BRPI0110867B1 - Proteínas inseticidas, proteína híbrida, dna codificando as mesmas, genes quiméricos, processos para controle de insetos e para tornar uma planta resistente a insetos, bem como composição compreendendo as referidas proteínas, e microrganismo - Google Patents

Abstract

"toxinas". foram isoladas novas proteínas inseticidas bacterianas e equivalentes das mesmas. estas proteínas e as seqüências de dna codificando as mesmas são úteis para fabricação de composições inseticidas ou plantas transgênicas para proteger as plantas do dano causado por insetos, especificamente isentos coleópteros.

Description

(54) Título: PROTEÍNAS INSETICIDAS, PROTEÍNA HÍBRIDA, DNA CODIFICANDO AS MESMAS, GENES QUIMÉRICOS, PROCESSOS PARA CONTROLE DE INSETOS E PARA TORNAR UMA PLANTA RESISTENTE A INSETOS, BEM COMO COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO AS REFERIDAS PROTEÍNAS, E MICRORGANISMO (73) Titular: BAYER CROPSCIENCE N.V.. Endereço: B-9000 Gent, Jozef Plateaustraat 22, BÉLGICA(BE) (72) Inventor: ANNEMIE BOETS; GRETA ARNAUT; NICOLE DAMME; JEROEN VAN RIE

Código de Controle: 55DD6C050071AA49 0D9DCB8FF7BFA951

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 03/04/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 03/04/2018

Assinado digitalmente por:

Júlio César Castelo Branco Reis Moreira

Diretor de Patente

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROTEÍNAS INSETICIDAS, PROTEÍNA HÍBRIDA, DNA CODIFICANDO AS MESMAS, GENES QUIMÉRICOS, PROCESSOS PARA CONTROLE DE INSETOS E PARA TORNAR UMA PLANTA RESISTENTE A INSETOS, BEM COMO

COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO AS REFERIDAS PROTEÍNAS, E MlCRORGANISMO.

Campo da Invenção

A presente invenção se refere a novas proteínas inseticidas secretadas (ISPs) isoladas de uma cepa bacteriana, preferivelmente uma cepa da espécie Brevibacillus. mais preferivelmente uma cepa da espécie Brevibacillus laterosporus. que são inseticidas quando ingeridas em combinação com uma proteína complementar de ISP, tal como outra proteína de ISP desta invenção e às sequências de DNA codificando tais proteínas. Estas proteínas são úteis para prevenir ou minimizar o dano causado por inse15 tos, especificamente de vermes de raiz de milho, às plantas em um campo.

A presente invenção também se refere às plantas, especificamente plantas de milho, que se tornam inseticidas, preferivelmente aos insetos coleópteros, especificamente aos insetos das espécies Diabrotica spp., Leptinotarsa spp. e Anthonomus pela expressão de proteínas ISP desta in20 venção nas células das plantas.

A presente invenção também se refere a um processo para controlar o dano causado pelos insetos das espécies Diabrotica spp., Leptinotarsa spp. e Anthonomus. preferivelmente Diabrotica spp., pragas de insetos, especificamente, vermes de raiz de milho, que possui as proteínas ISP da invenção, especificamente as proteínas com a sequência de aminoácido de qualquer uma das SE ID N°s 2, 4, 8 ou 10 ou fragmentos inseticidamente eficazes das mesmas, ingeridos portais insetos.

Descrição da Técnica Anterior

Algumas das pragas mais destrutivas são encontradas entre os besouros Diabroticina. Na América do Norte, as três espécies importantes de vermes de raiz de milho, Diabrotica virqifera (o verme de raiz de milho do Oeste), Diabrotica barberi (o verme de raiz de milho do Norte) e Diabrotica

Segue-se folha 1a

Petição 870170036158, de 30/05/2017, pág. 4/25

1a undecimpunctata howardi (o verme de raiz de milho do Sul) são consideradas como sendo as pragas de insetos mais caras de serem controladas (Metcalf, 1986, Foreword in Methods for the Study of Pest Diabrotica. páginas vii-xv, eds. Krysan, J.L. and Miller, T.A., Springer-Verlag, New York).

Segue-se folha 2 ··

Diabrotica virqifera e Diabrotica barberi são consideradas as pragas de insetos mais sérias do milho na maioria dos estados que produzem milho dos Estados Unidos e Canadá (Levine and Oloumi-Sadeghi, 1991, Annu. Rev. Entomol. 36, 229-55). As larvas alimentam-se das raízes e causam o dano direto no crescimento do milho e nos rendimentos do milho. Os custos com inseticidas de solo para controlar o dano das larvas aos sistemas de raízes do milho e aerossóis para reduzir o dano do besouro às espigas do milho, quando combinados com perdas da colheita, podem aproximar-se de um bilhão de dólares anualmente (Metcalf, 1986, supra). Recentemente, em alguns estados dos Estados Unidos, foi descoberto que o programa de rotação de colheita de plantio de soja após milho perde seu efeito, uma vez que as raízes do milho adaptaram-se a esta situação.

As cepas bacterianas e/ou genes com toxicidade aos vermes de raiz do milho foram descritas nas patentes US 6.023.013; 6.015.553; 6.001.637; 5.906.818 e 5.645.831. Também, as publicações PCT WO 00/09697, WO 99/57282, WO 98/18932, WO 97/40162 e WO 00/26378 referem-se às toxinas e genes que podem ser obtidos do Bacillus ou outra bactéria spp., alguns dos quais são descritos como sendo tóxicos ao verme da raiz de milho. WO 98/44137, WO 94/21795 e WO 96/10083 referem-se as cepas pesticidas de Bacillus. caracterizadas pelas proteínas pesticidas e proteínas auxiliares produzidas durante o crescimento vegetativo, algumas sendo descritas para ter toxicidade ao verme da raiz do milho. A patente US 5.055.293 descreve um processo para controlar os vermes de raiz de milho por inoculação do solo com inclusão paraesporal formando espécies de Bacillus laterosporus.

Orlova e outros (1998, Applied Environmental Microbiol. 64, 2723) mostrou atividade inseticida aos mosquitos associada aos cristais de proteína nas cepas de formação de cristal do Bacillus laterosporus.

Objetivos e Sumário da Invenção

Um objetivo da presente invenção é prover novas proteínas e seqüências de DNA codificando tais proteínas com toxicidade significante aos insetos, preferivelmente insetos Diabrotica sdd.. especificamente verme

de raiz de milho.

Em uma concretização da invenção, é provida uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido da menor toxina ativa da proteína da SE ID N⁹ 2, em que a menor toxina ativa é:

a) um fragmento da proteína da SE ID N⁹ 2, e

b) inseticida para as larvas de Diabrotica virqifera quando ingerida pelas larvas em combinação com a proteína da SE ID N⁹ 4 do aminoácido da posição 51 a 457. É também provida uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido da menor toxina ativa da proteína da SE ID N⁹ 4, em que a menor toxina ativa é:

a) um fragmento da proteína da SE ID N⁹ 4, e

b) inseticida para as larvas de Diabrotica virqifera quando ingerida pelas larvas em combinação com a proteína da SE ID N⁹ 2 do aminoácido da posição 38 a 871.

É especificamente preferida a proteína caracterizada por uma seqüência de aminoácido compreendendo a seqüência da SE ID N⁹ 2 de um aminoácido na posição 38 a um aminoácido na posição 768 a 781, preferivelmente a proteína caracterizada pela seqüência de aminoácido da SE ID N⁹ 2 ou SE ID N⁹ 10; e uma proteína caracterizada por uma seqüência de aminoácido compreendendo a seqüência da SE ID N⁹ 4, a partir do aminoácido na posição 51 para o aminoácido na posição 449 ou 457, preferivelmente uma proteína caracterizada pela seqüência de aminoácido da SE ID N⁹4ou SE ID N⁹ 8.

Um objetivo adicional da invenção é uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido do fragmento de digestão de protease da proteína codificada pelo DNA isp1A depositado no BCCM-LMBP sob o número de acesso LMBP 4009, o fragmento de digestão de protease é inseticida em relação a Diabrotica virgifera. mediante aplicação combinada com a proteína da SEQ ID. No. 4, a partir do aminoácido da posição 51 para o aminoácido na posição 457; e uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido do fragmento de digestão de protease da proteína codificada pelo DNA de isp2A, depositado no BCCM-LMBP sob o número de acesso ··· ···

LMBP 4009, o fragmento de digestão de protease sendo inseticida em relação a Diabrotica virgifera, mediante aplicação combinada com a proteína da SEQ ID N- 2 do aminoácido da posição 38 para o aminoácido da posição 871; especificamente em que o fragmento de digestão de protease é obtido por tratamento com suco intestinal do coleóptero.

É também provida, de acordo com esta invenção, uma seqüência de DNA codificando as proteínas acima, especificamente um DNA compreendendo uma seqüência de DNA artificial possuindo um uso de códon diferente para a seqüência de DNA que ocorre naturalmente, porém codificando a mesma seqüência de proteína, preferivelmente contida em um gene quimérico operavelmente ligado à região promotora expressável da planta (isto é, uma região promotora que é apropriada para expressão nas células da planta, isto pode ser de origem bacteriana, virótica ou da planta ou pode ser fabricado artificialmente); especificamente uma região promotora que é preferivelmente ativa no tecido da raiz.

Em uma concretização da invenção, o promotor no gene quimérico compreende a seqüência de DNA da SE ID N^Q 5 ou 6 ou um DNA hibridizando em relação ao mesmo, sob condições de hibridização estringentes.

Em uma concretização adicional desta invenção, o gene quimérico adicionalmente compreende um peptídeo de sinal para secreção da célula ou para alcançar o alvo em relação ao organelo celular, especificamente um peptídeo de trânsito de cloroplasto.

Também é provida uma célula de planta, uma planta ou uma semente, compreendendo quaisquer um destes genes quiméricos integrados em suas células, especificamente uma combinação do gene quimérico codificando o ISP1A ou um fragmento inseticidamente eficaz do mesmo e o gene quimérico codificando a proteína ISP2A, ou um fragmento inseticidamente eficaz do mesmo; especialmente uma célula de milho, planta ou semente.

Em outra concretização desta invenção, é provido um microorganismo transformado para conter quaisquer das seqüências de DNA.

Também é provido um processo para controle dos insetos, especificamente um processo para tornar a planta resistente aos insetos co-

leópteros, compreendendo expressão de qualquer uma das proteínas ISP desta invenção nas células de uma planta e regenerando as plantas transformadas das células que são resistentes aos insetos. Em tal processo, o inseto é preferivelmente selecionado do grupo consistindo em: vermes de raiz, gorgulhos, besouros de batatas, espécies Diabrotica. Anthonomus spp., Leptinotarsa spp., Aqelastica alni, Hypera postiça. Hypera brunneioennis. Haltica tombacina, Anthonomus qrandis. Tenebrio molitor, Triboleum castaneum, Dicladispa armiqera. Trichispa serica, Oulema orvzae. Colaspis brunnea. Lissorhorptrus orvzophilus. Phvllotreta cruciferae. Phvllotreta striolata. Psylliodes punctulata. Entomoscelis americana. Meliqethes aeneus. Ceutorynchus sp., Psylliodes chrysocephala. Phvllotreta undulata. Leptinotarsa decemlineata. Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata. Diabrotiça undecimpunctata howardi. Diabrotica barberi e Diabrotica virqifera.

Ainda outro objetivo da presente invenção é prover um processo para tornar as plantas inseticidas contra Coleópteros e um processo para controlar Coleópteros compreendendo o plantio, semeadura ou crescimento em um campo de plantas transformadas com seqüências de DNA codificando as proteínas de ISP da invenção, especificamente plantas de milho. Em uma concretização desta invenção, as proteínas de ISP são combinadas com outras proteínas inseticidas ou combinações de proteínas, preferivelmente proteínas toxinas aos vermes da raiz de milho.

Também são providos, de acordo com esta invenção, equivalentes ISP1A ou ISP2A, preferivelmente de uma cepa Brevibacillus laterosporus. especificamente de uma cepa Brevibacillus laterosporus não formando inclusões cristalinas. Tais equivalentes preferivelmente possuem pesos moleculares de cerca de 95 a cerca de 100 kD para equivalentes ISP1A e cerca de 45 a cerca de 50 kD para equivalentes ISP2A, conforme determinado na eletroforese de gel SDS-PAGE padrão 8-10% usando marcadores de peso molecular apropriados.

Descrição Detalhada das Concretizações Preferidas da Invenção

De acordo com esta invenção, novas toxinas bacterianas e seqüências de DNA codificando as mesmas foram isoladas e caracterizadas.

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As novas proteínas foram designadas ISP1A e ISP2A, e as seqüências de DNA codificando as mesmas isp1A e isp2A.

De acordo com esta invenção, proteína ISP1A refere-se a qualquer proteína compreendendo o menor fragmento de proteína da seqüência de aminoácido da SE ID N² 2 que mantém a atividade inseticida, especificamente aos insetos coleópteros, mais especificamente aos vermes de raiz de milho, gorgulho do algodão e besouro de batata Colorado, preferivelmente a Diabrotica spp., especialmente ao verme de raiz de milho do Sul, do Oeste e do Norte, especificamente a Diabrotica virqifera. mediante ingestão combinada por um inseto com uma proteína complementar a ISP apropriada, especificamente a proteína ISP2a madura. Isto inclui qualquer proteína com uma seqüência de aminoácido compreendendo a seqüência de aminoácido do aminoácido na posição 32 ou 38, preferivelmente 38, a um aminoácido na posição 768 ao aminoácido na posição 871 na SE ID N² 2, especificamente qualquer proteína com uma seqüência de aminoácido compreendendo pelo menos a seqüência de aminoácido da SE ID N² 2 do aminoácido na posição 38 ao aminoácido na posição 768. Isto também inclui a proteína obtida da seqüência de aminoácido da SE ID N² 2 por divagem de parte ou toda a seqüência de peptídeo de sinal terminal N ou a proteína em que a seqüência de peptídeo de sinal foi substituída por outra, por exemplo, uma planta, um peptídeo alvo, um aminoácido de metionina ou um dipeptídeo de metionina-alanina. Especificamente isto inclui a proteína compreendendo um peptídeo de sinal procariótico ou eucariótico, de terminal N, por exemplo de bactéria ou planta para secreção ou obtenção do alvo. Isto também inclui proteínas híbridas ou quiméricas compreendendo o menor fragmento de proteína tóxica, por exemplo, um híbrido entre uma proteína ISP1A e ISP2A desta invenção. Adicionalmente, incluídos na designação ISP1A, conforme usado aqui, encontram-se também os fragmentos resistentes a protease da proteína ISP1A mantendo a atividade inseticida obtida por tratamento com suco intestinal de inseto, preferivelmente, suco intestinal de coleóptero, especificamente proteases de intestino de coleóptero, preferivelmente proteases de vermes de raiz de milho, por exemplo, cis··

teína proteinases, serina proteinases, tripsina, quimiotripsina proteases ou semelhantes a tripsina. Especificamente, o coleóptero é selecionado do grupo consistindo em: vermes de raiz de milho, gorgulho de algodão e besouro de batata Colorado, Diabrotica spp., Diabrotica virqifera, Diabrotica barberi, Diabrotica undecimpuncata. Leptinotarsa decemlineata e Anthonomus qrandis. Em uma concretização preferida desta invenção, uma proteína ISP1A de acordo com esta invenção não é inseticida quando ingerida em isolamento sem provisão simultânea ou seqüencial de uma proteína complementar ISP, tal como, proteína ISP2A.

De acordo com esta invenção proteína ISP2A refere-se a qualquer proteína compreendendo o menor fragmento de proteína da seqüência de aminoácido da SE ID N⁹ 4 que mantém a atividade inseticida, especificamente para os isentos coleópteros, mais especificamente ao verme de raiz de milho, gorgulho de algodão e besouro de batata Colorado, preferivelmente Diabrotica spp., especialmente Diabrotica virqifera, Diabrotica barberi, Diabrotica undecimpuncata, mediante ingestão combinada por um inseto com uma proteína complementar ISP apropriada, especificamente a proteína ISP1A madura. Isto inclui qualquer proteína com uma seqüência de aminoácido compreendendo a seqüência de aminoácido do aminoácido na posição 43 ou 51, preferivelmente 51, ao aminoácido na posição do aminoácido na posição 449 à posição 457 na SE ID N⁹ 4, especificamente qualquer proteína com uma seqüência de aminoácido compreendendo pelo menos a seqüência de aminoácido da SE ID N⁹ 4 do aminoácido da posição 51 à posição 449. Isto também inclui a proteína obtida da seqüência de aminoácido da SE ID N⁹ 4 por divagem de parte ou toda a seqüência de peptídeo de sinal terminal N da proteína, e a proteína em que o peptídeo de sinal foi substituído por outro, por exemplo, uma planta, um peptídeo alvo, um aminoácido de metionina ou um dipeptídeo de metionina-alanina. Especificamente isto inclui a proteína compreendendo um peptídeo de sinal procariótico ou eucariótico, de terminal N, por exemplo de bactéria ou planta para secreção ou obtenção do alvo. Isto também inclui proteínas híbridas ou quiméricas compreendendo o menor fragmento de proteína tóxica, por %

exemplo, um híbrido entre uma proteína ISP1A e ISP2A desta invenção. Adicionalmente, incluídos na designação ISP1A, conforme usado aqui, encontram-se também os fragmentos resistentes a protease da proteína ISP1A mantendo a atividade inseticida obtida por tratamento com suco intestinal de inseto, preferivelmente, intestinal de coleóptero, especificamente proteases de intestino de coleóptero, por exemplo, cisteína proteinases, serina proteinases, tripsina, quimiotripsina proteases ou semelhantes a tripsina. Em uma concretização preferida desta invenção, uma proteína ISP2A de acordo com esta invenção não é inseticida quando ingerida em isolamento sem provisão simultânea ou seqüencial de uma proteína complementar ISP, tal como, proteína ISP1A.

Uma proteína complementar a ISP conforme usada aqui, refere-se a uma proteína, incluindo porém não limitado a proteína de ISP1A ou ISP2A madura, que em combinação com uma das proteína ISP desta invenção, é inseticida quando da ingestão por um inseto, especificamente um inseto coleóptero, preferivelmente um verme de raiz de milho, um gorgulho de algodão ou besouro de batata Colorado, mais especificamente Diabrotica virqifera. Diabrotica barberi, Diabrotica undecimpuncata ou Anthonomus grandis. Especificamente, também proteínas de VIP e fragmentos ativos das mesmas, especificamente as proteínas de VIP maduras com suas seqüências de sinal não-clivadas, conforme descrito no WO 98/44137, WO 94/21795 e WO 96/10083 são proteínas complementares de ISP de acordo com esta invenção. Uma proteína complementar de ISP para a proteína ISP1A é de forma ideal a proteína ISP2A ou a proteína VIP2Aa ou VIP2Ab ou fragmentos ativos das mesmas (tais como, as proteínas maduras com as seqüências de sinal removidas) conforme descrito na patente US 5.990.383 ou qualquer proteína secretada bacteriana que possui uma identidade de seqüência de pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 75%, especificamente pelo menos 85% a qualquer uma das proteínas ISP2 ou VIP2, e que é inseticida quando ingerida por um inseto, preferivelmente um inseto coleóptero, especificamente um verme de raiz de milho, em combinação com a proteína ISP1A madura. Uma proteína complementar de ISP para a

proteína ISP2A é de modo ideal a proteína ISP1A madura, a proteína VIPIAa ou VIPIAb ou fragmentos ativos dos mesmos (tais como a proteína madura com o peptídeo de sinal removido) conforme descrito na patente US 5.990.383 ou qualquer proteína secretada bacteriana que possui uma identidade de seqüência de pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 75%, especificamente pelo menos 85% com relação a qualquer uma das proteínas ISP1 ou VIP1 e que é inseticida quando ingerida por um inseto, preferivelmente um inseto coleóptero, especificamente um verme de raiz de milho, em combinação com a proteína ISP2A madura. Para evitar dúvidas, uma proteína complementar de ISP e uma proteína ISP são sempre proteínas diferentes.

Em uma concretização preferida desta invenção, as proteínas de ISP desta invenção ou seus equivalentes, quando usadas em isolamento, isto é, sem quaisquer proteínas ISP complementares presentes, não resultam em qualquer atividade inseticida significante, preferivelmente para larvas de verme de raiz de milho, especificamente para Diabrotica virqifera. quando testadas em um ensaio de contaminação de superfície na dieta de inseto padrão, e isto a uma concentração em que as proteínas (cada uma aplicada naquela concentração) em combinação resultam em 100% de mortalidade, preferivelmente para as larvas de verme de raiz de milho, especificamente para Diabrotica virqifera. Especificamente, as proteínas ISP1 desta invenção não fornecem mortalidade significante (isto é, nenhuma diferença com os controles usando uma solução tampão sozinha) para larvas de Diabrotica virqifera quando apenas uma proteína de ISP1 é aplicada a uma concentração de 70 ng/cm² em um ensaio de contaminação de superfície usando dieta de verme de raiz de milho padrão, e as proteínas de ISP2 desta invenção não oferecem mortalidade significativa (isto é, nenhuma diferença com os controles usando uma solução de tampão sozinha) para larvas Diabrotica virqifera quando apenas uma proteína de ISP2 é aplicada a uma concentração de 36 ng/cm² em um ensaio de contaminação de superfície usando dieta de verme de raiz de milho, enquanto as proteínas ISP1 e ISP2 aplicadas em conjunto nestas concentrações no mesmo tipo de ensaio

fornecem 100% de mortalidade a estas larvas.

Conforme usado aqui, equivalente ISP1A ou equivalente ISP2A refere-se a uma proteína com a mesma ou substancialmente a mesma toxicidade ao inseto alvo, como a proteína ISP1A ou ISP2A, respectivamente, quando aplicada a tal inseto alvo, preferivelmente quando ingerida por tal inseto, em uma combinação binária com uma proteína complementar ISP e substancialmente com a mesma seqüência de aminoácido que a proteína ISP1A ou ISP2A, respectivamente. Também incluídas na definição de equivalentes de ISP1A ou ISP2A estão as proteínas bacterianas respectivamente de 45 a cerca de 50 kD e cerca de 95 a cerca de 100 kD de peso molecular, conforme determinadas por eletroforese de gel SDS-PAGE de 8-10% padrão, preferivelmente de uma cepa Brevibacillus laterosporus. especificamente de uma cepa Brevibacillus laterosporus. não formando inclusões cristalinas, as proteínas em combinação porém não em isolamento, possuem atividade inseticida significativa para as larvas dos vermes de raiz de milho.

O uso dos termos em combinação, quando refere-se a aplicação de uma proteína ISP (ou seu equivalente) e uma proteína complementar de ISP a um inseto alvo para obter um efeito inseticida, inclui a aplicação simultânea (isto é, na mesma alimentação, células ou tecido e aplicada ou ingerida por um inseto no mesmo momento) e a aplicação separada, seqüencial (isto é, aquela provida após a outra, porém não aplicada ou ingerida ao mesmo tempo) de uma proteína de ISP (ou seu equivalente) e uma proteína complementar ISP desta invenção, à medida que estas proteínas são encontradas em conjunto no intestino do inseto de cada vez. A proteína de ISP1A desta invenção seria assim expressa em um determinado tipo de células ou uma determina zona nas raízes de uma planta, enquanto a proteína ISP2A desta invenção seria expressa em outro tipo de células ou outra zona nas raízes da mesma planta, de modo que as proteínas apenas interagirão uma vez que o material de raiz for ingerido. Também é incluída aqui a expressão de uma proteína de ISP ou seu equivalente nas raízes de uma planta, especificamente uma planta de milho, e a expressão de uma proteína complementar de ISP em bactérias associadas a raiz, tais como, cepas rhizobacteria (ou vice-versa).

A mesma toxicidade a um inseto alvo com relação a uma proteína de ISP ou uma proteína equivalente a ISP conforme usado aqui, significa que a mortalidade média da proteína de ISP, em presença de uma proteína complementar de ISP apropriada não é significativamente diferente da mortalidade média do equivalente de ISP, também em presença da mesma proteína complementar de ISP apropriada. Especificamente, isto refere-se a situação em que os limites fiduciários de 95% do LC50 da proteína de ISP (quando testados em presença de uma proteína complementar de ISP apropriada) sobrepõem-se aos limites fiduciários de 95% de LC50 do equivalente de ISP (quando testados em presença de uma proteína complementar de ISP apropriada).

Substancialmente, a mesma toxicidade a um inseto alvo, conforme usado aqui refere-se a uma proteína de ISP e uma proteína equivalente de ISP, refere-se aos níveis de mortalidade média de tais proteínas para um inseto alvo que são significativamente diferentes entre a proteína ISP e a proteína equivalente a ISP, porém que estão dentro de uma faixa de atividade inseticida que é útil para controlar ou matar o inseto alvo relevante, preferivelmente quando tal proteína é expressa em uma planta. Em uma concretização preferida desta invenção, as proteínas que possuem substancialmente a mesma toxicidade ao inseto alvo quando seus valores de LC50 para tal inseto alvo são os mesmos (replicados) no ensaio in vitro conduzido nas mesmas condições de ensaio diferem uma da outra em um fator de 2 a 100, preferivelmente 2 a 50, especificamente 2 a 20 e mais preferivelmente de 2 a 10.

Também, aminoácidos funcionalmente análogos podem ser usados para substituir determinados aminoácidos em uma proteína ISP1A ou ISP2A para obter equivalentes ISP1A ou ISP2A. Por exemplo, um ou mais aminoácidos dentro da seqüência podem ser substituídos por outros aminoácidos de uma polaridade semelhante que atuam como um equivalente funcional, resultando em uma alteração com relação a funcionalidade

• · · · ··· da proteína. Substitutos para um aminoácido dentro da seqüência podem ser selecionados de outros elementos da classe a qual o aminoácido pertence. Por exemplo, os aminoácidos não-polares (hidrófobos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina. Os aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina. Os aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina e histidina. Os aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. As proteínas em que as substituições de aminoácidos conservadoras são feitas usando aminoácidos da mesma classe indicada acima que retém substancialmente a mesma atividade inseticida em relação ao inseto alvo em comparação à proteína original estão incluídas aqui como equivalentes das proteínas de ISP desta invenção.

Uma proteína substancialmente a mesma seqüência de aminoácido em relação a uma proteína de ISP1A, conforme usado aqui, refere-se a uma proteína com pelo menos 90%, especificamente pelo menos 95%, preferivelmente pelo menos 97% de identidade de seqüência com a proteína ISP1A, em que a porcentagem da identidade da seqüência é determinada por uso da matriz de classificação blosum62 no programa GAP do pacote Wisconsin da GCG (Madison, Wisconsin, USA) versão 10.0 (GCG defaults usado). Identidade da seqüência conforme usado através de todo este pedido, quando relacionada às proteínas, refere-se à porcentagem de aminoácidos idênticos usando esta análise específica. A identidade da seqüência, conforme usada aqui, quando relacionada às seqüências de DNA, é determinada por uso da matriz de classificação nwsgapdna no programa GAP do pacote Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin, USA) versão 10,0 (GCG defaults usado).

Proteína de ISP ou proteína de ISP desta invenção, conforme usado aqui, refere-se a qualquer uma das novas proteínas desta invenção e identificadas aqui como proteína de ISP1A ou ISP2A ou seus equivalentes. Uma pró-toxina de ISP refere-se ao comprimento pleno da proteína ISP1A ou ISP2A conforme ela é codificada pela seqüência de DNA bacteri-

• ·

ana ocorrendo naturalmente, incluindo o peptídeo de sinal. Uma toxina de ISP refere-se a um fragmento inseticida da mesma, especificamente o menor fragmento tóxico da mesma ou a proteína madura com o peptídeo de sinal removido. Uma ISP madura, conforme usado aqui, refere-se a proteína de ISP desta invenção conforme secretada por sua célula hospedeira bacteriana nativa que é inseticidamente ativa em combinação com uma proteína complementar de ISP (sem a seqüência de peptídeo de sinal bacteriana de terminal N). Uma proteína de ISP madura pode ter um terminal N nativo completo ou pode ter uma truncagem no terminal C.

Também incluída nesta invenção como proteína de ISP encontra-se uma primeira proteína com um peso molecular aparente de sua forma madura de cerca de 95 a cerca de 100 kD, especificamente de cerca de 100 kD, que é secretada por uma bactéria, preferivelmente uma bactéria que não seja a B. thurinqiensis ou B.cereus, especificamente uma bactéria que seja Brevibacillus laterosporus, ou fragmentos isenticidamente eficazes da primeira proteína, caracterizada por uma atividade inseticida significante quando combinada com uma segunda proteína com um peso molecular aparente de sua forma madura de cerca de 45 a cerca de 50 kD, preferivelmente cerca de 45 kD, que é secretada por uma bactéria, preferivelmente uma bactéria que não seja a B. thurinqiensis ou B.cereus. especificamente uma bactéria que seja Brevibacillus laterosporus. ou fragmentos isenticidamente eficazes da segunda proteína, em que a combinação das primeira e segunda proteínas ou seus fragmentos inseticidas, seja significativamente inseticida para as larvas do besouro de batata Colorado, o verme de raiz de milho do Oeste, o verme de raiz de milho do Sul e o verme de raiz de milho do Norte, quando ingerida pelos insetos e em que a combinação da proteína não é significativamente inseticida para Ostrinia nubiialis. Spodoptera fruqiperda. Heliothis virescens, Helicoverpa zea e Sesamia nonaqroides. quando ingerida pelos insetos e em que a primeira proteína sozinha não possui atividade inseticida significativa quando ingerida por um inseto. Também incluída aqui encontra-se a segunda proteína, conforme descrita acima, que é inseticida quando ingerida por um inseto em combinação com a primeira ··· proteína descrita acima.

Peso molecular aparente conforme usado aqui, é o peso molecular conforme evidenciado por análise SDS-PAGE mediante comparação com padrões de peso molecular. Como apreciado por um versado na técnica, este peso molecular é uma determinação aproximada e pode ter uma faixa de variação de cerca de 10-15% com relação ao peso molecular real, conforme determinado com base na seqüência de aminoácido.

Conforme usado aqui, os termos DNA de isp1A ou DNA de isp2A referem-se a qualquer seqüência de DNA codificando a proteína de ISP1A ou ISP2A, respectivamente, conforme definido acima. Isto inclui seqüências de DNA artificiais ou sintéticas ocorrendo naturalmente codificando as proteínas isoladas recentemente ou seus fragmentos, conforme definido acima, especificamente seqüências de DNA com um uso de códon modificado adaptado para combinar mais de perto com o uso do códon de uma planta. Exemplos de seqüências de DNA artificiais codificando uma proteína ISP1A e ISP2A são mostradas na SE ID N²s 9 e 7, respectivamente (as proteínas de ISP codificadas por estas seqüências de DNA são definidas aqui como ISP1A-1 e ISP2A-1). Também encontram-se incluídas aqui as seqüências de DNA codificando proteínas inseticidas que são semelhantes o bastante à seqüência de DNA das SE ID N^es. 1, 3, 7 ou 9, de modo que elas podem (isto é, tem a capacidade de) hibridizar com relação àquelas seqüências de DNA sob condições de hibridização estringentes. Condições de hibridização estringentes conforme usado aqui, refere-se especificamente às condições que se seguem, em que a hibridização é ainda obtida: imobilização de uma primeira seqüência de DNA nos filtros, e préhibridização dos filtros por 1 a 2 horas em formamida a 50%, SSPE a 5%, reagente de Denhardt 2x e SDS a 0,1% a 42°C ou 1 a 2 horas em SSC 6x, reagente de Denhardt 2x e SDS a 0,1% a 68°C. O segundo DNA radiorrotulado desnaturado é então adicionado diretamente ao fluido de préhibridização e a incubação é realizada por 16 a 24 horas em uma das temperaturas selecionadas acima. Após incubação, os filtros são então lavados por 20 minutos a temperatura ambiente em 1 x SSC, 0,1% SDS, seguido por • ·4

* *• « « • «» «· ·« ί t * · ♦ * • · » ·» ··* três lavagens de 20 minutos cada a 68°C em SSC a 0,2x e SDS a 0,1%. Uma auto-radiografia é estabelecida por exposição dos filtros por 24 horas a 48 horas a um filme de raio X(Kodak XAR-2 ou equivalente) a -70°C com uma tela de intensificação. Naturalmente, condições equivalentes e parâmetros podem ser usados neste processo, enquanto ainda retendo as condições de hibridização estringentes desejadas. Conforme usado aqui, hibridização estringente preferivelmente ocorre entre as seqüências de DNA com pelo menos 90 a 95%, preferivelmente pelo menos 97%, especificamente 99% de identidade de seqüência.

Também encontram-se incluídas na definição de DNA de isp1 todas as seqüências de DNA codificando uma proteína com uma identidade de seqüência de pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95%, especificamente pelo menos 97%, mais preferivelmente pelo menos 99% com a proteína da SE ID N² 2 e que possui substancialmente a mesma, preferivelmente a mesma, identidade inseticida da proteína da SE ID N² 2, em que a identidade da seqüência de proteína é determinada por uso da matriz de classificação blosum62 no programa GAP do pacote de Wiconsin de GCG (Madison, Wisconsin, USA) versão 10.0 (GCG defaults usado). Incluídas na definição de DNA de isp2 encontram-se todas as seqüências de DNA codificando uma proteína com uma identidade de seqüência de pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95%, especificamente pelo menos 97%, mais preferivelmente pelo menos 99%, com a proteína da SEQ ID N² 4 e que possui substancialmente a mesma, preferivelmente a mesma, atividade inseticida da proteína da SEQ ID N² 4, em que a identidade da seqüência de proteína é determinada por uso da matriz de classificação blosum62 no programa GAP do pacote de Wiconsin de GCG (Madison, Wisconsin, USA) versão 10.0 (GCG defaults usado).

Um gene de isp ou DNA de isp conforme usado aqui é uma seqüência de DNA codificando uma proteína de ISP de acordo com esta invenção, referindo-se a qualquer uma das seqüências de isp1A ou isp2A definidas acima.

Um equivalente de DNA isp ou um equivalente de gene isp ·>. · ·« conforme suado aqui, é um DNA codificando uma proteína equivalente ISP conforme definido acima.

Os termos DNA/proteína compreendendo a seqüência X e DNA/proteína com a seqüência compreendendo a seqüência X conforme usado aqui, refere-se a um DNA ou proteína incluindo ou contendo pelo menos a seqüência X no seu nucleotídeo ou seqüência de aminoácido, de modo que outros nucleotídeos ou seqüências de aminoácido podem estar incluídas na extremidade 5' (ou terminal N) e/ou 3' (ou terminal C), por exemplo, um peptídeo de sinal ou de trânsito de terminal N. O termo compreendendo conforme usado aqui, é uma linguagem codificada aberta no significado de incluindo, significando que outros elementos além daqueles especificamente citados podem também estar presentes. O termo consistindo em, conforme usado aqui, é de linguagem codificada fechada, isto é, apenas aqueles elementos especificamente citados estão presentes. O termo DNA codificando uma proteína compreendendo a seqüência X conforme usado aqui, refere-se ao DNA compreendendo uma seqüência de codificação que após transcrição e tradução resulta em uma proteína contendo pelo menos uma seqüência de aminoácido X. Um DNA codificando uma proteína não precisa ser um DNA ocorrendo naturalmente, e pode ser um DNA completamente sintético ou artificial, semi-sintético e pode incluir íntrons e regiões de flanqueamento 5' e/ou 3'. O termo seqüência de nucleotídeo conforme usado aqui, refere-se a seqüência de uma molécula de DNA ou RNA, que pode estar em uma forma de filamento simples ou duplo.

O termo gene, conforme usado aqui refere-se a uma região de codificação de DNA flanqueada por seqüências reguladoras 5' e/ou 3' permitindo que um RNA seja transcrito, que pode ser traduzido para uma proteína, tipicamente compreendendo pelo menos uma região promotora. Um gene quimérico, quando refere-se a um DNA de isp desta invenção, refere-se a uma seqüência de DNA de isp possuindo seqüências reguladoras 5‘ e/ou 3' diferentes daquelas seqüências reguladoras 5' e/ou 3' que ocorrem naturalmente que movimentam a expressão da proteína de ISP em sua célula hospedeira nativa.

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Atividade inseticida ou inseticidamente eficaz quando referese a uma proteína de ISP da invenção ou seus equivalentes, conforme usado aqui, significa a capacidade de uma proteína de ISP de matar insetos acima dos níveis encontrados no tratamento de controle sob as mesmas condições de ensaio, mediante a ingestão de tal proteína por um inseto, preferivelmente um inseto coleóptero, especificamente um verme de raiz de milho, especialmente Diabrotica virqifera. em combinação com uma proteína complementar de ISP, tal como uma segunda proteína de ISP. Preferivelmente, a segunda proteína de ISP é a outra proteína codificada pelo mesmo operon bacteriano que a primeira ISP ou um fragmento isenticidamente eficaz ou equivalente do mesmo, rendendo mortalidade de inseto ótima mediante ingestão das proteínas combinadas. Quantidades de controle de inseto de uma proteína de ISP, conforme usado aqui, refere-se a uma quantidade de proteína de ISP que é suficiente para limitar o dano a uma planta por insetos que alimentam-se de tal planta para níveis comercialmente aceitáveis, por exemplo, por mortalidade dos insetos ou por inibição do desenvolvimento do inseto ou crescimento de modo que eles trazem menos prejuízo à planta e o rendimento da planta não é adversamente afetado, quando tal proteína de ISP é fornecida com uma proteína complementar de ISP, tal como outra proteína de ISP, preferivelmente a outra proteína codificada pelo mesmo operon que o primeiro ISP, ou um fragmento isenticidamente eficaz do mesmo. Fragmento de ISP inseticidamente eficaz, conforme usado aqui, refere-se a um fragmento de uma proteína de ISP desta invenção que mantém a atividade inseticida quando provida em combinação com uma proteína complementar de ISP, tal como outra proteína de ISP, preferivelmente a outra ISP codificada pelo mesmo operon que a primeira ISP. Nas definições acima relacionadas à atividade inseticida, o inseto preferivelmente é uma larva em qualquer um dos estágios de larva. Através de todo este pedido, pode ser feita referência a um DNA de isp e fragmentos inseticidamente eficazes o equivalentes do mesmo e pelo que, caso a atividade inseticida se refira obviamente a atividade da proteína codificada pelo DNA e não à atividade inseticida do DNA propriamente.

• ·

De acordo com esta invenção, foi verificado que as proteínas de ISP desta invenção e seus equivalentes, especificamente as proteínas de ISP1A e ISP2A maduras não possuem atividade inseticida significante para insetos lepidópteros selecionados do grupo consistindo em: Heliothis virescens. Helicoverpa zea. Manduca sexta, Helicoverpa armiqera. Spodoptera littoralis. Spodoptera frugiperda, Sesamia nonaqroides e Ostrinia nubilalis.

De acordo com esta invenção, os insetos alvo suscetíveis às proteínas de ISP da invenção ou seus equivalentes são contatados com estas proteínas em quantidades de controle de inseto, preferivelmente quantidades inseticidas, por expressão em uma planta transgênica de seqüências de DNA codificando tais proteínas de ISP. Os insetos alvo apenas serão afetados pelas proteínas inseticidas quando eles ingerem tecido de planta. Assim, em outro objetivo da presente invenção, é provido um processo para tornar as plantas inseticidas contra Coleópteros e um processo para controle de Coleópteros, compreendendo o plantio, semeadura ou crescimento em um campo de plantas transformado com seqüências de DNA codificando as proteínas de ISP da invenção, especificamente plantas de milho.

O peptídeo de sinal das proteínas de ISP da invenção pode ser removido ou modificado de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica, vide, por exemplo, pedido de patente PCT publicado WO 96/10083, ou eles podem ser substituídos por outro peptídeo, tal como peptídeo de trânsito de cloroplasto (por exemplo, Van Den Broeck e outros, 1985, Nature 313, 358, ou preferivelmente o peptídeo de trânsito de cloroplasto modificado da patente US 5.510.471) que causa o transporte da proteína para os cloroplastos, por um peptídeo de sinal secretório ou um peptídeo objetivando a proteína para outros plastídeos, mitocôndrias, ER ou outra organela, ou pode ser substituído por um aminoácido de metionina ou por um dipeptídeo de metionina-alanina. As seqüências de sinal objetivando as organelas intracelulares ou para secreção fora da célula de planta ou para a parede da célula são encontradas nas proteínas naturalmente objetivadas ou proteínas secretadas, preferivelmente aquelas descritas por Klõsgen e outros (1989,

Mol. Gen. Genet. 217, 155-161), Klõsgen e Weil (1991, Mol. Gen. Genet. 225, 297-304), Neuhaus & Rogers (1998, Plant Mol. Biol. 38, 127-144), Bih e outros (1999, J. Biol. Chem. 274, 22884-22894), Morris e outros, (1999, Biochem. Biophys. Res. Commun. 255, 328-333), Hesse e outros (1989, EMBO J. 8 2453-2461), Tavladoraki e outros (1998, FEBS Lett. 426, 62-66), Terashima e outros (1999, Appl. Microbiol. Biotechnoi. 52, 516-523), Park e outros (1997, J. Biol. Chem. 272, 6876-6881), Shcherban e outros (1995, Proc. Natl. Acad. Sei USA 92, 9245-9249), todos os quais são incorporados aqui como referência, especificamente as seqüências de peptídeo de sinal das proteínas marcadas ou secretadas do milho. Embora uma seqüência de DNA codificando tal peptídeo de sinal de planta possa ser inserida no gene quimérico codificando o ISP1A e no gene quimérico codificando a proteína ISP2A para expressão em plantas, em uma concretização desta invenção, uma seqüência de DNA codificando tal peptídeo de sinal é apenas inserida no gene ISP2A quimérico e o gene quimérico ISP1A perde um peptídeo de sinal ou possui um aminoácido de metionina ou um dipeptídeo de metioninaalanina ao invés do peptídeo de sinal. Em uma concretização preferida desta invenção, as proteínas são secretadas das raízes conforme descrito por Gleba e outros (1999, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 25, 5973-5977) e Borisjuk e outros, 1999 (Nat. Biotechn. 17, 466-469) usando um promotor preferido de raiz forte, especificamente um promotor preferido de raiz forte do milho e um peptídeo de sinal de terminal N para secreção das células de raiz, preferivelmente de milho, especificamente o peptídeo de sinal de uma proteína secretada, preferivelmente uma proteína secretada do milho, selecionada do grupo de: expansina, alfa-amilase, poliamina oxidase, citoquinina oxidase, endoxilanase.

As plantas incluídas no escopo desta invenção são milho, algodão, soja, ervilhas, feijões, lentilhas, batata, tomate, tabaco, alface, plantas da espécie Brassica, cana-de-açúcar, arroz, óleo de semente de colza, mostarda, aspargos, trigo, cevada, café, chá, vinhas, seringueira, beterraba, gramas de turfe, sorgo, aveias, centeio, cebolas, cenouras, alho-porró, pepino, abóbora, melão, girassol, especificamente qualquer planta que seja

• · • · suscetível ao dano por insetos coleópteros, preferivelmente verme de raiz de milho, besouro de batata ou gorgulhos, especificamente insetos das espécies Diabrotica ou Leptinotarsa. mais preferivelmente qualquer inseto selecionado do grupo consistindo em: Diabrotica virqifera. Diabrotica barberi. Diabrotica undecimpuncata. Leptinotarsa decemlineata e Anthonomus qrandis, mais preferivelmente plantas de milho.

Milho, conforme usado aqui, refere-se a todas as plantas da espécie Zea mavs, e quaisquer sementes, raízes ou grãos, ou outros materiais contendo ou diretamente produzidos de células de milho ou qualquer variedade de Zea mavs incluindo porém não limitado ao milho do campo, milho doce, milho híbrido, milho branco e milho denteado, se híbrido ou linhagens congênitas. Preferivelmente, as plantas de milho usadas nesta invenção são linhagens de origem apropriadas para produção de milho híbrido e, mais preferivelmente, elas já transportam resistência ao inseto endógena ou transgênica fornecendo aos mesmos proteção para as pragas de insetos lepidópteros de milho maiores incluindo, porém não limitadas Qstrinia nubilalis.

As proteínas de ISP1A e ISP2A desta invenção podem ser isoladas em uma maneira convencional a partir da cepa de E.coli, depositada de acordo com as condições do Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 2000 em BCCM-LMBP (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms Laboratorium voor Moleculaire Bidogie - Plasmidencollectie, Univesity of Gent, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Bélgica) sob o número de acesso LMBP 4009, ou mais preferivelmente, elas podem ser isoladas do sobrenadante de uma cepa de Bacillus, preferivelmente uma cepa de Bacillus thurinqiensis de menos cristal, transformada com um plasmídeo contendo o fragmento de Xbal-EcoRI de 7 kb aproximadamente do plasmídeo pUCIB120/ISP conforme depositado sob o número de acesso LMBP 4009. As proteínas de ISP podem ser usadas para preparar anticorpos monoclonais ou policlonais específicos em uma maneira convencional (Hõfte e outros, 1988, Appl. Environm. Microbiol. 54, 2010). As proteínas de ISP podem ser tratadas com uma protease, tal como, cisteína proteases, para obter os

4/)

• · · fragmentos resistentes a protease das proteínas de ISP.

As seqüências de DNA codificando as proteínas de ISP podem ser isoladas em uma maneira convencional da cepa depositada ou podem ser sintetizadas com base na seqüência de aminoácido codificada.

As seqüências de DNA codificando outras proteínas de ISP de acordo com esta invenção podem ser identificadas por digestão total do DNA de cepas bacterianas isoladas com enzimas de restrição; fracionamento de tamanho dos fragmentos de DNA, assim produzidos, em frações de DNA de 5 a 10 kb, preferivelmente 7 a 10 kb; ligando estas frações aos vetores de clonagem; classificando o E.coli, transformado com os vetores de clonagem, com uma sonda de DNA que foi construída de uma região de genes de proteína de ISP conhecidos ou com uma sonda de DNA com base nos fragmentos de PCR gerados de DNA de isp usando iniciadores correspondendo a determinadas regiões dentro dos genes de proteína de ISP conhecidos. Tais outras proteínas de ISP isoladas de acordo com esta invenção, como as proteínas de ISP desta invenção são caracterizadas por qualquer uma ou todas, preferivelmente todas as características que se seguem: a) sua atividade inseticida significante para larvas do verme de raiz de milho do Sul; Diabrotica undecimpunctata e para as larvas do besouro de batata Colorado, Leptinotarsa decemlineata, mediante ingestão de tal outra proteína de ISP com uma proteína complementar de ISP, preferivelmente a proteína ISP1A ou ISP2A madura desta invenção; b) sua falta de atividade inseticida significante para larvas dos insetos lepidópteros, preferivelmente Ostrinia nubilalis, mediante ingestão de tal outra proteína de ISP com uma proteína complementar de ISP, preferivelmente a proteína de ISP1A ou ISP2A madura desta invenção; c) seu peso molecular aparente de cerca de 100 kD ou cerca de 45 kD das formas maduras (sem peptídeo de sinal), d) sua ocorrência no sobrenadante de uma cultura de cepa bacteriana que não seja Bacillus thurinqiensis ou Bacillus cereus, e e) por sua falta de toxicidade significante para vermes de raiz de milho, preferivelmente Diabrotica virqifera, mediante ingestão na ausência de uma proteína complementar de ISP.

Naturalmente, qualquer outra seqüência de DNA que, diferente em seu uso no códon, porém codificando a mesma proteína ou proteína semelhante substancialmente com a mesma atividade inseticida, pode ser construída, dependendo da finalidade específica. Foi descrito em alguns sistemas de expressão procarióticos e eucarióticos que alterações no uso do códon em relação àquele da célula hospedeira são desejadas para expressão do gene em hospedeiros estranhos (Bennetzen & Hall, 1982, J. Biol. Chem. 257, 3026; Itakura, 1977, Science 198, 1056-1063). As tabelas de uso de códon estão disponíveis na literatura (Wada e outros, 1990, Nucl. Acids Res. 18, 2367-1411; Murray e outros, 1989, Nucleic Acids Research 17, 477-498) e na maior parte das bases de dados de seqüência de DNA. Conseqüentemente, as seqüências de DNA sintético podem ser construídas de modo que as mesmas ou substancialmente as mesmas proteínas são construídas. É evidente que várias seqüências de DNA podem ser projetadas, uma vez que a seqüência de aminoácido das proteínas de ISP desta invenção é conhecida. Tais outras seqüências de DNA incluem seqüências de DNA sintéticas ou semi-sintéticas que foram alteradas, a fim de inativar determinados locais no gene, por exemplo, por inativação seletiva de determinados elementos de processamento ou reguladores crípticos presentes na seqüência nativa, ou por adaptação da utilização de códon total, em relação àquela de um organismo hospedeiro mais correlato, preferivelmente aquela do organismo hospedeiro no qual a expressão é desejada. Seqüências de DNA sintéticas também poderíam ser feitas seguindo-se os procedimentos descritos na EP 0.385.962, EP 0.618.967 ou EP 0.682.115.

Pequenas modificações em relação a uma seqüência de DNA, tais como aquelas descritas acima podem ser feitas rotineiramente por mutagênese mediada por PCR (Ho e outros, 1989, Gene 77, 51-59; White e outros, 1989, Trends in Genet. 5, 185-189). Novos genes sintéticos ou semisintéticos podem ser feitos por síntese de DNA automatizada e ligação dos fragmentos de DNA resultantes.

Para impedir ou retardar o desenvolvimento de resistência por insetos coleópteros, especificamente vermes de raiz de milho, gorgulho de algodão ou besouro de batata Colorado, preferivelmente, Leptinotarsa decemlineata. Diabrotica barberi. Diabrotica undecimpuncata e Anthonomus grandis ou Diabrotica virgifera. nos hospedeiros transgênicos, especificamente plantas, expressando proteínas de ISP desta invenção ou seus equivalentes, é preferido também expressar no mesmo hospedeiro, preferivelmente, uma planta transgênica, outra proteína ou outro complexo de proteína, que possui um modo diferente de ação e uma toxicidade alta em relação ao mesmo inseto tido como alvo pela primeira toxina ou complexo de toxina quando produzida em um hospedeiro transgênico, preferivelmente uma planta. Candidatos apropriados para serem combinados com o ISP1A e ISP2A da invenção incluem a proteína de VIPIAa madura, quando combinada com a proteína VIP2Aa ou VIP2Ab madura da publicação PCT WO 96/10083, pelo que estas proteínas de VIP possuem um modo diferente de ação em comparação as proteínas de ISP; as toxinas de verme de raiz de milho de Photorhabdus ou Xenorhabdus spp., por exemplo, as proteínas inseticidas de Photorhabdus luminescens W-14 (Guo e outros, 1999, J. Biol. Chem. 274, 9836-9842); a proteína CryET70 do WO 00/26378; as proteínas inseticidas produzidas pelas cepas Bt PS80JJ1, PS149B1 e PS167H2, conforme descrito no WO 97/40162, especificamente com relação às proteínas 14 kD e 33 kD da cepa Bt PS149B1; a proteína Cry3Bb da patente US 6.023.013; inibidores de protease tais como inibidores de proteinase de cisteína N2 e R1 de soja (Zhao e outros, 1996, Plant Physiol. 111., 12991306) ou orizastatina, tais como, cistatina de arroz (entrada do Genbank S49967), cistatina de milho (entradas no Genbank D38130, D10622, D63342), tais como, cistatina de milho expressa em plantas, conforme descrito por Irie e outros (1996, Plant Mol. Biol. 30, 149-157). Também estão incluídos aqui todos os equivalentes e variantes, tais como, proteínas truncadas mantendo atividade inseticida, de quaisquer das proteínas acima.

Tal expressão combinada pode ser obtida por transformação de uma planta já transformada para expressar a proteína tóxica de verme de raiz de milho ou complexo de proteína ou por cruzamento das plantas transformadas para expressar diferentes proteínas tóxicas de verme de raiz

de milho. Alternativamente, a expressão das proteínas de ISP da invenção pode ser induzida em raízes por alimentar as larvas de verme de raiz de milho no tecido de raiz, por exemplo, usando uma região promotora induzida por enrolamento, preferivelmente uma região promotora preferida de raiz induzida por enrolamento.

Os fragmentos de 5 a 10, preferivelmente 7 a 10 kb, preparados do DNA total dos genes de isp desta invenção, podem ser ligados em vetores de expressão apropriados e transformados em E.coli e os clones podem então ser classificados por processos de imunossondagem de colônia convencionais (French e outros, 1986, Anal. Biochem. 156, 417-423) para expressão da toxina com anticorpos monoclonais ou policlonais que surgem contra as proteínas de ISP. Também, os fragmentos de 5 a 10 kb, preparados do DNA total das cepas bacterianas da invenção, podem ser ligados aos vetores bidirecionais Bt apropriados (Lereclus e outros, 1992, Bio/Technology 10, 418) e transformados em um mutante de Bt de menos cristal. Os clones são então classificados para produção de proteínas de ISP (por SDS-PAGE, Westernbblot e/ou ensaio com inseto).

Os genes codificando as proteínas de ISP desta invenção podem ser seqüenciados em uma maneira convencional (Maxam e Gilbert, 1980, Methods in Enzymol. 65, 499-560; Sanger, 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467) para obter a seqüência de DNA. As comparações de seqüência indicaram que os genes são diferentes dos genes descritos anteriormente codificando proteínas secretadas durante a fase de desenvolvimento vegetativo do Bacillus ou outras espécies bacterianas e proteínas de cristal de Bacillus thuringiensis com atividade contra Coleópteros (Crickmore e outros, 1998, Microbiology and Molecular Biology Reviews Vol. 62: 807-813; WO 98/44137, WO 94/21795, WO 96/10083, WO 00/09697, WO 9957282 e WO 9746105).

A fim de expressar toda ou uma parte inseticidamente eficaz da seqüência de DNA codificando uma proteína de ISP desta invenção em E.coli, em outras cepas bacterianas ou em plantas, sítios de restrição apropriados podem ser introduzidos, flanqueando a seqüência de DNA. Isto

pode ser feito por mutagênese dirigida ao sítio, usando procedimentos bemconhecidos (por exemplo, Stanssens e outros, 1989, Nucleic Acids Research 12, 4441-4454; White e outros, 1989, supra). Para expressão em plantas, o DNA de isp da invenção ou seu equivalente, é geralmente contido em um gene quimérico, flanqueado por seqüências reguladoras 5' e 3' incluindo uma região promotora expressável em planta e terminação de transcrição 3' e seqüência de poliadenilação ativa em células de plantas. A fim de obter expressão aperfeiçoada em plantas, a utilização de códon do DNA de isp ou seu equivalente desta invenção pode ser modificada para formar um gene equivalente, modificado ou artificial ou parte do gene ou o DNA de isp ou partes inseticidamente eficazes dos mesmos podem ser inseridas no genoma de cloroplasto e expressas lá usando um promotor ativo de cloroplasto (por exemplo, Mc Bride e outros, 1995, Bio/Technology 13, 362). Para obter expressão melhorada nas plantas de monocot, tais como, milho, um íntron de monocot também pode ser adicionado ao gene quimérico, e a seqüência de DNA de isp ou sua parte inseticida pode ser adicionalmente alterada em uma maneira translacionalmente neutra, para modificar possibilidade de inibição das seqüências de DNA presentes na parte do gene por meio da inserção de íntron direcionada ao sítio e/ou por introdução de alterações à utilização do códon, por exemplo, adaptação da utilização do códon àquela mais preferida pela planta específica (Murray e outros, 1989, supra) sem alterar significativamente a seqüência de aminoácido codificada.

O DNA de isp inseticidamente eficaz ou seu equivalente, preferivelmente, o gene quimérico de isp, codificando uma proteína de ISP, pode ser estavelmente inserido em uma maneira convencional no genoma nuclear de uma célula de planta simples e a célula de planta assim transformada pode ser usada em uma maneira convencional para produzir uma planta transformada que é resistente ao inseto. Com relação a isto, um plasmídeo de Ti desarmado, contendo a parte de gene de isp inseticidamente eficaz, em Aqrobacterium tumefaciens pode ser usada para transformar a célula de planta e após isto, uma planta transformada pode ser regenerada da célula de planta transformada usando os procedimentos descritos, por exemplo, na

EP 0.116.718, EP 0.270.822, publicação de PCT WO 84/02913 e pedido de patente europeu publicado (ΈΡ) 0.242.246 e em Gould e outros (1991, Plant Physiol. 95, 426-434). Os vetores de plasmídeo Ti preferidos que contém a seqüência de gene quimérica de isp inseticidamente eficaz entre as seqüências de limite, ou pelo menos localizada à esquerda da seqüência de limite direita, do T-DNA do plasmídeo Ti. Naturalmente, outros tipos de vetores podem ser usados para transformar a célula de planta, usando os procedimentos, tais como, transferência de gene direta (conforme descrito, por exemplo, na EP 0.233.247), transformação mediada por pólen (conforme descrito, por exemplo, na EP 0.270.356, publicação PCT WO 85/01856 e Patente US 4.684.611), transformação mediada por vírus de RNA de planta (conforme descrito, por exemplo, na EP 0.067.553 e Patente US 4.407.956), transformação mediada por lipossomo (conforme descrito, por exemplo, na Patente US 4.536.475), e outros processos, tais como os processos para transformação de terminadas linhagens de milho (Fromm e outros, 1990, Bio/Technology 8, 833-839; Gordon-Kamm e outros, 1990, The Plant Cell 2, 603-618, Patente US 5.767.367) e arroz (Shimamoto e outros, 1989, Nature 338, 274-276; Datta e outros, 1990, Bio/Technology 8, 736-740) e o processo descrito recentemente para transformação de monocots em geral (Publicação PCT WO 92/09696).

Procedimentos convencionais diferentes podem ser seguidos para obter expressão combinada de duas proteínas de ISP em plantas transgênicas conforme resumido a seguir:

I - Constructos de gene quimérico pelo que, duas seqüências de DNA de ISP e um gene marcador são transferidos para o genoma de planta como uma cavidade simples de DNA e conduzir à inserção em um local simples no genoma.

Ia - Os genes podem ser engenheirados em unidades transcricionais diferentes, cada uma sob controle de um promotor distinto.

Para expressar duas proteínas de ISP e uma proteína marcadora como unidades transcricionais separadas, vários fragmentos de promotor direcionando a expressão nas células de plantas podem ser usados confor27

-Jn ·** «·· ♦ · · · * · · »

O-J * · ♦ me descrito acima. Todas as combinações dos promotores mencionadas acima nas construções quiméricas para um gene de ISP são possíveis. A região de codificação de ISP em cada gene quimérico desta invenção pode ser o gene de isp intacto ou preferivelmente uma parte inseticidamente eficaz do gene de isp intacto. Os genes quiméricos individuais são clonados no mesmo vetor de plasmídeo de acordo com os procedimentos padrão (por exemplo, EP 0.193.259).

b - Dois genes (por exemplo, tanto um isp e um gene marcador ou dois genes de isp) ou mais podem ser combinados na mesma unidade transcricional.

Para expressar dois genes de isp na mesma unidade transcripcional, os casos que se seguem podem ser distintos:

Em um primeiro caso, os genes híbridos nos quais a região de codificação de um gene é fundida na estrutura com a região de codificação de outro gene podem ser colocados sob o controle de um promotor simples. As fusões podem ser feitas entre um gene de isp e um gene marcador ou entre dois genes de isp.

Também, entre cada gene codificando um ISP ou um fragmento inseticidamente ativo do mesmo, um fragmento de gene codificando uma parte de proteína sensível a protease (por exemplo, protease de tripsina, cisteína ou serina) seria incluída, tal como, um fragmento de gene codificando uma parte dos ISPs que é removida ou clivada mediante ativação por enzimas do intestino médio das espécies de inseto alvo. Alternativamente, entre cada gene codificando um ISP ou um fragmento inseticidamente ativo do mesmo, um fragmento de gene pode ser incluído codificando um peptídeo de cerca de 16 a 20 aminoácidos que possui a capacidade de mediar a divagem em seu próprio terminal C por uma reação independente de enzima (Halpin e outros, 1999, Plant J. 17, 453-459, Patente US 5.846.767) ou um fragmento de gene codificando uma seqüência de peptídeo ligante que permite que a produção de uma célula recombinante com toxicidade significante para os insetos alvo.

Em um segundo caso, as regiões de codificação dos dois genes

respectivos de isp podem ser combinadas em unidades dicistrônicas colocadas sob o controle de um promotor. As regiões de codificação dos dois genes de isp são colocadas uma após a outra com uma seqüência intergênica de comprimento definido. Uma molécula de RNA de mensageiro simples é gerada, conduzido a tradução em dois produtos de gene separados. Com base no modelo de escaneamento modificado (Kozak, 1987, Mol. Cel. Biol. 7, 3438-3445), o conceito de reinicio de tradução foi aceito, contanto que um códon de terminação na estrutura com um ATG a montante preceda o ATG a jusante. Dados experimentais também demonstraram que a maquinaria translacional das plantas é capaz de sintetizar vários polipeptídeos a partir de um mRNA policistrônico (Angenon e outros, 1989, Mol. Cell. Biol. 9, 5676-5684).

Com base no mecanismo de início interno da tradução (Jackson e Kaminski, 1995, RNA 1, 985-1000) o início da tradução do segundo gene ocorre por ligação do complexo de pré-início 43S à seqüência intergênica específica (seqüência de entrada de ribossoma interno; IRES). Dados experimentais também demonstraram que a maquinaria de tradução da planta é capaz de sintetizar vários polipeptídeos de um mRNA policistrônico contendo elementos IRES intergênicos (Hefferon e outros, 1997, J. Gen. Virol. 78, 3051-3059; Skulachev e outros, 1999, Virology 263, 139-154; publicação de patente PCT WO 98/54342).

II - Construção quimérica com um gene de isp que é transferido para o genoma de uma planta já transformada com um gene de isp:

Vários genes podem ser introduzidos em uma célula de planta durante as etapas de transformação sequencial (retransformação), contanto que um sistema alternativo para selecionar os transformantes esteja disponível para a segunda rodada de transformação ou, contanto que o gene marcador selecionável seja cortado do genoma da planta usando uma tecnologia de recombinação de DNA (por exemplo, pedidos PCT publicados WO 94/17176 e WO 91/09957). Esta retransformação conduz à expressão combinada dos genes de isp que são introduzidos em locais múltiplos no genoma. Preferivelmente, dois genes marcadores selecionáveis diferentes são usados nas etapas de transformação consecutivas. O primeiro marcador é usado para seleção das células transformadas na primeira transformação, enquanto o segundo marcador é usado para seleção de transformantes na segunda rodada de transformação. As etapas de transformação seqüencial usando canamicina e higromicina foram descritas, por exemplo, por Sandler e outros (1988, Plant Mol. Biol. 11, 301-310) e Delauney e outros (1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 4300-4304).

III - Construções quiméricas com genes de isp, que são transferidos separadamente para o genoma nuclear de plantas separadas nos eventos de transformação independentes e são subseqüentemente combinados em um genoma de planta simples através de cruzamentos

A primeira planta seria uma planta transformada com um primeiro gene de isp ou uma planta F1 derivada do mesmo através da autopolinização (preferivelmente uma planta F1 que seja homozigota para o gene de isp). A segunda planta seria uma planta transformada com um segundo gene de isp ou uma planta F1 derivada do mesmo através da autopolinização (preferivelmente uma planta F1 que seja homozigota para o segundo gene de isp). Os processos de seleção podem ser aplicados às plantas obtidas deste cruzamento, a fim de selecionar aquelas plantas possuindo dois genes de isp presentes em seu genoma (por exemplo, Southern blot) e expressão de dois ISPs (por exemplo, detecção de ELISA separada para ISPs imunologicamente diferentes). Esta é uma estratégia útil para produzir variedades híbridas de duas linhagens de origem, cada uma transformada com um gene de isp diferente, bem como para produzir linhagens congênitas contendo dois genes de isp diferentes através do cruzamento de dois transformantes independentes (ou sua descendência autopolinizada) da mesma linhagem congênita.

IV - Construções quiméricas com um ou mais genes de isp separadamente transferidos para o genoma de uma planta simples no mesmo experimento de transformação, conduzindo à inserção dos respectivos genes quiméricos no mesmo ou em locais múltiplos

A co-transformação envolve a transformação simultânea de uma planta com dois vetores de expressão diferentes, um contendo um primeiro gene de isp, o segundo contendo um segundo gene de isp. Juntamente com cada gene de isp, um gene marcador diferente pode se usado, e a seleção pode ser feita com dois marcadores simultaneamente. Alternativamente, um marcador simples pode ser usado e um número suficientemente grande de plantas selecionadas pode ser classificado, a fim de encontrar aquelas plantas possuindo dois genes de isp (por exemplo, por Southern blot) e expressando as duas proteínas (por exemplo por meio de ELISA). A cotransformação com mais do que um T-DNA pode ser realizada por uso simultâneo de duas cepas diferentes de Agrobacterium, cada uma com um plasmídeo de Ti-diferente (Depicker e outros, 1985, Mol. Gen. Genet. 201, 477-484) ou com uma cepa de Agrobacterium contendo dois T-DNAs nos plasmídeos separados (de Framond e outros, 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 125-131). A transferência direta de gene, usando uma mistura de dois plasmídeos ou fragmentos dos mesmos pode também ser empregada para cotransformar células de plantas com um gene selecionável e um nãoselecionável (Schocher e outros, 1986, Bio/technology 4, 1093-1096).

A planta transformada resultante pode ser usada em um esquema de reprodução de planta convencional para produzir mais plantas transformadas com as mesmas características ou para introduzir o gene de isp iseticidamente eficaz em outras variedades das mesmas espécies de plantas ou correlatas. Sementes, que são obtidas de plantas transformadas, contêm o gene de isp inseticidamente eficaz como uma inserção genômica estável. As células da planta transformada podem ser cultivadas em uma maneira convencional para produzir a porção inseticidamente eficaz da proteína de ISP que pode ser recuperada por uso em composições inseticidas convencionais contra insetos. Naturalmente, as possibilidades acima de produção combinada de proteínas de ISP nas plantas é bem aplicável aos fragmentos ativos das proteínas de ISP ou os equivalentes de ISP desta invenção. O gene de isp inseticidamente eficaz é inserido em um genoma de célula de planta, de modo que o gene inserido está a jusante (isto é, 3') e operativamente ligado a um promotor que pode dirigir a expressão de parte

do gene na célula de planta. Isto é preferivelmente realizado por inserção do gene quimérico de isp no genoma de célula de planta, especificamente no genoma nuclear ou cloroplasto. Os promotores preferidos incluem: os promotores 35S constitutivos fortes (os promotores 35S) do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) de isolados CM 1841 (Gardner e outros, 1981, Nucl. Acids Res. 9, 2871-2887), CabbB-S (Franck e outros, 1980, Cell 21, 285294) e CabbB-JI (Hull e Howell, 1987, Virology 86, 482-493); promotores da família de ubiquitina (por exemplo, o promotor de ubiquitina de milho de Christensen e outros, 1992, Plant Mol. Biol. 18, 675-689; vide também Cornejo e outros, 1993, Plant Mol. Biol. 23, 567-581), o promotor gos2 (de Pater e outros, 1992, Plant J. 2, 837-844), o promotor emu (Last e outros, 1990, Theor. Appl. Genet. 81,581-588), promotores de actina de arroz tais como o promotor descrito porZhang e outros (1991, The Plant Cell 3, 1155-1165); e o promotor TRT e o promotor TR2' (o promotor TRT e o promotor TR2', respectivamente) que movimentam a expressão dos genes T e 2', respectivamente do T-DNA (Velten e outros, 1984, EMBO J 3, 2723-2730). Alternativamente, um promotor pode ser utilizado, o qual não é constitutivo, porém ao invés disto é específico para um ou mais tecidos ou órgãos da planta (por exemplo, folhas e/ou raízes) pelo que, o gene de isp inserido é expresso apenas nas células do(s) tecido(s) específico(s) ou órgão(s). Em uma concretização preferida da invenção, o gene de isp inseticidamente eficaz é seletivamente expresso nas raízes de uma planta, preferivelmente milho, por colocação de parte do gene inseticidamente eficaz sob o controle de um promotor preferido de raiz (isto é, um promotor que é mais ativo no tecido de raiz, preferivelmente um promotor com nenhuma ou pouca transcrição no tecido de não raiz, tal como, pólen, folhas e haste, mais especificamente um promotor, apenas resultando na transcrição detectável no tecido de raiz). Promotores preferidos de raiz não precisam ser exclusivamente ativos nos tecido de raiz. Os promotores preferidos de raiz de acordo com esta invenção incluem, porém não estão limitados aos promotores localizados imediatamente a montante de uma seqüência de DNA correspondendo a um cDNA específico para raiz, preferivelmente de milho; o promotor da patente

US 5.837.876, pedidos de patente publicados PCT WO 00/29594, WO 00/73474, WO 01/00833 ou Patente US 6.008.436; o promotor de ZRP2 da Patente US 5.633.363 e Held e outros, (1997, Plant Mol. Biol. 35, 367-375, número de acesso do Genbank U38790); o promotor da Patente US 5.817.502; o promotor descrito por Framond (1991, FEBS 290: 103-106; EP 0.452.269), o promotor específico de raiz do gene de peroxidase POX1 do trigo (Hertig e outros, 1991, Plant Molec. Biol. 16, 171-174), o promotor da patente US 5.837.848, o promotor da publicação de PCT WO 015662, o promotor de Goddemeier e outros (1998, Plant Mol. Biol. 36, 799-802). Outros promotores específicos de raiz ou preferidos para raiz que podem ser úteis nesta invenção incluem os promotores descritos por Hirel e outros, 1992, Plant Mol. Biol. 20, 207; Keller e Baumgartner, 1991, The Plant Cell 3, 1051-1061; Sanger e outros, 1990, Plant Mol. Biol. 14, 433-443; Miao e outros, 1991, The Plant Cell 3, 11-22; Bogusz e outros, 1990, The Plant Cell, 2, 633-641; Geach e Aoyagi, 1991, Plant Science 79, 69-76; Teeri e outros 1989, EMBO Journal 8, 343-350, todos os quais são incorporados aqui como referência.

A expressão nas folhas de uma planta pode ser obtida por uso do promotor do gene de subunidade pequeno de carboxilase de ribulose1,5-bisfosfato da planta propriamente ou de outra planta, tal como, ervilha conforme revelado na Patente US 5.254.799. Outra alternativa é usar um promotor cuja expressão seja induzível (por exemplo, por fatores de temperatura ou químicos). Também, para plantas de milho, especificamente na época em que os vermes de raiz de milho adultos estão presentes nos campos de vermes de raiz de milho, a expressão no pólen é preferida, por uso de regiões promotoras resultando na expressão no pólen de milho, por exemplo, os promotores descritos nos pedidos PCT publicados WO 93/25695 e WO 01/12799.

O gene de isp inseticidamente eficaz é inserido no genoma da planta, de modo que a parte do gene inserida está a montante (isto é, 5') de sinais de regulação de transcrição de extremidade 3' apropriados (isto é, a formação de transcrito e sinais de poliadenilação).

Isto é preferivelmente realizado por inserção do gene quimérico de isp no genoma da célula de planta. A escolha da seqüência reguladora 3' no gene quimérico da invenção não é crítica. Em alguns casos, a boa expressão pode ser obtida quando nenhuma região está presente no gene quimérico, uma vez que a seqüência de DNA no sítio de inserção pode atuar como uma seqüência reguladora 3'. Sinais de poliadenilação e formação de transcrito preferidos incluem aqueles de CaMV 35S (Mogen e outros, 1990, The Plant Cell 2, 1261-1272), o gene de sintase octopina (Gielen e outros, 1984, EMBO J3, 835-845), o gene de sintase de nopalina (Depicker e outros, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1, p. 561), e o gene de T-DNA 7 (Velten and Schell, 1985, Nucleic Acids Research 13, 6981-6998), que atuam como seqüências de DNA 3'-não traduzidas nas células de plantas transformadas.

O gene de isp inseticidamente eficaz pode ser inserido opcionalmente no genoma de planta como um gene híbrido (Patente US 5.254.799; Vaeck e outros, 1987, Nature 327, 33-37), sob o controle do mesmo promotor como um gene marcador selecionável, tal como o gene neo (EP 0.242.236) codificando resistência a canamicina, de modo que a planta expressa uma proteína de fusão.

Todo ou parte do gene isp pode também ser usado para transformar outras bactérias, tais como, cepa de B.thurinqiensis que possui atividade inseticida contra Lepidópteros ou Coleópteros, ou bactérias de colonização de raiz, por exemplo, Pseudomonas putida de colonização de raiz (Vichez e outros, J. Bacteriol. 182, 91-99). Desta forma, uma cepa bacteriana transformada pode ser produzida, que é útil para combater insetos e que pode afetar um amplo espectro de pragas de insetos lepidópteros e coleópteros. A transformação da bactéria, tal como bactéria do gênero Aqrobacterium. Bacillus ou Escherichia. com todo ou parte do gene isp desta invenção ou seu equivalente, incorporado em um veículo de clonagem apropriado, pode ser realizada em uma maneira convencional, tal como transformação por choque térmico (Bergmans e outros, 1981, J. Bacteriol. 146, 564-570) ou técnicas de eletroporação convencionais, conforme descrito em Mahillon e outros (1989, FEMS Microbiol. Letters 60, 205-210) e na publicação de

Patente PCT WO 90/06999.

As cepas bacterianas transformadas, tais como, cepas da espécie Bacillus, preferivelmente cepas de Bacillus thuringiensis. contendo o gene de isp desta invenção podem se fermentadas por processos convencionais (Dulmage, 1981, Production of Bactéria for Biological Control of Insects em Biological Control in Crop Production, Ed. Paparizas, D.C., osmun Publishers, Totowa, N.J., USA, pp. 129-141; Bernhard e Utz, 1993, Production of Bacillus thuringiensis insecticides for experimental and commercial uses, em Bacillus thuringiensis. an Environmental Biopesticide: Theory and Practice, pp 255-267, eds. Entwistle, P.F., Cory, J.S., Bailey, M.J. e Higgs, S., John Wiley and Sons, New York) para prover altos rendimentos de células.

Uma composição inseticida, especificamente anti-coleópteros, preferivelmente anti-vermes de raiz de milho desta invenção pode ser formulada em uma maneira convencional usando os microorganismos transformados com o gene de isp, ou preferivelmente suas proteínas de ISP respectivas ou porções inseticidamente eficazes como um ingrediente ativo, em conjunto com veículos apropriados, diluentes, emulsificantes e/ou dispersantes (por exemplo, conforme descrito por Bernhard e Utz, 1993, supra). Esta composição inseticida pode ser formulada como um pó umectável, péletes, grânulos ou pó ou como uma formulação líquida com solventes aquosos ou não-aquosos como uma espuma, gel, suspensão, concentrado, etc. Microorganismos conhecidos incluem células de Pseudomonas ou outras bactérias, que servem para encapsular as proteínas em um ambiente estável antes da aplicação aos insetos. Também encontra-se incluído na invenção um produto compreendendo a proteína de ISP1A e ISP2A da invenção como uma preparação combinada para uso simultâneo, separado ou seqüência para proteger plantas de milho contra vermes de raiz de milho, especificamente tal produto é uma composição inseticida ou uma planta de milho transgênica.

Um processo para controlar insetos, especificamente, Coleópteros, de acordo com esta invenção pode compreender aplicação (por exem35 pio, aspersão) a um local (área) a ser protegido, de uma quantidade inseticida das proteínas de ISP ou células hospedeiras transformadas com o gene de isp desta invenção. O local a ser protegido pode incluir, por exemplo, o habita das pragas de insetos ou crescimento de vegetação ou uma área em que a vegetação deve crescer.

Para obter a proteína de ISP, as células dos hospedeiros recombinantes expressando a proteína de ISP podem ser desenvolvidas de uma maneira convencional em um meio de cultura apropriado e a proteína pode então ser obtida do meio usando dispositivos convencionais. A proteína de ISP pode então ser separada e purificada por técnicas padrão, tais como, cromatografia, extração, eletroforese ou semelhantes. A forma de toxina resistente a protease pode então ser obtida por protease, por exemplo, cisteína protease ou serina, digestão da proteína.

Bioensaios para teste da eficácia inseticida são bem conhecidos na técnica. Um processo para teste de verme de raiz de milho é descrito em Marrone e outros (1985, J. Econ. Entomol. 78, 290-293), porém muitos outros processos encontram-se disponíveis para testar isentos em dieta artificial ou em plantas transgênicas, por exemplo, Patente US 5.990.383. Em um bioensaio apropriado, os controles próprios estão incluídos para verificação do histórico de mortalidade.

Os exemplos que se seguem ilustram a invenção e não são fornecidos para limitar a mesma. Muitas variantes ou equivalentes destes Exemplos podem ser projetadas por um versado na técnica comum, sem com isto fugir dos ensinamentos da invenção e do conhecimento comum. A listagem de seqüência referida neste pedido (que forma parte do mesmo e encontra-se anexa) é como se segue:

Listagem de Seqüência:

SEQ ID N- 1 - seqüência de aminoácido e DNA da proteína de ISPIAe DNA

SEQ ID N^Q 2 - seqüência de aminoácido da proteína de ISP1A.

SEQ ID N^Q 3 - seqüência de aminoácido e DNA da proteína ISP2A e DNA.

*··

SEQ ID N⁹ 4 - proteína de ISP2A da seqüência de aminoácido.

SEQ ID N⁹ 5 - seqüência de DNA do fragmento promotor de zrp2 curto (n = qualquer nucleotídeo)

SEQ ID N⁹ 6 - seqüência de DNA do fragmento promotor de zrp2 longo (n = qualquer nucleotídeo)

SEQ ID N⁹ 7 - proteína de ISP2A-1 codificando seqüência de

DNA

SEQ ID N⁹ 8 - proteína de ISP2A-1 codificando seqüência de aminoácido.

SEQ ID N⁹ 9 - fragmento de proteína de ISP1A-1 codificando seqüência de DNA

SEQ ID N⁹ 10 - proteína de ISP1A-1 codificando seqüência de aminoácido.

A menos que de outra forma estabelecido nos Exemplos, todos os procedimentos para fabricação e manipulação de DNA recombinante são realizados pelos procedimentos padrão descritos em Sambrook e outros, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989) e nos Volumes 1 e 2 de Ausubel e outros (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Os materiais e processos padrão para trabalho de biologia molecular de plantas são descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.R.D. Croy, publicado em conjunto por BIOS Scientific Publicatións Ltd (Reino Unido) e Backwell Scientific Publicatións (Reino Unido). Os procedimentos para tecnologia de PCR podem ser encontrados em PCR protocols: a guide to methods and applications, Editado por M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky and T.J. White (Academic Press, Inc., 1990).

EXEMPLOS

Exemplo 1: Caracterização da cepa IB120-A

Uma cepa bacteriana, denominada aqui cepa IB120-A, foi encontrada em um campo no estado de Morelos, México.

A cepa cresceu durante a noite em placas ágar LB (meio LB com ágar a 1,5% adicionado; meio LB: 10 g/l de tripton, 10 g/l de NaCI, 5 g/l ·· ·

de extrato de levedura, pH 7,3) a 28°C. Para culturas em escala menor, 20 ml de meio TB (Terrific Broth: 12 g/l de triptona, 24 g/l de extrato de levedura, 3,8 g/l de KH₂PO₄, 12,5 g/l de K₂HPO₄, 5 ml/l de glicerol, pH 7,1) foi inoculado e desenvolveu por 65 horas a 28°C em uma plataforma de giro possuindo cerca de 70 rpm. Após 65 horas, uma mistura inibidora de protease foi adicionada à cultura. Este coquetel possui os seguintes ingredientes (volumes dados são aqueles necessários para adicionar a uma cultura de 20 ml): 200 μΙ de PMSF (100 mM), 200 μΙ de uma mistura de benzamidina, HCI (100 mM) e ácido épsilon-amino-n-capróico (500 mM), 400 μΙ de EGTA (0,5 M), 40 μΙ de antidor (0,5 mg/ml)/leupeptina (0,5 mg/ml) e 20 μΙ de etanol beta-mercapto (14 Μ). O meio de cultura ao qual a mistura de inibidor de protease foi adicionada, foi então centrifugada por 20 minutos a 3.000 rpm. Em alguns casos, o sobrenadante foi concentrado cerca de 4 vezes usando Centriprep YM-10 Centrifugai Filter Devices (Millipore Cat. número 4305). Para armazenamento a longo prazo, um loop de células esporuladas foi adicionado a 0,5 ml de glicerol a 25% ou 50% e após vortexação, armazenado a -70°C. As células esporuladas foram obtidas por desenvolvimento da cepa em placas ágar LB até esporulação (conforme aparente sob a luz do microscópio).

Após cultivo nas placas de ágar LB de colônias de células simples, análise microbiana da cultura de cepa de IB120A mostrou a presença de células vegetativas simples, móveis conformadas em bastão e esporângios intumescidos contendo um esporo oval. Nenhum cristal paraesporal foi detectado nas culturas da cepa IB120-A.

O sobrenadante da cepa IB120-A mostrou toxicidade forte às larvas de Diabrotica virgifera (doravante denominada Dv) nos ensaios de contaminação de superfície na dieta artificial (dieta conforme descrita por Sutter e outros (1971, J. Econ. Entomol. 64, 65-67)). Os ensaios foram feitos em 24°C (+/- 1°C) em 24 placas Costar de várias poças em 50 microlitros de solução de toxina por poça (2 cm²), 6 poças foram analisadas com 4 L1 larvas (primeiro estágio) por poças para cada amostra (classificação após 7 dias).

A classificação do sobrenadante colhido a 7, 24, 30, 48 e 120 horas após início da cultura mostrou a toxicidade mais forte para Dv a 48 horas, sem toxicidade significante encontrada em 7 horas. Em 48 horas, a mortalidade na faixa de 50-60% foi ainda encontrada, quando o sobrenadante (concentração de proteína total de 214 microgramas/ml) foi diluído a 1/1024.

A perda de atividade do sobrenadante IB120-A colhido 48, 65 e 144 horas após o início da cultura (em diluições de 1/1 a 1/8) mediante tratamento por aquecimento e retenção da atividade após precipitação de sulfato de amônio indicou que o composto tóxico é semelhante a uma proteína.

A caracterização preliminar da cepa de IB120-A por iniciadores PCR de genes de girase B (Yamada e outros, 1999, Appi. Environm. Microbiol. 65, 1483-1490) sugeriu que esta não era uma cepa Bacillus da subespécie thuringiensis. anthracis ou cereus. Também, nenhum produto de ampliação foi obtido usando iniciadores de PCR especificamente caracterizando as seqüências 16S RNA do gênero Paenibacillus que estão também reconhecendo as espécies Bacillus lentimorbus e Bacillus popilliae (Pettersson e outros, 1999, Int. J. Syst. Bacteriol. 49(2), 531-540). O crescimento em meio NB (caldo de nutriente: 3 g/l de extrato de carne bacto, 5 g/l de peptona bacto, pH 6,8) indicou que a nova cepa não era uma espécie Bacillus larvae. Assim, esta cepa IB120-A parece ser diferente das cepas Bacillus anteriormente isoladas conhecidas por produzir proteínas inseticidas secretadas que não estão contidas nos cristais.

Com base na forma semelhante a bastão e no crescimento aeróbio, a cepa seria uma cepa da espécie Bacillus. Com um conjunto de iniciadores gerais e específicos, para genes crv3 Bacillus thuringiensis. nenhum produto de ampliação foi encontrado quando da análise da cepa IB120-A.

A análise detalhada da cepa de IB 120-A usando técnicas de identificação microbiana padrão, incluindo análise de ácido graxo e testes API 50CHB combinados com testes API 20E, mostrou que esta cepa é uma cepa da espécie Brevibacillus laterosporus.

·· *

Exemplo 2 - Isolamento e caracterização de DNAs de isp1 e isp2/proteínas

A fim de isolar os genes responsáveis pela toxicidade de IB120A, DNA total desta cepa foi preparado e parcialmente digerido com Sau3A. O DNA digerido foi fracionado em um gradiente de sacarose e os fragmen5 tos variando de 7 kb a 10 kb foram ligados ao vetor de clonagem pUC19 tratado com TsAP e digerido com BamHI (fosfase alcalina termosensível) (Yannisch-Perron e outros, 1985, Gene 33, 103-119). A mistura de ligação foi eletroporada em células de E.coli XL-1Blue. Os transformantes foram colocados em placas LB-triacilina contendo Xgal e IPTG e as colônias bran10 cas foram selecionadas para serem usadas nos experimentos de hibridização de filtro. Os clones de E.coli recombinante contendo o vetor foram então classificados com uma sonda rotulada DIG que foi preparada como se segue. Primeiro, a PCR foi realizada usando como células de gabarito para cepa IB120-A. O produto de ampliação resultante foi purificado com gel e usado como gabarito em uma reação de PCR secundária usando dNTPs rotulados com DIG e os mesmos iniciadores como na primeira reação de PCR. Uma quantidade apropriada deste produto de ampliação foi usada nas reações de hibridização.

Seguindo-se a identificação de uma colônia positiva contendo um plasmídeo abrigando os genes de isp de comprimento pleno, a seqüência destes genes foi determinada usando o processo de rotulação de terminador de corante e um seqüenciador de DNA Perkin Elmer ABI Prism-377. As seqüências das duas estruturas de leitura aberta encontradas no fragmento de DNA clonado de uma colônia positiva são mostradas na SEQ ID

N³ 1 e 3. Estas seqüências de DNA foram verificadas como sendo organizadas em um operon e codificam novas proteínas, ISP1A (SEQ ID N³ 2) e ISP2A (SEQ ID N³ 4) que foram verificadas como sendo os agentes casuais da atividade inseticida alta observada. Uma colônia positiva contendo o plasmídeo derivado de pUC com os genes responsáveis pela toxicidade (no plasmídeo pUCIB120/ISP) foram depositados sob as condições do tratado de Budapeste no E.coli XLIBlue como LMBP 4009 em 11 de janeiro de 2000.

A preparação do plasmídeo foi feita da colônia positiva e este plasmídeo foi cortado usando Xbal e EcoRI (resultando em cerca de 7 kg de fragmentos) e ligado ao vetor de vaivém pSL40 que foi cortado usando as mesmas enzimas de restrição. Este plasmídeo rendeu pSLIB120/ISP. O plasmídeo pSLIB120/ISP foi então transferido para uma cepa de B.thurinqiensis de menos cristal. O sobrenadante desta cepa de Bt recombinante foi obtido como se segue.

A cepa cresceu por toda a noite nas placas de ágar LB contendo eritromicina (20 qg/ml) a 28°C. Para culturas em escala menor, 20 ml de meio TB contendo eritromicina (20 qg/ml) foram inoculados e cresceram por 65 horas a 28°C em uma plataforma de giro possuindo cerca de 70 rpm. Após 65 horas, uma mistura inibidora de protease foi adicionada à cultura. Este coquetel tinha os seguintes ingredientes (volumes dados são aqueles necessários para adicionar a uma cultura de 20 ml): 200 μΙ de PMSF (100 mM), 200 μΙ de uma mistura de benzamidina, HCI (100 mM) e ácido épsilonamino-n-capróico (500 mM), 400 μΙ de EGTA (0,5 M), 40 μΙ de antidor (0,5 mg/ml)/leupeptina (0,5 mg/ml) e 20 μΙ de etanol beta-mercapto (14 Μ). O meio de cultura ao qual a mistura de inibidor de protease foi adicionada, foi então centrifugada por 20 minutos a 3.000 rpm. Em alguns casos, o sobrenadante foi concentrado cerca de 4 vezes usando Centriprep YM-10 Centrifugai Filter Devices (Millipore Cat. número 4305).

A atividade inseticida do sobrenadante em 48 horas após início da cultura da cepa Bt recombinante contendo o plasmídeo pSLIB120/ISP usando o ensaio de contaminação de superfície Dv descrito acima, mostrou que o sobrenadante ainda tinha mortalidade significante na faixa de 60% em uma diluição de 1/1024, embora a mortalidade de controle (os controles incluíram sobrenadante da cepa Bt não transformados) fosse de 0%. Isto mostra que o DNA isolado codifica um ingrediente inseticida da cepa IB120A, e mediante transferência para outra bactéria é também expresso e secretado no meio de cultura. A análise da toxicidade de outra cepa de menos cristal Bt independente transformada com o plasmídeo pSLIB120/ISP confirmou a atividade inseticida alta dos sobrenadantes em comparação aquela t

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do controle não transformado. O valor de LC50 do sobrenadante na cepa Bt expressando as duas proteínas de ISP foi encontrado como sendo de 3,5 ng/cm² após 4 dias usando o ensaio de contaminação de superfície descrito acima com larvas Dv (com base na concentração de proteína de sobrenadante total). Análise detalhada da toxicidade do sobrenadante produzido por cepa de Bt recombinante expressando as proteínas ISP1A e ISP2A para insetos coleópteros selecionados é reportada na Tabela 1 abaixo. As proteínas de ISP desta invenção foram encontradas como tendo atividade inseticida significante contra larvas de verme de raiz de milho do Oeste, Norte e Sul, e também contra o besouro de batata Colorado e gorgulho de algodão.

As proteínas ISP1 e ISP2 maduras foram purificadas para homogeneidade aparente por precipitação de sulfato de amônio seguido por passagem em colunas cromatográficas diferentes. A análise cromatográfica sugere que as proteínas de ISP1A e ISP2A estão presentes no sobrenadante em razão equimolar. Foi verificado que a proteína ISP1A é de natureza hidrófoba, enquanto ISP2A é de natureza hidrófila. A determinação da seqüência de terminal amino das proteínas de ISP1A e ISP2A maduras produzidas na cepa Bt de menos cristal recombinante mostrou que a posição do aminoácido 38 na SEQ ID N² 2 para ISP1A e posição do aminoácido 51 na SEQ ID N² 4 para ISP2A são os aminoácidos de terminal N das proteínas ativas presentes no sobrenadante de tal cepa Bt transformada. O terminal N para ISP1A foi verificado como sendo IATTTQASKD, que para ISP2A foi verificado como sendo LVKTTNNTED, que combina plenamente com a seqüência de aminoácido das seqüências de DNA isoladas.

O peso molecular aparente da proteína de ISP1A madura pura foi determinada como sendo de cerca de 100 kD em 8% de eletroforese de gel SDS-PAGE, que o da proteína de ISP2A madura pura foi determinado como sendo de cerca de 45 kD de proteína em eletroforese de gel SDSPAGE a 10%, usando marcadores de peso molecular de 37, 50, 75, 100 e 150 kD.

A atividade das proteínas de ISP1A e ISP2A maduras produzidas pela cepa recombinante foi avaliada contra vários isentos. Os resultaX *··

··· dos contra insetos coleópteros selecionados são mostrados na Tabela 1 a seguir.

Tabela 1: Atividade dos coleópteros de ISP1A-ISP2A:

Inseto	Estágio	LC50 (pg/ml)	LC90 (qg/ml)
		(95% CL)	(95% CL)
Dv	L1	0.437	1.689
		(0.321-0.563)	(1.250-2.597)
óiijispie	L2	3.84	117.4
		(-)	(-)
	L3	21.674*	531.76
		(5.012-100.432)	(110.688-86864)
Db	L1	0.213	0.890
		. (0.116-0.338)	(0.542-2.006)
Du	L1	4.91	30.06
		(1.65-13.26)	(11.52-329.72)
Ld	L1+2d	0.037	1.068
		(-)	(-)
	L1	207.1	8759.2
		(84.3-654.7)	(1865.8-620175.8)

Dv: Diabrotica virqifera. verme da raiz de milho do Oeste; Db: 5 Diabrotica barbieri. verme de raiz de milho do Norte; Du: Diabrotica undecimpunctata howardi, verme de raiz de milho do Sul; Ld: Leptinotarsa decemlineata, besouro de batata colorado; Ag: Anthonomus grandis, gorgulho de algodão; L1: primeiro estágio da larva; L2: segundo estágio da larva; L3: terceiro estágio da larva; L1+2d: 2d após eclosão do ovo; *: 90% CL (CL = limites de confiança, LC50: concentração de proteína de sobrenadante total quando 50% dos insetos estão mortos).

Bioensaios usados: Dv, Db, Du: ensaio de contaminação de superfície em dieta artificial (vide acima para descrição) em razão de 25 μΙ/cm², classificação após 7 dias; Ld: teste de imersão com folhagem de batata (folhagem de batata cortada e imersa na solução de toxina, deixada secar e colocada em uma placa de petri (9 cm de diâmetro) com 10 larvas;

··· • ♦ • * »·· .J

após 1 dia sem tratamento, a folhagem foi adicionada a placa de petri, a classificação foi feita após 5 dias); Ag: teste de incorporação de dieta artificial: dieta conforme descrita por Moore e Whisnant, Handbook of Insect Rearing, volume 1, Pritah Singh e R.F. Moore; Elsevier, Amsterdam, 1985, página 217; ensaio: incorporação de 2 ml de solução de toxina por 25 ml de dieta, em 24 placas Costar de várias poças (cerca de 1 ml/poça), 1 ovo por poça, 20 poças por amostra, classificação após 14 dias). Nos ensaios reportados na Tabela 1, os controles (alimento não tratado, alimento fornecido com sobrenadante de uma cepa menos cristal Bt não transformada ou com água) não mostraram qualquer mortalidade acima de 20% para qualquer um dos insetos acima (uma variação de 5 a 20% de controle de mortalidade foi encontrada de acordo com o estágio larval e espécies de inseto (o valor de 20% é para o terceiro estágio da larva de Dv)).

Os valores de LC50 obtidos para larvas de Diabrotica virqifera usando o bioensaio conforme descrito acima, quando uma combinação equimolar de proteína ISP1A e ISP2A foi aplicada após purificação destas proteínas dos sobrenadantes da cepa Bt recombinante, não foram significativamente diferentes daqueles obtidos acima.

Os bioensaios de uma mistura de proteína de ISP1A e ISP2A em ensaios de contaminação de superfície padrão contra insetos de lepidóptero selecionados (Ostrinia nubilialis. Heliothis virescens. Helicoverpa zea. Spodoptera frugiperda. Sesamia nonaqrioides, Spodoptera littoralis. Helicoverpa armiqera. e Manduca sexta) mostrou que as proteínas de ISP desta invenção não causam qualquer mortalidade nestes insetos acima dos níveis de controle. Isto evidencia a natureza específica do coleóptero das proteínas desta invenção. Os bioensaios preliminares com duas espécies de pulgões também mostrou que uma mistura de proteínas de ISP1A e ISP2A não causa qualquer mortalidade significante para estes insetos.

Para determinar qual fragmento dos genes de isp é suficiente para codificar um complexo de proteína ISP tóxico para as larvas Diabrotica. uma série de proteínas de ISP truncadas de terminal C foi feita por inserção de um códon de parada na ORF dos genes de isp em posições diferentes (e assim fazendo truncagens de gene 3’ diferentes). Os códons de parada foram inseridos em posições aleatórias usando o Genome Priming System (GPS, New England Biolabs, catálogo número 7100). Usando este sistema, um transposon de 1,7 kb (contendo códons de parada em todas as três estruturas de leitura e 2 seqüências complementares para primes específicos) é inserido aleatoriamente, porém apenas uma vez no DNA alvo. A posição da inserção e portanto, a truncagem podem então ser estimadas por classificação de PCR usando um iniciador específico para gene e um iniciador específico para transposon ou pode ser precisamente determinado por seqüenciamento. Um conjunto de construções com um transposon em posições diferentes em um dos genes de isp foi então transformado individualmente em uma cepa Bt de menos cristal e a suscetibilidade das larvas de verme de raiz de milho do Oeste ao sobrenadante de cada cepa Bt recombinante foi testada usando o ensaio descrito acima.

Para truncagem do gene isp2. um fragmento contendo o gene foi cortado de pSLIB120/ISP usando BstBi e Pmll. Seguindo-se a reação de GPS, este fragmento foi então ligado ao vetor de pSLIB120/ISP, cortado com as mesmas enzimas. Colônias de E.coli recombinantes foram classificadas por PCR, a fim de estimar a posição do sítio de inserção de transposon. Um conjunto de 10 clones com o transposon em posições diferentes na segunda metade (3' metade) do gene isp2 foi selecionado. O DNA de plasmídeo destes clones foi transformado em uma cepa de E.coli negativa de metilase dem e dam GM2163. O DNA de plasmídeo isolado desta cepa foi então transformado em uma cepa Bt de menos cristal. O sobrenadante foi preparado e bioensaiado, usando sobrenadante da cepa Bt transformado com pSLIB120/ISP como um controle positivo e sobrenadante da cepa Bt menos cristal como um controle negativo. Para truncagem do gene isp1. um fragmento foi cortado de pSLlB120/ISP usando Pmll e EcoRI. A mesma metodologia foi seguida como para a truncagem do gene isp2.

Os resultados da análise de inserção de transposon indicam que a truncagem de segmentos relativamente grandes do gene isp2A na extremidade 31 abole a toxicidade, indicando que nenhuma ou apenas uma • ·

Γ truncagem de terminal C relativamente curta é permitida na proteína ISP2A. Após seqüenciamento, o fragmento de toxina ISP2A truncado no terminal C menor retendo a toxicidade neste estudo quando testado em combinação com a proteína de ISP1A foi encontrado como terminando em uma posição de aminoácido 449 na SEQ ID N^Q 4.

Os resultados destas análises indicam que uma truncagem maior da proteína de ISP1A na extremidade 3' é possível: a determinação da seqüência mostrou que o fragmento tóxico com a truncagem de terminal C maior terminou na posição de aminoácido 768 na SEQ ID N- 2. Assim, cerca de 300 pb de ISP1A codificando a região podem ser apagados no lado 3' sem enfraquecer a toxicidade.

O estudo acima também indica que a atividade inseticida é reduzida para o nível de base quando nenhum ISP1A funcional é produzido, confirmando a natureza binária das proteínas de ISP desta invenção.

A proteína de ISP2A da posição de aminoácido 51 para a posição de aminoácido 449 na SEQ ID N^Q 4 e a proteína de ISP1A da posição de aminoácido 38 para a posição de aminoácido 768 na SEQ ID N- 2 são assim fragmentos inseticidas úteis das proteínas de ISP.

Adicionalmente, um gene quimérico contendo uma fusão de DNA dos genes de ISP1A e ISP2A foi expressa em uma cepa 1715 de Berlim de Bacillus thuringiensis de menos cristal. Uma seqüência de DNA codificando um ligante Arg-Lys (RKRKRK) ou uma seqüência de DNA codificando um ligante Gly (GGGGGG)foi provida entre as estruturas de leitura aberta codificando as proteínas ISP2A e ISP1A (ISP2A ainda possui seu peptídeo de sinal de terminal N presente, enquanto ISP1A perde seu peptídeo de sinal), de modo que a proteína de fusão translacional é produzida; isto é, uma proteína de fusão na qual o ligante especificado conecta a proteína ISP2A (como a parceira de fusão de terminal N) à proteína ISP1A (como a parceira de fusão de terminal C). A cepa Bt recombinante provou causar a morte de Diabrotica virqifera que foi significativamente maior do que aquela da cepa de controle não transformada (isto é, a cepa de Bt 1715 de menos cristal). Isto mostra a possibilidade de produção de proteínas de

• · ·

ISP da invenção como uma proteína de fusão em uma célula hospedeira recombinante por uso de um gene quimérico simples. Obviamente, conforme explicado na descrição da invenção, várias abordagens diferentes podem ser usadas para obter-se a produção de uma proteína de fusão na célula recombinante, por exemplo, células de uma planta.

Exemplo 3: Produção de proteínas de ISP nas plantas:

Para obter a expressão ótima em plantas, as seqüências de DNA nativo isp1A e isp2A são modificadas para produzir seqüências de DNA modificadas codificando as proteínas de ISP1A e ISP2A. As seqüências de DNA otimizadas codificando as proteínas de ISP1A-1 e ISP2A-1 com seus peptídeos de sinal substituídas por uma metionina e aminoácido de alanina são mostradas nas SEQ ID N⁹ 9 e 7, respectivamente.

Estas regiões de codificação são inseridas em um gene quimérico operavelmente ligado às seqüências reguladoras apropriadas, por exemplo, um promotor, com base nas seqüências promotoras zrp2 longas ou curtas da SEQ ID N⁹ 5 ou 6 usando técnicas padrão e terminação de transcrição 3' apropriada e seqüências de poliadenilação. Em algumas construções, os genes quiméricos acima contêm uma seqüência de DNA codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto otimizado (no lugar do peptídeo de sinal bacteriano de terminal N) conforme descrito na Patente US 5.510.471 (ou Patente US reemitida RE 036449) resultando no alvo para os plastídeos ou um peptídeo de sinal levando ao alvo a parede da célula. Outros peptídeos de sinal eficazes nas células das plantas podem ser similarmente usados, preferivelmente o peptídeo de sinal codificado pelo gene 3 de alfa-amilase de arroz (Sutliff e outros, 1991, Plant Molec. Biol. 16, 579591), o peptídeo de sinal codificado pelo gene de ferredoxina NADP+ oxidorreductase do espinafre (Oelmueller e outros, 1993, Mol. Gen. Genet. 237, 261-272) ou o peptídeo de sinal codificado pelo gene II inibidor de proteinase de batata (Keil e outros, 1986, Nucl. Acids Res. 14, 5641-5650).

As células de milho são estavelmente transformadas com os genes quiméricos isp1A e isp2A usando transformação mediada por Agrobacterium (Ishida e outros, 1996, Nature Biotechnology 14, 745-750; e Patente (Λ

US número 5.591.616), transformação de protoplasto conforme descrito na patente US 5.792.936 ou por eletroporação usando calos embriogênico degradado por enzima e enrolado, conforme descrito no WO 92/09696 ou Patente US 5.641.664 (todas as referências citadas acima são incorporadas aqui como referência). As plantas de milho são regeneradas das células transformadas e são selecionadas para níveis de expressão ótimos em raízes e quanto as características agronômicas totais. As plantas de milho transgênicas assim obtidas produzindo as proteínas de ISP da invenção, acima, causam mortalidade significante às larvas de Diabrotica virqifera que tentam alimentar-se de tais plantas.

De acordo com esta invenção, plantas de milho transformadas estavelmente são também obtidas contendo vários constructos de DNA, de modo que a planta de milho pode expressar uma ou ambas as proteínas de ISP da invenção nas células sob controle das regiões de controle reguladoras apropriadas, em conjunto com um gene marcador apropriado, preferivelmente um gene resistente a herbicida. Nestas construções de DNA uma seqüência de poliadenilação e terminação de transcrição 3' preferida é um fragmento de 215 bp contendo as seqüências de poliadenilação e terminação de transcrição 3' obtidas da Cauliflower Mosaic virus (vírus mosaico da couve-flor) (Oka e outros, 1981, J. Mol. Biol. 147, 217-226). Em algumas construções, uma seqüência líder não traduzida 5' pode ser adicionada, preferivelmente àquelas escolhidas das seqüências líder de um gene cab22 de Petunia (Harpster e outros, 1988, Mol. Gen Genetics 212, 182-190) ou o gene zrp2 (Held e outros, 1997, Plant Molecular Biology 35, 367-375, número de acesso ao Genbank U38790). Os promotores preferidos nas construções são partes eficazes do promotor do promotor 35S (por exemplo, Odell e outros, 1985, Nature 313, 810-812) ou promotores zrp2 (Held e outros, 1997, Plant Molecular Biology 35, 367-375, número de acesso do Genbank U38790). Os constructos podem também conter um peptídeo de sinal eficaz nas células de plantas além dos peptídeos de trânsito de cloroplasto otimizados acima, a saber, o peptídeo de sinal do gene 3 de alfa-amilase do arroz (Sutliff e outros, 1991, Plant Molec. Biol. 16, 579-591), o peptídeo de • · · sinal de ferredoxina NADP+ oxidorreductase do espinafre(Oelmueller e outros, 1993, Mol. Gen. Genet. 237, 261-272) ou o peptídeo de sinal do inibidor II de proteinase de batata (Keil e outros, 1986, Nucl. Acids Res. 14, 5641-5650). As transformações das plantas com genes quiméricos de ISP usando uma seleção dos elementos preferidos acima usando técnicas disponíveis aos versado na técnica comum podem ser usadas para obter o objetivo desejado da invenção. Preferivelmente, as plantas também contêm um gene codificando uma proteína que confere resistência ao flufosinato ou glifosfato, para o que um promotor diferente e/ou seqüência líder é usada, por exemplo, o promotor gos2 e/ou o líder gos2 (de Pater e outros, 1992, Plant J. 2, 837-844).

Desnecessário dizer que esta invenção não está limitada aos processos de transformação de plantas de milho acima, nem às proteínas de ISP específicas ou seqüências de DNA usadas. Ao invés disto, a invenção também inclui qualquer variante ou equivalente da proteína de ISP retendo atividade inseticida, tal como uma proteína possuindo substancialmente a seqüência de aminoácido das proteínas de ISP da invenção e possuindo substancialmente a atividade inseticida das proteínas de ISP. Também, qualquer planta que seja suscetível ao dano por insetos coleópteros, especificamente vermes de raiz de milho, gorgulhos ou besouros de batata, especialmente Diabrotica virgifera ou Leptinotarsa decemlineata. preferivelmente um inseto selecionado do grupo consistindo em: Agelastica alni, Hypera postiça. Hypera brunneipennis. Haltica tombacina. Anthonomus qrandis. Tenebrio molitor. Triboleum castaneum, Dicladispa armigera. Trichispa serica, Oulema oryzae, Colaspis brunnea. Lissorhorptrus orvzophilus. Phvllotreta cruciferae, Phvllotreta striolata. Psylliodes Punctulata. Entomoscelis americana. Meligethes aeneus, Ceutorvnchus sp., Psylliodes chrysocephala. Phvllotreta undulata, Leptinotarsa decemlineata. Diabrotica undecimpunctata, Diabrotica undecimpunctata howardi. Diabrotica barberi e Diabrotica virgifera. está incluído na invenção como um alvo preferido para transformação com um DNA codificando uma proteína de ISP.

Claims (30)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende:

   (i) a sequência de aminoácido de SEQ ID N° 2 da posição de aminoácido 38 à posição de aminoácido 768,

   5 fusionada a:

   (a) um peptídeo sinal de planta para secreção ou endereçamento, (b) um aminoácido metionina, ou (c) um dipeptídeo metionina-alanina,

   10 sendo que a proteína é inseticida para larvas de Diabrotica virgifera, quando ingerida pelas referidas larvas em combinação com uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 4 da posição de aminoácido 51 a 457.
2. 2. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende:

   15 (i) a sequência de aminoácido de SEQ ID N° 4 da posição de aminoácido 51 à posição 449, fusionada a:

   (a) um peptídeo sinal de planta para secreção ou endereçamento,

   20 (b) um aminoácido metionina, ou (c) um dipeptídeo metionina-alanina, sendo que a proteína é inseticida para larvas de Diabrotica virgifera, quando ingerida pelo inseto em combinação com uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 2 da posição de aminoácido 38 a

   25 871.
3. 3. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido peptídeo sinal de planta é um peptídeo de trânsito de cloroplasto.
4. 4. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo 30 fato de que compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID N° 10.
5. 5. Proteína, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o referido peptídeo sinal de planta é um peptídeo de trânsito de

   Petição 870170036158, de 30/05/2017, pág. 5/25 cloroplasto.
6. 6. Proteína, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID N° 8.
7. 7. Proteína híbrida, caracterizada pelo fato de que compreende a

   5 sequência de aminoácido de SEQ ID N° 2 da posição de aminoácido 38 à posição de aminoácido 768, e a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 4 da posição de aminoácido 51 à posição 449.
8. 8. Gene quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (i) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 1 da posição de

   10 nucleotídeo 112 à posição de nucleotídeo 2304 ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos que a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 1 da posição de nucleotídeo 112 à posição de nucleotídeo 2304;

   (ii) a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 3 da posição de

   15 nucleotídeo 151 à posição de nucleotídeo 1347 ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos que a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 3 da posição de nucleotídeo 151 à posição de nucleotídeo 1347; e (iii) uma região promotora heteróloga;

   20 em que (i), (ii) e (iii) estão operacional mente ligadas.
9. 9. Gene quimérico, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a região promotora heteróloga é uma região promotora expressável em planta.
10. 10. DNA codificando uma proteína inseticida para larvas de Dia25 brotica virgifera, quando ingerida pelas referidas larvas em combinação com uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 4 da posição de aminoácido 51 a 457, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 1 da posição de nucleotídeo 112 à posição de nucleotídeo 2304 ou uma sequência de nucleotídeos

    30 degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos que a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 1 da posição de nucleotídeo 112 à posição de nucleotídeo 2304, fusionada a:

    Petição 870170036158, de 30/05/2017, pág. 6/25 (a) um DNA codificando um peptídeo sinal de planta para secreção ou endereçamento, (b) um DNA codificando um aminoácido metionina, ou (c) um DNA codificando um dipeptídeo metionina-alanina.

    5
11. 11. DNA codificando uma proteína inseticida para larvas de Diabrotica virgifera, quando ingerida pelas referidas larvas em combinação com uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 2 da posição de aminoácido 38 a 871, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 3 da posição de nucleotí10 deo 151 à posição de nucleotídeo 1347 ou uma sequência de nucleotídeos degenerada da mesma codificando a mesma sequência de aminoácidos que a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 3 da posição de nucleotídeo 151 à posição de nucleotídeo 1347, fusionada a:

    (a) um DNA codificando um peptídeo sinal de planta para secre15 ção ou endereçamento, (b) um DNA codificando um aminoácido metionina, ou (c) um DNA codificando um dipeptídeo metionina-alanina.
12. 12. DNA de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 9.

    20
13. 13. DNA de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 7.
14. 14. Gene quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende o DNA, como definido na reivindicação 10 ou 12, e uma região promotora expressável em planta.

    25
15. 15. Gene quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende o DNA, como definido na reivindicação 11 ou 13, e uma região promotora expressável em planta.
16. 16. Gene quimérico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a referida região promotora é preferivelmente ativa

    30 no tecido de raiz.
17. 17. Gene quimérico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a referida região promotora é preferivelmente ativa

    Petição 870170036158, de 30/05/2017, pág. 7/25 no tecido de raiz.
18. 18. Gene quimérico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o promotor compreende a sequência de DNA da SEQ ID N° 5 ou 6.

    5
19. 19. Gene quimérico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o referido promotor compreende a sequência de DNA da SEQ ID N° 5 ou 6.
20. 20. Gene quimérico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um peptídeo sinal para secreção

    10 da célula ou para endereçamento a uma organela celular.
21. 21. Gene quimérico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um peptídeo sinal para secreção da célula ou para endereçamento a uma organela celular.
22. 22. Gene quimérico, de acordo com a reivindicação 20, caracte15 rizado pelo fato de que o referido peptídeo sinal é um peptídeo de trânsito de cloroplasto.
23. 23. Gene quimérico, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o referido peptídeo de sinal é um peptídeo de trânsito de cloroplasto.

    20
24. 24. Processo para controle de insetos, caracterizado pelo fato de que compreende expressar, nas células de uma planta, a proteína, como definida na reivindicação 7, ou duas proteínas, em que a primeira proteína é selecionada da proteína, como definida em qualquer uma das reivindicações 1, 3 e 4, e a segunda proteína é selecionada da proteína, como definida em
25. 25 qualquer uma das reivindicações 2, 5 e 6.

    25. Processo para tornar uma planta resistente a insetos coleópteros, caracterizado pelo fato de que compreende transformar células de plantas com o gene quimérico, como definido na reivindicação 9, ou com um primeiro gene quimérico e um segundo gene quimérico e regenerar plantas

    30 transformadas das referidas células que são resistentes a insetos, em que o referido primeiro gene quimérico é o gene quimérico, como definido em qualquer uma das reivindicações 14, 16, 18, 20 ou 22; e o referido segundo

    Petição 870170036158, de 30/05/2017, pág. 8/25 gene quimérico é o gene quimérico, como definido em qualquer uma das reivindicações 15, 17, 19, 21 ou 23.
26. 26. Processo para controlar pragas de insetos coleópteros, caracterizado pelo fato de que compreende plantar, semear ou cultivar em um

    5 campo, plantas transformadas com o gene quimérico, como definido na reivindicação 9, ou com um primeiro gene quimérico e um segundo gene quimérico, em que o referido primeiro gene quimérico é o gene quimérico, como definido em qualquer uma das reivindicações 14, 16, 18, 20 e 22; e o referido segundo gene quimérico é selecionado do gene quimérico, como definido

    10 em qualquer uma das reivindicações 15, 17, 19, 21 e 23.
27. 27. Processo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que as referidas plantas são plantas de milho.
28. 28. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado pelo fato de que o inseto é selecionado do grupo con15 sistindo em: vermes de raiz, gorgulhos, besouros de batatas, espécies Diabrotica, Anthonomus spp., Leptinotarsa spp., Agelastica alni, Hypera postiça, Hypera brunneipennis, Haltica tombacina, Anthonomus grandis, Tenebrio molitor, Triboleum castaneum, Dicladispa armigera, Trichispa serica, Oulema oryzae, Colaspis brunnea, Lissorhorptrus oryzophilus, Phyllotreta cruciferae,

    20 Phyllotreta striolata, Psylliodes Punctulata, Entomoscelis americana, Meligethes aeneus, Ceutorynchus sp., Psylliodes chrysocephala, Phyllotreta undulata, Leptinotarsa decemlineata, Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata, Diabrotica undecimpunctata howardi, Diabrotica barberi e Diabrotica virgifera.

    25
29. 29. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende:

    (i) a proteína, como definida em qualquer uma das reivindicações 1, 3 ou 4, e a proteína, como definida em qualquer uma das reivindicações 2, 5 ou 6, ou (!’) a proteína, como definida na reivindicação 7,
30. 30 em conjunto com (ii) veículos, diluentes, emulsificantes e/ou dispersantes apropriados como uma preparação combinada para uso simultâneo, separado ou

    Petição 870170036158, de 30/05/2017, pág. 9/25 sequencial para proteger as plantas de milho contra vermes de raiz de milho.

    30. Microrganismo, caracterizado pelo fato de que é transformado para conter o DNA, como definido em qualquer uma das reivindicações

    10a 13.

    Petição 870170036158, de 30/05/2017, pág. 10/25