BRPI0308659B1 - Sequências de ácido nucléico, gene quimérico, vetor, cepa de bacillus thuringiensis, bem como processo de proteção de planta contra danos causados por insetos. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SEQUÊNCIAS DE ÁCIDO NUCLÉICO, GENE QUIMÉRICO, VETOR, CEPA DE BA-CtLLUS THURINGIENSIS, BEM COMO PROCESSO DE PROTEÇÃO DE PLANTA CONTRA DANOS CAUSADOS POR INSETOS".

Campo da Invenção A presente invenção se refere ao campo do controle de pragas vegetais, particularmente ao controle de insetos. São fornecidas novas sequências de ácido nucléico de cepas do Bacillus thuringiensis (Bt), que codificam proteínas inseticidas expressas durante os estágios de crescimento vegeta ti vo. Particularmente, são fornecidas as sequências de DNA que codificam as proteínas denominadas de ISP-3-1099E, ISP3-327D e ISP3-2245J, que são úteis para proteger plantas dos danos causados por insetos. São ainda fornecidos plantas e microorganismos que compreendem pelo menos uma das novas moléculas de ácido nucléico, assim como processos e meios para a utilização destas seqüências de ácido nucléico para a redução dos danos causados por insetos nas plantas. Técnica Anterior As pragas de insetos causam enormes perdas econômicas no mundo todo na produção de plantas de cultivo e os fazendeiros encaram todos os anos a ameaça de perdas de rendimento causadas pela infestação de insetos. A engenharia genética da resistência a insetos nas plantas de cultivo agrícolas tem sido uma abordagem atraente para reduzir os custos associados com as práticas de controle das plantas de cultivo e de controle químico, A primeira geração de plantas de cultivo resistentes a insetos foi introduzida no mercado a partir de 1996, com base na expressão em plantas de proteínas isoladas da bactéria do solo gram-positiva Bacillus thuringiensis (Bt). As proteínas Cry de Bt inseticidas são produzidas durante o estágio de esporulação de cepas de Bt e as proteínas se acumulam em grandes cristais citoplasmáticos dentro da bactéria. Quando ingeridos por insetos, uma proteína Cry típica de Bt tóxica aos Lepídópteros é solubilizada e processada no intestino médio do inseto em uma forma ativa de aproximadamente 60 até 65 kDa, A proteína ativa exerce seu efeito tóxico através da ligação com as Segue-se folha 1 a células epiteliais do intestino médio causando a brana celular que leva à Iko -*■ rmaçao de poros na mem- ar, que leva a hse os™.,ca das células (GUI e outros, 1992), Segue-se folha 2 Uma cepa de Bt pode produzir muitas toxinas diferentes. Desde o isolamento do primeiro gene que codifica uma proteína inseticida em cristal do Bt em 1981 (Schnepf e Whiteley, 1981) mais de 100 genes que codificam toxinas Cry do Bt foram clonados e as pragas de insetos foram eficientemente controladas através da expressão de proteínas derivadas do Bt em espécies de plantas de cultivo agrícola importantes. Entretanto, o uso de proteínas de Bt individuais é freqüentemente limitado, uma vez que a maior parte das proteínas de Bt são em grande parte ativa apenas contra um número relativamente pequeno das numerosas pragas de insetos existentes. Acredita-se que a especificidade das proteínas Cry de Bt seja determinada por fatores tais como a ativação da toxina no intestino do inseto (Haider e outros, 1986) e sua capacidade de se ligar a receptores específicos (Ho-fmann e outros 1988). É amplamente reconhecido que há um risco de que espécies de insetos susceptíveis possam desenvolver resistência contra as toxinas Cry do Bt. Conseqüentemente, têm sido feitos esforços ativos para identificar novas proteínas inseticidas. Uma estratégia, que foi utilizada, foi selecionar cepas de Bacillus para a produção de proteínas inseticidas durante os estágios de crescimento vegetativo, ao invés de durante os estágios de esporu-lação. Utilizando esta abordagem, foi identificado um número de "proteínas inseticidas vegetativas" ou "VIPs".

Estruch e outros (1996), WO 94/21795, WO 96/10083, WO 98/44137, Patente U.S. N- 5.877.012, Patente U.S. N- 6.107.279, Patente U.S. N° 6.137.033 e Patente U.S. N2 6.291.156 descrevem o isolamento de vip3A(a), vip3A(b) e vip3A(c) dos fluidos do sobrenadante de cepas de Bt AB88, AB424 e AB51. De acordo com os autores estes genes codificam proteínas com atividade inseticida para uma faixa ampla de pragas de insetos Lepidópteros. O WO 98/18932 e o WO 99/57282 descrevem um número de seqüências de nucleotídeos isoladas de cepas de Bt. Estas seqüências são referidas como mis (mis-1 até mis-8), war e sup. De acordo com os autores as proteínas codificadas possuem atividade contra pragas Lepidópteras e Coleópteras. O WO 00/09697 descreve toxinas do tipo MIS e do tipo WAR solúveis termolábeis, assim como toxinas menores (1 até 10 kDa), que podem ser obtidas partindo do sobrenadante de culturas de cepas de Bacillus laterosporus, que, de acordo com os autores, possuem atividade contra as larvas do Verme de Raiz do Milho do Oeste. O WO 98/00546 e a Patente U.S. N° 6.274.721 descrevem o isolamento de cepas de Bt e de toxinas de Bt, que, de acordo com os autores, possuem atividade contra pragas Lepidópteras. O WO 99/33991 descreve o isolamento de cepas de Bt e de toxinas de BT, que, de acordo com os autores, possuem atividade contra pragas de Lepidópteros.

Recentemente, Selvapandiyan e outros, (2001) descreveram o isolamento de um gene que codifica uma proteína denominada de VIP-S. De acordo com os autores a proteína VIP-S exibia toxicidade contra um número de espécies de insetos Lepidópteros.

Doss e outros (2002) descrevem a clonagem de VIP3V da cepa Bt kurstaki. O WO 02/078437 descreve as toxinas VIP3 de Bt, tais como a VIP3A, a VIP3B e a toxina híbrida VIP3A-B.

Apesar do isolamento e da caracterização de um número relativamente alto de proteínas inseticidas diferentes até hoje, permanece uma necessidade de identificação, isolamento e caracterização de novas proteínas inseticidas. As razões para isso são múltiplas. Em primeiro lugar, devido à especificidade de proteínas inseticidas para grupos particulares de pragas alvo (espectros de insetos hospedeiros), há uma necessidade de clonar genes que codificam proteínas com espectros de atividade diferentes, de forma que para as plantas de cultivo diferentes e para as regiões geográficas diferentes estejam disponíveis proteínas adequadas para o combate de pragas de insetos. A especificidade das proteínas Cry de Bt, por exemplo, é na maior parte dos casos limitada. Permanece desejável a identificação de toxinas com especificidade para alvos de insetos diferentes. Em segundo lugar, após o uso prolongado em uma região geográfica, sabe-se que os insetos possuem a capacidade de desenvolver resistência aos inseticidas químicos, aos sprays microbianos (por exemplo, baseados em misturas de esporos -cristais de Bt) e acredita-se que tenham a capacidade de desenvolver resistência a plantas que expressam proteínas inseticidas. O desenvolvimento de resistência dentro de populações de insetos poderia potencialmente tornar as proteínas inseticidas existentes ineficientes, fornecendo uma necessidade de novos genes e proteínas. Em terceiro lugar, por razões de saúde e ambientais é desejável identificar proteínas com potência inseticida específica alta e atividade biológica aguda para as espécies de insetos alvo.

Posteriormente aqui, incluindo as modalidades diferentes descritas nas reivindicações, são descritas as novas seqüências de ácido nu-cléico e as seqüências de aminoácidos isoladas de cepas de Bacillus thurin-giensis, que são úteis para proteger as plantas de danos causados por insetos, seja pela expressão das seqüências de ácido nucléico dentro das plantas sob o controle de promotores adequados ou pela aplicação externa das toxinas nas plantas. As toxinas da presente invenção são distintas das toxinas pesticidas descritas anteriormente.

Sumário da Invenção A invenção fornece proteínas inseticidas ISP3 e os ácidos nu-cléicos que codificam as mesmas. São fornecidas as proteínas inseticidas ISP3-1099E (SEQ ID Ne: 2), ISP3-327D (SEQ ID Np: 4) e ISP3-2245J (SEQ ID NQ: 6) e os ácidos nucléicos que codificam as mesmas, isp3-1099E (SEQ ID NQ: 1), isp3-327D (SEQ ID Ne: 3) e isp3-2245J (SEQ ID NQ: 5), respectivamente. As proteínas da invenção possuem atividade inseticida contra pragas de insetos Lepidópteros, particularmente contra os insetos selecionados do grupo que consiste em Helicoverpa zea, Helicoverpa armigera, Helico-verpa punctigera, Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugiper-da, Agrotis ipsilon, Pectinophora gossypiella, Scirphophaga incertulas, Cna-phalocrocis medinalis, Sesamia inferens, Chilo partellus, Anticarsia gemma-talis, Plathypena scabra, Pseudoplusia includens, Spodoptera exigua, Spodoptera ornithogalli, Epinotia aporema e Rachiplusia nu.

Em uma outra modalidade da invenção são fornecidas as variações inseticidas e os fragmentos das proteínas ISP3 e os ácidos nucléicos que as codificam. As variações fornecidas são, por exemplo, seqüências de ácido nucléico, que se hibridizam sob condições rigorosas à SEQ ID NQ: 1, à SEQ ID Ne: 3 ou à SEQ ID Ne: 5.

Em uma modalidade da invenção, são fornecidas proteínas inseticidas que compreendem pelo menos 91% de identidade de seqüência com a SEQ ID N°: 2, pelo menos 91% de identidade de seqüência com a SEQ ID N-: 4 ou pelo menos 88% de identidade de seqüência com a SEQ ID NQ: 6.

Em uma modalidade adicional da invenção, são fornecidas as seqüências de ácido nucléico isoladas que compreendem pelo menos 93% de identidade de seqüência com a SEQ ID NQ: 1, pelo menos 94% de identidade de seqüência com a SEQ ID Ne: 3 ou pelo menos 97% de identidade de seqüência com a SEQ ID N°: 5.

Ainda em uma modalidade adicional, são fornecidas as seqüências de ácido nucléico que codificam as proteínas ISP3 da invenção, sendo que a seqüência de ácido nucléico é uma seqüência sintética que foi otimizada para a expressão em plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas ou em células vegetais. É um outro objetivo da invenção fornecer genes quiméricos, que compreendem uma seqüência promotora ligada de forma operacional a uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma proteína ISP3, particularmente ISP3-1099E, ISP3-327D ou ISP3-2245J ou variações ativas como inseticidas ou fragmentos das mesmas. São também fornecidos os vetores que compreendem seqüências de ácido nucléico que codificam as proteínas ISP3, particularmente ISP3-1099E, ISP3-327D ou ISP3-2245J ou variações ou fragmentos ativos como inseticidas das mesmas. A invenção fornece ainda células hospedeiras que compreendem genes quiméricos, particularmente microorganismos ou células vegetais, tecidos vegetais, órgãos vegetais, sementes vegetais ou plantas inteiras transgênicas que compreendem as seqüências de nucleotídeos que codifi- cam as proteínas ISP3, particularmente ISP3-1099E, ISP3-327D ou ISP3-2245J ou fragmentos ou variações ativas como inseticidas das mesmas. Em uma modalidade a planta transformada é uma planta de milho ou de algodão. Em uma outra modalidade, a planta transformada é uma planta de arroz ou soja. Em uma modalidade adicional a planta transformada é qualquer planta, particularmente qualquer planta selecionada do grupo do sorgo, do trigo, da cevada, do centeio, do girassol, da cana-de-açúcar, do tabaco de espécies de Brassica (tais como a colza de semente oleosa, a mostarda, a couve, o brocólis etc.), espécies vegetais (tomate, couve-flor, rabanete, espinafre, pimenta, cebola, feijão, ervilha, cenoura etc.), beterraba, espécies de árvores (maçã, pêra, ameixa, coníferas, árvores decíduas etc.), batata, alfa-fa, manga, papaia, banana.

Em uma outra modalidade, são fornecidos métodos de proteção de uma planta contra os danos causados por insetos, que compreendem colocar a dita planta em contato com uma proteína ISP3 inseticida. A planta pode ser colocada em contato com uma proteína ISP3 através da transformação da planta com uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína ISP3 ou através da aplicação de uma proteína ISP3 externamente à planta.

Em uma modalidade da invenção, é fornecida uma cepa de Bt que compreende um ácido nucléico isp3, particularmente isp3-1099E, isp3-327D ou isp3-2245J.

Em uma modalidade adicional, é fornecida uma composição inseticida que compreende uma quantidade eficiente como inseticida da proteína ISP3. Quando aplicada externamente à planta, a composição inseticida aumenta a resistência aos danos causados por insetos quando comparada à das plantas de controle, às quais não é aplicada tal composição.

Em uma modalidade adicional, é fornecido um método de evolução de uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma proteína ISP3, o método compreende as etapas de: (a) fornecimento de uma população de seqüências de ácido nucléico que codificam as seqüências de aminoácidos da SEQ ID NQ: 2 e/ou 4 e/ou 6 ou variações ou fragmentos das seqüências de aminoácidos da SEQ ID N°: 2 e/ou 4 e/ou 6 ou variações ou fragmentos das seqüências de aminoácidos da SEQ ID N°: 2 e/ou 4 e/ou 6, em que as ditas variações ou fragmentos possuem uma identidade de seqüência de pelo menos 91% com a SEQ ID Ne: 2 ou 4 e pelo menos 88% com a SEQ ID NQ: 6 (b) embaralhamento da dita população de variações ou de fragmentos para formar as moléculas de ácido nucléico recombinantes (c) seleção ou separação de moléculas de ácido nucléico recombinantes, que codificam proteínas que possuem atividade inseticida (d) repetição das etapas (a) até (c) com as moléculas de ácido nucléico recombinantes selecionadas na etapa (c) até que uma molécula de ácido nucléico recombinante seja encontrada na etapa (c), em que a proteína codificada pela dita molécula de ácido nucléico possui a propriedade inseticida desejada.

Descrição Detalhada das Modalidades O campo da invenção é fornecer métodos e meios para a redução de danos causados por pragas às plantas, particularmente pragas de insetos, mais particularmente pragas de insetos lepidópteros. Foram identificadas e isoladas novas seqüências de ácido nucléico e proteínas, que são distintas das seqüências de ácido nucléico e das proteínas descritas anteriormente e que podem ser utilizadas para o controle de pragas de insetos através da integração e da expressão de pelo menos uma destas novas seqüências de nucleotídeos em plantas ou células vegetais ou através do tratamento externo de plantas ou partes vegetais com composições que compreendem as toxinas codificadas por estas moléculas de ácido nucléico. É uma modalidade da invenção fornecer novas toxinas pesticidas isoladas das cepas de Bacillus thuringiensis. Particularmente, são fornecidas as proteínas pesticidas denominadas de proteína ISP3-1099E, proteína ISP3-327D e ISP3-2245J.

De acordo com esta invenção, uma "seqüência de ácido nucléico" refere-se a uma molécula de DNA ou de RNA na forma de filamentos simples ou duplos, preferencialmente um DNA ou um RNA, particularmente um DNA, que codifica qualquer uma das proteínas ISP3 desta invenção. Uma "sequência de ácido nucléico isolada", como utilizado aqui, refere-se a uma seqüência de ácido nucléico que não está mais em seu ambiente natural onde foi isolada, por exemplo, da seqüência de ácido nucléico em um outro hospedeiro bacteriano ou em um genoma nuclear vegetal.

De acordo com esta invenção, os termos "proteína" ou "poli-peptídeo" são utilizados de forma intercambeável para se referirem a uma molécula que consiste em uma cadeia de aminoácidos, sem referência a qualquer modo de ação específico, tamanho, estruturas tridimensionais ou origem. Consequentemente, um fragmento ou uma parte de uma proteína ISP3 da invenção é ainda referido aqui como uma "proteína". Uma "proteína isolada", como utilizado aqui, refere-se a uma proteína que não está mais em seu ambiente natural. O ambiente natural da proteína refere-se ao ambiente em que a proteína poderia ser encontrada quando a seqüência de nu-cleotídeos que a codifica foi expressa e traduzida em seu ambiente natural, isto é, no ambiente do qual a seqüência de nucleotídeos foi isolada. Por exemplo, uma proteína isolada pode estar presente in vitro ou em um outro hospedeiro bacteriano ou em uma célula vegetal ou pode ser secretada partindo de um outro hospedeiro bacteriano ou de uma célula vegetal.

De acordo com esta invenção, as seqüências de ácido nucléico, particularmente as seqüências de DNA, que codificam novas proteínas ISP3 foram isoladas e caracterizadas. Os novos genes foram denominados isp3-1099E, isp3-327D e isp3-2245J e suas proteínas codificadas ISP3-1099E, ISP3-327D e ISP3-2245J, respectivamente.

De acordo com esta invenção "proteína ISP3-1099E" refere-se a qualquer proteína que compreenda o fragmento menor da seqüência de aminoácidos da SEQ ID N°: 2, que mantenha a atividade inseticida (referido posteriormente aqui como o "menor fragmento tóxico"). Isto inclui proteínas híbridas ou quiméricas que compreendem o menor fragmento tóxico. São também incluídas nesta invenção as variações da seqüência de aminoácido na SEQ ID N°: 2, tais como as seqüências de aminoácidos essencialmente similares à SEQ ID N°: 2, que possuem uma identidade de seqüência de pelo menos 91%, particularmente de pelo menos 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% no nível de seqüência de aminoácidos, que é determinada utilizando alinhamentos em pares utilizando o programa GAP do pacote Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin, EUA, versão 10.2). O programa GAP é utilizado com os parâmetros a seguir para as comparações de seqüências de aminoácidos: a matriz de classificação 'blosum62', uma 'penalidade de criação de espaços' (ou 'peso do espaço') de 8 e uma 'penalidade de extensão de espaço' (ou 'peso do comprimento') de 2. Preferencialmente, as proteínas que possuem alguns, preferencialmente 5-10, particularmente menos de 5, aminoácidos adicionados, substituídos ou deletados sem alterar significativamente, preferencialmente sem alterar a atividade inseticida da proteína ou pelo menos sem alterar a atividade inseticida da proteína de uma forma negativa, estão incluídas nesta definição.

De acordo com esta invenção, a "proteína ISP3-327D" refere-se a qualquer proteína que compreenda o menor fragmento da seqüência de aminoácidos da SEQ ID N2: 4 que mantenha a atividade inseticida (referido posteriormente aqui como o "menor fragmento tóxico"). Isto inclui proteínas híbridas ou quiméricas que compreendem o menor fragmento tóxico. São também incluídas nesta invenção as variações da seqüência de aminoácido na SEQ ID N2: 4, tais como as seqüências de aminoácidos essencialmente similares, que possuem uma identidade de seqüência de pelo menos 91 %, particularmente de pelo menos 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% no nível de seqüência de aminoácidos, que é determinada utilizando alinhamentos em pares utilizando o programa GAP do pacote Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin, EUA, versão 10.2). O programa GAP é utilizado com os parâmetros a seguir para as comparações de seqüências de aminoácidos: a matriz de classificação 'blosum62', uma 'penalidade de criação de espaços' (ou 'peso do espaço') de 8 e uma 'penalidade de extensão de espaço' (ou 'peso do comprimento') de 2. Preferencialmente, as proteínas que possuem alguns, preferencialmente 5-10, particularmente menos de 5, aminoácidos adicionados, substituídos ou deletados sem alterar significativamente, preferencialmente sem alterar a atividade inseticida da proteína ou pelo menos sem alterar a atividade inseticida da proteína de uma forma negativa, estão incluídas nesta definição.

De acordo com esta invenção, a "proteína ISP3-2245J" refere-se a qualquer proteína que compreenda o menor fragmento da seqüência de aminoácidos da SEQ ID N2: 6, que mantenha a atividade inseticida (referido posteriormente aqui como o "menor fragmento tóxico"). Isto inclui proteínas híbridas ou quiméricas que compreendem o menor fragmento tóxico. São também incluídas nesta invenção as variações da seqüência de aminoácido na SEQ ID N2: 6, tais como as seqüências de aminoácidos essencialmente similares à SEQ ID Ne: 2, que possuem uma identidade de seqüência de pelo menos 88%, particularmente de pelo menos 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% no nível de seqüência de aminoácidos, que é determinada utilizando alinhamentos em pares utilizando o programa GAP do pacote Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin, EUA, versão 10.2). O programa GAP é utilizado com os parâmetros a seguir para as comparações de seqüências de aminoácidos: a matriz de classificação 'blosum62', uma 'penalidade de criação de espaços' (ou 'peso do espaço') de 8 e uma 'penalidade de extensão de espaço' (ou 'peso do comprimento') de 2. Preferencialmente, as proteínas que possuem alguns, preferencialmente 5-10, particularmente menos de 5, aminoácidos adicionados, substituídos ou de-letados sem alterar significativamente, preferencialmente sem alterar a atividade inseticida da proteína ou pelo menos sem alterar a atividade inseticida da proteína de uma forma negativa, estão incluídas nesta definição.

Como utilizado aqui, "que compreende" deve ser interpretado como especificando a presença das características citadas, os números inteiros, as etapas ou os componentes aos quais são referidos, mas não impede a presença ou a adição de uma ou mais características, números inteiros, etapas ou componentes ou grupos dos mesmos. Assim, o termo "DNA/proteína que compreende a seqüência ou a região X", como utilizado aqui, refere-se a um DNA ou uma proteína que inclui ou contém pelo menos a seqüência ou a região X, de forma que outras seqüências de nucleotídeos ou de aminoácidos possam ser incluídos na extremidade 5' (N-terminal) e/ou 3' (C-terminal), por exemplo, (a sequência de nucleotídeos de) uma proteína marcadora que pode ser selecionada como é divulgado na EP 0 193 259, (a seqüência de nucleotídeos de) um peptídeo de trânsito e/ou uma seqüência lidera 5' ou a 3'. O "menor fragmento tóxico" de uma proteína ISP3 da invenção, como utilizado aqui, é o menor fragmento ou parte de uma proteína ISP3 que retenha a atividade inseticida que pode ser obtida através da digestão enzimática da proteína ISP3 de comprimento completo ou o menor fragmento ou parte de uma proteína ISP3 que retenha a atividade inseticida que pode ser obtida fazendo deleções de nucleotídeos no DNA que codifica uma proteína ISP3. É entendido, que o DNA que codifica fragmentos de ISP3 tóxicos mais curtos também pode ser sintetizado quimicamente e o fragmento tóxico menor que pode ser obtido da transcrição e da tradução do DNA sintético é incluído na definição de menor fragmento tóxico.

Em uma modalidade da invenção, o menor fragmento tóxico de uma proteína ISP3 possui um peso molecular de aproximadamente 65 kDa que é determinado através da análise de SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sódio). Em uma outra modalidade, o menor fragmento tóxico de uma proteína ISP3 possui um peso molecular de aproximadamente 23 kDa. Em uma outra modalidade, o menor fragmento tóxico de uma proteína ISP3 possui um peso molecular de aproximadamente 33 kDa. Em uma modalidade adicional, o menor fragmento tóxico compreende os aminoácidos centrais da proteína ISP3, em particular do aminoácido 200 até o aminoácido 455 da SEQ ID Ne: 2, da SEQ ID NQ: 4 ou da SEQ ID Na: 6. A digestão enzimática das proteínas ISP3 pode ser realizada utilizando enzimas purificadas ou utilizando fluidos do suco gástrico de larvas de insetos e incubando os extratos do suco gástrico com soluções que compreendem uma das proteínas ISP3, como é descrito em Yu e outros (1997). Os produtos proteolíticos podem ser separados e visualizados em SDS-PAGE. Os ensaios biológicos podem ser realizados com fragmentos protéicos fracionados por cromatografia processados com a finalidade de determinar a relação entre cada fragmento proteolítico e a sua atividade inseticida. O suco gástrico preferido utilizado para determinar o menor fragmento tóxico de proteínas ISP3 é o suco gástrico de insetos Lepidópteros, preferencialmente do Verme da Espiga de Milho (Helicoverpa zea), da Lagarta do Algodão (Helicoverpa armigera), do Verme do Broto Nativo (Helicoverpa punctigera), do Verme do Broto do Tabaco (Heliothis virescens), da Broca do Milho Europeu (Ostrinia nubilalis), da Lagarta de Cereais do Outono (Spodoptera frugiperda), da Lagarta Negra que destrói plantas novas (Agrotis ipsilon), da Lagarta Cor-de-Rosa do Algodoeiro (Pectinophora gos-sypiella), da Broca Amarela do Caule (Scirphophaga incertulas), do Dobra-dor de Folhas (Cnaphalocrocis medinalis), da Broca Cor-de-Rosa do Caule (Sesamia inferens), da Broca em Manchas do Caule do Milho (Chilo parte-llus), da Lagarta Aveludada (Anticarsia gemmatalis), do Mede-Palmos da Soja (Pseudoplusia includens), da Broca da Vagem (Epinotia aporemá), Ra-chiplusia nu.

As extremidades das seqüências de aminoácidos N- e C-terminais do menor fragmento tóxico são convenientemente determinadas através da determinação da seqüência de aminoácidos dos fragmentos anteriores através de técnicas rotineiramente disponíveis na técnica.

Como utilizado aqui, os termos "isp3-1099E\ "isp3-327D" e "isp3-2245J' referem-se a qualquer seqüência de DNA que codifica a "proteína ISP3-1099E" ou a "proteína ISP3-327D" ou a "proteína ISP3-2245J", respectivamente, como é definido anteriormente. Isto inclui as seqüências de DNA que ocorrem naturalmente, artificiais ou sintéticas que codificam as proteínas da SEQ ID NQ: 2 ou da SEQ ID N°: 4 ou da SEQ ID NQ: 6 ou seus fragmentos ou variações inseticidas como definido anteriormente. São também incluídas aqui as seqüências de DNA, que codificam proteínas inseticidas, que são similares o suficiente às seqüências de DNA fornecidas na listagem de seqüência de forma que possam se (isto é, ter a capacidade de) hibridizar com estas seqüências de DNA sob condições de hibridização rigorosas. "Condições de hibridização rigorosas", como utilizado aqui, refe- re-se particularmente às condições a seguir: imobiiização do DNA relevante em um filtro e pré-hibridização dos filtros durante 1 até 2 horas em 50% de formamida, SSPE 5 x, reagente de Denhardt 2 x e SDS 0,1% a 42°C ou 1 ou 2 horas em SSC 6 x, reagente de Denhardt 2 x e SDS 0,1 % a 68°C. A sonda marcada (Digoxigenina ou radioativa) desnaturada é então adicionada diretamente ao fluido de pré-hibridização e a incubação é realizada durante 16 até 24 horas na temperatura apropriada mencionada anteriormente. Após a incubação, os filtros são então lavados durante 30 minutos à temperatura ambiente em SSC 2 x, SDS 0,1%, seguidos por 2 lavagens de 30 minutos cada a 68°C em SSC 0,5 x e SDS 1%. Uma auto-radiografia é estabelecida através da exposição dos filtros durante 24 até 48 horas a um filme de raio-X (Kodak XAR-2 ou equivalente) a -70°C com uma tela intensificadora. [SSC 20 x = NaCI 3 M e citrato de sódio 0,3 M; reagente de Denhart 100 x = 2% (p/v) de albumina de soro bovino, 2% (p/v) Ficoll™ e 2% (p/v) de polivinilpir-rolidona; SDS = dodecil sulfato de sódio; SSPE 20 x = NaCI 3,6 M, fosfato de sódio 0,2 M e EDTA 0,02M pH 7,7], Evidentemente, condições e parâmetros equivalentes podem ser utilizados neste processo enquanto mantêm ainda as condições de hibridização rigorosas. É evidente que há muitas abordagens conhecidas na técnica para o isolamento de variações das seqüências de DNA da invenção. As variações podem, por exemplo, ser isoladas partindo de cepas de Bt através da hibridização descrita supra e/ou através da tecnologia da PCR que é conhecida na técnica. Os iniciadores específicos ou degenerados podem ser produzidos para regiões das seqüências de DNA do isp3 e utilizados para amplificar variações de cepas conhecidas ou novas de Bt.

As variações preferidas do DNA de isp3-1099E desta invenção são seqüências de DNA que codificam as variações de proteínas ISP-1099E inseticidas descritas anteriormente ou uma seqüência de DNA, que codifica uma proteína inseticida, com pelo menos 93%, particularmente pelo menos 94%, mais preferencialmente 95%, 96% ou 97%, mais preferencialmente pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de seqüência com a SEQ ID Ns: 1. As variações preferidas do DNA de isp3-327D desta invenção são as seqüências de DNA que codificam as variações de proteínas ISP3-327D descritas anteriormente ou uma seqüência de DNA, que codifica uma proteína inseticida, com pelo menos 94%, preferencialmente pelo menos 95%, particularmente pelo menos 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99% de identidade de seqüência com a SEQ ID N°: 3. As variações preferidas do DNA de isp3-2245J desta invenção são seqüências de DNA que codificam as variações da proteína ISP3-2245J descritas anteriormente ou uma seqüência de DNA, que codifica uma proteína inseticida, com pelo menos 97%, preferencialmente pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de seqüência com a SEQ ID NQ: 5. As identidades de seqüência referidas às anteriores são calculadas utilizando o programa GAP do pacote Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin, EUA) Versão 10.2. O programa de GAP é utilizado com os parâmetros a seguir para os ácidos nucléicos: a matriz de classificação 'nwsgapdna', uma 'penalidade de criação de espaço’ (ou 'peso do espaço') de 50 e uma 'penalidade de extensão de espaço' (ou 'peso do comprimento’) de 3. As condições de hibridização rigorosa são como definido anteriormente. "Atividade inseticida" de uma proteína, como utilizado aqui, significa a capacidade de uma proteína de matar insetos quando tal proteína é alimentada aos insetos, preferencialmente através da expressão em um hospedeiro recombinante tal como uma planta. É entendido que uma proteína possui atividade inseticida se esta possuir a capacidade de matar o inseto durante pelo menos um de seus estágios de desenvolvimento, preferencialmente o estágio larvar. "Quantidades de controle de insetos" de uma proteína, como utilizado aqui, refere-se a uma quantidade de proteína que é suficiente para limitar os danos em uma planta, causados por insetos (por exemplo, larvas de insetos) que se alimentam de tal planta, em níveis comercialmente aceitáveis, por exemplo, matando os insetos ou inibindo o desenvolvimento, a fertilidade ou o crescimento do inseto de uma maneira que forneçam menos danos a uma planta e o rendimento da planta não é significativamente afetado de forma adversa.

De acordo com esta invenção, os insetos susceptíveis às novas proteínas ISP3 da invenção são colocados em contato com esta proteína em quantidades que controlam os insetos, preferencialmente, em quantidades inseticidas. Os insetos alvos preferidos para as proteínas desta invenção são pragas de insetos que danificam economicamente as plantas de milho, algodão, arroz ou soja, particularmente nos países da Américas do Norte e do Sul, da Ásia e da Austrália. O termo planta, como utilizado aqui, abrange plantas inteiras assim como partes de plantas, tais como folhas, caules, sementes, flores ou raízes. Os insetos alvo particularmente preferidos para as proteínas ISP3 desta invenção são pragas de insetos lepidópteros, tais como Heliothis spp., Helicoverpa spp., Spodoptera spp., Ostrinia spp., Pectinopho-ra spp., Agrotis spp., Scirphophaga spp., Cnaphalocrocis spp., Sesamia spp., Chilo spp., Anticarsia spp., Pseudoplusia spp., Epinotia spp. e Rachi-plusia spp., preferencialmente Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Helicoverpa armigera, Helicoverpa punctera, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugi-perda, Agrotis ipsilon, Pectinophora gossypiella, Scirphophaga incertulas, Cnaphalocrocis medinalis, Sesamia inferens, Chilo partellus, Anticarsia gemmatalis, Pseudoplusia includens, Epinotia aporema e Rachiplusia nu. As proteínas ISP3 da invenção possuem particularmente atividade inseticida contra pelo menos uma espécie de insetos lepidópteros, mais preferencialmente contra várias espécies de insetos Lepidópteros.

Os termos "proteína ISP3", "proteína ISP3 desta invenção", "proteína ISP" ou "proteína ISP desta invenção", como utilizados aqui, referem-se a qualquer uma das novas proteínas isoladas de acordo com esta invenção e identificadas e definidas aqui como as proteínas ISP3-1099E, ISP3-327D e ISP3-2245J.

Uma proteína ISP3, como utilizado aqui, pode ser uma proteína no tamanho de comprimento completo ou pode estar em uma forma truncada contanto que a atividade inseticida seja mantida ou pode ser uma combinação de proteínas ou domínios de proteínas diferentes em uma proteína híbrida ou de fusão. Uma "toxina de ISP3" refere-se a um fragmento ou a uma parte inseticida de uma proteína ISP3, particularmente ao menor frag- mento tóxico da mesma. Um "gene isp", "gene isp3", "DNA de isp" ou ”DNA de isp3", como utilizado aqui, é uma sequência de DNA que codifica uma proteína ISP3 de acordo com esta invenção, se referindo particularmente a qualquer uma das seqüências de DNA do isp3-1099E, do isp3-327D ou do isp3-2245J definidas aqui. A seqüência de ácido nucléico, particularmente a seqüência de DNA, que codifica as proteínas ISP3 desta invenção pode ser produzida de forma sintética e pode ser inserida em vetores de expressão para produzir altas quantidades de proteínas ISP3. As proteínas ISP3 podem ser utilizadas para preparar anticorpos monoclonais ou policlonais específicos de uma maneira convencional (Hofte e outros, 1988; Harlow e Lane, 1988).

Em uma modalidade da invenção, são fornecidos anticorpos que se ligam especificamente à proteína ISP3. Em particular, são fornecidos anticorpos monoclonais ou policlonais que se ligam à ISP3-1099E, à ISP3-327D ou à ISP3-2245J ou a fragmentos ou variações das mesmas. Estão incluídos os fragmentos de anticorpos monoclonais ou policlonais, que mantêm a capacidade de se ligarem à proteína ISP3 ou a um fragmento contra o qual foram produzidos. Um anticorpo para uma proteína ISP3 pode ser preparado através da utilização da proteína ISP3 como um antígeno em um animal (tal como um coelho ou um camundongo), utilizando métodos conhecidos na técnica, tais como os descritos em Harlow e Lane "Using An-tibodies: A Laboratory Manual" (Nova York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998), em Liddell e Cryer "A Praticai Guide to Monoclonal Antibodies" (Wiley and Sons, 1991). Os anticorpos podem ser utilizados para isolar, identificar, caracterizar ou purificar a proteína ISP3 à qual se ligam. Por exemplo, o anticorpo pode ser utilizado para detectar a proteína ISP3 em uma amostra, permitido que o anticorpo e a proteína formem um complexo imunológico e detectando a presença do complexo imunológico, por exemplo, através de ELISA ou de imunoblots.

Em adição, são fornecidos kits imunológicos, úteis para a detecção de proteínas ISP3, fragmentos ou epitopos de proteínas em uma amostra. As amostras podem ser células, sobrenadantes de células, suspensões de células e similares. Tal kit compreende um anticorpo que se liga à proteína ISP3 (ou a um fragmento da mesma) e um ou mais reagentes para detecção imunológica.

Os anticorpos também podem ser utilizados para isolar proteínas inseticidas com atividade similar, por exemplo, através de ELISA (ensaio imunológico ligado à enzima) ou "Western blotting". As linhagens de anticorpos monoclonais com especificidade de ligação desejada podem ser também utilizadas para clonar o DNA para o anticorpo monoclonal particular.

Em uma modalidade adicional da invenção, são fornecidos inici-adores da PCR e/ou sondas e kits para a detecção das seqüências de DNA do isp3-1099E, do isp3-327D ou do isp3-2245J. Os pares de iniciadores para a PCR para amplificar o DNA de isp3 partindo de amostras podem ser sintetizados com base na SEQ ID Ne: 1, na SEQ ID N°: 3 ou na SEQ ID NQ: 5, como é conhecido na técnica (ver Dieffenbach e Dveksler (1995) PCR Prí-mer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press e McPher-son e outros (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, Primeira Edição, Springer Verlag, Alemanha). Similarmente, os fragmentos de DNA da SEQ ID Ne: 1, da SEQ ID Ne: 3 ou da SEQ ID NQ: 5 podem ser utilizados como sondas de hibridização. Um kit de detecção de isp3 pode compreender iniciadores específicos para isp3 ou sondas específicas para isp3 e um protocolo associado para utilizar os iniciadores ou as sondas para detectar o DNA de isp3 em uma amostra. Tal kit de detecção pode, por exemplo, ser utilizado para determinar, se uma planta foi transformada com um gene isp3 (ou parte do mesmo) da invenção.

Devido à degeneração do código genético, alguns códons de aminoácidos podem ser substituídos por outros sem alterar a sequência de aminoácidos da proteína. Além disso, alguns aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos equivalentes sem alterar significativamente, preferencialmente sem alterar, a atividade inseticida da proteína, pelo menos sem alterar a atividade inseticida da proteína de uma forma negativa. Por exemplo, as substituições conservativas de aminoácidos dentro das categorias básicas (por exemplo, Arg, His, Lys), ácida (por exemplo, Asp, Glu), não polar (por exemplo, Ala, Vai, Trp, Leu, lie, Pro, Met, Phe, Trp) ou polar (por exemplo, Gly, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn, Gin) estão dentro do âmbito da invenção contanto que a atividade inseticida da proteína ISP3 não seja significativamente, preferencialmente não, alterada, pelo menos não alterada de uma maneira negativa. Em adição, as substituições de aminoácidos não conser-vativas estão dentro do âmbito da invenção contanto que a atividade inseticida da proteína ISP3 não seja alterada significatívamente, preferencialmente não ou pelo menos não alterada de uma maneira negativa. As variações ou os equivalentes das seqüências de DNA da invenção incluem se-qüências de DNA que se hibridizam com as seqüências de DNA de isp3 da SEQ ID Ns: 1 ou da SEQ ID NQ: 3 ou da SEQ ID NQ: 5 sob condições de hi-bridização rigorosas e que codificam uma proteína com as mesmas características inseticidas que às da proteína desta invenção ou seqüências de DNA que possuem um uso de códons diferente comparado com o dos genes isp3 nativos desta invenção, mas que codificam uma proteína com a mesma atividade inseticida e com substancialmente a mesma, preferencialmente a mesma, seqüência de aminoácidos. As seqüências de DNA de isp3 podem ter os códons otimizados através da adaptação do uso de códons aos mais preferidos nos genes vegetais, particularmente aos genes nativos do gênero ou da espécie vegetal de interesse (Bennetzen & Hall, 1982; Itakura e outros, 1977) utilizando tabelas de uso de códons disponíveis (por exemplo, mais adaptadas para a expressão no algodão, na soja, no milho ou no arroz). As tabelas de uso de códons para várias espécies de plantas são publicadas, por exemplo, por Ikemura (1993) e Nakamura e outros (2000).

Ainda, filamentos longos de nucleotídeos AT ou GC podem ser removidos e sítios de restrição adequados podem ser introduzidos.

Ainda, o terminal N de uma proteína ISP3 pode ser modificado para possuir um contexto ótimo de início da tradução, adicionando ou dele-tando da mesma um ou mais aminoácidos na extremidade N-terminal da proteína. Na maior parte dos casos, é preferido que as proteínas da invenção sejam expressas em células vegetais iniciando com um dipeptídeo Met-Asp ou Met-Ala para o início ótimo da tradução, requerendo a inserção no DNA de isp3 de um códon que codifica um aminoácido Asp ou Ala a jusante do códon de início como um novo segundo códon. Alternativamente, o quarto nucleotídeo da SEQ ID Ns: 1, da SEQ ID NQ: 3 ou da SEQ ID N°: 5 pode ser substituído por um 'G', de forma que o segundo aminoácido (seguido da Met) seja Asp. Similarmente, o segundo códon (AAC ou AAT, que codifica Asn) pode ser substituído por um códon para Asp (GAT ou GAC) ou Ala (GCT, GCC, GCA ou GCG) ou por qualquer outro códon que comece com um ’G'.

As seqüências de DNA podem ser também modificadas para remover sítios de processamento ilegítimos. Como os genes bacterianos podem conter motivos, que são reconhecidos em outros hospedeiros, especialmente em hospedeiros eucarióticos tais como plantas, como sítios de processamento a 5' ou a 3', a transcrição nestes outros hospedeiros pode ser prematuramente terminada, resultando em um mRNA truncado. Os sítios de processamento ilegítimos podem ser identificados através da análise com base em computador das seqüências de DNA e/ou através da análise da PCR que é conhecida na técnica.

Evidentemente, pode ser construída qualquer seqüência de DNA que difira em sua utilização de códons, mas que codifica a mesma proteína ou uma proteína similar com substancialmente a mesma atividade inseticida, dependendo da finalidade particular. Foi descrito nos sistemas de expressão procarióticos e eucarióticos que a alteração da utilização de códons em relação àquela da célula hospedeira é desejada em hospedeiros estranhos (Bennetzen & Hall, 1982; Itakura e outros, 1977). As tabelas de utilização de códons estão disponíveis na literatura (Wada e outros, 1990; Murray e outros, 1989) e nos bancos de dados de seqüências de DNA principais (por exemplo, EMBL em Heidelberg, Alemanha) e são como descrito por Naka-mura e outros (2000). Conseqüentemente, as seqüências de DNA sintéticas podem ser construídas de forma que as mesmas ou substancialmente as mesmas proteínas seja produzidas. É evidente que várias seqüências de DNA podem ser produzidas uma vez que a seqüência de aminoácidos das proteínas ISP3 desta invenção é conhecida. Tais outras seqüências de DNA incluem as seqüências de DNA sintéticas ou semi-sintéticas que foram alteradas com a finalidade de inativar certos sítios no gene, por exemplo, inati-vando seletivamente certos elementos reguladores ou de processamento crípticos presentes na seqüência nativa como descrito nas publicações PCT WO 91/16432 e WO 93/09218 ou adaptando o uso geral de códons com o de um organismo mais relacionado, preferencialmente o de um organismo hospedeiro em que é desejada a expressão. Várias técnicas para a modificação do uso de códons para os preferidos pelas células hospedeiras podem ser encontradas em patentes e na literatura científica. O método exato de modificação do uso de códons não é crítico para esta invenção contanto que a maior parte ou todos as seqüências reguladoras ou os elementos de processamento crípticos tenham sido substituídos por outras seqüências.

Pequenas modificações em uma seqüência de DNA tais como as descritas anteriormente podem ser feitas rotineiramente, isto é, através de mutagênese mediada pela PCR (Ho e outros, 1989, White e outros, 1989). As modificações mais profundas em uma seqüência de DNA podem ser rotineiramente executadas através da síntese de novo do DNA de uma região codificadora desejada utilizando técnicas disponíveis.

Com o termo "substancialmente a mesma", quando refere-se à seqüência de aminoácidos de uma proteína ISP3, entende-se que inclua uma seqüência de aminoácidos que difere não mais que 5%, preferencialmente não mais que 2%, da seqüência de aminoácidos da proteína comparada; e quando refere-se à toxicidade de uma proteína ISP3, entende-se que inclua, uma proteína cujo valor médio de LC50 (que é a concentração da proteína que causa 50% de mortalidade da população de teste), calculado partindo de três ensaios biológicos independentes, realizados utilizando as mesmas condições de ensaio biológico, difere em não mais que um fator de 2 do valor médio de LC50 obtido para a proteína comparada (também calculado partindo de três ensaios biológicos independentes, realizados utilizando as mesmas condições de ensaio biológico como para a proteína que é comparada). Os valores de LC50 são calculados com a análise de Probit, utilizando 0 programa POLO PC (da LeOra Software, 1987, Berkely, Califórnia).

Entende-se que 95% (ou 90%) dos limites de confidência (um parâmetro associado calculado com a análise de Probit) são calculados para os valores de LC50 de cada uma das duas proteínas que serão comparadas a fim de determinar se existe uma diferença estatisticamente significativa nos valores de LC50. Em geral, é observado que a toxicidade de duas proteínas é substancialmente a mesma, se os limites de confidência se sobrepuserem e substancialmente diferente se os limites de confidência não se sobrepuserem. O termo "domínio" de uma toxina ISP3 (ou proteína ISP3) como utilizado aqui significa qualquer (quaisquer) parte(s) ou domínio(s) da toxina (ou proteína ISP3) com uma estrutura ou função específica que pode(m) ser transferido(s) para uma outra proteína para fornecer uma nova proteína híbrida com pelo menos uma característica funcional (por exemplo, as características de ligação e/ou de toxicidade) da toxina ISP3 (ou proteína ISP3) da invenção (Ge e outros, 1991). Tais partes podem formar uma característica essencial da proteína híbrida com as características de ligação e/ou de toxicidade das proteínas ISP3 desta invenção. Tal proteína híbrida pode ter uma faixa de hospedeiros maior, uma maior toxicidade e/ou pode ser utilizada em uma estratégia para prevenir o desenvolvimento de resistência de insetos (EP 408 403; Visser e outros, 1993). As seqüências de DNA que codificam os domínios são abrangidas por esta definição. Uma proteína híbrida ou uma proteína de fusão é utilizada aqui para significar uma proteína compreendida de domínios protéicos diferentes, formando uma proteína quimérica funcional com as características dos domínios individuais. Um outro domínio que uma proteína híbrida ou quimérica pode, por exemplo, compreender é um domínio de estabilização. Foi descrito, por exemplo, que os domínios de estabilização estão presentes no terminal C de proteína(s) VIP3(a) e acredita-se que forneçam estabilidade à proteína tóxica no ambiente intestinal de insetos susceptíveis.

Em adição à criação de proteínas híbridas, a função dos domínios específicos também pode ser analisada através da introdução de dele-ções de todos ou parte do(s) domínio(s) ou da introdução de mutações no domínio e das análises do efeito resultante sobre a toxicidade para os insetos, a estabilidade da proteína, a sensibilidade à proteólise da enzima, as alterações de temperaturas, a ligação a DNA/proteínas/células específicas etc. É uma modalidade da invenção fornecer um método de "evolução" de uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma proteína ISP3, particularmente ISP3-1099E ou ISP3-327D ou ISP3-2245J, em uma nova seqüência de ácido nucléico, que codifica uma proteína que possui atividade inseticida. A seqüência de ácido nucléico evoluída possui preferencialmente maior atividade inseticida comparada com a da seqüência não-evoluída. O termo "evolução" como utilizado aqui refere-se a um método de maior evolução da seqüência através da recombinante das seqüências, como descrito na Patente U.S. N2 5.811.238, WO 97/20078 e Patente U.S. N° 6.180.406, incorporados aqui como referência. O "embaralhamento" de ácido nucléico é utilizado aqui para indicar a recombinação in vitro ou in vivo entre seqüências de ácido nucléico de uma população ou grupo de ácidos nucléicos e pode ser realizada como é conhecido na técnica e como descrito na Patente U.S. N2 5.811.238, no WO 97/20078, na Patente U.S. N2 6.180.406, na Patente U.S. N2 6.117.679, todos incorporados aqui como referência. O método de evolução de uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma proteína ISP3 compreende as etapas a seguir: (a) fornecimento de uma população de seqüências de ácido nucléico que codificam as seqüências de aminoácidos da SEQ ID N2: 2 e/ou 4 e/ou 6 ou variações ou fragmentos das seqüências de aminoácidos da SEQ ID N2: 2 e/ou 4 e/ou 6, em que as ditas variações ou fragmentos possuem uma identidade de seqüência de pelo menos 91% com a SEQ ID N2: 2 ou 4 e pelo menos 88% com a SEQ ID N2: 6. (b) embaralhamento da dita população de variações ou fragmentos para formar moléculas recombinantes de ácido nucléico (c) seleção ou varredora de moléculas recombinantes de ácido nucléico, que codificam proteínas que possuem atividade inseticida; repetição das etapas (a) até (c) com as moléculas recombinantes de ácido nucléico selecionadas na etapa (c) até que seja encontrada uma molécula recombinante de ácido nucléico na etapa (c), em que a proteína codificada pela dita molécula de ácido nucléico possui a propriedade inseticida desejada.

Um ácido nucléico não-evoluído é um ácido nucléico fornecido como o material de partida na etapa (a), enquanto que um ácido nucléico evoluído correspondente que é utilizado aqui refere-se a um ácido nucléico recombinante obtido na etapa (d) quando realizado o método utilizando o ácido nucléico não-evoluído na etapa (a). Os ácidos nucléicos preferidos utilizados na etapa (a) são seqüências de ácido nucléico que codificam as sequências de aminoácidos da ISP3-1099E (SEQ ID N-. 2) e/ou da ISP3-327D (SEQ ID Ne: 4) e/ou da ISP3-2245J (SEQ ID N°: 6) ou variações ou fragmentos dos mesmos. A população de moléculas de ácidos nucléicos e/ou variações e/ou fragmentos de moléculas de ácidos nucléicos na etapa (a) podem compreender o DNA que codifica uma única proteína ISP3 e/ou variações e/ou fragmentos do ácido nucléico que codifica uma única proteína ISP3 da invenção ou uma mistura de ácidos nucléicos que codificam proteínas ISP3 diferentes da invenção e/ou fragmentos e/ou variações dos mesmos. As seqüências de ácido nucléico que codificam variações da seqüência de aminoácidos SEQ ID Ne: 2 são seqüências de ácido nucléico que codificam seqüências de aminoácidos que possuem pelo menos 91 %, preferencialmente pelo menos 92%, mais preferencialmente pelo menos 93%, 94%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência no nível de aminoácidos com a SEQ ID Ne: 2. As seqüências de ácido nucléico que codificam variações da seqüência de aminoácidos SEQ ID N°: 4 são seqüências de ácido nucléico que codificam seqüências de aminoácidos que possuem pelo menos 91%, preferencialmente pelo menos 92 ou 93%, mais preferencialmente pelo menos 94%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência no nível de aminoácidos com a SEQ ID NQ: 4. As seqüências de ácido nucléico que codificam variações da seqüência de aminoácidos SEQ ID N°: 6 são seqüências de ácido nucléico que codificam seqüências de aminoácidos que possuem pelo menos 88%, preferencialmente pelo menos 89 ou 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, 92%, 93%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência no nível de aminoácidos com a SEQ ID Ne: 6.

Uma seqüência de ácido nucléico evoluída obtida na etapa (d) codifica preferencialmente uma proteína com maior atividade inseticida, isto é, a proteína possui, por exemplo, maior toxicidade que a proteína codificada pelas seqüências não-evoluídas utilizadas na etapa (a) como material de partida ou possui atividade contra um espectro diferente de insetos alvo que as seqüências não-evoluídas ou se liga a um sítio de ligação alvo diferente em um inseto alvo. A seleção ou a varredura da toxicidade maior desejada e/ou espectro de toxicidade diferente (etapa (c)) pode ser feita realizando ensaios biológicos com insetos, comparando a atividade inseticida das proteínas codificadas pelas seqüências de ácido nucléico evoluídas e não-evoluídas. Outros ensaios funcionais alternativos ou adicionais podem ser realizados, dependendo da propriedade inseticida desejada. Por exemplo, se a maior ligação for uma propriedade desejada, pode ser realizado um ensaio de ligação antes de realizar um ensaio biológico com o inseto.

As seqüências de DNA do isp3 da invenção, preparadas partindo do DNA total, podem ser ligadas em vetores de expressão adequados e transformadas em uma cepa bacteriana, tal como E. coli ou uma cepa de Bt e os clones podem ser então selecionados através de métodos convencionais de sondas imunológicas em colônias (French e outros, 1986) para a expressão da toxina com anticorpos monoclonais ou policlonais produzidos contra as proteínas ISP3.

Os clones de Bt ou de E. coli podem ser então selecionados em relação à produção de proteínas ISP3 (o sobrenadante de cultura isento de células ou o lisado de células podem ser corridos em géis de SDS-PAGE utilizando métodos padronizados e procedimentos de western-blotting padronizados podem ser realizados) ou as bactérias podem ser testadas em relação à sua atividade inseticida comparada com a das bactérias de controle. Os clones podem ser também analisados em relação à presença de mRNA que codifica uma proteína ISP3 utilizando procedimentos de PCR padronizados, tal como a RT-PCR.

Os genes que codificam as proteínas ISP3 desta invenção podem ser seqüenciados de uma maneira convencional (Maxam e Gilbert, 1980; Sanger, 1977) para a obtenção da seqüência de DNA. As comparações de seqüência indicaram que os genes são diferentes dos genes descritos anteriormente que codificam toxinas com atividade contra Lepidópte-ras.

Uma parte eficiente como inseticida das seqüências de DNA, que codificam uma parte eficiente como inseticida das proteínas ISP3 re-cém-identificadas, pode ser produzida de uma maneira convencional após a análise de seqüência do gene. A seqüência de aminoácidos das proteínas ISP3 pode ser determinada partindo da seqüência de DNA das seqüências de DNA isoladas. Por "uma parte eficiente como inseticida (ou porção ou fragmento)" das seqüências de DNA que codificam a proteína ISP3, também referida aqui como "gene truncado" ou "DNA truncado", entende-se uma seqüência de DNA que codifica um polipeptídeo que possui menos aminoácidos que a forma da proteína ISP3 de comprimento completo, mas que é inseticida.

Para expressar toda ou uma parte eficiente como inseticida da seqüência de DNA que codifica uma proteína ISP3 desta invenção em E. coli, em outras cepas de Bt e em plantas, podem ser introduzidos sítios de restrição adequados, flanqueando a seqüência de DNA. Isto pode ser feito através da mutação direcionada ao sítio, utilizando procedimentos bem conhecidos (Stanssens e outros, 1989; White e outros, 1989). Para obter uma melhor expressão em plantas, o uso de códons do gene isp3 ou de uma parte do gene isp3 eficiente como inseticida desta invenção pode ser modificado para formar um gene ou parte de um gene equivalente, modificado ou artificial de acordo com as publicações PCT WO 91/16432 e WO 93/09218 e publicações EP 0 385 962, EP 0 359 472 e Patente U.S. NQ 5.689.052 ou os genes ou partes de genes isp3 podem ser inseridas no genoma de plastí-deos, mitocôndrias ou cloroplastos e expressas ali utilizando um promotor adequado (por exemplo, Mc Bride e outros, 1995; Patente U.S. Ne 5.693.507).

Para obter uma maior expressão em plantas monocotiledôneas tal como o milho ou o arroz, um íntron, preferencialmente um íntron de mo-nocotiledônea, também pode ser adicionado ao gene quimérico. Por exemplo, foi mostrado que a inserção do íntron do gene Adh1 do milho na região reguladora a 5' aumenta a expressão no milho (Callis e outros, 1987). Similarmente, o íntron HSP70, que é descrito na Patente U.S. N° 5.859.347, pode ser utilizado para aumentar a expressão. A seqüência de DNA do gene isp3 ou de sua parte inseticida pode ser adicionalmente alterada de uma maneira neutra em relação à tradução, para modificar seqüências de DNA inibidoras possíveis presentes na parte do gene através da inserção de íntron direcionada ao sítio e/ou através da introdução de alterações no uso dos códons, por exemplo, adaptando o uso dos códons aos mais preferidos pelas plantas, preferencialmente o gênero de planta relevante específico (Mur-ray e outros, 1989), sem alterar significativamente, preferencialmente sem alterar, a seqüência de aminoácido codificada.

De acordo com uma modalidade desta invenção, é preferido que as proteínas sejam direcionadas para organelas intracelulares tais como plastídeos, preferencialmente cloroplastos, mitocôndrias ou sejam secreta-das da célula, otimizando potencialmente a estabilidade e/ou a expressão das proteínas. Para esta finalidade, em uma modalidade desta invenção, os genes quiméricos da invenção compreendem uma região codificadora que codifica um peptídeo sinal ou alvo, ligada à região codificadora da proteína ISP3 da invenção. Os peptídeos particularmente preferidos que devem ser incluídos nas proteínas desta invenção, são os peptídeos de trânsito para o cloroplasto ou outras regiões peptídicas de trânsito especialmente duplicadas de direcionamento para os plastídeos dos genes selecionados cujo produto gênico é direcionado para os plastídeos, o peptídeo de trânsito otimizado de Capellades e outros (Patente U.S. N- 5.635.618), o peptídeo de trânsito descrito em Wong e outros (1992) e os peptídeos de direcionamento no pedido de patente PCT publicado WO 00/26371. São também preferidos os peptídeos que sinalizam a secreção de uma proteína ligada a tal peptídeo fora da célula, tais como o sinal de secreção do inibidor II da proteinase da batata (Keil e outros, 1986), o sinal de secreção do gene 3 da alfa amilase do arroz (Sutliff e outros, 1991) e o sinal de secreção da proteína PR1 do tabaco (Cornelissen e outros, 1986).

Os peptídeos de sinal particularmente úteis de acordo com a invenção incluem o peptídeo de trânsito para os cloroplastos (por exemplo, Van Den Broeck e outros, 1985) ou o peptídeo otimizado de trânsito para os cloroplastos da Patente U.S. N° 5.510.471 e da Patente U.S. NQ 5.635.618 que possibilita o transporta da proteína para os cloroplastos, um peptídeo de sinal de secreção ou um peptídeo que direciona a proteína a outros plastí-deos, para as mitocôndrias, para o RE ou para uma outra organela. As se-qüências de sinal para o direcionamento para organelas intracelulares ou para a secreção para fora da célula vegetal ou para a parede celular são encontradas em proteínas naturalmente direcionadas ou secretadas, preferencialmente as descritas por Klõsgen e outros (1989), Klõsgen e Weil (1991), Neuhaus & Rogers (1998), Bih e outros (1999), Morris e outros (1999), Hesse e outros (1989), Tavladoraki e outros (1998), Terashima e outros (1999), Park e outros (1997), Shcherban e outros (1995), dos quais todos são incorporados aqui como referência, particularmente as sequências peptídicas de sinal de proteínas direcionadas ou secretadas do milho, do algodão, da soja ou do arroz.

Para permitir a secreção das proteínas ISP3 para fora da célula hospedeira transformada, um peptídeo de sinal de secreção apropriado pode ser fundido com a extremidade amino terminal (extremidade N-terminal) da proteína ISP3. Ainda, qualquer peptídeo putativo de sinal de secreção de Bacillus nativo pode ser deletado ou pode ser substituído por um peptídeo de sinal apropriado, tal como um peptídeo de sinal de secreção eucariótico que é descrito anteriormente. Particularmente, os aminoácidos 1 até 54 das proteínas ISP3 da invenção compreendem um peptídeo de sinal putativo de Bacillus. Os aminoácidos 1 até 10, preferencialmente 1 até 50, mais preferencialmente 1 até 54 podem ser removidos das proteínas ISP3 ou podem ser substituídos por um peptídeo de sinal apropriado, particularmente um peptídeo de sinal eucariótico que é descrito anteriormente. Os peptídeos sinais putativos podem ser detectados utilizando uma análise com base em computador, utilizando programas tal como o programa de busca de Peptídeos de Sinal (SignalP V1.1 ou 2.0), utilizando uma matriz para bactérias gram-positivas procarióticas e um escore limiar menor que 0,5, especialmente um escore limiar de 0,25 ou menor (Von Heijne, Gunnar, 1986 e Niel-sen e outros, 1996).

Além disso, as propriedades de ligação das proteínas ISP3 da invenção podem ser avaliadas, utilizando métodos conhecidos na técnica (por exemplo, Van Rie e outros, 1990), para determinar se as proteínas ISP3 da invenção se ligam aos sítios no intestino do inseto, tal como no intestino médio, que não são reconhecidas (ou competem com) por outras proteínas de Bt. As proteínas inseticidas de Bt com sítios de ligação diferentes para os quais não há competição pela ligação em insetos susceptíveis relevantes são muito valiosas para substituir proteínas de Bt às quais os insetos podem ter desenvolvido resistência ou para utilizar em combinação com proteínas inseticidas de Bt que possuem um modo diferente de ação para prevenir ou retardar o desenvolvimento de resistência do inseto contra as proteínas de Bt, particularmente quando expressas em uma planta. Devido às características das toxinas de Bt recém-isoladas, estas são extremamente úteis para a transformação de plantas, por exemplo, monocotiledôneas tais como o milho e o arroz e dicotiledôneas tais como o algodão e a soja, para proteger estas plantas de danos causados por insetos. É esperado que as propriedades de ligação das proteínas ISP3 da presente invenção sejam diferentes comparadas com às de toxinas Cry. Tais propriedades de ligação diferentes podem ser medidas através de ensaios de ligação de rotina que são descritos anteriormente ou na Patente U.S. N- 6.291.156 e na Patente U.S. N° 6.137.033.

Especialmente para as finalidades de controle da resistência de insetos para uma praga de inseto específica, é preferido combinar uma proteína ISP3 desta invenção com uma outra proteína de controle de insetos, particularmente uma proteína Cry de Bt ou uma proteína VIP ou VIP-similar, preferencialmente uma proteína que não reconhece pelo menos um sítio de ligação reconhecido por tal proteína ISP3. As proteínas preferidas de controle de insetos para combinar com as proteínas ISP3 desta invenção, particularmente para a expressão simultânea em plantas, preferencial mente plantas de milho, de algodão, de arroz ou de soja, incluem as proteínas Cry, tais como a proteína Cry1F ou híbridos derivados de uma proteína Cry1F (por exemplo, as proteínas híbridas Cry1A-Cry1F descritas na Patente U.S. NQ 6.326.169; na Patente U.S. NQ 6.281.016; na Patente U.S. NQ 6.218.188 ou fragmentos tóxicos das mesmas), as proteínas do tipo Cry1A ou fragmentos tóxicos das mesmas, preferencialmente a proteína CrylAc ou híbridos derivados da proteína CrylAc (por exemplo, a proteína híbrida CrylAb-CrylAc descrita na Patente U.S. NQ 5.880.275) ou a proteína CrylAb ou Bt2 ou fragmentos inseticidas das mesmas que são descritos na EP451878, as proteínas Cry2Ae, Cry2Af ou Cry2Ag que são descritas no WO 02/057664, as proteínas Cry que são descritas no WO 01/47952, a proteína VIP3Aa ou um fragmento tóxico da mesma que é descrito em Estruch e outros (1996) e na Patente U.S. Ns 6.291.156, proteínas inseticidas de cepas das espécies de Xenorhabdus (que são descritas no WO 98/50427), de Serratia (particularmente de S. entomophila) ou de Photorhabdus, tais como as proteínas Tc de Photorhabdus que são descritas no WO 98/08932 (por exemplo, Waterfi-eld e outros, 2001; Ffrench-Constant e Bowen, 2000). Em uma modalidade, tal co-expressão é facilmente obtida através da transformação de uma planta que já expressa uma proteína de controle de insetos com uma ISP3 desta invenção ou através do cruzamento de plantas transformadas com a proteína de controle de insetos e plantas transformadas com uma ou mais proteínas ISP desta invenção. Para as plantas de milho, arroz, algodão ou soja, preferencialmente a proteína ISP3-327D ou a proteína ISP3-1099E ou a proteína ISP3-2245J é utilizada como a primeira proteína de controle de insetos e como a segunda proteína de controle de insetos são utilizadas as proteínas CrylAb, CrylAc, CrylAe ou VIP3Aa ou derivados das mesmas. Os métodos para a obtenção da expressão de proteínas inseticidas diferentes de Bt (ou similarmente, para outras proteínas de controle de insetos) na mesma planta em um esforço de minimizar ou prevenir o desenvolvimento da resistência de plantas transgênicas resistentes a insetos são descritos na EP 0 408 403. É entendido que as proteínas diferentes podem ser expressas na mesma planta ou cada uma pode ser expressa em uma única planta e então combinada na mesma planta através do cruzamento de plantas individuais uma com a outra. Por exemplo, na produção de sementes híbridas, cada planta parental pode expressar uma única proteína. Após o cruzamento das plantas parentais para a produção de híbridos, ambas as proteínas são combinadas na planta híbrida. É bem sabido que as proteínas Cry de Bt são expressas na forma de pró-toxinas, que são convertidas no núcleo tóxico através de proteóli-se no intestino dos insetos. Quando as proteínas ISP3 da invenção são combinadas com as proteínas Cry de Bt, é entendido que os genes Cry de Bt que codificam a pró-toxina completa ou o núcleo tóxico ou qualquer forma intermediária podem ser utilizados.

Preferencialmente, para as finalidades de seleção, mas também para aumentar as opções de controle de ervas daninhas, as plantas transgênicas da invenção são também transformadas com um DNA que codifica uma proteína que confere resistência a um herbicida de amplo espectro, por exemplo, os herbicidas com base no glufosinato ou no glifosato.

A parte do gene isp3 eficiente como inseticida ou seu equivalente, preferencialmente o gene quimérico isp3, que codifica uma parte eficiente como inseticida da proteína ISP3, pode ser inserida de forma estável de uma maneira convencional no genoma nuclear de uma única célula vegetal e a célula transformada dessa forma pode ser utilizada de uma maneira convencional para produzir uma planta transformada que é resistente a insetos. Sob este aspecto, um vetor de T-DNA, contendo a parte do gene isp3 eficiente como inseticida, em Agrobacterium tumefaciens pode ser utilizado para transformar a célula vegetal e depois disso, uma planta transformada pode ser regenerada partindo da célula vegetal transformada utilizando os procedimentos descritos, por exemplo, na EP 0 116 718, na EP 0 270 822, na publicação PCT WO 84/02913 e no pedido de Patente Européia publicado EPO 242 246 e em Gould e outros (1991). A construção de um vetor de T-DNA para a transformação de plantas mediada por Agrobacterium é bem conhecida na técnica. O vetor de T-DNA pode ser um vetor binário como é descrito na EP 0 120 561 e na EP 0 120 515 ou um vetor co-integrado que pode se integrar no plasmídeo Ti de Agrobacterium através de recombinação homóloga, como é descrito na EP 0 116 718. Os vetores de T-DNA preferidos contêm cada um promotor ligado de forma operacional à parte do gene isp3 eficiente como inseticida entre as seqüências da borda do T-DNA ou pelo menos localizado à esquerda da seqüência da borda direita. As seqüências das bordas são descritas em Gielen e outros (1984). Evidentemente, outros tipos de vetores podem ser utilizados para transformar a célula vegetal, utilizando procedimentos tais como a transferência direta do gene (como é descrito, por exemplo, na EP 0 223 247), a transformação mediada por pólen (como é descrito, por exemplo, na EP 0 270 356 e no WO 85/01856), a transformação de protoplastos como descrito, por exemplo, na Patente U.S. N- 4.684.611, a transformação mediada por vírus de RNA (como é descrito, por exemplo, na EP 0 067 553 e na Patente U.S. N- 4.407.956), a transformação mediada por lipossomos (como é descrito, por exemplo, na Patente U.S. N° 4.536.475) e outros métodos tais como os métodos descritos recentemente para a transformação de certas linhagens de milho (por exemplo, na Patente U.S. Ne 6.140.553; Fromm e outros, 1990; Gordon-Kamm e outros, 1990) e de arroz (Shimamoto e outros, 1989; Datta e outros, 1990) e o método para a transformação de monocotiledôneas em geral (publicação PCT WO 92/09696). Para a transformação do algodão, é especialmente preferido o método descrito na publicação de patente PCT WO 00/71733. Para a transformação do arroz, faz-se referência aos métodos descritos no WO 92/09696, no WO 94/00977 e no WO 95/06722. O termo "milho" como utilizado aqui refere-se à Zea mays. O algodão como utilizado aqui refere-se a Gossypium spp., particularmente G. hirsutum e G. barbadense. O termo "arroz" refere-se a Oryza spp., particularmente O. sativa. "Soja" refere-se a Glycine spp., particularmente G. Max.

Além da transformação do genoma nuclear, é também incluída na invenção a transformação do genoma de plastídeos, preferencialmente do genoma de cloroplastos. Kota e outros (1999) descreveram um método para superexpressar uma proteína Cry2Aa em cloroplastos do tabaco. A planta transformada resultante pode ser utilizada em um esquema de cruzamento vegetal convencional para produzir plantas mais transformadas com as mesmas características ou para introduzir a parte do gene isp3 eficiente como inseticida em outras variedades da mesma ou de plantas de espécies relacionadas. As sementes, que são obtidas das plantas transformadas, contêm a parte do gene isp3 eficiente como inseticida na forma de uma inserção genômica estável. As células da planta transformada podem ser cultivadas de uma maneira convencional para produzir a parte eficiente como inseticida da toxina ou da proteína ISP3, que pode ser recuperada para uso em composições inseticidas convencionais contra Lepi-dópteras (Patente U.S. Ne 5.254.799). A parte do gene isp3 eficiente como inseticida é inserida no genoma de uma célula vegetal de forma que o gene inserido fique a jusante (isto é, a 3') de, sob o controle de, um promotor que pode direcionar a expressão da parte do gene na célula vegetal. Isto é preferencialmente realizado através da inserção do gene quimérico isp3 no genoma da célula vegetal, particularmente no genoma nuclear ou dos plastídeos (por exemplo, cloroplastos).

Os promotores preferidos incluem: os promotores 35 S constitutivos fortes (os "promotores 35S"), do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) de isolados CM 1841 (Gardner e outros, 1981), CabbB-S (Franck e outros, 1980) e CabbB-JI (Hull e Howell, 1987); o promotor 35S descrito por Odell e outros (1985), os promotores da família da ubiquitina (por exemplo, o promotor da ubiquitina do milho de Christensen e outros, 1992, EP 0 342 926, ver também Cornejo e outros, 1993), o promotor gos2 (de Pater e outros, 1992), o promotor emu (Last e outros, 1990), os promotores da actina de Arabidopsis tal como o promotor descrito por An e outros (1996), os promotores da actina do arroz tal como o promotor descrito por Zhang e outros (1991) e o promotor descrito na Patente U.S. N° 5.641.876; os promotores do vírus mosaico de veio da Mandioca (WO 97/48819, Verdaguer e outros (1998)), a série pPLEX de promotores do Vírus de Atrofia do Trevo Subterrâneo (WO 96/06932, particularmente o promotor S7), um promotor da álcool desidrogenase, por exemplo, pAdhIS (números de acesso no GenBank X04049, X00581) e o promotor TRT e o promotor TR2' (o "promotor TR1" e o "promotor TR2", respectivamente) que controlam a expressão dos genes 1' e 2’, respectivamente, do T-DNA (Velten e outros, 1984). Alternativamente, pode ser utilizado um promotor que não é constitutivo, mas ao invés disso é específico para um ou mais tecidos ou órgãos da planta (por exemplo, folhas e/ou raízes) através do qual a parte do gene isp3 inserida é expressa somente nas células de tecido(s) ou órgão(s) específicos. Por exemplo, a parte do gene isp3 eficiente como inseticida poderia ser seletivamente expressa nas folhas de uma planta (por exemplo, milho, algodão, arroz, soja) colocando a parte do gene eficiente como inseticida sob o controle de um promotor com indução leve tal como promotor do gene da subunidade pequena da ribulose-1,5-bifosfato carboxilase da própria planta ou de uma outra planta, tal como a ervilha, como é descrito na Patente U.S. NQ 5.254.799. O promotor pode, por exemplo, ser escolhido de forma que o gene isp3 da invenção seja expresso somente nos tecidos ou células em que a praga de inseto alvo se alimenta de forma que a alimentação pelo inseto alvo susceptível resultará em danos reduzidos causados pelos insetos à planta hospedeira, comparadas com plantas que não expressam o gene isp3. Uma praga de inseto Lepidóptera que danifica principalmente as raízes pode ser assim controlada de forma eficiente através da expressão de um gene isp3 sob um promotor específico à raiz. Um promotor preferencialmente ativo nas raízes é descrito no WO 00/29566. Um promotor preferido para a expressão preferencial na raiz é o promotor ZRP (e modificações do mesmo) que é descrito na Patente U.S. NQ 5.633.363. Uma outra alternativa é utilizar um promotor cuja expressão pode ser induzida, por exemplo, um promotor que pode ser induzido por feridas tal como o promotor MPI descrito por Cordera e outros (1994), que é induzido pelo ferimento (tal como o causado pela alimentação dos insetos) ou um promotor que pode ser induzido por um reagente químico, tal como a dexametasona que é descrita por Aoyama e Chua (1997) ou um promotor que pode ser induzido pela temperatura, tal como o promotor de choque térmico descrito na Patente U.S. Ns 5.447.858 ou um promotor que pode ser induzido por outros estímulos externos. A parte do gene isp3 eficiente como inseticida é inserida no ge-noma da planta de forma que a parte do gene inserida fique a montante (isto é, a 5’) de sinais reguladores da transcrição adequados da extremidade 3’ (isto é, sinais de formação do produto da transcrição e de poliadenilação). Isto é preferencialmente realizado através da inserção do gene quimérico isp3 no genoma da célula vegetal. Os sinais preferidos de poliadenilação e de formação de produtos da transcrição incluem aqueles do gene 35S do CaMV, do gene da nopalina sintase (Depicker e outros, 1982), do gene da octopina sintase (Gielen e outros, 1984) e do gene 7 do T-DNA (Velten e Schell, 1985), que atuam como seqüências de DNA não-traduzidas a 3' em células vegetais transformadas. A introdução do vetor de T-DNA em Agrobacterium pode ser realizada utilizando métodos conhecidos, tal como a eletroporação ou o cruzamento triparental. A parte do gene isp3 eficiente como inseticida pode ser opcionalmente inserida no genoma da planta na forma de um gene híbrido (Patente U.S. N- 5.254.799; Vaeck e outros, 1987) sob o controle do mesmo promotor como um gene marcador que pode ser selecionado ou classificado, tal como o gene neo (EP 0 242 236) que codifica a resistência à canamicina, de forma que a planta expressa uma proteína de fusão que pode ser facilmente detectada. A transformação de células vegetais também pode ser utilizada para produzir as proteínas da invenção em grandes quantidades em culturas de células vegetais, por exemplo, para produzir uma proteína ISP3 que possa ser então aplicada nas plantas de cultivo após a formulação apropriada. Quando se faz referência aqui a uma célula vegetal transgênica, esta refere-se a uma célula vegetal (ou ainda a um protoplasto de planta) em uma cultura isolada ou tecidual, ou a uma célula de planta (ou protoplasto) contida em uma planta ou em um órgão ou tecido diferenciado e ambas as possibilida- des são especificamente incluídas aqui. Conseqüentemente, uma referência a uma célula vegetal na descrição ou nas reivindicações não significa que refere-se apenas a células isoladas em cultura, mas refere-se a qualquer célula vegetal, qualquer que seja o local que possa estar ou qualquer que seja o tipo de tecido ou órgão vegetal em que possa estar presente.

Todo ou parte do gene isp3, que codifica uma proteína antilepi-dóptera, pode ser também utilizada para transformar outros microorganismos, tais como bactérias, tal como um B. thuringiensis que possui atividade inseticida contra Lepidóptera ou Coleóptera.

Dessa maneira, pode ser produzida uma cepa de Bt transformada que é útil para combater um espectro amplo de pragas de insetos Lepi-dópteros e/ou Coleópteros ou para combater pragas de insetos Lepidópteros adicionais. A transformação de bactérias, tais como as bactérias do gênero Pseudomonas, Agrobacterium, Bacillus ou Escherichia, com todo ou uma parte do gene isp desta invenção, incorporada em um veículo de clonagem adequado, pode ser realizada de uma maneira convencional, preferencialmente utilizando técnicas convencionais de eletroporação que são descritas em Mahillon e outros (1989) e na publicação de Patente PCT WO 90/06999.

As cepas de espécies de Bacillus transformadas contendo o gene isp3 desta invenção podem ser fermentadas através de métodos convencionais (Dulmage, 1981; Bernhard e Utz, 1993) para fornecer altos rendimentos de células. Sob condições de crescimento apropriadas que são bem entendidas, estas cepas secretam proteínas ISP3 em altos rendimentos.

Os microorganismos adequados alternativos em que os genes isp3 podem ser expressos são fungos, algas ou vírus, particularmente espécies que são espécies colonizadoras de plantas (por exemplo, (en-do)simbiônticas) ou agentes patogênicos de insetos.

Uma composição inseticida, particularmente antilepidóptera, desta invenção pode ser formulada de uma maneira convencional utilizando os microorganismos transformados com o gene isp3 ou preferencialmente suas proteínas ISP3 respectivas ou a toxina ISP3 ou uma parte da toxina eficiente como inseticida como um ingrediente ativo, junto com veículos, di- luentes, emulsificantes e/ou dispersantes adequados (por exemplo, que são descritos por Bernhard e Utz, 1993). A composição inseticida pode ser formulada na forma de um pó que pode ser umedecido, em péletes, de grânulos ou de pó fino ou na forma de uma formulação líquida com solventes aquosos ou não aquosos como uma espuma, um gel, uma suspensão, um concentrado etc. Os exemplos de composições que compreendem esporos inseticidas de Bt são descritos no WO 96/10083.

Um método para controlar insetos, particularmente Lepidóptera, de acordo com esta invenção, pode compreender a aplicação (por exemplo, a borrifação), em um local (área) que deve ser protegido, de uma quantidade inseticida das proteínas ISP3 ou de composições que compreendem as proteínas ISP3 ou que compreendem células hospedeiras transformadas com os genes isp3 desta invenção. O local que deve ser protegido pode incluir, por exemplo, o habitat das pragas de insetos ou a vegetação em crescimento (por exemplo, aplicação na folhagem) ou uma área em que a vegetação dever crescer (por exemplo, aplicação no solo ou na água). Uma composição preferida compreende uma quantidade inseticida de pelo menos uma das proteínas ISP3 da invenção, preferencialmente produzida por um hospedeiro bacteriano e a aplicação preferida da composição é a aplicação nas folhas, a aplicação no solo ou o revestimento de sementes. O termo "colocar em contato" é utilizado aqui para significar "colocar em contato físico com". O contato de uma planta com uma proteína inseticida significa que a proteína inseticida é colocada em contato com células da planta, internamente (por exemplo, através da expressão na planta) ou externamente (por exemplo, através da aplicação de composições que compreendem a proteína inseticida externamente à planta). É entendido que o termo não indica o período de tempo de contato, mas compreende qualquer período de tempo de contato (por exemplo, contato breve, contato longo). Quando se faz referência a um método de proteção de uma planta contra danos causados por insetos que compreende colocar a dita planta em contato (ou células ou tecidos da mesma) com uma proteína inseticida da invenção, o contato é preferencialmente longo o suficiente e extenso o sufi- ciente (com uma quantidade alta o suficiente de proteína em contato com um número grande o suficiente de células) para prevenir ou reduzir os danos causados por insetos.

Esta invenção refere-se ainda a um método de controle de pragas de insetos Lepidópteros do algodão, particularmente lagarta que ataca o algodoeiro, vermes do broto, vermes da espiga, preferencialmente uma praga de inseto Lepidóptero selecionado do grupo Helicoverpa zea (Verme da Espiga de Milho), Helicoverpa armigera (Lagarta que ataca o Algodoeiro), Helicoverpa punctígera (Lagarta que ataca o algodoeiro Nativa), Heliothis virescens (Verme do broto do Tabaco), Spodoptera frugiperda (Lagarta de Cereais do Outono) e Pectinophora gossipiella (Lagarta cor-de-rosa que ataca o algodoeiro), cujo método compreende a aplicação em uma área ou planta que deve ser protegida, de uma proteína ISP3 que é definida aqui, preferencialmente uma proteína ISP3-1099E e/ou uma proteína ISP3-327D e/ou uma proteína ISP3-2245J, todas como definido aqui, (isto é, colocando em contato uma planta de algodão com uma proteína ISP3 desta invenção, por exemplo, plantando uma planta de algodão transformada com um gene isp3 desta invenção ou borrifando uma composição que contém uma proteína ISP3 desta invenção). A invenção refere-se ainda ao uso das proteínas ISP3 desta invenção, particularmente a proteína ISP3-1099E e/ou a proteína ISP3-327D e/ou a proteína ISP3-2245J, contra pragas de insetos de algodão Lepidópteros para minimizar os danos nas plantas de algodão.

Esta invenção refere-se ainda a um método para controle de pragas de insetos do milho, particularmente vermes da espiga, lagarta de cereais do outono, brocas do milho, preferencialmente uma praga de inseto do milho selecionada do grupo de Helicoverpa zea (Verme da Espiga de Milho), Agrotis ipsilon (Lagarta Negra que Destrói Plantas novas), Ostrinia nu-bilalis (Broca do Milho Europeu) e Spodoptera frugiperda (Lagarta de Cereais dó Outono), cujo método compreende a aplicação em uma área ou planta que deve ser protegida, de uma proteína ISP3 que é definida aqui, preferencialmente uma proteína ISP3-1099E e/ou uma proteína ISP3-327D e/ou uma proteína ISP3-2245J todas como definido aqui, (isto é, colocando uma planta de milho em contato com uma proteína ISP3 desta invenção, por exemplo, plantando uma planta de milho transformada com um gene isp3 desta invenção ou borrifando uma composição que contém uma proteína ISP3 desta invenção). A invenção refere-se ainda ao uso das proteínas ISP3 desta invenção, particularmente a proteína ISP3-1099E e/ou a proteína ISP3-327D e/ou a proteína ISP3-2245J, contra pragas de insetos de milho Lepidópteros para minimizar os danos causados às plantas de milho.

Esta invenção refere-se ainda a um método para o controle de pragas de insetos de arroz Lepidópteros, particularmente brocas do caule do arroz, larvas do arroz, lagartas que destroem plantas novas do arroz, lagarta de cereais do arroz, grumixá do arroz, dobradores de folha do arroz, preferencialmente uma praga de inseto de arroz selecionado do grupo de Broca Amarela do Caule (Scirphophaga incertulas), Dobrador de Folhas (Cnapha-locrocis medinalis), Broca Cor-de-Rosa do Caule (Sesamia inferens) e Broca do Caule em Manchas do Milho (Chilo partellus), cujo método compreende a aplicação em uma área ou planta que deve ser protegida, de uma proteína ISP3 que é definida aqui, preferencialmente uma proteína ISP3-1099E e/ou uma proteína ISP3-327D e/ou uma proteína ISP3-2245J, todas como é definido aqui, (isto é, colocando em contato uma planta de arroz com uma proteína ISP3 desta invenção, por exemplo, plantando uma planta de arroz transformada com um gene i$p3 desta invenção ou borrifando uma composição que contém uma proteína ISP3 desta invenção). A invenção refere-se ainda ao uso das proteínas ISP3 desta invenção, particularmente a proteína ISP3-1099E e/ou a proteína ISP3-327D e/ou a proteína ISP3-2245J, contra pragas de insetos Lepidópteros do arroz para minimizar os danos causados às plantas de arroz.

Esta invenção refere-se ainda a um método para o controle de pragas de insetos da soja Lepidópteros, preferencialmente uma praga de inseto da soja selecionada do grupo de Lagarta Aveludada do Feijão (Anti-carsia gemmatalis), Mede Palmos da Soja (Pseudoplusia includens), Lagarta de Cereais da Beterraba (Spodoptera exígua), Lagarta de Cereais de Listras Amarelas (Spodoptera ornithogallí), Vermes da Espiga de Milho (Helicoverpa zea), Broca da Vagem (Epinotia aporema) e Rachiplusia nu, cujo método compreende a aplicação em uma área ou planta que deve ser protegida, de uma proteína ISP3 que é definida aqui, preferencialmente uma proteína ISP3-1099E e/ou uma proteína ISP3-327D e/ou uma proteína ISP3-2245J, todas como é definido aqui, (isto é, colocando em contato uma planta de soja com uma proteína ISP3 desta invenção, por exemplo plantando uma planta de soja transformada com um gene isp3 desta invenção ou borrifando uma composição que contém uma proteína ISP3 desta invenção). A invenção refere-se ainda ao uso das proteínas ISP3 desta invenção, particularmente a proteína ISP3-1099E e/ou a proteína ISP3-327D e/ou a proteína ISP3-2245J, contra pragas de insetos Lepidópteros da soja para minimizar os danos causados às plantas de soja.

Para a obtenção da proteína ou da toxina da ISP3, as células dos hospedeiros recombinantes que expressam a proteína ISP3 podem ser cultivadas de uma maneira convencional em um meio de cultura adequado. A toxina secretada pode ser separada e purificada do meio de cultura. Alternativamente, se as proteínas não forem secretadas, as células podem ser lisadas utilizando meios convencionais tal como a degradação de enzimas ou detergentes ou similares. A toxina pode ser então separada e purificada através de técnicas padronizadas tal como a cromatografia, a extração, a eletroforese ou similares. O termo "gene" significa qualquer fragmento de DNA ou de RNA que compreende uma região (a "região transcrita") que é transcrita em uma molécula de RNA (por exemplo, um mRNA) em uma célula, ligado de forma operacional a regiões reguladoras adequadas, por exemplo, um promotor que pode ser expresso em plantas. Um gene pode compreender assim vários fragmentos ligados de forma operacional tal como um promotor, uma se-qüência líder a 5', uma região codificadora e uma seqüência não traduzida a 3', que compreende um sítio de poliadenilação. Um gene endógeno a um organismo particular (tal como uma espécie de planta ou uma cepa bacteria-na) é um gene, que é encontrado naturalmente em tal organismo na nature- za. Um gene quimérico, quando refere-se a um DNA de isp3 desta invenção, refere-se a uma seqüência de DNA do isp3 que possui seqüências reguladoras a 5' e/ou a 3' diferentes das seqüências reguladoras a 5’ e/ou a 3' bacte-rianas que ocorrem naturalmente, que controlam a expressão do gene isp3 em sua célula hospedeira nativa. O termo "expressão de um gene" refere-se ao processo em que uma região do DNA ou do RNA que é ligada de forma operacional a regiões reguladoras apropriadas, particularmente a um promotor, é transcrita em um RNA que é biologicamente ativo, isto é, que é capaz de interagir com uma outra molécula de aminoácido ou que é capaz de ser traduzido em um poli-peptídeo ou uma proteína ativa biologicamente. É dito que um gene codifica um RNA quando o produto final da expressão do gene é um RNA biologicamente ativo, tal como, por exemplo, um RNA com sentido inverso, uma ribo-zima ou um intermediário replicativo. É dito que um gene codifica uma proteína quando o produto final da expressão do gene é uma proteína ou um polipeptídeo biologicamente ativo.

Para a finalidade desta invenção a "identidade de seqüência" de duas seqüências de nucleotídeos ou de aminoácidos relacionadas, expressa na forma de uma porcentagem, refere-se ao número de posições nas duas seqüências alinhadas de forma ótima que possuem resíduos idênticos (x100) divididos pelo número de posições comparadas. Um espaço, isto é, uma posição em um alinhamento em que um resíduo está presente em uma seqüência, mas não na outra é considerado como uma posição com resíduos não-idênticos. Para calcular a identidade de seqüência entre duas seqüências para a finalidade desta invenção, é utilizado o programa GAP, que utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) e que é fornecido pelo Wisconsin Package, Versão 10.2, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin 53711, EUA. Os parâmetros de GAP utilizados são uma penalidade de criação de espaço = 50 (nucleotídeos)/8 (aminoácidos), uma penalidade de extensão de espaço = 3 (nucleotídeos)/2 (aminoácidos) e uma matriz de classificação "nwsgapdna" (nucleotídeos) ou "blosum62" (aminoácidos). O GAP utiliza o algoritmo de alinhamento global de Needleman e Wunsch para alinhar duas seqüências ao longo de seu comprimento total, maximizando o número de combinações e minimizando o número de espaços. Os parâmetros pré-estabelecidos são uma penalidade de criação de espaço = 50 (nucleotídeos)/8 (proteínas) e a penalidade de extensão de espaço = 3 (nucleotídeos)/2 (proteínas). Para os nucleotídeos a matriz de classificação pré-estabelecida é "blosum62" (Henikoff & Henikoff, 1992).

Estas e/ou outras modalidades desta invenção são refletidas nas expressões das reivindicações, que fazem parte da descrição da invenção.

Os Exemplos a seguir ilustram a invenção e não são fornecidos para limitar a invenção ou à busca de proteção. A listagem de seqüência referida nos Exemplos, nas Reivindicações a não Descrição é a seguinte: SEQ ID Ne: 1: seqüência de DNA do isp3-1099E SEQ ID N°: 2: seqüência de aminoácidos da ISP3-1099E SEQ ID N-: 3: seqüência de DNA do isp3-327D SEQ ID N-: 4: seqüência de aminoácidos da ISP3-327D SEQ ID N-: 5: seqüência de DNA do isp3-2245J SEQ ID Ne: 6: seqüência de aminoácidos da ISP3-2245J A não ser que seja citado de outra forma nos Exemplos, todas as técnicas de DNA recombinante são realizadas de acordo com protocolos padronizados que são descritos em Sambrook e Russel (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor Labora-tory Press, NY, nos Volumes 1 e 2 de Ausubel e outros (1994) Current Pro-tocols in Molecular Biology, Current Protocols, EUA e nos Volumes I e II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Segunda Edição, Academic Press (Reino Unido). Os materiais e os métodos padronizados para o trabalho molecular de plantas são descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R. D. D. Cray, publicado juntamente pela BIOS Scientific Publications Ltd. (Reino Unido) e Blackwell Scientific Publications, Reino Unido. Os materiais e os métodos para as reações em cadeia da polimerase podem ser encontrados em Dieffenbach e Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press e em McPherson e outros (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, Primeira Edição, Springer Verlag, Alemanha.

Exemplos Exemplo 1: Caracterização de cepas bacterianas Uma cepa bacteriana, chamada aqui de BTS01099E, foi isolada partindo da poeira de grãos da Bélgica. Uma cepa bacteriana adicional, chamada aqui de BTS00327D, foi isolada de estrume de cavalo da Espanha. Uma outra cepa bacteriana, chamada aqui de BTS02245J, foi isolada da poeira de grãos das Filipinas.

Cada cepa foi crescida durante a noite em placas de LB com ágar (meio LB com 1,5% de ágar adicionado; meio LB: 10 g/L de triptona, 10 g/L de NaCI, 5 g/L de extrato de levedura, pH 7,3) a 28°C. Para culturas em pequena escala, 20 mL de meio TB (Terrific Broth: 12 g/L de triptona, 24 g/L de extrato de levedura, 3,8 g/L de KH2P04, 12,5 g/L de K2HP04, 5 mL/L de glicerol, pH 7,1) foram inoculados e cultivados durante 65 horas a 28°C em uma plataforma giratória possuindo aproximadamente 70 rotações por minuto. Após 65 horas, uma mistura de inibidor de protease foi adicionada à cultura. Este coquetel possui os ingredientes a seguir (os volumes fornecidos são os necessários para serem adicionados em uma cultura de 20 mL): 200 pL de PMSF (100 mM), 200 pL de uma mistura de benzamidina.HCI (100 mM) e ácido epsilon-amino-n-capróico (500 mM), 400 pL de EGTA (0,5 M), 40 pL de antipaína (0,5 mg/mL)/leupeptina (0,5 mg/mL) e 20 pL de beta-mercapto etanol (14 M). O meio de cultura ao qual a mistura de inibidor de proteases foi adicionada, foi então centrifugado durante 20 minutos a 3000 rpm. Em alguns casos, o sobrenadante foi concentrado aproximadamente 4 vezes utilizando Centriprep YM-10 Centrifugai Filter Devices (Ns de Cat. da Millipore 4305).

Para o armazenamento a longo prazo, uma alça de células es-poruladas foi adicionada a 0,5 mL de 25% de glicerol e após submeter ao vórtex, armazenada a -70°C. As células esporuladas foram obtidas através do cultivo da cepa em placas de LB com ágar até a esporulação (que é visí- vel sob microscópio luminoso).

Após o cultivo em placas de LB com ágar de colônias de células isoladas, a análise microscópica das culturas das cepas BTS01099E, BTS00327D e BTS02245J mostrou a presença de células vegetativas isoladas móveis em forma de bastão e esporângios contendo um esporo oval. Os cristais paraesporais foram detectados em culturas de BTS00327D, BTS01099E e BTS02245J.

Com base na forma similar a um bastão, no crescimento aeróbi-co e na presença de cristais paraesporais, acredita-se que estas 3 cepas sejam cepas da espécie Bacillus thuríngiensis.

Cada cepa pode ser cultivada em meios padronizados convencionais, preferencialmente o meio T3 (triptona 3 g/L, triptose 2 g/L, extrato de levedura 1,5 g/L, 5 mg de MnCI2, 0,05 M de Na2HP04.2H20, 0,05 M de NaH-2P04.H20, pH 6,8 e 1,5% de ágar), preferencialmente a 28°C. Para armazenamento a longo prazo, é preferido misturar um volume equivalente de uma suspensão de cristal de esporo com um volume equivalente de glicerol a 50% e armazenar a -70°C ou liofilizar uma suspensão de cristais de esporos. Para a esporulação, o cultivo em meio T3 é preferido durante 72 horas a 28°C.

Exemplo 2: Ensaios biológicos de cepas de Bacillus com insetos (utilizando sobrenadante de cultura contendo a proteína inseticida) Os ensaios biológicos foram realizados em larvas neonatais de Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugiper-da e Agrotis ipsilon. O sobrenadante isento de células de culturas bacterianas de cepas de Bacillus diferentes foi utilizado nos ensaios biológicos com insetos ("ensaio de contaminação da superfície") contra vários insetos lepidópteros. A cepa BTS01099E, BTS00327D ou BTS02245J foi cultivada a 28°C em meio TB. O sobrenadante de cultura isento de células foi coletado 65 horas após o início da cultura, foram feitas diluições e aplicadas na superfície de uma dieta artificial solidificada (ágar 20 g, água 1000 mL, farinha de milho 96 g, levedura 30 g, gérmen de trigo 64 g, sal de Wesson 7,5 g, caseína 15 g, ácido sórbico 2 g, Aureomicina 0,3 g, Nipagina 1 g, óleo de gérmen de trigo 4 mL, sacarose 15 g, colesterol 1 g, ácido ascórbico 3,5 g, mistura de vitaminas modificadas de Vanderzand 12 g) (com base em Van-derzand 1962), dispensada em cavidades de placas de 48 cavidades Costar e foi permitido que solidificasse. 25 μΐ_ da solução do sobrenadante foram aplicados na superfície de cada cavidade (1 cm2). Uma larva de inseto neo-natal (L1; primeiro instar) foi colocada em cada cavidade e 18-20 larvas foram utilizadas por amostra. As placas foram mantidas a 25 + 1°C e as taxas de mortalidade (porcentagem de larvas mortas versus vivas) foram registradas após 7 dias. Como um controle negativo, uma dieta padronizada e o TB foram utilizados.

Os resultados (mostrados na Tabela 1 abaixo) mostraram que os sobrenadantes isentos de células das cepas BTS01099E, BTS00327D e BTS02245J exibiam toxicidade para larvas de HeUothis virescens, Helicover-pa zea e Ostrinia nubilalis. Em adição, o sobrenadante da cepa BTS02245J também mostrou toxicidade para larvas de Spodoptera frugiperda e o sobrenadante BTS00327D mostrou toxicidade para as larvas de Agrotis ipsilon. Tabela 1: Hv: Heliothis virescens, Hz: Helicoverpa zea, On: Ostrinia nubilalis, Sf: Spodoptera frugiperda; Ai: Agrotis ipsilon; nt: não testado Controles negativos (dieta padronizada): BTS02245J - Hv 9%, Hz 0%, On 0%, Sf 0% BTS00327D - Hv 10%, Hz 6%, On 4%, Ai 0% BTS01099E - Hv 10%, Hz 0%, On 0% Observações adicionais: gi: inibição do crescimento das larvas (larvas ainda vivas no estágio instar L1/L2 após 7 dias) ir: crescimento irregular da larva (uma proporção de larvas vivas no estágio instar L1/L2, uma proporção de larvas vivas no estágio instar L3/L4 após 7 dias) O sobrenadante isento de células da cepa BTS02245J causou 11% e 33% de mortalidade das larvas de H. virescens, 94% e 50% de mortalidade das larvas de H. zea, 50% de mortalidade das larvas de O. nubilalis e 78% de mortalidade das larvas de S. frugiperda, mostrando que o sobrenadante desta cepa possui atividade inseticida, particularmente contra H. zea e S. frugiperda. A toxicidade é provavelmente causada por uma proteína secretada por esta cepa no meio de cultura. O sobrenadante isento de células da cepa BTS00327D causou 70% de mortalidade das larvas de H. virescens, 35% até 78% de mortalidade das larvas de H. zea, 100% de mortalidade das larvas de O. nubilalis e 100% de mortalidade das larvas de Agrotis ipsiion. Assim, o sobrenadante desta cepa mostrou grande toxicidade a pelo menos quatro espécies diferentes de insetos Lepidópteras. A toxicidade é provavelmente causada por uma proteína ativa como inseticida secretada por esta cepa no meio de cultura. O sobrenadante isento de células da cepa BTS01099E causou 25% de mortalidade das larvas de H. virescens, 10% de mortalidade das larvas de H. zea e 46% de mortalidade das larvas de O. nubilalis, indicando que o sobrenadante desta cepa possui atividade tóxica contra espécies diferentes de insetos Lepidópteros. A toxicidade é provavelmente causada por uma proteína ativa como inseticida secretada por esta cepa no meio de cultura.

Exemplo 3: Clonagem dos genes isp3 Clonagem da seqüência de nucleotídeos que codifica ISP3-1099E partindo da cepa BTS01099E O DNA total da cepa BTS01099E foi preparado e parcialmente digerido com Sau3A. O DNA digerido foi fracionado por tamanho em um gradiente de sacarose.

Os fragmentos variando de 7 kb até 10 kb foram ligados ao vetor de clonagem pUC19l (um derivado do pUC19; Yannisch-Perron e outros, 1985), após a digestão com BamH1 e o tratamento do vetor de clonagem com TsAP (fosfatase alcalina termossensível). A mistura de ligação foi então submetida à eletroporação em células de E. coli XL1-Blue. Os transforman-tes foram plaqueados em placas de LB-triacilina contendo X-gal e IPTG e as colônias brancas foram selecionadas para serem utilizadas em experimentos de hibridização em filtro. Os clones de E. coli recombinantes contendo o vetor foram então selecionados com uma sonda marcada com DIG que foi preparada como a seguir. Primeiro, foi realizada uma PCR utilizando as células moldes da cepa BTS01099E. O produto resultante da amplificação foi purificado em gel e clonado em pGEM-T. O plasmídeo resultante foi utilizado como molde em uma reação da PCR utilizando dNTPs marcados com DIG e os mesmos iniciadores que os na primeira reação da PCR. Uma quantidade apropriada deste produto de amplificação foi utilizada em reações de hibridização.

Após a identificação de uma colônia positiva contendo um plasmídeo que porta o gene isp3 de comprimento completo, a seqüência deste gene foi determinada utilizando o método de marcação do terminador com corante e um seqüenciador de DNA Perkin Elmer ABI Prism-377. Ambos os filamentos codificadores e não-codificadores foram seqüenciados. A seqüência do quadro aberto de leitura encontrado no fragmento de DNA clonado de uma colônia positiva é mostrada na SEQ ID N°: 1 (isp3-1099E). Foi descoberto que esta seqüência de DNA codifica a nova proteína mostrada na SEQ ID Ns: 2 (ISP3-1099E).

Para mostrar que esta seqüência de DNA é a causa da atividade inseticida observada, a seqüência foi expressa em uma cepa bacteriana e o sobrenadante ou o lisado de células da cepa recombinante foi testado em relação à atividade inseticida em ensaios biológicos com insetos.

Clonagem da seqüência de nucleotídeos que codifica ISP3-327D partindo da cepa BTS00327D O DNA total da cepa BTS00327D foi preparado e parcialmente digerido com Sai/3A. O DNA digerido foi fracionado por tamanho em um gradiente de sacarose.

Os fragmentos variando de 7 kb até 10 kb foram ligados ao vetor de clonagem pUC19l (um derivado do pUC19; Yannisch-Perron e outros, 1985), após a digestão com BamHI e o tratamento do vetor de clonagem com TsAP (fosfatase alcalina termossensível). A mistura de ligação foi então submetida à eletroporação em células de E. coli XL1-Blue. Os transforman-tes foram plaqueados em placas de LB-triacilina contendo X-gal e IPTG e as colônias brancas foram selecionadas para serem utilizadas em experimentos de hibridização em filtro. Os clones de E. coli recombinantes contendo o vetor foram então selecionados com uma sonda marcada com DIG que foi preparada como a seguir. Primeiro, foi realizada uma PCR utilizando as células moldes da cepa BTS00327D. O produto resultante da amplificação foi purificado em gel e clonado em pGEM-T. O plasmídeo resultante foi utilizado como molde em uma reação da PCR utilizando dNTPs marcados com DIG e os mesmos iniciadores que os na primeira reação da PCR. Uma quantidade apropriada deste produto de amplificação foi utilizada em reações de hibridização.

Após a identificação de uma colônia positiva contendo um plasmídeo que porta o gene isp3 de comprimento completo, a seqüência deste gene foi determinada utilizando o método de marcação do terminador com corante e um seqüenciador de DNA Perkin Elmer ABI Prism-377. Ambos os filamentos codificadores e não-codificadores foram seqüenciados. A seqüência do quadro aberto de leitura encontrado no fragmento de DNA clonado de uma colônia positiva é mostrada na SEQ ID N-: 3 (isp3-327D). Foi descoberto que esta seqüência de DNA codifica a nova proteína mostrada na SEQ ID N°: 4 (ISP3-327D).

Para mostrar que esta seqüência de DNA é a causa da atividade inseticida observada, a seqüência foi expressa em uma cepa bacteriana e o sobrenadante ou o lisado de células da cepa recombinante foi testado em relação à atividade inseticida em ensaios biológicos com insetos.

Clonagem da seqüência de nucleotídeos que codifica ISP3-2245J partindo da cepa BTS02245J O DNA total da cepa BTS02245J foi preparado e parcialmente digerido com Sau3A. O DNA digerido foi fracionado por tamanho em um gradiente de sacarose.

Os fragmentos variando de 7 kb até 10 kb foram ligados ao vetor de clonagem pUC19l (um derivado do pUC19; Yannisch-Perron e outros, 1985), após a digestão com BamW e o tratamento do vetor de clonagem com TsAP (fosfatase alcalina termossensível). A mistura de ligação foi então submetida à eletroporação em células de E. coli XL1-Blue. Os transforman-tes foram plaqueados em placas de LB-triacilina contendo X-gal e IPTG e as colônias brancas foram selecionadas para serem utilizadas em experimentos de hibridização em filtro. Os clones de E. coli recombinantes contendo o vetor foram então selecionados com uma sonda marcada com DIG que foi preparada como a seguir. Primeiro, foi realizada uma PCR utilizando as células moldes da cepa BTS02245J. O produto resultante da amplificação foi purificado em gel e clonado em pGEM-T. O plasmídeo resultante foi utilizado como molde em uma reação da PCR utilizando dNTPs marcados com DIG e os mesmos iniciadores que os na primeira reação da PCR. Uma quantidade apropriada deste produto de amplificação foi utilizada em reações de hibridização.

Após a identificação de uma colônia positiva contendo um plasmídeo que porta o gene isp3 de comprimento completo, a seqüência deste gene foi determinada utilizando o método de marcação do terminador com corante e um seqüenciador de DNA Perkin Elmer ABI Prism-377. Ambos os filamentos codificadores e não-codificadores foram seqüenciados. A seqüência do quadro aberto de leitura encontrado no fragmento de DNA clonado de uma colônia positiva é mostrada na SEQ ID N°: 5 (isp3-2245J). Foi descoberto que esta seqüência de DNA codifica a nova proteína mostrada na SEQ ID N°: 6 (ISP3-2245J).

Para mostrar que esta seqüência de DNA é a causa da atividade inseticida observada, a seqüência foi expressa em uma cepa bacteriana e o sobrenadante ou o lisado de células da cepa recombinante foi testado em relação à atividade inseticida em ensaios biológicos com insetos.

Exemplo 4: Expressão recombinante de proteínas ISP3 em E. coli A SEQ ID N2: 1 (isp3-1099E), a SEQ ID N2: 3 (isp3-327D) e a SEQ ID N°: 5 (isp3-2245J) foram subclonadas em um vetor de expressão, sob o controle do promotor cry1 Ab e expressas na cepa de E. coli WK6. Durante a subclonagem, um sítio de restrição Λ/col foi introduzido no códon de início ATG, alterando assim o segundo aminoácido da SEQ ID N2: 2, da SEQ ID N2: 4 e da SEQ ID N2: 6 de Asparagina (Asn) para Aspartato (Asp). A análise de SDS-PAGE de lisados de células de E. coli transformadas mostrou que as proteínas do peso molecular esperado (+ 88 kDa) foram produzidas para cada um dos três genes. Como controles negativos foi utilizado o lisado de células de E. coli WK6 não-transformadas. O lisado de células de culturas de E. coli recombinantes, que expressam isp3-327D e isp3-1099E, foi utilizado em ensaios biológicos com insetos (ensaios de contaminação de superfície) como é descrito no Exemplo 5. Os resultados são resumidos na Tabela 2 abaixo. Os símbolos de positivo indicam mortalidade de insetos significativa em relação ao controle negativo.

Tabela 2: Hz: Helicoverpa zea, Hv: Heliothis virescens, Sf: Spodoptera frugiperda, Dw: Diabrotica virgifera virgifera, Ag: Anticarsia gemmatalis Ensaios biológicos: Hz: Contaminação de superfície na alimentação de Heliothis em placas Costar de 48 cavidades múltiplas, 25 μΐ./cavidade (1 cm2), 18x1L1 por concentração Hv: Contaminação de superfície na alimentação de Heliothis em placas Costar de 24 cavidades múltiplas, 50 pL/cavidade (1 cm2), 20x1 L1 por concentração Sf: Contaminação de superfície na alimentação de littoralis em placas Costar de 48 cavidades múltiplas, 25 pL/cavidade (1 cm2), 18x1L1 por concentração Ag: Contaminação de superfície na alimentação de littoralis em placas Costar de 24 cavidades múltiplas, 50 pL/cavidade (2 cm2), 12x1L1 por concentração Incubação à T: 25 + 1°C; Escore após 7 dias Para a proteína ISP3-327D e a proteína ISP3-1099E, foi encontrada uma mortalidade significativa nos ensaios de contaminação de superfície com Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Spodoptera frugiperda e Anti-carsia gemmatalis. Em adição, o lisado de células não diluído de E. coli expressando ISP3-327D ou ISP3-1099E mostrou mortalidade significativa contra Ostrínia nubilalis (50% (gi) de mortalidade para ISP3-327D, 26% (gi) de mortalidade para ISP3-1099E comparados com 0% de mortalidade pelo controle WK6).

Exemplo 5: Expressão recombinante de proteínas ISP3 em Bt A SEQ ID NQ: 1 (isp3-1099E) e a SEQ ID Ns: 5 foram subclona-das em um vetor bidirecional e expressas em uma cepa de Bt que não produz cristal (IPS 78/11 ou Berliner 1715cry ). Nos ensaios biológicos, o sobre-nadante da cepa Bt não-transformada é utilizado como o controle negativo. O sobrenadante de cultura isento de células da cepa Bt recombinante é testado em relação à toxicidade contra larvas de insetos Lepidóp-teros, particularmente contra H. virescens, H. zea, H. armigera, O. nubilalis, S. frugiperda, Agrotis ipsilon, Pectinophora gossypiella e A. gemmatalis, utilizando um ensaio de contaminação de superfície como descrito anteriormente (Exemplo 2) e abaixo (para determinar os valores de LC5o). O sobrenadante da cepa de Bt recombinante é obtido como a seguir. A cepa de Bt é cultivada durante a noite em placas de LB com ágar contendo eritromicina (20 pg/mL) a 28°C. Para culturas em pequena escala, 20 mL de meio TB contendo eritromicina (20 pg/mL) são inoculados e cultivados durante 65 horas a 28°C em uma plataforma giratória que possui aproximadamente 70 rotações por minuto. Após 65 horas, uma mistura de inibidores de proteases é adicionada à cultura. Este coquetel possui os ingredientes a seguir (os volumes fornecidos são os necessários para serem adicionados em uma cultura de 20 ml_): 200 μΙ_ de PMSF (100 mM), 200 μΙ_ de uma mistura de benzamidina.HCI (100 mM)/ácido epsilon-amino-n-capróico (500 mM), 400 μΙ_ de EGTA (0,5 M), 40 μΙ_ de antipaína (0,5 mg/mL)/leupeptina (0,5 mg/mL) e 20 μΙ_ de beta-mercaptoetanol (14 M). O meio de cultura ao qual a mistura de inibidores de proteases foi adicionada, é então centrifugado durante 20 minutos a 3000 rpm. Em alguns casos, o sobrenadante é concentrado aproximadamente 4 vezes utilizando centriprep YM-10 Centrifugai Filter Devices (NQ de Cat. da Millipore 4305).

Para Helicoverpa zea e Heliothis virescens é utilizada a dieta artificial a seguir no ensaio de contaminação de superfície: água 1 litro, ágar 20 g, farinha de soja 81 g, gérmen de trigo 36 g, mistura de sais de Wesson 10 g, sacarose 14,7 g, Nipagina 1 g, ácido sórbico 1,1 g, mistura de vitaminas Vanderzant 9,5 g, óleo de milho 5 mL, Nistatina 0,06 g, Aureomicina 0,17g.

Nos ensaios de contaminação de superfície para outros insetos lepidópteros, é utilizada a dieta artificial a seguir: água 1 litro, ágar 20 g, farinha de milho 112 g, gérmen de trigo 28 g, levedura 30 g, ácido sórbico 1,2 g, Nipagina 1 g, Aureomicina 0,06 g, Nistatina 0,03 g, ácido ascórbico 4,8 g. A dieta artificial é dispensada nas cavidades de placas de 24 cavidades múltiplas Costar e foi permitido que solidificasse. 50 μΙ_ de sobrenadante diluído foram aplicados sobre a superfície de cada cavidade (2 cm2). Uma ou duas larvas neonatais (L1; primeiro instar) são colocadas em cada cavidade (dependendo da espécie, por exemplo, para O. nubilalis 2 larvas/cavidade) e aproximadamente 20 até 24 larvas são utilizadas por diluição do sobrenadante. Seis até oito diluições do sobrenadante (o fator de diluição é aproximadamente 3), variando de aproximadamente 4050 até 0,1 ng/cm2 são testadas. As placas são mantidas a 25 + 1°C e as taxas de mortalidade (porcentagem de larvas mortas versus vivas) são registradas após 7 dias. Como um controle negativo a dieta padronizada e o TB são utilizados. Os valores de LC50 e/ou os valores de LC90 são calculados com a análise de probit utilizando o programa POLO PC (de LeOra Software, 1987, Berkely, Califórnia). O valor de LC50 é a concentração total de proteínas no sobrena-dante quando 50% das larvas de insetos são mortas Os ensaios biológicos mostram que as proteínas codificadas por cada uma das seqüências isp3-1099E e isp3-2245J clonadas causam uma atividade inseticida significativa contra os insetos Lepidópteros selecionados. A SEQ ID N-: 3 (isp3-327D) foi subclonada em um vetor bifunci-onal e expressa na cepa Bt que não produz cristais IPS78/11. Nos ensaios biológicos, o sobrenadante da cepa Bt não-transformada foi utilizado como o controle negativo. A análise de SDS-PAGE mostrou que o sobrenadante de cultura continha uma proteína com um peso molecular próximo ao peso molecular calculado da proteína ISP3-327D (+ 88 kDa).

Utilizando o ensaio de contaminação de superfície como é descrito no Exemplo 2, o sobrenadante de cultura isento de células da cepa de Bt IPS78/11 que expressa a SEQ ID N°: 3 (isp3-327D) mostrou atividade inseticida significativa contra Ostrinia nubilalis (On), Pectinophora gossypiella (Pg) e Helicoverpa zea (Hz), como é mostrado na Tabela 3.

Tabela 3: gi: inibição do crescimento de larvas/Dw: Diabrotica virgifera virgifera Ensaios Biológicos: Os ensaios de contaminação de superfície, como descritos anteriormente, utilizando 0 sobrenadante concentrado após 26 horas de cultura em TB e seguidos da adição do coquetel de inibidores de proteases. A dieta artificial de Heliothis (como acima) foi utilizada para H. zea e a dieta artificial para littoralis para O. nubillalis e P. gossypiella. Para H. zea e O. nubialis foram utilizadas placas Costar de 48 cavidades, 25 pL/cavidade (1 cm2), 18 cavidades com uma larva L1 por cavidade. Para P. gossypiella foram utilizadas placas Costar de 24 cavidades, 50 pL/cavidade (2 cm2) e 12 cavidades com duas larvas L1 por cavidade. A dieta artificial para Dw (como acima) foi utilizada para Dw em placas de 24 cavidades, 50 pL/cavidade (2 cm2), 6 cavidades com 4 L1/cavidade. O ensaio biológico mostrou que a proteína codificada pela se-qüência clonada isp3-327D possuía atividade inseticida significativa contra os insetos Lepidópteros selecionados.

Exemplo 6: caracterização adicional da ISP3-327D O sobrenadante da cepa de Bt que não produz cristal IPS78/11 expressando a SEQ ID N-: 3 (isp3-327D) foi utilizado para testar a capacidade de digestão pela tripsina da proteína ISP3-327D e a toxicidade dos fragmentos resultantes. O tratamento com a tripsina do sobrenadante da cultura de IPS78/11 transformada resultou em duas bandas maiores de aproximadamente 65 kDa e aproximadamente 23 kDa, que são determinadas através da análise de SDS-PAGE.

Tanto o sobrenadante tratado com tripsina (4 horas de tratamento; a reação foi interrompida com PMSF de uma concentração final de 0,1 mM) quanto o sobrenadante que não foi tratado com tripsina foram utilizados nos ensaios de contaminação de superfície contra Helicoverpa zea. O ensaio de contaminação de superfície foi realizado no alimento de heliothis em placas de 48 cavidades múltiplas (25 pL/cavidade; 1 cm2). Foram testadas seis diluições do sobrenadante. Por diluição foram utilizadas 18 cavidades e uma larva L1 por cavidade. A mortalidade foi avaliada após a incubação a 25° + 1°C após 7 dias.

Os valores de LC50 para a proteína ISP3-327D não tratada e tratada com tripsina mostrou intervalos de confiança com 90% de sobreposição, mostrando que a proteína tratada com tripsina mantém a atividade tóxica contra H. zea.

Exemplo 7: Ensaios biológicos com insetos do arroz de proteínas ISP3 re-combinantes As seqüências para isp3-1099E (SEQ ID N°: 1), isp3-327D (SEQ ID N°: 3) e isp3-2245J (SEQ ID N°: 5) foram expressas em E. coli como é descrito anteriormente.

Os lisados de células de E. coli recombinante foram testados em ensaios biológicos com insetos em relação à atividade contra quatro pragas de arroz Lepidópteras. Foram testadas cinco até seis doses por proteína. (a) Ensaio biológico com a Broca Amarela do Caule (Scirpho-phaga incertulas): Adultos da Broca Amarela do Caule foram coletados de campos de arroz. Os ovos colocados pelos adultos foram coletados e mantidos em placas de Petri para eclosão a 30°C. As larvas recém-eclodidas foram utilizadas nos ensaios biológicos.

Bainhas da haste do arroz de 6 cm foram utilizadas. Segmentos de seis centímetros de comprimento das bainhas foliares foram cortados de hastes de arroz recém-cortadas da variedade susceptível TN1. A parte mais interna do segmento, junto com uma cobertura de bainha, foram imersas separadamente em doses de proteínas diferentes durante 30 segundos. A bainha da haste tratada foi imobilizada verticalmente sobre 2 cm de gel de ágar em tubos para amostras (7 cm de comprimento; 2,5 cm de diâmetro). 10-15 larvas neonatais da Broca Amarela do Caule foram adicionadas a cada haste tratada e os tubos foram selados e incubados durante cinco dias. Após 5 dias, os números de larvas sobreviventes e de mortas foram contados. (b) Ensaio biológico com o Dobrador de Folhas (Cnaphalocrocis medinalis)·.

Os insetos foram coletados de campos de arroz no norte da índia. As larvas de insetos foram cultivadas sobre as plantas de arroz na estufa. Os adultos emergentes foram confinados na câmara de oviposição e as plantas que sofreram oviposição foram mantidas em bandejas de água durante a eclosão das larvas. Foram utilizadas larvas de um dia de idade nos ensaios biológicos.

Os ensaios biológicos foram conduzidos em câmaras cilíndricas, utilizando folhas recém-cortadas de plantas de arroz no estágio de formação de grelo. Uma lâmina foliar de 8 cm de comprimento foi cortada da estria central do grelo de arroz. A lâmina foliar foi colocada na câmara e foram aplicadas dosagens de proteínas diferentes. Após 30 minutos, cinco até dez larvas foram adicionadas por folha. Pelo menos três folhas foram utilizadas por dose de proteína. Cinco dias após a incubação, o número de larvas mortas e sobreviventes foi contado. (c) Ensaio biológico com a Broca Cor-de-Rosa do Caule (Sesa-mia inferens): Os insetos foram coletados em campos de arroz no norte da índia e cultivados sobre plantas de arroz.

Os ensaios biológicos foram realizados em frascos de vidro (7,5 cm x 2,5 cm de diâmetro) utilizando uma dieta artificial constituída de pó seco de feijão, levedura de cervejaria, ácido sórbico, ácido ascórbico, metil parabeno, ágar e água. A dieta foi colocada nos frascos até 2 cm de profundidade. Pelo menos três frascos foram preparados por dose de proteína. 40 μΙ_ da dose de teste foram espalhados uniformemente sobre a superfície da dieta em cada frasco e deixados secar durante uma hora. Dez até quinze larvas do primeiro instar da Broca Cor-de-Rosa do Caule foram adicionadas por frasco. Após sete dias o número de larvas mortas e sobreviventes foi contado. (d) Ensaios biológicos com a Broca em Manchas do Caule do Milho (Chilo partellus): Os insetos foram mantidos em uma dieta artificial constituída de pó de feijão vermelho, levedura de cervejaria, ácido sórbico, pó de folha de sorgo, ácido ascórbico, ácido metil para-hidróxi benzóico, vitaminas, óleo de gérmen de trigo, mistura de sais de Wesson, ágar, formaldeído e água. As larvas neonatais destas culturas foram utilizadas nos ensaios biológicos. Os ensaios biológicos foram realizados como descrito para a Broca Cor-de-Rosa do Caule (Sesamia inferens). (e) Resultados dos ensaios biológicos com insetos no arroz Os resultados dos ensaios biológicos, resumidos na tabela 4 abaixo, mostraram que a ISP3-327D e a ISP3-1099E eram altamente tóxicas para quatro pragas Lepidópteras do arroz, a saber, a Broca Amarela do Caule (Scirphophaga incertulas), o Dobrador de Folhas (Cnaphalocrocis me-dinalis), a Broca Cor-de-Rosa do Caule (Sesamia inferens) e a Broca em Manchas do Caule de Milho (Chilo partellus). Ainda, a proteína ISP3-2245J mostrou toxicidade significativa para três pragas lepidópteras do arroz, a saber, a Broca Amarela do Caule (Scirphophaga incertulas), o Dobrador de Folhas (Cnaphalocrocis medinalis) e a Broca Cor-de-Rosa do Caule (Sesamia inferens), enquanto que não foi detectada qualquer toxidade da proteína ISP3-2245J contra a Broca em Manchas do Caule de Milho (Chilo partellus). Tabela 4: YSB: Broca Amarela do Caule, LF: Dobrador de Folhas, PSB: Broca Cor-de-Rosa do Caule, SSB: Broca em Manchas do Caule; os símbolos de positivo (+) indicam mortalidade significativa em relação ao controle negativo.

Exemplo 8: Produção de proteínas ISP3 em plantas transformadas São construídos vetores de expressão que compreendem um promotor que pode ser expresso em plantas, ligado de forma operacional a uma seqüência de DNA que codifica ISP3-1099E, ISP3-327D ou ISP3-2245J (ou um fragmento tóxico ou variação do mesmo) e um sinal de poliadenila-ção a 3'. Uma seqüência líder, tal como a proveniente do gene da proteína de ligação com a clorofila a/b de Petúnia (Harpster e outros, 1988), é inserida a 5' do DNA do isp3. Preferencialmente, o uso de códons do isp3-1099E, do isp3-327D e do isp3-2245J é adaptado ao da planta hospedeira (por exemplo, milho, algodão ou arroz), por exemplo, como é descrito no WO 94/24264.

Os promotores utilizados para controlar os genes isp3 são selecionados dos promotores constitutivos CaMV 35S (Hull e Howell, 1987), o promotor da ubiquitina do milho, o promotor da actina do arroz e o promotor do Vírus Mosaico do Veio da Mandioca. Como a terminação do produto da transcrição a 3' e o sinal de poliadenilação, são utilizados o 3'35S, o 3'nos (Depicker e outros, 1982), 3'ocs ou o gene 7 a 3'. Para a transformação mediada por Agrobacterium, o cassete de expressão é inserido em um vetor de T-DNA, entre as seqüências das bordas à direita e à esquerda. Transformação de plantas de milho (Zea mavs), de algodão (Gossypium hir-sutum ou Gossypium barbadense) e de arroz (Orvza sativa).

As células de milho são transformadas de forma estável através da transformação mediada por Agrobacterium como é descrito na Patente U.S. N- 6.140.553, incorporada aqui como referência. As células de algodão são transformadas de forma estável através da transformação mediada por Agrobacterium como é descrito no WO 00/71733, incorporado aqui como referência. As células de arroz são transformadas de forma estável como é descrito no WO 92/09696.

As células e as plantículas transformadas são regeneradas como é descrito nas referências anteriores. Para as construções que compreendem adicionalmente um gene marcador selecionável, tal como um gene de resistência a um herbicida, por exemplo, o 2mEPSPS (EP 0 508 909 e EP 0 507 698 incorporadas aqui como referência) que confere resistência ao glifosato ou o gene bar ou PAT que confere resistência ao glufosinato de amônio (EP 0 242 236 e EP 0 242 246 incorporadas como referência), as células são cultivadas em meios para seleção contendo o agente seletivo, de forma que a maior parte dos regenerantes selecionados são transformados.

Dos regenerantes, os transformantes que expressam o gene isp3 são selecionados por ELISA, por Southern blot, por Northern blot e/ou pela análise da PCR. Os eventos de transformação, particularmente os eventos de cópia única, são então selecionados para a atividade inseticida para pragas de insetos Lepidópteros (utilizando ensaios biológicos). As plantas contendo o gene quimérico isp3-1099E, isp3-327D ou isp3-2245J mostram maior resistência a insetos lepidópteros comparadas com plantas de controle não-transformadas. Particularmente plantas com altos níveis de tolerância a insetos expressam um alto nível de proteína ISP3 e de mRNA do isp3.

Os transformantes são adicionalmente selecionados em relação às características agronômicas (fenótipo normal, rendimento, arquitetura da planta etc.)· Após os aumentos da semente, são realizados testes de campo de plantas de milho, de algodão ou de arroz transformadas em regiões diferentes onde as pragas de insetos susceptíveis estão presentes, demonstrando que as plantas que expressam as proteínas ISP3 possuem uma tolerância a insetos maior sob condições do campo em ambientes diferentes. Particularmente, após a infestação (artificial ou natural) do campo por pragas de insetos, as perdas de rendimento das plantas transformadas são reduzidas comparadas com plantas de controle não-transformadas.

Para gerar plantas com ampla atividade inseticida, os eventos de expressão de ISP3 são cruzados uns com os outros e com outras plantas transgênicas, que expressam proteínas inseticidas com um espectro inseticida diferente preferencialmente complementar. A progênie dos cruzamentos é analisada em relação à atividade inseticida utilizando ensaios biológicos para uma faixa de pragas de insetos diferentes. As plantas com atividade inseticida contra a faixa de insetos desejada são geradas desta forma.

Esta invenção não está limitada às plantas de milho, algodão, soja ou arroz anteriores, aos métodos de transformação, às construções de vetores (promotor, extremidades a 3' etc.) ou às proteínas ISP3 particulares ou às seqüências de DNA utilizadas. A invenção inclui variações ou equivalentes das proteínas ISP3 que mantêm a atividade inseticida.

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Claims (12)

1. Sequência de ácido nucleico codificando uma proteína inseticida, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência degenerada de SEQ ID NO: 3 da posição de nucleotídeo 598 à posição de nucleotí-deo 1365, em que a referida sequência degenerada codifica a mesma sequência de aminoácidos que SEQ ID NO: 3 da posição de nucleotídeo 598 à posição de nucleotídeo 1365.

2. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo degenerada de SEQ ID NO: 3 codificando a mesma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

3. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a referida proteína é inseticida contra pelo menos uma espécie de insetos selecionada do grupo que consiste em Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugiper-da, Agrotis ipsilon, Pectinophora gossypiella, Scirphophaga incertulas, Cna-phalocrocis medinalis, Sesamia inferens, Chilo partellus e Anticarsia gemma-talis.

4. Gene quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência promotora heteróloga ligada de forma operacional a uma sequência de ácido nucleico compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 3 da posição de nucleotídeo 598 à posição de nucleotídeo 1365, ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos que SEQ ID NO: 3 da posição de nucleotídeo 598 à posição de nucleotídeo 1365.

5. Gene quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência promotora heteróloga ligada de forma operacional a uma sequência de ácido nucleico compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma, codificando a mesma sequência de aminoácidos que SEQ ID NO: 3.

6. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o gene quimérico como definido na reivindicação 4 ou 5.

7. Processo de proteção de uma planta contra danos causados por insetos, caracterizado pelo fato de que compreende colocar a referida planta em contato com uma proteína inseticida, em que a referida proteína possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4.

8. Processo de proteção de uma planta contra danos causados por insetos, caracterizado pelo fato de que compreende integrar o gene qui-mérico, como definido na reivindicação 4 ou 5, no genoma da referida planta.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o referido gene quimérico é integrado por cruzamento de uma planta transgênica compreendendo o referido gene quimérico com outra planta e seleção de sua progênie compreendendo o referido gene quimérico.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida proteína é aplicada externamente à referida planta.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma planta de milho, algodão, soja ou arroz.

12. Cepa de Bacillus thuringiensis transformada, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou o gene quimérico, como definido na reivindicação 4 ou 5.