CN102948425B

CN102948425B - 一种生物农药和昆虫防治方法

Info

Publication number: CN102948425B
Application number: CN201210409250.1A
Authority: CN
Inventors: 张必良; 龚亮; 胡美英
Original assignee: GUANGZHOU RIBOBIO CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU RIBOBIO CO Ltd
Priority date: 2010-03-05
Filing date: 2010-03-05
Publication date: 2014-10-22
Anticipated expiration: 2030-03-05
Also published as: CN102948425A

Abstract

本发明提供了一种昆虫防治方法，该方法为将针对鳞翅目昆虫特定基因的siRNA与阳离子聚合物配伍喂食鳞翅目昆虫，所述siRNA为体外化学合成17-50nt的双链RNA，阳离子聚合物为聚乙烯亚胺(PEI)、壳聚糖、聚赖氨酸和明胶。本发明还涉及了一种生物农药，该农药以针对鳞翅目昆虫特定基因的siRNA为有效成。本发明涉及通过饲喂含有昆虫特异基因如：干扰昆虫线粒体复合物ⅢFe-S亚基基因、乙酰胆碱酯酶基因、γ-氨基丁酸受体基因等的siRNA对鳞翅目昆虫的基因表达进行抑制，从而干扰昆虫正常的生长发育，进而实现对昆虫的有效治理；进一步通过盆栽实验结果，显示这是一类高效的生物杀虫剂。

Description

一种生物农药和昆虫防治方法

原申请日：2010-3-5

原申请号：201010122016.1

原申请发明名称：一种生物农药和昆虫防治方法

技术领域

本发明涉及化学合成及修饰的小分子干扰RNA领域，具体地，是涉及一种生物农药和昆虫防治方法。

背景技术

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指外源或内源的双链RNA(dsRNA)特异性地引起基因表达沉默的现象，它是进化上高度保守且在生物界普遍存在的一种基因调控机制。1998年在线虫Caenorhabditis elegans中首次发现了这种现象，随后在真菌、植物、昆虫和动物中也发现了这种现象。RNAi的作用机制是：体外导入的或内源性转录生成的长链dsRNA被Dicer家族RNase-III切割成21-25nt（碱基）的siRNA，siRNA进一步与Argonaute蛋白结合形成RISC（RNA-induced silencing complex），最后由RISC介导siRNA反义链与靶mRNA分子互补结合引起同源靶mRNA分子的特异性降解。近几年来RNAi研究取得了突破性进展，被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。以特异性剔除或关闭昆虫特定基因的表达为基本思路，探索害虫防治的新策略，有望成了新型生物农药创制的热门技术。

线虫在摄入或局部注射dsRNA后，其RNAi效应能传遍整个有机体甚至是传递到后代，此被定义为系统性RNAi。昆虫必须具有体内传播RNAi效应的机制，才能有望实现以siRNA为主效因子的生物农药防治策略。昆虫系统性RNAi效应首次在赤拟谷盗（Triboliumcastaneum）中发现，此虫幼虫期注射Tc-ASH基因的dsRNA，在成虫期表现出缺失鬃的显型(Tomoyasu Y,Denell RE.Larval RNAi in Tribolium(Coleoptera)for analyzing adult development.Dev Genes Evol.2004,214:575-578)，并且此昆虫Distalless等基因的RNAi效应会从亲代传递至子代(Bucher G.Parental RNAi in Tribolium(Coleoptera).Curr Biol,2002,12:R85R86)。目前，系统性RNAi效应已存在如下昆虫中得已验证：双翅目昆虫采采蝇；鞘翅目昆虫赤拟谷盗；膜翅目昆虫蜜蜂；直翅目昆虫蝗虫；蜚蠊目昆虫德国小蠊；鳞翅目昆虫斜纹夜蛾、小菜蛾、甜菜夜蛾、浅棕苹果蛾；半翅目昆虫豌豆蚜。系统性RNAi效应在昆虫中的广泛性，表明siRNA在害虫防治方面具有广泛的应用潜力。

鳞翅目（Lepidoptera）昆虫纲中第二大目。完全变态。幼虫一般称为毛虫，亦称“蛅蟖”。蛹为被蛹。成虫称蛾或蝶，其翅和体上密被鳞片，故名。具吸收口器，形成长形而能卷起的喙；复眼大；触角变化多，呈丝状、羽状或栉状等。全世界已知有十四万种左右，我国已有记载的约两万种。大多数种类与国民经济有重大关系，如螟虫、粘虫、松毛虫和菜粉蝶、小菜蛾等，为农林植物的重要害虫；家蚕、柞蚕和蓖麻蚕等，是著名的资源昆虫。

据最近几年的相关报道，昆虫通过饲喂表达dsRNA的植物或菌株，能有效的阻断昆虫目标基因的表达。毛颖波等（2007）通过转基因手段，让植物自身产生P450基因的dsRNA。然后，将植物喂食棉铃虫（Helicoverpa armigera）。dsRNA从食道进入细胞，抑制棉铃虫体内P450基因的表达，致使棉铃虫对棉子酚的抗性降低。最后，对棉铃虫造成致命的影响。玉米根萤叶甲（Diabrotica virgifera virgifera Leconte）饲喂含有V-ATPase A等基因的dsRNA植物饲料，幼虫出现滞育或死亡，显著降低了此虫对玉米根部的危害。田宏刚等（2009）利用具有双T7启动子的载体L4440和RNase III缺失的HT115(DE3)菌株，构建了诱导表达能产生seCHSA基因dsRNA的工程菌株，饲喂甜菜夜蛾，导致个别虫体出现畸形或死亡。

RNA干扰技术已应用于小菜蛾功能基因的研究。如：Z.-X.Yang等用微注射的方法导入cadherin基因的dsRNA,导致该虫的死亡率和性别比率增加，并且幼虫期出现滞育现象。通过饲喂的方法，导入小菜蛾细胞色素P450（CYP6BG1）基因的dsRNA，致使该虫对除虫菊脂类农药的抗性降低（Ma,A.M.B.,Tadashi,M.,Ken M.,Toshiharu,T.RNAinterference-mediated knockdown of a cytochrome P450,CYP6BG1,from the diamondback moth,Plutella xylostella,reduces larval resistance to permethrin.Insect.2009.Biochem.Mol.Biol.39:38–46.）。据此，我们认为小菜蛾具有系统性RNA干扰的能力，有可能实现以RNA干扰技术为手段的防治策略。

虽然目前的研究开启了RNAi技术在害虫防治方面应用的新一页，但其中基因特异dsRNA仅来自于转基因植物或是工程菌株，抑或是体外转录生成。目前制约利用RNAi技术生产新型生物农药的重大共性和关键技术是：一、现有利用转基因技术转入作物体系防治害虫的技术体系和策略存在转基因植物食品安全性问题；二、表达dsRNA的工程菌株见效慢、防效低，且环境适应性难以评估；三、dsRNA的体外转录合成成本高、稳定性不好等。这些问题极大的限制了该技术在害虫防治领域的广泛应用。

发明内容

为克服以上的缺点，本发明提供一种新的昆虫防治方法。

具体技术方案如下：

一种昆虫防治方法，主要包括：将针对鳞翅目昆虫特定靶标基因的siRNA喂食鳞翅目昆虫，所述siRNA为体外化学合成17-50nt的双链RNA，所述靶标基因为乙酰胆碱酯酶基因、或为乙酰胆碱酯酶基因和γ-氨基丁酸受体基因、或为乙酰胆碱酯酶基因和线粒体复合物ⅢFe-S亚基基因、或为乙酰胆碱酯酶基因和线粒体复合物ⅢFe-S亚基基因以及γ-氨基丁酸受体基因。

更优选地，将上述siRNA直接喷雾在鳞翅目昆虫食用的农作物的叶片上，让昆虫自然取食。

本发明所述的昆虫防治方法，通过体外化学合成17-50nt双链RNA（siRNA）的方法，还可通过化学修饰以及与阳离子聚合物配伍增强了siRNA的稳定性和药效，通过自然饲喂或喷雾含有特定靶标基因siRNA的饲料来有效的阻断昆虫靶基因mRNA的表达，对昆虫造成致命影响。该方法制备以siRNA为主效因子的生物农药，具有周期短、见效快、无毒、无环境污染等优点，可以广泛地使用。

本发明的另一目的是提供一种生物农药。

一种生物农药，以针对鳞翅目昆虫特定靶标基因的siRNA为有效成份，所述siRNA为体

外化学合成17-50nt的双链RNA。

优选地，所述生物农药还包括有阳离子聚合物为有效成份，更优选地，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚赖氨酸或明胶。

优选地，所述siRNA经化学修饰或siRNA3'末端还设有以两个脱氧核苷的组合的悬挂碱基，所述化学修饰为2’-甲基化，氟代，5’-PEG，胆固醇，或多肽等。

优选地，所述siRNA包括有针对乙酰胆碱酯酶基因的siRNA为SEQ ID NO.7及SEQ IDNO.8、SEQ IDNO.9及SEQ IDNO.10、SEQ IDNO.11和SEQ IDNO.12、SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18中的一对或多对。

更优选地，所述siRNA为还包括有针对线粒体复合物ⅢFe-S亚基基因的siRNA为SEQ IDNO.1及SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6中的一对或多对；和/或针对γ-氨基丁酸受体基因的siRNA为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、SEQID NO.21和SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24中的一对或多对。

优选地，所述鳞翅目昆虫为小菜蛾。

本发明对昆虫直接饲喂含有特定靶标基因的siRNA，导致昆虫该基因mRNA水平或蛋白质水平的变化，通过该方法对昆虫对应的某一特定基因的表达进行抑制。由于采用化学合成的方法制备17-50nt siRNA，生产快捷，并可以通过化学修饰和与阳离子聚合物配伍增强siRNA的稳定性和效果，方法简便；由于把所生产的siRNA直接喷雾在叶片上，让昆虫自然取食即可，操作简单，实现了真正意义上的农药施药方式，可以广泛地推广。因此，采用本方法抑制昆虫基因的表达，可以为害虫防治提供新的方法。进一步通过盆栽实验结果，显示这是一类高效的生物杀虫剂。

附图说明

图1：为实施例1中饲喂siRNA的小菜蛾幼虫表现出死亡结果示意图；

图2：为实施例1中的qRT-PCR结果示意图；

图3：为实施例1中western blot结果示意图；

图4：为实例1中的ATP测定结果示意图；

图5：为实施例3中施药后第5天的防治效果比较示意图；

图6：实施例5中小菜蛾表现出脱皮未尽的症状示意图。

具体实施方式

本发明所述生物农药中的siRNA的浓度通常大于1ppm，优选大于10ppm，更优选为50ppm—500ppm。本领域的技术人员也可根据常识，按照实际需要，配比成合适的浓度，以及选择合适的施药时的叶面浓度，通常，浓度越大，效果越好。阳离子聚合物的浓度和siRNA一样，可以根据实际需要，配比成合适的浓度，通常可大于10ppm。优选地，在所述生物农药中N（阳离子聚合物）：P（siRNA）的比为1：1-100：1。具体无需赘述。

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定。

实施例一

本实例特别提供了小菜蛾线粒体复合物ⅢFe-S亚基基因的siRNA,通过自然饲喂此靶标基因siRNA后对鳞翅目昆虫如小菜蛾造成了致命的影响。

本实例是用于防治鳞翅目昆虫小菜蛾（Plutella xylostella）的方法。通过喂食含有沉默线粒体复合物ⅢFe-S亚基基因(GeneBank登录号为EU815629)的siRNA，从而阻断昆虫线粒体电子传递，抑制昆虫ATP的形成，进而实现了对昆虫的有效治理。

线粒体复合物Ⅲ又称泛醌细胞色素C还原酶（Ubiquinol-cytochrome c reductase），由9-11个亚基组成，包括两个细胞色素b（b562和b566）、一个细胞色素C1和一个Fe-S蛋白。其中Fe-S蛋白亚基负责将一个电子从还原型辅酶Q传递给细胞色素C1，并将一个质子释放到膜间隙，以此产生膜电位用于ATP的形成（Trumpower B L.Cytochrome bc1complexes ofmicroorganisms.Microbiological reviews,1990,54:101-29）。本实施例的生物学原理就是通过沉默昆虫线粒体复合物ⅢFe-S亚基基因mRNA，进而阻断昆虫线粒体电子传递，抑制ATP的形成，从而来达到害虫防治的目的。

将化学合成的siRNA用DEPC稀释后均匀涂布于甘蓝叶面，通过对昆虫幼虫进行自然饲喂涂有针对线粒体复合物ⅢFe-S亚基基因siRNA的甘蓝叶片，从而在阻断昆虫特定基因如小菜蛾线粒体复合物ⅢFe-S亚基基因的表达，来实现对该昆虫的有效治理。此干扰效果可通过检测昆虫mRNA或蛋白水平的改变来确定，如可通过检测小菜蛾线粒体复合物ⅢFe-S亚基mRNA表达情况和其蛋白表达情况，抑或是小菜蛾幼虫ATP的合成情况，来确定干扰效果。如实验表明，小菜蛾取食其线粒体复合物ⅢFe-S亚基的siRNA后，该基因mRNA和蛋白表达水平降低，表现出电子传递受阻，最终因无法正常合成ATP而死亡。

所述方法主要包括以下步骤：

（一）昆虫特定功能基因的选择：

考虑到昆虫复合物ⅢFe-S亚基基因在线粒体电子传递中的关键作用，因此本发明选择该特定功能的基因为沉默对象，其基因序列参见GeneBank登录号为EU815629。

（二）小菜蛾线粒体复合物ⅢFe-S亚基基因siRNA的设计和合成：

Si-UQCR_001：GCAAGTCCGTCACCTTCAA（19nt）

正义链(5'-3')：5'GCAAGUCCGUCACCUUCAA dTdT 3'SEQ ID NO.1

反义链(3'-5')：3'dTdT CGUUCAGGCAGUGGAAGUU 5'SEQ ID NO.2、

Si-UQCR_002：CATCCAGTGTAGTGAGCAA（19nt）

正义链(5'-3')：5'CAUCCAGUGUAGUGAGCAA dTdT 3'SEQ ID NO.3

反义链(3'-5')：3'dTdT GUAGGUCACAUCACUCGUU 5'SEQ ID NO.4

Si-UQCR_003：CAACAACCTCTGAGAAGTT（19nt）

正义链(5'-3')：5'CAACAACCUCUGAGAAGUU dTdT 3'SEQ ID NO.5

反义链(3'-5')：3'dTdT GUUGUUGGAGACUCUUCAA 5'SEQ ID NO.6

上述SEQ ID NO1-6的siRNA的3'末端设有两个TT的悬挂碱基。

以上述每对siRNA做为有效成份，DEPC水稀释，制备成所述生物农药。

（三）将上述以siRNA为活性成份的生物农药均匀涂布于甘蓝叶片并喂食小菜蛾二龄幼虫：将siRNA用DEPC（diethypyrocarbonate）水稀释成浓度为100ppm的溶液（生物农药）,然后均匀涂布于甘蓝叶片上，叶面浓度为3.0μg/cm²,将该叶片喂食二龄小菜蛾。每对siRNA处理30头虫，设3个重复，并用DEPC水作为阴性对照组。之后，于12h、24h、36h、48h、60h、72h分别调查虫子的死亡数，计算死亡率。

（四）用荧光定量PCR的方法检测昆虫体内ISP基因mRNA的沉默水平：待调查完虫子的死亡数，便收集表现出显形症状的昆虫，如：表现出死亡性状的个体，提取总RNA，反转成第一链cDNA，用于qRT-PCR的模板。之后用荧光定量PCR仪配套软件计算出相对表达值。

荧光定量PCR引物：

EU815629_FP GTTGTGAGGTCAGGGCATTT SEQ ID NO.31

EU815629_RP GGAGAGGCTGAGACACCAAC SEQ ID NO.32

（五）用WB检测饲喂了siRNA的昆虫体内目的蛋白的表达：待昆虫饲喂特定的siRNA，如：Si-UQCR_003（SEQ ID NO 5和6）siRNA后，在12h，24h，48h，72h收集表现出显性症状的个体，提取总蛋白，用BCA法测定每个样品的蛋白浓度，在调整上样总蛋白量一致的情况下，用15%SDS-PAGE凝胶电泳分离各样品的总蛋白，之后，经一抗、二抗孵育后，曝光显影，得到如图3结果。

（六）饲喂了siRNA的昆虫体内ATP量的检测：待昆虫饲喂特定的的siRNA，如：Si-UQCR_003siRNA后，在6h，12h，24h，36h，48h，72h收集活体昆虫样品，并同时收集饲喂了DEPC水的活体昆虫样品，之后用碧云天公司生产ATP检测试剂盒（产品编号:S0026）测定其ATP的含量。

通过本实验发现，经过自然饲喂涂有选定基因的siRNA叶片后，昆虫体内的线粒体复合物ⅢFe-S亚基基因的表达沉默，目的基因mRNA表达水平降低，同时蛋白表达水平也受到抑制，进而阻断昆虫电子传递，抑制ATP的形成，从而导致昆虫个体显著死亡。

表1：饲喂涂有含ISP基因siRNA的生物农药甘蓝叶片后对小菜蛾死亡率的对比统计

所述化学修饰为3’和5’-末端各三个碱基为2’-甲基和氟代修饰。

图2：为qRT-PCR结果。该表说明饲喂基因特异siRNA后，表现出死亡显性性状的小菜蛾体内ISP基因的mRNA显著降低。

图3：为westernblot结果。改图说明饲喂ISP基因Si-UQCR_003siRNA后，在12小时，小菜蛾体内ISP蛋白表达量显著降低，之后随着小菜蛾的逐步长大，该蛋白的表达量逐步增加。

图5：为ATP测定结果。1-6分别代表6、12、24、36、48、72小时。

实施例二

本实例特别提供了小菜蛾线粒体复合物ⅢFe-S亚基基因的siRNA,通过自然饲喂此靶标基因Si-UQCR_001（SEQ ID NO 5和6）siRNA分别与阳离子聚合物为聚乙烯亚胺(PEI)、壳聚糖、聚赖氨酸和明胶等配伍后对鳞翅目昆虫如小菜蛾造成了致命的影响。

将Si-UQCR_001（SEQ ID NO 1和2）siRNA与上述阳离子聚合物制备成生物农药，并均匀涂布于甘蓝叶片并喂食小菜蛾二龄幼虫，组别1－4中，生物农药中的N：P为1：1，组别5－6中，生物农药中的N：P为20：1。siRNA的叶面浓度为3.0μg/cm²。每对siRNA处理30头虫，设3个重复，并用DEPC水作为阴性对照组。之后，于12h、24h、36h、48h、60h、72h分别调查虫子的死亡数，计算死亡率，实验结果如表2。

表2：饲喂涂有ISP基因siRNA和各种阳离子聚合物的甘蓝叶片后对小菜蛾死亡率的对比统计

实验中1-8号siRNA生物农药：1和5为聚乙烯亚胺(PEI)、2和6为壳聚糖、3和7为聚赖氨酸、4和8为明胶。

实施例三

本实例特别提供了小菜蛾乙酰胆碱酯酶基因的siRNA,通过自然饲喂此靶标基因siRNA后对鳞翅目昆虫如小菜蛾造成了致命的影响。

本实例是用于防治鳞翅目昆虫小菜蛾（Plutella xylostella）的方法。通过喂食含有沉默乙酰胆碱酯酶基因1和2(GeneBank登录号分别为：AY970293和AY061975)的siRNA，从而影响昆虫正常的神经冲动传递，使昆虫持续处于兴奋状态而死亡，进而实现了对昆虫的有效治理。

乙酰胆碱酯酶是一种丝氨酸水解酶，它的主要功能是在胆碱能神经突触处通过快速水解神经递质乙酰胆碱(ACh)而中止神经冲动的传递（Taylor T，Radie Z，1994．Thecholinesterases：from genes to proteins．Annu Rev Pharmaco1．Toxico1．，34：281-320）。本发明的生物学原理就是通过沉默昆虫乙酰胆碱酯酶基因mRNA，进而影响昆虫神经冲动的传递，使昆虫持续处于兴奋状态而死亡。

具体而言，该饲喂siRNA抑制昆虫基因表达的方法，是对昆虫直接饲喂含有特定基因的siRNA，导致昆虫的生长发育受阻，通过该方法对昆虫对应的某一特定基因的表达进行抑制。所述方法主要包括以下步骤：

（1）昆虫特定功能基因的选择：

考虑到昆虫乙酰胆碱酯酶基因在神经脉冲传递中的关键作用，因此本发明选择该特定功能的基因为沉默对象。序列具体参见GeneBank登录号分别为：AY970293和AY061975。（2小菜蛾乙酰胆碱酯酶基因基因siRNA的设计和合成：

GenBank:AY 970293ace1

Si-ace 1_001：CATGCATGGTGATGAAATA

正义链(5'-3')：5'-CAUGCAUGGUGAUGAAAUATT-3'SEQ ID NO.7

反义链(3'-5')：3'-TTGUACGUACCACUACUUUAU-5'SEQ ID NO.8

Si-ace1_002(R S27/A29)：GAATGATGTTGCCAGACAA

正义链(5'-3')：5'-GAAUGAUGUUGCCAGACAATT-3'SEQ ID NO.9

反义链(3'-5')：3'-TTCUUACUACAACGGUCUGUU-5'SEQ ID NO.10

Si-ace1_003(R S27/A29)：CAGAGAGGAGAGTGTGATA

正义链(5'-3')：5'-CAGAGAGGAGAGUGUGAUATT-3'SEQ ID NO.11

反义链(3'-5')：3'-TTGUCUCUCCUCUCACACUAU-5'SEQ ID NO.12

GenBank:AY061975ace2

Si-ace2_001：CGGCGACACTTGATCTATA

正义链(5'-3')：5'-CGGCGACACUUGAUCUAUATT-3'SEQ ID NO.13

反义链(3'-5')：3'-TTGCCGCUGUGAACUAGAUAU-5'SEQ ID NO.14

Si-ace2_002：CAGACACGATGATGAAAGA

正义链(5'-3')：5'-CAGACACGAUGAUGAAAGATT-3'SEQ ID NO.15

反义链(3'-5')：3'-TTGUCUGUGCUACUACUUUCU-5'SEQ ID NO.16

Si-ace2_003：CTGGCTATTCGTTGGATAA

正义链(5'-3')：5'-CUGGCUAUUCGUUGGAUAATT-3'SEQ ID NO.17

反义链(3'-5')：3'-TTGACCGAUAAGCAACCUAUU-5'SEQ ID NO.18

上述SEQ ID NO7－18的siRNA的3'末端设有两个TT的悬挂碱基。

以上述每对siRNA做为有效成份，DEPC水稀释，分别制备成所述生物农药。

（3）将siRNA均匀涂布于甘蓝叶片并喂食小菜蛾二龄幼虫：将siRNA用DEPC水稀释成浓度为100ppm的溶液（生物农药）,然后均匀涂布于甘蓝叶片上，叶面浓度为3.0μg/cm²,将该叶片喂食二龄小菜蛾。每对siRNA处理30头虫，设3个重复，并用DEPC水作为阴性对照组。之后，于12h、24h、48h分别调查虫子的死亡数，计算死亡率。

（4）上述siRNA致死中浓度LC50值的计算：将siRNA用DEPC水稀释成不同浓度梯度：0ppm、10ppm、50ppm、100ppm、200ppm，制备成所述生物农药，取400μl均匀涂于甘蓝叶片（8cm2），每个重复10头虫，设三个重复，之后在48h统计死亡虫口数，计算LC50和LC90值。

（5）Si-ace2_001siRNA的室内防治效果：用盆栽实验的方法来确定Si-ace2_001siRNA的室内防治效果。在每个盆栽甘蓝植物上放置50头小菜蛾，然后对每盆栽甘蓝喷施5ml的以Si-ace2_001号siRNA为有效成份的生物农药,其浓度为100ppm。设两个重复。用DEPC水做为对照。

（6）将Si-ace2_001siRNA与上述阳离子聚合物做为有效成份制备成生物农药siRNA的浓度为10ppm，N:P为10：1，均匀涂布于甘蓝叶片并喂食小菜蛾二龄幼虫，siRNA叶面浓度为3.0μg/cm2。每个siRNA处理30头虫，设3个重复，并用DEPC水作为阴性对照组。之后，于12h、24h、48h分别调查虫子的死亡数，计算死亡率，实验结果如表5。

通过本实验发现，经过自然饲喂涂有所述的生物农药的叶片后，昆虫出现显著死亡（请参见图5）。

表3：饲喂涂有乙酰胆碱脂酶基因siRNA的生物农药的甘蓝叶片后对小菜蛾死亡率的对比统计

表4：Si-ace2_001siRNA的致死中浓度值的计算。

由此表计算出Si-ace2_001siRNA的LC50=8.20ppm；LC95=935.70ppm

表5：饲喂涂有乙酰胆碱脂酶基因Si-ace2_001siRNA和阳离子聚合物的生物农药的甘蓝叶片后对小菜蛾死亡率的对比统计

实验中1-4号siRNA生物农药：1号为聚乙烯亚胺(PEI)、2为聚赖氨酸、3号为明胶和4为壳聚糖。

实施例四

本实例特别提供了小菜蛾乙酰胆碱酯酶基因的Si-ace1_001siRNA和线粒体复合物ⅢFe-S亚基基因Si-UQCR_003siRNA混合使用,通过自然饲喂此靶标基因siRNA混合生物农药后对鳞翅目昆虫如小菜蛾造成了致命的影响。

本实例是用于防治鳞翅目昆虫小菜蛾（Plutella xylostella）的方法。通过喂食含有沉默乙酰胆碱酯酶基因1和线粒体复合物ⅢFe-S亚基基因的混合siRNA的生物农药，（1）表现出电子传递受阻，最终因无法正常合成ATP；（2）影响昆虫正常的神经冲动传递，使昆虫持续处于兴奋状态，从而引起昆虫死亡，进而实现了对昆虫的有效治理。

siRNA混配毒力实验：将Si-UQCR_003siRNA siRNA和Si-ace1_001siRNA等浓度混配，然后均匀涂布于甘蓝叶片上，叶面siRNA浓度为3μg/cm²,将该叶片喂食三龄小菜蛾。处理了10头虫，分别在12h、24h、48h调查其死亡率分别为:40%、60%、75%。

通过本实例发现，经过自然饲喂涂有选定基因的混合siRNA叶片后，昆虫死亡明显比单个siRNA增加。

实施例五

本实例特别提供了小菜蛾γ-氨基丁酸受体基因的siRNA,通过自然饲喂此靶标基因siRNA后对鳞翅目昆虫如小菜蛾造成了致命的影响。

本实例是用于防治鳞翅目昆虫小菜蛾（Plutella xylostella）的方法。通过喂食含有沉默γ-氨基丁酸受体(GeneBank登录号为EU273945)的siRNA，从而影响昆虫正常的突触传递,造成神经功能失常，进而实现对昆虫的有效治理。

γ-氨基丁酸(GABA)是动物（昆虫）体内一种主要的抑制性神经递质,GABA是一种来源于非蛋白质的重要氨基酸,它的合成受谷氨酸脱酸酶控制,通过与GABA受体结合而引起神经传递的抑制，使突触后神经元处于保护性抑制状态（KerrD.IB.,Ong J.GABA agonists andantagonists.Med Res Rev,2002,12(6):593～636），GABA受体是杀虫剂最重要靶标之一。本发明的生物学原理就是通过沉默昆虫γ-氨基丁酸受体基因mRNA，进而影响昆虫正常的突触传递,造成神经功能失常，从而达到害虫防治的目的。

具体而言，该饲喂含siRNA的生物农药抑制昆虫基因表达的方法，是对昆虫直接饲喂含有特定基因的siRNA，导致昆虫显著死亡，通过该方法对昆虫对应的某一特定靶标基因的表达进行抑制。所述方法主要包括以下步骤：

（1）昆虫特定功能基因的选择：

考虑到昆虫γ-氨基丁酸受体在神经冲动传递中的关键作用，因此本发明选择该特定功能的基因为沉默对象。

小菜蛾γ-氨基丁酸受体基因siRNA的设计和合成，序列如下：

Si-GABA_001：GGGTCTATTACCAGAAGTA

正义链(5'-3')：5'-GGGUCUAUUACCAGAAGUATT-3'SEQ ID NO.19

反义链(3'-5')：3'TTCCCAGAUAAUGGUCUUCAU-5'SEQ ID NO.20

Si-GABA_002：CCATGTATGTGCTCTCTAT

正义链(5'-3')：5'-CCAUGUAUGUGCUCUCUAUTT-3'SEQ ID NO.21

反义链(3'-5')：3'-TTGGUACAUACACGAGAGAUA-5'SEQ ID NO.22

Si-GABA_003：GTGGAGGAGACGAGGATAA

正义链(5'-3')：5'-GUGGAGGAGACGAGGAUAATT-3'SEQ ID NO.23

反义链(3'-5')：3'-TTCACCUCCUCUGCUCCUAUU-5'SEQ ID NO.24以上述每对siRNA做为有效成份，DEPC水稀释，分别制备成所述生物农药。

（3）将siRNA均匀涂布于甘蓝叶片并喂食小菜蛾二龄幼虫：将siRNA用DEPC水稀释成浓度为100ppm的溶液（生物农药）,然后均匀涂布于甘蓝叶片上，叶面浓度为3.0μg/cm²,将该叶片喂食二龄小菜蛾。每个siRNA处理30头虫，设3个重复，并用DEPC水作为阴性对照组。之后，于12h、24h、36h、48h、60h、72h分别调查虫子的死亡数，计算死亡率（表六）。

（4）将Si-GABA_001siRNA与上述阳离子聚合物制备成生物农药，并均匀涂布于甘蓝叶片并喂食小菜蛾二龄幼虫，其叶面浓度为3.0μg/cm2。每个siRNA处理30头虫，设3个重复，并用鱼藤酮作为阳性对照组。之后，于24h、48h、72h分别调查虫子的死亡数，计算死亡率，实验结果如表7。

通过本实验发现，经过自然饲喂涂有选定基因的siRNA叶片后，导致昆虫个体显著死亡。

表6：饲喂涂有γ-氨基丁酸基因siRNA的甘蓝叶片后对小菜蛾死亡率的对比统计

表7：饲喂涂有γ-氨基丁酸基因Si-GABA_001siRNA（SEQ ID NO.19和20）和阳离子聚合物的生物农药（N：P为50：1）的甘蓝叶片后对小菜蛾死亡率的统计

001-005号:001号为壳聚糖，002号为聚赖氨酸，003号为明胶，004号为聚乙烯亚胺(PEI)，005号为鱼藤酮。

实施例六

本实例特别提供了小菜蛾脱皮激素受体基因的siRNA,通过自然饲喂此靶标基因siRNA后对鳞翅目昆虫如小菜蛾脱皮发育过程造成了不良影响。

本实例是用于防治鳞翅目昆虫小菜蛾（Plutella xylostella）的方法。通过喂食含有沉默脱皮激素受体(GeneBank登录号为EF417852)的siRNA，从而影响昆虫正常的脱皮过程,进而实现对昆虫的有效治理。

昆虫的蜕皮、变态和繁殖受到蜕皮激素的严格调控.蜕皮激素作用靶标由蜕皮激素受体(ecdvsteroid receptor,EcR)和超气门蛋白(ultraspiracle protein,USP)组成,蜕皮激素与EcR/USP作用启动蜕皮级联反应过程.本发明试图通过阻断小菜蛾脱皮激素受体基因的表达，干扰其正常的脱皮过程，进而实现防治害虫的目的。

具体而言，该饲喂siRNA抑制昆虫基因表达的方法，是对昆虫直接饲喂含有特定基因的siRNA，导致昆虫发育不良或死亡，通过该方法对昆虫对应的某一特定基因的表达进行抑制。所述方法主要包括以下步骤：

（1）昆虫特定功能基因的选择：

考虑到昆虫脱皮激素受体在昆虫脱皮发育中的关键作用，因此本发明选择该特定功能的基因为沉默对象。

小菜蛾脱皮激素受体基因siRNA的设计和合成：

Si-EcR_001(R S27/A29)：CTCACTCAAGCTCAAGAACAAGAAGCTGC（边框表示siRNA靶点）

正义链(5'-3')：5'-CACUCAAGCUCAAGAACAAGAAGCUGC 3'SEQ ID NO.25

反义链(3'-5')：3'GAGUGAGUUCGAGUUCUUGUUCUUCGACG 5'SEQ ID NO.26

Si-EcR_002(R S27/A29)：AGGCACAAAGGGAGAAGGATAAGCTGCCT（边框表示siRNA靶点）

正义链(5'-3')：5'-GCACAAAGGGAGAAGGAUATT-3'SEQ ID NO.27

反义链(3'-5')：3'-TTCGUGUUUCCCUCUUCCUAU-5'SEQ ID NO.28

Si-EcR_003(R S27/A29)：CTGCATGTACTCGCTGAATATGGACAATA（边框表示siRNA靶点）

正义链(5'-3')：5'-GCAUGUACUCGCUGAAUAUTT-3'SEQ ID NO.29

反义链(3'-5')：3'-TTCGUACAUGAGCGACUUAUA-5'SEQ ID NO.30

上述SEQ ID NO27－30的siRNA的3'末端设有两个TT的悬挂碱基。

（3）将siRNA均匀涂布于甘蓝叶片并喂食小菜蛾二龄幼虫：将siRNA用DEPC水稀释成浓度为100ppm的溶液,（生物农药）然后均匀涂布于甘蓝叶片上，叶面浓度为3.0μg/cm²,将该叶片喂食二龄小菜蛾。每个siRNA处理30头虫，设3个重复，并用DEPC水作为阴性对照组。之后，于12h、24h、36h、48h、60h、72h分别调查虫子的死亡数，计算死亡率。通过本实验发现，经过自然饲喂涂有选定基因的siRNA叶片后，导致昆虫个体表现出脱皮未尽的症状（参见图6），但死亡并不显著。

Claims

1.一种生物农药，其特征是，以针对小菜蛾靶标基因的siRNA为有效成份，所述siRNA为体外化学合成17-50nt的双链RNA，所述靶标基因为乙酰胆碱酯酶基因、或为乙酰胆碱酯酶基因和γ-氨基丁酸受体基因、或为乙酰胆碱酯酶基因和线粒体复合物ⅢFe-S亚基基因、或为乙酰胆碱酯酶基因和线粒体复合物ⅢFe-S亚基基因以及γ-氨基丁酸受体基因，其中，针对小菜蛾乙酰胆碱酯酶基因的siRNA为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，以及选自SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9及SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和SEQID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18中的零对或一对以上；针对线粒体复合物ⅢFe-S亚基基因的siRNA为SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6中的一对或多对；针对γ-氨基丁酸受体基因的siRNA为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24中的一对或多对。

2.根据权利要求1所述的生物农药，其特征是，还包括有阳离子聚合物为有效成份，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚赖氨酸或明胶。

3.根据权利要求1－2任一项所述的生物农药，其特征是，所述siRNA经化学修饰或siRNA3'末端还设有以两个脱氧核苷的组合的悬挂碱基。

4.一种昆虫防治方法，其特征是，将权利要求1－3任一项所述的生物农药喂食鳞翅目昆虫，所述鳞翅目昆虫为小菜蛾。

5.根据权利要求4所述的昆虫防治方法，其特征是，所述喂食方式为：将所述生物农药直接喷雾在鳞翅目昆虫食用的农作物的叶片上，让昆虫自然取食，所述siRNA的叶面浓度大于0.1μg/cm²，所述鳞翅目昆虫为小菜蛾。

6.一种用于制备针对鳞翅目昆虫的生物农药的siRNA，其特征是，所述siRNA包括有：针对乙酰胆碱酯酶基因的siRNA为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，以及选自SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ IDNO.18中的零对或一对以上，所述鳞翅目昆虫为小菜蛾。

7.根据权利要求6所述的用于制备针对鳞翅目昆虫的生物农药的siRNA，其特征是，所述siRNA还包括有针对线粒体复合物ⅢFe-S亚基基因的siRNA为SEQ IDNO.1及SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6中的一对或多对，和/或针对γ-氨基丁酸受体基因的siRNA为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ IDNO.24中的一对或多对。