGAGTGGTTTCTGGACCCGACACTTATAGGGTATCTGGTAAG TTT GAGCT CTTGGACAGAATATT GCCC AAAAT GAAAGCAACTAACCATA GG ATTCTT CTTTT CT GT C AAAT GACT C AATTAAT G AC C AT C AT GG AAG A TTATCTAAATTGGAGAGGATTCAAATATCTTCGTCTTGATGGTACAATC AAATCAGAAGATCGCGGGGACCTATTATCGAAATTTAATGATAAAAAT AGT GAATATTTTTT GTTTTT GCTAT CTACACGGGCT GGAGGT CT GGGAC TTAATTT GC AG AC AG CT GATACT GT G ATTAT CTT CG ATT C C G ATT G G AA TC CT C AT C AGG ATTTAC AAG CTC AG GAT CG AG CT C AT CGTATT G GAC AG CAAAAT G AGGTCCGAGTTTTGCGTTT GAT GACTGTTAACT CT GTT GAGG AACGAATTTTAGCTGCAGCTAAATACAAGCTTACTATGGACGAAAAGGT C ATT C AAGCT GGTAT GTT CGAT C AG AAGT CTAC AGGCT CAG AGAGAC AT CAGTTTTT GCAGAGTATTTTACACCAT GACGGAAGCGACGAAGAAGA GGAAAACGAAGTT CCT GAT GACGAAACAGT GAACC AGAT GTTGGCCCG AAGGGAAAACGAATTTCAGCTTTTCCAGAAGATGGATCAGGAAAGAAA G G AAGAAG AT G AAAAG AC C GG AAAGT CGC G ACTTATT C AAG AAAG CG AATT GCCCGAATGGCT GTT G AAGCAAGACGAT GAAATCTACT CGT GGG GCCTTGATGATCCAGATGCTGTTTTAGGAAGGGGTAGTAGGCAAAGAAA AGAAGTT GATTAT GTT GACAGCCT GAC GG AG AAAG AGT GGCTTAAGGCT ATT GACGAAGAGGGAGAATTT GAGGAAGAACAAGAAGGT GATAAAG AA GGT CT CAGAAAGAAAAGAGGGAGGAAGAGGAAGAAGCGCGAT GAT GA C G AAG AGGC AAG C C AAATT AAG AG AAG AAAG GT G C AT CTAG C CG AG AT C AAG AT G AAGAAAAAG AT G AAG AG GCTTAT GG AAGTT GTT GT G AACTA CAGGGACAGGGATGGTAGAGTATTGAGCGAACCGTTTATGAAACTTCC AT C AAAG AAG G AGTT ACCT G AGTATTAC GATAC G ATTAAG AAACCTATT GATATT GAAAAAGT CGTT GC CAACGTAG AAG AAGG AAAATATTT C ACG A T GCACGATTT GGAAAGAG ATTT CGACTT GCT GTGCCAAAACGCCCAAC AAT ACAACGAAGAAG ACTCCAT GAT CTACGAGGACAGCCTCGTT CTT C GAC AG GT GTTTAG AAGCG C G AG G G AAAAGATCG AC G GT AC CT CAG AC

CACGACGACAACGCCGATGGACCGGCGGTGGCTCAGATCAAACGACC TCGTGGTAGACCTCGAAAACACAAGAGACCCGAAGAGATCGAGGCCG AAGCGGCGGCTCAGAAAGCTATGGAGGAGGCATCGAAGCTGAGAGCTC AAGCTGAGGCGGAAGAGCTTAGATCTAAGGTGGAGGAGGCATCTCAGA GAGCCAAAGAGGAAGCGAAAGCAAGGGAGGAAGCCAAAGCTAGGGAA GAAGCCGAAATCGAGAACAT GGAGG AGATT CCCACAAGCACAT GAT CTA TAGAGCAACCGGAAACAAAAAGGCAAAAAAGAAATATTATATAGAAAA GAT GTACAT GTT CAAT GGAGATACATTTTCGCCGAGTTACAACGGGTAA T GCTTTTACAACGGATATTTT GACGTATGAAT GTT GACGTTCAGAT GAAG TATATTTATAAAATAAT CC AGACCTTTACGTTTT GGTT G ATTT GTTTT CT G TATT GTT CAGTTTATT GAACAACCATTAATAGCAGCTTACCTAAAT GATT TAG AAAAGC AT CT G AGTTATTTAG ATAAGTTTT G AG ATTATATTTATTAA CTTTAATATTACTATCTTTATTATAGCATATTGTAATTATTTTTTCCTGTCC TTCTTTCGTTGTGTGGTAGATAATCCGAGAGTCAACAGTTATAAGCAAA T G AAATT C AGTTAAACCT CAAAT GTAC AAAAT GAT C AAATTAAT GTTTA CAATTTAITTTI I T ACCACGCACATT CACTATTACT ATT GT CAGTCATT GA GATAT CATTTTATATAGCT CCAT GT CT GTCTT CCT C AATTTACAGAGAAG C AATTAG AC AAGTAAT G AC ATAATAT G GTGCT GAAATAAT GT G CTT GATA GT GAT GTT C AC AAAGTAACTATT C GTTAC AAAGTACT C GTTACTTAC AAA TACCGAAACTAACGATTACTATACAGAGAGGCAAATCGTTACTTTGATTA CACT GATTACTTCGTAT CAATCGTAT CAGAGCGAGTAACGA A SEQ ID N°:104 mostra uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como F5XY5KV01 DBWKA_brahma_587-707 ou Brahma Regí: ATT CT G GTT AAT AG G AAAG CTT AAGG AATATT C AAATTAG AGG GTT AG AA TGGAT GGT GT CTTT GTAC AATAACAAT CT G AAT GGTATT CTAGC AG AT G A GATGGGTCTAGGTAAACCNTTCAAACGNTTGGCTTGTTGACCTATTTGA T GGAAAAAAAGAAGATAAAT GGACCGTTTTT GAT CATAGT GCCACTTT C AACCATT CTAATTGGATAGTT GG AATTT C AAAGTAGGGCCCTACTAGTA GTT GT CATTT CATACAAAGGCT CT CCT GT GGTTAGAAAAGTNATCCAGA GCCAGTT AAAAGCT GCTAAATT CAAT GT GCTT CT CACTACCTACGAGT AC ATTATTAAGGCAAGGT GATTAGCAAAAAAT CCCAGTTTAAATATAT GAT C

ATAGATN AGGT CATCATNAAACACACT GCAATT GAACT CAAGGCCT GAA TACGCA A SEQ ID N°:105 mostra uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns casos como Contig[0001]_brahma_949-1126 ou Brahma Reg2: AGT GTATTAG C AAAAAT C C C ATTTAAATATAT G AT C ATAG AT GAGG GTC A TCGTAT GAAAAACCACCACT GCAAATT GACT CAAGT CCT GAATACGCACT ATTTGGCGCCCTACAGACTCCTGCTTACTGGTACTCCCCTACAAAATAA ATTACCAGAATTAT GGGCCTT GTT GAATTT CTTGTT GCCTTCGATTTT CA AGAGTT GCT CCACTTTT G AACAAT GGTT CAATGCGCCATT CGC AACAAC AGGAGAAAAGGTT GAGTTAAACGAAGAAGAAACTATCCTTATCATCCGT C GT CTT C ACAAAGTACT CAGGCCGTTT CT CCT GAGACGT CT C AAG AAAGA AGT CGAATCT CAGCTTCCAGACAAAGT GGAATATAT CATAAAGT GT GACA TGTCGGGCCTACAAAAGGTTCTCTATGCACACATGCAGAGCAAGGGTG TGTTACTTACCGATGGTTCCGAGAAGGGCAGTAAAGGAAGGGG ATCTAAGGACAACTAGATGAACACCATTATGCAGCTGAGGAAACTGTGCT A SEQ ID N°:106 mostra uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333 ou Brahma Reg3: AGGGCT GGAGGT CT GGGACTTAATTT GCAGACAGCT GAT ACT GT GATT ATCTTCGATTCCGATTGGAATCCTCATCAGGATTTACAAGCTCAGGATC GAGCT CAT CGT ATTGGACAGCAAAAT GAGGT CCGAGTTTTGCGTTT GA T GACT GTTAACT CTGTT GAGGAACGAATTTTAGCTGCAGCTAAATAC AA GCTTACTATGGACGAAAAGGT CATTCAAGCTGGTAT GTTCGAT CAGAAG T CTACGGGAT CT GAAAGGCAGCAGTTT CTT CAGAGTATTTTACACAAT GAT GGTAGT GAT

A SEQ ID N°:107 mostra um segmento exemplar de sequência de cDNA de Brahma Reg3 de Diabrotica AGGGCTGGAGGTCT

A SEQ ID N°:108 mostra um fragmento amplificado exemplar de Brahma Reg2usado como um molde para síntese de dsRNA: ATGAGGGTCATCGTATGAAAAACCACCACTGCAAATTGACTCAAGTCCT

GAATACGCACTATTTGGCGCCCTACAGACTCCTGCTTACTGGTACTCC CCTACAAAATAAATTACCAGAATTAT GGGCCTT GTTGAATTT CTT GTT GC CTT CGATTTT CAAG AGTT GCTCCACTTTT GAAC AAT GGTT CAAT GC GCCA TTCGCAACAACAGGAGAAAAGGTT GAGTTAAACGAAGAAGAAACTAT CC TT AT CATCCGTCGTCTT CACAAAGTACT CAGGCCGTTTCTCCT GAGACG T CT C AAG AAAG AAGT C G AAT CT C AGCTT C C AG AC AAAGT G GAAT ATAT C ATAAAGTGTGACATGTCGGGCCTACAAAAGGTTCTCTATGCACACATG CAGAGCAAGGGTGTGTTACTTACCGATGGTTCCGAGAAGGGCAGTAAA GGAAGGGGATCTAAGGACA

A SEQ ID N°:109 mostra uma sequência de formação de RNA grampo de cabelo de Brahma Reg contendo um íntron ST-LS1 (sublinhado): GCGCCCTACAGACTCCTGCTTACTGGTACTCCCCTACAAAATAAATTAC C AG AATTAT G G GC CTT GTT G AATTT CTT GTT GC CTTC GATTTT CAAG AGT T GCTCCACTTTT GAACAAT GGTT CAAT GCGCC ATT CGC AACAACAGGAG AAAAG GTT G AGTTAAAC GAAGAAG AAACTAT C CTTAT C AT C CGTCGT CTT CACAAAGTACTCAGGCCGTTTCTCCTGAGACGTCTCAAGAAAGAAGTCG AAT CT C AGCTT CCAG AC AAAGT G GAATAT AT C ATAAAGT GT G AC AT GT G A CTAGTACCGGTTGGGAAAGGTATGTTTCTGCTTCTACCTTTGATATATAT ATAATAATTATCACTAATTAGTAGTAATATAGTATTTCAAGTATf TT I I I CA AAATAAAAGAATGTAGTATATAGCTATTGCTTTTCTGTAGTTTATAAGTGT GTATATTTTAATTTATAACTTTTCTAATATATGACCAAAACATGGTGATGT GCAGGTTGATCCGCGGACAT GT CACACTTTAT GATATATT CCACTTT GT C TGGAAGCT GAGATTCGACTT CTTT CTT GAGACGT CT CAGGAGAAACGGC CTG AGTACTTT GT GAAG AC GAC G G AT G ATAAG G ATAGTTT CTTCTTC GTT T AACT CAACCTTTT CT C CTGTT GTTGCGAAT GGCGC ATT GAACCATT GTT C AAAAGT G G AG CAACT CTT G AAAAT C G AAGGCAACAAGAAATT C AAC AA GGCCCATAATTCTGGTAATTTATTTTGTAGGGGAGTACCAGTAAGCAGG AGTCTGTAGGGCGC

A SEQ ID N°:110 mostra uma sequência de proteína codificada pela sequência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como Contig[0001]_brahma_949-1126 (Brahma Reg2): SVLAKIPFKYMIIDEGHRMKNHHCKLTQVLNTHYLAPYRLLLTGTPLQNK

LPELWALLNFLLPSIFKSCSTFEQWFNAPFATTGEKVELNEEETILIIRRLHK

VLRPFLLRRLKKEVESQLPDKVEYIIKCDMSGLQKVLYAHMQSKGVLLTDGS

EKGSKGRGSKDN

Descrição Detalhada I. Visão geral de várias modalidades São descritos aqui métodos e composições para controle genético de infestações por peste coleóptera. Métodos para identificação de um ou mais gene(s) essencial(ais) para o ciclo de vida de uma peste coleóptera para uso como um gene-alvo para controle mediado por RNAi de uma população de peste coleóptera são também providos. Vetores de plasmídeo de DNA codificando uma molécula de RNA podem ser projetados para suprimir um ou mais gene(s)-alvo(s) essencial(ais) para crescimento, sobrevivência, desenvolvimento e/ou reprodução. Em algumas modalidades, a molécula de RNA pode ser capaz de formar moléculas de dsRNA. Em algumas modalidades, são providos métodos para repressão pós-transcripcional de expressão ou inibição de um gene-alvo através de moléculas de ácido nucleico que são complementares a uma sequência de codificação ou não codificação do gene-alvo em uma peste coleóptera. Nessas e em modalidades adicionais, uma peste coleóptera pode ingerir uma ou mais moléculas de dsRNA, siR-NA, miRNA e/ou hpRNA transcritas de toda ou uma porção de uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência de codificação ou não codificação de um gene-alvo, desta maneira provendo um efeito protetor à planta.

Desta maneira, algumas modalidades envolvem inibição específica de sequência de expressão de produtos de gene-alvo usando dsRNA, siRNA, miRNA e/ou hpRNA que é complementar a sequências de codificação e/ou não codificação do(s) gene(s) alvo para obter controle pelo menos parcial de uma peste coleóptera. É aqui descrito um conjunto de moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendendo uma sequência de nucleotídeo, por exemplo, conforme mostrado em uma das SEQ ID NoS:1-7 e 103-106, e seus fragmentos. Em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA estabilizada pode ser expressa a partir dessas sequências, seus fragmentos e/ou um gene compreendendo uma dessas sequências, para o silenciamento ou inibição pós-transcripcional de um gene-alvo. Em certas modalidades, moléculas de ácido nucieico isoladas e purificadas compreendem toda ou parte de SEQ ID N°:3.

Algumas modalidades envolvem uma célula hospedeiro recom-binante (por exemplo, uma célula de planta) tendo em seu genoma pelo menos uma sequência de DNA recombinante codificando pelo menos uma molécula^) de iRNA (por exemplo, dsRNA). Em modalidades particulares, a(s) molécula(s) de dsRNA pode(m) ser produzida(s) quando ingerida(s) por uma peste coleóptera para pós-transcripcionalmente silenciar ou inibir a expressão de um gene-alvo na peste coleóptera. A sequência de DNA recombinante pode compreender, por exemplo, qualquer uma de SEQ ID N°*:1-7 e 103-106, fragmentos de qualquer uma das SEQ ID NoS:1-7 e 103-106 ou uma sequência parcial de um gene compreendendo uma de SEQ ID N05:1 -7 e 103-106 ou seus complementos.

Modalidades particulares envolvem uma célula hospedeiro recombinante tendo sem seu genoma uma sequência de DNA recombinante codificando pelo menos uma molécula(s) de iRNA (por exemplo, dsRNA) compreendendo toda ou parte de SEQ ID N°:3. Quando ingerida por uma peste coleóptera, a(s) molécula(s) de iRNA pode(m) silenciar ou inibir a expressão de um gene-alvo compreendendo SEQ ID N°:3 na peste coleóptera, e desta maneira resulta em parada de crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou alimentação na peste coleóptera.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeiro recombinante tendo em seu genoma pelo menos uma sequência de DNA recombinante codificando pelo menos uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA pode ser uma célula de planta transformada. Algumas modalidades envolvem plantas transgênicas compreendendo tal célula de planta transformada. Em adição a tais plantas transgênicas, plantas progênies de qualquer geração de planta transgênica, sementes transgênicas e produtos de planta transgênica são todos providos, cada um deles compreende sequência^) de DNA recombinante. Em modalidades particulares, uma molé- cuia de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA da invenção pode ser expressa em uma célula de planta transgênica. Desta maneira, nessas e outras modalidades, uma molécula de dsRNA da invenção pode ser isolada de uma célula de planta transgênica. Em modalidades particulares, a planta transgênica é uma planta selecionada do grupo consistindo em milho (Zea mays), soja (Glycine max) e plantas da família Poaceae.

Algumas modalidades envolvem um método para modulação da expressão de um gene-alvo em uma célula de peste coleóptera. Nessas e em outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser provida, onde a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico codificando uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA. Em modalidades particulares, uma sequência de nucleotídeo codificando uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA pode ser operavelmente ligada a um promotor, e pode também ser opera-velmente ligada a uma sequência de terminação de transcrição. Em modalidades particulares, um método para modulação da expressão de um gene-alvo em uma célula de peste coleóptera pode compreender: (a) transformação de uma célula de planta com um vetor compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA; (b) cultura da célula de planta transformada sob condições suficientes para permitir desenvolvimento de uma cultura de célula de planta compreendendo uma pluralidade de células de planta transformadas; (c) seleção de uma célula de planta transformada que integrou o vetor em seu ge-noma; e (d) determinação que a célula de planta transformada selecionada compreende a molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA codificada pela sequência de nucleotídeo do vetor. Uma planta pode ser regenerada a partir de uma célula de planta que tem o vetor integrado em seu genoma e compreende a molécula de dsRNA codificada pela sequência de nucleotídeo do vetor.

Desta maneira, é também descrita uma planta transgênica compreendendo um vetor tendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA integrada em seu genoma, onde a planta transgênica compreende a molécula de dsRNA codificada pela sequência de nucleotídeo do vetor. Em modalidades particulares, expressão de uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA em uma planta é suficiente para modular a expressão de um ge-ne-alvo em uma célula de uma peste coleóptera que contata a planta ou célula de planta transformada, por exemplo, através de alimentação na planta transformada, uma parte da planta (por exemplo, raiz) ou célula de planta. Plantas transgênicas descritas aqui podem exibir resistência e/ou tolerância aumentada a infestações por peste coleóptera. Plantas transgênicas particulares exibem resistência e/ou tolerância aumentada a uma ou mais pestes coleópteras selecionadas do grupo consistindo em: WCR; NCR; SCR; MCR; D. balteata LeConte; D. u. undecimpunctata Mennerheim. São também descritos aqui métodos para aplicação de agentes de controle, tal como uma molécula de iRNA, a uma peste coleóptera. Tais agentes de controle podem causar, diretamente ou indiretamente, um prejuízo na habilidade da peste coleóptera em se alimentar, crescer ou de outra maneira causar dano em um hospedeiro. Em algumas modalidades, é provido um método compreendendo aplicação de uma molécula de dsRNA estabilizada a uma peste coleóptera para suprimir pelo menos um gene-alvo na peste coleóptera, desta maneira reduzindo ou eliminando dano à planta em um hospedeiro de peste coleóptera. Em algumas modalidades, um método de inibição da expressão de um gene-alvo em uma peste coleóptera pode resultar na parada do crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou alimentação na peste coleóptera. Em algumas modalidades, o método pode eventualmente resultar em morte da peste coleóptera.

Em algumas modalidades, são providas composições (por exemplo, uma composição tópica) que compreendem uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA) da invenção para uso em plantas, animais e/ou no ambiente de uma planta ou animal para obter a eliminação ou redução da infestação de uma peste coleóptera. Em modalidades particulares, a composição pode ser uma composição nutricional ou fonte de alimento a ser alimentada à peste coleóptera. Algumas modalidades compreendem disponibilização da compo- sição nutricional ou fonte de alimento à peste coleóptera. Ingestão de uma composição compreendendo moléculas de iRNA pode resultar na absorção das moléculas por uma ou mais células da peste coleóptera, o que pode por sua vez resultar na inibição de expressão de pelo menos um gene-alvo em célula(s) da peste coleóptera. Ingestão de ou dano a uma planta ou célula de planta por uma peste coleóptera pode ser limitado ou eliminado em ou qualquer tecido hospedeiro ou ambiente onde a peste coleóptera está presente através da provisão de uma ou mais composições compreendendo uma molécula de iRNA da invenção no hospedeiro da peste coleóptera.

As composições e os métodos descritos aqui podem ser usados juntos em combinações com outros métodos e composições para controle de dano por pestes coleópteras. Por exemplo, uma molécula de iRNA conforme descrito aqui para proteção de plantas contra pestes coleópteras pode ser usada em um método compreendendo o uso adicional de um ou mais agentes químicos eficazes contra uma peste coleóptera, biopesticidas eficazes contra uma peste coleóptera, rotação de cultura ou técnicas genéticas recombinantes que exibem características diferentes das características dos métodos mediados por RNAi e composições de RNAi da invenção (por e-xemplo, produção recombinante de proteínas em plantas que são prejudiciais para uma peste coleóptera (por exemplo, toxinas Bt)). II Abreviações dsRNA ácido ribonucleico de filamento duplo Gl Inibição de crescimento NCBI National Center for Biotechnology Information gDNA DNA genômico iRNA ácido ribonucleico inibidor ORF estrutura de leitura aberta RNAi interferência de ácido ribonucleico miRNA ácido ribonucleico microinibidor siRNA ácido ribonucleico inibidor pequeno hpRNA ácido ribonucleico grampo de cabelo UTR região não traduzida WCR lagarta da raiz do milho do oeste (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) NCR lagarta da raiz do milho do norte (Diabrotica barberi Smith e Lawrence) MCR lagarta da raiz do milho do México (Diabrotica virgifera zeae Krysan e Smith) PCR Reação em cadeia da polimerase RISC Complexo de Silenciamento Induzido por RNA SCR lagarta da raiz do milho do sul (Diabrotica undecimpunctata howardi Barber) III. Termos No relatório e na tabela que seguem, vários termos são usados. A fim de prover uma compreensão clara e consistente do relatório e reivindicações, incluindo o escopo a ser dado a tais termos, as definições que seguem são providas: Peste coleóptera: conforme aqui usado, o termo "peste coleópte-ra" refere-se a insetos pestes da ordem Coleoptera, incluindo insetos pestes no gênero Diabrotica, que se alimentam de culturas agriculturais e produtos de cultura, incluindo milho e outras gramíneas verdadeiras. Em exemplos particulares, uma peste coleóptera é selecionada da lista compreendendo D. v. virgifera LeConte (WCR); D. barberi Smith e Lawrence (NCR); D. u. howardi (SCR); D. v. zeae (MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella; e D. u. undecimpunctata Mannerheim.

Contato (com um organismo): conforme aqui usado, o termo "contato com" ou "absorção por" um organismo (por exemplo, uma peste coleóptera), com relação a uma molécula de ácido nucleico, inclui internali-zação da molécula de ácido nucleico no organismo, por exemplo, e sem limitação: ingestão da molécula pelo organismo (por exemplo, através da alimentação); contato do organismo com uma composição compreendendo a molécula de ácido nucleico; e embebimento de organismos com uma solução compreendendo a molécula de ácido nucleico.

Contíguo: conforme aqui usado, o termo "contíguo" refere-se a uma sequência de DNA que é reconstruída a partir de um conjunto de segmentos de DNA sobrepostos derivados de uma fonte genética única.

Planta de Milho: conforme aqui usado, o termo "planta de milho" refere-se a uma planta da espécie Zea mays (milho).

Codificando um dsRNA: conforme aqui usado, a descrição "codificando um dsRNA" refere-se a um polinucleotídeo de DNA cujo produto de transcrição de RNA é capaz de formar uma estrutura de dsRNA intramo-lecular (por exemplo, um grampo de cabelo) ou estrutura de dsRNA inter-molecular (por exemplo, através de hibridização para uma molécula de RNA-alvo).

Expressão: conforme aqui usado, "expressão" de uma sequência de codificação (por exemplo, um gene ou um transgene) refere-se ao processo através do qual a informação codificada de uma unidade transcripcional de ácido nucleico (incluindo, por exemplo, DNA ou cDNA) é convertida para uma parte operacional, não operacional ou estrutural de uma célula, frequentemente incluindo a síntese de uma proteína. Expressão de gene pode ser influenciada por sinais externos; por exemplo, exposição de uma célula, tecido ou organismo a um agente que aumenta ou diminui expressão de gene. Expressão de um gene pode ser também regulada em qualquer ponto no curso de DNA para RNA para proteína. Regulagem de expressão de gene ocorre, por exemplo, através de controles que agem sobre transcrição, tradução, transporte e processamento de RNA, degradação de moléculas intermediárias tal como mRNA ou através da ativação, inativação, compartimentalização ou degradação de moléculas de proteína específicas após elas terem sido feitas ou através de suas combinações. Expressão de gene pode ser medida no nível de RNA ou nível de proteína através de qualquer método conhecido na técnica incluindo, sem limitação, northern blot, RT-PCR, western blot ou ensaio(s) de atividade de proteína in vitro, in situ ou in vivo.

Material genético: conforme aqui usado, o termo "material genético" inclui todos os genes, e moléculas de ácido nucleico, tais como DNA e RNA.

Inibição: conforme aqui usado, o termo "inibição", quando usado para descrever um efeito sobre uma sequência de codificação (por exemplo, um gene), refere-se a uma diminuição mensurável no nível celular de mRNA transcrito a partir da sequência de codificação e/ou peptídeo, polipeptídeo ou produto de proteína da sequência de codificação. Em alguns exemplos, expressão de uma sequência de codificação pode ser inibida de maneira que expressão é aproximadamente eliminada. "Inibição específica" refere-se à inibição de uma sequência de codificação-alvo sem consequentemente afetar a expressão de outras sequências de codificação (por exemplo, genes) na célula onde a inibição específica está sendo realizada.

Isolado: um componente biológico "isolado" (tal como um ácido nucleico ou proteína) foi substancialmente separado, produzido separado ou purificado de outros componentes biológicos na célula do organismo onde o componente ocorre naturalmente (isto é, outros DNA e RNA cromossomais ou extracromossomais e proteínas), enquanto realizando uma mudança química ou funcional no componente (por exemplo, um ácido nucleico pode ser isolado de um cromossomo através da quebra de ligações químicas que conectam o ácido nucleico ao DNA restante no cromossomo). Moléculas de ácido nucleico e proteínas que foram "isoladas" incluem moléculas de ácido nucleico e proteínas purificadas através de métodos de purificação padrão. O termo também compreende ácidos nucleicos e proteínas preparados através da expressão recombinante em uma célula hospedeiro, bem como moléculas de ácido nucleico, proteínas e peptídeos quimicamente sintetizados.

Molécula de ácido nucleico: conforme aqui usado, o termo "molécula de ácido nucleico" pode referir-se a uma forma polimérica de nucleotí-deos, que pode incluir ambos os filamentos de sentido e antissentido de RNA, cDNA, DNA genômico e formas sintéticas e polímeros mistos dos acima. Um nucleotídeo ou nucleobase pode se referir a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Uma "molécula de ácido nucleico" conforme aqui usado é sinônimo de "ácido nucleico" e "polinucleotídeo". Uma molécula de ácido nucleico é geralmente de pelo menos 10 bases de comprimento, a menos que de outra maneira especificado. Por questão de convenção, a sequência de nucleotí- deo de uma molécula de ácido nucleico é lida da extremidade 5' para a 3' da molécula. O "complemento" de uma sequência de nucleotídeo refere-se à sequência de nucleobases que pode formar pares de base com as nucleo-bases da sequência de nucleotídeo (isto é, A-T/U e G-C).

Algumas modalidades incluem ácidos nucleicos compreendendo um DNA molde que é transcrito em uma molécula de RNA que é o complemento de uma molécula de mRNA. Nessas modalidades, o complemento da sequência de nucleotídeo transcrita na molécula de mRNA está presente na orientação 5' a 3’, de maneira que a polimerase de RNA (que transcreve DNA na direção 5' para 3') vai transcrever um ácido nucleico do complemento que pode hibridizar para a molécula de mRNA. A menos que explicitamente declarado de outra maneira, ou está claro ser de outra maneira a partir do contexto, o termo "complemento" desta maneira refere-se à sequência, de 5' para 3’, de nucleobases que pode formar pares de base com as nucleobases de uma sequência de nucleotídeo particular. Similarmente, a menos que seja explicitamente declarado de outra maneira (ou for claro ser de outra maneira a partir do contexto), o "complemento reverso" de uma sequência de ácido nucleico refere-se à sequência do complemento em orientação reversa. O acima é demonstrado na ilustração que segue: ATGATGATG sequência de nucleotídeo TACTACTAC "complemento" da sequência de nucleotídeo CATCATGAT "complemento reverso" da sequência de nucleotídeo.

Algumas modalidades da invenção podem incluir moléculas de RNAi de formação de RNA grampo de cabelo. Nessas moléculas de RNAi, ambos o complemento de uma sequência de nucleotídeo a ser direcionada por interferência de RNA e o complemento reverso da sequência podem ser encontrados na mesma molécula, de maneira que a molécula de RNA de filamento simples pode "dobrar" e hibridizar para si mesma na região compreendendo as sequências complementares e complementares reversas. "Moléculas de ácido nucleico" incluem formas de filamento simples e duplo de DNA; formas de filamento simples de RNA; e formas de filamento duplo de RNA (dsRNA). O termo "sequência de nucleotídeo" ou "se- quência de ácido nucleico" refere-se a ambos os filamentos de sentido e an-tissentido de um ácido nucleico ou como filamentos simples individuais ou no duplex. O termo "ácido ribonucleico" (RNA) inclui iRNA (RNA inibidor), dsR-NA (RNA de filamento duplo), siRNA (RNA de interferência pequeno), mRNA (mRNA mensageiro), miRNA (micro-RNA), hpRNA (RNA grampo de cabelo), tRNA (RNAs de transferência, sejam carregados ou descarregados com um aminoácido acilado correspondente) e cRNA (RNA complementar). O termo "ácido desoxirribonucleico" (DNA) inclui cDNA, DNA genômico e híbridos de DNA-RNA. Os termos "segmento de ácido nucleico" e "segmento de sequência de nucleotídeo", ou mais em geral "segmento", serão compreendidos por aqueles versados na técnica como um termo funcional que inclui ambas as sequências genômicas, sequências de RNA ribossomal, sequências de RNA de transferência, sequências de RNA mensageiro, sequências de operon e sequências de nucleotídeo engenheiradas menores que codificam ou podem ser adaptadas para codificar peptídeos, polipeptídeos ou proteínas.

Oliaonucleotídeo: um oligonucleotídeo é um polímero de ácido nucleico curto. Oligonucleotídeos podem ser formados através de divagem de segmentos de ácido nucleico mais longos ou através da polimerização de precursores de nucleotídeo individuais. Sintetizadores automáticos permitem a síntese de oligonucleotídeos até várias centenas de base de comprimento. Devido ao fato que os oligonucleotídeos podem se ligar a uma sequência de nucleotídeo complementar, eles podem ser usados como sondas para detecção de DNA ou RNA. Oligonucleotídeos compostos de DNA (oligodesso-xirribonucleotídeos) podem ser usados em PCR, uma técnica para a amplificação de sequências de DNA. Em PCR, o oligonucleotídeo é tipicamente referido como um "iniciador", que permite que uma polimerase de DNA estenda o oligonucleotídeo e replique o filamento complementar.

Uma molécula de ácido nucleico pode incluir um ou ambos os nucleotídeos de ocorrência natural e modificados ligados juntos por ligações de nucleotídeo de ocorrência natural e/ou não natural. Moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas quimicamente ou bioquimicamente ou po- dem conter bases de nucleotídeo não naturais ou derivatizadas, como será prontamente compreendido por aqueles versados na técnica. Tais modificações incluem, por exemplo, marcadores, metilação, substituição de um ou mais nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações in-ternucleotídeo (por exemplo, ligações não carregadas: por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos etc; ligações carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos etc; porções pendentes: por exemplo, peptídeos; intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno etc; quelantes; alquiladores; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nuclei-cos alfa anoméricos etc). O termo "molécula de ácido nucleico" inclui qualquer conformação topológica, incluindo conformações de filamento simples, filamento duplo, parcialmente duplexadas, triplexadas, grampo de cabelo, circular e trancado.

Conforme aqui usado com relação a DNA, o termo "sequência de codificação", "sequência de nucleotídeo estrutural" ou "molécula de ácido nucleico estrutural" refere-se a uma sequência de nucleotídeo que é por fim traduzida em um polipeptídeo, através de transcrição e mRNA, quando posta sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. Com relação a RNA, o termo "sequência de codificação" refere-se a uma sequência de nucleotídeo que é traduzida em um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Os limites de uma sequência de codificação são determinados por um códon de início de tradução no terminal 5' e um códon de parada de tradução no terminal 3'. Sequências de codificação incluem, mas não estão limitadas a: DNA genô-mico; cDNA; EST; e sequências de nucleotídeo recombinantes.

Conforme aqui usado, "sequência de não codificação transcrita" refere-se a segmentos de moléculas de mRNA tais como 5'UTR, 3'UTR e segmentos de íntron que não são traduzidos em um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Ainda, "sequência de não codificação transcrita" refere-se a uma sequência de nucleotídeo que é transcrita em um RNA que funciona na célula, por exemplo, RNAs estruturais (por exemplo, RNA ribossomal (rRNA) conforme exemplificado por rRNA 5S, rRNA 5.8S, rRNA 16S, rRNA 18S, rRNA 23S e rRNA 28S e similar); RNA de transferência (tRNA); e snRNAs tais como U4, U5 e U6 e similar. Sequências de não codificação transcritas também incluem, por exemplo e sem limitação, RNAs pequenos (sRNA), termo que é frequentemente usado para descrever RNAs de não codificação bacterianos pequenos; RNAs nucleolares pequenos (snoRNA); microRNAs; RNAs de interferência pequenos (siRNA); RNAs de interação Piwi (piRNA); e RNAs de não codificação longos. Ainda, "sequência de não codificação transcrita" refere-se a uma sequência de nucleotídeo que pode existir nativamente como uma sequência "espaçadora" intragênica em um organismo e que é transcrita em uma molécula de RNA.

Genoma: conforme aqui usado, o termo "genoma" refere-se a DNA cromossomal encontrado dentro do núcleo de uma célula, e refere-se também a DNA de organela encontrado dentro de componentes subcelula-res da célula. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser induzida em uma célula de planta de maneira que a molécula de DNA seja integrada ao genoma da célula de planta. Nessas e em modalidades adicionais, a molécula de DNA pode ser ou integrada ao DNA nuclear da célula de planta ou integrada ao DNA do cloroplasto ou mitocôndria da célula de planta. O termo "genoma" como ele se aplica a bactérias refere-se a ambos o cromossomo e os plasmídeos dentro da célula bacteriana. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma bactéria de maneira que a molécula de DNA é integrada ao genoma da bactéria. Nessas e em modalidades adicionais, a molécula de DNA pode ser ou cromossomicamente integrada ou localizada como ou em um plasmí-deo estável.

Identidade de sequência: o termo "identidade de sequência" ou "identidade", conforme aqui usado no contexto de duas sequências de ácido nucleico ou polipeptídeo, refere-se aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhados para correspondência máxima em uma janela de comparação especificada.

Conforme aqui usado, o termo "porcentagem de identidade de sequência" pode se referir ao valor determinado através da comparação de duas sequências otimamente alinhadas (por exemplo, sequências de ácido nucleico ou sequências de polipeptídeo) em uma janela de comparação, onde a porção da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) comparada com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas sequências. A porcentagem é calculada através da determinação do número de posições onde o resíduo de nucleotídeo ou aminoácido idêntico ocorre em ambas as sequências para dar o número de posições compatíveis, dividindo o número de posições compatíveis pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para dar a porcentagem de identidade de sequência. Uma sequência que é idêntica em toda posição em comparação com uma sequência de referência é dita ser 100% idêntica à sequência de referência e vice-versa. Métodos para alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos, por exemplo, em: Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:2444; Higgins e Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins e Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al (1988) Nu-cleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Uma consideração detalhada de métodos de alinhamento de sequência e cálculos de homologia pode ser encontrada em, por exemplo, Altschul ef a/(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.

Uma Basic Local Alignment Search Tool (BLAST®; Altschul et al (1990)) do National Center for Biotechnology Information (NCBI) está disponível de várias fontes, incluindo o National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD), e na internet, para uso em conexão com vários programas de análise de sequência. Uma descrição de como determinar identidade de sequência usando este programa está disponível na internet na seção "help" para BLAST®. Para comparação de sequências de ácido nucleico, a função "BLAST 2 sequences" do programa BLAST® (Blastn) pode ser empregada usando o ajuste de matriz BLOSUM62 padrão para parâmetros de padrão. Sequências de ácido nucleico com similaridade ainda maior com as sequências de referência vão mostrar identidade de porcentagem alta quando avaliadas através deste método.

Especificamente hibridizável/Especificamente complementar: conforme aqui usado, os termos "Especificamente hibridizável" e "Especificamente complementar" são termos que indicam um grau de complementaridade suficiente de maneira que ligação estável e específica ocorre entre a molécula de ácido nucleico e uma molécula de ácido nucleico-alvo. Hibridi-zação entre duas moléculas de ácido nucleico envolve a formação de um alinhamento antiparalelo entre as sequências de ácido nucleico das duas moléculas de ácido nucleico. As duas moléculas são então capazes de formar ligações de hidrogênio com bases correspondentes no filamento oposto para formar uma molécula duplex que, se for suficientemente estável, é de-tectável usando métodos bem conhecidos na técnica. Uma molécula de ácido nucleico não precisa ser 100% complementar à sua sequência-alvo para ser especificamente hibridizável. No entanto, a quantidade de complementaridade de sequência que deve existir para hibridização ser específica é uma função das condições de hibridização usadas.

Condições de hibridização resultando em graus particulares de adstringência vão variar dependendo da natureza do método de hibridização de escolha e da composição e comprimento das sequências de ácido nuclei-co de hibridização. Em geral, a temperatura de hibridização e a resistência iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou Mg++) do tampão de hibridização vão determinar a adstringência de hibridização, embora tempos de lavagem também influenciem a adstringência. Cálculos com relação a condições de hibridização requeridas para obter graus particulares de adstringência são conhecidos daqueles de habilidade comum na técnica e são discutidos, por exemplo, em Sambrook et al (ed.) Molecular Clonina: A Laboratorv Manual. 2a ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, capítulos 9 e 11; e Hames e Higgins (eds.) Nucleic Acid Hvbridization, IRL Press, Oxford, 1985. Instrução e orientação detalhadas adicionais com relação à hibridização de ácidos nucleicos podem ser encon- tradas, por exemplo, em Tijssen, "OverView of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", em Laboratorv Techniques in Biochemistrv and Molecular Bioloav- Hybridization with Nucleic Acid Probes. Parte I, Capítulo 2, Elsevier, NY, 1993; e Ausubel et al, Eds., Current Protocols in Molecular Bioloav. Capítulo 2, Greene Publishing e Wiley-Interscience, NY, 1995.

Conforme aqui usado, "condições adstringentes" compreende condições sob as quais hibridização vai ocorrer apenas se houver menos do que 20% de incompatibilidade entre a molécula de hibridização e uma sequência homóloga dentro da molécula de ácido nucleico-alvo. "Condições adstringentes" incluem níveis particulares adicionais de adstringência. Desta maneira, conforme aqui usado, condições de "adstringência moderada" são aquelas sob as quais moléculas com mais de 20% de incompatibilidade de sequência não vão hibridizar; condições de "alta adstringência" são aquelas sob as quais sequências com mais de 10% de incompatibilidade não vão hibridizar; e condições de "adstringência muito alta" são aquelas sob as quais sequências com mais de 5% de incompatibilidade não vão hibridizar. O que segue são condições representativas de hibridização, não iimitantes.

Condição de adstringência alta (detecta sequências que compartilham pelo menos 90% de identidade de sequência): Hibridização em tampão SSC 5x a 65°C por 16 horas; lavar duas vezes em tampão SSC 2x em temperatura ambiente por 15 minutos cada; e lavar duas vezes em tampão SSC 0,5x a 65°C por 20 minutos cada.

Condição de adstringência moderada (detecta sequências que compartilham pelo menos 80% de identidade de sequência): hibridização em tampão SSC 5x-6x a 65-70% por 16-20 horas; lavar duas vezes em tampão SSC 2x em temperatura ambiente por 5-20 minutos; e lavar duas vezes em tampão SSC 1x a 55-70°C por 30 minutos cada.

Condição de controle não adstringente (sequências que compartilham pelo menos 50% de identidade de sequência vão hibridizar): hibridização em tampão SSC 6x em temperatura ambiente até 55°C por 16-20 horas; lavar pelo menos duas vezes em tampão SSC 2x-3x em temperatura ambiente até 55°C por 20-30 minutos cada.

Conforme aqui usado, o termo "substancialmente homólogo" ou "homologia substancial", com relação a uma sequência de ácido nucleico contígua, refere-se a sequências de nucleotídeo contíguas compreendidas dentro das moléculas de ácido nucleico que hibridizam sob condições adstringentes para uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácido nucleico de referência. Por exemplo, moléculas de ácido nucleico compreendendo sequências que são substancialmente homólogas a uma sequência de ácido nucleico de referência de qualquer uma das SEQ ID Ν°*:1-7 e 103-106 são aquelas moléculas de ácido nucleico que hibridizam sob condições adstringentes (por exemplo, as condições de Adstringência Moderada mostradas, supra) para uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico de referência de qualquer uma das SEQ ID Ν°*:1-7 e 103-106. Sequências substancialmente homólogas podem ter pelo menos 80% de i-dentidade de sequência. Por exemplo, sequências substancialmente homólogas podem ter de a partir de cerca de 80% a 100% de identidade de sequência, tal como cerca de 81%; cerca de 82%; cerca de 83%; cerca de 84%; cerca de 85%; cerca de 86%; cerca de 87%; cerca de 88%; cerca de 89%; cerca de 90%; cerca de 91%; cerca de 92%; cerca de 93%; cerca de 94% cerca de 95%; cerca de 96%; cerca de 97%; cerca de 98%; cerca de 98,5%; cerca de 99%; cerca de 99,5%; e cerca de 100%. A propriedade de homologia substancial está intimamente relacionada com hibridização específica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico é especificamente hibridizável quando há um grau suficiente de complementaridade para evitar ligação não específica do ácido nucleico a sequências não alvo sob condições onde ligação específica é desejada, por exemplo, sob condições de hibridização adstringente.

Conforme aqui usado, o termo "ortólogo" refere-se a um gene em duas ou mais espécies que se desenvolveu a partir de uma sequência de nucleotídeo ancestral comum, e pode reter a mesma função nas duas ou mais espécies.

Conforme aqui usado, duas moléculas de sequência de ácido nucleico são ditas exibir "complementaridade completa" quando cada nucle-otídeo de uma sequência lida na direção 5' a 3' é complementar a cada nu-cleotídeo da outra sequência quando lida na direção 3' para 5'. Uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência de nucleotí-deo de referência vai exibir uma sequência idêntica à sequência de complemento reverso da sequência de nucleotídeo de referência. Esses termos e descrições são bem definidos na técnica e são facilmente compreendidos por aqueles de habilidade comum na técnica.

Operavelmente ligado: uma primeira sequência de nucleotídeo é operavelmente ligada com uma segunda sequência de ácido nucleico quando a primeira sequência de ácido nucleico está em uma relação funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. Quando recombinantemente produzidas, sequências de ácido nucleico operavelmente ligadas são geralmente contíguas e, onde necessário unir duas regiões de codificação de proteína, na mesma estrutura de leitura (por exemplo, em uma ORF traducio-nalmente fundida). No entanto, os ácidos nucleicos não precisam ser contíguos para serem operavelmente ligados. O termo "operavelmente ligado", quando usado com referência a uma sequência reguladora e uma sequência de codificação, significa que a sequência reguladora afeta a expressão da sequência de codificação ligada. "Sequências reguladoras" ou "elementos de controle" referem-se a sequências de nucleotídeo que influenciam o momento e/ou nível/quantidade de transcrição, processamento ou estabilidade de RNA ou tradução da sequência de codificação associada. Sequências reguladoras podem incluir promotores; sequências líderes de tradução; íntrons; aumentadores; estruturas de haste-alça; sequências de ligação de repressor; sequências de terminação; sequências de reconhecimento de poliadenilação etc. Sequências reguladoras particulares podem estar localizadas a montante e/ou a jusante de uma sequência de codificação operavelmente ligada a elas. Também, sequências reguladoras particulares operavelmente ligadas a uma sequência de codificação podem estar localizadas no filamento complementar associado de uma molécula de ácido nucleico de filamento duplo.

Promotor: conforme aqui usado, o termo "promotor" refere-se a uma região de DNA que pode estar a montante do início de transcrição e que pode estar envolvida em reconhecimento e ligação de polimerase de RNA e outras proteínas para iniciar transcrição. Um promotor pode ser ope-ravelmente ligado a uma sequência de codificação para expressão em uma célula ou um promotor pode ser operavelmente ligado a uma sequência de nucleotídeo codificando uma sequência de sinal que pode ser operavelmente ligada a uma sequência de codificação para expressão em uma célula. Um "promotor de planta" pode ser um promotor capaz de iniciar transcrição em células de planta. Exemplos de promotores sob controle desenvolvimen-tal incluem promotores que preferivelmente iniciam transcrição em certos tecidos, tais como folhas, raízes, sementes, fibras, vasos do xilema, traqueí-dos ou esclerênquima. Tais promotores são referidos como "preferidos de tecido". Promotores que iniciam transcrição apenas em certos tecidos são referidos como "específicos de tecido". Um promotor "específico de tipo de célula" direciona principalmente expressão em certos tipos de célula em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Um promotor "induzível" pode ser um promotor que pode estar sob controle ambiental. Exemplos de condições ambientais que podem iniciar transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas e a presença de luz. Promotores específicos de tecido, preferidos de tecido, específicos de tipo de célula e induzíveis constituem a classe de promotores "não constitutivos". Um promotor "constitutivo" é um promotor que pode ser ativo sob a maioria das condições ambientais ou na maioria dos tipos de tecido ou célula.

Qualquer promotor induzível pode ser usado em algumas modalidades da invenção. Vide Ward et al (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366. Com um promotor induzível, a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente de indução. Promotores induzíveis exemplares incluem, mas não estão limitados a: Promotores do sistema ACEI que respondem a cobre; gene In2 de milho que responde a protetores de herbicida benzenossulfonami-da; repressor Tet de Tn10; e o promotor induzível de um gene de hormônio esteroide, cuja atividade transcripcional pode ser induzida por um hormônio glucocorticosteroide (Schena et aI (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:0421).

Promotores constitutivos exemplares incluem, mas não estão limitados a: promotores de vírus de planta, tal como o promotor 35S do Vírus do Mosaico da Couve-flor (CaMV); promotores dos genes da actina do arroz; promotores da ubiquitina; pEMU; MAS; promotor da histona H3 do milho; e o promotor ALS, fragmento Xbal/Ncol 5' para o gene estrutural ALS3 de Bras-sica napus (ou uma sequência de nucleotídeo similar ao dito fragmento Xbal/Ncol) (Publicação PCT Internacional N°. W096/30530).

Adicionalmente, qualquer promotor específico de tecido ou preferido de tecido pode ser utilizado em algumas modalidades da invenção. Plantas transformadas com uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de codificação operavelmente ligada a um promotor específico de tecido podem produzir o produto da sequência de codificação exclusivamente, ou preferivelmente, em um tecido específico. Promotores específicos de tecido ou preferidos de tecido exemplares incluem, mas não estão limitados a: Um promotor preferido de semente, tal como aquele do gene da faseolina; um promotor específico de folha e induzido por luz tal como aquele de cab ou rubisco; um promotor específico de antera tal como aquele de LAT52; um promotor específico de pólen tal como aquele de Zm13\ e um promotor preferido de microesporo tal como aquele de apg.

Transformacão: conforme aqui usado, o termo "transformação" ou "transdução" refere-se à transferência de uma ou mais molécula(s) de ácido nucleico para uma célula. Uma célula é "transformada" por uma molécula de ácido nucleico transduzida para a célula quando a molécula de ácido nucleico se torna estavelmente replicada pela célula, ou através da incorporação da molécula de ácido nucleico no genoma celular ou através de repli-cação epissomal. Conforme aqui usado, o termo "transformação" compreende todas as técnicas através das quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida em tal célula. Exemplos incluem, mas não estão limitados a: transfecção com vetores virais; transformação com vetores de plasmídeo; eletroporação (Fromm et I (1986) Nature 319:791-3); lipofecção (Felgner et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7413-7); microinjeção (Mueller et al (1978) Cell 15:579-85); transferência mediada por Agrobacterium (Fraley et al (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803-7); absorção de DNA direta; e bombardeamento com microprojétil (Klein et a/(1987) Nature 327:70).

Transqene: uma sequência de ácido nucleico exógena. Em alguns exemplos, um transgene pode ser uma sequência que codifica um ou ambos os filamentos de um RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA que compreende uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma molécula de ácido nucleico encontrada em uma peste coleóptera. Em exemplos adicionais, um transgene pode ser uma sequência de ácido nucleico de antissentido, onde expressão da sequência de ácido nucleico de antissentido inibe expressão de uma sequência de ácido nucleico-alvo. Ainda em exemplos adicionais, um transgene pode ser uma sequência de gene (por exemplo, um gene de resistência a herbicida), um gene codificando um composto industrialmente ou farmaceuticamente útil ou um gene codificando uma característica agricultural desejável. Nesses e em outros exemplos, um transgene pode conter sequências reguladoras operavelmente ligadas a uma sequência de codificação do transgene (por exemplo, um promotor).

Vetor: uma molécula de ácido nucleico conforme introduzida em uma célula, por exemplo, para produzir uma célula transformada. Um vetor pode incluir sequências de ácido nucleico que permitem que ele replique na célula hospedeiro, tal como uma origem de replicação. Exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a: um plasmídeo; um cosmídeo; bacteriófa-go; ou vírus que carrega DNA exógeno para uma célula. Um vetor pode também incluir um ou mais genes, incluindo aqueles que produzem moléculas de antissentido, e/ou genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Um vetor pode transduzir, transformar ou infectar uma célula, desta maneira fazendo com que a célula expresse as moléculas de ácido nucleico e/ou proteínas codificadas pelo vetor. Um vetor inclui opcionalmente materiais para auxiliar na obtenção da entrada da molécula de ácido nucleico na célula (por exemplo, um lipossoma, revestimento de proteína etc).

Rendimento: um rendimento estabilizado de cerca de 100% ou mais com relação ao rendimento de variedades de checagem no mesmo local de crescimento crescendo ao mesmo tempo e sob as mesmas condições. Em modalidades particulares, "rendimento aperfeiçoado" significa uma cultivar tendo um rendimento estabilizado de 105% ou mais com relação ao rendimento de variedades de checagem no mesmo local de crescimento contendo densidades significantes de pestes coleópteras que são prejudiciais para esta cultura crescendo ao mesmo tempo e sob as mesmas condições. A menos que especificamente indicado ou implicado, os termos "um", "uma" e "o", "a" significam "pelo menos um" conforme aqui usado. A menos que de outra maneira especificamente explicado, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que geralmente compreendido por aqueles de habilidade comum na técnica à qual a presente invenção pertence. Definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em, por exemplo, Lewin's Genes X. Jones & Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs et a/(eds.), The Encvclopedia of Molecular Bioloav. Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Meyers R.A. (ed.), Molecular Bioloav e Biotechnoloqv: A Comprehensive Desk Reference. VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Todas as porcentagens são em peso e todas as proporções de mistura de solvente são em volume a menos que de outra maneira registrado. Todas as temperaturas estão em graus Celsius. IV. Moléculas de Ácido Nucleico Compreendendo uma Sequência de Peste Coleóptera A. Visão geral São descritas aqui moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pestes coleópteras. Moléculas de ácido nucleico descritas incluem sequências-alvo (por exemplo, genes nativos e sequências de não codificação), dsRNAs, siRNAs, hpRNAs e miRNAs. Por exemplo, moléculas de dsRNA, siRNA, miRNA e/ou hpRNA são descritas em algumas modalidades que podem ser especificamente complementares a toda ou parte de uma ou mais sequências de ácido nucleico nativas em uma peste coleóptera. Nessas e em modalidades adicionais, a(s) sequência(s) de ácido nucleico nativa(s) pode(m) ser um ou mais gene(s)-alvo, cujo produto pode estar, por exemplo e sem limitação: envolvido em um processo metabólico; envolvido em um processo reprodutor; ou envolvido em um desenvolvimento larval. Moléculas de ácido nucleico descritas aqui, quando introduzidas em uma célula compreendendo pelo menos uma sequência^) de ácido nucleico nativa à qual moléculas de ácido nucleico são especificamente complementares, podem iniciar RNAi na célula, e consequentemente reduzem ou eliminam expressão da(s) sequência(s) de ácido nucleico nativa(s). Em alguns exemplos, redução ou eliminação da expressão de um gene-alvo por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência especificamente complementar a ele pode ser letal em pestes coleópteras ou resulta em crescimento e/ou reprodução reduzido.

Em algumas modalidades, pelo menos um gene-alvo em uma peste coleóptera pode ser selecionado, onde o gene-alvo compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada da lista compreendendo proteína fos-fatase PP1-87B (SEQ ID N°:1), D_vir_Contig0011_87B (SEQ ID N°:3), RPA70 (SEQ ID N°:2), D__vir_c43870__RPA70 ou região 1 de RPA70 (SEQ ID N°:4), D_vir_c18764_RPA70 ou região 2 de RPA70 (SEQ ID N°:5), D_vir_c7971_RPA70 ou região 3 de RPA70 (SEQ ID N°:6), RPS6 (SEQ ID N°:7), Brahma (SEQ ID N°:103); F5XY5KV01 DBWKA_brahma_587-707 ou Brahma Regí (SEQ ID N°:104), D_vir__Contig[0001]_brahma_949-1126 ou Brahma Reg2 (SEQ ID N°:105) e F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333 ou Brahma Reg3 (SEQ ID N°:106). Em exemplos particulares, um gene-alvo em uma peste coleóptera é selecionado, onde o gene-alvo compreende a sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°:3.

Em algumas modalidades, um gene-alvo pode ser uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido contígua que é pelo menos 85% idêntica (por exemplo, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100% ou 100% idêntica) à sequência de aminoácido do produto de proteína de uma de PP1-87B (SEQ ID N°:1), RPA70 (SEQ ID N°:2), D_vir_Contig0011_87B (SEQ ID N°:3), D_vir_c43870_RPA70 ou região 1 de RPA70 (SEQ ID N°:4), D_vir_c18764_RPA70 ou região 2 de RPA70 (SEQ ID N°:5), D_vir_c7971_RPA70 ou região 3 de RPA70 (SEQ ID N°:6), RPS6 (SEQ ID N°:7), Brahma (SEQ ID N°:103); F5XY5KV01 DBWKA_brahma_587-707 ou Brahma Regí (SEQ ID N°:104), D_vir_Contig[0001Lbrahma_949-1126 ou Brahma Reg2 (SEQ ID N°:105) e F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333 ou Brahma Reg3 (SEQ ID N°:106).

Um gene-alvo pode ser qualquer sequência de ácido nucleico em uma peste coleóptera, cuja inibição pós-transcripcional tem um efeito prejudicial sobre a peste coleóptera ou provê um benefício protetor contra a peste coleóptera a uma planta. Em exemplos particulares, um gene-alvo é uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleo-tídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido contígua que é pelo menos 85% idêntica, cerca de 90% idêntica, cerca de 95% idêntica, cerca de 96% idêntica, cerca de 97% idêntica, cerca de 98% idêntica, cerca de 99% idêntica, cerca de 100% idêntica ou 100% idêntica à sequência de aminoácido do produto de proteína de sequência de nucleotídeo SEQ ID N°:3. São providas de acordo com a invenção sequências de nucleotídeo, cuja expressão resulta em uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa que é codificada por uma sequência de codificação em uma peste coleóptera. Em algumas modalidades, após ingestão da molécula de RNA expressa por uma peste coleóptera, sub-regulagem da sequência de codificação em células da peste coleóptera pode ser obtida. Em modalidades particulares, sub-regulagem da sequência de codificação em células da peste coleóptera pode resultar em um efeito prejudicial sobre crescimento, viabilidade, proliferação e/ou reprodução da peste coleóptera.

Em algumas modalidades, sequências-alvo incluem sequências de RNA de não codificação transcritas, tais como 5'UTRs; 3'UTRs; sequências líderes unidas; sequências de íntron; sequências de outron (por exemplo, RNA de 5'UTR subsequentemente modificado em união trans)\ sequências de donatron (por exemplo, RNA de não codificação requerido para prover sequências doadoras para união trans)\ e outro RNA transcrito de não codificação de genes de peste coleóptera-alvo. Tais sequências podem ser derivadas de ambos os genes monocistrônicos e policistrônicos.

Desta maneira, são também descritas aqui em conexão com algumas modalidades moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma sequência de nu-cleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma se-quência-alvo em uma peste coleóptera. Em algumas modalidades uma molécula de iRNA pode compreender sequência(s) de nucleotídeo que é/são complementares a todas ou parte de uma pluralidade de sequências-alvo; por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, 10 ou mais sequências-alvo. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA pode ser produzida in vitro ou in vivo por um organismo geneticamente modificado tal como uma planta ou bactéria. São também descritas sequências de cDNA que podem ser usadas para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de miRNA e/ou hpRNA que são especificamente complementares a toda ou parte de uma sequência-alvo em uma peste coleóptera. São ainda descritos construtos de DNA recombinantes para uso na obtenção da transformação estável de alvos hospedeiros particulares. Alvos hospedeiros transformados podem expressar níveis eficazes de moléculas de dsRNA, siRNA, miRNA e/ou hpRNA dos construtos de DNA recombinante. Desta maneira, é também descrito um vetor de transformação de planta compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo operavelmente ligada a um promotor he-terólogo funcional em uma célula de planta, onde expressão da(s) sequên-cia(s) de nucleotídeo resulta em uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma sequência-alvo em uma peste coleóptera.

Em algumas modalidades, moléculas de ácido nucleico úteis pa- ra o controle de pestes coleópteras podem incluir: toda ou parte da sequência de ácido nucleico nativa isolada de Diabrotica de proteína fosfatase D_vir_Contig0011_87B (SEQ ID N°:3); uma sequência de nucleotídeo que quando expressa resulta em uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa que é codificada por proteína fosfatase D_vir_Contig0011_87B (SEQ ID N°:3); moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte da proteína fosfatase D_vir_Contig0011_87B (SEQ ID N°:3); e constru-tos de DNA recombinante para uso na obtenção de transformação estável de alvos hospedeiros particulares, onde um hospedeiro alvo transformado compreende uma ou mais das moléculas de ácido nucleico acima.

Nessas e em modalidades adicionais, moléculas de ácido nucleico adicionais úteis para o controle de pestes coleópteras podem incluir: PP1-87B (SEQ ID N°:1), RPA70 (SEQ ID N°:2), D_vir_c43870_RPA70 ou Região 1 de RPA70 (SEQ ID N°:4), D_vir_c18764_RPA70 ou Região 2 de RPA70 (SEQ ID N°:5), D_vir_c7971_RPA70 ou Região 3 de RPA70 (SEQ ID N°:6), RPS6 (SEQ ID N°:7), Brahma (SEQ ID N°:103); F5XY5KV01 DBWKA_brahma_587-707 ou Brahma Regí (SEQ ID N°:104), D_vir_Contig[0001Lbrahma_949-1126 ou Brahma Reg2 (SEQ ID N°:105) e F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333 ou Brahma Reg3 (SEQ ID N°:106); moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de PP1-87B (SEQ ID N°:1), RPA70 (SEQ ID N°:2), D_vir_c43870_RPA70 ou Região 1 de RPA70 (SEQ ID N°:4), D_vir_c18764_RPA70 ou Região 2 de RPA70 (SEQ ID N°:5), D_vir_c7971 _RPA70 ou Região 3 de RPA70 (SEQ ID N°:6), RPS6 (SEQ ID N°:7), Brahma (SEQ ID N°:103); F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707 ou Brahma Regí (SEQ ID N°:104), D_yir_Contig[0001]_brahma_949-1126 ou Brahma Reg2 (SEQ ID N°:105), e F5XY5KV01DOIM6_brahma_1237-1333 ou Brahma Reg3 (SEQ ID N°:106); sequências de nucleotídeo que quando expressas resultam em uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar a uma molécula de RNA nativa que é codificada por PP1-87B (SEQ ID N°:1), RPA70 (SEQ ID N°:2), D_vir_c43870_RPA70 ou Região 1 de RPA70 (SEQ ID N°:4), D_vir_c18764 RPA70 ou Região 2 de RPA70 (SEQ ID N°:5), D_vir_c7971_RPA70 ou Região 3 de RPA70 (SEQ ID N°:6), RPS6 (SEQ ID N°:7), Brahma (SEQ ID N°:103); F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707 ou Brahma Regí (SEQ ID N°:104), D_vir_Contig[0001]_brahma_949-1126 ou Brahma Reg2 (SEQ ID N°:105), e F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333 ou Brahma Reg3 (SEQ ID N°:106); moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de PP1-87B (SEQ ID N°:1), RPA70 (SEQ ID N°:2), D_vir_c43870_RPA70 ou Região 1 de RPA70 (SEQ ID N°:4), D_vir_c18764_RPA70 ou Região 2 de RPA70 (SEQ ID N°:5), D_vir_c7971_RPA70 ou Região 3 de RPA70 (SEQ ID N°:6), RPS6 (SEQ ID N°:7), Brahma (SEQ ID N°:103); F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707 ou Brahma Regí (SEQ ID N°:104), D_vir_Contig[0001]_brahma_949-1126 ou Brahma Reg2 (SEQ ID N°:105), e F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333 ou Brahma Reg3 (SEQ ID N°:106); moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar a PP1-87B (SEQ ID N°:1), RPA70 (SEQ ID N°:2), D_vir_c43870_RPA70 ou Região 1 de RPA70 (SEQ ID N°:4), D_vir_c18764_RPA70 ou Região 2 de RPA70 (SEQ ID N°:5), D_vir_c7971_RPA70 ou Região 3 de RPA70 (SEQ ID N°:6), RPS6 (SEQ ID N°:7), Brahma (SEQ ID N°:103); F5XY5KV01 DBWKA_brahma_587-707 ou Brahma Regí (SEQ ID N°:104), D_vir_Contig[0001]_brahma_949-1126 ou Brahma Reg2 (SEQ ID N°:105), e F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333 ou Brahma Reg3 (SEQ ID N°:106); moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de PP1-87B (SEQ ID N°:1), RPA70 (SEQ ID N°:2), D_vir_c43870_RPA70 ou Região 1 de RPA70 (SEQ ID N°:4), D_vir_c18764_RPA70 ou Região 2 de RPA70 (SEQ ID N°:5), D_vir_c7971_RPA70 ou Região 3 de RPA70 (SEQ ID N°:6), RPS6 (SEQ ID N°:7), Brahma (SEQ ID N°:103); F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707 ou Brahma Regí (SEQ ID N°:104), D_vir_Contig[0001l_brahma_949-1126 ou Brahma Reg2 (SEQ ID N°:105), e F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333 ou Brahma Reg3 (SEQ ID N°:106); sequências de cDNA que podem ser u-sadas para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de miRNA e/ou hpRNA que são especificamente complementares a PP1-87B (SEQ ID N°:1), RPA70 (SEQ ID N°:2), D_vir_c43870_RPA70 ou Região 1 de RPA70 (SEQ ID N°:4), D_vir_c18764_RPA70 ou Região 2 de RPA70 (SEQ ID N°:5), D_vir_c7971_RPA70 ou Região 3 de RPA70 (SEQ ID N°:6), RPS6 (SEQ ID N°:7), Brahma (SEQ ID N°:103); F5XY5KV01 DBWKA_brahma_587-707 ou Brahma Regí (SEQ ID N°:104), D_vir_Contig[0001]_brahma_949-1126 ou Brahma Reg2 (SEQ ID N°:105), e F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333 ou Brahma Reg3 (SEQ ID N°:106); moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de PP1-87B (SEQ ID N°:1), RPA70 (SEQ ID N°:2), D_vir_c43870_RPA70 ou Região 1 de RPA70 (SEQ ID N°:4), D_vir_c18764_RPA70 ou Região 2 de RPA70 (SEQ ID N°:5), D_vir_c7971_RPA70 ou Região 3 de RPA70 (SEQ ID N°:6), RPS6 (SEQ ID N°:7), Brahma (SEQ ID N°:103); F5XY5KV01DBWKA_brahma_687-707 ou Brahma Regí (SEQ ID N°:104), D_vir_Contig{0001]_brahma_949-1126 ou Brahma Reg2 (SEQ ID N°:105), e F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333 ou Brahma Reg3 (SEQ ID N°:106); e construtos de DNA recombinante para uso na obtenção de transformação estável de alvos hospedeiros particulares, onde um hospedeiro alvo transformado compreende uma ou mais das moléculas de ácido nucleico acima. B. Moléculas de Ácido Nucleico A presente invenção provê, inter alia, moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) que inibem expressão de gene- alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma peste coleóptera; e moléculas de DNA capazes de ser expressas como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir expressão de gene-alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma peste coleóptera.

Algumas modalidades da invenção proveem uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo a sequência de nucleotídeo de: SEQ ID N°:3; o complemento de SEQ ID N°:3; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:3; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:3; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID N°:3; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:3; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:3; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:3; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:3; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:3; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:3; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:3. Em modalidades particulares, contato com ou absorção por uma peste coleóptera da sequência de ácido nucleico isolada inibe o crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou alimentação da peste coleóptera.

Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada da invenção pode compreender pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três ou mais) sequência(s) de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID N°:1; o complemento de SEQ ID N°:1; SEQ ID N°:2; o complemento de SEQ ID N°:2; SEQ ID N°:4; o complemento de SEQ ID N°:4; SEQ ID N°:5; o complemento de SEQ ID N°:5; SEQ ID N°:6; o complemento de SEQ ID N°:6; SEQ ID N°:7; o complemento de SEQ ID N°:7; SEQ ID N°:103; o complemento de SEQ ID N°:103; SEQ ID N°:104; o complemento de SEQ ID N°:104; SEQ ID N°:105; o complemento de SEQ ID N°:105; SEQ ID N°:106; o complemento de SEQ ID N°:106; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e 103-106; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e 103-106; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ IDNoS:1, 2, 4-7 e 103-106; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID N^il, 2, 4-7 e 103-106; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e 103-106; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e 103-106; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID N^tl, 2, 4-7 e 103-106; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e 103-106; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e 103-106; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e 103-106. Em modalidades particulares, contato com ou absorção por uma peste coleóptera da sequência de ácido nucleico isolada inibe o crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou alimentação da peste coleóptera.

Em exemplos particulares, uma molécula de ácido nucleico isolada da invenção pode compreender pelo menos um (por exemplo, um, dois, três ou mais) segmento de SEQ ID NoS:1-7, 103 e/ou 106 (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NoS:99-102 e 107, que pode ser encontrada como fragmentos em SEQ ID NoS:3-6 e 106).

Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode compreender pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três ou mais) sequência(s) de DNA capaz de ser expressa como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir expressão de gene-alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma peste coleóptera. Tal(is) se-quência(s) de DNA pode(m) ser operavelmente ligada(s) a uma sequência promotora que funciona em uma célula compreendendo a molécula de DNA para iniciar ou aumentar a transcrição do RNA codificado capaz de formar uma molécula(s) de dsRNA. Em uma modalidade, a pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três ou mais) sequência(s) de DNA pode ser derivada da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°:3. Derivados de SEQ ID N°:3 incluem fragmentos de SEQ ID N°:3. Em algumas modalidades, tal fragmento pode compreender, por exemplo, pelo menos cerca de 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:3 ou um complemento da mesma. Desta maneira, tal fragmento pode compreender, por exemplo, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 17, 28, 29 ou 30 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:3 ou um complemento da mesma. Nessas e em modalidades adicionais, tal fragmento pode compreender, por exemplo, mais de cerca de 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:3 ou um complemento da mesma. Desta maneira, um fragmento de SEQ ID N°:3 pode compreender, por exemplo, 19, 20, 21, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:3 ou um complemento da mesma.

Em modalidades particulares, pelo menos uma sequência(s) de DNA capaz de ser expressa como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir expressão de gene-alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma peste coleóptera pode compreender sequência(s) de DNA que são derivadas de uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e 103-106. Derivados de uma sequência de nucleotídeo selecionada dos grupos consistindo em SEQ ID N^l, 2, 4-7 e 103-106 incluem fragmentos de SEQ ID Ν°Μ, 2, 4-7 e/ou 103-106. Em algumas modalidades, tal fragmento pode compreender, por exemplo, pelo menos cerca de 19 nucleotídeos de SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e/ou 103-106 ou um complemento da mesma. Desta maneira, tal fragmento pode compreender, por exemplo, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e/ou 103-106 ou um complemento da mesma. Nessas e em modalidades adicionais, tal fragmento pode compreender, por exemplo, mais do que cerca de 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e/ou 103-106 ou um complemento da mesma. Desta maneira, um fragmento de uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e 103-106 pode compreender, por exemplo, 19, 20, 21, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais nucleotídeos contíguos das SEQ ID Ν°*:1, 2, 4-7 e/ou 103-106 ou um complemento da mesma. Em algumas modalidades particulares, os fragmentos podem compreender, por exemplo, mais do que cerca de 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NoS:99-102 ou um complemento da mesma. Em certas modalidades, os fragmentos podem compreender, por exemplo, os 14 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:107 ou um complemento da mesma.

Algumas modalidades compreendem introdução de moléculas de dsRNA parcial- ou integralmente estabilizadas em uma peste coleóptera para inibir expressão de um gene-alvo em uma célula, tecido ou órgão da peste coleóptera. Quando expressas como uma molécula de iRNA (por e-xemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) e absorvidas pela peste coleóptera, sequências de ácido nucleico compreendendo um ou mais fragmentos de qualquer uma de SEQ ID NoS:1-7 podem causar uma ou mais de morte, inibi- ção de crescimento, mudança em razão de sexo, redução em tamanho de prole, parada de infecção e/ou parada de alimentação por uma peste coleóp-tera. Por exemplo, em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo incluindo cerca de 19 a cerca de 300 nucleotídeos que são substancialmente homólogos a uma sequência de gene-alvo de peste coleóptera e compreendendo um ou mais fragmentos da sequência de nucleotídeo de SEQ ID N°:3 é provida. Essas e moléculas de dsRNA adicionais podem compreender ainda um ou mais fragmentos de uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e/ou 103-106. Expressão de tal molécula de dsRNA pode, por exemplo, levar à mortalidade e/ou inibição de crescimento em uma peste coleóptera que absorve a molécula de dsRNA.

Em certas modalidades, moléculas de dsRNA providas pela invenção compreendem sequências de nucleotídeo complementares a uma gene-alvo compreendendo SEQ ID N°:3 e/ou sequências de nucleotídeo complementares a um fragmento de SEQ ID N°:3, inibição do gene-alvo em uma peste coleóptera resulta na redução ou remoção de um agente de sequência de proteína ou nucleotídeo que é essencial para o crescimento, desenvolvimento ou outra função biológica da peste coleóptera. Uma sequência de nucleotídeo selecionada pode exibir de a partir de cerca de 80% a cerca de 100% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:3, um fragmento contínuo da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID N°:3 ou o complemento de qualquer uma das acima. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeo selecionada pode exibir cerca de 81%; cerca de 82%; cerca de 83%; cerca de 84%; cerca de 85%; cerca de 86%; cerca de 87%; cerca de 88%; cerca de 89%; cerca de 90%; cerca de 91%; cerca de 92%; cerca de 93%; cerca de 94% cerca de 95%; cerca de 96%; cerca de 97%; cerca de 98%; cerca de 98,5%; cerca de 99%; cerca de 99,5%; ou cerca de 100% de identidade de sequência com a SEQ ID N°:3, um fragmento contínuo da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID N°:3 ou o complemento de qualquer uma das acima. Em modalidades particulares, uma molécula de dsRNA provida pela invenção pode compreender ainda uma ou mais se- quências de nucleotídeo complementares a um gene-alvo compreendendo uma das SEQ ID Ν^ιΐ, 2, 4-7 e 103-106, a inibição de tal gene-alvo em uma peste coleóptera resulta na redução ou remoção de um agente de sequência de proteína ou nucleotídeo que é essencial para o crescimento, desenvolvimento ou outra função biológica da peste coleóptera.

Em algumas modalidades, uma molécula de DNA capaz de ser expressa como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir expressão de gene-alvo pode compreender uma sequência de nucleotídeo simples que é especificamente complementar a toda ou parte de uma sequência de ácido nucleico nativa encontrada em uma ou mais espécie de peste coleóptera-alvo, ou a molécula de DNA pode ser construída como uma quimera a partir de uma pluralidade de tais sequências especificamente complementares.

Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode compreender uma primeira e uma segunda sequência de nucleotídeo separadas por uma "sequência espaçadora". Uma sequência espaçadora pode ser uma região compreendendo qualquer sequência de nucleotídeos que facilita formação de estrutura secundária entre as primeira e segunda sequências de nucleotídeo, onde isto for desejado. Em uma modalidade, a sequência espaçadora é parte de uma sequência de codificação de sentido ou antissentido para mRNA. A sequência espaçadora pode compreender alternativamente qualquer combinação de nucleotídeos ou seus homólogos que são capazes de ser ligados covalentemente a uma molécula de ácido nucleico.

Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de DNA pode compreender uma sequência de nucleotídeo codificando uma ou mais moléculas de RNA diferentes, onde cada uma das moléculas de RNA diferentes compreende uma primeira sequência de nucleotídeo e uma segunda sequência de nucleotídeo, onde as primeira e segunda sequências de nucleotídeo são complementares umas à outra. As primeira e segunda sequências de nucleotídeo podem ser conectadas dentro de uma molécula de RNA através de uma sequência espaçadora. A sequência espaçadora pode constituir parte da primeira sequência de nucleotídeo ou da segunda sequência de nucleotídeo. Expressão de uma molécula de RNA compreendendo as primeira e segunda sequências de nucleotídeo pode levar à formação de uma molécul^ de dsRNA da presente invenção, através de emparelha-mento de base intramolecular específico das primeira e segunda sequências de nucleotídeo. A primeira sequência de nucleotídeo ou a segunda sequência de nucleotídeo pode ser substancialmente idêntica a uma sequência de ácido nucleico nativa para uma peste coleóptera (por exemplo, um gene-alvo ou sequência de não codificação transcrita), um derivado da mesma ou uma sequência complementar à mesma.

Molépulas de ácido nucleico de dsRNA compreendem filamentos duplos de sequências de ribonucleotídeo polimerizadas e podem incluir modificações ou na estrutura principal de fosfato-açúcar ou no nucleosídeo. Modificações na estrutura do RNA podem ser feitas especialmente para permitir inibição específica. Em uma modalidade, moléculas de dsRNA podem ser modificadas através de um processo enzimático ubíquo de maneira que moléculas de siRNA podem ser geradas. Este processo enzimático pode utilizar uma enzima RNAse III, tal como DICER em eucariontes ou in vitro ou in vivo. Vide Elbashir et ai (2001) Nature 411:494-8; e Hamilton e Baulcombe (1999) Science 286(5441):950-2. DICER ou enzimas RNAse III funcionalmente equivalentes clívam filamentos de dsRNA e/ou moléculas de hpRNA maiores em oligonucleotídeos menores (por exemplo, siRNAs), cada um deles é de cerca de 19-25 nucleotídeos de comprimento. As moléculas de siRNA produzidas por essas enzimas têm 2 a 3 sobreposições 3' de nucleotídeo e terminais fosfato 5' e hidroxila 3’. As moléculas de siRNA geradas por enzimas RNAse III não são enroladas e separadas em RNA de filamento simples na célula. As moléculas de siRNA então hibridizam especificamente com sequências de RNA transcritas a partir de um gene-alvo, e ambas as moléculas de RNA são subsequentemente degradadas por um mecanismo de degradação de RNA celular inerente. Este processo pode resultar na degradação ou remoção eficaz da sequência de RNA codificada pelo gene-alvo no organismo-alvo. O resultado é o silenciamento pós- transcripcional do gene direcionado. Em algumas modalidades, moléculas de siRNA produzidas por enzimas RNAse III endógenas a partir de moléculas de ácido nucleico heterólogas podem eficientemente mediar a sub-regulagem de genes-alvo em pestes coleópteras.

Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode incluir pelo menos uma sequência de nucleotídeo de ocorrência não natural que pode ser transcrita em uma molécula de RNA de filamento simples capaz de formar uma molécula de dsRNA in vivo através de hibridização intermolecular. Tais sequências de dsRNA tipicamente realizam automontagem, e podem ser providas na fonte de nutrição de uma peste coleóptera para obter a inibição pós-transcripcional de um gene-alvo. Nessas e em modalidades adicionais, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode compreender duas sequências de nucleotídeo de ocorrência não natural diferentes, cada uma delas é especificamente complementar a um gene-alvo diferente em uma peste coleóptera. Quando tal molécula de ácido nucleico é provida como uma molécula de dsRNA a uma peste coleóptera, a molécula de dsRNA inibe a expressão de pelo menos dois genes-alvo diferentes na peste coleóptera. C. Obtenção de Moléculas de Ácido Nucleico Uma variedade de sequências nativas em pestes coleópteras pode ser usada como sequências-alvo para o projeto de moléculas de ácido nucleico da invenção, tais como moléculas de iRNAs e DNA codificando iR-NAs. Seleção de sequências nativas não é, no entanto, um processo direto. Apenas um pequeno número de sequências nativas na peste coleóptera serão alvos eficazes. Por exemplo, não pode ser previsto com certeza se uma sequência nativa particular pode ser eficazmente sub-regulada pelas moléculas de ácido nucleico da invenção ou se sub-regulagem de uma sequência nativa particular terá um efeito prejudicial sobre o crescimento, viabilidade, proliferação e/ou reprodução da peste coleóptera. A maioria esmagadora de sequências de peste coleóptera nativas, tais como ESTs isoladas das mesmas (por exemplo, conforme listado na Patente U.S. N°. 7.612.194), não tem um efeito prejudicial sobre o crescimento, viabilidade, proliferação e/ou re- produção da peste coleóptera, tal como WCR ou NCR. Também não é pre-visivo quais das sequências nativas que podem ter um efeito prejudicial sobre uma peste coleóptera são capazes de ser usadas em técnicas recombi-nantes para expressão de moléculas de ácido nucleico complementares a tais sequências nativas em uma planta hospedeira e provisão do efeito prejudicial sobre a peste coleóptera quando da alimentação sem causar prejuízo à planta hospedeira.

Em algumas modalidades, moléculas de ácido nucleico da invenção (por exemplo, moléculas de dsRNA a serem providas na planta hospedeira de uma peste coleóptera) são selecionadas para se direcionarem a se-quências-alvo de cDNA que codificam proteínas ou partes de proteínas essenciais para sobrevivência de peste coleóptera, tais como sequências de aminoácido envolvidas em cursos bioquímicos metabólicos ou catabólicos, divisão celular, reprodução, metabolismo de energia, digestão, reconhecimento de planta hospedeira e similar. Conforme aqui descrito, ingestão de composições por um organismo-alvo contendo um ou mais dsRNAs, pelo menos um segmento do mesmo é especificamente complementar a pelo menos um segmento substancialmente idêntico de RNA produzido nas células do organismo peste-alvo, pode resultar na morte ou outra inibição do alvo. Uma sequência de nucleotídeo, ou DNA ou RNA, derivada de uma peste coleóptera pode ser usada para construir células de planta resistentes à infestação pelas pestes coleópteras. A planta hospedeira da peste coleóptera (por exemplo, Z. mays ou G. max), por exemplo, pode ser transformada para conter uma ou mais das sequências de nucleotídeo derivadas da peste coleóptera conforme provido aqui. A sequência de nucleotídeo transformada no hospedeiro pode codificar um ou mais RNAs que se transformam em uma sequência de dsRNA nas células ou fluidos biológicos dentro do hospedeiro transformado, desta maneira disponibilizando o dsRNA se/quando a peste coleóptera formar uma relação nutricional com o hospedeiro transgênico. Isto pode resultar na supressão de expressão de um ou mais genes nas células da peste coleóptera, e por fim morte ou inibição de seu crescimento ou desenvolvimento.

Desta maneira, em algumas modalidades, é direcionado um ge- ne que está essencialmente envolvido no crescimento, desenvolvimento e reprodução de uma peste coleóptera. Outros genes-alvo para uso na presente invenção podem incluir, por exemplo, aqueles que desempenham papéis importantes em viabilidade, movimento, migração, crescimento, desenvolvimento, infectividade, estabelecimento de sítios de alimentação e reprodução de peste coleóptera. Um gene-alvo pode então ser um gene regulador ou um fator de transcrição. Ainda, uma sequência de nucleotídeo de peste coleóptera nativa para uso na presente invenção pode ser também derivada de um homólogo (por exemplo, um ortólogo) de um gene de planta, viral, bacteriano ou de inseto, cuja função é conhecida daqueles de habilidade na técnica, e cuja sequência de nucleotídeo é especificamente hibridizável com um gene-alvo no genoma da peste coleóptera-alvo. Métodos de identificação de um homólogo de um gene com uma sequência de nucleotídeo conhecida através de hibridização são conhecidos daqueles de habilidade na técnica.

Em algumas modalidades, a invenção provê métodos para obtenção de uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo para produção de uma molécula de iRNA (por exemplo, ds-RNA, siRNA, miRNA e hpRNA). Modalidade do tipo compreende: (a) análise de um ou mais gene(s)-alvo quanto à sua expressão, função e fenótipo quando da supressão de gene mediada por dsRNA em uma peste coleóptera; (b) experimentação de uma biblioteca de cDNA ou gDNA com uma sonda compreendendo toda ou uma porção de uma sequência de nucleotídeo ou um homólogo da mesma de uma peste coleóptera-alvo que mostra um fenótipo de crescimento ou desenvolvimento alterado (por exemplo, reduzido) em uma análise de supressão mediada por dsRNA; (c) identificação de um clone de DNA que hibridiza especificamente com a sonda; (d) isolamento do clone de DNA identificado na etapa (b); (e) sequenciamento do fragmento de cD-NA ou gDNA que compreende o clone isolado na etapa (d), onde a molécula de ácido nucleico sequenciada compreende toda ou uma porção substancial da sequência de RNA ou um homólogo da mesma; e (f) sintetizar quimica-mente toda ou uma porção substancial de uma sequência de gene ou uma siRNA ou miRNA ou hpRNA ou mRNA ou dsRNA.

Em modalidades adicionais, um método para obtenção de um fragmento de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo para produção de uma porção substancial de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) inclui: (a) síntese de primeiro e segundo iniciadores de oligonucleotídeo especificamente complementares a uma porção de uma sequência de nucleotídeo nativa de uma peste coleópte-ra-alvo; e (b) amplificação de uma inserção de cDNA ou gDNA presente em um vetor de clonagem usando os primeiro e segundo iniciadores de nucleotídeo da etapa (a), onde a molécula de ácido nucleico amplificada compreende uma porção substancial de uma molécula de siRNA ou miRNA ou h-pRNA ou mnRNA ou dsRNA.

Os ácidos nucleicos da invenção podem ser isolados, amplificados ou produzidos através de várias abordagens. Por exemplo, uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) pode ser obtida através de amplificação por PCR de uma sequência de ácido nucleico-alvo (por exemplo, um gene-alvo ou uma sequência de não codificação transcrita-alvo) derivada de uma biblioteca de gDNA ou cDNA ou suas porções. DNA ou RNA pode ser extraído de um organismo-alvo, e bibliotecas de ácido nucleico podem ser preparadas a partir dele usando métodos conhecidos daqueles de habilidade comum na técnica. Bibliotecas de gDNA ou cDNA geradas a partir de um organismo-alvo podem ser usadas para amplificação ou sequenciamento por PCR de genes-alvo. üm produto de PCR confirmado pode ser usado como um molde para transcrição in vitro para gerar RNA de sentido e antissentido com promotores mínimos. Alternativamente, moléculas de ácido nucleico podem ser sintetizadas através de qualquer número de técnicas (vide, por exemplo, Ozaki et al (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214; e Agrawal et al (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423), incluindo o uso de um sintetizador de DNA automático (por exemplo, um P.E. Biosystems, Inc. (Foster City, Calif.) model 392 ou 394 DNA/RNA Syn-thesizer), usando químicas padrão, tal como química de fosforamidita. Vide, por exemplo, Beaucage et al (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311; Patentes U.S. Nos. 4.980,460, 4.725.677, 4.415.732, 4.458.066 e 4.973.679. Quími- cas alternativas resultando em grupos de estrutura principal não naturais, tais como fosforotioato, fosforamidato, e similar, podem ser também empregadas.

Uma molécula de RNA, dsRNA, siRNA, miRNA ou hpRNA da presente invenção pode ser produzida quimicamente ou enzimaticamente por um versado na técnica através de reações manuais ou automáticas ou in vivo em uma célula compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência codificando a molécula de RNA, dsRNA, siRNA, miRNA ou hpRNA. RNA pode também ser produzido através de síntese orgânica parcial ou total - qualquer ribonucleotídeo modificado pode ser introduzido através de uma síntese enzimática ou orgânica in vitro. Uma molécula de RNA pode ser sintetizada através de uma polimerase de RNA celular ou uma polimerase de RNA de bacteriófago (por exemplo, polimerase de RNA T3, polimerase de RNA T7 e polimerase de RNA SP6). Construtos de expressão úteis para a clonagem e expressão de sequências de nucleotídeo são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Publicação PCT Internacional N°. WO 97/32016; e Patente U.S. Nos. 5.593.874, 5.698.425, 5.712.135, 5.789.214 e 5.804693. Moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou através de síntese enzimática in vitro podem ser purificadas antes da introdução em uma célula. Por exemplo, moléculas de RNA podem ser purificadas a partir de uma mistura através de extração com um solvente ou resina, precipitação, eletroforese, cromatografia ou uma combinação das mesmas. Alternativamente, moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou através de síntese enzimática in vitro podem ser usadas com nenhuma ou um mínimo de purificação, por exemplo, para evitar perdas devido a processamento de amostra. As moléculas de RNA podem ser secas para armazenamento ou dissolvidas em uma solução aquosa. A solução pode conter tampões ou sais para promover anelamento e/ou estabilização de filamentos de duplex de molécula de dsRNA.

Em modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser formada por um filamento de RNA autocomplementar simples ou a partir de dois filamentos de RNA complementares. Moléculas de dsRNA podem ser sintetizadas ou in vivo ou in vitro. Uma polimerase de RNA endógena da célula pode mediar transcrição de um ou dois filamentos de RNA in vivo ou polimerase de RNA clonada pode ser usada para mediar transcrição in vivo ou in vitro. Inibição pós-transcripcional de um gene-alvo em uma peste coleóptera pode ser direcionada a hospedeiro através de transcrição específica em órgão, tecido ou tipo de célula do hospedeiro (por exemplo, usando um promotor específico de tecido); estimulação de uma condição ambiental no hospedeiro (por exemplo, usando um promotor induzível que é responsivo à infecção, estresse, temperatura e/ou indutores químicos); e/ou transcrição de engenharia em um estágio ou idade desenvolvimental do hospedeiro (por exemplo, usando um promotor específico de estágio desenvolvimental). Filamentos de RNA que formam uma molécula de dsRNA, seja transcrita in vitro ou in vivo, podem ou não ser poliadenilados, e podem ou não ser capazes de ser traduzidos em um polipeptídeo por um aparelho de tradução da célula. D. Vetores Recombinantes e Transformação de Célula Hospedeira Em algumas modalidades, a invenção também provê uma molécula de DNA para introdução em uma célula (por exemplo, uma célula bacte-riana, uma célula de levedura ou uma célula de planta), onde a molécula de DNA compreende uma sequência de nucleotídeo que, quando da expressão para DNA e ingestão por uma peste coleóptera, obtém supressão de um gene-alvo em uma célula, tecido ou órgão da peste coleóptera. Desta maneira, algumas modalidades proveem uma molécula de ácido nucleico recombinan-te compreendendo uma sequência de ácido nucleico capaz de ser expressa como uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpR-NA) em uma célula de planta para inibir expressão de gene-alvo em uma peste coleóptera. A fim de iniciar ou aumentar expressão, tais moléculas de ácido nucleico recombinantes podem compreender uma ou mais sequências reguladoras, sequências reguladoras que podem ser operavelmente ligadas à sequência de ácido nucleico capaz de ser expressa como um iRNA. Métodos para expressar uma molécula de supressão de gene em plantas são conhecidos, e podem ser usados para expressar uma sequência de nucleotídeo da presente invenção. Vide, por exemplo, Publicação PCT Internacio- nal N°. WO06/073727; e Publicação de Patente U.S. N° 2006/0200878 A1).

Em modalidades específicas, uma molécula de DNA recombi-nante da invenção pode compreender uma sequência de ácido nucleico codificando um RNA que pode formar uma molécula de dsRNA. Tais moléculas de DNA recombinantes podem codificar RNAs que podem formar moléculas de dsRNA capazes de inibição da expressão de gene(s)-alvo endógeno(s) em uma peste coleóptera quando da ingestão. Em muitas modalidades, um RNA transcrito pode formar uma molécula de dsRNA que pode ser provida em uma forma estabilizada; por exemplo, como uma estrutura grampo de cabelo e haste e alça.

Nessas e em modalidades adicionais, um filamento de uma molécula de dsRNA pode ser formado através da transcrição a partir de uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente homóloga à sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°:3; o complemento de SEQ ID N°:3; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:3; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:3; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por e-xemplo, WCR) compreendendo SEQ ID N°:3; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:3; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:3; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:3; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID N°:3; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:3; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:3; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:3.

Um filamento de uma molécula de dsRNA pode ser também formado através da transcrição a partir de uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente homóloga a uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID N°:1; o complemento de SEQ ID N°:1; SEQ ID N°:2; o complemento de SEQ ID N°:2; SEQ ID N°:4; o complemento de SEQ ID N°:4; SEQ ID N°:5; o complemento de SEQ ID N°:5; SEQ ID N°:6; o complemento de SEQ ID N°:6; SEQ ID N°:7; o complemento de SEQ ID N°:7; SEQ ID N°:103; o complemento de SEQ ID N°:103; SEQ ID N°:104; o complemento de SEQ ID N°:104; SEQ ID N°:105; o complemento de SEQ ID N°:105; SEQ ID N°:106; o complemento de SEQ ID N°:106; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma de SEQ ID N^il, 2, 4-7 e 103-106; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma de SEQ ID N08:!, 2, 4-7 e 103-106; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma de SEQ ID N0*: 1, 2, 4-7 e 103-106; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma de SEQ ID Ν°®:1, 2, 4-7 e 103-106; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e 103-106; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e 103-106; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma de SEQ ID Ν°®:1, 2, 4-7 e 103-106; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID N05:1, 2, 4-7 e 103-106; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e 103-106; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e 103-106.

Em modalidades particulares, uma molécula de DNA recombi-nante codificando uma molécula de dsRNA pode compreender pelo menos duas sequências de nucleotídeo dentro de uma sequência transcrita, onde as sequências estão dispostas de maneira que a sequência transcrita compreende uma das sequências de nucleotídeo em uma orientação de sentido e outra das sequências de nucleotídeo (compreendendo o complemento da primeira sequência de nucleotídeo) está em uma orientação de antissentido, com relação a pelo menos um promotor, onde a sequência de nucleotídeo de sentido e a sequência de nucleotídeo de antissentido são ligadas ou conectadas por uma sequência espaçadora de a partir de cerca de cinco (~5) a cerca de mil (~1000) nucleotídeos. A sequência espaçadora pode formar uma alça entre as sequências de sentido e antissentido na molécula de dsRNA. A sequência de nucleotídeo de sentido ou a sequência de nucleotídeo de antissentido pode ser substancialmente homóloga à sequência de nucleotídeo de um gene-alvo (por exemplo, um gene compreendendo uma de SEQ ID Ν°*:1-7 e 103-106) ou fragmento da mesma. Em algumas modalidades, no entanto, uma molécula de DNA recombinante pode codificar um RNA que pode formar uma molécula de dsRNA sem uma sequência espaçadora. Em modalidades, uma sequência de codificação de sentido e uma sequência de codificação de antissentido podem ser de comprimentos diferentes.

Sequências identificadas como tendo um efeito prejudicial sobre pestes coleópteras ou um efeito protetor de planta com relação a pestes co-leópteras podem ser prontamente incorporadas a moléculas de dsRNA expressas através da criação de cassetes de expressão apropriados em uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. Por exemplo, tais sequências podem ser expressas como um grampo de cabelo com estrutura haste e alça pegando um primeiro segmento correspondendo a uma sequência de gene-alvo (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NoS:1-7 e 103-106 e seus fragmentos); ligação dessa sequência a uma segunda região espaçadora de segmento que não é homóloga ou complementar ao primeiro segmento; e ligação desta a um terceiro segmento, onde pelo menos uma porção do terceiro segmento é substancialmente complementar ao primeiro segmento. Tal construto forma uma estrutura haste e alça através de empa-relhamento de base intramolecular do primeiro segmento com o terceiro segmento, onde a estrutura de alça forma e compreende o segundo segmento. Vide, por exemplo, Publicações de Patente U.S. Nos. 2002/0048814 e 2003/0018993; e Publicações PCT Internacionais Nos. W094/01550 e W098/05770. Uma molécula de dsRNA pode ser gerada, por exemplo, na forma de uma estrutura de filamento duplo tal como uma estrutura de haste alça (por exemplo, grampo de cabelo), com o que a produção de siRNA direcionado a uma sequência de peste coleóptera nativa é aumentada pela co-expressão de um fragmento do gene-alvo, por exemplo, em um cassete ex-pressável de planta adicional, que leva à produção de siRNA aumentada, ou reduz metilação para prevenir silenciamento de gene transcripcional do promotor de grampo de cabelo dsRNA.

As modalidades da invenção incluem introdução de uma molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção em uma planta (isto é, transformação) para obter níveis inibidores em peste coleóptera de expressão de uma ou mais moléculas de iRNA. Uma molécula de DNA recombinante pode, por exemplo, ser um vetor, tal como um plasmídeo linear ou circular fechado. O sistema de vetor pode ser um vetor ou plasmídeo único, ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma de um hospedeiro. Ainda, um vetor pode ser um vetor de expressão. Sequências de ácido nucleico da invenção podem, por exemplo, ser adequadamente inseridas em um vetor sob o controle de um promotor adequado que funciona em um ou mais hospedeiros para direcionar expressão de uma sequência de codificação ligada ou outra sequência de DNA. Muitos vetores estão disponíveis para este propósito, e seleção do vetor apropriado vai depender principalmente do tamanho do ácido nucleico a ser inserido no vetor e da célula hospedeiro particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes dependendo da sua função (por exemplo, amplificação de DNA ou expressão de DNA) e da célula hospedeiro particular com a qual ele é compatível.

Para fornecer resistência à peste coleóptera a uma planta trans-gênica, um DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrito em uma molécula de iRNA (por exemplo, uma molécula de RNA que forma uma molécula de dsRNA) dentro dos tecidos ou fluidos da planta recombinante. Uma molécula de iRNA pode compreender uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente homóloga e especificamente hibridizável para uma sequência de nucleotídeo transcrita correspondente dentro de uma peste coleóptera que pode causar dano a espécies de planta hospedeira. A peste coleóptera pode contatar a molécula de iRNA que é transcrita em células da planta hospedeira transgênica, por exemplo, através de ingestão das células ou fluidos da planta hospedeira transgênica que compreendem a molécula de iRNA. Desta maneira, expressão de um gene-alvo é suprimida pela molécula de iRNA dentro de pestes coleópteras que infestam a planta hospedeira transgênica. Em algumas modalidades, supressão de expressão do gene-alvo na peste coleóptera-alvo pode resultar na planta sendo resistente a ataque pela peste. A fim de permitir fornecimento de moléculas de iRNA a uma peste coleóptera em uma relação nutricional com uma célula de planta que foi transformada com uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção, expressão (isto é, transcrição) de moléculas de iRNA na célula de planta é requerida. Desta maneira, uma molécula de ácido nucleico recombinante pode compreender uma sequência de nucleotídeo da invenção operavelmente ligada a uma ou mais sequências reguladoras, tal como uma sequência promotora heteróloga que funciona em uma célula hospedeiro, tal como uma célula bacteriana onde a molécula de ácido nucleico deve ser amplificada, e uma célula de planta onde a molécula de ácido nucleico deve ser expressa.

Promotores adequados para uso em moléculas de ácido nucle- ico da invenção incluem aqueles que são induzíveis, virais, sintéticos ou constitutivos, todos são bem conhecidos na técnica. Exemplos não limitan-tes descrevendo tais promotores incluem Patentes U.S. NoS. 6.437.217 (promotor RS81 do milho); 5.641.876 (promotor da actina do arroz); 6.426.446 (promotor RS324 do milho); 6.429.362 (promotor PR-1 do milho); 6.232.526 (promotor A3 do milho); 6.177.611 (promotores do milho constitutivos); 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196 (promotor 35S do CaMV); 6.433.252 (promotor da oleosina L3 do milho); 6.429.357 (promotor 2 da actina do arroz e íntron 2 da actina do arroz); 6.294.714 (promotores induzíveis por luz); 6.140.078 (promotores induzíveis por sal); 6.252.138 (promotores induzíveis por patógeno); 6.175.060 (promotores induzíveis por deficiência de fósforo); 6.388.170 (promotores bidirecioanis); 6.635.806 (promotor da gama-coixina); e Publicação de Patente U.S. N°. 2009/757.089 (promotor da aldolase do cloroplasto do milho). Promotores adicionais incluem o promotor da nopalina sintase (NOS) (Ebert etal (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84(16):5745-9) e os promotores da octopina sintase (OCS) (que são carregados em plasmídeos de indução de tumor de Agrobacterium tumefaciens)·, os promotores do caulimovirus tal como o promotor 19S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton et al (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); o promotor 35S de CaMV (Odell et al (1985) Nature 313:810-2; o promotor 35S do vírus do mosaico de figwort (Walker et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84(19):6624-8); o promotor da sacarose sintase (Yang e Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:4144-8); o promotor do complexo do gene R (Chandler et al (1989) Plant Cell 1:1175-83); o promotor do gene da proteína de ligação a/b de clorofila; CaMV 35S (Patentes U.S. NoS. 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196); FMV 35S (Patentes U.S. Ν°*. 6.051.753 e 5.378.619); um promotor PC1SV (Patente U.S. N°. 5.850.019); o promotor SCP1 (Patente U.S. N°. 6.677.503); e promotores AGRtu.nos (N°. de Acesso GenBank® V00087; Depicker et al (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan et al (1983) Nature 304:184-7).

Em modalidades particulares, moléculas de ácido nucleico da in- venção compreendem um promotor específico de tecido, tal como um promotor específico de raiz. Promotores específicos de raiz direcionam expressão de sequências de codificação operavelmente ligadas exclusivamente ou preferivelmente em tecido de raiz. Exemplos de promotores específicos de raiz são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Patentes U.S. NoS. 5.110,732; 5.459.252 e 5.837.848; e Opperman et al (1994) Science 263:221-3; e Hirel et a/(1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18. Em algumas modalidades, uma sequência ou fragmento de nucleotídeo para controle de peste coleóptera de acordo com a invenção pode ser clonado entre dois promotores específicos de raiz orientados em direções transcripcionais opostas com relação à sequência ou fragmento de nucleotídeo, e que são operáveis em uma célula de planta transgênica e expressos nela para produzir moléculas de RNA na célula de planta transgênica que subsequentemente podem formar moléculas de dsRNA, conforme descrito supra. As moléculas de iRNA expressas em tecidos de planta podem ser ingeridas por uma peste coleóptera de maneira que supressão de expressão de gene-alvo é obtida.

Sequências reguladoras adicionais que podem ser opcionalmente operavelmente ligadas a uma molécula de ácido nucleico de interesse incluem 5'UTRs localizadas entre uma sequência de promotor e uma sequência de codificação que funcionam como uma sequência líder de tradução. A sequência líder de tradução está presente no mRNA integralmente processado, e pode afetar o processamento do transcrito primário e/ou estabilidade do RNA. Exemplos de sequências líderes de tradução incluem líderes de proteína de choque térmico do milho e da petúnia (Patente U.S. N°. 5.362.865), líderes da proteína de revestimento do vírus de planta, líderes de rubisco da planta e outros. Vide, por exemplo, Turner e Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36. Exemplos não limitantes de 5'UTRs incluem GmHsp (Patente U.S. N°. 5.659.122); PhDnaK (Patente U.S. N°. 5.362.865); AtAntl; TEV (Carrington e Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); e AGRtunos (N°. de Acesso GenBank® V00087; e Bevan et al (1983) Nature 304:184-7).

Sequências reguladoras adicionais que podem ser opcionalmen- te operavelmente ligadas a uma molécula de ácido nucleico de interesse também incluem sequências não traduzidas 3', regiões de terminação de transcrição 3' ou regiões de poliadenilação. Esses são elementos genéticos localizados a jusante de uma sequência de nucleotídeo, e incluem polinucle-otídeos que proveem sinal de poliadenilação, e/ou outros sinais reguladores capazes de afetar transcrição ou processamento de mRNA. O sinal de poliadenilação funciona em plantas para causar a adição de nucleotídeos de poliadenilação à extremidade 3' do precursor de mRNA. A sequência de poliadenilação pode ser derivada de uma variedade de genes de planta ou de genes de T-DNA. Um exemplo não limitante de uma região de terminação de transcrição 3' é a região 3' da nopalina sintase (nos 3'; Fraley et al (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803-7). Um exemplo do uso de regiões não traduzidas 3' diferentes é provido em Ingelbrecht et al, (1989) Plant Cell 1:671-80. Exemplos não limitantes de sinais de poliadenilação incluem um de um gene RbcS2 de Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al (1984) EMBOJ. 3:1671-9) e AGRtu.nos (N°. de Acesso no GenBank®N° E01312).

Algumas modalidades podem incluir um vetor de transformação de planta que compreende uma molécula de DNA isolada e purificada compreendendo pelo menos uma das sequências reguladoras descritas acima operavelmente ligada a uma ou mais sequências de nucleotídeo da presente invenção. Quando expressas, a uma ou mais sequências de nucleotídeo resultam em uma ou mais molécula(s) de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa em uma peste coleóptera. Desta maneira, a sequência(s) de nucleotídeo pode compreender um segmento codificando toda ou parte de uma sequência de ribonucleotídeo presente dentro de um transcrito de RNA de peste coleóptera-alvo, e pode compreender repetições invertidas de todo ou uma parte de um transcrito de peste coleóptera-alvo. Um vetor de transformação de planta pode conter sequências especificamente complementares a mais de uma sequência-alvo, desta maneira permitindo produção de mais de um dsRNA para inibição de expressão de dois ou mais genes em células de uma ou mais populações ou espécies de pes- tes coleópteras-alvo. Segmentos de sequência de nucleotídeo especificamente complementar a sequências de nucleotídeo presentes em genes diferentes podem ser combinados em uma molécula de ácido nucleico composta única para expressão em uma planta transgênica. Tais segmentos podem ser contíguos ou separados por uma sequência espaçadora.

Em algumas modalidades, um plasmídeo da presente invenção já contendo pelo menos uma sequência(s) de nucleotídeo da invenção pode ser modificado pela inserção sequencial de sequência(s) de nucleotídeo adicional no mesmo plasmídeo, onde a sequência(s) de nucleotídeo adicional é operavelmente ligada aos mesmos elementos reguladores que a pelo menos uma sequência(s) de nucleotídeo original. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser projetada para a inibição de genes-alvo múltiplos. Em algumas modalidades, os genes múltiplos a serem inibidos podem ser obtidos da mesma espécie de peste coleóptera, o que pode aumentar a eficácia da molécula de ácido nucleico. Em outras modalidades, os genes podem ser derivados de pestes coleópteras diferentes, o que pode ampliar a faixa de pestes coleópteras contra as quais o(s) agente(s) é/são eficazes. Quando genes múltiplos são direcionados para supressão ou uma combinação de expressão e supressão, um elemento de DNA policistrônico pode ser fabricado.

Uma molécula ou vetor de ácido nucleico recombinante da presente invenção pode compreender um marcador selecionável que confere um fenótipo selecionável a uma célula transformada, tal como uma célula de planta. Marcadores selecionáveis podem também ser usados para selecionar plantas ou células de planta que compreendem uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. O marcador pode codificar resistência a biocida, resistência a antibiótico (por exemplo, canamicina, Geneticina (G418), bleomicina, higromicina etc) ou resistência a herbicida (por exemplo, glifosato etc). Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a: um gene neo que codifica resistência à canamicina e pode ser selecionado para uso de canamicina, G418 etc; um gene bar que codifica resistência a bialafos; um gene da EPSP sintase mutante que codifica resistência a glifosato; um gene da nitriiase que confere resistência à bromo-xinila; um gene da acetolactato sintase (ALS) mutante que confere resistência à imidazolinona ou sulfonilureia; e um gene de DHFR resistente a meto-trexato. Marcadores selecionáveis múltiplos estão disponíveis, os quais conferem resistência à ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higro-micina, canamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, es-pectinomicina, rifampicina, estreptomicina e tetraciclina e similar. Exemplos de tais marcadores selecionáveis são ilustrados nas, por exemplo, Patentes U.S. N08. 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e 6.118.047.

Uma molécula de ácido nucleico ou vetor recombinante da presente invenção pode também incluir um marcador que pode ser avaliado. Marcadores que podem ser avaliados podem ser usados para monitorar expressão. Marcadores que podem ser avaliados exemplares incluem um gene da β-glucuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (Jefferson et al (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); um gene de locus-R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos de planta (Dellaporta et al (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." Em 18th Stadler Genetics Svmposium. P. Gustafson e R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82); um gene da β-laçtamase (Sutcliffe et al (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:3737-41); um gene que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogê-nica); um gene da luciferase (Ow et al (1986) Science 234:856-9); um gene xylE que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos (Zukowski et al (1983) Gene 46(2-3):247-55): um gene da amilase (Ikatu et al (1990) Bio/Technol. 8:241-2); um gene da tirosinase que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina em DOPA e dopaquinina que por sua vez condensa em melanina (Katz et al (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); e uma a-galactosidase.

Em algumas modalidades, moléculas de ácido nucleico recom-binantes, conforme descrito, supra, podem ser usadas em métodos para cri- ação de plantas transgênicas e expressão de ácidos nucleicos heterólogos em plantas para preparar plantas transgênicas que exibem suscetibilidade reduzida a pestes coleópteras. Vetores de transformação de planta podem ser preparados, por exemplo, através da inserção de moléculas de ácido nucleico codificando moléculas de iRNA em vetores de transformação de planta e introdução desses em plantas. Métodos adequados para transformação de células hospedeiro incluem qualquer método através do qual DNA pode ser introduzido em uma célula, tal como através de transformação de protoplastos (vide, por exemplo, Patente U.S. N°. 5.508.184), através de absorção de DNA mediada por dissecação/inibição (vide, por exemplo, Potrykus et al (1985) Mol. Gen. Ge-net. 199:183-8), através de eletroporação (vide, por exemplo, Patente U.S. N°. 5.384.253), através de agitação com fibras de carbida de silício (vide, por exemplo, Patentes U.S. N0*5. 5.302.523 e 5.464.765), através de transformação mediada por Agrobacteríum (vide, por exemplo, Patentes U.S. NoS. 5.563.055; 5.591.616; 5.693.512; 5.824.877; 5.981.840 e 6.384.301) e através de aceleração de partículas revestidas com DNA (vide, por exemplo, Patentes U.S. N08. 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160,208; 6.399.861; e 6.403.865) etc. Técnicas que são particularmente úteis para transformação de milho são descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. N°®. 7.060,876 e 5.591.616; e Publicação PCT Internacional WO95/06722. Através da aplicação de técnicas tais como essas, as células de virtualmente qualquer espécie podem ser estavelmente transformadas. Em algumas modalidades, DNA transformante é integrado ao genoma da célula hospedeiro. No caso de espécies multicelulares, células transgênicas podem ser regeneradas em um organismo transgênico. Qualquer uma dessas técnicas pode ser usada para produzir uma planta transgênica, por exemplo, compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico codificando uma ou mais moléculas de iRNA no genoma da planta transgênica. O método mais amplamente utilizado para introdução de um vetor de expressão em plantas é baseado no sistema de transformação natural de Agrobacteríum, A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias do solo pa- togênicas de planta que transformam geneticamente células de planta. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, carregam genes responsáveis pela transformação genética da planta. Os plasmídeos Ti (indução de tumor) contêm um segmento grande, conhecido como T-DNA, que é transferido para plantas transformadas. Outro segmento do plasmídeo Ti, a região Vir, é responsável pela transferência de T-DNA. A região de T-DNA é cercada por repetições terminais. Em vetores binários modificados, os genes de indução de tumor foram deletados, e as funções da região Vir são utilizadas para transferir DNA estranho cercado pelas sequências de borda de T-DNA. A região T pode também conter um marcador selecionável para recuperação eficiente de células e plantas transgênicas, e um sítio de clonagem múltiplo para inserção de sequências para transferência tal como um ácido nucleico de codificação de dsRNA.

Desta maneira, em algumas modalidades, um vetor de transformação de planta é derivado de um plasmídeo Ti de A. tumefaciens (Vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937 e 5.501.967; e Patente Européia N°. EP 0 122 791) ou um plasmídeo Ri de A. rhizogenes. Vetores de transformação de planta adicionais incluem, por e-xemplo e sem limitação, aqueles descritos por Herrera-Estrella et al (1983) Nature 303:209-13; Bevan et al (1983) Nature 304:184-7; Klee et al (1985) Bio/Technol. 3:637-42; e na Patente Européia N°. EP 0 120 516 e aqueles derivados de qualquer um dos acima. Outras bactérias tais como Sinorhizo-bium, Rhizobium e Mesorhizobium que interagem com plantas naturalmente podem ser modificadas para mediar transferência de gene para várias plantas diferentes. Essas bactérias simbióticas associadas à planta podem ser tornadas competentes para transferência de gene através da aquisição de ambos um plasmídeo Ti desarmado e um vetor binário adequado.

Após provisão de DNA exógeno a células recipientes, células transformadas são geralmente identificadas para cultura adicional e regeneração de planta. A fim de aperfeiçoar a habilidade em identificar células transformadas, uma pessoa pode desejar empregar um gene marcador selecionável ou que pode ser avaliado, conforme anteriormente descrito, com o vetor de transformação usado para gerar o transformante. No caso onde um marcador selecionável é usado, células transformadas são identificadas dentro da população de célula potencialmente transformada através da exposição das células a um agente ou agentes seletivos. No caso onde um marcador que pode ser avaliado é usado, as células podem ser avaliadas quanto à característica de gene marcador desejada.

As células que sobrevivem à exposição ao agente seletivo, ou células que foram classificadas positivas em um ensaio de avaliação, podem ser culturadas em meio que apoia regeneração de plantas. Em algumas modalidades, qualquer meio de cultura de tecido de planta adequado (por e-xemplo, meios MS e N6) pode ser modificado através da inclusão de substâncias adicionais, tais como reguladores de crescimento. Tecido pode ser mantido em um meio básico com reguladores de crescimento até que tecido suficiente esteja disponível para começar esforços de regeneração de planta, ou seguindo rodadas repetidas de seleção manual, até que a morfologia do tecido seja adequada para regeneração (por exemplo, pelo menos 2 semanas), então transferido para meios condutores para formação de ramo. As culturas são transferidas periodicamente até que formação de ramo suficiente tenha ocorrido. Uma vez formados os ramos, eles são transferidos para meios condutores de formação de raiz. Uma vez raízes suficientes sendo formadas, as plantas podem ser transferidas para solo para crescimento adicional e maturação.

Para confirmar a presença de uma molécula de ácido nucleico de interesse (por exemplo, uma sequência de DNA codificando uma ou mais sequências de iRNA que inibem expressão de gene-alvo em uma peste coleóp-tera) na regeneração de plantas, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo: ensaios biológicos moleculares, tais como Southern e northem blotting, PCR e sequenciamento de ácido nucleico; ensaios bioquímicos, tal como detecção da presença de um produto de proteína, por exemplo, através de meios imunológicos (ELISA e/ou western blots) ou através de função enzimática; ensaios de parte de planta, tais como ensaios de folha ou raiz; e análise do fenótipo da planta regenerada inteira.

Eventos de integração podem ser analisados, por exemplo, através de amplificação por PCR usando, por exemplo, iniciadores de oligonu-cleotídeo específicos para uma molécula de ácido nucleico de interesse. Genotipificação por PCR é compreendida incluir, mas não ser limitada a, amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) de DNA genômico derivado de tecido de calo de planta hospedeira isolada prevista conter uma molécula de ácido nucleico de interesse integrada ao genoma, seguido por clonagem e análise de sequência padrão de produtos de amplificação por PCR. Métodos de genotipificação por PCR foram bem descritos (por exemplo, Rios, G. et al, (2002) Plant J. 32:243-53) e podem ser aplicados a DNA genômico derivado de qualquer espécie de planta (por exemplo, Z. mays ou G. max) ou tipo de tecido, incluindo culturas de célula.

Uma planta transgênica formada usando métodos de transformação dependentes de Agrobacterium tipicamente contém uma sequência de DNA recombinante única inserida em um cromossomo. A sequência de DNA recombinante única é referida como um "evento transgênico" ou "evento de integração". Tais plantas transgênicas são heterozigotas para a sequência exógena inserida. Em algumas modalidades, uma planta transgênica homozigota com relação a um transgene pode ser obtida através de (auto) acasalamento sexual de uma planta transgênica segregante independente que contém uma sequência de gene exógena única com ela mesma, por exemplo, uma planta T0, para produzir uma semente Ti. Um quarto da semente Tt produzida será homozigoto com relação ao transgene. Semente Ti germinante resulta em plantas que podem ser testadas quanto à heterozigo-sidade, tipicamente usando um ensaio SNP ou um ensaio de amplificação térmica que permite a distinção entre heterozigotos e homozigotos (isto é, um ensaio de zigosidade).

Em modalidades particulares, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais moléculas de iRNA diferentes são produzidas em uma célula de planta que têm um efeito inibidor de peste coleóptera. As moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) podem ser expressas a partir de sequências de ácido nucleico múltiplas introduzidas em eventos de transfor- mação diferentes ou a partir de uma sequência de ácido nucleico única introduzida em um evento de transformação único. Em algumas modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA é expressa sob o controle de um promotor único. Em outras modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA é expressa sob o controle de promotores múltiplos. Moléculas de siR-NA únicas podem ser expressas, as quais compreendem sequências de ácido nucleico múltiplas que são cada uma homólogas para locais diferentes dentro de uma ou mais pestes coleópteras (por exemplo, os loci definidos pela SEQ ID N°:3 e uma ou mais de SEQ ID Ν°*:1, 2, 4-7 e 103-106), ambos em populações diferentes da mesma espécie de peste coleóptera ou em espécies diferentes de pestes coleópteras.

Em adição à transformação direta de uma planta com uma molécula de ácido nucleico recombinante, plantas transgênicas podem ser preparadas cruzando uma primeira planta tendo pelo menos um evento transgênico com uma segunda planta sem tal evento. Por exemplo, uma molécula de ácido recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica uma molécula de iRNA pode ser introduzida em uma primeira linhagem de planta que é condescendente à transformação para produzir uma planta transgênica, planta transgênica que pode ser cruzada com uma segunda linhagem de planta para introduzir a sequência de nucleotídeo que codifica a molécula de iRNA na segunda linhagem de planta. A invenção também inclui produtos de base contendo uma ou mais das sequências da presente invenção. Modalidades particulares incluem produtos de base produzidos a partir de uma planta ou semente recombinante contendo uma ou mais das sequências de nucleotídeo da presente invenção. Um produto de base contendo uma ou mais das sequências da presente invenção pretende incluir, mas não está limitado a, farinhas, óleos, grãos ou sementes moídos ou inteiros de uma planta ou qualquer produto alimentício compreendendo qualquer farinha, óleo ou grão moído ou inteiro de uma planta ou semente recombinante contendo uma ou mais das sequências da presente invenção. A detecção de uma ou mais das sequências da presente invenção em uma ou mais base ou produtos de base compreendidos aqui é de facto evidência que a base ou produto de base é produzido a partir de uma planta transgênica projetada para expressar uma ou mais das sequências de nucleotídeo da presente invenção para o propósito de controle de doença de planta usando métodos de supressão de gene mediada por dsRNA.

Em alguns aspectos, sementes e produtos de base produzidos pelas plantas transgênicas derivadas de células de planta transformadas são incluídos, onde as sementes ou produtos de base compreendem uma quantidade detectável de uma sequência de ácido nucleico da invenção. Em algumas modalidades, tais produtos de base podem ser produzidos, por e-xemplo, através da obtenção de plantas transgênicas e preparação de alimento ou ração a partir das mesmas. Produtos de base compreendendo uma ou mais das sequências de ácido nucleico da invenção incluem, por exemplo e sem limitação: farinhas, óleos, grãos ou sementes moídos ou inteiros de uma planta e qualquer produto alimentício compreendendo qualquer farinha, óleo ou grão moído ou inteiro de uma planta ou semente re-combinante compreendendo uma ou mais das sequências de ácido nucleico da invenção. A detecção de uma ou mais das sequências da invenção em uma ou mais base ou produtos de base é de facto evidência de que a base ou produto de base é produzido a partir de uma planta transgênica projetada para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA da invenção para o propósito de controle de pestes coleópteras.

Em algumas modalidades, uma planta ou semente transgênica compreendendo uma molécula de ácido nucleico da invenção pode também compreende pelo menos outro evento transgênico em seu genoma, incluindo, sem limitação: um evento transgênico a partir do qual é transcrita uma molécula de iRNA se direcionando a um locus em uma peste coleóp-tera outros que não os definidos pelas SEQ ID NoS:1-7 e 103-106 (por e-xemplo e sem limitação, Caf1-180 (Pedido de Patente Internacional PCT N°. PCT/US2011/068062 (depositado em 30 de dezembro de 2011)), Vat-paseC (Pedido de Patente Internacional PCT N°. PCT/US2011/068144 (depositado em 30 de dezembro de 2011)), VatpaseH (Pedido de Patente Internacional PCT N°. PCT/US2011/068162 (depositado em 30 de dezembro de 2011)) e Rho1 (Pedido de Patente Internacional PCT N°. PCT/US2011/068188 (depositado em 30 de dezembro de 2011)); um evento transgênico a partir do qual é transcrita uma molécula de iRNA se direcionando a um gene em um organismo outro que não uma peste coleópte-ra (por exemplo, um nematoide parasítico de planta); um gene codificando uma proteína inseticida (por exemplo, uma proteína inseticida de Bacillus thuringiensis, tal como, por exemplo, Cyr34Ab1 (Pat. U.S. NoS. 6.127.180, 6.624.145 e 6.340.593), Cry35Ab1 (Pat. U.S. NoS. 6.083.499, 6.548.291 e 6.340,593), uma combinação "Cry34/35Ab1" em um evento único (por e-xemplo, evento de milho DAS-59122-7; Pat. U.S. N°. 7.323,.56), Cry3A (por exemplo, Pat. U.S. N°. 7.230.167), Cry3B (por exemplo, Pedido de Patente Internacional PCT N°. PCT/US1999/018883), Cry6A (por exemplo, Pat. U.S. N°. 6.831.062) e suas combinações (por exemplo, Pedidos de Patente Internacionais PCT NoS. PCT/US11/033618 (depositado em 15 de abril 2011), PCT/US11/033618 (depositado em 22 de abril de 2011) e PCT/US11/033617 (depositado em 22 de abril de 2011)); um gene de tolerância a herbicida (por exemplo, um gene provendo tolerância a glifosato, glufosinato, dicamba ou 2,4-D (por exemplo, Patente U.S. N°. 7.838.733)); e um gene contribuindo para um fenótipo desejado na planta transgênica, tal como rendimento aumentado, metabolismo de ácido graxo alterado ou restauração de esterilidade masculina citoplásmica). Em modalidades particulares, sequências codificando moléculas de iRNA da invenção podem ser combinadas com outras características de controle de inseto e doença em uma planta para obter características desejadas para controle aumentado de doença e dano por inseto em planta. Combinação de características de controle de inseto que empregam modos de ação distintos pode prover plantas transgênicas protegidas com durabilidade superior com relação a plantas carregando uma característica de controle única, por exemplo, por causa da probabilidade reduzida que resistência à(s) característi-ca(s) vá se desenvolver no campo. V. Supressão de Gene-alvo em uma Peste Coleóptera A. Visão Geral Em algumas modalidades da invenção, pelo menos uma molécula de ácido nupleico útil para o controle de pestes coleópteras pode ser provida a uma peste coleóptera, onde a molécula de ácido nucleico leva a silenciamento de gene mediado por RNAi na peste coleóptera. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) pode ser provida ao hospedeiro de coleóptera. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pestes coleópteras pode ser provida a uma peste coleóptera através do contado da molécul^ de ácido nucleico com a peste coleóptera. Nessas e em modalidades adicionais, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pestes coleópteras pode ser provida em um substrato de alimentação da peste coleóptera, por exemplo, uma composição nutricional. Nessas e em modalidades adicionais, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pestes coleópteras pode ser provida através da ingestão de um material de planta compreendendo a molécula de ácido nucleico que é ingerida pela peste coleóptera. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico está presente em material de planta através da expressão de uma sequência de ácido nucleico recombinante introduzida no material de planta, por exemplo, através da transformação de uma célula de planta com um vetor compreendendo a sequência de ácido nucleico recombinante e regeneração de um material de planta ou planta inteira a partir da célula de planta transformada. B. Supressão de Gene-alvo mediada por RNAi Em modalidades, a invenção provê moléculas de iRNA (por e-xemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) que podem ser projetadas para se direcionarem a sequências-alvo de nucleotídeo nativas essenciais (por e-xemplo, genes essenciais) no transcriptoma de uma peste coleóptera (por exemplo, WCR ou NCR), por exemplo, através do projeto de uma molécula de iRNA que compreende pelo menos um filamento compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar à sequên-cia-alvo. A sequência de uma molécula de iRNA então projetada pode ser idêntica à sequência-aívo ou pode incorporar incompatibilidades que não previnem hibridização específica entre a molécula de iRNA e sua sequência-alvo.

As moléculas de iRNA da invenção podem ser usadas em métodos para supressão de gene em uma peste coleóptera, desta maneira reduzindo o nível ou incidência de dano causado pela peste em uma planta (por exemplo, uma planta transformada protegida compreendendo uma molécula de iRNA). Conforme aqui usado, o termo "supressão de gene" refere-se a qualquer um dos métodos bem conhecidos para redução dos níveis de uma proteína produzida como um resultado de transcrição de gene para mRNA e subsequente tradução do mRNA, incluindo a redução de expressão de proteína de um gene ou uma sequência de codificação incluindo inibição pós-transcripcional de expressão e supressão transcripcional. Inibição pós-transcripcional é mediada por homologia específica entre todo ou uma parte de um mRNA transcrito a partir de um gene direcionado para supressão e a molécula de iRNA correspondente usada para supressão. Ainda, inibição pôs-transcripcional refere-se à redução substancial e mensurável da quantidade de mRNA disponível na célula para ligação por ribossomos.

Em modalidades onde uma molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA, a molécula de dsRNA pode ser clivada pela enzima, DICER, em moléculas de siRNA curtas (aproximadamente 20 nucleotídeos de comprimento). A molécula de siRNA de filamento duplo gerada pela atividade de DICER sobre a molécula de dsRNA pode ser separada em duas siRNAs de filamento simples; o "filamento passageiro" e o "filamento guia". O filamento passageiro pode ser degradado, e o filamento guia pode ser incorporado a RISC. Inibição pós-transcripcional ocorre através de hibridização específica do filamento guia com uma sequência especificamente complementar de uma molécula de mRNA, e subsequente divagem pela enzima, Argonauta (componente catalítico do complexo RISC).

Em modalidades da invenção, qualquer forma de molécula de iRNA pode ser usada. Aqueles de habilidade na técnica vão compreender que as moléculas de dsRNA tipicamente são mais estáveis durante prepara- ção e durante a etapa de provisão da molécula de iRNA a uma célula do que são moléculas de RNA de filamento simples, e são tipicamente também mais estáveis em uma célula. Desta maneira, embora moléculas de siRNA e miRNA, por exemplo, possam ser igualmente eficazes em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser escolhida devido à sua estabilidade.

Em modalidades particulares, uma molécula de ácido nucleico é provida, a qual compreende uma sequência de nucleotídeo, sequência de nucleotídeo que pode ser expressa in vitro para produzir uma molécula de iRNA que é substancialmente homóloga a uma molécula de ácido nucleico codificada por uma sequência de nucleotídeo dentro do genoma de uma peste coleóptera. Em certas modalidades, a molécula de iRNA transcrita in vitro pode ser uma molécula de dsRNA estabilizada que compreende uma estrutura haste-alça. Após uma peste coleóptera contatar a molécula de iRNA transcrita in vitro, inibição pós-transcripcional de um gene-alvo na peste coleóptera (por exemplo, um gene essencial) pode ocorrer.

Em algumas modalidades da invenção, expressão de uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeo é usada em um método para inibição pós-transcripcional de um gene-alvo em uma peste coleóptera, onde a sequência de nucleotídeo é selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID N°:3; o complemento de SEQ ID N°:3; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:3; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:3; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID N°:3; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:3; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:3; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:3; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica {por e-xemplo, WCR) compreendendo SEQ ID N°:3; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:3; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:3; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:3. Em certas modalidades, expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100% e 100%) com qualquer uma das acima pode ser usada. Nessas e em modalidades adicionais, uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa, a qual hibridiza especificamente para uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma peste coleóp-tera.

Em algumas modalidades, expressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotideo pode ser usada em um método para inibição pós-transcripcional de um gene-alvo em uma peste coleóptera, onde a sequência de nucleotideo é selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID N°:1; o complemento de SEQ ID N°:1; SEQ ID N°:2; o complemento de SEQ ID N°:2; SEQ ID N°:4; o complemento de SEQ ID N°:4; SEQ ID N°:5; o complemento de SEQ ID N°:5; SEQ ID N°:6; o complemento de SEQ ID N°:6; SEQ ID N°:7; o complemento de SEQ ID N°:7; SEQ ID N°:103; o complemento de SEQ ID N°:103; SEQ ID N°:104; o complemento de SEQ ID N°:104; SEQ ID N°:105; o complemento de SEQ ID N°:105; SEQ ID N°:106; o complemento de SEQ ID N°:106; um fragmento de pelo menos 19 núcleo- tídeos contíguos de qualquer uma de SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e 103-106; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma de SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e 103-106; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma de SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e 103-106; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica {por e-xemplo, WCR) compreendendo qualquer uma de SEQ ID Ν°*:1, 2, 4-7 e 103-106; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID Ν°*:1, 2, 4-7 e 103-106; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e 103-106; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica {por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma de SEQ ID N°®:1, 2, 4-7 e 103-106; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e 103-106; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e 103-106; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NoS:1, 2, 4-7 e 103-106. Em certas modalidades, expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100% e 100%) com qualquer uma das acima pode ser usada. Nessas e em modalidades adicionais, uma molécula de áci- do nucleico pode ser expressa, a qual hibridiza especificamente para uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma peste coleóp-tera. Em exemplos particulares, tal molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ IDNoS:99-102 e 107. É uma característica importante de algumas modalidades da invenção que o sistema de inibição pós-transcripcional de RNAi seja capaz de tolerar variações de sequência dentre os genes-alvo que poderiam ser esperadas devido à mutação genética, polimorfismo de linhagem ou divergência evolucionária. A molécula de ácido nucleico introduzida pode não precisar ser absolutamente homóloga ou a um produto de transcrição primário ou um mRNA integralmente processado de um gene-alvo, contanto que a molécula de ácido nucleico introduzida seja especificamente hibridizável ou para um produto de transcrição primário ou um mRNA integralmente processado do gene-alvo. Além disso, a molécula de ácido nucleico introduzida pode não precisar ser de comprimento integral, com relação ou a um produto de transcrição primário ou um mRNA integralmente processado do gene-alvo.

Inibição de um gene-alvo usando a tecnologia de iRNA da presente invenção é específica de sequência, isto é, sequências de nucleotídeo substancialmente homólogas à(s) molécula(s) de iRNA são direcionadas para inibição genética. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo idêntica a uma porção de uma sequência de gene-alvo pode ser usada para inibição. Nessas e em modalidades adicionais, uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo com uma ou mais inserção, deleção e/ou mutações por ponto com relação a uma sequência de gene-alvo pode ser usada. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA e uma porção de um gene-alvo podem compartilhar, por exemplo, pelo menos de a partir de cerca de 80%, pelo menos de a partir de cerca de 81%, pelo menos de a partir de cerca de 82%, pelo menos de a partir de cerca de 83%, pelo menos de a partir de cerca de 84%, pelo menos de a partir de cerca de 85%, pelo menos de a partir de cerca de 86%, pelo menos de a partir de cerca de 87%, pelo menos de a partir de cerca de 88%, pelo menos de a partir de cerca de 89%, pelo menos de a partir de cerca de 90%, pelo menos de a partir de cerca de 91%, pelo menos de a partir de cerca de 92%, pelo menos de a partir de cerca de 93%, pelo menos de a partir de cerca de 94%, pelo menos de a partir de cerca de 95%, pelo menos de a partir de cerca de 96%, pelo menos de a partir de cerca de 97%, pelo menos de a partir de cerca de 98%, pelo menos de a partir de cerca de 99%, pelo menos de a partir de cerca de 100% e 100% de identidade de sequência. Alternativamente, a região de duplex de uma molécula de dsRNA pode ser especificamente hibridizável com uma porção de um transcrito de gene-alvo. Em moléculas especificamente hibridizáveis, uma sequência de comprimento menos do que integral exibindo uma homologia maior compensa uma sequência menos homóloga, mais longa. O comprimento da sequência de nucleotídeo de uma região duplex de uma molécula de dsRNA que é idêntica a uma porção de um transcrito de gene-alvo pode ser de pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ou pelo menos cerca de 1000 bases. Em algumas modalidades, uma sequência maior do que 20-100 nucleotídeos pode ser usada. Em modalidades particulares, uma sequência maior do que cerca de 200-300 nucleotídeos pode ser usada. Em modalidades particulares, uma sequência maior do que cerca de 500-1000 nucleotídeos pode ser usada, dependendo do tamanho do gene-alvo.

Em certas modalidades, expressão de um gene-alvo em uma peste coleóptera pode ser inibida em pelo menos 10%; pelo menos 33%; pelo menos 50%; ou pelo menos 80% dentro de uma célula da peste coleóptera, de maneira que uma inibição significante acontece. Inibição significante refere-se à inibição em um limiar que resulta em um fenótipo detectável (por exemplo, parada de crescimento, alimentação, desenvolvimento, mortalidade etc) ou uma diminuição detectável em RNA e/ou produto de gene correspondendo ao gene-alvo sendo inibido. Embora em certas modalidades da invenção inibição ocorra em substancialmente todas as células da peste coleóptera, em outras modalidades inibição ocorre apenas em um subconjunto de células expressando o gene-alvo.

Em algumas modalidades, supressão transcripcional é mediada pela presença em uma célula de uma molécula de dsRNA exibindo identidade de sequência substancial com uma sequência de DNA de promotor ou o seu complemento para realizar o que é referido como "supressão trans de promotor". Supressão de gene pode ser eficaz contra genes-alvo em uma peste coleóptera que pode ingerir ou contatar tais moléculas de dsRNA, por exemplo, através da ingestão ou contato do material de planta contendo as moléculas de dsRNA. Moléculas de dsRNA para uso em supressão trans de promotor podem ser especificamente projetadas para inibir ou suprimir a expressão de uma ou mais sequências homólogas ou complementares nas células da peste coleóptera. Supressão de gene pós-transcripcional por RNA orientado de antissentido ou sentido para regular expressão de gene em células de planta é descrita nas Patentes U.S. N055. 5.107.065; 5.759.829; 5.283.184; e 5.231.020, C. Expressão de Moléculas de iRNA Providas a uma Peste Coleóptera Expressão de moléculas de iRNA para inibição de gene mediada por RNAi em uma peste coleóptera pode ser realizada em qualquer um de muitos formatos in vitro ou in vivo. As moléculas de iRNA podem ser então providas a uma peste coleóptera, por exemplo, através do contato das moléculas de iRNA com a peste, ou fazendo com que a peste ingira ou de outra maneira internalize as moléculas de iRNA. Algumas modalidades da invenção incluem plantas hospedeiro transformadas de uma peste coleóptera, células de planta transformadas e progênie de plantas transformadas. As células de planta transformadas e as plantas transformadas podem ser en-genheiradas para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA, por e-xemplo, sob o controle de um promotor heterólogo, para prover um efeito protetor contra peste. Desta maneira, quando uma planta ou célula de planta transgênica é consumida por uma peste coleóptera durante alimentação, a peste pode ingerir moléculas de iRNA expressas nas plantas ou células transgênicas. As sequências de nucleotídeo da presente invenção podem ser também introduzidas em uma ampla variedade de hospedeiros de microorganismos procarióticos e eucarióticos para produzir moléculas de iRNA. O termo "microorganismo" inclui espécies procarióticas e eucarióticas, tais como bactérias e fungos.

Modulação de expressão de gene pode incluir supressão parcial ou completa de tal expressão. Em outra modalidade, um método para supressão de expressão de gene em uma peste coleóptera compreende provisão no tecido do hospedeiro da peste de uma quantidade supressiva de gene de pelo menos uma molécula de dsRNA formada seguindo transcrição de uma sequência de nucleotídeo conforme aqui descrito, cujo pelo menos um segmento é complementar a uma sequência de mRNA dentro das células da peste coleóptera. Uma molécula de dsRNA, incluindo sua forma modificada tal como uma molécula de siRNA, miRNA ou hpRNA, ingerida por uma peste coleóptera de acordo com a invenção pode ser de pelo menos a partir de cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou cerca de 100% idêntica a uma molécula de RNA transcrita a partir de uma molécula de ácido nu-cleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NoS:1-7 e 103-106. Moléculas de ácido nucleico isoladas e substancialmente purificadas incluindo, mas não limitado a, sequências de nucleotídeo de ocorrência não natural e construtos de DNA recombi-nante para provisão de moléculas de dsRNA da presente invenção são então providas, as quais suprimem ou inibem a expressão de uma sequência de codificação endógena ou uma sequência de codificação-alvo na peste coleóptera quando introduzidas na mesma.

Modalidades particulares proveem um sistema de aplicação para aplicação de moléculas de iRNA para a inibição pós-transcripcional de um ou mais gene(s)-alvo em uma peste de planta coleóptera e controle de uma população de uma peste de planta coleóptera. Em algumas modalidades, o sistema de aplicação compreende ingestão de uma célula de planta transgênica hospedeira ou teores da célula hospedeira compreendendo moléculas de RNA transcritas na célula hospedeira. Nessas e em modalidades adicionais, uma célula de planta transgênica ou planta transgênica é criada, a qual contém um construto de DNA recombinante provendo uma molécula de dsRNA estabilizada da invenção. Células de planta transgêni-cas e plantas transgênicas compreendendo sequências de ácido nucleico codificando uma molécula de iRNA particular podem ser produzidas empregando tecnologias de DNA recombinante (cujas tecnologias básicas são bem conhecidas na técnica) para construir um vetor de transformação de planta compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando uma molécula de iRNA da invenção (por exemplo, uma molécula de dsRNA estabilizada); para transformar uma célula de planta ou planta; e para gerar a célula de planta transgênica ou a planta transgênica que contém a molécula de iRNA transcrita.

Para fornecer resistência à peste coleóptera a uma planta transgênica, uma molécula de DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrita em uma molécula de iRNA, tal como uma molécula de dsRNA, uma molécula de siRNA, uma molécula de miRNA ou uma molécula de hpRNA. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA transcrita a partir de uma molécula de DNA recombinante pode formar uma molécula de dsRNA dentro dos tecidos ou fluidos da planta recombinante. Tal molécula de dsRNA pode ser compreendida em parte de uma sequência de nucleotídeo que é idêntica a uma sequência de nucleotídeo correspondente transcrita a partir de uma sequência de DNA dentro de uma peste coleóptera de um tipo que pode infestar a planta hospedeira. Expressão de um gene-alvo dentro da peste-alvo é suprimida pela molécula de dsRNA ingerida ou de outra maneira contatada, e a supressão de expressão de um gene-alvo na peste coleóptera resulta em, por exemplo, parada da alimentação pela peste coleóptera, com um último resultando sendo, por exemplo, que a planta transgênica é protegida de dano adicional pela peste coleóptera. Os efeitos moduladores de moléculas de dsRNA foram mostrados ser aplicáveis a uma variedade de genes expressos em pestes incluindo, por exemplo, genes endógenos responsáveis por metabolismo celular ou transformação celular, incluindo genes controladores; fatores de transcrição; genes relacionados à muda; e outros genes que codificam polipeptídeos envolvidos em metabolismo celular ou crescimento e desenvolvimento normais.

Para transcrição a partir de um transgene in vivo ou um constru-to de expressão, uma região reguladora (por exemplo, promotora, aumenta-dora, silenciadora ou de sinal de poliadenilação) pode ser usada em algumas modalidades para transcrever o filamento de RNA (ou filamentos). Desta maneira, em algumas modalidades, conforme mostrado, supra, uma sequência de nucleotídeo para uso na produção de moléculas de iRNA pode ser operavelmente ligada a uma ou mais sequências promotoras funcionais em uma célula hospedeiro de planta. O promotor pode ser um promotor en-dógeno, normalmente residente no genoma do hospedeiro. A sequência de nucleotídeo da presente invenção, sob o controle de uma sequência de promotor operavelmente ligada, pode ser ainda flanqueada por sequências adicionais que vantajosamente afetam sua transcrição e/ou a estabilidade de um transcrito resultante. Tais sequências podem estar localizadas a montante do promotor operavelmente ligado, a jusante da extremidade 3' do cons-truto de expressão e podem ocorrer ambos a montante do promotor e a jusante da extremidade 3' do construto de expressão.

Algumas modalidades proveem métodos para redução do dano a uma planta hospedeira (por exemplo, uma planta de milho) causado por uma peste coleóptera que se alimenta da planta, onde o método compreende provisão na planta hospedeira de uma célula de planta transformada expressando pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção, onde a(s) molécula(s) de ácido nucleico funciona(m) quando sendo absorvida(s) pela peste coleóptera para inibir a expressão de uma sequência-alvo dentro da peste coleóptera, inibição da expressão que resulta em mortalidade, crescimento reduzido e/ou reprodução reduzida da peste coleóptera, desta maneira reduzindo o dano à planta hospedeira causado pela peste coleóptera. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido nucleico compreendem moléculas de dsRNA. Nessas e em modalidades adicionais, a(s) molé-cula(s) de ácido nucleico compreendem moléculas de dsRNA que compreendem cada uma mais de uma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável para uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de peste coleóptera. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido nucleico consiste(m) em uma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável para uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de peste coleóptera.

Em algumas modalidades, um método para aumento do rendimento de uma cultura de milho é provido, onde o método compreende introdução em uma planta de milho de pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção; cultivo da planta de milho para permitir a expressão de uma molécula de iRNA compreendendo a sequência de ácido nucleico, onde expressão de uma molécula de iRNA compreendendo a sequência de ácido nucleico inibe dano pela e/ou crescimento da peste coleóptera, desta maneira reduzindo ou eliminando uma perda de rendimento devido à infestação por peste coleóptera. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nessas e em modalidades adicionais, a(s) molécula(s) de ácido nucleico compreende(m) moléculas de dsRNA que compreendem cada uma mais de uma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável para uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de peste coleóptera. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido nucleico consiste(m) em uma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável para uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de peste coleóptera.

Em algumas modalidades, um método para modulação da expressão de um gene-alvo em uma peste coleóptera é provido, o método compreendendo: transformação de uma célula de planta com um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção, onde a sequência de nucleotídeo é operavelmente ligada a um promotor e uma sequência de terminação de transcrição; cultura da célula de planta transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de célula de planta incluindo uma pluralidade de células de planta transformadas; seleção de células de planta transformadas que integraram a molécula de ácido nucleico em seus genomas; avaliação das células de planta transformadas quanto à expressão de uma molécula de iRNA codificada pela molécula de ácido nuclei- co integrada; seleção de uma célula de planta transgênica que expressa a molécula de iRNA; e alimentação da célula de planta transgênica selecionada à peste coleóptera. Plantas podem também ser regeneradas a partir de células de planta transformadas que expressam uma molécula de iRNA codificada pela molécula de ácido nucleico integrada. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nessas e em modalidades adicionais, a(s) molécula(s) de ácido nucleico compreende(m) moléculas de dsRNA que compreendem cada uma mais de uma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável para uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de peste coleóptera. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido nucleico consiste(m) em uma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável para uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de peste coleóptera.

Moléculas de iRNA da invenção podem ser incorporadas dentro das sementes de uma espécie de planta (por exemplo, milho), ou como um produto de expressão a partir de um gene recombinante incorporado a um genoma das células de planta, ou incorporadas a um revestimento ou tratamento de semente que é aplicado à semente antes do plantio. Uma célula de planta compreendendo um gene recombinante é considerada ser um evento transgênico. Também incluídos nas modalidades da invenção estão sistemas de aplicação para a aplicação de moléculas de iRNA a pestes coleópteras. Por exemplo, moléculas de iRNA da invenção podem ser diretamente introduzidas nas células de uma peste coleóptera. Métodos para introdução podem incluir mistura direta de iRNA com tecido de planta de um hospedeiro para a peste coleóptera, bem como aplicação de composições compreendendo moléculas de iRNA da invenção a tecido de planta hospedeira. Por exemplo, moléculas de iRNA podem ser pulverizadas sobre a superfície de uma planta. Alternativamente, uma molécula de iRNA pode ser expressa por um microorganismo, e o microorganismo pode ser aplicado sobre a superfície da planta, ou introduzido em uma raiz ou caule através de um meio físico tal como injeção. Conforme discutido, supra, uma planta transgênica pode também ser geneticamente engenheirada para expressar pelo menos uma molécula de iRNA em uma quantidade suficiente para matar as pestes coleópteras conhecidas infestar a planta. Moléculas de iRNA produzidas através de síntese química ou enzimática podem ser também formuladas de uma maneira consistente com práticas agricul-turais comuns, e usadas como produtos para pulverização para controle de dano à planta por uma peste coleóptera. As formulações podem incluir os agentes de pegajosidade e umectantes apropriados requeridos para cobertura de folhagem eficiente, bem como protetores de UV para proteger moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) de dano por UV. Tais aditivos são geralmente usados na indústria bioinseticida, e são bem conhecidos daqueles versados na técnica. Tais aplicações podem ser combinadas com outras aplicações de inseticida de pulverização (biologicamente baseado ou outra maneira) para aumentar a proteção da planta contra pestes coleópteras.

Todas as referências, incluindo publicações, patentes e pedidos de patente, mencionadas aqui são incorporadas a título de referência até o ponto que elas não sejam inconsistentes com os detalhes explícitos da presente invenção, e são então incorporadas até o mesmo ponto que se cada referência fosse individualmente e especificamente indicada ser incorporada a título de referência e fosse mostrada em sua totalidade aqui. As referências discutidas aqui são providas apenas quanto à sua descrição antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui deve ser considerado como uma admissão que os inventores não estão autorizados a antedatar tal descrição em virtude da invenção anterior.

Os exemplos que seguem são providos para ilustrar certas características e/ou aspectos particulares. Esses exemplos não devem ser considerados limitar a descrição às características ou aspectos particulares descritos.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Materiais e Métodos Preparação e Bioensaios de Amostra. Várias moléculas de dsRNA (incluindo aquelas correspondendo a PP1-87B, RPA70 Regí, RPA70 Reg2, RPA70 REg3 e RPS6) foram sintetizadas e purificadas usando um estojo de RNA MEGAscrípt®. As moléculas de dsRNA purificadas foram preparadas em tampão de TE, e todos os bio-ensaios continham um tratamento controle consistindo neste tampão, que serviu como uma checagem de base quanto à mortalidade ou inibição de crescimento WCR. As concentrações de moléculas de dsRNA no tampão de bioensaio foram medidas usando um espectrofotômetro NanoDrop® 8000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE).

As amostras foram testadas quanto à atividade em inseto em bi-oensaios conduzidos com larvas de inseto neonatais sob dieta de inseto artificial. Ovos de WCR foram obtidos da Crop Characteristics, Inc. (Farmington, MN).

Os bioensaios foram conduzidos em bandejas de plástico de 128 cavidades especificamente projetadas para bioensaios de inseto (C-D International, Pitman, NJ). Cada cavidade continha aproximadamente 1,0 mL de uma dieta feita para crescimento de insetos coleópteros. Uma alíquota de 60 μΙ_ de amostra de dsRNA foi aplicada através de pipeta sobre a superfície da dieta de 1,5 cm2 de cada cavidade (40 pL/cm2). Concentrações de amostra de dsRNA foram calculadas como a quantidade de dsRNA por centímetro quadrado (ng/cm2) de área de superfície na cavidade. As bandejas tratadas foram mantidas em uma capela até que o líquido na superfície da dieta evaporasse ou fosse absorvido na dieta.

Dentro de algumas horas da eclosão, larvas individuais foram pegas com uma escova de cabelo de camelo umedecida e depositadas sobre a dieta tratada (uma ou duas larvas por cavidade). As cavidades infestadas das bandejas de plástico de 128 cavidades foram então vedadas com folhas adesivas ou plástico transparente e ventiladas para permitir troca de gás. Bandejas de bioensaio foram mantidas sob condições ambientais controladas (28°C, -40% de Umidade Relativa, 16:8 (Luz:Escuro)) por 9 dias, após o que o número total de insetos expostos a cada amostra, o número de insetos mortos e o peso de insetos sobreviventes foram registrados. A mortalidade percentual, pesos vivos médios e inibição de cresci- mento foram calculados para cada tratamento. Atrofia foi definida como uma diminuição em pesos vivos médios. Inibição de crescimento (Gl) foi calculada como segue: Gl = [1 - (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)] onde TWIT é o Peso Total de Insetos Vivos no Tratamento; TNIT é o Número Total de Insetos no Tratamento; TWIBC é o Peso Total de Insetos Vivos na Checagem de Base (Controle de tampão); e TNIBC é o Número Total de Insetos na Checagem de Base (Controle de tampão). A GI50 é determinada ser a concentração de amostra na dieta na qual o valor de Gl é 50%. A LC50 (Concentração Letal 50%) é registrada como a concentração de amostra na dieta na qual 50% de insetos de teste são mortos. Análise estatística foi feita usando software JMP® (SAS, Cary, NC).

Bioensaios replicados demonstraram que ingestão de amostras particulares resultou em mortalidade e inibição surpreendentes e inesperadas de crescimento de larvas da lagarta da raiz do milho. EXEMPLO 2: Identificação de Genes-alvo Candidatos Estágios múltiplos de desenvolvimento de WCR (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) foram selecionados para análise do transcriptoma agrupada para prover sequências de gene-alvo candidatas para controle através da tecnologia de resistência a inseto de planta transgênica RNAi. RNA total foi isolado de a partir de cerca de 0,9 g de larvas de WCR de primeiro estágio inteiras (Diabrotica virgifera virgifera LeConte; 4 a 5 dias pós-eclosão, mantida a 16° C) e purificado usando o método baseado em fenol/TRI REAGENT® que segue (Molecular Research Center, Cincinna-ti; OH; N°. Cat. TR 118): as larvas foram homogeneizadas em temperatura ambiente em um homogeneizador de 15 mL com 10 mL de TRI REAGENT® até que uma suspensão homogênea foi obtida. Seguindo 5 minutos de incubação em temperatura ambiente, o homogenato foi despejado em tubos encaixe perfilado de 1,5 mL (1 mL por tubo), 200 pL de clorofórmio foram adicionados e a mistura foi vigorosamente agitada por 15 segundos. Depois de deixar a extração sedimentar em temperatura ambiente por 10 minutos, as fases foram separadas através de centrifugação a 12.000 x g a 4°C. A fase superior (compreendendo cerca de 0,6 mL) foi cuidadosamente transferida para outro tubo de 1,5 mL estéril, e um volume igual (0,6 mL) de isopropanol em temperatura ambiente foi adicionado. Depois de incubação em temperatura ambiente por 5 a 10 minutos, a mistura foi centrifugada 8 minutos a 12.000 x g (4°C ou 25°C). O sobrenadante foi cuidadosamente removido e descartado, e o pelete de RNA foi lavado duas vezes através de vórtex com etanol 75%, com recuperação através de centrifugação por 5 minutos a 7.500 x g (4°C ou 25°C) após cada lavagem. O etanol foi cuidadosamente removido, o pelete foi deixado secar ao ar por 3 a 5 minutos e então foi dissolvido em água estéril livre de nuclease. Concentração de RNA foi determinada através da medição da absorbância (A) a 260 nm e 280 nm. Uma extração típica de a partir de cerca de 0,9 g de larvas deu mais de 1 mg de RNA total, com uma razão A260/A280 de 1,9. O RNA então extraído foi armazenado a -80°C até ser processado mais. A qualidade do RNA foi determinada através da passagem de uma alíquota através de gel de agarose 1%. A solução de gel de agarose foi feita usando tampão TAE 10x autoclavado (EDTA Tris-acetato, concentração 1x é Tris-acetato 0,04M, EDTA 1 mM (sal de sódio do ácido etilenodiamino tetra-acético), pH 8,0) diluído com água tratada com DEPC (dietil pirocarbonato) em um recipiente autoclavado. TAE 1x foi usado como o tampão contínuo. Antes do uso, o tanque de eletroforese e o pente de formação de cavidade foram limpos com RNAseAway® (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Dois pL de amostra de RNA fora misturados com 8 pL de tampão TE (Tris HCI 10 mM pH 7,0; EDTA 1 mM) e 10 pL de tampão de amostra de RNA (Novagen® N°. Catálogo 70606; EMD4 Bioscience, Gibbstown, NJ). A amostra foi aquecida a 70°C por 30 minutos, esfriada para temperatura ambiente e 5 pL (contendo 1 pg a 2 pg de RNA) foram carregados por cavidade. Marcadores de peso molecular de RNA comer- cialmente disponíveis foram simultaneamente administrados em cavidades separadas para comparação de tamanho molecular. O gel foi administrado a 60 v por duas horas.

Uma biblioteca de cDNA normalizada foi preparada a partir do RNA total larval por um provedor de serviço comercial (Eurofins MWG Ope-ron, Huntsville, AL), usando preparação aleatória. A biblioteca de cDNA larval normalizada foi sequenciada em escala de placa V* através de química de série GS FLX 454 Titanium® da Eurofins MWG Operon, que resultou em mais de 600.000 leituras com um comprimento de leitura médio de 348 pb. 350.000 leituras foram reunidas em mais de 50.000 contíguas. Ambas as leituras não reunidas e as contíguas foram convertidas em bancos de dados BLASTable usando o programa publicamente disponível, FORMATDB (disponível da NCBI).

Bibliotecas de RNA total e cDNA normalizado foram similarmente preparadas a partir de materiais coletados em outros estágios desenvol-vimentais de WCR. Uma biblioteca de transcriptoma agrupado para avaliação de gene-alvo foi construída combinando membros da biblioteca de cDNA representando os vários estágios desenvolvidos.

Genes candidatos para direcionamento de RNAi foram selecionados usando informação com relação a efeitos de RNAi letais de genes particulares em outros insetos tais como Drosophila e Tribolium. Esses genes foram hipotetizados ser essenciais para sobrevivência e crescimento em insetos coleópteros. Homólogos de gene-alvo selecionado foram identificados no banco de dados de sequência de transcriptoma conforme descrito abaixo. Sequências de comprimento integral ou parcial dos genes-alvo foram amplificadas através de PCR para preparar moldes para produção de RNA de filamento duplo (dsRNA).

Pesquisas TBLASTN usando sequências de codificação de proteína candidatas foram realizadas contra bancos de dados BLASTable contendo as leituras de sequência de Diabrotica não reunidas ou os contíguas reunidas. As mais significantes para uma sequência de Diabrotica (definidas como melhores do que e'20 para homologias contíguas e melhores do que e' 10 parà homologias de leituras de sequência não reunidas) foram confirmadas usando BLASTX contra o banco de dados não redundante NCBI. Os resultados desta pesquisa BLASTX confirmaram que as sequências de gene candidatas homólogas de Diabrotica identificadas na pesquisa TBLASTN na verdade compreendiam genes de Diabrotica ou foram as melhores disponíveis n$s sequências de Diabrotica para a sequência de gene candidata não Diabrôtica. Na maioria dos casos, genes candidatos de Tribolium que foram registrados como codificando uma proteína deram uma homologia de sequência sem ambiguidade para uma sequência ou sequências nas sequências dfe transcriptoma de Diabrotica. Em poucos casos, ficou claro que algumas das leituras de sequência contíguas ou não reunidas de Diabrotica selecionadas através de homologia com um gene não Diabrotica candidato se sobrepuseram, e que a montagem das contíguas tinha falhado em se unir a essas sobreposições. Nesses casos, Sequencher® v4.9 (Gene Codes Cor-poratibn, Ann. Arbor, Ml) foi usado para montar as sequências em contíguas maiores.

Uma pluralidade de genes-alvo candidatos foi identificada como genes que podem levar à mortalidade ou inibição de crescimento, desenvolvimento ou reprodução de peste coleóptera em WCR, incluindo SEQ ID NoS:1-|7. Clones de comprimento integral ou parciais de sequências de homólogos de gene candidato de Diabrotica foram usados para gerar amplicons de P0R para síntese de dsRNA. A SEQ ID N°:1 compreende uma sequência codificando uma proteína fosfatase proteína (daqui em diante referida como PP1-87B), que corresponde a uma subunidade catalítica de proteína fosfatase específica de serinà/treonina, metalo dependente. A SEQ ID N°:2 compreende uma sequência codificando uma proteína RPA70 (daqui em diante referida como RPA70), que corresponde à proteína de Replicação A-70, uma subunidade de uma proteína de ligação de DNA de filamento simples. A SEQ ID N°:3 representa contig0011_87B, um fragmento de uma região de codificação para uma proteína fosfatase PP1-87B. A SEQ ID N°:4 representa D_vir_c43870_RPA70, um fragmento de uma região de codificação para uma proteína RPA70 e referida aqui como região 1 de RPA ou RPA70 Regí. A SEQ ID N°:5 representa D_vir_c18764_RPA70, um fragmento de uma região de codificação para uma proteína RPA70 e referida aqui como RPA70 Reg2. A SEQ ID N°:6 representa D_vir_c7971_RPA70, um fragmento de uma região de codificação para uma proteína RPA70 e referida aqui como RPA70 Reg3. A SEQ ID N°:7 compreende uma sequência codificando uma proteína RPS6, que é Proteína Ribossomal S-6. EXEMPLO 3: Amplificação de Genes-alvo Os iniciadores foram projetados para amplificar porções de regiões de codificação de cada gene-alvo através de PCR. Vide Tabela 1. Onde apropriado, uma sequência de promotor de fago T7 (TTAATACGACTCAC-TATAGGGAGA (SEQ ID N°:8)) foi incorporada às extremidades 5' dos filamentos de sentido e antissentido amplificados. Vide Tabela 1. RNA total foi extraído de WCR, e cDNA de primeiro filamento foi usado como molde para reações de PCR usando iniciadores opostos posicionados para amplificar toda ou parte da sequência de gene-alvo nativa.

Tabela 1. Iniciadores e Pares de Iniciador usados para amplificar porções de regiões de codificação de genes-alvo exemplares. EXEMPLO 4: Construtos de RNAi Preparação de molde através de PCR e síntese de dsRNA A estratégia usada para prover moldes específicos para produção de dsRNA é mostrada na figura 1. DNAs de molde pretendidos para uso em síntese de dsRNA foram preparados através de PCR usando os pares de iniciador na Tabela 1 e (como molde de PCR) cDNA de primeiro filamento preparado a partir de RNA total isolado de larvas de primeiro estágio de WCR. Para cada região de gene-alvo selecionado, duas amplificações por PCR separadas foram realizadas. A primeira amplificação por PCR introduziu uma sequência de promotor T7 na extremidade 5' dos filamentos de sentido amplificados. A segunda reação incorporou a sequência de promotor T7 nas extremidades 5' dos filamentos de antissentido. Os dois fragmentos amplificados por PCR para cada região dos genes-alvo foram então misturados em quantidades aproximadamente iguais, e a mistura foi usada como molde de transcrição para produção de dsRNA. figura 1. As sequências dos moldes de dsRNA amplificados com os iniciadores particulares foram: SEQ ID N°:25 (PP1-87B); SEQ ID N°:26 (RPA70 Reg2); SEQ ID N°:27 (RPA70 Reg3) e SEQ ID N°:28 (RPS6). RNA de filamento duplo foi sintetizado e purificado usando um estojo de RNAi Ambion® MEGAscript® seguindo as instruções do fabricante (Invitrogen). As concentrações de dsRNAs foram medidas usando um espectrofotômetro NanoDrop®8000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE).

Construção de vetores de transformação de planta Dois tipos de vetores de expressão de RNA grampo de cabelo, um conjunto para transformação de célula de milho mediada por WHIS-KERS® e um segundo conjunto para transformação mediada por Agrobacte-ríum convencional, foram montados usando métodos de clonagem padrão Gateway® (Invitrogen). Construtos de gene-alvo para formação de grampo de cabelo compreendendo segmentos de PP1-87B (SEQ ID N°:1; segmento SEQ ID N°:3), RPA70 (SEQ ID N°:2; segmento SEQ ID N°:5) e RPS6 (SEQ ID N°:7) foram montados usando uma combinação de fragmentos quimica-mente sintetizados (DNA2.0, Menlo Park, CA) e métodos de clonagem molecular padrão. Formação de grampo de cabelo intramolecular através de transcritos primários de RNA foi facilitada pela disposição (dentro de uma unidade de transcrição única) de duas cópias dos fragmentos de gene-alvo em orientação oposta uma para a outra, os dois fragmentos sendo separados por uma sequência de íntron ST-LS1 (Vancanneyt et al (1990) Mol. Gen.

Genet. 220(2):245-50). Vetores de entrada contendo cassetes de expressão dos construtos de grampo de cabelo de PP1-87B, região 2 de RPA70 e RPS60 foram montados usando métodos de clonagem Gateway® e métodos de clonagem padrão. Produção do transcrito de mRNA primário é direcionada por uma cópia do promotor 1 da ubiquitina do milho (Patente U.S. N°. 5.510.474). Desta maneira, o transcrito de mRNA primário contém duas sequências de fragmento de gene como repetições invertidas grandes uma da outra, separadas pela sequência de íntron. Um fragmento compreendendo uma região não traduzida 3' de um gene da peroxidase 5 do milho (ZmPer5 3‘UTR v2; Patente U.S. N°. 6.699.984) foi usado para terminar a transcrição dos genes-alvo. O mesmo conjunto de vetores de entrada foi usado para clonagem Gateway® em dois vetores de destino de partida para construir dois tipos de vetores de transformação de expressão de RNA grampo de cabelo; um conjunto para transformação de célula de milho mediada por WHISKER e um segundo conjunto para transformação mediada por Agrobacterium. Todos os vetores de expressão de RNA grampo de cabelo para transformação mediada por WHISKER® foram construídos usando um vetor de desti-nação de partida (pDAB108916) e um dos vetores de entrada construídos por meio de uma reação de recombinação Gateway® padrão. O vetor de destinação compreendia dois genes marcadores: um gene da proteína fluorescente amarela (YFP; Shagin et al (2004) Mol. Biol. Evoí. 21(5):841-50) e um gene de tolerância a herbicida (fosfinotricin acetil transferase (PAT); We-hrmann et al (1996) Nat. Biotechnol. 14(10):1274-8). As expressões de ambas a YFP e a PAT foram direcionadas por uma cópia de um promotor de badnavírus baciliforme da cana de açúcar (ScBV) respectiva mente (Schenk et al (1999) Plant Molec. Biol. 39:1221-30). Um fragmento compreendendo uma região não traduzida 3' de um gene da lipase do milho (ZmLip 3'UTR; Patente U.S. N°. 7.179.902) foi usado para terminar a transcrição do gene de YFP, enquanto terminação da transcrição do gene de PAT foi controlada por um fragmento contendo um gene pinll da batata 3'UTR (StPinll 3’UTR; essencialmente N°. de Acesso GenBank® X04118.1).

Todos os vetores de transformação de expressão de RNA grampo de cabelo para transformação de embrião de milho mediada por Agrobac-teríum foram construídos usando um vetor de destinação binário típico (pDAB101847) e um dos vetores de entrada descritos acima através do uso de uma reação de recombinação Gateway® padrão. O vetor de destinação binário compreendia outro gene de resistência a herbicida (ariloxialcanoato dioxigenase; AAD-1 v3) (Wright et al (2010) Proc. Natí. Acad. Sei. U.S.A. 107:20240-5) sob a regulação do promotor ScBV e terminador ZmLip 3'UTR. Os plasmídeos de vetor binário eram pDAB109818 (compreendendo o cons-truto grampo de cabelo de RPA70), pDAB109822 (compreendendo o cons-truto grampo de cabelo de PP1-87B) e pDAB109823 (compreendendo o construto grampo de cabelo de RPS6). A SEQ ID N°:29 apresenta uma sequência de formação de grampo de cabelo de PP1-87B, a SEQ ID N:30 apresenta uma sequência de formação de grampo de cabelo de RPA70 Reg2 e a SEQ ID N°:31 apresenta uma sequência de formação de grampo de cabelo de RPS6.

Purificação de fragmento para transformação mediada por WHISKERS® é realizada em uma escala preparativa através de cromatogra-fia líquida de alta pressão (HPLC) após os DNAs do vetor de expressão YFP/hpRNA/PAT terem sido digeridos com enzimas de restrição apropriadas para remover um gene de resistência à espectinomicina bacteriano presente na estrutura principal do vetor. EXEMPLO 5: Avaliação de Genes-alvo Candidatos O dsRNA sintético projetado para inibir algumas, mas não todas, as sequências de gene-alvo identificadas no exemplo 2 causou mortalidade e inibição de crescimento quando administrado a WCR em ensaios à base de dieta. PP1-87B, RPA 70 Reg2, RPA70 Reg3 e RPS6 foram observados exibir eficiência bem alta neste ensaio com relação a outros dsRNAs avaliados.

Bioensaios replicados demonstraram que ingestão de preparações de dsRNA derivadas de PP1-87B, RPA70 Reg2, RPA70 Reg3 e RPS6 cada uma resultou em mortalidade e/ou inibição de crescimento de larvas da lagarta da raiz do milho do oeste. A Tabela 2 e a Tabela 3 mostram os resultados de bioensaios de alimentação com base na dieta de larvas WCR seguindo exposição de 9 dias a esses dsRNAs. A figura 2 e a figura 3 mostram gráficos de variabilidade para dados de mortalidade e a figura 4 e a figura 5 mostram gráficos de variabilidade para os dados de inibição de crescimento de pestes coleópteras tratadas com moléculas de ácido nucleico exemplares.

Tabela 2. Resultados de ensaios de alimentação com dieta obtidos com lar-vas de lagarta da raiz do milho do oeste._________________________________ *As unidades de dose estão em ng/cm2. **ND = Não feito Tabela 3. Resultados de ensaios de alimentação com dieta obtidos com lar-vas de lagarta da raiz do milho do oeste__________________________________ *As letras em parênteses significam níveis estatísticos. Níveis não conectados pela mesma letra são significantemente diferentes (Análise de Contingência, P<0,05) Foi anteriormente sugerido que certos genes de Diabrotica spp. podem ser explorados para controle de inseto mediado por RNAi. Vide Publicação de Patente U.S. N°. 2007/0124836, que revela 906 sequências, e a Patente U.S. N°. 7.614.924, que revela 9.112 sequências. No entanto, foi determinado que muitos genes sugeridos ter utilidade para controle de inseto mediado por RNAi não são eficazes no controle de Diabrotica. Foi determinado também que PP1-87B, RPA70 Reg2, RPA70 Reg3 e RPS6 proveem cada um controle superior surpreendente e inesperado de Diabrotica, comparado com outros genes sugeridos ter utilidade para controle de inseto mediado por RNAi.

Por exemplo, anexina, beta espectrina 2 e mtRP-L4 foram cada um sugeridos na Patente U.S. N°. 7.614.924 ser eficazes em controle de inseto mediado por RNAi. A SEQ ID N°:32 é a sequência de DNA da região 1 de anexina e a SEQ ID N°:33 é a sequência de DNA da região 2 de anexina. A SEQ ID N°:34 é a sequência de DNA da região 1 de beta espectrina 2 e a SEQ ID N°:35 é a sequência de DNA da região 2 de beta espectrina 2. A SEQ ID N°:36 é a sequência de DNA da região 1 de mRP-L4 e a SEQ ID N°:37 é a sequência de DNA da região 2 de mtRP-L4. Uma sequência de YFP (SEQ ID N°:38) foi também usada para produzir dsRNA como um controle negativo.

Cada uma das sequências mencionadas acima foi usada para produzir dsRNA através dos métodos do exemplo 4, e os dsRNAs foram cada um testados através dos mesmos métodos de bioensaio baseados em dieta descritos acima. A Tabela 4 lista as sequências dos iniciadores usadas para produzir as moléculas de dsRNA de anexina, beta espectrina 2 e mtRP-L14. A Tabela 5 apresenta os resultados de bioensaios de alimentação com base em dieta de larvas de WCR seguindo exposição de 9 dias a essas moléculas de dsRNA. Bioensaios replicados demonstraram que ingestão desses dsRNAs resultou em nenhuma mortalidade ou inibição de crescimento de larvas da raiz do milho do oeste acima daquela vista com amostra controle de tampão de TE, YFP ou água.

Tabela 4. Iniciadores e Pares de Iniciador usados para amplificar porções de reaiões de codificação de genes.

Tabela 5. Resultados de ensaios de alimentação com dieta obtidos com lar-vas de lagartas da raiz do milho do oeste___________________________ EXEMPLO 6: Produção de Tecidos de Milho Transaênico Compreendendo dsRNAs Grampo de Cabelo Inseticidas Plantas que produzem uma ou mais moléculas de dsRNA inseticidas (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA se direcionando a um gene compreendendo uma das SEQ ID Ν°*:1-7) através da expressão de um gene quimérico estavelmente integrado ao genoma da planta são produzidas. Preparações de moléculas de DNA de transformação de planta preparadas essencialmente conforme descrito no EXEMPLO 4 são aplicadas a culturas de célula de suspensão Hi-ll de milho através de transformação mediada por WHISKERS® (essencialmente conforme descrito nas Patentes U.S. N05*. 5.302.523 e 5.464.765; Publicação de Patente U.S. N°. 2008/0182332; e Petolino e Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67, que são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade). Tecidos transformados são selecionados quanto à sua habilidade em crescer em meio contendo BASTA® ou haloxifope e são avaliados quanto à produção de YFP, conforme apropriado. Porções de tais culturas de tecido transformado podem ser apresentadas a larvas da lagarta da raiz do milho neonatais para bioensaio, essencialmente conforme descrito no exemplo 7.

Transformação mediada por Aarobacterium. Alternativamente, células, tecidos e plantas de milho transgênico que produzem uma ou mais moléculas de dsRNA inseticidas (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA se direcionando a um gene compreendendo uma de SEQ ID NoS:1-7) através da expressão de um gene quimérico estavelmente integrado ao genoma da planta foram produzidos seguindo transformação mediada por Agrobacterí-um. Métodos de transformação de milho empregando vetores de transformação superbinários ou binários são conhecidos na técnica, conforme descrito, por exemplo, na Publicação PCT Internacional N°. WO2010/120452. Tecidos transformados foram selecionados quanto à sua habilidade em crescer em meio contendo haloxifope e foram avaliados quanto à produção de dsRNA, conforme apropriado. Porções de tais culturas de tecido transformado podem ser apresentadas a larvas de lagarta da raiz do milho neona-tais para bioensaio, essencialmente conforme descrito no exemplo 7.

Esterilização de espiga e isolamento de embrião. Embriões imaturos de milho foram obtidos de plantas de linhagem de cruzamento entre a mesma espécie de Zea mays B104 cultivadas na estufa e auto- ou sib-polinadas para produzir espigas. As espigas foram colhidas aproximadamente 9 a 12 dias pós-polinação. No dia experimental, as espigas descascadas foram esterilizadas na superfície através de imersão em uma solução 20% de hipoclorito de sódio (6,15%) e agitadas por 20 a 30 minutos, seguido por três enxágues em água estéril. Após esterilização, embriões zigóticos imaturos (1,5 a 2,4 mm) foram assepticamente dissecados de cada espiga e aleatoriamente distribuídos em tubos de microcentrífuga contendo Meio de Ino-culação líquido. O meio de inoculação continha: 2,2 g/L de sais de MS e Vitaminas MS Modificadas 1X ISU (Frame et al (2011) "Genetic Transformati-on Using Maize Immature Zygotic Embryos." Em Plant Embrvo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Bioloav. T. A. Thorpe e E. C. Yeung, (Eds.), SPRINGER SCIENCE AND BUSINESS MEDIA, LLC., pp 327-341); 68,4 gm/L de sacarose; 36 gm/L de glicose; 115 mg/L de L-prolina; 100 mg/L de mio-inositol; e 200 μΜ de acetosiringona (preparada em DM- SO); em pH 5,4. Para um dado conjunto de experimentos, embriões de espigas agrupadas foram usados para cada transformação.

Início de Cultura de Agrobacterium. Estoques de glicerol de linhagem de Agrobacterium DAt13192 contendo um vetor de transformação binário, tal como pDAB109818, pDAB109822 ou pDAB109823, foram riscados em placas de meio mínimo AB (Watson et al (1975) J. Bacteriol. 123:255-64) contendo antibióticos apropriados e foram cultivados a 20°C por 3 a 4 dias. Uma colônia única foi pega e riscada em placas de YEP (10 g/L de extrato de levedura; 10 g/L de Peptona; 5 g/L de NaCI) contendo os mesmos antibióticos e as placas foram incubadas a 20°C por 1-2 dias.

Cultura e Co-cultivo de Agrobacterium. Colônias de Agrobacterium foram pegas de uma placa de YEP, suspensas em 10 mL de Meio de Inoculação em um tubo de 50 mL descartável e a densidade celular foi ajustada para uma OD550 de 0,2 a 0,4 (Densidade Óptica medida a 550 nm, uma medida indireta de concentração celular) usando um espectrofotômetro. As culturas de Agrobacterium foram incubadas em um agitador giratório a 125 rpm (temperatura ambiente) enquanto dissecação de embrião era realizada. Embriões zigóticos imaturos (previamente isolados dos grãos de milho esterilizados e postos em 1 mL de Meio de Inoculação) foram lavados uma vez no mesmo meio.

Dois mL de suspensão de Agrobacterium foram adicionados a cada tubo de embriões, e os tubos foram postos em uma plataforma de agitação por 10 a 15 minutos. Os embriões foram transferidos para Meio de Co-cultura, orientados com o escutelo para cima e incubados a 25°C, sob luz 24 horas a 50 pEm'2 seg'1 de intensidade de luz por 3 dias. O meio de Co-cultivo continha 4,33 gm/L de sais de MS; Vitaminas MS Modificadas 1X1-SU; 30 gm/L de sacarose; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de Dicamba (ácido 3,6-dicloro-o-anísico ou ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico) em KOH; 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L de Hidrolisato Enzimático de Caseína; 15 mg/L de AgNC>3; 100 pg de acetosiringoma em DMSO; e 3 g/L de GELZAN® (SIGMA-ALDRICH); em pH 5,8.

Seleção de Calo e Regeneração de Eventos Putativos. Seguindo 0 período de co-cultivo, os embriões foram transferidos para Meio de Descanso e incubados a 25°C sob luz 24 horas a 50 pEm'2 seg'1 de intensidade de luz por 3 dias. O Meio de Descanso continha 4,33 gm/L de sais de MS; Vitaminas de MS Modificadas 1X ISU; 30 gm/L de sacarose; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de Dicamba em KOH; 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L de Hidrolisato Enzimático de Caseína; 15 mg/L de AgN03; 0,5 gm/L de MES (monoidrato do ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico; PHY7OTECHNOLO-GIES LABR.; Lenexa, KS); 250 mg/L Carbenicilina; e 2,3 gm/L GELZAN®; em pH 5,8. Os embriões foram transferidos para Meio de Seleção 1 (que consistia no Meio de Descanso (acima) com ácido R-Haloxifope 100 nM (0,0362 mg/L)) e incubados ou no escuro e/ou sob luz 24 horas em 50 pEm* 2seg‘1 de intensidade de luz por 7 a 14 dias a 28°C.

Calos embriogênicos em proliferação foram transfectados em Meio de Seleção 2 (que consistia em Meio de Descanso (acima), com ácido R-Haloxifope 500 nM (0,1810 mg/L)) e foram incubados em 24 horas de luz a 50 pEm’2seg'1 de intensidade de luz por 14 a 21 dias a 28°C. Esta etapa de seleção permitiu que os calos transgênicos proliferassem e diferenciassem mais.

Calos embriogênicos, em proliferação, foram transferidos para Meio de PreRegeneração e culturados sob luz por 24 horas em 50 pEm' 2seg‘1 de intensidade de luz por 7 dias a 28°C. Meio de PreRegeneração continha 4,33 gm/L de sais de MS; Vitaminas de MS Modificadas 1X ISU; 45 gm/L de sacarose; 350 mg/L de L-prolina; 100 mg/L de mio-inositol; 50 mg/L de Hidrolisato Enzimático de Caseína; 1,0 mg/L de AgN03; 0,25 gm/L de MES; 0,5 mg/L de ácido naftalenoacético em NaOH; 2,5 mg/L de ácido abs-císico em etanol; 1 mg/L de 6-benzilaminopurina; 250 mg/L de Carbenicilina; 2,5 gm/L de GELZAN®; e 500 nM de ácido R-Haloxifope; em pH 5,8.

Calos embriogênicos com brotos tipo ramo foram transferidos para Meio de Regeneração e culturados sob luz por 24 horas a 50 pEm'2seg‘ 1 de intensidade de luz por 7 dias. Meto de Regeneração 1 continha 4,33 gm/L de sais de MS; Vitaminas de MS Modificadas 1X ISU; 60 gm/L de sa- carose; 100 mg/L de mio-inositol; 125 mg/L de Carbenicilina; 3,0 gm/L de GELZAN®; e 500 nM de ácido R-Haloxifope; em pH 5,8.

Ramos pequenos com raízes primárias foram transferidos para meio de Ramo/Raiz em PHYTATRAYS® (PHYTOTECHNOLOGIES L/\BR.; Lenexa, KS) e foram incubados sob 16:8 horas luz:escuro a 140 a 190 pEm' 2seg"1 de intensidade de luz por 7 dias a 27°C. Meio do e Ramo/Raiz continha 4,33 gm/L de sais de MS; Vitaminas de MS Modificadas 1X ISU; 30 gm/L de sacarose; 100 mg/L de mio-inositol; 3,5 gm/L de GELZAN®; em pH 5,8.

Mudas transgênicas putativas foram analisadas quanto a número de cópia de transgene através de ensaios de PCR em tempo real quantitativos usando iniciadores projetados para detectar números de cópia relativos do ZmPer5 3' UTR (usado para determinar transcrição de gene de expressão de RNA-grampo de cabelo reptina) e foram transferidas para o solo.

Transferência e estabelecimento de plantas Tn na estufa para bioensaio e produção de semente. Tecidos de planta transformados selecionados quanto à sua habilidade em crescer em meio contendo 500 nM de ácido R-Haloxifope receberam identificadores únicos, transplantados em meio de crescimento sem solo METRO-MIX® 360 (SUN GRO HORTICUL-TURE) e endurecidos em uma sala de crescimento (~28°C temp. dia/~24°C tem. noite/luz suplementar 16:8). As plantas foram então transplantadas para mistura de solo SUNSHINE CUSTOM BLEND® 160 e cultivadas até florescimento na estufa.

As plantas a serem usadas para bioensaios de inseto foram transplantadas a partir de potes pequenos para TINUS® 350-4 ROOTRAINERS® (Spencer-Lemaire Industries, Acheson, Alberta, Canada) (uma planta por evento por ROOTRAINER®). Aproximadamente quatfo dias depois do transplante para ROOTRAINERS®, plantas T0 foram infestadas para bioensaio.

Plantas da geração Ti foram obtidas através de polinização dos cabelos de plantas transgênicas To com pólen coletado de plantas de linhagem de cruzamento entre a mesma espécie não transgênicas B104 e plantio das sementes resultantes. EXEMPLO 7: Bioensaios de Inseto As plantas que produziram um dsRNA inseticida foram bioensai-adas na estufa quanto a dano de alimentação da raiz. Ovos de lagarta da raiz do milho do oeste (WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte) foram recebidos em solo da Crop Characteristics (Farmington, MN), e os ovos foram incubados a 28°C por 10-11 dias. Os ovos foram lavados do solo, postos em uma solução de ágar 0,15% e a concentração foi ajustada para aproximadamente 75 a 100 ovos por alíquota de 0,25 mL. Uma placa de oclusão foi posta em uma placa de Petri com uma alíquota de suspensão de ovo para monitorar taxas de oclusão. O solo em torno das plantas de milho foi infestado com 150 a 200 ovos de WCR. Os insetos foram deixados se alimentar por 2 semanas, depois desse tempo uma "Classificação de Raiz" foi dada a cada planta. Uma Escala de Lesão de Nó foi utilizada para graduação, essencialmente de acordo com Oleson et al (2005) J. Econ. Entomol. 98(1):1-8. As plantas que passaram por este bioensaio foram transplantadas imediatamente para potes de 22,72 L (5 galões) para polinização à mão e produção de semente. As sementes produzidas por essas plantas foram guardadas para avaliação nas gerações de plantas Ti e subsequentes.

Plantas de controle negativo para os bioensaios consistiam em plantas B104 não transformadas produzidas a partir de semente ou plantas transformadas com um vetor binário carregando uma região de codificação de YFP sob controle de expressão de um promotor da ubiquitinal derivada de milho e Per5 3' UTR, e uma região de codificação AAD1 sob o controle de expressão de um promotor da ubiquitinal derivada de milho e Lip 3'UTR. O vetor binário de controle negativo não compreendia um construto codificando um dsRNA.

Plantas da geração T0 regeneradas a partir de transformação utilizando vetores binários compreendendo: um construto codificando um dsRNA grampo de cabelo de RPA70 (Tabela 14); um construto codificando um dsRNA grampo de cabelo de PP1-87B (Tabela 12); e um construto codificando um dsRNA grampo de cabelo de RPS6 (Tabela 13) foram bioensaia-dos na estufa conforme descrito. Poucos eventos To de PP1-87B e RPS6 testados demonstraram evidência de proteção de dano por alimentação pela lagarta da raiz do milho do oeste. Tabelas 12 e 13.

Sementes da geração Ti foram produzidas através de polinização de cabelos de plantas T0 com pólen coletado de plantas de linhagem de cruzamento entre a mesma espécie de elite não transgênicas B104. Plantas de eventos selecionados foram provocadas em bioensaios com larvas da lagarta da raiz do milho do oeste conforme descrito. As figuras 6 e 7 mostram dados de variabilidade de scores de dano de classificação de raiz médios de plantas Ti compreendendo construtos codificando dsRNAs grampo de cabelo de PP1-87B, RPS6 e RPA70. Os dados mostrados nas figuras são providos ainda nas Tabelas 6 e 7.

Tabela 6. Classificações de Dano à Raiz Médio por lagarta da raiz do milho do oeste de plantas de estufa T-\ de eventos compreendendo um construto codificando um dsRNA grampo de cabelo de PP1-87B (pDAB109822; descrito como Evento 109822), e plantas de outros eventos compreendendo construtos codificando um dsRNA grampo de cabelo de RPS6 (pDAB109823; descrito como Evento 109823). *A letras indicam níveis estatísticos conforme separado pelo teste Tukey-Kramer nas médias. Nomes de evento/planta não conectados pela mesma letra são significantemente diferentes (P<0,05).

Tabela 7. Classificações de Dano à Raiz Médio da lagarta da raiz do milho do oeste de plantas de estufa Ti de eventos compreendendo um construto codificando um dsRNA grampo de cabelo de RPA70. *A letras indicam níveis estatísticos conforme separado pelo teste Tukey-Kramer nas médias. Nomes de evento/planta não conectados pela mesma letra são significantemente diferentes (P<0,05). EXEMPLO 9: Bioensaios de inseto in vitro Bioatividade do dsRNA da presente invenção produzido em células de planta é demonstrada através de métodos de bioensaio. Vide, por e- xemplo, Baum et al (2007) Nat Biotechnol. 25(11):1322-6. Alguém seria capaz de demonstrar eficácia, por exemplo, através da alimentação de vários tecidos ou pedaços de tecido de planta derivados de uma planta produtora de um dsRNA inseticida a insetos-alvo em um ambiente de alimentação controlada. Alternativamente, são preparados extratos de vários tecidos de planta derivados de uma planta produtora de dsRNA inseticida e os ácidos nucle-icos extraídos são aplicados em cima de dietas artificiais para bioensaios conforme anteriormente descrito aqui. Os resultados de tais ensaios de alimentação são comparados com bioensaios similarmente conduzidos que empregam tecidos de controle apropriados de plantas hospedeiro que não produzem um dsRNA inseticida ou a outra amostras controle. EXEMPLO 10: Análises moleculares de Tecidos de Milho Transaênicos Nível de expressão de transcrito de RN A grampo de cabelo: aP-CR de Per 5 3'UTR. Eventos de célula de calo ou plantas transgênicas foram analisados através de PCR quantitativa (qPCR) em tempo real da sequência Per 5 3'UTR para determinar o nível de expressão relativa do transcrito grampo de cabelo de comprimento integral, comparado com o nível de transcrito de um gene de milho interno (SEQ ID N°:70; N°. de Acesso GEN-ΒΑΝΚ BT069734) que codifica uma proteína tipo TIP41 (isto é, um homólogo de milho de N°. de Acesso GENBANK AT4G34270; score tBLASTX de 74% de identidade). RNA foi isolado usando o estojo RNAEASY® 96 (QIAGEN, Va-lencia, CA). Após a primeira lavagem (RW1), as colunas foram tratadas com DNase livre de RNase QIAGEN em tampão RDD® (de acordo com o protocolo alternativo sugerido pelo estojo). cDNA de primeiro filamento foi preparado usando um HIGH CAPACITY cDNA SYNTHESIS KIT (INVITROGEN) em um volume de reação de 10 pL com 5 pL de RNA desnaturado, substancialmente de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O protocolo foi modificado ligeiramente para incluir a adição de 10 pL 100 pL de oli-gonucleotídeo T20VN (IDT) no tubo de 1 mL de mistura de estoque de inici-ador aleatório, a fim de preparar um estoque de trabalho de iniciadores aleatórios e oligo dT combinados.

Seguindo síntese de cDNA, as amostras foram diluídas 1:3 com água livre de nuclease e armazenadas a -20°C até serem ensaiadas. PCR de tempo real foi realizada em um LIGHTCYCLER® 480 (ROCHE DIAG-NOSTICS, Indianapolis, IN) em um volume de reação de 10 μΙ_. Todos os ensaios incluíam controles negativos de não molde (mistura apenas). Para as curvas padrão, um vazio (água em cavidade da fonte) foi também incluído na placa da fonte para checar contaminação cruzada da amostra. As reações foram realizadas com a ROCHE UNIVERSAL PROBE® a 0,5 μΜ e os iniciadores para os genes-alvo e de referência a 10 μΜ. As sequências de iniciador são mostradas na Tabela 8. Condições de reações de PCR foram como segue: (1) Ativação do alvo a 95°C por 10 minutos; (2) 43 ciclos de (desnaturação a 95°C por 10 segundos e extensão a 60°C); (3) aquisição a 72°C por 1 segundo; e (4) esfriamento a 40°C por 10 segundos.

Tabela 8. Sequências de iniciador usadas para análises moleculares de níveis de transcrito em milho transgênico *Proteína tipo TIP41.

Os dados foram analisados usando Software LIGHTCYCLER® v1.5 através de quantificação relativa usando um segundo algoritmo max derivado para cálculo de valores Cq, de acordo com as recomendações do fabricante. Para análises de expressão, valores de expressão foram calculados usando o método ACq (isto é, 2-(Cq TARGET - Cq REF)), que se apoia na comparação de diferenças de valores Cq entre dois alvos, com o valor de base de 2 sendo selecionado sob a hipótese que, para reações de PCR otimizadas, o produto dobra a cada ciclo.

Tamanho e integridade do transcrito grampo de cabelo: Caracte-rização molecular adicional de algumas das plantas transgênicas foi realizada através do uso de análise northem blot (blot de RNA) para determinar o tamanho molecular do RNA grampo de cabelo reptina em plantas transgêni-cas expressando um dsRNA grampo de cabelo reptina. Um transcrito nascente de comprimento integral é esperado ter um tamanho molecular de cerca de 900 pb, dependendo da quantidade de poliadenilação do RNA.

Todos os materiais e equipamentos foram tratados com RNA-ZAP® (AMBION/INVITROGEN) antes do uso. Amostras de tecido (100 mg a 500 mg) foram coletadas em tubos SAFELOCK® EPPENDORF de 2 mL, rompidas com um pulverizador de tecido KLECKO® (Garcia Manfacturing, Visalia, CA) com três contas de tungsgênio em 1 mL de TRIZOL® (INVI-TROGEN) por 5 minutos, então incubadas em temperatura ambiente (RT) por 10 minutos. Opcionalmente, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 4°C a 11.000 rpm e o sobrenadante foi transferido para um tubo SAFELOCK® EPPENDORF de 2 mL.

Depois de 200 pL de clorofórmio terem sido adicionados ao ho-mogenato, o tubo foi misturado através de inversão por 2 a 5 minutos, incubado em RT por 10 minutos e centrifugado a 12.000 x g por 15 minutos a 4°C. A fase superior foi transferida para um tubo EPPENDORF de 1,5 mL estéril, e 600 pL de isopropanol 100% foram adicionados, seguido por incubação em RT por entre 10 minutos e duas horas, então centrifugação a 12.000 x g por 10 minutos em a partir de 4°C a 25°C. O sobrenadante foi descartado e o pelete de RNA foi lavado duas vezes com 1 mL de etanol 70%, com centrifugação a 7.500 x g por 10 minutos em a partir de 4°C a 25°C entre as lavagens. O etanol foi descartado e o pelete foi rapidamente seco ao ar por 3 a 5 minutos antes de ser ressuspenso em 50 pL de água livre de nuclease. RNA total foi quantificado usando o NANODROP® 8000 (Ther-mo-Fisher), e as amostras foram normalizadas para 5 pg/10 pL. 10 pL de glioxal (AMBION/INVITROGEN) foram então adicionados a cada amostra. 5 a 14 ng de mistura de marcador padrão de RNA DIG (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) foram aplicados e adicionados a um volume igual de glioxal. RNAs de amostras e marcador foram desnaturados a 50°C por 45 minutos e armazenados em gelo até carregamento em um gel de agarose SEAKEM® GOLD 1,25% (Lonza, Allendale, NJ) em tampão de administração glioxal NORTHERNMAX® 10 X (AMBION/INVITROGEN). RN As foram separados através de eletroforese a 65 volts/30 mA por duas horas e 15 minutos.

Seguindo eletroforese, o gel foi enxaguado com SSC 2X por 5 minutos e imagem feita em uma estação GEL DOC® (BioRad, Hercules, CA). Então, o RNA foi passivamente transferido para uma membrana de náilon (MILLIPORE) da noite para o dia em temperatura ambiente, usando SSC 10X como o tampão de transferência (SSC 20X consiste em NaCI 3 M e ci-trato de trissódio 300 mM, em pH 7,0). Seguindo a transferência, a membrana foi enxaguada em SSC 2X por 5 minutos, o RNA foi reticulado com UV para a membrana (Agilent/Stratagene) e a membrana foi deixada secar em temperatura ambiente por até 2 dias. A membrana foi pré-hibridizada em tampão ULTRAHYB® (AM-BION/INVITROGEN) por uma a duas horas. A sonda consistia em um produto amplificado por PCR contendo as sequências de interesse (por exemplo, as porções de sequência de antissentido de uma de SEQ ID N°s:29-31) marcadas com digoxigenina por meio de um procedimento de DIG da Roche Applied Science. Hibridização em tampão recomendado foi realizada da noite para o dia em uma temperatura de 60°C em tubos de hibridização. Seguindo hibridização, o blot foi submetido a lavagens com DIG, enrolado, exposto à película por 1 a 30 minutos e então a película foi desenvolvida, tudo através de métodos recomendados pelo fornecedor do estojo de DIG.

Tamanho e integridade do transcrito de grampo de cabelo: Ensaio de Sonda de Hidrólise de íntron ST-LS1. Um ensaio de sonda de hidró-lise (conforme descrito abaixo; "Hydrolysis Probe Assays" se direcionando à sequência espaçadora íntron ST-LS1 (SEQ ID N°:77) nos RNAs grampo de cabelo (SEQ ID Ν°*:29-31) foi desenvolvido para medir a integridade do transcrito de dsRNA. Os oligonucleotídeos usados são listados na Tabela 7.

Ensaios de Número de Cópia de Transgene de Sonda de Hidró-lise. Tecidos de plantas de milho transgênicas foram avaliados através de um ensaio de sonda de hidrólise para confirmar a região de codificação aad-1 (eventos de B104 transformados por Agrobacterium). Os dados foram u- sados para estimar o número de cópia de transgene, comparado com resultados obtidos em ensaios similares para detectar um gene da invertase cro-mossomal nativo de duas cópias (SEQ ID N°:75). Os oligonucleotídeo usados são listados na Tabela 9.

Amostras de tecido foram maceradas com um pulverizador de tecido KLECO® e contas de aço inoxidável (Hoover Precision Products, Cumming, GA) em tampão QIAGEN RLT®. DNA genômico foi isolado em formato de alto rendimento usando um estojo BIOSPRINT® 96 Plant (QIAGEN), de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante, e quantificado através do QUANT-IT® PICO GREEN DNA ASSAY KIT (MOLECULAR PROBES/INVITROGEN). A concentração de DNA foi ajustada para em torno de 2 ng/pL para o ensaio de sonda de hidrólise usando um manuseador de líquido automático BIOROBOT® 3000 (QIAGEN). Determinação do número de cópia de transgene foi realizada através de PCR de tempo real usando o sistema LIGHTCYCLER® 480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN).

Os ensaios foram projetados para aad-1 e um gene da invertase de referência (SEQ ID N°:75; N°. de Acesso GENBANK: U16123.1) usando o LIGHTCYCLER® PROBE DESIGN SOFTWARE v2.0, Para amplificação, mistura de LIGHTCYCLER® 480 Probes Master foi preparada em concentração final 1X em uma reação multiplex de 10 pL de volume, contendo 0,4 pM de cada iniciador para aad-1 e 0,2 pM para cada sonda (Tabela 9). Uma reação de amplificação de 2 etapas foi realizada com uma extensão a 60°C por 40 segundos com aquisição de fluorescência. Todas as amostras foram administradas, e os valores de Limiar de ciclo (Ct) (Cycle thneshold) médios foram usados para análise de cada amostra. Análise de dados de PCR de tempo real foi realizada u-sando LIGHTCYCLER® SOFTWARE release 1.5, usando o módulo quant relativo, e foi baseada no método AACt. Controles incluiam uma amostra de DNA genômico de uma linha de calibrador de cópia única e checagens de duas cópias conhecidas que foram incluídas em cada rodada.

Ensaios de sonda de hidrólise de estrutura principal de vetor. Tecidos transgênicos foram analisados por meio de um ensaio de sonda de hidrólise projetado para detectar o gene SpnR (de resistência à espectinomi- cina bacteriano) (SEQ ID N°:76) abrigado no plasmídeo transformante, para determinar se qualquer DNA de estrutura principal do vetor tinha sido integrado ao genoma de milho. Os oligonucleotídeos usados são listados na Tabela 9.

Tabela 9. Sequências de iniciador e sonda usadas para ensaios de sonda de hidrólise.

Ensaios de sonda de hidrólise de alca de grampo de cabelo. Te-cidos transgênicos foram analisados quanto à presença de uma alça de grampo de cabelo conforme provido em construtos compreendendo sequências de grampo de cabelo mostradas em SEQ ID NoS:29-31. Os construtos de grampo de cabelo foram projetados de maneira que a alça do grampo de cabelo compreende uma sequência de um íntron ST-L1 (SEQ ID N°:77). Os componentes e as condições de reação do ensaio de sonda de hidrólise de alça de grampo de cabelo são dados na Tabela 10, e as sequências dos oligonucleotídeos são apresentadas na Tabela 11. Os parâmetros de componente e reação dados na Tabela 10 eram padrão para outros ensaios de sonda de hidrólise.

Tabela 10. Componentes de qPCR de alça de grampo de cabelo e parâmetros de reação Tabela 11. Sequências de oligonucleotídeos usadas em ensaios de sonda de hidrólise de grampo de cabelo._______ ________ Plantas T0 compreendendo construtos de grampo de cabelo foram analisadas conforme acima descrito e os resultados são dados nas Tabelas 12, 13 e 14.

Tabela 12. Resultados de análise molecular de plantas B104 transgênicas To compreendendo um construto codificando um dsRNA grampo de cabelo de PP1-87B. _________________________________ ________________ *Nível de Transcrito com relação ao nível de transcrito Per5. Números em parênteses foram obtidos em repetições do ensaio. **NT = não testado Tabela 13. Resultados de análise molecular de plantas B104 transgênicas T0 compreendendo um construto codificando um dsRNA grampo de cabelo de RPS6 *Nível de Transcrito com relação ao nível de transcrito Per5. Números em parênteses foram obtidos em repetições do ensaio. **NT = Não testado Tabela 14. Resultados de análise molecular de plantas B104 transgênicas T0 compreendendo um construto codificando um dsRNA grampo de cabelo de RPA70. * Nível de transcrito com relação ao nível de transcrito Per5. Números em parênteses foram obtidos em repetições do ensaio. **siRNA = Análise Northern blot para RNA de interferência curto *** NT = Não testado Plantas Ti compreendendo construtos grampo de cabelo foram . analisadas conforme acima descrito e os resultados são dados nas Tabelas 15, 16 e 17.

Tabela 15. Resultados de análise molecular de plantas B104 transgênicas Ti compreendendo um construto codificando um dsRNA grampo de cabelo de PP1-87B. *Nível de transcrito com relação ao nível de transcrito Per5. **Nível de transcrito com relação ao nível de alça de grampo de cabelo. ***Plantas 101556[93] são eventos transgênicos B104 que foram obtidos seguindo transformação mediada por Agrobacterium com um vetor binário pDAB101556 através dos métodos descritos aqui.

Tabela 16. Resultados de análise molecular de plantas B104 transgênicas Ti compreendendo um construto codificando um dsRNA grampo de cabelo de RPS6__________________________________________________________________ *Nível de transcrito com relação ao nível de transcrito Per5. **Nível de transcrito com relação ao nível de alça de grampo de cabelo. ***Plantas 101556[93] são eventos transgênicos B104 que foram obtidos seguindo transformação mediada por Agrobacterium com um vetor binário pDAB101556 através dos métodos descritos aqui.

Tabela 17. Resultados de análise molecular de plantas B104 transgênicas Tí compreendendo um construto codificando um dsRNA grampo de cabelo de PRA70. •Nível de transcrito com relação ao nível de transcrito Per5. **NT = Não testado •••Plantas 101556 são eventos transgênicos B104 que foram obtidos seguindo transformação mediada por Agrobacteríum com um vetor binário pDAB101556 através dos métodos descritos aqui.

Os dados acima mostram que certas pestes coleópteras, especialmente pestes de plantas Diabrotica, podem ser controladas através do direcionamento de certas transcritos produzidos nas pestes, através do contato das pestes com quantidades eficazes de dsRNA que hibridizam (isto é, são homólogos) para os transcritos-alvo. EXEMPLO 9: Zea mavs Transgênico Compreendendo Sequências de Peste Coleóptera 10 a 20 plantas de Zea mays T0 transgênicas são geradas conforme descrito no exemplo 6. Mais 10-20 linhagens independentes de Zea mays Ti expressando dsRNA grampo de cabelo para um construto de RNAi conforme descrito nas SEQ ID Nos:1-7 são obtidas para provocação com Ia- garta da raiz do milho. Essas são confirmadas através de RT-PCR. RNA total de linhagens Ti independentes selecionadas é opcionalmente usado para RT-PCR com iniciadores projetados para se ligarem no íntron ST-LS1 do cassete de grampo de cabelo em cada um dos construtos de RNAi. Ainda, iniciadores específicos para cada gene-alvo em um construto de RNAi são opcionalmente usados para amplificar e confirmar a produção do mRNA pré-processado requerido para produção de siRNA in planta. A amplificação das faixas desejadas para cada gene-alvo confirma a expressão do RNA grampo de cabelo em cada Zea mays transgênico. Processamento do grampo de cabelo dsRNA dos genes-alvo em siRNA é subsequentemente opcionalmente confirmado em linhagens transgênicas independentes usando hibridiza-ções de blot de RNA.

Comparação fenotípica de linhagens de RNAi transgênicas e Zea mays do tipo selvagem.

Genes ou sequências de peste coleóptera-alvo selecionados para criação de dsRNA grampo de cabelo não têm nenhuma similaridade com nenhum gene ou sequência de planta conhecido. Desta maneira, não é esperado que a produção ou a ativação de RNAi (sistêmico) por construtos se direcionando a esses genes ou sequências tenha quaisquer efeitos prejudiciais sobre plantas transgênicas. No entanto, características de desenvolvimento e morfológicas de linhagens transgênicas são comparadas com plantas do tipo selvagem, bem como com aquelas de linhagens transgênicas transformadas com um vetor de grampo de cabelo vazio. Características de raiz, ramo, folhagem e reprodução de planta são comparadas. Não há qualquer diferença observável em padrões de comprimento e crescimento de raiz de plantas transgênicas e do tipo selvagem. Características de ramo de planta tais como altura, números e tamanhos de folha, momento de florescimento, tamanho e aparência floral são similares. Em geral, não há quaisquer diferenças morfológicas observáveis entre linhagens transgênicas e aquelas sem expressão de moléculas de iRNA-alvo quando culturadas in vitro e em solo na estufa. EXEMPLO 10: Zea mavs transaênico Compreendendo uma Sequência de Peste Coleóptera e Construtos de RNAi Adicionais Uma planta de Zea mays transgênica compreendendo uma sequência de codificação heteróloga em seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que se direciona a um organismo outro que não uma peste coleóptera é transformada através de WHISKERS® para produzir uma ou mais moléculas de dsRNA inseticidas (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA se direcionando a um gene compreendendo uma de SEQ ID 1^:1-7). Transformação mediada por WHISKERS® é empregada para produzir Preparações de moléculas de DNA de transformação de planta preparadas essencialmente conforme descrito no exemplo 4 são aplicadas em culturas de célula em suspensão Hi-ll de milho obtidas de uma planta de Zea mays transgênica compreendendo uma sequência de codificação heteróloga em seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que se direciona a um organismo outro que não uma peste coleóptera. EXEMPLO 11: Plantas Resistentes à Peste Coleóptera Transaênicas Aplicação in planta de dsRNA, siRNA ou miRNA correspondendo a genes-alvo e a subsequente absorção por pestes coleópteras através de alimentação resulta em sub-regulagem dos genes-alvo através de silen-ciamento de gene mediado por RNA. Quando a função de um gene-alvo é importante, crescimento, desenvolvimento e reprodução da peste coleóptera são afetados e, no caso de pelo menos uma de WCR, NCR, SCR, MCR, D. balteata LeConte, D. u. tenella e D. u. undecimpunctata Mannerheim, leva à falha em infestar, se alimentar, se desenvolver e/ou reproduzir com sucesso ou leva à morte da peste coleóptera em um ou mais estágios de desenvolvimento. A escolha de genes-alvo e a aplicação bem sucedida de RNAi são então usadas para controlar pestes coleópteras. Cinco a dez réplicas de 10-20 linhagens transgênicas de Zea mays Ti independentes para cada cons-truto de RNAi são provocadas com uma espécie de lagarta da raiz do milho. A provocação é duplicada para cada espécie de lagarta da raiz do milho. Sementes Ti de linhagens de RNAi são germinadas e plantas resistentes transferidas para meio de Knop modificado 10-15 dias após germinação. Sementes de Z. mays de controle do tipo selvagem são germinadas ao mesmo tempo e usadas para infecção de lagarta da raiz do milho. Há significantemente mais lagartas da raiz do milho sobreviventes (>50%) em controles do que em linhagens de Z. mays transgênicas alojando um ou mais construtos de RNAi. Abundância de iRNA é medida em lagartas da raiz do milho que se alimentam em raízes de plantas do tipo selvagem e transgênicas usando RT-PCR em tempo real quantitativa. Há significantemente mais moléculas de iRNA encontradas em linhagens de Zea mays transgênicas alojando um ou mais construtos de RNAi do que em plantas controle. Esses resultados indicam que as linhagens transgênicas processam siRNAs correspondendo a genes-alvo e que esses siRNAs estão disponíveis para absorção através da alimentação de lagartas da raiz do milho. Sobretudo de maior importância, os resultados indicam que inibição mediada por RNAi de todos os genes-alvo afeta crescimento, desenvolvimento e viabilidade da lagarta da raiz do milho-alvo. Além disso, moléculas de RNAi com sequências incompatíveis com mais de 80% de identidade de sequência com genes-alvo afetam lagartas da raiz do milho de uma maneira similar a sequências do tipo selvagem. O emparelhamento de sequência incompatível com sequências nativas para formar um dsRNA grampo de cabelo no mesmo construto de RNAi fornece siRNAs processados por planta capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade de pestes coleópteras que se alimentam.

Claims

1. Polinucleotídeo isolado compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: I) SEQ ID N°:3, o complemento de SEQ ID N°:3, uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:3, o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:3, uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:3 e o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:3; II) SEQ ID N°:99, o complemento de SEQ ID N°:99, uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:99, o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:99, uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:99 e o complemento de uma sequência de não codificação riativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:99; e III) SEQ ID N°:100, o complemento de SEQ ID N°:100, um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:100, o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:100, uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:100, o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:100, uma sequência de codificação não nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:100 e o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:100.

2. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, onde o poli-nucleotídeo compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID Ν^ιΐ e 3.

3. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, onde o polinucleotídeo compreende ainda pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: (IV) SEQ ID N°:1, o complemento de SEQ ID N°:1, um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:1, o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:1, uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:1, o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:1, uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:1, o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:1, um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:1, o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:1, um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:1 e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:1; (V) SEQ ID N°:2, o complemento de SEQ ID N°:2, um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:2, o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:2, uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:2, o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:2, uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:2, o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:2, um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:2, o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:2, um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:2 e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:2; e (VI) SEQ ID N°:7, o complemento de SEQ ID N°:7, um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:7, o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:7, uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:7, o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ÍD N°:7, uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7, o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7, um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:7, o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:7, um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7 e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7.

4. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, onde a pelo menos uma sequência de nucleotídeo é operavelmente ligada a um promotor heterólogo.

5. Vetor de transformação de planta compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

6. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, onde o organismo Diabrotica é selecionado do grupo consistindo em D. v. virgifera LeConte; D. barberi Smith e Lawrence; D. u. howardi: D. v. zeae\ D. balteata LeConte; D. u. tenella; e D. u. undecimpunctata Mannerheim.

7. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, onde o polinucleotídeo é uma molécula de ácido ribonucleico (RNA).

8. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, onde o polinucleotídeo é uma molécula de ácido desoxirribonucleico (DNA).

9. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda pelo menos uma sequência de nucleotídeo codificando um poli-peptídeo de Bacillus thuringiensis.

10. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 9, onde o po-lipeptídeo de B. thuringiensis é selecionado do grupo consistindo em Cry3, Cry34 e Cry35.

11. Molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo produzida a partir da expressão do polinucleotídeo como definido na reivindicação 8.

12. Molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo de acordo com a reivindicação 11, onde o contato da molécula com a peste coleóptera inibe a expressão de um ácido nucleico endógeno compreendendo uma sequência de nucleotídeo especificamente complementar à sequência de nucleotídeo como definido na reivindicação 1.

13. Molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo de acordo com a reivindicação 12, onde o contato da molécula com uma peste coleóp-tera mata ou inibe o crescimento, reprodução e/ou alimentação da peste co-leóptera.

14. Molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo de acordo com a reivindicação 11, compreendendo uma primeira, uma segunda e uma terceira sequências de nucleotídeo, onde a primeira sequência de nucleotídeo compreende o polinu-cleotídeo como definido na reivindicação 1, onde a terceira sequência de nucleotídeo é ligada à primeira sequência de nucleotídeo pela segunda sequência de nucleotídeo, e onde a terceira sequência de nucleotídeo é substancialmente o complemento reverso da primeira sequência de nucleotídeo, de maneira que as porções da molécula de ácido ribonucleico compreendendo cada uma das primeira e terceira sequências de nucleotídeo que hibridizam uma para a outra na molécula de ribonucleotídeo de filamento duplo.

15. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 7, onde o po-linucleotídeo é selecionado do grupo consistindo em uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo e uma molécula de ácido ribonucleico de filamento simples com entre cerca de 19 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento.

16. Molécula de ácido ribonucleico produzida a partir da expressão do polinucleotídeo como definido na reivindicação 8, onde a molécula de ácido ribonucleico é selecionada do grupo consistindo em uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo e uma molécula de ácido ribonucleico de filamento simples com cerca de 19 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento.

17. Vetor de transformação de planta compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1, onde a pelo menos uma sequência de nucleotídeo é operavelmente ligada a um promotor heterólogo funcional em uma célula de planta.

18. Célula transformada com o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

19. Célula de acordo com a reivindicação 18, onde a célula é uma célula procariótica.

20. Célula de acordo com a reivindicação 18, onde a célula é uma célula eucariótica.

21. Célula de acordo com a reivindicação 20, onde a célula é uma célula de planta.

22. Planta transformada com o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

23. Semente da planta como definida na reivindicação 22, onde a semente compreende o polinucleotídeo.

24. Planta de acordo com a reivindicação 22, onde a pelo menos uma sequência de nucleotídeo é expressa na planta como uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo.

25. Célula de acordo com a reivindicação 21, onde a célula é uma célula de Zea mays.

26. Planta de acordo com a reivindicação 22, onde a planta é Zea mays

27. Planta de acordo com a reivindicação 22, onde a pelo menos uma sequência de nucleotídeo é expressa na planta como uma molécula de ácido ribonucleico, e a molécula de ácido ribonucleico inibe a expressão de uma sequência de nucleotídeo de peste coleóptera endógena especificamente complementar à pelo menos uma sequência de nucleotídeo quando a peste coleóptera ingere uma parte da planta.

28. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda mais de uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID N°:1; o complemento de SEQ ID N°:1; SEQ ID N°:2; o complemento de SEQ ID N°:2; SEQ ID N°:4; o complemento de SEQ ID N°:4; SEQ ID N°:5; o complemento de SEQ ID N°:5; SEQ ID N°:6; o complemento de SEQ ID N°:6; SEQ ID N°:7; o complemento de SEQ ID N°:7; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NoS:1, 2 e 4-7; o complemento de fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma de SEQ ID NoS:1, 2 e 4-7; uma se- quência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NoS:1, 2 e 4-7; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NoS:1, 2 e 4-7; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NoS:1, 2 e 4-7; e o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID Ν°*:1, 2 e 4-7.

29. Produto de base produzido a partir de uma planta como definida na reivindicação 22, onde o produto de base compreende uma quantidade detectável do polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

30. Método para controle de uma população de peste coleóptera compreendendo provisão de um agente compreendendo uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo que funciona quando do contato com a peste coleóptera para inibir uma função biológica dentro da peste coleóptera, onde o agente compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

31. Método para controle de uma população de peste coleóptera, o método compreendendo: provisão de um agente compreendendo uma primeira e uma segunda sequências de nucleotídeo que funciona quando do contato com a peste coleóptera para inibir uma função biológica dentro da peste coleóptera, onde a primeira sequência de polinucleotídeo compreende uma região que exibe de a partir de cerca de 90% a cerca de 100% de identidade de sequência com a partir de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:1, e onde a primeira sequência de polinucleotídeo é especificamente hibridizada para a segunda sequência de polinucleotídeo.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, onde a primeira e/ou segunda sequência de polinucleotídeo compreende ainda uma região que exibe de a partir de cerca de 90% a cerca de 100% de identidade de sequência com a partir de 19 a cerca de 30 nucleotídeos contíguos de um gene de peste coleóptera selecionado do grupo consistindo em RPA70 e RPS6.

33. Método para controle da população de uma peste coleóptera, o método compreendendo: provisão em uma planta hospedeira de uma peste coleóptera de uma célula de planta transformada compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1, onde o polinucleotídeo é expresso para produzir uma molécula de ácido ribonucleico que funciona quando do contato com uma peste coleóptera pertencente à população para inibir a expressão de uma sequência-alvo dentro da peste coleóptera e resulta em crescimento menor da peste coleóptera ou população de peste coleóptera, com relação ao crescimento em uma planta hospedeira da mesma espécie sem a célula de planta transformada.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, onde a molécula de ácido ribonucleico é uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo.

35. Método de acordo com a reivindicação 33, onde a população de peste coleóptera é reduzida com relação a uma população de peste coleóptera que infesta uma planta hospedeira da mesma espécie sem a célula de planta transformada.

36. Método de controle de infestação de peste coleóptera de planta em uma planta, o método compreendendo provisão na dieta de uma peste coleóptera do polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, onde a dieta compreende uma célula de planta transformada para expressar o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

38. Método para aperfeiçoamento do rendimento de uma cultura de milho, o método compreendendo: introdução do polinucleotídeo como definido na reivindicação 1, em uma planta de milho para produzir uma planta de milho transgênica; e cultivo da planta de milho para permitir a expressão de uma molécula de ácido nucleico compreendendo a pelo menos uma sequência de nucleotídeo; onde a expressão da molécula de ácido nucleico inibe infecção por peste coleóptera ou crescimento e perda de rendimento devido à infecção por peste coleóptera.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, onde a molécula de ácido nucleico é uma molécula de RNA que suprime pelo menos um primeiro gene-alvo em uma peste coleóptera que contatou uma porção da planta de milho.

40. Método para produção de uma célula de planta transgênica, o método compreendendo: transformação de uma célula de planta com um vetor compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1, operativamente ligado a um promotor e uma sequência de terminação de transcrição; cultura da célula de planta transformada sob condições suficientes para permitir desenvolvimento de uma cultura de célula de planta compreendendo uma pluralidade de células de planta transformadas; seleção das células de planta transformadas que integraram a pelo menos uma sequência de nucleotídeo em seus genomas; avaliação das células de planta transformadas quanto à expressão de uma molécula de ácido ribonucleico codificada por pelo menos uma sequência de nucleotídeo; e seleção de uma célula de planta que expressa a molécula de á-cido ribonucleico.

41. Método para produção de uma planta transgênica resistente à peste coleóptera, o método compreendendo: provisão da célula de planta transgênica produzida através do método de acordo com a reivindicação 40; e regeneração de uma planta transgênica a partir da célula de planta transgênica, onde a expressão da molécula de ácido ribonucleico codificada pela pelo menos uma sequência de nucleotídeo é suficiente para modular a expressão de um gene-alvo em uma peste coleóptera que contata a planta transgênica.