ES2348509T3

ES2348509T3 - Nuevas proteínas insecticidas de bacillus thuringiensis.

Info

Publication number: ES2348509T3
Application number: ES03744850T
Authority: ES
Inventors: Stijn Vanneste; Greta Arnaut; Karel De Rudder; Annemie Boets; Jeroen Van Rie
Original assignee: Bayer Bioscience NV
Current assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 2002-03-22
Filing date: 2003-03-20
Publication date: 2010-12-07
Anticipated expiration: 2023-03-20
Also published as: AU2003209748A1; BRPI0308659B8; ATE469171T1; EP1490397B2; BR0308659A; AU2003209748B2; WO2003080656A1; BRPI0308659B1; CA2479769C; MXPA04009206A; DK1490397T3; CA2479769A1; EP1490397B1; EP1490397A1; ES2348509T5

Abstract

Una proteína aislada insecticida para Ostrinia nubilalis, que comprende la se- cuencia de aminoácidos de una variante de la proteína de SEQ ID No. 4, en donde dicha variante tiene 5 a 10 aminoácidos añadidos, reemplazados o delecionados en comparación con la proteína de SEQ ID No. 4 sin cambio significativo de la actividad insecticida de la proteína.

Description

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo del control de plagas de las plantas, parti-cularmente control de los insectos. Se proporcionan nuevas secuencias de ácido nucleico procedentes de cepas de Bacillus thuringiensis (Bt), que codifican proteínas insecticidas expresadas durante las etapas de crecimiento vegetativo. Particularmente, se proporcionan 10 secuencias de DNA que codifican una proteína designada como ISP3-327D, que son útiles para proteger las plantas contra el deterioro causado por los insectos. Se proporcionan adi-cionalmente plantas y microorganismos que comprenden al menos una de las nuevas molé-culas de ácido nucleico, así como métodos y medios para utilizar estas secuencias de ácido nucleico para reducir el deterioro de las plantas causado por los insectos. 15

Antecedentes de la técnica

Las plagas de insectos causan enormes pérdidas económicas mundialmente en la producción de cosechas, y los agricultores se enfrentan todos los años a la amenaza de pérdidas de rendimiento debida a la infestación por insectos. La ingeniería genética de re-sistencia a los insectos en las cosechas agrícolas ha constituido un enfoque atractivo para 20 reducir los costes asociados con la gestión de las cosechas y las prácticas de control de los productos químicos. Las primeras generaciones de cosechas resistentes a los insectos se han introducido en el mercado desde 1996, basadas en la expresión en plantas de proteínas aisladas de la bacteria gram-positiva del suelo Bacillus thuringiensis (Bt)). Las proteínas insecticidas Cry de Bt se producen durante la etapa de esporulación de cepas Bt y las pro-25 teínas se acumulan en grandes cristales citoplásmicos en el interior de la bacteria. Cuando son consumidas por los insectos, una proteína Cry de Bt típica tóxica para los Lepidópteros se solubiliza y se procesa en el intestino medio de los insectos en una forma activa de aproximadamente 60 a 65 kDa. La proteína activa ejerce su efecto físico por fijarse a las células epiteliales del intestino medio, causando la formación de poros en la membrana 30 celular, lo que conduce a la lisis osmótica de las células (Gill et al., 1992).

Una cepa Bt puede producir muchas toxinas diferentes. Desde el aislamiento de la primera proteína insecticida cristalina codificada por el gen de Bt en 1981 (Schnepf y White-ley, 1989) han sido clonados más de 100 genes codificantes de toxinas Cry de Bt y han sido controladas eficazmente plagas de insectos por expresión de proteínas derivadas de Bt en 35 importantes especies de cosechas agrícolas. Sin embargo, el uso de proteínas Bt individua-les se ve limitado a menudo, dado que la mayoría de las proteínas Bt son principalmente activas sólo contra un número relativamente pequeño de las numerosas plagas de insectos

existentes. Se cree que la especificidad de las proteínas Cry de Bt viene determinada por factores tales como la activación de la toxina en el intestino del insecto (Haider et al., 1986) y su capacidad para fijar receptores específicos (Hoffmann et al., 1988).

Esta ampliamente reconocido que existe el riesgo de que las especies de insectos susceptibles puedan desarrollar resistencia contra las toxinas Cry de Bt. Por consiguiente, 5 se han realizado esfuerzos activos para identificar nuevas proteínas insecticidas. Una estra-tegia, que ha sido utilizada, consistía en cribar cepas de Bacillus para la producción de pro-teínas insecticidas durante las etapas de crecimiento vegetativo, en lugar de hacerlo durante las etapas de esporulación. Utilizando este enfoque, han sido identificadas varias "proteínas insecticidas vegetativas" o "VIPs". 10

Estruch et al. (1996), WO94/21795, WO96/10083, WO98/44137, US 5,877,012, US 6,107,279, US 6,137,033 y US 6,291,156 describen el aislamiento de vip3A(a), vip3A(b) y vip3A(c) a partir de fluidos sobrenadantes de las cepas BT AB88, AB424 y AB51. De acuer-do con los autores, estos genes codifican proteínas con actividad insecticida frente a una extensa gama de plagas de insectos Lepidópteros. 15

WO 98/18932 y WO 99/57282 describen cierto número de secuencias de nucleóti-dos aisladas de cepas Bt. A estas secuencias se hace referencia como mis (mis-1 a mis-8), war y sup. De acuerdo con los autores, las proteínas codificadas tienen actividad contra plagas de Lepidópteros o Coleópteros.

WO 00/09697 describe toxinas termolábiles, de tipo soluble MIS y de tipo WAR, así 20 como toxinas de menor tamaño (1 a 10 kDa), que pueden obtenerse a partir del sobrena-dante de cultivos de cepas de Bacillus laterosporus, que, de acuerdo con los autores, tienen actividad contra las larvas de la Oruga de las Raíces del Maíz Occidental.

WO 98/00546 y US 6.274.721 describen el aislamiento de cepas Bt y toxinas Bt, que, de acuerdo con los autores, tienen actividad contra plagas de Lepidópteros. 25

WO 99/33991 describe el aislamiento de cepas Bt y toxinas Bt, que, de acuerdo con los autores, tienen actividad contra plagas de Lepidópteros.

Recientemente, Selvapandiyan et al. (2001) han descrito el aislamiento de un gen que codifica una proteína designada como VIP-S. De acuerdo con los autores, la proteína VIP-S exhibía toxicidad contra cierto número de especies de insectos Lepidópteros. 30

Doss et al. (2002) describen la clonación de VIP3V a partir de la cepa krustaki de Bt.

WO 02/078437 describe toxinas VIP3 de Bt, tales como las toxinas híbridas VIP3A, VIP3B y VIP3A-B.

A pesar del aislamiento y caracterización de un número relativamente grande de diferentes proteínas insecticidas hasta la fecha, persiste la necesidad de identificación, ais-35 lamiento y caracterización de nuevas proteínas insecticidas. Las razones para esto son múltiples. En primer lugar, debido a la especificidad de las proteínas insecticidas para gru-pos particulares de plagas diana, (espectros de insectos hospedadores), hay necesidad de

clonar genes que codifiquen proteínas con diferentes espectros de actividad, a fin de que para diferentes cosechas y diferentes regiones geográficas estén disponibles proteínas ade-cuadas para combatir plagas de insectos. La especificidad de las proteínas Cry de Bt, por ejemplo, es muy limitada. La identificación de toxinas con especificidad para diferentes in-sectos diana sigue siendo deseable. En segundo lugar, después del uso prolongado en una 5 región geográfica, se sabe que los insectos tienen capacidad para desarrollar resistencia frente a los insecticidas químicos, pulverizaciones microbianas (basadas por ejemplo en mezclas de cristales de esporas Bt), y se cree que tienen capacidad para desarrollar resis-tencia frente a las plantas que expresan proteínas insecticidas. El desarrollo de resistencia en las poblaciones de insectos podría hacer potencialmente ineficaces las proteínas insecti-10 cidas existentes, dando lugar a una necesidad de nuevos genes y proteínas. En tercer lugar, por razones de salud y ambientales, es deseable identificar proteínas con potencia insectici-da alta específica y bioactividad aguda frente a especies de insectos diana.

En lo sucesivo, con inclusión de las diferentes realizaciones descritas en las reivin-dicaciones, se describen nuevas secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácidos 15 aisladas de cepas de Bacillus thuringiensis, que son útiles para proteger las plantas contra el deterioro causado por los insectos, sea por la expresión de las secuencias de ácido nu-cleico en las plantas bajo el control de promotores adecuados, o por aplicación externa de las toxinas a las plantas. Las toxinas de la presente invención son distintas de las toxinas plaguicidas descritas anteriormente. 20

Sumario de la invención

La invención proporciona proteínas ISP3 insecticidas y ácidos nucleicos codificantes de las mismas. Se proporciona la proteína insecticida ISP3-327D (SEQ ID No. 4) y los áci-dos nucleicos que codifican la misma, isp3-327D (SEQ ID No. 3). La proteína de la inven-ción tiene actividad insecticida contra plagas de insectos Lepidópteros, particularmente 25 contra insectos seleccionados del grupo constituido por Helicoverpa zea, Helicoverpa armi-gera, Helicoverpa punctigera, Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugiperda, Agrotis ipsilon, Pectinophora gossypiella, Scirphophaga incertulas, Cnaphalocrocis medina-lis, Sesamia inferens, Chilo partellus, Anticarsia gemmatalis, Plathypena scabra, Pseudoplu-sia includens, Spodoptera exigua, Spodoptera ornithogalli, Epinotia aporema y Rachiplusia 30 nu.

En otra realización de la invención, se proporcionan variantes y fragmentos insecti-cidas de la proteína ISP3, y de los ácidos nucleicos que codifican la misma.

En una realización, la proteína ISP3 reivindicada de la invención es una proteína aislada insecticida para Ostrinia nubilalis, que comprende la secuencia de aminoácidos de 35 una variante de la proteína de SEQ ID No. 4, en donde dicha variante tiene 5 a 10 aminoá-cidos añadidos, reemplazados o delecionados comparada con la proteína de SEQ ID No. 4 sin cambiar significativamente la actividad insecticida de la proteína; o dicha proteína que

comprende la secuencia de aminoácidos de una variante de SEQ ID No. 4 en donde dicha variante tiene menos de 5 aminoácidos añadidos, reemplazados o delecionados en compa-ración con la proteína de SEQ ID No. 4 sin cambiar significativamente la actividad insectici-da de la proteína.

En otra realización, la proteína ISP3 reivindicada es una proteína que comienza con 5 un dipéptido Met-Asp o Met-Ala, por inserción de un codón codificante de un aminoácido Asp o Ala aguas abajo del codón inicial en el DNA codificante de dicha proteína, o es una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4.

Una proteína ISP3 reivindicada, como se proporciona en esta memoria, es también una proteína aislada insecticida para Ostrinia nubilalis, que comprende la secuencia de ami-10 noácidos del fragmento más pequeño de la proteína de SEQ ID No. 4 que retiene actividad insecticida, que se obtiene por digestión enzimática de la proteína de SEQ ID No. 4 con fluido del jugo intestinal de Ostrinia nubilalis.

Se proporciona adicionalmente en esta memoria una proteína ISP3 reivindicada que es insecticida contra Pectinophora gossypiella, Scirphophaga incertulas, Cnaphalocrocis 15 medinalis, Sesamia inferens, Chilo partellus y Anticarsia gemmatalis.

En una realización adicional de la invención, se proporcionan secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican la proteína ISP3 reivindicada, tales como una secuencia de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 1 a 2367 de SEQ ID No. 3.

En otra realización adicional, se proporcionan secuencias de ácido nucleico que 20 codifican las proteínas ISP3 reivindicadas de la invención, en donde la secuencia de ácido nucleico es una secuencia sintética que se ha optimizado para expresión en plantas mono-cotiledóneas o dicotiledóneas o células vegetales.

Es otro objetivo de la invención proporcionar genes quiméricos, que comprenden una secuencia promotora enlazada operativamente a una secuencia de ácido nucleico que 25 codifica la proteína ISP3-327D, o variantes con actividad insecticida o fragmentos de las mismas como se reivindica en esta memoria. Se proporcionan también vectores que com-prenden secuencias de nucleótidos que codifican proteínas ISP3, particularmente ISP3-327D, o variantes o fragmentos activos como insecticidas de las mismas como se reivindica en esta memoria. 30

La invención proporciona adicionalmente células hospedadoras que comprenden genes quiméricos, particularmente microorganismos o células vegetales, tejidos de plantas, órganos de plantas, semillas de plantas o plantas enteras transgénicas que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican la proteína ISP3-327D, o fragmentos activos como insecticidas o variantes de los mismos como se reivindican en esta memoria. En una reali-35 zación, la planta transformada es una planta de maíz o algodón. En otra realización, la plan-ta transformada es una planta de arroz o soja. En una realización adicional, la planta transformada es cualquier planta, particularmente cualquier planta seleccionada del grupo

de sorgo, trigo, cebada, centeno, girasol, caña de azúcar, tabaco, especies de Brassica (tales como colza oleaginosa, mostaza, col, brócoli, etc.), especies de hortalizas (tomate, coliflor, rábano, espinaca, pimiento, cebolla, judía, guisante, zanahoria, etc.), remolacha azucarera, especies de árboles (manzano, peral, ciruelo, coníferas, árboles de hoja caduca, etc.), patata, alfalfa, mango, papaya, banana. 5

En otra realización, se proporcionan métodos de protección de una planta contra el deterioro causado por los insectos, que comprenden poner en contacto dicha planta con una proteína insecticida ISP3 reivindicada. La planta puede ponerse en contacto con dicha pro-teína ISP3 por transformación de la planta con una secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína ISP3 o por aplicación de dicha proteína ISP3 externamente a la planta. 10

En una realización de la invención, se proporciona una cepa Bt que comprende el ácido nucleico ISP3 reivindicado, particularmente isp3-327D. En una realización adicional, se proporciona una composición insecticida que comprende una cantidad eficaz como in-secticida de la proteína ISP3 reivindicada. Cuando se aplica externamente a una planta, la composición insecticida aumenta la resistencia al deterioro causado por los insectos en 15 comparación con las plantas de control, a las cuales no se ha añadido dicha composición.

Se proporciona también en esta memoria el uso de la proteína ISP3 reivindicada contra una plaga de insectos Lepidópteros del algodón, maíz, arroz o soja, particularmente cuando dicha plaga de insectos es Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugiperda, Pectinophora gossypiella, Scirphophaga incertulas, Cnaphalocrocis 20 medinalis, Sesamia inferens, Chilo partellus y Anticarsia gemmatalis.

Se proporciona adicionalmente en esta memoria una planta que comprende el gen quimérico reivindicado, que se expresa simultáneamente con la proteína de SEQ ID No. 4 o su fragmento o variante: una proteína Cry, una proteína Cry1F, un híbrido derivado de una proteína Cry1F, una proteína de tipo Cry1A o un fragmento tóxico de la misma, una proteína 25 Cry1Ac o un híbrido derivado de la misma, una proteína Cry1Ab o un fragmento insecticida de la misma, una proteína Cry2Ae, una proteína VIP3Aa o un fragmento tóxico de la misma, o una proteína insecticida de cepas de especies de Xenorhabdus, Serratia o Photorhabdus; particularmente dicha planta que es maíz, arroz, algodón, o soja, o una que es una planta híbrida. 30

Se proporciona también en esta memoria el uso de la proteína ISP3 reivindicada, co-expresada en plantas de maíz, arroz, algodón o soja, en combinación con otra proteína de control de los insectos, en donde dicha otra proteína de control de los insectos es: una proteína Cry1Ac, una proteína Cry1Ab, una proteína Cry2Ae, o una proteína VIP3Aa o deri-vados de las mismas. 35

Se proporciona adicionalmente en esta memoria la célula de la planta o la planta que comprende el gen quimérico reivindicado, que comprende también un gen PAT que

confiere resistencia al glufosinato de amonio, o un gen 2mEPSPS que confiere resistencia al glifosato.

Descripción detallada de las realizaciones

El campo de la invención consiste en proporcionar métodos y medios para reducir el deterioro causado a las plantas por plagas, particularmente plagas de insectos, más particu-5 larmente plagas de insectos Lepidópteros. Se han identificado y aislado nuevas secuencias de ácido nucleico y proteínas, que son distintas de las secuencias de ácido nucleico y pro-teínas descritas anteriormente, y que pueden utilizarse para controlar plagas de insectos por integración y expresión de al menos una de estas nuevas secuencias de nucleótidos en las plantas o células de las plantas o por tratamiento externo de las plantas o partes de las 10 plantas con composiciones que comprenden las proteínas codificadas por estas moléculas de ácido nucleico.

Es una realización de la invención proporcionar nuevas toxinas plaguicidas aisladas de las cepas de Bacillus thuringiensis. Particularmente, se proporciona una proteína plagui-cida designada como ISP3-327D. 15

De acuerdo con esta invención, una "secuencia de ácido nucleico" se refiere a una molécula de DNA o RNA en forma monocatenaria o bicatenaria, preferiblemente un DNA o RNA, particularmente un DNA, que codifica cualquiera de las proteínas ISP3 de esta inven-ción. Una "secuencia de ácido nucleico aislada", como se utiliza en esta memoria, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que ya no está en el ambiente natural del que se aisló, 20 v.g., la secuencia de ácido nucleico en otro hospedador bacteriano o en un genoma nuclear de planta.

De acuerdo con esta invención, los términos "proteína" o "polipéptido" se utilizan intercambiablemente para hacer referencia a una molécula constituida por una cadena de aminoácidos, sin referencia a ningún modo de acción específico, tamaño, estructuras tridi-25 mensionales u origen. Por tanto, un fragmento o porción de una proteína ISP3 de la inven-ción se designa también en esta memoria como una "proteína". Una "proteína aislada", como se utiliza en esta memoria, se refiere a una proteína que ya no existe en su ambiente natural. El ambiente natural de la proteína se refiere al ambiente en el cual podía encontrar-se la proteína cuando la secuencia de nucleótidos codificante de la misma se expresó y se 30 tradujo en su ambiente natural, es decir en el ambiente del que se aisló la secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, una proteína aislada puede estar presente in vitro, o en otro hos-pedador bacteriano o en una célula vegetal o puede secretarse de otro hospedador bacte-riano o de una célula vegetal.

De acuerdo con esta invención, se han aislado y caracterizado secuencias de ácido 35 nucleico, particularmente secuencias de DNA, que codifican nuevas proteínas ISP3. El nue-vo gen se designó isp3-237D y su proteína codificada ISP3-327D.

De acuerdo con esta invención, "proteína ISP3-327D" se refiere a cualquier proteína insecticida para Ostrinia nubilalis que comprende la secuencia de aminoácidos del fragmen-to más pequeño de la proteína de SEQ ID No. 4 que retiene actividad insecticida, que se obtiene por digestión enzimática de la proteína SEQ ID No. 4 con fluido de jugo intestinal de Ostrinia nubilalis (a la que se hace referencia en lo sucesivo en esta memoria como "frag-5 mento tóxico más pequeño"). Esto incluye proteínas híbridas o quiméricas que comprenden el fragmento tóxico más pequeño. Se describen también en esta memoria variantes reivindi-cadas de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4, tales como secuencias de aminoá-cidos esencialmente similares, que tienen una identidad de secuencia de al menos 91%, particularmente al menos 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% al nivel de la se-10 cuencia de aminoácidos, tal como se determina utilizando alineaciones apareadas que em-plean el programa GAP del paquete Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin, EE.UU., versión 10.2). Se utiliza el programa GAP con los parámetros siguientes para las compara-ciones de secuencias de aminoácidos: la matriz de registro 'blosum62', una 'penalidad por creación de laguna' (o 'peso de laguna') de 8 y una 'penalidad por extensión de laguna' (o 15 'peso de longitud') de 2. En una realización de la invención, se proporciona una variante de proteína ISP3 insecticida para Ostrinia nubilalis que tiene 5-10, particularmente menos de 5, aminoácidos añadidos, reemplazados o delecionados sin cambio significativo, preferible-mente sin cambio de la actividad insecticida de la proteína, o al menos sin cambio de la actividad insecticida de la proteína de manera negativa. 20

Como se utiliza en esta memoria, "que comprende" debe interpretarse como especi-ficación de la presencia de las características expuestas, entidades, pasos o componentes a los que se hace referencia, pero no excluye la presencia o adición de una o más caracterís-ticas, entidades, pasos o componentes, o grupos de los mismos. Así pues, el término "DNA/proteína que comprende la secuencia o región X", como se utiliza en esta memoria, 25 hace referencia a un DNA o proteína que incluye o contiene al menos la secuencia o región X, de tal modo que otras secuencias de nucleótidos o aminoácidos pueden incluirse en el extremo 5' (o terminal N) y/o 3' (o terminal C), v.g. (la secuencia de nucleótidos de) una pro-teína marcadora seleccionable como se expone en EP 0 193 259 (la secuencia de nucleóti-dos de) un péptido de tránsito, y/o una secuencia conductora 5' o 3'. 30

El "fragmento tóxico más pequeño" de una proteína ISP3 de la invención, como se utiliza en esta memoria, es aquel fragmento o porción más pequeño de una proteína ISP3 que retiene actividad insecticida que puede obtenerse por digestión enzimática de la proteí-na ISP3 de longitud total (el mismo fragmento o porción de una proteína ISP3 que contiene actividad insecticida puede obtenerse también por realización de deleciones de nucleótidos 35 en el DNA que codifica una proteína ISP3). Debe entenderse que el DNA que codifica los fragmentos ISP3 tóxicos más cortos reivindicados en esta memoria puede sintetizarse tam-

bién químicamente, y que el fragmento tóxico más pequeño obtenible por transcripción y traducción de DNA sintético está incluido en la definición del fragmento tóxico más pequeño.

En una realización de la invención, el fragmento tóxico más pequeño de una proteí-na ISP3 tiene un peso molecular de aproximadamente 65 kDa como se determina por análi-sis SDS-PAGE (electroforesis en gel dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida). En otra 5 realización, el fragmento tóxico más pequeño de una proteína ISP3 tiene un peso molecular de aproximadamente 23 kDa. En otra realización, el fragmento tóxico más pequeño de una proteína ISP3 tiene un peso molecular de aproximadamente 33 kDa. En una realización adicional, el fragmento tóxico más pequeño comprende los aminoácidos centrales de una proteína ISP3, en particular desde el aminoácido 200 al aminoácido 455 de SEQ ID No. 4. 10

Las digestiones enzimáticas de las proteínas ISP3 pueden realizarse utilizando en-zimas purificadas o utilizando fluidos de jugo intestinal de larvas de insecto e incubando extractos de jugo intestinal con soluciones que comprenden una de las proteínas ISP3, co-mo se describe en Yu et al. (1997). Los productos proteolíticos pueden separarse y visuali-zarse en SDS-PAGE. Los bioensayos pueden realizarse con fragmentos de proteína 15 procesados, fraccionados cromatográficamente a fin de determinar la relación entre cada fragmento proteolítico y su actividad insecticida. El jugo intestinal preferido utilizado para determinar el fragmento tóxico más pequeño de las proteínas ISP3 es jugo intestinal de insectos Lepidópteros, preferiblemente de la Oruga de las Mazorcas del Maíz (Helicoverpa zea), la Oruga de las Cápsulas del Algodón (Helicoverpa armigera), la Oruga de los Brotes 20 Nativa (Helicoverpa punctigera), la Oruga de los Brotes del Tabaco (Heliothis virescens), el Perforador del Maíz Europeo (Ostrinia nubilalis), la Larva de la Esciara de Otoño (Spodopte-ra frugiperda), la Noctuida Negra (Agrotis ipsilon), la Oruga Rosa de las Cápsulas (Pecti-nophora gossypiella), el Perforador Amarillo de los Vástagos (Scirphophaga incertulas), el Doblador de las Hojas (Cnaphalocrocis medinalis), el Perforador Rosa de los Vástagos (Se-25 samia inferens), el Perforador Moteado de los Vástagos del Maíz (Chilo partellus), la Oruga Aterciopelada (Anticarsia gemmatalis), el Geómetra de la Soja (Pseudoplusia includens), el Perforador de las Vainas (Epinotia aporema), Rachiplusia nu.

Los extremos de las secuencias de aminoácidos N- y C-terminales del fragmento tóxico más pequeño se determinan convenientemente por determinación de la secuencia de 30 aminoácidos de los fragmentos anteriores por métodos disponibles rutinariamente en la técnica.

Como se utiliza en esta memoria, el término "isp3-327D" se refiere a cualquier se-cuencia de DNA que codifica la "proteína ISP3-327D", como se define anteriormente. Esto incluye secuencias de DNA existentes naturalmente, artificiales o sintéticas que codifican las 35 proteínas de SEQ ID No. 4, o sus fragmentos o variantes insecticidas como se reivindica en esta memoria. Se incluyen también secuencias de DNA, que codifican las proteínas insecti-cidas reivindicadas, que son lo bastante similares a las secuencias de DNA proporcionadas

en el listado de secuencias para que las mismas puedan (es decir, tengan la aptitud para) hibridarse a estas secuencias de DNA en condiciones de hibridación severas.

"Condiciones de hibridación severas", como se utiliza en esta memoria, se refiere particularmente a las condiciones siguientes: inmovilización del DNA relevante en un filtro, y prehibridación de los filtros durante 1 a 2 horas en 50% de formamida, 5x SSPE, 2x reactivo 5 de Denhardt y 0,1% SDS a 42ºC o 1 a 2 horas en 6x SSC, 2x reactivo de Denhardt y 0,1% SDS a 68ºC. La sonda desnaturalizada (digoxigenina- o radio-)marcada se añade luego directamente al fluido de prehibridación y se lleva a cabo la incubación durante 16 a 24 horas a la temperatura apropiada arriba mencionada. Después de la incubación, se lavan los filtros durante 30 minutos a la temperatura ambiente en 2 x SSC, 0,1% SDS, seguido por 10 2 lavados de 30 minutos cada uno a 68ºC en 0,5 x SSC y 0,1% SDS. Se establece una au-torradiografía por exposición de los filtros durante 24 a 48 horas en película de rayos X (Ko-dak XAR-2 o equivalente) a -70ºC con un filtro intensificador. [20 x SSPE = NaCl 3M y citrato de sodio 0,3M; 100x reactivo de Denhardt = 2% (p/v) seroalbúmina bovina, 2% (p/v) FicollTM y 2% (p/v) polivinilpirrolidona; SDS = dodecilsulfato de sodio; 20x SSC = NaCl 3,6M, 15 fosfato de sodio 0,2M y EDTA 0,02M, pH 7,7]. Por supuesto, pueden utilizarse condiciones y parámetros equivalentes en este proceso, reteniendo todavía las condiciones de hibridación severa deseadas.

Está claro que existen muchos enfoques conocidos en la técnica para el aislamiento de variantes de las secuencias de DNA de la invención. Las variantes pueden aislarse, por 20 ejemplo, a partir de cepas Bt por hibridación como se ha descrito arriba, y/o por tecnología PCR como es conocido en la técnica. Pueden construirse iniciadores específicos o degene-rados para regiones de las secuencias de DNA isp3, y utilizarse para amplificar variantes a partir de cepas Bt conocidas o nuevas.

Variantes preferidas del DNA isp3-327D de esta invención son secuencias de DNA 25 que codifican las variantes de la proteína ISP3-327D arriba descritas, o una secuencia de DNA que codifica dicha proteína ISP3 reivindicada, con al menos 94%, preferiblemente al menos 95%, particularmente al menos 96%, 97%, 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 3. Las identidades de secuencia a las que se hace referencia arriba se calculan utilizando el programa GAP del paquete Wisconsin de GCG (Madison, 30 Wisconsin, EE.UU., versión 10.2). El programa GAP se utiliza con los parámetros siguientes para ácidos nucleicos: la matriz de registro "nwsgapdna", una 'penalidad por creación de laguna' o 'peso de laguna') de 50 y una 'penalidad por extensión de laguna' (o peso de longi-tud) de 3. Las condiciones de hibridación severa son como se ha definido arriba.

La 'actividad insecticida' de una proteína, como se utiliza en esta memoria, significa 35 la capacidad de una proteína para destruir los insectos cuando dicha proteína se proporcio-na como alimento a los insectos, preferiblemente por expresión en un hospedador recombi-nante tal como una planta. Debe entenderse que una proteína tiene actividad insecticida si

la misma tiene capacidad para destruir el insecto durante al menos una de sus etapas de desarrollo, preferiblemente la etapa larvaria.

"Cantidades controladoras de los insectos" de una proteína, como se utiliza en esta memoria, se refiere a una cantidad de proteína que es suficiente para limitar el deterioro en una planta causado por los insectos (v.g. larvas de insecto) que se alimentan de dicha plan-5 ta, hasta niveles comercialmente aceptables, v.g. por destrucción de los insectos o por in-hibición del desarrollo, la fertilidad o el crecimiento de los insectos de tal manera que los mismos causan menos daño a una planta y el rendimiento de la planta no se ve afectado adversamente en un grado significativo.

De acuerdo con esta invención, los insectos susceptibles a las nuevas proteínas 10 ISP3 de la invención se ponen en contacto con esta proteína en cantidades controladoras de los insectos, preferiblemente cantidades insecticidas. Insectos diana preferidos para pro-teínas de esta invención son plagas de insectos que causan deterioro económico en las plantas de maíz, algodón, arroz o soja, particularmente en los países de América del Norte y del Sur, Asia y Australia. El término planta, como se utiliza en esta memoria, abarca plantas 15 enteras así como partes de plantas, tales como hojas, tallos, semillas, flores o raíces. Insec-tos diana particularmente preferidos para las proteínas ISP3 de esta invención son placas de insectos Lepidópteros, tales como Heliothis spp., Helicoverpa spp., Spodoptera spp., Ostrinia spp., Pectinophora spp., Agrotis spp., Scirphophaga spp., Cnaphalocrocis spp., Sesamia spp., Chilo spp., Anticarsia spp., Pseudoplusia spp., Epinotia spp., y Rachiplusia 20 spp., preferiblemente Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Helicoverpa armigera, Helicover-pa punctera, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugiperda, Agrotis ipsilon, Pectinophora gossy-piella, Scirphophaga incertulas, Cnaphalocrocis medinalis, Sesamia inferens, Chilo partellus, Anticarsia gemmatalis, Pseudoplusia includens, Epinotia aporema y Rachiplusia nu. Las proteínas ISP3 de la invención tienen preferiblemente actividad insecticida contra al menos 25 una especie de insecto Lepidóptero, más preferiblemente contra varias especies de insectos Lepidópteros.

Los términos "proteína ISP3", "proteína ISP3 de esta invención", "proteína ISP", o "proteína ISP de esta invención", como se utilizan en esta memoria, hacen referencia a la nueva proteína aislada de acuerdo con esta invención e identificada y definida en esta me-30 moria como proteína ISP3-327D.

Una proteína ISP3, como se utiliza en esta memoria, puede ser una proteína del tamaño de longitud total, o puede encontrarse en forma truncada con tal que se retenga la actividad insecticida, o puede ser una combinación de diferentes proteínas o dominios de proteínas en una proteína híbrida o proteína de fusión. Una "toxina ISP3" se refiere a un 35 fragmento o porción insecticida de una proteína ISP3, particularmente el fragmento tóxico más pequeño de la misma. Un "gen isp", "gen isp3", "DNA isp" o "DNA isp3", como se utiliza en esta memoria, es una secuencia de DNA que codifica una proteína ISP3 de acuerdo con

esta invención, haciendo referencia particularmente a las secuencias de DNA isp3-327D arriba definidas.

La secuencia de ácido nucleico, particularmente secuencia de DNA, que codifica las proteínas ISP3 de esta invención puede producirse sintéticamente y puede insertarse en vectores de expresión para producir grandes cantidades de proteínas ISP3. Las proteínas 5 ISP3 pueden utilizarse para preparar anticuerpos monoclonales o policlonales específicos de manera convencional (Höfte et al., 1988; Harlow y Lane, 1988).

Se describen también en esta memoria anticuerpos que se fijan específicamente a la proteína ISP3. En particular, se describen anticuerpos monoclonales o policlonales que fijan ISP3-327D, o a fragmentos o variantes de la misma. Se incluyen fragmentos de anti-10 cuerpos monoclonales o policlonales, que retienen la capacidad para fijarse a la proteína ISP3 o fragmento contra los cuales se generaron los mismos. Un anticuerpo para una pro-teína ISP3 puede prepararse por utilización de la proteína ISP3 como antígeno en un animal (tal como un conejo o un ratón), utilizando métodos conocidos en la técnica, tales como se describen en Harlow y Lane “Using Antibodies: A Laboratory Manual” (Nueva York: Cold 15 Spring Harbor Laboratory Press, 1998), en Liddell y Cryer "A Practical Guide to Monoclonal Antibodies" (Wiley y Sons, 1991). Los anticuerpos pueden utilizarse para aislar, identificar, caracterizar o purificar la proteína ISP3 a la que se fija aquél. Por ejemplo, el anticuerpo puede utilizarse para detectar la proteína ISP3 en una muestra, por permitir que el anticuer-po y la proteína formen un inmunocomplejo, y detectar la presencia del inmunocomplejo, por 20 ejemplo por ELISA o inmunotransferencias.

Adicionalmente, se proporcionan kits inmunológicos, útiles para la detección de proteínas ISP3, fragmentos o epítopes de proteínas en una muestra. Las muestras pueden ser células, sobrenadantes de células, suspensiones de células, y análogos. Dicho kit com-prende un anticuerpo que se fija a la proteína ISP3 (o fragmento de la misma) y uno o más 25 reactivos de inmunodetección.

Los anticuerpos pueden utilizarse también para aislar proteínas insecticidas con actividad similar mediante, por ejemplo, ELISA (inmunoensayo unido a enzima) o transfe-rencia Western. Líneas de anticuerpos monoclonales con la especificidad de fijación desea-da pueden utilizarse también para clonar el DNA para el anticuerpo monoclonal particular. 30

Se describen también en esta memoria iniciadores PCR y/o sondas y kits para de-tectar las secuencias de DNA isp3-327D. Pares de iniciadores PCR para amplificar DNA de isp3 a partir de muestras pueden sintetizarse basándose en SEQ ID No. 3, como es conoci-do en la técnica (véase

Dieffenbach y Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor La-35 boratory Press, y McPherson at al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, Prime-ra Edición, Springer Verlag, Alemania). Análogamente, pueden utilizarse fragmentos de DNA de SEQ ID No. 3 como sondas de hibridación. Un kit de detección de isp3 puede com-

prender iniciadores isp3 específicos o sondas isp3 específicas, y un protocolo asociado para utilizar los iniciadores o la sonda a fin de detectar el DNA isp3 en una muestra. Un kit de deleción de este tipo puede utilizarse, por ejemplo, para determinar si una planta ha sido transformada con un gen isp3 (o parte del mismo) de la invención.

Debido a la degeneración del código genético, algunos codones de aminoácidos 5 pueden reemplazarse por otros sin cambiar la secuencia de aminoácidos de la proteína. Adicionalmente, algunos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos equivalen-tes sin cambiar significativamente, preferiblemente sin cambiar en absoluto, la actividad insecticida de la proteína, al menos sin cambiar la actividad insecticida de la proteína de manera negativa. Por ejemplo, para obtener una proteína ISP3 reivindicada, sustituciones 10 conservadoras de aminoácidos dentro de las categorías de aminoácidos básicos (v.g. Arg, His, Lys), ácidos (v.g. Asp, Glu), no polares (v.g. Ala, Val, Trp, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp) o polares (v.g. Gly, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn, Gln) caen dentro del alcance de la invención con tal que la actividad insecticida de la proteína ISP3 no se modifique significativamente, prefe-riblemente no se modifique en absoluto, al menos no se modifique de manera negativa. 15 Adicionalmente, en las proteínas ISP3 reivindicadas, las sustituciones de aminoácidos no conservadoras caen dentro del alcance de la invención con tal que la actividad insecticida de la proteína ISP3 no se cambie significativamente, preferiblemente no se cambie en abso-luto, o al menos no se cambie de manera negativa. Variantes o equivalentes de las secuen-cias de DNA de la invención incluyen secuencias de DNA que se hibridan a la secuencia de 20 DNA de isp3 de SEQ ID No. 3 en condiciones de hibridación severas y que codifican una proteína ISP3 reivindicada, o secuencias de DNA que tienen un uso de codones diferente comparado con los genes nativos isp3 de esta invención pero que codifican una proteína ISP3 reivindicada. Las secuencias de DNA de isp3 pueden optimizarse en codones por adaptación del uso de codones al más preferido en genes de plantas, particularmente a 25 genes nativos para el género o especie de plantas de interés (Bennetzen & Hall, 1982; Ita-kura et al., 1977) utilizando tablas disponibles de uso de codones (v.g. más adaptados hacia la expresión en algodón, soja, maíz o arroz). Las tablas de uso de codones para diversas especies de plantas han sido publicadas por ejemplo por Hikemura (1993) y Nakamura et al. (2000). 30

Asimismo, pueden eliminarse tramos largos de nucleótidos AT o GC y pueden intro-ducirse sitios de restricción adecuados.

Asimismo, el término N de una proteína ISP3 puede modificarse para tener un con-texto óptimo de iniciación de la traducción, añadiendo o delecionando con ello uno o más aminoácidos en el extremo N-terminal de la proteína. En la mayoría de los casos, se prefiere 35 que las proteínas de la invención a expresar en células vegetales comiencen con un di-péptido Met-Asp o Met-Ala para iniciación óptima de la traducción, requiriendo la inserción en el DNA de isp3 de un codón que codifica un aminoácido Asp o Ala aguas abajo del

codón de comienzo como un nuevo segundo codón. Alternativamente, el cuarto nucleótido de SEQ ID No. 3 puede reemplazarse por un 'G', de tal modo que el segundo aminoácido (el siguiente a Met) es Asp. Análogamente, el segundo codón (AAC o AAT, que codifican Asn) puede reemplazarse por un codón para Asp (GAT o GAC) o Ala (GCT, GCC, GCA o GCG), o por cualquier otro codón que comience con un 'G'. 5

Las secuencias de DNA pueden modificarse también para eliminar sitios de remode-lación ilegítimos. Dado que los genes bacterianos pueden contener motivos, que son reco-nocidos en otros hospedadores, especialmente en hospedadores eucariotas tales como plantas, como sitios de remodelación 5' o 3', la transcripción en dichos otros hospedadores puede determinarse prematuramente, dando como resultado mRNA truncado. Los sitios de 10 remodelación ilegítimos pueden identificarse por análisis basado en computadora de las secuencias de DNA y/o por análisis PCR como es conocido en la técnica.

Por supuesto, puede construirse cualquier secuencia de DNA que difiera en su uso de codones pero codifique la misma proteína o una proteína similar que tiene sustancial-mente la misma actividad insecticida, dependiendo del propósito particular. Se ha descrito 15 en sistemas de expresión procariotas y eucariotas que el cambio del uso de codones al de la célula hospedadora se desea para expresión génica en hospedadores extraños (Bennet-zen & Hall, 1982; Itakura et al., 1977). Las tablas de uso de codones están disponibles en la bibliografía (Wada et al., 1990; Murray et al., 1989) y en las bases de datos principales de secuencia de DNA (v.g. EMBL en Heidelberg, Alemania) y como ha sido descrito por Naka-20 mura et al. (2000). De acuerdo con ello, pueden construirse secuencias de DNA sintético de tal modo que se produzcan las mismas o sustancialmente las mismas proteínas. Es eviden-te que pueden construirse varias secuencias de DNA una vez que se conoce la secuencia de aminoácidos de las proteínas ISP3 de esta invención. Dichas otras secuencias de DNA incluyen secuencias de DNA sintéticas o semi-sintéticas que han sido modificadas con obje-25 to de desactivar ciertos sitios en el gen, v.g. por desactivación selectiva de ciertos elemen-tos crípticos reguladores o de procesamiento presentes en la secuencia nativa como se describe en las publicaciones PCT WO 91/16432 y WO 93/09218, o por adaptación del uso global de codones al de un organismo hospedador más afín, preferiblemente el del orga-nismo hospedador en el que se desea la expresión. Varias técnicas para modificación del 30 uso de codones al preferido por las células hospedadoras pueden encontrarse en la biblio-grafía de patentes y científica. El método exacto de modificación del uso de codones no es crítico para esta invención con tal que la mayor parte o la totalidad de las secuencias regu-ladoras o elementos de procesamiento crípticos hayan sido reemplazados por otras se-cuencias. 35

Pequeñas modificaciones en una secuencia de DNA tales como las arriba descritas pueden hacerse rutinariamente, v.g., por mutagénesis mediada por PCR (Ho et al., 1989, White et al., 1989). Modificaciones más profundas en una secuencia de DNA pueden reali-

zarse rutinariamente por síntesis de DNA de novo de una región codificante deseada utili-zando técnicas disponibles.

Con el término "sustancialmente la misma", cuando se hace referencia a la secuen-cia de aminoácidos de una proteína ISP3, se entiende la inclusión de una secuencia de aminoácidos que difiere no más de 5%, preferiblemente no más de 2% de la secuencia de 5 aminoácidos de la proteína de comparación; y cuando se hace referencia a la toxicidad de una proteína ISP3, se entiende la inclusión de una proteína cuyo valor medio CL50 (que es la concentración de proteína que causa 50% de mortalidad de la población de test), calculado a partir de tres bioensayos independientes, realizados utilizando las mismas condiciones de bioensayo, difiere en no más de un factor 2 del valor medio CL50 obtenido para la proteína 10 de comparación (calculada también a partir de tres bioensayos independientes, realizados utilizando las mismas condiciones de bioensayo que para la proteína de comparación). Los valores CL50 se calculan con análisis Probit, utilizando el programa POLO PC (de LeOra Software, 1987, Berkeley, California). Debe entenderse que los límites de confianza de 95% (o 90%) (un parámetro asociado calculado por análisis Probit) se calculan para los valores 15 CL50 de cada una de las dos proteínas a comparar a fin de determinar si existe una diferen-cia estadísticamente significativa de los valores CL50. En general, se considera que la toxici-dad de las dos proteínas es sustancialmente la misma, si los límites de confianza se superponen, y es sustancialmente diferente si los límites de confianza no se solapan.

El término "dominio" de una toxina ISP3 (o proteína ISP3) tal como se utiliza en esta 20 memoria significa cualesquiera partes o dominios de la toxina (o proteína ISP3) con una estructura o función específica que puede transferirse a otra proteína para proporcionar una nueva proteína híbrida con al menos una característica funcional (v.g., las características de fijación y/o toxicidad) de la proteína ISP3 (o proteína ISP3) de la invención (Ge et al., 1991). Dichas partes pueden constituir una característica esencial de la proteína híbrida con las 25 características de fijación y/o toxicidad de las proteínas ISP3 de esta invención. Una proteí-na híbrida de este tipo puede tener una gama de hospedadores más amplia, una toxicidad aumentada y/o puede utilizarse en una estrategia para prevenir el desarrollo de resistencia a los insectos (EP 408 403; Visser et al., 1993). Secuencias de DNA que codifican los domi-nios están abarcadas por esta definición. En esta invención se utiliza una proteína híbrida o 30 proteína de fusión con el significado de una proteína constituida por diferentes dominios proteínicos, que forman una proteína funcional quimérica con las características de los do-minios individuales. Otro dominio que puede comprender una proteína híbrida o quimérica, por ejemplo, es un dominio estabilizador. Por ejemplo, se han descrito dominios estabiliza-dores que están presentes en el término C de proteínas VIP3(a), y se cree que proporcionan 35 estabilidad a la proteína tóxica en el ambiente del intestino de los insectos susceptibles.

Además de la creación de proteínas híbridas, la función de dominios específicos puede analizarse también por la introducción de deleciones de la totalidad o parte del o de

los dominios o la introducción de mutaciones en el dominio, y análisis del efecto resultante sobre la toxicidad hacia los insectos, estabilidad de las proteínas, sensibilidad a la proteóli-sis enzimática, los cambios de temperatura, la fijación a DNA/proteínas/células específicas, etc.

Se describe también en esta memoria un método de "evolución" de una secuencia 5 de ácido nucleico que codifica una proteína ISP3, particularmente ISP3-327D, en una nueva secuencia de ácido nucleico, que codifica una proteína reivindicada por poseer actividad insecticida. La secuencia de ácido nucleico desprendida tiene preferiblemente actividad insecticida mejorada comparada con la secuencia no desprendida. El término "evolución", como se utiliza en esta memoria, se refiere a un método de evolución de una secuencia 10 mejorada por recombinación de secuencias, como se describe en US 5.811.238, WO 97/20078 y US 6.180.406. El "desordenamiento" de un ácido nucleico se utiliza en esta memoria para indicar una recombinación in vitro o in vivo entre secuencias de ácido nuclei-co de una población o conjunto de ácidos nucleicos, y puede realizarse como es conocido en la técnica y como se describe en US 5.811.238, WO 97/20078, US 6.180.406 y US 15 6.117.679.

El método de evolución de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteí-na ISP3 reivindicada comprende los pasos siguientes:

(a) provisión de una población de secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos de SEQ ID No. 4, o variantes o fragmentos de las se-20 cuencias de aminoácidos de SEQ ID No. 4, en donde dichas variantes o fragmentos tienen una identidad de secuencia de al menos 91% con SEQ ID No. 4;

(b) desordenamiento de dicha población de variantes o fragmentos para formar moléculas de ácido nucleico recombinante;

(c) selección o cribado de moléculas de ácido nucleico recombinante, que codifican 25 proteínas reivindicadas que tienen actividad insecticida;

repetición de los pasos (a) a (c) con las moléculas de ácido nucleico recombinante seleccio-nadas en el paso (c) hasta que se ha encontrado una molécula de ácido nucleico recombi-nante en el paso (c), en donde la proteína reivindicada modificada por dicha molécula de ácido nucleico tiene la propiedad insecticida deseada. 30

Un ácido nucleico no desprendido es un ácido nucleico proporcionado como mate-rial de partida en el paso (a), mientras que un ácido nucleico desprendido correspondiente como se utiliza en esta memoria, se refiere a un ácido nucleico recombinante obtenido en el paso (d) cuando se lleva a cabo el método utilizando el ácido nucleico no desprendido en el paso (a). Los ácidos nucleicos preferidos utilizados en el paso (a) son secuencias de ácido 35 nucleico que codifican secuencias de aminoácidos ISP3-327D (SEQ ID No. 4) o variantes o fragmentos de los mismos como se reivindican en esta memoria. La población de moléculas de ácido nucleico y/o variantes y/o fragmentos de moléculas de ácido nucleico en el paso

(a) puede comprender el DNA que codifica una proteína ISP3 individual y/o variantes y/o fragmentos del ácido nucleico que codifica una proteína ISP3 de la invención, o una mezcla de ácidos nucleicos que codifican diferentes proteínas ISP3 de la invención, y/o fragmentos y/o variantes de los mismos.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican variantes reivindicadas de la se-5 cuencia de aminoácidos SEQ ID No. 4 son secuencias de ácido nucleico que codifican se-cuencias de aminoácidos de proteínas ISP3 reivindicadas, v.g. las proteínas ISP3 reivindicadas que tienen al menos 91%, preferiblemente al menos 92 ó 93%, muy preferi-blemente al menos 94%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia al nivel de aminoácidos con SEQ ID No. 4. 10

Las secuencias de DNA isp3 de la invención, preparadas a partir de DNA total, pue-den ligarse en vectores de expresión adecuados y transformarse en una cepa bacteriana, tal como una cepa E. coli o una cepa Bt, y los clones pueden cribarse luego por métodos de inmunosondeo de colonias convencional (French et al., 1986) para expresión de la toxina con anticuerpos monoclonales o policlonales generados contra las proteínas ISP3. 15

Los clones Bt o clones de E. coli pueden cribarse luego en cuanto a la producción de proteínas ISP3 (el sobrenadante de cultivo exento de células o el lisado de células pue-den correrse en geles SDS-PAGE utilizando métodos estándar y pueden llevarse a cabo procedimientos estándar de transferencia Western), o las bacterias pueden testarse en cuanto a su actividad insecticida comparada con las bacterias de control. Los clones pueden 20 analizarse también en cuanto a la presencia de mRNA que codifica una proteína ISP3 utili-zando procedimientos PCR estándar, tales como RT-PCR.

Los genes que codifican las proteínas ISP3 de esta invención pueden secuenciarse de manera convencional (Maxam y Gilbert, 1980; Sanger, 1977) a fin de obtener la secuen-cia de DNA. Las comparaciones de secuencia indicaron que los genes son diferentes de 25 genes descritos previamente que codifican toxinas con actividad contra Lepidópteros.

Una parte eficaz como insecticida de las secuencias de DNA, que codifica una por-ción eficaz como insecticida de las nuevas proteínas ISP3 identificadas, puede producirse de manera convencional después del análisis de la secuencia del gen. La secuencia de aminoácidos de las proteínas SP3 puede determinarse a partir de la secuencia de DNA de 30 las secuencias de DNA aisladas. Por "una parte eficaz como insecticida (o porción o frag-mento)" de secuencias de DNA que codifican la proteína ISP3, a la que se hace referencia también en esta memoria como "gen truncado" o "DNA truncado", se entiende una secuen-cia de DNA que codifica un polipéptido que tiene menos aminoácidos que la forma de la proteína ISP3 de longitud total, pero que es insecticida. 35

Con objeto de expresar la totalidad o una parte eficaz como insecticida de la se-cuencia de DNA que codifica una proteína ISP3 de esta invención en E. coli, en otras cepas Bt y en plantas, pueden introducirse sitios de restricción adecuados, que flanquean la se-

cuencia de DNA. Esto puede hacerse por mutagénesis orientada, utilizando procedimientos bien conocidos (Stanssens et al., 1989; White et al., 1989). Con objeto de obtener expresión mejorada en plantas, el uso de codones del gen isp3 o parte del gen isp3 eficaz como insec-ticida de esta invención puede modificarse para formar un gen o parte de gen equivalente, modificado o artificial de acuerdo con las publicaciones PCT WO 91/16432 y WO 93/09218 5 y las publicaciones EP 0 385 962, EP 0 359 472 y US 5.689.052, o los genes o partes de genes isp3 pueden insertarse en el genoma del plasto, la mitocondria o el cloroplasto y ex-presarse en él utilizando un promotor adecuado (v.g., Mc Bride et al., 1995; US 5.693.507).

Para obtener una expresión intensificada en plantas monocotiledóneas tales como maíz o arroz, puede añadirse también un intrón, preferiblemente un intrón de monocotiledó-10 nea, al ácido quimérico. Por ejemplo, se ha demostrado que la inserción del intrón del gen Adh1 del maíz en la región reguladora 5' intensifica la expresión en maíz (Callis et al., 1987). Análogamente, el intrón HSP70, descrito en US 5.859.347, puede utilizarse para intensificar la expresión. La secuencia de DNA del gen isp3 o su parte insecticida puede cambiarse ulteriormente de una manera neutra en cuanto a la traducción, para modificar las 15 secuencias de DNA posiblemente inhibidoras presentes en la parte del gen por medio de inserción orientada de intrones y/o por introducción de cambios en cuanto al uso de codo-nes, v.g., adaptación del uso de codones al más preferido por las plantas, preferiblemente el género de plantas específicas relevantes (Murray et al., 1989), sin cambiar significativamen-te, preferiblemente sin cambiar en absoluto, la secuencia de aminoácidos codificada. 20

De acuerdo con una realización de esta invención, se prefiere que las proteínas se direccionen a orgánulos intracelulares tales como plastos, preferiblemente cloroplastos, mitocondrias, o sean secretadas por la célula optimizando potencialmente la estabilidad y/o expresión de las proteínas. Para este propósito, en una realización de esta invención, los genes quiméricos de la invención comprenden una región codificante que codifica un pépti-25 do señal o péptido diana, enlazado a la región codificante de la proteína ISP3 de la inven-ción. Péptidos particularmente preferidos a incluir en las proteínas de esta invención son los péptidos de tránsito para direccionamiento a cloroplastos u otros plastos, y especialmente regiones duplicadas de péptidos de tránsito a partir de genes de plantas cuyo producto génico está direccionado a los plastos, el péptido de tránsito optimizado de Capellades et al. 30 (US 5.635.618), el péptido de tránsito de la ferredoxin-NADT+ oxidorreductasa de la espina-ca (Oelmuller et al., 1993), el péptido de tránsito descrito en Wong et al. (1992) y los pépti-dos de direccionamiento que aparecen en la solicitud de Patente PCT publicada WO 00/26371. Se prefieren también péptidos de señalización de la secreción de una proteína enlazada a dicho péptido fuera de la célula, tal como la señal de secreción del inhibidor II de 35 la proteinasa de la patata (Keil et al., 1986), la señal de secreción del gen 3 de alfa-amilasa del arroz (Sutliff et al., 1991), y la señal de secreción de la proteína PR1 del tabaco (Corne-lissen et al., 1986).

Péptidos señal particularmente útiles de acuerdo con la invención incluyen el pépti-do de tránsito de los cloroplastos (v.g. Van Den Broeck et al., 1985), o el péptido de tránsito optimizado de los cloroplastos de US 5.510.471 y US 5.635.618 que causa el transporte de la proteína a los cloroplastos, un péptido señal secretor o un péptido que direcciona la pro-teína a otros plastos, mitocondrias, el ER, u otro orgánulo. Secuencias señal para el direc-5 cionamiento a orgánulos intracelulares o para secreción fuera de la célula de la planta o a la pared de la célula se encuentran en proteínas naturalmente direccionadas o secretadas, preferiblemente las descritas por Klösgen et al. (1989), Klösgen y Weil (1991), Neuhaus & Rogers (1998), Bih et al. (1999), Morris et al. (1999), Hesse et al. (1989), Tavladoraki et al. (1998), Terashima et al. (1999), Park et al. (1997), Shcherban et al. (1995), particularmente 10 las secuencias de péptidos señal de proteínas direccionadas o secretadas de maíz, al-godón, soja o arroz.

Para permitir la secreción de las proteínas ISP3 al exterior de la célula hospedadora transformada, puede fusionarse un péptido señal de secreción apropiado al extremo amino-terminal (extremo N-terminal) de la proteína ISP3. Asimismo, cualquier péptido señal de 15 secreción de Bacillus supuesto nativo puede delecionarse o puede reemplazarse por un péptido señal apropiado, tal como un péptido señal de secreción eucariota como se ha des-crito arriba. Particularmente, los aminoácidos 1 a 54 de las proteínas ISP3 de la invención comprenden un péptido señal supuesto de Bacillus. Los aminoácidos 1 a 10, preferiblemen-te 1 a 50, más preferiblemente 1 a 54 pueden eliminarse de las proteínas ISP3 o pueden 20 reemplazarse por un péptido señal apropiado, particularmente un péptido señal eucariota como se ha descrito arriba. Péptidos señal supuestos pueden detectarse utilizando análisis basado en computadora, utilizando programas tales como el programa de investigación Signal Peptide (Signal P V1.1 ó 2.0), utilizando una matriz para bacterias procariotas gram-positivas y un registro umbral inferior a 0,5, especialmente un registro umbral de 0,25 o me-25 nos (Von Heijne, Gunnar, 1986 y Nielsen et al., 1996).

Adicionalmente, las propiedades de fijación de las proteínas ISP3 de la invención pueden evaluarse, utilizando métodos conocidos en la técnica (v.g., Van Rie et al., 1990) para determinar si las proteínas ISP3 de la invención se fijan a sitios en el intestino de los insectos, tales como el intestino medio, que no son reconocidos (o que no entran en compe-30 tencia) por otras proteínas Bt. Las proteínas insecticidas Bt con sitios de fijación diferentes para las cuales no existe competición alguna para la fijación en insectos susceptibles rele-vantes, son muy valiosas para reemplazar proteínas Bt conocidas a las cuales pueden haber desarrollado resistencia los insectos, o para uso en combinación con proteínas insec-ticidas Bt que tienen un modo de acción diferente a fin de prevenir o retardar el desarrollo de 35 la resistencia de los insectos contra las proteínas Bt, particularmente cuando se expresan en una planta. Debido a las características de las nuevas toxinas Bt aisladas, las mismas son extremadamente útiles para transformación de plantas, v.g. monocotiledóneas tales

como maíz y arroz y dicotiledóneas como algodón y soja, a fin de proteger estas plantas contra el deterioro causado por los insectos. Se espera que las propiedades de fijación de las proteínas ISP3 de la presente invención sean diferentes comparadas con las de las toxi-nas Cry. Tales propiedades diferentes de fijación pueden medirse por ensayos de fijación rutinarios como se ha descrito arriba o como se describe en US 6.291.156 y US 6.137.033. 5

Especialmente para propósitos de gestión de la resistencia los insectos para una plaga de insectos específica, se prefiere combinar una proteína ISP3 de esta invención con otra proteína de control de los insectos, particularmente una proteína Cry de Bt o una pro-teína VIP o semejante a VIP, preferiblemente una proteína que no reconoce al menos un sitio de fijación reconocido por una proteína ISP3 de este tipo. Proteínas de control de insec-10 tos preferidas para combinar con las proteínas ISP3 de esta invención, particularmente para expresión simultánea en plantas, preferiblemente maíz, algodón, arroz o soja, incluye las proteínas Cry, tales como la proteína Cry1F o híbridos derivados de una proteína Cry1F (v.g., las proteínas híbridas Cry1A-Cry1F descritas en US 6.326.169; US 6.281.016; US 6.218.188, o fragmentos tóxicos de las mismas), las proteínas de tipo Cry1A o fragmentos 15 tóxicos de las mismas, preferiblemente la proteína Cry1Ac o híbridos derivados de la proteí-na Cry1Ac (v.g. la proteína híbrida Cry1Ab-Cry1Ac descrita en US 5.880.275) o la proteína Cry1 Ab o Bt2 o fragmentos insecticidas de las mismas como se describen en EP 451878, las proteínas Cry2Ae, Cry2Af o Cry2Ag como se describen en WO 02/057664, las proteínas Cry como se describen en WO 01/47942, la proteína VIP3Aa o un fragmento tóxico de la 20 misma como se describe en Estruch et al. (1996) y US 6.291.156, proteínas insecticidas de Xenorhabdus (como se describe en WO 98/50227), Serratia (particularmente de S. ento-mophila) o cepas de especies de Photorhabdus, tales como proteínas Tc de Photorhabdus como se describen en WO98/08932(v.g., Waterfield et al., 2001; French-Constant y Bowen, 2000). 25

En una realización, dicha co-expresión se obtiene fácilmente por transformación de una planta que expresa ya una proteína de control de los insectos con una ISP3 de esta inven-ción, o por cruzamiento de plantas transformadas con la proteína de control de los insectos y plantas transformadas con una o más proteínas ISP de esta invención. Para plantas de maíz, arroz, algodón o soja, se utiliza preferiblemente la proteína ISP3-327D como primera 30 proteína de control de los insectos, y como segunda proteína de control de los insectos se utilizan las proteínas Cry1Ab, Cry1Ac, Cry2Ae o VIP3Aa o derivados de las mismas. Méto-dos para obtención de la expresión de diferentes proteínas insecticidas de Bt (o análoga-mente, para otras proteínas de control de los insectos) en la misma planta en un esfuerzo para minimizar o prevenir el desarrollo de resistencia a plantas transgénicas resistentes a 35 los insectos se describen en EP 0 408 403. Debe entenderse que las diferentes proteínas pueden expresarse en la misma planta, o cada una puede expresarse en una planta indivi-dual y combinarse luego en la misma planta por cruzamiento de las plantas individuales

unas con otras. Por ejemplo, en la producción de semillas híbridas, cada planta parental puede expresar una proteína individual. Después del cruzamiento de las plantas parentales para producir híbridos, ambas proteínas están combinadas en la planta híbrida.

Es bien sabido que las proteínas Cry de Bt se expresan como protoxinas, que se convierten en el núcleo tóxico por proteólisis en el intestino del insecto. Cuando se combi-5 nan las proteínas ISP3 de la invención con proteínas Cry de Bt, se entiende que pueden utilizarse genes Cry de Bt que codifican la protoxina entera o el núcleo tóxico o cualquier forma intermedia.

Preferiblemente, para propósitos de selección, pero también para aumentar las op-ciones de control de las malezas, las plantas transgénicas de la invención se transforman 10 también con un DNA que codifica una proteína que confiere resistencia a un herbicida de amplio espectro, v.g., herbicidas basados en glufosinato o glifosato.

La parte del gen isp3 eficaz como insecticida o su equivalente, preferiblemente el gen quimérico isp3, que codifica una porción eficaz como insecticida de la proteína ISP3, puede insertarse establemente de manera convencional en el genoma nuclear de una célula 15 individual de la planta, y la célula de la planta así transformada puede utilizarse de una ma-nera convencional para producir una planta transformada que es resistente a los insectos. A este respecto, un vector de T-DNA, que contiene la parte del gen isp3 eficaz como insectici-da, en Agrobacterium tumefaciens, puede utilizarse para transformar la célula de la planta, y después de ello, puede regenerarse una planta transformada a partir de la célula de la plan-20 ta transformada utilizando los procedimientos descritos, por ejemplo, en EP 0 116 718, EP 0 270 822, la publicación PCT WO 84/02913 y la solicitud de Patente Europea Publicada EP 0 242 246 y en Gould et al. (1991). La construcción de un vector de T-DNA para transforma-ción de plantas mediada por Agrobacterium es bien conocida en la técnica. El vector de T-DNA puede ser un vector binario como se describe en EP 0 120 561 y EP 0 120 515, o un 25 vector co-integrado que puede integrarse en el plásmido Ti de Agrobacterium por recombi-nación homóloga, como se describe en EP 0116718. Vectores de T-DNA preferidos contie-nen cada uno un promotor enlazado operativamente a la parte del gen isp3 eficaz como insecticida entre las secuencias de borde del T-DNA, o al menos localizado a la izquierda de la secuencia del borde derecho. Secuencias de borde se describen en Gielen et al. (1984). 30 Por supuesto, pueden utilizarse otros tipos de vectores para transformar la célula de la plan-ta, utilizando procedimientos tales como transferencia de genes dirigida (como se describe, por ejemplo, en EP 0 223 247), transformación mediada por polen (como se describe, por ejemplo, en EP 0 270 356 y WO 85/01856), transformación de protoplastos como se descri-be, por ejemplo, en US 4.684.611, transformación del DNA de la planta mediada por virus 35 (como se describe, por ejemplo, en EP 0 067 553 y US 4.407.956), transformación mediada por liposomas (como se describe, por ejemplo, en US 4.536.475), y otros métodos tales como los métodos recientemente descritos para transformación de ciertas líneas de maíz

(v.g., US 6.140.553; Fromm et al., 1990; Gordon-Kamm et al., 1990) y arroz (Shimamoto et al., 1989; Datta et al., 1990) y el método para transformación de monocotiledóneas gene-ralmente (publicación PCT WO 92/09696). Para transformación del algodón, se prefiere especialmente el método descrito en la Publicación de Patente PCT WO 00/71733. Para transformación del arroz, se hace referencia a los métodos descritos en WO 92/09696, WO 5 94/00977 y WO 95/06722.

Los términos "maíz dulce" y "maíz común" se utilizan en esta memoria como sinó-nimos, haciendo referencia a Zea mays. El algodón, como se utiliza en esta memoria, se refiere a Gossypium spp., particularmente G. hirsutum y G. barbadense. El término "arroz" se refiere a Oryza spp., particularmente O. sativa. "Soja" se refiere a Glycine spp., particu-10 larmente G. max.

Además de la transformación del genoma nuclear, se incluye también en la inven-ción la transformación del genoma de los plastos, preferiblemente del genoma de los cloro-plastos. Kota et al. (1999) han descrito un método para sobreexpresar una proteína Cry2Aa en cloroplastos de tabaco. 15

La planta transformada resultante puede utilizarse en un esquema de reproducción convencional de plantas para producir más plantas transformadas con las mismas carac-terísticas o para introducir la parte del gen isp3 eficaz como insecticida en otras variedades de la misma especie de plantas o especies afines. Las semillas, que se obtienen de las plantas transformadas, contienen la parte del gen isp3 eficaz como insecticida como una 20 inserción genómica estable. Células de la planta transformada pueden cultivarse de manera convencional para producir una porción eficaz como insecticida de la toxina o proteína ISP3, que puede recuperarse para uso en composiciones insecticidas convencionales contra Le-pidópteros (US 5.254.799).

La parte del gen isp3 eficaz como insecticida se inserta en el genoma de una célula 25 de la planta de tal manera que el gen insertado se encuentra aguas abajo (es decir, 3') de, y bajo el control de, un promotor que puede dirigir la expresión de la parte del gen en la célula de la planta. Esto se realiza preferiblemente por inserción del gen quimérico isp3 en el ge-noma de la célula de la planta, particularmente en el genoma nuclear o de los plastos (v.g., cloroplastos). 30

Promotores preferidos incluyen: los promotores 35S constitutivos fuertes (los "pro-motores 35S") del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) de aislados CM 1841 (Gardner et al., 1981), CabbB-S (Franck et al., 1980) y CabbB-JI (Hulf y Howell, 1987); el promotor 35S descrito por Odell et al. (1985), promotores de la familia de la ubiquitina (v.g., el promotor de ubiquitina del maíz de Christensen et al., 1992, EP 0 342 926, véase también Cornejo et al., 35 1993), el promotor gos2 (de Pater et al., 1992), el promotor emu (Last et al., 1990), promoto-res de actina de Arabidopsis tales como el promotor descrito por An et al. (1996), promoto-res de actina del arroz tales como el promotor descrito por Zhang et al. (1991) y el promotor

descrito en US 5,641,876; promotores del virus del mosaico de los nervios de la Mandioca (WO 97/48819, Verdaguer et al. (1998)), la serie pPLEX de promotores del Virus de la Atro-fia Subterránea del Trébol (WO 96/06932, particularmente el promotor S7), un promotor de alcohol-deshidrogenasa, v.g., pAdh1S (números de acceso en GenBank X04049, X00581), y el promotor TR1' y el promotor TR2' (el " promotor TR1'" y "promotor TR2'", respectiva-5 mente) que dirigen la expresión de los genes 1' y 2' genes, respectivamente, del T-DNA (Velten et al., 1984). Alternativamente, puede utilizarse un promotor que no es constitutivo sino que más bien es específico para uno o más tejidos u órganos de la planta (v.g., hojas y/o raíces) con lo cual la parte del gen isp3 insertada se expresa únicamente en células del o de los tejidos u órganos específicos. Por ejemplo, la parte del gen isp3 eficaz como insec-10 ticida podría expresarse selectivamente en las hojas de una planta (v.g., maíz, algodón, arroz, soja) poniendo la parte del gen eficaz como insecticida bajo el control de un promotor fotoinducible tal como el promotor del gen de la subunidad pequeña de la ribulosa-1,5-bisfosfato-carboxilasa de la propia planta o de otra planta, tal como guisante, como se des-cribe en US 5.254.799. El promotor puede, por ejemplo, seleccionarse de tal modo que el 15 gen isp3 de la invención se exprese únicamente en aquellos tejidos o células en los cuales se alimenta la plaga de insecto diana, de tal modo que la alimentación por el insecto diana susceptible dé como resultado un deterioro por los insectos reducido a la planta hospedado-ra, comparada con plantas que no expresan el gen isp3. Una plaga de insectos Lepidópte-ros que daña principalmente las raíces puede controlarse así eficazmente por expresión de 20 un gen isp3 bajo un promotor específico de raíz. Un promotor preferentemente activo en las raíces se describe en WO 00/29566. Un promotor preferido para expresión preferencial en las raíces es el promotor ZRP (y modificaciones del mismo) como se describe en US 5.633.363. Otra alternativa consiste en utilizar un promotor cuya expresión es inducible, por ejemplo un promotor inducible por lesiones tal como v.g. el promotor MPI descrito por Cor-25 dera et al. (1994), que es inducido por lesiones (tales como las causadas por alimentación de los insectos), o un promotor inducible por un producto químico, tal como dexametasona como ha sido descrito por Aoyama y Chua (1997) o un promotor inducible por temperatura, tal como el promotor del choque térmico descrito en US 5.447.858, o un promotor inducible por otros estímulos externos. 30

La parte del gen isp3 eficaz como insecticida se inserta en el genoma de la planta de tal modo que la parte del gen insertada se encuentra aguas arriba (es decir, 5') de las señales de transcripción-regulación del extremo 3' adecuadas (es decir, señales de forma-ción de transcritos y poliadenilación). Esto se realiza preferiblemente por inserción del gen quimérico isp3 en el genoma de la célula de la planta. Señales de poliadenilación y forma-35 ción de transcritos preferidas incluyen las del gen 35S de CaMV, el gen de nopalina-sintasa (Depicker et al., 1982), el gen de octopina-sintasa (Gielen et al., 1984) y el gen 7 del T-DNA

(Velten y Schell, 1985), que actúan como secuencias de DNA 3' no traducidas en células vegetales transformadas.

La introducción del vector de T-DNA en Agrobacterium puede llevarse a cabo utili-zando métodos conocidos, tales como electroporación o apareamiento triparental.

La parte del gen isp3 eficaz como insecticida puede insertarse opcionalmente en el 5 genoma de la planta como un gen híbrido (US 5.254.799; Vaeck et al., 1987) bajo el control del mismo promotor como un gen marcador seleccionable o registrable, tal como el gen neo (EP 0 242 236) que codifica resistencia a la kanamicina, de tal modo que la planta expresa una proteína de fusión que es fácilmente detectable.

La transformación de células vegetales puede utilizarse también para producir las 10 proteínas de la invención en grandes cantidades en cultivos de células vegetales, v.g. para producir una proteína ISP3 que puede aplicarse luego a las cosechas después de una for-mulación apropiada. Cuando se hace referencia en esta memoria a una célula vegetal transgénica, ello hace referencia a una célula vegetal (o también a un protoplasto de planta) como tal en forma aislada o en cultivo de tejidos, o a una célula (o protoplasto) de planta 15 contenida en una planta o en un órgano o tejido diferenciado, y ambas posibilidades se in-cluyen específicamente en esta memoria. Por tanto, una referencia a una célula vegetal en la descripción o las reivindicaciones no debe entenderse como referencia únicamente a células aisladas en cultivo, sino que se refiere a cualquier célula de la planta, dondequiera que pueda estar localizada la misma o en cualquier tipo de tejido de planta u órgano en el 20 que pueda estar presente.

La totalidad o parte del gen isp3, que codifica una proteína anti-Lepidópteros, puede utilizarse también para transformar otros microorganismos, tales como bacterias, tales como una B. thuringiensis que tiene actividad insecticida contra Lepidópteros o coleópteros.

De este modo puede producirse una cepa transformada de Bt, que es útil para com-25 batir un amplio espectro de plagas de insectos Lepidópteros y/o coleópteros o para combatir plagas de insectos Lepidópteros adicionales. La transformación de bacterias, tales como bacterias de los géneros Pseudomonas, Agrobacterium, Bacillus o Escherichia, con la totali-dad o parte del gen isp3 de esta invención, incorporado en un vehículo de clonación ade-cuado, puede llevarse a cabo de una manera convencional, utilizando preferiblemente 30 técnicas convencionales de electroporación como se describe en Mahillon et al. (1989) y en la Publicación de Patente PCT WO 90/06999.

Cepas transformadas de especies de Bacillus que contienen el gen isp3 de esta invención pueden fermentarse por métodos convencionales (Dulmage, 1981; Bernhard y Utz, 1993) para proporcionar rendimientos o derivados de células. En condiciones de creci-35 miento apropiadas que son bien conocidas, estas cepas secretan proteínas ISP3 con ren-dimientos altos.

Microorganismos hospedadores adecuados alternativos en los cuales pueden ex-presarse los genes isp3 son hongos, algas, o virus, particularmente especies que son espe-cies colonizadoras de plantas (v.g., (endo)simbióticas) o patógenos de insectos.

Una composición insecticida, particularmente anti-Lepidópteros, de esta invención puede formularse de manera convencional utilizando los microorganismos transformados 5 con el gen isp3, o preferiblemente sus proteínas ISP3 respectivas o la toxina ISP3, o una porción de toxina eficaz como insecticida como ingrediente activo, junto con vehículos, dilu-yentes, emulsionantes y/o dispersantes adecuados (v.g., como ha sido descrito por Bern-hard y Utz, 1993). Esta composición insecticida puede formularse como un polvo humectable, pelets, gránulos o polvo fino o como una formulación líquida con disolventes 10 acuosos o no acuosos como una espuma, gel, suspensión, concentrado, etc. Ejemplos de composiciones que comprenden esporas insecticidas Bt se describen en WO 96/10083.

Un método para controlar insectos, particularmente Lepidópteros, de acuerdo con esta invención puede comprender la aplicación (v.g., por pulverización), a un locus (área) a proteger, de una cantidad insecticida de las proteínas ISP3 o composiciones que compren-15 den las proteínas ISP3 o que comprenden células hospedadoras transformadas con los genes isp3 de esta invención. El locus a proteger puede incluir, por ejemplo, el hábitat de las plagas de insectos o la vegetación en crecimiento (v.g. aplicación al follaje) o un área en la que va a desarrollarse la vegetación (v.g. aplicación al suelo o al agua). Una composición preferida comprende una cantidad insecticida de al menos una de las proteínas ISP3 de la 20 invención, producidas preferentemente por un hospedador bacteriano, y las aplicaciones preferidas de la composición son aplicación a las hojas, aplicación al suelo o acondiciona-miento de semillas.

El término "puesta en contacto" se utiliza en esta memoria para significar "puesta en contacto físico con". La puesta en contacto de una planta con una proteína insecticida signi-25 fica que la proteína insecticida se pone en contacto con las células de la planta, sea inter-namente (por ejemplo por expresión en la planta) o externamente (por ejemplo por aplicación externa a la planta de composiciones que comprenden la proteína insecticida). Debe entenderse que el término no indica la duración del tiempo de contacto, sino que comprende cualquier periodo de tiempo de contacto (v.g. contacto breve, contacto largo). 30 Cuando se hace referencia a un método de protección de una planta contra el deterioro por los insectos que comprende poner en contacto dicha planta (o células o tejidos de la misma) con una proteína insecticida de la invención, el contacto es preferiblemente lo bastante pro-longado y extenso (con una cantidad suficientemente alta de proteína en contacto con un número suficientemente grande de células) para prevenir o reducir el deterioro causado por 35 los insectos.

Esta invención se refiere adicionalmente a un método para controlar plagas de in-sectos Lepidópteros del algodón, particularmente orugas de la cápsula, orugas de los bro-

tes, orugas de las espigas (sic), preferiblemente una plaga de insectos Lepidópteros del algodón seleccionada del grupo de Helicoverpa zea (Oruga de las Mazorcas del Maíz), Heli-coverpa armigera (Oruga de las Cápsulas del Algodón), Helicoverpa punctigera (Oruga de las Cápsulas Nativa), Heliothis virescens (Oruga de los Brotes del Tabaco), Spodoptera frugiperda (Larva de la Esciara de Otoño) y Pectinophora gossypiella (Oruga Rosa de las 5 Cápsulas), método que comprende aplicar a un área o a la planta a proteger, una proteína ISP3 reivindicada como se define en esta memoria, preferiblemente una proteína ISP3-327D como se define en esta memoria (es decir por contacto de la planta de algodón con una proteína ISP3 de esta invención, por ejemplo por plantación de una planta de algodón transformada con un gen isp3 de esta invención, o pulverización de una composición que 10 contiene una proteína ISP3 de esta invención). La invención se refiere también al uso de las proteínas ISP3 de esta invención, particularmente la proteína ISP3-327D, contra las plagas de insectos Lepidópteros del algodón para minimizar el deterioro de las plantas de algodón.

Esta invención se refiere adicionalmente a un método para controlar plagas de in-sectos Lepidópteros del maíz, particularmente larvas de las mazorcas, larvas de esciara, 15 perforadores del maíz, preferiblemente una plaga de insectos del maíz seleccionada del grupo de Helicoverpa zea (Oruga de las Mazorcas del Maíz), Agrotis ipsilon (Noctuida Ne-gra), Ostrinia nubilalis (Perforador del Maíz Europeo) y Spodoptera frugiperda (Larva de la Esciara de Otoño), método que comprende aplicar a un área o a la planta a proteger, una proteína ISP3 reivindicada como se define en esta memoria, preferiblemente una proteína 20 ISP3-327D como se define en esta memoria (a saber por contacto de una planta de maíz con una proteína ISP3 de esta invención, por ejemplo por plantación de una planta de maíz transformada con un gen isp3 de esta invención, o pulverización de una composición que contiene una proteína ISP3 de esta invención). La invención se refiere también al uso de las proteínas ISP3 reivindicadas de esta invención, particularmente la proteína ISP3-327D, con-25 tra plagas de insectos Lepidópteros del maíz para minimizar el deterioro de las plantas de maíz.

Esta invención se refiere adicionalmente a un método para controlar plagas de in-sectos Lepidópteros del arroz, particularmente perforadores de los vástagos del arroz, sal-tones del arroz, noctuidas del arroz, larvas de esciara del arroz, orugas-caja del arroz, 30 dobladores de las hojas del arroz, preferiblemente una plaga de insectos del arroz seleccio-nada del grupo de Perforador Amarillo de los Vástagos (Scirphophaga incertulas), Doblador de las Hojas (Cnaphalocrocis medinalis), Perforador Rosa de los Vástagos (Sesamia infe-rens) y Perforador Moteado de los Vástagos del Maíz (Chilo partellus), método que com-prende aplicar a un área o planta a proteger una proteína ISP3 reivindicada como se define 35 en esta memoria, preferiblemente una proteína ISP3-327D como se define en esta memoria (a saber, por contacto de una planta de arroz con una proteína ISP3 de esta invención, por ejemplo por plantación de una planta de arroz transformada con un gen isp3 de esta inven-

ción, o por pulverización de una composición que contiene una proteína ISP3 de esta inven-ción). La invención se refiere también al uso de las proteínas ISP3 reivindicadas de esta invención, particularmente la proteína ISP3-327D, contra plagas de insectos Lepidópteros del arroz para minimizar el deterioro de las plantas de arroz.

Esta invención se refiere adicionalmente a un método para controlar plagas de in-5 sectos Lepidópteros de la soja, preferiblemente una plaga de insectos de la soja seleccio-nada del grupo de la Oruga Aterciopelada del Haba (Anticarsia gemmatalis), el Geómetra de la Soja (Pseudoplusia includens), la Larva de Esciara de la Remolacha (Spodoptera exigua), la Larva de Esciara de Bandas Amarillas (Spodoptera ornithogalli), la Oruga de las Mazor-cas del Maíz (Helicoverpa zea), el Perforador de las Vainas (Epinotia aporema) y Rachiplu-10 sia nu, método que comprende aplicar a un área o planta a proteger una proteína ISP3 reivindicada como se define en esta memoria, preferiblemente una proteína ISP3-327D co-mo se define en esta memoria (a saber, por contacto de una planta de soja con una proteína ISP3 de esta invención, por ejemplo por plantación de una planta de soja transformada con un gen isp3 de esta invención, o por pulverización de una composición que contiene una 15 proteína ISP3 de esta invención). La invención se refiere también al uso de las proteínas ISP3 reivindicadas de esta invención, particularmente la proteína ISP3-327D, contra plagas de insectos Lepidópteros de la soja para minimizar el deterioro de las plantas de soja.

Para obtener la toxina o proteína ISP3, células de los hospedadores recombinantes que expresan la proteína ISP3 pueden cultivarse de manera convencional en un medio de 20 cultivo adecuado. La toxina secretada puede separarse y purificarse del medio de cultivo. Alternativamente, si las proteínas no se secretan, las células pueden lisarse utilizando me-dios convencionales tales como degradación enzimática o detergentes o medios análogos. La toxina puede separarse luego y purificarse por técnicas estándar tales como cromato-grafía, extracción, electroforesis, o medios análogos. 25

El término "gen" significa cualquier fragmento de DNA o RNA que comprende una región (la "región transcrita") que se transcribe en una molécula de RNA (v.g. un mRNA) en una célula, enlazada operativamente a regiones reguladoras adecuadas, v.g. un promotor expresable en plantas. Un gen puede comprender así varios fragmentos enlazados operati-vamente tales como un promotor, una secuencia conductora 5', una región codificante, y 30 una secuencia 3' no traducida, que comprende un sitio de poliadenilación. Un gen endógeno para un organismo particular (tal como una especie de planta o una cepa bacteriana) es un gen, que se encuentra naturalmente en dicho organismo en la naturaleza. Un gen quiméri-co, cuando se hace referencia a un DNA isp3 de esta invención, se refiere a una secuencia de DNA de isp3 que tiene secuencias reguladoras 5' y/o 3' diferentes de las secuencias 35 reguladoras 5' y/o 3' existentes naturalmente, que impulsan la expresión del gen isp3 en su célula hospedadora nativa.

El término "expresión de un gen" hace referencia al proceso en el que una región de DNA o RNA que está enlazada operativamente a regiones reguladoras apropiadas, particu-larmente a un promotor, se transcribe en un RNA que es biológicamente activo, es decir, que es capaz de interaccionar con otro ácido nucleico o que es susceptible de traducirse en un polipéptido o proteína biológicamente activo. Se dice que un gen codifica un RNA cuando 5 el producto final de la expresión del gen es RNA biológicamente activo, tal como v.g. un RNA antisentido, una ribozima o un compuesto intermedio replicativo. Se dice que un gen codifica una proteína cuando el producto final de la expresión del gen es una proteína o polipéptido biológicamente activo.

Para el propósito de esta invención, la "identidad de secuencia" de dos secuencias 10 afines de nucleótidos o aminoácidos, expresada como porcentaje, se refiere al número de posiciones en las dos secuencias alineadas óptimamente que tienen residuos idénticos (x 100) dividido por el número de posiciones comparadas. Una laguna, es decir una posición en una alineación en la cual está presente un residuo en una secuencia pero no en la otra se considera como una posición con residuos no idénticos. Para calcular la identidad de 15 secuencia entre dos secuencias para el propósito de esta invención, se utiliza el programa GAP, que emplea el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) y que se proporciona en el Paquete Wisconsin, Versión 10.2, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin 53711, EE.UU. Los parámetros de GAP son una penalidad por creación de laguna = 50 (nucleótidos)/8 (aminoácidos), una penalidad por extensión de laguna = 3 20 (nucleótidos)/2 (aminoácidos), y una matriz de registro "nwsgapdna" (nucleótidos) o "blo-sum62" (aminoácidos).

GAP utiliza el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias en toda su longitud, maximizando el número de coincidencias y minimizan-do el número de lagunas. Los parámetros por defecto son una penalidad por creación de 25 laguna = 50 (nucleótidos)/8 (proteínas) y penalidad por extensión de laguna = 3 (nucleóti-dos)/2 (proteínas). Para nucleótidos, la matriz de registro por defecto utilizada es (nwsgapd-na) y para proteínas la matriz de registro por defecto es "blosum62" (Henikoff & Henikoff, 1982).

Éstas y/u otras realizaciones de esta invención se reflejan en la expresión de las 30 reivindicaciones, que forman parte de la descripción de la invención.

Los ejemplos siguientes ilustran la invención, y no se proporcionan para limitar la invención o la protección buscada. El listado de secuencias a que se hace referencia en los Ejemplos, las Reivindicaciones y la Descripción es como sigue:

SEQ ID No. 1: secuencia de DNA del DNA de referencia isp3-1099E 35

SEQ ID No. 2: secuencia de aminoácidos de la proteína de la referencia ISP3-1099E

SEQ ID No. 3: secuencia de DNA isp3-327D

SEQ ID No. 4: secuencia de aminoácidos ISP3-327D

SEQ ID No. 5: secuencia de DNA del DNA de referencia isp3-2245J

SEQ ID No. 6: secuencia de aminoácidos de la proteína de referencia ISP3-2245J

A no ser que se indique otra cosa en los Ejemplos, todas las técnicas de DNA re-combinante se llevan a cabo de acuerdo con protocolos estándar como se describe en 5 Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, en los volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Pro-tocols in Molecular Biology, Current Protocols, EE.UU. y en los Volúmenes I y II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Segunda Edición, Academic Press (Reino Unido). Mate-riales y Métodos estándar para trabajo molecular con plantas se describen en Plant Molecu-10 lar Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido. Materiales y métodos estándar para las reacciones en cadena de la polimerasa pueden encontrarse en Dieffenbach y Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labo-ratory Press, y en McPherson et al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, Pri-15 mera Edición, Springer Verlag, Alemania.

Ejemplos

Ejemplo de Referencia 1: Caracterización de las cepas bacterianas

Una cepa bacteriana, denominada en esta memoria BTS01099E, se aisló de polvo de cereales de Bélgica. Una cepa bacteriana adicional, denominada en esta memoria 20 BTS00327D, se aisló de estiércol de caballo de España. Una cepa bacteriana adicional, designada en esta memoria BTS02245J, se aisló de polvo de cereales de las Filipinas.

Cada cepa se cultivó durante una noche en placas de agar LB (medio LB con 1,5% de agar añadido; medio LB: 10 g/l triptona, 10 g/l NaCl, 5 g/l extracto de levadura, pH 7,3) a 28ºC. Para cultivos en pequeña escala, se inocularon 20 ml de medio TB (Terrific Broth: 12 25 g/l triptona, 24 g/l extracto de levadura, 3,8 g/l KH2PO4, 12,5 g/l K2HPO4, 5 ml/l glicerol, pH 7,1) y se cultivaron durante 65 horas a 28ºC en una plataforma rotativa que daba aproxima-damente 70 vueltas por minuto. Después de 65 horas, se añadió al cultivo una mezcla de inhibidores de proteasa. Este cóctel tiene los ingredientes siguientes (los volúmenes dados son los requeridos para añadir a un cultivo de 20 ml): 200 µl PMSF (100 mM), 200 µl de una 30 mezcla de benzamidina.HCl (100 mM) y ácido épsilon-amino-n-caproico (500 mM), 400 µl de EGTA (0,5 M), 40 µl de antipaína (0,5 mg/ml)/leupeptina (0,5 mg/ml) y 20 µl de beta-mercaptoetanol (14M).

El medio de cultivo al que se había añadido la mezcla de inhibidores de proteasas, se centrifugó luego durante 20 minutos a 3000 rpm. En algunos casos, el sobrenadante se 35 concentró aproximadamente 4 veces utilizando Centriprep YM-10 Centrifugal Filter Devices (Millipore Cat. No. 4305).

Para almacenamiento a largo plazo, se añadió un asa de siembra de células espo-ruladas a 0,5 ml de glicerol al 25% y, después de agitar enérgicamente, se guardó a -70ºC. Las células esporuladas se obtuvieron por cultivo de la cepa en placas de agar LB hasta la esporulación (tal como era visible bajo el microscopio óptico).

Después del cultivo en placas de agar LB de colonias de células simples, el análisis 5 microscópico de los cultivo de las cepas BTS01099E, BTS00327D y BTS02245J demostró la presencia de células vegetativas simples y móviles en forma de varilla y esporangios que contenían una espora oval. Se detectaron cristales paraesporales en los cultivos de BTS00327D, BTS01099E y BTS02245J.

Basándose en la forma semejante a varillas, el crecimiento aerobio y la presencia 10 de cristales paraesporales, se cree que estas tres cepas son cepas de la especie B. thurin-giensis.

Cada cepa puede cultivarse en medios estándar convencionales, preferiblemente medio T3 (triptona 3 g/l, triptosa 2 g/l, extracto de levadura 1,5 g/l, 5 mg MnCl2, Na2HPO4.2H2O 0,05 M, NaH2PO4.H20 0,05 M, pH 6,8 y 1,5% agar), preferiblemente a 28ºC. 15 Para almacenamiento a largo plazo, se prefiere mezclar un volumen igual de una suspen-sión esporas-cristales con un volumen igual de glicerol al 50% y guardar esto a -70ºC o liofilizar una suspensión esporas-cristales. Para la esporulación, se prefiere el cultivo en medio T3 durante 72 horas a -28ºC.

Ejemplo de referencia 2: Bioensayos con insectos de cepas Bacillus (utilizando so-20 brenadante de cultivo que contiene proteína insecticida)

Se realizaron bioensayos sobre larvas recién nacidas de Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugiperda y Agrotis ipsilon.

Se utilizó en los bioensayos con insectos el sobrenadante exento de células de cul-tivo bacterianas de diferentes cepas de Bacillus ("ensayo de contaminación superficial") 25 contra diversos insectos Lepidópteros.

Las cepas BTS01099E, BTS00327D o BTS02245J se cultivaron a 98ºC en medio TB. El sobrenadante de cultivo exento de células se recogió 65 horas después de la inicia-ción del cultivo, se hicieron diluciones y se aplicaron sobre la superficie de una dieta artificial sólida (agar 20 g, agua 1000 ml, harina de maíz 96 g, levadura 30 g, gérmenes de trigo 64 30 g, sal de Wesson 7,5 g, caseína 15 g, ácido sórbico 2 g, Aureomicina 0,3 g, Nipagina 1 g, aceite de germen de trigo 4 ml, sacarosa 15 g, colesterol 1 g, y ácido ascórbico 3,5 g).

Se dispensó mezcla vitamínica modificada de Vanderzant (12 g) (basada en Van-derzant 1962) en los pocillos de placas Costar de 48 pocillos y se dejó solidificar. Se aplica-ron 25 µl de solución sobrenadante en la superficie de cada pocillo (1 cm2). Se puso una 35 sola larva de insecto recién nacida (L1; primera etapa entre mudas) en cada pocillo y se utilizaron 18-20 larvas por muestra. Se guardaron las cápsulas a 25 ±1ºC y se registraron

las tasas de mortalidad (porcentaje de larvas muertas frente a larvas vivas) después de 7 días. Como control negativo se utilizaron dieta estándar y TB.

Los resultados (presentados a continuación en la Tabla 1) demostraron que los so-brenadantes exentos de células de las cepas BTS01099E, BTS00327D y BTS02245J exhib-ían toxicidad frente a larvas de Heliothis virescens, Helicoverpa zea y Ostrinia nubilalis). 5 Adicionalmente, el sobrenadante de la cepa BTS02945J exhibía también toxicidad frente a las larvas de Spodoptera frugiperda y el sobrenadante de BTS00327D exhibía toxicidad frente a las larvas de Agrotis ipsilon.

Tabla 1:

Cepa: Hv muertas (%) Hz muertas (%) On muertas (%) Sf muertas (%) Ai muertas (%)

BTS02245J: 11 (ir) / 33 (gi) 94 (gi) / 50 50 (gi) 78 (gi) nt

BTS00327D: 70 35-78 (gi) 100 nt 100

BTS01099E: 25 10 46 nt nt

Hv: Heliothis virescens, Hz: Helicoverpa zea; On: Ostrinia nubilalis, Sf: Spodoptera frugiperda; Ai: Agrotis ipsilon; nt: no testado Controles negativos (dieta estándar): BTS02245J – Hv 9%, Hz 0%, On 0%, Sf 0% BTS00327D - Hv 10%, Hz 6%, On 4%, Ai 0% BTS01099E - Hv 10%, Hz 0%, On 0%

10

Observaciones adicionales:

gi: inhibición del crecimiento de las larvas (larvas vivas todavía en la etapa entre mudas L1/L2 después de 7 días); ir: crecimiento irregular de las larvas (una proporción de larvas vivas en la etapa entre mudas L1/L2, una proporción de larvas vivas en la etapa entre mudas L3/L4 después de 7 días). 15

El sobrenadante exento de células de la cepa BPS02245J causaba 11% y 33% de mortalidad de las larvas de H. virescens, 94% y 50% de mortalidad de las larvas de H. zea, 50% de mortalidad de las larvas de O. nubilalis y 78% de mortalidad de las larvas de S. frugiperda, demostrando que el sobrenadante de esta cepa tiene actividad insecticida, parti-cularmente contra H. zea y S. frugiperda. La toxicidad está causada probablemente por una 20 proteína secretada por esta cepa en el medio de cultivo.

El sobrenadante exento de células de la cepa BTS00327D causaba 70% de mortali-dad de las larvas de H. virescens, 35 a 78% de mortalidad de las larvas de H. zea, 100% de mortalidad de las larvas de O. nubilalis y 100% de mortalidad de las larvas de Agrotis ipsi-lon. Así pues, el sobrenadante de esta cepa exhibía toxicidad fuerte contra al menos 4 es-25 pecies diferentes de insectos Lepidópteros. La toxicidad está causada probablemente por una proteína activa como insecticida secretada por esta cepa en el medio de cultivo.

El sobrenadante exento de células de la cepa BTS01099E causaba 25% de mortali-dad de las larvas de H. virescens, 10% de mortalidad de las larvas de H. zea y 46% de mor-talidad de las larvas de O. nubilalis, indicando que el sobrenadante de esta cepa tiene actividad tóxica contra diferentes especies de insectos Lepidópteros. La toxicidad está cau-sada probablemente por una proteína activa como insecticida secretada por esta cepa en el 5 medio de cultivo.

Ejemplo 3. Clonación de los genes isp3

Clonación de la secuencia de nucleótidos de referencia que codifica ISP3-1099E a partir de la cepa BTS01099E

Se preparó el DNA total de cepa BTS0199E y se digirió parcialmente con Sau3A. El 10 DNA digerido se fraccionó por tamaños en un gradiente de sacarosa. Los fragmentos com-prendidos entre 7 kb y 10 kb se ligaron al vector de clonación pUC191 (un derivado de pUC19; Yannisch-Perron et al. 1985), después de digestión con BamHI y tratamiento del vector de clonación con TsAP (fosfatasa alcalina termosensible). La mezcla de ligación se sometió luego a electroporación en células XL1-Blue de E. coli. Los transformantes se ex-15 tendieron en placas sobre LB-triacilina que contenían X-gal e IPTG y se seleccionaron colo-nias blancas para utilización en experimentos de hibridación en filtro. Los clones recombinantes de E. coli que contenían el vector se cribaron luego con una sonda marcada con DIG que se preparó como sigue. Primeramente, se realizó una PCR utilizando como molde células de la cepa BTS1099E. El producto de amplificación resultante se purificó en 20 gel y se clonó en pGEM-T. El plásmido resultante se utilizó como molde en una reacción PCR utilizando dNTPs marcados con DIG y los mismos iniciadores que en la primera reac-ción PCR. Se utilizó una cantidad apropiada de este producto de amplificación en las reac-ciones de hibridación.

Después de la identificación de una colonia positiva que contenía un plásmido que 25 albergaba el gen isp3 de longitud total, se determinó la secuencia de este gen utilizando el método de marcación con el terminador de tinte y un secuenciador de DNA Perkin Elmer ABI Prism-377. Se secuenciaron ambas cadenas, la codificante y la no codificante.

La secuencia del marco de lectura abierto encontrada en el fragmento de DNA de referencia clonado de una colonia positiva se muestra en SEQ ID No. 1 (isp3-1099E). Se 30 encontró que esta secuencia de DNA codificaba la nueva proteína de referencia que se muestra en SEQ ID No. 2 (ISP3-1099E).

Para demostrar que esta secuencia de DNA es la causa de la actividad insecticida observada, se expresó la secuencia en una cepa bacteriana y se testó el sobrenadante o lisado de células de la cepa recombinante con respecto a actividad insecticida en bioensa-35 yos con insectos.

Clonación de la secuencia de nucleótidos que codifica ISP3-327D a partir de la cepa BTP00327D

Se preparó el DNA total de la cepa BTS00327D y se digirió parcialmente con Sau3A. El DNA digerido se fraccionó por tamaños en un gradiente de sacarosa. Fragmentos comprendidos entre 7 kb y 10 kb se ligaron al vector de clonación pUC19I (un derivado de pIC19; Yannisch-Perron et al. 1985), después de digestión con BamHI y tratamiento del vector de clonación con TsAP (fosfatasa alcalina termosensible). La mezcla de ligación se 5 sometió luego a electroporación en células XL1-Blue de E. coli. Los transformantes se ex-tendieron sobre placas de LB-triacilina que contenían X-gal e IPTG y se seleccionaron colo-nias blancas para utilización en experimentos de hibridación en filtro. Los clones recombinantes de E. coli que contenían el vector se cribaron luego con una sonda marcada con DIG que se preparó como sigue. En primer lugar, se realizó una PCR utilizando como 10 molde células de la cepa BTS00327D. El producto de amplificación resultante se purificó en gel y se clonó en pGEM-7. El plásmido resultante se utilizó como molde en una reacción PCR utilizando dNTPs marcados con DIG y los mismos iniciadores que en la primera reac-ción PCR. Se utilizó una cantidad apropiada de este producto de amplificación en las reac-ciones de hibridación. 15

Después de la identificación de una colonia positiva que contenía un plásmido que albergaba el gen isp3 de longitud total, se determinó la secuencia de este gen utilizando el método de marcación con el terminador de tinte y un secuenciador de DNA Perkin Elmer ABI Prism-377. Se secuenciaron ambas cadenas, la codificante y la no codificante.

La secuencia del marco de lectura abierto encontrada en el fragmento de DNA clo-20 nado de una colonia positiva se muestra en SEQ ID No. 3 (isp3-327D). Se encontró que esta secuencia de DNA codificaba la nueva proteína que se muestra en SEQ ID No. 4 (ISP3-327D).

Para demostrar que esta secuencia de DNA es la causa de la actividad insecticida observada, se expresó la secuencia en una cepa bacteriana y el sobrenadante o lisado de 25 células de la cepa recombinante se testó respecto a actividad insecticida en bioensayos con insectos.

Clonación de la secuencia de nucleótidos de referencia que codifica ISP3-2245J a partir de la cepa BTS02245J

Se preparó el DNA total de la cepa BTS02245J y se digirió parcialmente con Sau3A. 30 El DNA digerido se fraccionó por tamaños en un gradiente de sacarosa. Los fragmentos comprendidos entre 7 kb y 10 kb se ligaron al vector de clonación pUC19I (un derivado de pIC19; Yannisch-Perron et al. 1985), después de digestión con BamHI y tratamiento del vector de clonación con TsAP (fosfatasa alcalina termosensible). La mezcla de ligación se sometió luego a electroporación en células XL1-Blue de E. coli. Los transformantes se ex-35 tendieron sobre placas de LB-triacilina que contenían X-gal e IPTG y se seleccionaron colo-nias blancas para utilización en experimentos de hibridación en filtro. Los clones recombinantes de E. coli que contenían el vector se cribaron luego con una sonda marcada

con DIG que se preparó como sigue. En primer lugar, se realizó una PCR utilizando como molde células de la cepa BTS02245J. El producto de amplificación resultante se purificó en gel y se clonó en pGEM-7. El plásmido resultante se utilizó como molde en una reacción PCR utilizando dNTPs marcados con DIG y los mismos iniciadores que en la primera reac-ción PCR. Se fusionó (sic) una cantidad apropiada de este producto de amplificación en las 5 reacciones de hibridación.

Después de la identificación de una colonia positiva que contenía un plásmido que albergaba el gen isp3 de longitud total, se determinó la secuencia de este gen utilizando el método de marcación con el terminador de tinte y un secuenciador de DNA Perkin Elmer ABI Prism-377. Se secuenciaron ambas cadenas, la codificante y la no codificante. 10

La secuencia del marco de lectura abierto encontrada en el fragmento de DNA clo-nado de una colonia positiva se muestra en SEQ ID No. 5 (isp3-2245J). Se encontró que esta secuencia de DNA codificaba la nueva proteína que se muestra en SEQ ID No. 6 (ISP3-2245J).

Para demostrar que esta secuencia de DNA es la causa de la actividad insecticida 15 observada, se expresó la secuencia en una cepa bacteriana y el sobrenadante o lisado de células de la cepa recombinante se testó respecto a actividad insecticida en bioensayos con insectos.

Ejemplo 4: Expresión recombinante de proteínas ISP3 en E. coli

El DNA de referencia de SEQ ID No. 1 (isp3-9099E), SEQ ID No. 3 (isp3-327D) y el 20 DNA de referencia de SEQ ID No. 5 (isp3-2245J) se subclonaron en un vector de expresión, bajo control del promotor cry1Ab, y se expresaron en la cepa WK6 de E. coli. Durante la subclonación, se introdujo un sitio de restricción en NcoI en el codón inicial ATG, cambiando con ello el segundo aminoácido de SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4 y SEQ ID No. 6 de Aspara-gina (Asn) en Aspartato (Asp). 25

El análisis por SDS-PAGE de los lisados de células transformadas de E. coli de-mostró que se producían proteínas del peso molecular esperado (±88 kDa) por cada uno de los tres genes. Como controles negativos se utilizaron lisados de células de WK6 de E. coli no transformados.

El lisado de células de los cultivos recombinantes de E. coli, que expresaban la pro-30 teína de referencia isp3-327D e isp3-1099E, se utilizó en los ensayos con insectos (ensayos de contaminación superficial) como se describe en el Ejemplo 5. Los resultados se resumen en la Tabla 2 a continuación. Los símbolos más indican mortalidad significativa de los insec-tos con respecto al control negativo.

35

Tabla 2:

Gen en E. coli: Hz Hv Sf Ag Dvv

isp3-327D: + + + + -

isp3-1099E: + + + + -

control negativo WK6: - - - - -

Hz: Helicoverpa zea, Hz: Heliothis virescens, Sf: Spodoptera frugiperda, Dvv: Diabrotica virgifera virgifera, Ag: Anticarsia gemmatalis Bioensayos: Hz: Contaminación superficial en alimentación de Heliothis en placas Costar de 48 multipocillos, 25µl/pocillo (1cm2), 18x1L1 por concentración Hv: Contaminación superficial en alimentación de Heliothis en placas Costar de 24 multipocillos, 50µl/pocillo (2cm2), 20x1L1 por concentración Sf: Contaminación superficial en alimentación de littoralis en placas Costar de 48 multipocillos; 25µl/pocillo (1cm2); 18x1L1 por concentración Ag: Contaminación superficial en alimentación de littoralis en placas Costar de 24 multipocillos, 50µl/pocillo (2cm2), 12x2L1 por concentración Incubación a T:25±1°C; registro al cabo de 7 días

Para la proteína ISP3-327D y la proteína de referencia ISP3-1099F, se encontró una mortalidad significativa en los ensayos de contaminación superficial con Helicoverpa zea, 5 Heliothis virescens, Spodoptera frugiperda y Anticarsia gemmatalis. Adicionalmente, el lisa-do de células sin diluir de E. coli recombinante que expresaba la proteína de referencia ISP3-327D o ISP3-1099E exhibía una mortalidad significativa contra Ostrinia nubilalis (50%(gi) mortalidad para ISP3-327D, 26% (gi) mortalidad para ISP3-1099E comparada con 0% mortalidad para el control WK6). 10

Ejemplo 5: Expresión recombinante de proteínas ISP3 en Bt

El DNA de referencia de SEQ ID No. 1 (isp3-1099E) y SEQ ID No. 5 se subclonaron en un vector lanzadera y se expresaron en una cepa de Bt, la cepa Crystal Minus (IPS 78/11 o Berliner 1715cry ). En los bioensayos, se utiliza como control negativo el sobrenadante de la cepa Bt no transformada. 15

El sobrenadante de cultivo exento de células procedente de la cepa recombinante Bt se testa respecto a toxicidad contra larvas de insectos Lepidópteros, particularmente contra H. virescens, H. zea, H. armigera, O. nubilalis, S. frugiperda, Agrotis ipsilon, Pecti-nophora gossypiella y A. gemmatalis, utilizando un ensayo de contaminación superficial como se ha descrito arriba (Ejemplo 2) y más adelante (para determinar los valores CL50). 20

El sobrenadante de la cepa Bt recombinante se obtiene como sigue.

Se cultiva la cepa Bt durante una noche en placas de agar LB que contienen eritromi-cina (20 µg/ml) a 28°C. Para cultivos en pequeña escala, se inoculan 20 ml de medio BT que contiene eritromicina (20 µg/ml) y se dejan crecer durante 65 horas a 28°C sobre una platafor-ma rotativa que da aproximadamente 70 vueltas por minuto. Después de 65 horas, se añade 5 al cultivo una mezcla de inhibidores de proteasas. Este cóctel tiene los ingredientes siguien-tes:(los volúmenes indicados son los que deben añadirse a 20 ml de cultivo): 200µl PMSF (100mM), 200µl de una mezcla de benzamidina.HCl (100mM)/ácido épsilon-amino-n-caproico (500 mM), 400µl EGTA (0,5M), 40µl antipaína (0,5 mg/ml)/leupeptina (0,5 mg/ml) y 20µl beta-mercaptoetanol (14M). 10

El medio de cultivo al que se había añadido la mezcla de inhibidores de proteasas, se centrifuga luego durante 20 minutos a 3000 rpm. En algunos casos, el sobrenadante se concentra aproximadamente 4 veces utilizando Centrifugal Filter Devices Centriprep YM-10 (Millipore, Cat. No. 4305).

Para Helicoverpa zea y Heliothis virescens se utiliza la dieta artificial siguiente en el 15 ensayo de contaminación superficial: agua 1 litro, agar 20g, harina de soja 81g, germen de trigo 36g, mezcla de sales de Wesson 10g, sacarosa 14,7g, Nipagina 1g, ácido sórbico 1,1g, mezcla vitamínica Vanderzant 9,5g, aceite de maíz 5ml, Nistatina 0,06g, Aureomicina 0,17g.

En los ensayos de contaminación superficial para otros insectos Lepidópteros, se utiliza la dieta artificial siguiente: agua 1 litro, agar 20g, harina de maíz 112g, germen de 20 trigo 28g, levadura 30g, ácido sórbico 1,2g, Nipagina 1g, Aureomicina 0,06g, Nistatina 0,3g, ácido ascórbico 4,8g.

La dieta artificial se dispensa en los pocillos de placas Costar de 24 multipocillos y se deja solidificar. Se aplican 50 µl de sobrenadante diluido sobre la superficie de cada poci-llo (2 cm2). Se ponen en cada pocillo una o dos larvas recién nacidas (L1; primera etapa 25 entre mudas) (dependiendo de la especie, v.g. para O. nubilalis 2 larvas/pocillo) y se utilizan alrededor de 20 a 24 larvas por cada dilución del sobrenadante. Se testan 6 a 8 diluciones del sobrenadante (el factor de dilución es aproximadamente 3), comprendidas entre aproxi-madamente 4050 y 0,21 ng/cm2. Las cápsulas se guardan a 25 ±1ºC y se registran las tasas de mortalidad (porcentaje de larvas muertas frente a larvas vivas) después de 7 días. Como 30 control negativo se utilizan dieta estándar y TB. Se calculan los valores CL50 y/o CL90 con análisis Probit utilizando el programa POLO PC (de LeOra Software, 1987, Berkeley, Cali-fornia). El valor CL50 es la concentración total de proteína sobrenadante cuando se destru-yen el 50% de las larvas de insectos testadas.

Los bioensayos demuestran que las proteínas codificadas por las secuencias de 35 referencia clonadas isp3-1099E e isp3-2945J exhiben cada una de ellas actividad insectici-da significativa contra insectos Lepidópteros seleccionados.

Se subclonó SEQ ID No. 3 (isp3-327D) en un vector lanzadera y se expresó en la cepa de Bt Crystal Minus IPS78/11. En los bioensayos, se utilizó como control negativo el sobrenadante de la cepa Bt no transformada.

El análisis SDS-PAGE demostró que el sobrenadante de cultivo contenía una pro-teína con un peso molecular próximo al peso molecular calculado de la proteína ISP3-327D 5 (±88 kDa).

Utilizando el ensayo de contaminación de superficie descrito en el Ejemplo 2, el sobrenadante del cultivo exento de células de la cepa Bt IPS78/11 que expresaba SEQ ID No. 3 (isp3-327D) demostró actividad insecticida significativa contra Ostrinia nubilalis (On), Pectinophora gossypiella (Pg) y Helicoverpa zea (Hz), como se muestra en la Tabla 3. 10

Tabla 3:

: Hz muertas (%) On muertas (%) Pg muertas (%) Dvv muertas (%)

isp3-327D en IPS 78/11: 94 (gi) / 58 (gi) 19 (gi) 29 (gi) 0

Control IPS 78/11: 0 6 0 5

gi: inhibición del crecimiento de las larvas / Dvv: Diabrotica virgifera virgifera

Bioensayos:

Ensayos de contaminación superficial, como se han descrito arriba, utilizando so-brenadante concentrado después de 26 horas de cultivo en TB y después de la adición de 15 cóctel inhibidor de proteasas. Se utilizó dieta artificial de Heliothis (como anteriormente) para H. zea y dieta artificial de littoralis para O. nubilalis y P. gossypiella. Para H. zea y O. nubila-lis se utilizaron placas Costar de 48 pocillos, 25 µl/pocillo (1 cm2), 18 pocillos con una sola larva L1 por pocillo. Para P. gossypiella se utilizaron placas Costar de 24 pocillos, 50 µl/pocillo (2 cm2) y 12 pocillos con 2 larvas L1 por pocillo. Se utilizó dieta artificial Dvv (como 20 anteriormente) para Dvv en placas de 24 pocillos, 50 µl/pocillo (2 cm2), 6 pocillos con 4 L1/pocillo.

El bioensayo demostró que la proteína codificada por la secuencia clonada isp3-327D tiene actividad insecticida significativa contra insectos Lepidópteros seleccionados.

Ejemplo 6: Caracterización adicional de ISP3-327D 25

Se utilizó el sobrenadante de la cepa de Bt Crystal Minus IPS78/11 que expresaba SEQ ID No. 3 (isp3-327D) para testar la digestibilidad con tripsina de la proteína ISP3-327D y la toxicidad de los fragmentos resultantes. El tratamiento con tripsina del sobrenadante del cultivo IPS78/11 transformado dio como resultado dos bandas principales de aproximada-mente 65 kDa y aproximadamente 23 kDa, como se determina por análisis SDS-PAGE. 30

Se utilizaron tanto sobrenadante tratado con tripsina (4 horas de tratamiento; la re-acción se paró con PMSF de una concentración final de 0,1 mM) como sobrenadante sin tratar con tripsina en los ensayos de contaminación superficial contra Helicoverpa zea. El ensayo de contaminación superficial se realizó sobre alimento de Heliothis en placas de 48 multipocillos (25 µl/pocillo; 1 cm2). Se testaron 6 diluciones del sobrenadante. Por cada dilu-5 ción se utilizaron 18 pocillos y una sola larva L1 por pocillo. La mortalidad se registró des-pués de incubación a 25º ±1ºC al cabo de 7 días.

Los valores CL50 para la proteína ISP3-327D sin tratar y tratada con tripsina exhibie-ron intervalos de confianza solapantes de 90%, demostrando que la proteína tratada con tripsina retiene actividad tóxica contra H. zea. 10

Ejemplo 7: Bioensayos con insectos del arroz de las proteínas ISP3 recombinantes

Las secuencias para DNA de referencia isp3-1099E (SEQ ID No. 1), isp-327D (SEQ ID No. 3) y DNA de referencia isp3-2445J (SEQ ID No. 5) se expresaron en E. coli como se ha descrito arriba.

Los lisados de células de E. coli recombinante se testaron en bioensayos con insec-15 tos respecto a actividad contra 4 plagas de Lepidópteros del arroz. Se testaron 5 a 6 dosis por proteína.

(a) Bioensayo del Perforador Amarillo de los Vástagos (Scirphophaga incertulas):

Se recogieron de campos de arroz adultos del perforador amarillo de los vástagos. Se recogieron huevos puestos por los adultos y se guardaron en cápsulas Petri hasta la 20 eclosión a 30ºC. Se utilizaron en los bioensayos las larvas recién eclosionadas.

Se utilizaron vainas de tallos de arroz de 6 cm. Se cortaron segmentos de 6 centí-metros de longitud de las vainas de las hojas de tallos de arroz recién arrancados de la va-riedad susceptible TN1. La parte más interna del segmento, junto con una cubierta de la vaina, se sumergieron por separado en las diferentes dosis de proteínas durante 30 segun-25 dos. La vaina del tallo tratada se inmovilizó verticalmente en 2 cm de gel de agar en tubos de muestra (longitud 7 cm; diámetro 2,5 cm). Se añadieron a cada tallo tratado 10-15 larvas recién nacidas del Perforador Amarillo de los Vástagos y los tubos se sellaron y se incuba-ron durante 5 días. Al cabo de 5 días, se contaron los números de larvas supervivientes y de larvas muertas. 30

(b) Bioensayo del doblador de las hojas (Cnaphalocrocis medinalis):

Se recogieron los insectos de campos de arroz en el norte de la India. Se desarrolla-ron las larvas de insecto sobre plantas de arroz en el invernadero. Los adultos emergentes se confinaron en la cámara de oviposición y las plantas ovidepositadas se mantuvieron en bandejas con agua hasta la eclosión de las larvas. Se utilizaron en los bioensayos larvas de 35 un solo día.

Se condujeron los bioensayos en cámaras cilíndricas, utilizando hojas recién arran-cadas de plantas de arroz en la etapa de retoñado. Se cortó una lámina de hoja de 8 cm de

longitud del verticilo central del retoño de arroz. La lámina de hoja se puso en la cámara y se aplicaron las diferentes dosis de proteína. Después de 30 minutos, se añadieron 5 a 10 larvas por hoja. Se utilizaron al menos tres hojas por cada dosis de proteína. Cinco días después de la incubación, se contó el número de larvas muertas y supervivientes.

(c) Bioensayo del Perforador Rosa de los Vástagos (Sesamia inferens): 5

Se recogieron los insectos de campos de arroz en el norte de la India y se desarro-llaron en plantas de arroz. Los bioensayos se condujeron en viales de vidrio (7,5 cm x 2,5 cm de diámetro) utilizando una dieta artificial constituida por polvo de judía seco, levadu-ra de cerveza, ácido sórbico, ácido ascórbico, metil-parabén, agar y agua. Se dispensó la dieta en los viales hasta una altura de 2 cm. Se prepararon al menos tres viales por cada 10 dosis de proteína. Se extendieron uniformemente 40 µl de la dosis de test en la superficie de la dieta en cada vial y se dejó que se secaran durante 1 hora. Se añadieron de 10 a 15 larvas en la primera etapa entre mudas del Perforador Rosa de los Vástagos por vial. Des-pués de 7 días se contó el número de larvas muertas y supervivientes.

(d) Bioensayos del Perforador Moteado de los vástagos del Maíz (Chilo partellus): 15

Los insectos se mantuvieron con una dieta artificial constituida por polvo de judía roja, levadura de cerveza, ácido sórbico, polvo de hojas de sorgo, ácido ascórbico, ácido metil-para-hidroxibenzoico, vitaminas, aceite de germen de trigo, mezcla de sales de Wes-son, agar, formaldehído y agua. Se utilizaron en los bioensayos larvas recién nacidas de estos cultivos. Los bioensayos se realizaron como ha sido descrito para el Perforador Rosa 20 de los Vástagos (Sesamia inferens).

(e) Resultados de bioensayos con insectos del arroz:

Los resultados de los bioensayos con insectos, resumidos a continuación en la Ta-bla 4, demostraron que ISP3-327D y la proteína de referencia ISP3-1099E eran sumamente tóxicos para cuatro plagas de Lepidópteros del arroz, a saber Perforador Amarillo de los 25 Vástagos (Scirphophaga incertulas), Doblador de las Hojas (Cnaphalocrocis medinalis), Perforador Rosa de los Vástagos (Sesamia inferens) y Perforador Moteado de los Vástagos del Maíz (Chilo partellus). Adicionalmente, la proteína de referencia ISP3-2245J exhibía toxicidad significativa frente a tres plagas de Lepidópteros del arroz, a saber Perforador Amarillo de los Vástagos (Scirphophaga incertulas), Doblador de las Hojas (Cnaphalocrocis 30 medinalis) y Perforador Rosa de los Vástagos (Sesamia inferens), en tanto que no se de-tectó toxicidad alguna de la proteína de referencia ISP3-2245J contra el Perforador Motea-do de los Vástagos del Maíz (Chilo partellus).

Tabla 4: 35

Gen en E. coli: YSB LF PSB SSB

isp3-327D: + + + +

isp3-1099E: + + + +

Isp3-2245J: + + + -

Control negativo: - - - -

YSB: Perforador Amarillo de los Vástagos, LF: Doblador de las Hojas, PSB: Perforador Rosa de los Vástagos, SSB: Perforador Moteado de los Vástagos; los símbolos más (+) indican mortalidad significativa mayor que la del control negativo.

Ejemplo 8: Producción de proteínas ISP3 en plantas transformadas

Se construyen vectores de expresión en plantas que comprenden un promotor ex-presable en plantas, enlazado operativamente a una secuencia de DNA que codifica la pro-teína de referencia ISP3-1099E, ISP3-327D o la proteína de referencia ISP3-2245J (o un 5 fragmento tóxico o variante de la misma), y una señal de poliadenilación 3'. Se inserta una secuencia conductora, tal como la del gen de la proteína de fijación de la clorofila a/b de Petunia (Harpster et al., 1988), 5' respecto al DNA de isp3. Preferiblemente, se adapta el uso de codones del DNA de referencia isp3-1099E, isp3-327d y el DNA de referencia isp3-2245J al de la planta hospedadora (v.g. maíz, algodón o arroz), por ejemplo como se descri-10 be en WO 94/24264.

Los promotores utilizados para conducir los genes isp3 se seleccionan de los pro-motores constitutivos 35S de CaMV (Hull y Howell, 1987), el promotor ubiquitina del maíz, el promotor actina del arroz y el promotor del Virus del Mosaico de los Nervios de la Mandioca. Como señal de terminación y poliadenilación del transcrito 3' se utilizan el 3' 35S, 3' nos 15 (Depicker et al., 1982), 3' ocs o 3' gen 7. Para la transformación mediada por Agrobacterium se inserta la casete de expresión en un vector de T-DNA, entre la secuencia de los bordes derecho e izquierdo.

Transformación de plantas de maíz (Zea mays), algodón (Gossipium hirsutum o Gossipium barbadense) y arroz (Ozyza sativa). 20

Se transforman de manera estable células de maíz por transformación mediada por Agrobacterium como se describe en US 6.140.553. Las células de algodón se transforman de manera estable por transformación mediada por Agrobacterium como se describe en WO 00/71733. Las células de arroz se transforman de manera estable como se describe en WO 92/09696. 25

Las células y plántulas transformadas se regeneran como se describe en las refe-rencias anteriores. Para constructos que comprenden adicionalmente un gen marcador se-leccionable, tal como un gen de resistencia a los herbicidas, por ejemplo 2mEPSPS (EP 0 508 909 y EP 0 507 698) que confiere resistencia a glifosato o el gen bar o PAT que confie-ren resistencia a glufosinato de amonio (EP 0 242 236 y EP 0 242 246) las células transfor-30

madas se cultivan en medios de selección que contienen el agente selectivo, de tal modo que se transforman la mayor parte de los regenerantes seleccionados.

A partir de los regenerantes se seleccionan los transformantes que expresan el gen isp3 por ELISA, transferencia Southern, transferencia Northern y/o análisis PCR. Los suce-sos de transformación, particularmente sucesos de una sola copia, se seleccionan luego 5 respecto a actividad insecticida frente a las plagas de insectos Lepidópteros (utilizando bio-ensayos). Las plantas de la progenie que contienen el gen quimérico de referencia isp3-1099E, isp3-327D o el gen de referencia isp3-2245J exhiben resistencia incrementada a los insectos Lepidópteros comparadas con las plantas de control no transformadas. Particular-mente las plantas con niveles altos de tolerancia a los insectos expresan un nivel alto de 10 proteína ISP y mRNA de isp3.

Se seleccionan ulteriormente transformantes en cuanto a características agronómi-cas (fenotipo normal, rendimiento, arquitectura de planta, etc.). Después de los aumentos de las semillas, se llevan a cabo pruebas en campo de pantas de maíz, algodón o arroz trans-formadas en diferentes regiones en las que están presentes plagas de insectos suscepti-15 bles, demostrando que las plantas que expresan las proteínas ISP3 tienen una tolerancia incrementada a los insectos en condiciones de campo en diferentes ambientes. Particular-mente, después de la infestación (artificial o natural) del campo por las plagas de insectos, las pérdidas de rendimiento de las plantas transformadas se reducen comparadas con las plantas de control no transformadas. 20

Para generar plantas con actividad insecticida amplia, los sucesos de expresión de ISP3 se cruzan unos con otros y con otras plantas transgénicas, expresando proteínas in-secticidas con un espectro insecticida diferente, preferiblemente complementario. Las pro-genies de los cruces se ensayan respecto a actividad insecticida utilizando bioensayos para una gama de plagas de insectos diferentes. De este modo se generan plantas con actividad 25 insecticida contra la gama de insectos deseada.

Esta invención no se limita a las plantas de maíz, algodón, soja o arroz citadas ante-riormente, métodos de transformación, constructos vectores (promotores, extremos 3', etc.) o las proteínas ISP3 o secuencias de DNA particulares utilizadas. La invención incluye va-riantes o equivalentes de las proteínas ISP3 que retienen actividad insecticida. 30

REFERENCIAS

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LISTADO DE SECUENCIAS 30

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Nuevas proteínas insecticidas de bacillus thuringiensis

Secuencia de nucleótidos de isp3-1099E de Bacillus thuringiensis

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Secuencia de aminoácidos de ISP3-1099E de Bacillus thuringiensis

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Secuencia de nucleótidos de isp3-327D de Bacillus thuringiensis

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Secuencia de aminoácidos de ISP3-327D de Bacillus thuringiensis

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Secuencia de nucleótidos de isp3-2245J de Bacillus thuringiensis

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Secuencia de aminoácidos de ISP3-2245J de Bacillus thuringiensis

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Claims

REIVINDICACIONES
1.- Una proteína aislada insecticida para Ostrinia nubilalis, que comprende la se-cuencia de aminoácidos de una variante de la proteína de SEQ ID No. 4, en donde dicha variante tiene 5 a 10 aminoácidos añadidos, reemplazados o delecionados en comparación 5 con la proteína de SEQ ID No. 4 sin cambio significativo de la actividad insecticida de la proteína.
2.- La proteína de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de una variante de SEQ ID No. 4 en donde dicha variante tiene menos de 5 aminoácidos añadidos, reemplazados o delecionados en comparación con la proteína de SEQ ID No. 4 10 sin cambio significativo de la actividad insecticida de la proteína.
3.- La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde dicha pro-teína comienza con un dipéptido Met-Asp o Met-Ala, por inserción de un codón que codifica un aminoácido Asp o Ala aguas abajo del codón de inicio en el DNA que codifica la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 15
4.- La proteína de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4.
5.- Una proteína aislada insecticida para Ostrinia nubilalis, que comprende la se-cuencia de aminoácidos del fragmento más pequeño de la proteína de SEQ ID No. 4 que retiene actividad insecticida, que se obtiene por digestión enzimática de la proteína de SEQ 20 ID No. 4 con fluido de jugo intestinal de Ostrinia nubilalis.
6.- La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es insecticida contra Pectinophora gossypiella, Scirphophaga incertulas, Cnaphalocrocis medinalis, Sesa-mia inferens, Chilo partellus y Anticarsia gemmatalis.
7.- Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica la proteína de una cual-25 quiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8.- La secuencia de ácido nucleico aislada de la reivindicación 7, que comprende los nucleótidos 1 a 2367 de SEQ ID No. 3.
9.- La secuencia de ácido nucleico aislada de la reivindicación 7, que es una se-cuencia sintética que ha sido optimizada para expresión en plantas monocotiledóneas o 30 plantas dicotiledóneas.
10.- Un gen quimérico que comprende una secuencia promotora enlazada operati-vamente a una secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.
11.- El gen quimérico de la reivindicación 10, que comprende también una región codificante que codifica un péptido de tránsito para direccionamiento a los cloroplastos o a 35 otros plastos, enlazada a la secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindi-caciones 7 a 9.
12.- Un vector que comprende el gen quimérico de la reivindicación 10 ó 11.
13.- Una célula hospedadora transgénica que comprende el gen quimérico de la reivindicación 10 ó 11.
14.- La célula hospedadora de la reivindicación 13, que es una célula vegetal.
15.- La célula hospedadora de la reivindicación 13, que es un microorganismo.
16.- Una planta transgénica que comprende el gen quimérico de la reivindicación 10 5 ó 11.
17.- La planta de la reivindicación 16, que es una planta de maíz, algodón, arroz o soja.
18.- Un método de protección de una planta contra el deterioro causado por los insectos, que comprende poner en contacto dicha planta con la proteína insecticida de una 10 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
19.- El método de la reivindicación 18, en donde dicha proteína insecticida es codifi-cada por un gen quimérico integrado en el genoma de dicha planta.
20.- El método de la reivindicación 18, en donde dicha proteína se aplica externa-mente a dicha planta. 15
21.- El método de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en donde dicha planta es una planta de maíz, algodón, soja o arroz.
22.- Una cepa de Bacillus thuringiensis transformada con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.
23.- Una composición insecticida que comprende la proteína de una cualquiera de 20 las reivindicaciones 1 a 6 que, cuando se aplica externamente a una planta, aumenta la resistencia al deterioro causado por los insectos comparada con las plantas de control a las que no se ha aplicado dicha composición.
24.- El uso de la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 contra una plaga de insectos Lepidópteros del algodón, el maíz, el arroz o la soja. 25
25.- El uso de la reivindicación 24, en donde dicha plaga de insectos es Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugiperda, Pectinophora gossypiella, Scirphophaga incertulas, Cnaphalocrocis medinalis, Sesamia inferens, Chilo partellus y An-ticarsia gemmatalis.
26.- El uso de la reivindicación 25, en donde dicha plaga de insectos es Scirphop-30 haga incertulas, Cnaphalocrocis medinalis, Sesamia inferens, Chilo partellus y Anticarsia gemmatalis.
27.- La planta de la reivindicación 16, que expresa simultáneamente con la proteína de SEQ ID No. 4 o su fragmento o variante: una proteína Cry, una proteína Cry1F, un híbri-do derivado de una proteína Cry1F, una proteína de tipo Cry1A o un fragmento tóxico de la 35 misma, una proteína Cry1Ac o un híbrido derivado de la misma, una proteína Cry1Ab o un fragmento insecticida de la misma, una proteína Cry2Ae, una proteína VIP3Aa o un frag-

mento tóxico de la misma, o una proteína insecticida de cepas de especies de Xenorhab-dus, Serratia o Photorhabdus.
28.- La planta de la reivindicación 27 que es maíz, arroz, algodón o soja.
29.- La planta de la reivindicación 27 ó 28, que es una planta híbrida.
30.- Uso de la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 co-5 expresada en plantas de maíz, arroz, algodón o soja, en combinación con otra proteína de control de los insectos, en donde dicha otra proteína de control de los insectos es: una pro-teína Cry1Ac, una proteína Cry1Ab, una proteína Cry2Ae, o una proteína VIP3Aa o deriva-dos de la misma.
31.- La célula vegetal de la planta de la reivindicación 14 o la planta de la reivindica-10 ción 16, que comprenden también un gen PAT que confiere resistencia a glufosinato de amonio, o un gen 2mEPSPS que confiere resistencia a glifosato.