BRPI0206346B1 - Dna que codifica uma proteína inseticida cry2ae, gene quimérico compreendendo o mesmo, proteína inseticida, uso da mesma, micro-organismo, bem como processo para tornar uma planta resistente a um inseto lepidóptero - Google Patents
Dna que codifica uma proteína inseticida cry2ae, gene quimérico compreendendo o mesmo, proteína inseticida, uso da mesma, micro-organismo, bem como processo para tornar uma planta resistente a um inseto lepidóptero Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0206346B1 BRPI0206346B1 BRPI0206346-8A BRPI0206346A BRPI0206346B1 BR PI0206346 B1 BRPI0206346 B1 BR PI0206346B1 BR PI0206346 A BRPI0206346 A BR PI0206346A BR PI0206346 B1 BRPI0206346 B1 BR PI0206346B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- protein
- dna
- amino acid
- acid sequence
- fact
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 367
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 294
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims description 86
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 51
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 35
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 7
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 title description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 74
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 claims abstract description 56
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 119
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 52
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 48
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 31
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 20
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 19
- 241000255967 Helicoverpa zea Species 0.000 claims description 11
- 241001147398 Ostrinia nubilalis Species 0.000 claims description 11
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 241000256244 Heliothis virescens Species 0.000 claims description 7
- 241000625764 Anticarsia gemmatalis Species 0.000 claims description 6
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 claims description 6
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 6
- 241001147381 Helicoverpa armigera Species 0.000 claims description 5
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 claims description 5
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims description 5
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 claims description 4
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims description 3
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 claims description 3
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 claims description 3
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 claims description 3
- JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N Met-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 3
- QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N Met-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 3
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 3
- 241001515826 Cassava vein mosaic virus Species 0.000 claims description 2
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 2
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 3
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 claims 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 claims 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims 1
- 229930002868 chlorophyll a Natural products 0.000 claims 1
- 229930002869 chlorophyll b Natural products 0.000 claims 1
- NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M chlorophyll b Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C=O)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M 0.000 claims 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 abstract description 6
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 abstract description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 70
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 39
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 39
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 30
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 30
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 24
- 101150086784 cry gene Proteins 0.000 description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 20
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 20
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 20
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 20
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 19
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 19
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 16
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 14
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 14
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 13
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 13
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 13
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 12
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 12
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 12
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 11
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 10
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 9
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 7
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 7
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 7
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 6
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 6
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 6
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 6
- 241000426497 Chilo suppressalis Species 0.000 description 5
- 241000098277 Cnaphalocrocis Species 0.000 description 5
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 4
- 101710151559 Crystal protein Proteins 0.000 description 4
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 4
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 238000003462 Bender reaction Methods 0.000 description 3
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 241000661337 Chilo partellus Species 0.000 description 3
- 241000289657 Cnaphalocrocis exigua Species 0.000 description 3
- 241000098289 Cnaphalocrocis medinalis Species 0.000 description 3
- 241000008892 Cnaphalocrocis patnalis Species 0.000 description 3
- 101150102464 Cry1 gene Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 3
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 3
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 3
- 241001147397 Ostrinia Species 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 241001249129 Scirpophaga incertulas Species 0.000 description 3
- 241000098281 Scirpophaga innotata Species 0.000 description 3
- 241000563489 Sesamia inferens Species 0.000 description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 3
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 3
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 3
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 235000021405 artificial diet Nutrition 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 2
- 101150000551 CRYAA gene Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 2
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 2
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 2
- 235000004341 Gossypium herbaceum Nutrition 0.000 description 2
- 240000002024 Gossypium herbaceum Species 0.000 description 2
- 235000008694 Humulus lupulus Nutrition 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 241000931987 Sesamia Species 0.000 description 2
- 241000661452 Sesamia nonagrioides Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- CYDMQBQPVICBEU-UHFFFAOYSA-N chlorotetracycline Natural products C1=CC(Cl)=C2C(O)(C)C3CC4C(N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)C4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O CYDMQBQPVICBEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004475 chlortetracycline Drugs 0.000 description 2
- CYDMQBQPVICBEU-XRNKAMNCSA-N chlortetracycline Chemical compound C1=CC(Cl)=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O CYDMQBQPVICBEU-XRNKAMNCSA-N 0.000 description 2
- 235000019365 chlortetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 210000005061 intracellular organelle Anatomy 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 235000021590 normal diet Nutrition 0.000 description 2
- 229960000988 nystatin Drugs 0.000 description 2
- VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N nystatin A1 Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/CC/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 1
- 101150101112 7 gene Proteins 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101710165031 Alpha-amylase 3 Proteins 0.000 description 1
- 241000625753 Anticarsia Species 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 108700003918 Bacillus Thuringiensis insecticidal crystal Proteins 0.000 description 1
- 101000878902 Bacillus thuringiensis Pesticidal crystal protein Cry6Aa Proteins 0.000 description 1
- 101000878906 Bacillus thuringiensis Pesticidal crystal protein Cry6Ba Proteins 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 101150063057 CRYAB gene Proteins 0.000 description 1
- 206010007134 Candida infections Diseases 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 241000426499 Chilo Species 0.000 description 1
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 description 1
- 244000189548 Chrysanthemum x morifolium Species 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 244000241235 Citrullus lanatus Species 0.000 description 1
- 235000012828 Citrullus lanatus var citroides Nutrition 0.000 description 1
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 1
- 101000622007 Crotalus adamanteus Snake venom metalloproteinase adamalysin-2 Proteins 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N D-ribulose 1,5-bisphosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)COP(O)(O)=O YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 1
- 235000012040 Dahlia pinnata Nutrition 0.000 description 1
- 244000033273 Dahlia variabilis Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010074122 Ferredoxins Proteins 0.000 description 1
- 241000245654 Gladiolus Species 0.000 description 1
- 241001425722 Greta Species 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 241000255990 Helicoverpa Species 0.000 description 1
- 241000256257 Heliothis Species 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 241000220225 Malus Species 0.000 description 1
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 description 1
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 208000007027 Oral Candidiasis Diseases 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 241001148062 Photorhabdus Species 0.000 description 1
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 description 1
- 240000003889 Piper guineense Species 0.000 description 1
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 description 1
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 108020005089 Plant RNA Proteins 0.000 description 1
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 1
- 240000001987 Pyrus communis Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 241001249127 Scirpophaga Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 1
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 1
- 240000003829 Sorghum propinquum Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 241001508381 Subterranean clover stunt virus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- 241000287411 Turdidae Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000704 biodegradable plastic Polymers 0.000 description 1
- 230000000853 biopesticidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000081 body of the sternum Anatomy 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 201000003984 candidiasis Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 1
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000011833 salt mixture Substances 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 235000000891 standard diet Nutrition 0.000 description 1
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
"proteínas inseticidas de bacillus thuringiensis". a invenção pertence a novos compostos inseticidas derivados de linhagens de bacillus thuringiensis. novas proteínas designadas cry2ae, cry2af e cry2ag, e suas variantes são providas, assim como seqüências de dna codificando estas proteínas ou suas variantes. são ainda providos hospedeiros recombinantes expressando tais proteínas, particularmente células de plantas e plantas.
Description
(54) Título: DNA QUE CODIFICA UMA PROTEÍNA INSETICIDA CRY2AE, GENE QUIMÉRICO COMPREENDENDO O MESMO, PROTEÍNA INSETICIDA, USO DA MESMA, MICRO-ORGANISMO, BEM COMO PROCESSO PARA TORNAR UMA PLANTA RESISTENTE A UM INSETO LEPIDÓPTERO (73) Titular: BAYER CROPSCIENCE NV, Sociedade Belga. Endereço: B-9000 Gent, Jozef Plateaustraat 22, BÉLGICA (BE) (72) Inventor: GRETA ARNAUT; ANNEMIE BOETS; STIJN VANNESTE; JEROEN VAN RIE; SARA VAN HOUDT
Código de Controle: 132D8E39BCF6E4A3 76DDF59C976DEFAD
Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 03/04/2018, observadas as condições legais
Expedida em: 03/04/2018
Assinado digitalmente por:
Júlio César Castelo Branco Reis Moreira
Diretor de Patente
1/43
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para DNA QUE CODIFICA UMA PROTEÍNA INSETICIDA Cry2Ae, GENE QUIMÉRICO COMPREENDENDO O MESMO, PROTEÍNA INSETICIDA, USO DA MESMA, MICRO-ORGANISMO, BEM COMO PROCESSO PARA TORNAR UMA PLANTA RESISTENTE A UM INSETO LEPIDÓPTERO.
INTRODUÇÃO [001] A presente invenção refere-se a novas sequências de ácido nucléico, particularmente sequências de DNA, codificando proteínas inseticidas produzidas por linhagens de Bacillus thuringiensis. Particularmente, novas sequências de ácido nucléico, particularmente sequências de DNA codificando proteínas designadas como Cry2Ae, Cry2Af e Cry2Ag são providas as quais são úteis para proteção de plantas a partir de dano de inseto. Também são aqui incluídos microorganismos e plantas transformadas com uma sequência de ácidos nucléicos, particularmente uma sequência de DNA, codificando pelo menos uma das proteínas Cry2A recém-isoladas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO (i) Campo da Invenção:
[002] Bacillus thringiensis (aqui abreviado como Bt) é bem conhecido por sua específica toxidez para pestes de insetos, e tem sido usado desde quase um século para controlar pestes de insetos de plantas. Em anos mais recentes, plantas transgênicas expressando proteínas Bt foram obtidas as quais foram verificadas controlarem com sucesso dano de inseto sobre plantas (por exemplo, Vaeck et al., 1987, Jansens et al., 1997).
[003] À despeito de isolamento de um bom número de genes Bt inseticidas,a busca por novos genes codificando proteínas inseticidas continua. Realmente, proteínas Bt inseticidas são conhecidas terem uma faixa de inseto alvo relativamente estreita comparado a insetici2/43 das químicos. Também, tendo-se toxinas múltiplas para as mesmas espécies de inseto alvo é permitido o uso de proteínas tendo diferentes modos de ação de modo que desenvolvimento de resistência de inseto pode ser prevenido ou retardado. E ainda, proteínas Bt inseticidas com diferentes sequências de aminoácidos têm diferentes níveis de eficácia inseticida contra específicos insetos, tornando desejável ter-se várias diferentes proteínas inseticidas disponíveis de modo a possibilitar o controle de relevantes pestes de insetos de diferentes plantas de colheita.
(ii) Descrição de Técnica Relacionada:
[004] Previamente, vários tipos de proteínas Cry2A foram identificados (ver Crickmore et ai., 1998, aqui incorporado por referência). [005] A nova proteína Cry2A desta invenção tem a mais alta identidade de sequência de aminoácidos para a proteína Cry2Aa1 (Donovan et ai., número de acesso GenBank M31738), mas ainda difere em cerca de 9 por cento de sua sequência de aminoácidos. A mais próxima identidade de sequência para a proteína Cry2Af foi encontrada na proteína Cry2Ab1 (Widner and Whiteley, número de acesso GenBank M23724), mas ambas proteínas ainda diferem em cerca de 5 por cento de sua sequência de aminoácidos. A mais próxima identidade de sequência para a proteína Cry2Ag foi encontrada em proteína Cry2Ac1 (Wu et ai., número de acesso GenBank X57252), mas ambas proteínas ainda diferem em cerca de 20 por cento de sua sequência de aminoácidos. Ainda, proteínas Cry2A conhecidas incluem a proteína Cry2Ad1 (Choi et ai., 1999), e outras proteínas Cry2Aa, Cry2Ab, e Cry2Ac (Crickmore et ai., 1998). Proteínas semelhantes-Cry2A e sequências de DNA codificando as mesmas também são mostradas na patente US 5.338.544, N° pedido de patente PCT publicado WO 00/26371 e em pedido de patente PCT publicado W098/40490.
[006] Expressão de proteínas tipo-Cry2A em plantas foi descrita,
3/43 por exemplo, em Kota et al. (1999) e em pedido de patente PCT publicado WO 00/26371.
OBJETOS E SUMÁRIO DA INVENÇÃO [007] De acordo com esta invenção é provida uma sequência de ácidos nucléicos, particularmente uma sequência de DNA, codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em: a) a sequência de aminoácidos do menor fragmento tóxico da proteína codificada pelo gene cry2Ae depositado no BCCM-LMBP sob o número de acesso LMBP 4248, b) a sequência de aminoácidos do menor fragmento tóxico da proteína codificada pelo gene cry2Af depositado no BCCM-LMBP sob o número de acesso 4247, e c) a sequência de aminoácidos do menor fragmento tóxico da proteína codificada pelo gene cry2Ag depositado no BCCM-LMBP sob o número de acesso LMBP 4249.
[008] Particularmente preferida de acordo com esta invenção é uma sequência de ácidos nucléicos, particularmente uma sequência de DNA, codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em: a sequência de aminoácidos de um fragmento inseticida da proteína de SEQ ID No. 2, a sequência de aminoácidos de um fragmento inseticida da proteína de SEQ ID No. 4, a sequência de aminoácidos de um fragmento inseticida da proteína de SEQ ID No. 4.
[009] Ainda, de acordo com esta invenção são providas sequências de ácidos nucléicos, particularmente sequências de DNA, codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em: a sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 2 de aminoácido de posição 1 a aminoácido de posição 632, a sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 4 a partir de aminoácido de posição 1 a aminoácido de posição 632, e a sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 6 a partir de aminoácido de posição 1 a
4/43 aminoácido de posição 627.
[0010] Ainda, de acordo com esta invenção são providas as sequências de ácidos nucléicos acima,particularmente sequências de DNA, compreendendo uma sequência artificial, tendo uma diferente utilização de códon comparada à sequência ocorrendo naturalmente, mas codificando a mesma proteína ou seu fragmento inseticida, preferivelmente tal utilização de códon parece-se com aquela de plantas, particularmente a planta hospedeira na qual a sequência de ácido nucléico, particularmente o DNA, é para ser transformado.
[0011] Mesmo ainda provida de acordo com esta invenção é uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em: a) a sequência de aminoácidos do menor fragmento tóxico da proteína codificada pelo gene cry2Ae depositado no BCCM-LMBP sob o número de acesso LMBP 4248, b) a sequência de aminoácido do menor fragmento tóxico da proteína codificada pelo gene cry2Af depositado no BCCM-LMBP sob o número de acesso LMBP 4247, e c) a sequência de aminoácidos do menor fragmento tóxico inseticida da proteína codificada pelo gene cry2Ag depositado no BCCM-LMBP sob o número de acesso LMBP 4249.
[0012] Particularmente preferida aqui é uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em: a sequência de aminoácidos de um fragmento inseticida da proteína de SEQ ID No. 2, a sequência de aminoácidos de um fragmento inseticida da proteína de SEQ ID No. 4, e a sequência de aminoácidos de um fragmento inseticida da proteína de SEQ ID No. 6.
[0013] São também aqui providos genes quiméricos compreendendo o DNA como definido acima sob o controle de um promotor expressável em planta, e células de planta, plantas ou sementes transformadas para conterem aqueles genes quiméricos, particularmente células de plantas,plantas, ou sementes selecionadas do grupo consis5/43 tindo em: milho, algodão, arroz, tabaco, colza, espécies Brassica, berinjela, soja, batata, girassol, tomate, cana-de-açúcar, chá, feijão, tabaco, morango, trevo, pepino, melancia, pimenta, aveia, cevada, trigo, dália.gladíolo, crisântemo, beterraba sacarina, sorgo, alfafa, maçã, pêra, morango, e amendoim. De acordo com esta invenção, o gene quimérico pode ser integrado no DNA nuclear, plastídeo ou mitocondrial das células de planta, ou também pode conter um DNA codificando um peptídeo de alvo ou trânsito efetivo para endereçar para o vacúolo, cloroplasto, mitocôndria, plastídeo ou para secreção.
[0014] Ainda de acordo com esta invenção são providos microorganismos, transformados para conterem quaisquer das sequências de DNA acima, particularmente aqueles selecionados do gênero Pseudomonas, Agrobacterium, Escherichia, ou Bacillus.
[0015] É também provido aqui um processo para controle de insetos, compreendendo expressão de qualquer uma das sequências de ácidos nucléicos acima, particularmente sequências de DNA, em uma célula hospedeira particularmente células de plantas, e contatando insetos com as ditas células hospedeiras, e um processo para tornar uma planta resistente a insetos, compreendendo transformação de células de plantas com qualquer uma das sequências de DNA acima ou genes quiméricos, e regenerando plantas transformadas a partir de tais células que são resistentes a insetos.
[0016] Esta invenção também refere-se a um processo para controle de insetos lepidópteros, particularmente pestes de insetos lepidópteros de algodão, milho ou soja, cujo processo compreende aplicação a uma área ou planta a ser protegida, uma proteína Cry2A como aqui definida, preferivelmente uma proteína Cry2Ae como aqui definida, (isto é, através de plantio de uma planta transformada com um gene cry2A desta invenção, ou através de espargimento de uma composição contendo uma proteína Cry2A desta invenção). A invenção tam6/43 bém refere-se ao uso das proteínas Cry2A desta invenção, particularmente a proteína Cry2Ae, contra pestes de insetos Lepidópteros para minimizar dano a plantas de soja.
[0017] Esta invenção ainda refere-se a um processo para controle de pestes de insetos lepidópteros de arroz, particularmente Lepidópteros broca de caule de arroz, hespérias de arroz, lagarta de agrotídeos de arroz, lagarta dos cereais de arroz, grumixá de arroz, ou dobradores de folha de arroz, preferivelmente um inseto selecionado do grupo consistindo em: Chilo suppressalis, Chilo partellus, Scirpophaga incertulas, Sesamia inferens, Cnaphalocrocis medinalis, Marasmia patnalis, Marasmia exigua, Marasmia ruralis, Scirpophaga innotata, cujo processo compreende aplicação a uma área ou planta a ser protegida, uma proteína Cry2A como aqui definida, preferivelmente uma proteína Cry2Ae como aqui definida (isto é, através de plantio de uma planta de arroz transformada com um gene cry2A desta invenção, ou espargimento de uma composição contendo uma proteína Cry2A desta invenção). A invenção também refere-se ao uso das proteínas Cry2A desta invenção, particularmente a proteína Cry2Ae, contra pestes de insetos Lepidópteros de arroz para minimizar dano para plantas de arroz. DESCRIÇÃO DETALHADA DE REALIZAÇÕES PREFERIDAS DA INVENÇÃO [0018] De acordo com esta invenção, uma sequência de ácido nucléico refere-se a uma molécula de DNA ou ARN em forma de fita simples ou dupla, preferivelmente um DNA ou ARN, particularmente um DNA, codificando qualquer das proteínas Cry2A desta invenção. Uma sequência de ácidos nucléicos isolada, como aqui usada, refere-se a uma sequência de ácidos nucléicos que não está mais no ambiente natural de onde ela foi isolada, por exemplo, a sequência de ácidos nucléicos em um outro hospedeiro bacterial ou em um genoma nuclear de planta.
7/43 [0019] De acordo com esta invenção, os termos proteína ou polipeptídeo são usados intercambiavelmente para referirem-se a uma sequência de aminoácidos, sem referência a qualquer funcionalidade, tamanho, estruturas tridimensionais ou origem. Portanto, um fragmento ou porção de uma proteína Cry2A da invenção é ainda aqui referido como uma proteína.
[0020] De acordo com esta invenção, sequências de ácidos nucléicos, particularmente sequências de DNA, codificando novas toxinas Cry Bt foram isoladas e caracterizadas. Os novos genes foram designados cry2Ae, cry2Af, cry2Ag e suas proteínas codificadas Cry2Ae, Cry2Af e Cry2Ag.
[0021] De acordo com esta invenção proteína Cry2Ae refere-se a qualquer proteína compreendendo o menor fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 2 que retem atividade inseticida (daqui por diante referido como o menor fragmento tóxico), particularmente qualquer proteína compreendendo a sequência de aminoácidos a partir do aminoácido na posição 1 ao aminoácido na posição 625, particularmente para o aminoácido na posição 632 em SEQ ID No. 2. Isto inclui proteínas híbridas ou quiméricas compreendendo o menor fragmento de proteína tóxico,assim como proteínas contendo pelo menos um dos três domínios da proteína de SEQ ID No. 2. Também incluídas nesta definição são variantes da sequência de aminoácidos em SEQ ID No. 2, tais como proteínas tendo uma identidade de sequência de pelo menos 92%, particularmente pelo menos 93%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% no nível de sequência de aminoácidos, como determinado usando alinhamentos de pares usando o programa GAP do pacote Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin, USA, versão 10.0; usar defaults GCG dentro de programa GAP; para as comparações de sequências de aminoácidos, usar a matriz escore blosum62), preferivelmente proteínas tendo alguns, preferivelmente 5-10, particularmente
8/43 menos que 5, aminoácidos adicionados, substituídos ou suprimidos sem mudança significativa, preferivelmente sem alteração, de atividade inseticida da proteína, por exemplo, a proteína Cry2Ae de SEQ ID No. 8.
[0022] O termo DNA/proteína compreendendo a sequência X, como aqui usado, refere-se a um DNA ou proteína incluindo ou contendo pelo menos a sequência X, de modo que outras sequências de nucleotídeos ou aminoácidos podem ser incluídas na extremidade 5’ (ou N-terminal) e/ou 3’ (ou C-terminal), por exemplo, (a sequência de nucleotídeos de) uma proteína marcadora selecionável como mostrada em EP 0 193 259, (a sequência de nucleotídeos de) um peptídeo trânsito, e/ou uma sequência líder 5’ ou 3’.
[0023] O menor fragmento tóxico de uma proteína Cry da invenção, como aqui usado, é o menor fragmento ou porção de uma proteína Cry retendo atividade inseticida que pode ser obtido através de digestão enzimática, preferivelmente tripsina ou quimiotripsina, da proteína Cry de inteiro comprimento, ou aquele menor fragmento ou porção de uma proteína Cry retendo atividade inseticida que pode ser obtido fazendo-se supressões de nucleotídeos no DNA codificando uma proteína Cry. As extremidades de sequência de aminoácidos N- e Cterminais do menor fragmento tóxico são convenientemente determinadas através de determinação de sequência de aminoácidos dos fragmentos acima através de técnicas rotineiramente disponíveis. Para os fragmentos de proteína Cry2A retendo atividade inseticida desta invenção, tipicamente supressões N-terminais podem ser feitas enquanto pouco pode ser suprimido em sua extremidade C-terminal. Para as proteínas Cry2Ae e Cry2Af da invenção, é esperado que supressões até aminoácido de posição 625 no C-terminal (isto é, o aminoácido terminal-C pode ser o aminoácido na posição 625) pode ser feita enquanto conservando a atividade inseticida, para a proteína Cry2Ag,
9/43 é esperado que supressões até aminoácido em posição 620 no Cterminal (isto é, o aminoácido terminal-C pode ser o aminoácido na posição 620) podem ser feitas enquanto conservando a atividade inseticida da proteína. É esperado que supressões N-terminais até ao redor de aminoácido posição 50, preferivelmente supressões N-terminais até aminoácido de posição 50 (isto é, o aminoácido N-terminal pode ser posição 50 das sequências mostradas na listagem de sequências) na sequência de aminoácidos das três proteínas Cry2A desta invenção, retêm maior parte de sua atividade inseticida contra insetos Lepidópteros.
[0024] De acordo com esta invenção, proteína Cry2Af refere-se a qualquer proteína compreendendo o menor fragmento tóxico da sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 4, particularmente qualquer proteína compreendendo a sequência de aminoácidos a partir do aminoácido na posição 1 ao aminoácido na posição 625, particularmente para o aminoácido na posição 632, em SEQ ID No. 4. Isto inclui proteínas híbridas ou quiméricas compreendendo o menor fragmento tóxico de proteína, assim como proteínas contendo pelo menos um dos três domínios da proteína de SEQ ID No. 4. Também incluídas nesta definição são variantes da sequência de aminoácidos em SEQ ID No. 4, tais como proteínas tendo uma identidade de sequência de pelo menos 95%, particularmente pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% no nível de sequência de aminoácidos, como determinado usando-se alinhamentos emparelhados usando o programa GAP do pacote Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin, USA, version 10.0; usar defaults GCG dentro do programa GAP; para as comparações de sequência de aminoácidos, usar a matriz de escore blosum62), preferivelmente proteínas tendo alguns, preferivelmente 5-10, particularmente menos que 5 aminoácidos adicionados, substituídos ou suprimidos sem alteração significante, preferivelmente sem alteração de
10/43 atividade inseticida da proteína.
[0025] De acordo com esta invenção, proteína Cry2Ag refere-se a qualquer proteína compreendendo o menor fragmento tóxico da sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 6, particularmente qualquer proteína compreendendo a sequência de aminoácidos a partir do aminoácido na posição 1 ao aminoácido na posição 620, particularmente para o aminoácido na posição 627, em SEQ ID No. 6. Isto inclui proteínas híbridas ou quiméricas compreendendo o menor fragmento tóxico de proteína, assim como proteínas contendo pelo menos um dos três domínios do fragmento tóxico de SEQ ID No. 6. Também incluída nesta definição são variantes da sequência de aminoácidos em SEQ ID No. 6, tais como proteínas tendo uma identidade de sequência de pelo menos 80%, particularmente pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelo menos 99% no nível de sequência de aminoácidos, como determinado usando-se alinhamentos emparelhados usando o programa GAP do pacote Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin, USA, version 10.0; usar defaults GAP dentro do programa GAP; para as comparações de sequência de aminoácidos, usar a matriz de escore blosum62), preferivelmente proteínas tendo alguns, preferivelmente 5-10, particularmente menos que 5, aminoácidos adicionados, substituídos ou suprimidos sem alterar significantemente, preferivelmente sem alterar a atividade inseticida da proteína.
[0026] Como aqui usados, os termos DNA cry2Ae, DNA cry2Af', ou DNA cry2Ag referem-se a qualquer sequência de DNA codificando a proteína Cry2Ae, Cry2Af ou Cry2Ag, respectivamente, como definido acima. Isto inclui sequências de DNA ocorrendo naturalmente, artificiais ou sintéticas codificando as proteínas de SEQ ID Nos. 2, 4 ou 6 ou seus fragmentos ou variantes inseticidas como definido acima. Também incluídas aqui são sequências de DNA codificando proteínas inseticidas que são similares o suficiente às regiões codificantes das
11/43 sequências de DNA genômico depositadas ou as sequências providas na listagem de sequências de modo que elas possam (isto é, tenham a habilidade de) hibridizar a estas sequências de DNA sob condições de hibridização rigorosas. Condições de hibridização rigorosas, como aqui usado, referem-se particularmente às seguintes condições: imobilização de sequências de DNA genômico relevantes sobre um filtro, e préhibridização de filtros por 1 a 2 horas em formamida 50%, SSPE 5%, 2x reagente de Denhardt e SDS 0,1% a 42°C ou 1 a 2 horas em 6x SSC, 2x reagente de Denhardt e 0,1% SDS a 68°C. A sonda (dig- ou rádio-) rotulada desnaturada é então diretamente adicionada ao fluido de pré-hibridização e incubação é realizada por 16 a 24 horas na temperatura apropriada mencionada acima. Após incubação, os filtros são então lavados por 30 minutos em temperatura ambiente em 2x SSC, SDS 0,1%, seguido por 2 lavagens de 30 minutos cada a 68°C em 0,5xSSC e SDS 0,1%. Uma auto-radiografia é estabelecida através de exposição de filtros por 24 a 48 horas a filme de raio X (Kodak XAR-2 ou equivalente) a -70°C com uma tela de intensificação. É claro, condições e parâmetros equivalentes podem ser usados neste processo enquanto ainda obtendo as desejadas condições de hibridização rigorosas. Variantes preferidas do DNA cry2Ae desta invenção são um DNA codificando as variantes de proteína Cry2Ae inseticida descritas acima, ou uma sequência de DNA codificando uma proteína inseticida com pelo menos 92%, preferivelmente pelo menos 93 a 97%, particularmente pelo menos 98% ou pelo menos 99%, de identidade de sequência à sequência codificante de SEQ ID No. 1. Particularmente, tais sequências de DNA também hibridizam sob condições rigorosas de hibridização à sequência codificante de cry2Ae depositada no BCCM-LMBP sob o número de acesso LMBP 4248, ou à sequência codificante de SEQ ID No. 1. Variantes preferidas do DNA cry2Af desta invenção são um DNA codificando as variantes de proteína insetici12/43 da Cry2Af descritas acima, ou uma sequência de DNA codificando uma proteína inseticida com pelo menos 95%, preferivelmente pelo menos 96% ou 97%, mais preferivelmente pelo menos 98% ou pelo menos 99%, de identidade de sequência à sequência codificante de SEQ ID No. 3. Particularmente, tais sequências de DNA também hibridizam sob condições rigorosas de hibridização à sequência codificando cry2Af depositada em BCCM-LMBP sob o número de acesso LMBP 4247 ou à sequência codificante de SEQ ID No. 3. Variantes preferidas do DNA cry2Ag desta invenção são um DNA codificando as variantes de proteína Cry2Ag descritas acima, ou uma sequência de DNA com pelo menos 86%, preferivelmente 87%, particularmente pelo menos 98% ou pelo menos 99%, de identidade de sequência à sequência codificante de SEQ ID No. 5. Particularmente, tais sequência de DNA também hibridizam sob condições rigorosas de hibridização à sequência codificante de cry2Ag depositada no BCCM-LMBP sob o número de acesso LMBP 4249, ou à sequência de codificante de SEQ ID No.
5. As identidades de sequências referidas acima são calculadas usando-se o programa GAP do pacote Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin, USA) version 10.0 (defaults GCG são usados, para estas comparações de sequências de DNA), a matriz de escore nwsgapdna é usada), as condições rigorosas de hibridização são como definidas acima.
[0027] Atividade inseticida de uma proteína, como aqui usado, significa a capacidade de uma proteína matar insetos quando tal proteína é alimentada para insetos, preferivelmente através de expressão em um hospedeiro recombinante tal como uma planta. Quantidades controladoras de inseto de uma proteína, como aqui usado, referemse a uma quantidade de proteína que é suficiente para limitar dano sobre a planta por insetos alimentando-se sobre tal planta para níveis comercial mente aceitáveis, por exemplo, através de morte dos insetos
13/43 ou através de inibição de desenvolvimento de inseto, fertilidade ou crescimento em uma maneira tal que eles proporcionem menos dano para a planta e rendimento de planta não seja significantemente afetado adversamente.
[0028] De acordo com esta invenção, insetos suscetíveis às novas proteínas Cry da invenção são contatados com esta proteína em quantidades controladoras de insetos, preferivelmente quantidades inseticidas. Insetos alvos preferidos para as proteínas desta invenção são pestes de insetos danificando economicamente plantas de milho, algodão, arroz e soja, particularmente em países da América do Norte e da América do Sul. Insetos alvos particularmente preferidos para as proteínas Cry2A desta invenção, particularmente a proteína Cry2Ae, são insetos Heliothis spp., Helicoverpa spp., Spodoptera spp., Sesamia spp., Anticarsia spp., Ostrinia spp., Chilo spp., Sesamia spp., Marasmia spp., Scirpophaga spp., e Cnaphalocrocis spp., preferivelmente, mais preferivelmente Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Helicoverpa armigera, Anticarsia gemmatalis e Ostrinia nubilalis.
[0029] Os termos proteína Cry2A, proteína Cry2A desta invenção, proteína Cry, ou proteína Cry desta invenção, como aqui usados, referem-se a qualquer uma das novas proteínas isoladas de acordo com esta invenção e identificadas e definidas aqui como proteína Cry2Ae, Cry2Af ou Cry2Ag. Uma proteína Cry, como aqui usada, pode ser uma proteína no tamanho inteiro, também chamada uma protoxina, ou pode estar em uma forma truncada tanto quanto a atividade inseticida seja retida, ou pode ser uma combinação de diferentes proteínas em uma proteína híbrida ou de fusão. Uma protoxina Cry refere-se à proteína cristal de inteiro comprimento como é codificada pela sequência de DNA de Bt ocorrendo naturalmente, uma toxina Cry refere-se a um seu fragmento inseticida, particularmente seu menor fragmento tóxico, tipicamente na faixa de peso molecular de cerca de
14/43
50-65 kD, particularmente cerca de 60 kD, como determinado por eletroforese SDS-PAGE. Um gene cry, gene cry2A, DNA cry ou DNA cry2A, como aqui usado, é uma sequência de DNA codificando uma proteína Cry de acordo com esta invenção, referindo-se a qualquer uma das sequências de DNA cry2Ae, cry2Af ou cry2Ag definidas acima.
[0030] A sequência de ácidos nucléicos, particularmente sequência de DNA, codificando as proteínas Cry desta invenção podem ser isoladas em uma maneira convencional a partir de linhagens de E. coli recombinantes, depositadas de acordo com o Tratado de Budapeste em 6 de outubro de 2000 no Vakgroep voor Moleculaire BiologiePlasmidencollectie, Universiteit Gent, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Belgium (daqui por diante abreviado como BCCM-LMBP sob os seguintes números de acesso: BCCM-LMBP 4247 para cepa XL1Blue:pUC1099E/cry2clone 1, que codifica a proteína Cry2Af; BCCM-LMBP 4248 para cepa XL1 Blue:pUC1099E/ cry2clone7, que codifica a proteína Cry2Ae; e BCCM-LMBP 4249 para cepa XL1Blue:pUC2761A/cry2clone 141, que codifica a proteína Cry2Ag. As sequências de DNA codificando as proteínas Cry da invenção podem ser isoladas destas linhagens depositadas usando-se técnicas rotineiras, e podem ser inseridas em vetores de expressão para produção de altas quantidades de proteínas Cry. As proteínas Cry podem ser usadas para preparação de específicos anticorpos monoclonais ou policlonais em uma maneira convencional (Hõfte et al., 1988).
[0031] Também, sequências de DNA para uso nesta invenção podem ser obtidas sinteticamente. Realmente, devido à degenerescência do código genético, alguns códons aminoácidos podem ser substituídos por outros sem alteração de sequência de aminoácidos da proteína. Além disso, alguns aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos equivalentes sem alterar significantemente, preferível15/43 mente sem alteração, da atividade inseticida da proteína. Também, mudanças em sequência de aminoácidos ou composição em regiões da molécula, diferentes daquelas responsáveis por ligação ou formação de poro são menos prováveis de causarem uma diferença em atividade inseticida da proteína. Equivalentes das sequências de DNA da invenção incluem sequências de DNA hibridizando à sequência de DNA das proteínas Cry de SEQ ID No. 1, 3, ou 5 sob condições rigorosas de hibridização e codificando uma proteína com as mesmas características inseticidas como a proteína desta invenção, ou sequências de DNA tendo uma diferente utilização de códon comparadas aos genes cry2A nativo desta invenção mas que codificam uma proteína com a mesma atividade inseticida e com substancialmente a mesma, preferivelmente a mesma, sequência de aminoácidos. Exemplos de sequências de DNA otimizadas - códon para a proteína Cry2Ae desta invenção são encontrados em SEQ ID Nos. 7 e 9. Estas sequências de DNA foram otimizadas através de adaptação de utilização de códon àquela mais preferida em genes de plantas, particularmente para genes nativos para o gênero ou espécie de planta de interesse (Bennetzen & Hall, 1982; Itakura et al., 1977) usando-se tabelas de uso de códon disponíveis (SEQ ID No. 7 foi mais adaptada na direção de expressão em algodão, SEQ ID No. 9 mais na direção de milho), e também para eliminar estiramentos de nucleotídeos AT ou GC mais longos que 5 ou 6, preferivelmente mais longos que 5, nucleotídeos, e também para inserir apropriados sítios de restrição.
[0032] Também, o N-terminal de uma proteína Cry pode ser modificado para ter um ótimo contexto de início de tradução, pelo que adicionando ou suprimindo um ou mais aminoácidos na extremidade Nterminal da proteína. Na maioria dos casos, é preferido que as proteínas da invenção sejam expressas em células de plantas iniciadas com um dipeptídeo Met-Asp ou Met-Ala para ótimo início de tradução, re16/43 querendo a inserção no DNA cry2A de um códon codificando um aminoácido Asp ou Ala a jusante do códon de partida como um novo segundo códon.
[0033] É claro, qualquer sequência de DNA diferindo em seu uso de códon mas codificando a mesma proteína ou uma proteína similar com substancialmente a mesma atividade inseticida, pode ser construída, dependendo do particular propósito. Foi descrito em sistemas de expressão procarióticos e eucarióticos que mudança de uso de códon para aquele da célula hospedeira é desejada para expressão de gene em hospedeiros estranhos (Bennetzen & Hall, 1982; Itakura et al., 1977). Além disso, genes de proteína cristal de Bt são conhecidos não terem inclinação na direção de códons eucarióticos, e serem muito ricos-AT (Adang et al., 1985, Schnepf et al., 1985). Tabelas de uso de códon são disponíveis na literatura (Wada et al., 1990; Murray et al., 1989) e nas bases de dados de sequência de DNA principal (por exemplo, EMBL em Heidelberg, Germany). Da mesma maneira, sequências de DNA sintéticas podem ser construídas de modo que as mesmas ou substancialmente as mesmas proteínas sejam produzidas. É evidente que várias sequências de DNA podem ser feitas uma vez que a sequência de aminoácidos das proteínas Cry desta invenção seja conhecida. Tais outras sequências de DNA incluem sequências de DNA sintéticas ou semi - sintéticas que foram alteradas de modo a inativar certos sítios no gene, por exemplo, através de inativação seletiva de certos elementos reguladores ou de processamento crípticos presentes na sequência nativa como descrito em publicações PCT WO 91/16432 e WO 93/09218, ou através de adaptação de uso de códon total àquele de um organismo hospedeiro mais relacionado, preferivelmente aquele do organismo hospedeiro onde é desejada expressão. Várias técnicas para modificação de utilização de códon para aquela preferida pelas células hospedeiras podem ser encontradas em
17/43 literatura de patente e científica. O exato processo de modificação de uso de códon não é crítico para esta invenção tanto quanto maior parte ou todas as sequências reguladoras crípticas ou elementos de processamento tenham sido substituídas por outras sequências. Exemplos de sequências de DNA otimizadas para expressão em plantas são mostrados em SEQ ID Nos. 7 e 9 incluídas.
[0034] Pequenas modificações para uma sequência de DNA tal como descrito acima podem ser rotineiramente feitas, isto é, por mutagênese mediada - PCR (Ho et al., 1989, White et al., 1989).
[0035] Modificações mais profundas para uma sequência de DNA podem ser feitas rotineiramente através de síntese de DNA de novo de uma desejada região codificante usando-se técnicas disponíveis.
[0036] Com o termo substancialmente a mesma, quando referindo-se à sequência de aminoácidos de uma proteína Cry, é pretendido incluir-se uma sequência de aminoácidos que difere em não mais que 5%, preferivelmente não mais que 2%, da sequência de aminoácidos da proteína comparada; e quando referindo-se a toxidez de uma proteína Cry, é pretendido incluir-se uma proteína cujo valor LC50 obtido sob as mesmas condições de bioensaio difere por não mais que 10%, preferivelmente não mais que 5%, do valor LC50 obtido para a proteína comparada.
[0037] O termo domínio de uma toxina Cry como aqui usado significa qualquer parte(s) ou domínio(s) da toxina com uma estrutura específica que pode ser transferida para outra proteína (Cry) para provimento de uma nova proteína híbrida com pelo menos uma característica funcional (por exemplo, as características de ligação e/ou toxidez) da toxina Cry da invenção (Ge et al., 1991). Tais partes podem formar uma característica essencial da proteína híbrida Bt com as características de ligação e/ou toxidez da proteína Cry desta invenção. Uma tal proteína híbrida pode ter uma aumentada faixa de hospedeiros, uma
18/43 toxidez aperfeiçoada e/ou pode ser usada em uma estratégia para prevenir desenvolvimento de resistência de inseto (publicação de patente EP 408 403; Visser et ai., 1993).
[0038] As sequências de DNA cry da invenção, preparadas a partir de DNA total, podem ser ligadas em apropriados vetores de expressão e transformadas em E. coli, e os clones então podem ser selecionados através de convencionais processos de imuno-sondagem (French et ai., 1986) para expressão da toxina com anticorpos monoclonais ou policlonais elevados contra as proteínas Cry.
[0039] Também, o DNA cry da invenção, pode ser ligado em apropriados vetores lançadores Bt (Lereclus et ai., 1992) e transformado em um Bt-mutante minus cristal. Os clones então podem ser selecionados para a produção de cristais (detectados por microscopia) ou proteínas cristais (detectadas por SDS-PAGE), ou podem ser testados para sua atividade inseticida comparados à cepa minus-cristal controle.
[0040] Os genes codificando as proteínas Cry desta invenção podem ser sequenciados em uma maneira convencional (Maxam and Gilbert, 1980; Sanger, 1977) para obtenção de sequência de DNA. Comparações de sequências indicaram que os genes são diferentes dos genes descritos anteriormente codificando protoxinas e toxinas com atividade contra Lepidóptera (ver, por exemplo, Hõfte and Whiteley, 1989; Crickmore, et ai., 1998; e a atualização de 16 de outubro de 2000 no website de nomenclatura de Bt correspondendo à publicação de Crickmore et ai. (1998), encontrada em: http://epunix.biols.susx.ac.uk./Home/Neil Crickmore/Bt/index.html).
Também, as proteínas Cry2A da invenção são novas sobre qualquer das sequências de proteína cristal de Bacillus thuringiensis na atualização de 13 de dezembro de 2001 deste web site de nomenclatura de Bt.
19/43 [0041] Uma parte inseticidamente eficaz das sequências de DNA, codificando uma porção inseticidamente eficaz das recém-identificadas formas de protoxina de proteína Cry, pode ser obtida em uma maneira convencional após análise de sequência do gene. Em tais fragmentos, é preferido que pelo menos a sequência homóloga ao bloco 5 de sequência conservada de proteínas cristais de Bt (Hofte & Whiteley, 1989; Schnepf et al., 1998) seja incluída em tal proteína, preferivelmente até dois aminoácidos após esta região homóloga. Para as proteínas Cry2Ae e CryA2Af, esta região homóloga termina na posição de aminoácido 625 em SEQ ID Nos. 2 e 4, respectivamente, para Cry2Ag na posição 620 em SEQ ID No. 6. A sequência de aminoácidos das proteínas Cry pode ser determinada a partir da sequência de DNA das sequências de DNA isoladas. Por uma parte inseticidamente eficaz (ou porção ou fragmento) de sequência de DNA codificando a proteína Cry, também aqui referida como gene truncado ou DNA truncado, é pretendido uma sequência de DNA codificando um polipeptídeo que tem menos aminoácidos que a forma protoxina de proteína Cry mas que é inseticida.
[0042] De modo a expressar toda ou uma parte inseticidamente eficaz da sequência de DNA codificando uma proteína Cry desta invenção em E. coli, em outras linhagens de Bt e em plantas, apropriados sítios de restrição podem ser introduzidos, flanqueando as sequências de DNA. Isto pode ser feito por mutagênese direcionada sítio, usando-se procedimentos bem-conhecidos (Stanssens et al., 1989; White et al., 1989). De modo a obter-se aperfeiçoada expressão em plantas, a utilização de códon do gene cry ou parte de gene cry inseticidamente eficaz desta invenção pode ser modificada para formar um gene equivalente, modificado ou artificial ou parte de gene de acordo com publicações PCT WO 91/16432 e WO 93/09218; EP 0 358 962 e EP 0 359 472, ou os genes Bt ou partes de genes podem ser
20/43 inseridos no genoma de plastídeo, mitocondrial ou cloroplasto e expressos ali usando-se um promotor apropriado (por exemplo, Mc Bride et ai., 1995; patente US 5 693 507). Para obtenção de expressão aperfeiçoada em plantas monocotiledôneas tais como milho, um íntron, preferivelmente um íntron monocotiledôneo, também pode ser adicionado ao gene quimérico, e a sequência de DNA do gene cry ou sua parte inseticida pode ser ainda alterada em uma maneira translacionalmente neutra, para modificar sequências possivelmente inibindo DNA presentes na parte de gene por meio de inserção de íntron direcionada - sítio e/ou através de introdução de alterações para a utilização de códon, por exemplo, adaptação de utilização de códon àquela mais preferida por plantas, preferivelmente o específico gênero de planta relevante (Murray et ai., 1989) sem alterar significantemente, preferivelmente sem alterar, a sequência de aminoácidos codificada. [0043] De acordo com uma realização desta invenção, é preferido que as proteínas sejam endereçadas para organelas intracelulares tais como plastídeos, preferivelmente cloroplastos, mitocôndrias, ou sejam secretadas da célula, potencialmente otimizando estabilidade e/ou expressão de proteína. Para este propósito, os genes quiméricos da invenção compreendem uma região codificante codificando um peptídeo sinal ou alvo, ligado à região codificando proteína Cry da invenção. Peptídeos particularmente preferidos para serem incluídos nas proteínas desta invenção são os peptídeos de trânsito para cloroplastos ou outro endereçador de plastídeo, especialmente regiões de peptídeo de trânsito duplicadas a partir de genes de plantas cujo produto gene é endereçado para os plastídeos,o peptídeo de trânsito otimizado de Capellades et ai. (patente US 5 635 618), o peptídeo de trânsito de ferredoxina-NADP+ óxido-redutase de espinafre (Oelmuller et ai., 1993), o peptídeo de trânsito descrito em Wong et ai. (1992) e os peptídeos endereçadores em pedido de patente PCT publicado WO
21/43
00/26371. Também preferidos são peptídeos sinalizando secreção de uma proteína ligada a tal peptídeo fora da célula, tal como o sinal de secreção do inibidor proteinase de batata II (Keil et al., 1986), o sinal de secreção do gene alfa-amilase 3 de arroz (Sutliff et al., 1991) e o sinal de secreção de proteína PR1 de tabaco (Cornelissen et al., 1986).
[0044] Peptídeos sinais particularmente úteis de acordo com a invenção incluem o peptídeo de trânsito de cloroplasto (por exemplo, Van den Broeck et al. (1985), ou o peptídeo de trânsito de cloroplasto otimizado da patente US 5 510 471 e patente US 5 635 618 causando transporte da proteína para os cloroplastos, um peptídeo sinal de secreção ou um peptídeo endereçando a proteína para outros plastídeos, mitocôndria, a ER, ou outra organela. Sequências sinais para endereçar organelas intracelulares ou para secreção fora da célula de planta ou para a parede de célula são encontradas em proteínas secretadas ou endereçadas naturalmente, preferivelmente aquelas descritas por Klõsgen et al. (1989), Klõsgen and Weil (1991), Neuhaus & Rogers (1998), Bih et al. (1999), Morris et al. (1999), Hesse et al. (1989), Tavladoraki et al. (1998), Terashima et al. (1999), Park et al. (1997), Shcherban et al. (1995), todas as quais são aqui incorporadas por referência, particularmente as sequências de peptídeo sinal de proteínas endereçadas ou secretadas de milho, algodão, arroz ou soja.
[0045] Além disso, as propriedades de ligação das proteínas Cry da invenção podem ser avaliadas, usando-se processos conhecidos na técnica (por exemplo, Van Rie et al., 1990), para determinar se as proteínas Cry da invenção ligam-se a sítios no intestino do inseto que não são reconhecidos (ou competidos) por proteínas Cry conhecidas, ou outras de Bt. Toxinas de Bt com diferentes sítios de ligação para os quais existe ligação não-competitiva em insetos suscetíveis relevantes são muito valiosas para substituição de toxinas Bt conhecidas para as
22/43 quais insetos desenvolveram resistência, ou para uso em combinação com toxinas Bt tendo um modo diferente de ação para prevenir ou retardar o desenvolvimento de resistência de inseto contra toxinas Bt, particularmente quando expressas em uma planta. Devido às características das toxinas Bt recém-isoladas, elas são extremamente úteis para transformação de plantas, por exemplo, monocotiledôneas tais como milho ou arroz e dicotiledôneas tais como algodão, soja e plantas de espécies Brassica, para proteger estas plantas de dano de inseto. Foi descrito que em Helicoverpa zea, a proteína Cry2Aa não compartilha sítios de ligação com a proteína CrylAc (English et al., 1994). Similarmente, é esperado que as propriedades ligantes das proteínas cry2A da corrente invenção serão diferentes comparadas àquelas de toxinas Cry1 ou Cry9 correntemente usadas em plantas transgênicas nas pestes de insetos relevantes. Tais diferentes propriedades de ligação podem ser medidas através de ensaios de ligação de rotina como descrito acima. Especialmente para propósitos de gerenciamento de resistência de inseto para uma específica peste de inseto, é preferido combinar-se uma proteína Cry2A desta invenção com uma outra proteína de controle de inseto, particularmente uma proteína cristal Bt, que não reconhece pelo menos um sítio de ligação reconhecido por tal proteína Cry2A. Proteínas de controle de inseto preferidas para combinação com as proteínas Cry2A desta invenção, preferivelmente a proteína Cry2Ae, particularmente para expressão simultânea em plantas, preferivelmente plantas de algodão, incluem a proteína Cry1 F ou híbridos derivados de uma proteína Cry1F (por exemplo, as proteínas híbridas Cry1A-Cry1F descritas nas patentes US 6 326 169; 6 281 016; 6 218 188, ou seus fragmentos tóxicos), as proteínas tipo-Cry1A ou seus fragmentos tóxicos, preferivelmente a proteína CrylAc ou híbridos derivados da proteína CrylAc (por exemplo, a proteína híbrida Cry1Ab-Cry1Ac descrita na patente US 5 880 275), a proteína VIP3Aa
23/43 ou um seu fragmento tóxico como descrito em Estruch et al., 1996 e patente US 6 291 156, proteínas inseticidas de espécies de cepa Xhenorhabdus, Serratia ou Photorhabdus (por exemplo, Waterfield et al., 2001; ffrench-Constant and Bowen, 2000). Em uma realização, tal coexpressão é facilmente obtida através de transformação de uma planta já expressando uma proteína de controle de inseto com uma Cry2A desta invenção, ou através de cruzamento de plantas transformadas com a proteína de controle de inseto e plantas transformadas com a proteína Cry2A desta invenção. Para plantas de algodão, preferivelmente a proteína Cry2Ae é usada como primeira proteína de controle de inseto e como segunda proteína de controle de insetos as proteínas CrylAc ou VIP3Aa ou seus derivados são usados. Processos para obtenção de expressão de diferentes proteínas inseticidas de Bt (ou similarmente, para outras proteínas de controle de inseto) na mesma planta em um esforço para minimizar ou prevenir desenvolvimento de resistência para plantas resistentes a insetos transgênicas são descritos na patente EP 0 408 403.
[0046] As proteínas Cry2A desta invenção também podem ser convenientemente usadas para controlar insetos em caso de desenvolvimento de resistência de inseto contra proteínas de controle de insetos, tais como as proteínas de Bt Cry1,que são correntemente já comercializadas em plantas transgênicas.
[0047] Preferivelmente, para propósitos de seleção mas também para aumento de opções de controle de erva daninha, as plantas transgênicas da invenção também são transformadas com um DNA codificando proteína conferindo resistência a um herbicida de amplo espectro, por exemplo, herbicidas baseados em glufosinate ou glyphosate.
[0048] A parte de gene cry inseticidamente eficaz ou seu equivalente, preferivelmente o gene quimérico cry, codificando uma porção
24/43 inseticidamente eficaz da protoxina Cry, pode ser estavelmente inserido em uma maneira convencional no genoma nuclear de uma célula de planta simples, e a célula de planta assim transformada pode ser usada em uma maneira convencional para produção de uma planta transformada que é resistente a inseto. Neste sentido, um plasmídeoTi desarmado, contendo a parte de gene cry inseticidamente eficaz em Agrobacterium tumefaciens pode ser usada para transformar a célula de planta, e a seguir, uma planta transformada pode ser regenerada da célula de planta transformada usando-se os procedimentos descritos, por exemplo, em EP 0 116 718, EP 0 270 822, publicação PCT WO 84/02913 e pedido de patente EP 0 242 246 e em Gould et al. (1991). Vetores plasmídeos-Ti preferidos cada um contém a parte de gene cry inseticidamente eficaz entre as sequências de borda, ou pelo menos localizada à esquerda da sequência de borda direita, do DNA-T do plasmídeo-Ti. É claro, outros tipos de vetores podem ser usados para transformação de célula de planta, usando-se procedimentos tais como transferência direta de gene (como descrito, por exemplo, em EP 0 233 247), transformação mediada por pólen (como descrito, por exemplo, em EP 0 270 356, publicação PCT W 085/01856, e patente US 4 684 611), transformação mediada-vírus ARN de planta (como descrito, por exemplo, em EP 0 067 553 e patente US 4 407 956), transformação mediada por lipossoma (como descrito, por exemplo, em patente US 4 536 475), e outros processos tais como os processos descritos recentemente descritos para transformação de certas linhas de milho (por exemplo, patente US 6 140 553; Fromm et al., 1990; Gordon-Kamm et al., 1990) e arroz (Shimamoto et al., 1989; Datta et al., 1990) e o processo para transformação de monocotiledôneas genericamente (publicação PCT WO 92/09696).Para transformação de algodão, é especialmente preferido o processo descrito na publicação de patente PCT WO 00/71733. Para transformação de soja, é feita re25/43 ferência a processos conhecidos na técnica, por exemplo, Hinchee et al. (1988) e Christou et al. (1990) ou o processo de WO 00/42207. [0049] Também, além de transformação do genoma nuclear, também transformação do genoma de plastídeo, preferivelmente genoma de cloroplasto, é incluída na invenção. Kota et al. (1999) descreveu um processo para super-expressão de uma proteína Cry2Aa em cloroplastos de tabaco.
[0050] A resultante planta transformada pode ser usada em um esquema de cultivo de planta convencional para produzir mais plantas transformadas com as mesmas características ou para introduzir a parte de gene cry inseticidamente eficaz em outras variedades da mesma ou espécies relacionadas de planta. Sementes, que são obtidas das plantas transformadas, contêm a parte de gene cry inseticidamente eficaz como uma inserção genômica estável. Células da planta transformada podem ser cultivadas em uma maneira convencional para produzir a porção inseticidamente eficaz da protoxina Cry, preferivelmente a toxina Cry, que pode ser recuperada para uso em composições inseticidas convencionais contra Lepidóptera (patente US 5 254 799).
[0051] A parte de gene cry inseticidamente eficaz, preferivelmente o gene cry truncado, é inserida em um genoma de célula de planta de modo que o gene inserido esteja a jusante (isto é, 3’) de, e sob o controle de, um promotor que pode direcionar a expressão da parte do gene na célula de planta. Isto é preferivelmente realizado através de inserção de gene quimérico cry no genoma de planta, particularmente no genoma nuclear ou plastídeo (por exemplo, cloroplasto). Promotores preferidos incluem: os promotores 35S constitutivos fortes (os promotores 35S) do vírus mosaico de couve-flor (CaMV) de isolatos de CM 1841 (Gardner et al., 1981), CabbB-S (Franck et al., 1980) e CabbB-JI (Hull and Howell, 1987); o promotor 35S descrito por Odell et
26/43 al. (1985), promotores da família ubiquitina (por exemplo, o promotor ubiquitina de milho de Christensen et al., 1992, ver também Cornejo et al., 1993), o promotor gos2 (de Pater et al., 1992), o promotor emu (last et al., 1990), promotores actina de Arabidopsis tal como o promotor descrito por An et al. (1996), promotores actina de arroz tal como o promotor descrito por Zhang et al. (1991); promotores do vírus mosaico da nervura de Cassava (WO 97/48819, Verdaguer et al. (1998)), as séries pPLEX de promotores de vírus Subterranean Clover Stunt (WO 96/06932, particularmente o promotor S7), um promotor álcool desidrogenase, por exemplo, pAdhIS (números de acesso GenBank X04049, X00581), e o promotor TR1’ e o promotor TR2’ (o promotor TR1’ e promotor TR2’, respectivamente) que dirigem a expressão dos genes Γ e 2’, respectivamente,do DNA-T (Velten et al., 1984). Alternativamente, um promotor pode ser utilizado que não é constitutivo mas antes é específico para um ou mais tecidos ou órgãos da planta (por exemplo, folhas e/ou raízes) pelo que a parte de gene cry inserida é expressa somente em células do tecido(s) ou órgão(ãos) específicos. Por exemplo, a parte de gene cry inseticidamente eficaz pode ser seletivamente expressa nas folhas de uma planta (por exemplo, milho, algodão) através de colocação da parte de gene inseticidamente eficaz sob o controle de um promotor induzível - luz tal como o promotor o gene subunidade pequena ribulose-1,5-bis-fosfato carboxilase da própria planta ou de uma outra planta tal como ervilha como mostrado na patente US 5 254 799. Uma outra alternativa é usar um promotor cuja expressão seja induzível, preferivelmente por ferimento tal como alimentação de inseto, por exemplo, o promotor MPI descrito por Cordera et al. (1994) ou por fatores químicos.
[0052] A parte de gene cry inseticidamente eficaz é inserida no genoma de planta de modo que a parte de gene inserida está a montante (isto é, 5’) de apropriados sinais de regulação de transcrição de
27/43 extremidade 3’ (isto é, formação de transcrito e sinais de poliadenilação). Isto é preferivelmente realizado por inserção de gene quimérico cry no genoma de célula de planta. Sinais de formação de transcrito e de poliadenilação preferidos incluem aqueles do gene nopalina sintase (Depicker et al., 1982), o gene octopina sintase (Gielen et al., 1984) e o gene DNA-T 7 (Velten and Schell, 1985), que atuam como sequências de DNA 3’-não-traduzidas em células de plantas transformadas. [0053] A parte de gene cry inseticidamente eficaz opcionalmente pode ser inserida no genoma de planta como um gene híbrido (patente US 5 254 799; Vaeck et al., 1987) sob o controle do mesmo promotor como um gene marcador selecionável ou que pode ser feito escore, tal como o gene neo (EP 0 242 236) codificando resistência a canamicina, de modo que a planta expressa uma proteína de fusão que é facilmente detectável.
[0054] Transformação de células de plantas também pode ser usada para produzir as proteínas da invenção em grandes quantidades em culturas de células de planta,por exemplo, para produzir uma proteína Cry2A que então pode ser aplicada sobre colheitas após própria formulação. Quando é feita aqui referência a uma célula de planta transgênica, isto refere-se a uma célula de planta (ou também um protoplasto de planta) como tal em isolamento ou em cultura de tecido, ou a uma célula de planta (ou protoplasto) contido em uma planta ou em um órgão ou tecido diferenciado, e ambas possibilidades são especificamente aqui incluídas. Portanto, uma referência a uma célula de planta na descrição ou reivindicações não é pretendida referir-se somente a células isoladas em cultura, mas refere-se a qualquer célula de planta, onde quer que possa estar localizada ou em qualquer tipo de tecido ou órgão de planta onde possa estar presente.
[0055] Todo ou parte do gene cry, codificando uma proteína antilepidóptero, também pode ser usada para transformar outras bacté28/43 rias, tais como B. thuringiensis que tem atividade inseticida contra Lepidóptera ou Coleóptera. Pelo que, uma cepa Bt transformada pode ser produzida a qual é útil para combater um amplo espectro de pestes de insetos lepidópteros e coleópteros ou para combater adicionais pestes de insetos lepidópteros. Transformação de bactérias, tais como bactérias do gênero Pseudomonas, Agrobacterium, Bacillus ou Escherichia,com todo ou parte do gene cry desta invenção, incorporado em um veículo de clonagem apropriado, pode ser realizada em uma maneira convencional, preferivelmente usando técnicas convencionais de eletroporação como descrito em Mahillon et al. (1989) e em publicação de patente PCT W090/06999.
[0056] Linhagens de espécies Bacillus transformadas contendo o gene cry desta invenção podem ser fermentadas através de processos convencionais (Dulmage, 1981; Bernhard and Utz, 1993) para provimento de altos rendimentos de células. Sob condições apropriadas que são bem entendidas (Dulmage, 1981), cada uma destas linhagens esporula para produzir proteínas cristais contendo a protoxina Cry em altos rendimentos.
[0057] Uma composição inseticida, particularmente antilepidópteros, desta invenção pode ser formulada em uma maneira convencional usando-se os micro-organismos transformados com o gene cry, ou preferivelmente suas respectivas proteínas Cry ou a protoxina, toxina ou porção de protoxina inseticidamente eficaz Cry como um ingrediente ativo, junto com apropriados veículos, diluentes, emulsificantes e/ou dispersantes (por exemplo, como descrito por Bernhard and Utz, 1993). Esta composição inseticida pode ser formulada como pulverizado umedecível, péletes, grânulos ou pó ou como uma formulação líquida com solventes aquosos ou não-aquosos como uma espuma, gel, suspensão, concentrado, etc.
[0058] Um processo para controle de insetos, particularmente Le29/43 pidóptera, de acordo com esta invenção pode compreender aplicação (por exemplo, espargimento), a um locus (área) a ser protegida, de uma quantidade inseticida das proteínas Cry ou células hospedeiras transformadas com o gene cry desta invenção. O locus a ser protegido pode incluir, por exemplo, o habitat das pestes de insetos ou vegetação de crescimento ou uma área onde vegetação é para ser crescida. [0059] Esta invenção ainda refere-se a um processo para controle de pestes de insetos lepidópteros de soja,particularmente Lepidópteros broca de caule de arroz, hespérias de arroz, lagarta de agrotídeos de arroz, lagarta dos cereais de arroz, grumixá de arroz, ou dobradores de folha de arroz, preferivelmente um inseto selecionado do grupo consistindo em: Chilo suppressalis, Chilo partellus, Scirpophaga incertulas, Sesamia inferens, Cnaphalocrocis medinalis, Marasmia patnalis, Marasmia exigua, Marasmia ruralis, Scirpophaga innotata, cujo processo compreende aplicação a uma área ou planta a ser protegida, uma proteína Cry2A como aqui definida, preferivelmente uma proteína Cry2Ae como aqui definida (isto é, através de plantio de uma planta de arroz transformada com um gene cry2A desta invenção, ou espargimento de uma composição contendo uma proteína Cry2A desta invenção). A invenção também refere-se ao uso das proteínas Cry2A desta invenção, particularmente a proteína Cry2Ae, contra pestes de insetos Lepidópteros de arroz para minimizar dano para plantas de arroz. [0060] Esta invenção ainda refere-se a um processo para controle de pestes de insetos lepidópteros de algodão, cujo processo compreende aplicação a uma área ou planta a ser protegida, de uma proteína Cry2A como aqui definida, preferivelmente uma proteína Cry2Ae como aqui definida, (isto é, através de plantio de uma planta de arroz transformada com um gene cry2A desta invenção, ou espargindo uma composição contendo uma proteína Cry2A desta invenção). A invenção também refere-se ao uso das proteínas Cry2A desta invenção,
30/43 particularmente a proteína Cry2Ae, contra pestes de insetos Lepidópteros de arroz para minimizar dano para plantas de arroz.
[0061] Esta invenção também refere-se a um processo para controle de pestes de insetos lepidópteros de arroz, particularmente Lepidópteros broca de caule de arroz, hespérias de arroz, lagarta de agrotídeos de arroz, lagarta dos cereais de arroz, grumixá de arroz, ou dobradores de folha de arroz, preferivelmente um inseto selecionado do grupo consistindo em: Chilo suppressalis, Chilo partellus, Scirpophaga incertulas, Sesamia inferens, Cnaphalocrocis medinalis, Marasmia patnalis, Marasmia exigua, Marasmia ruralis, Scirpophaga innotata, cujo processo compreende aplicação a uma área ou planta a ser protegida, uma proteína Cry2A como aqui definida, preferivelmente uma proteína Cry2Ae como aqui definida (isto é, através de plantio de uma planta de arroz transformada com um gene cry2A desta invenção, ou espargimento de uma composição contendo uma proteína Cry2A desta invenção). A invenção também refere-se ao uso das proteínas Cry2A desta invenção, particularmente a proteína Cry2Ae, contra pestes de insetos Lepidópteros de arroz para minimizar dano para plantas de arroz.
[0062] Para obter-se a protoxina ou toxina Cry, células dos hospedeiros recombinantes expressando a proteína Cry podem ser crescidas em uma maneira convencional sobre um meio de cultura apropriado e então lisadas usando-se meios convencionais tais como degradação enzimática ou detergentes ou semelhantes. A protoxina então pode ser separada e purificada através de técnicas padrões tais como cromatografia, extração, eletroforese, ou semelhantes. A toxina então pode ser obtida por digestão com tripsina da protoxina.
[0063] Estas e/ou outras realizações desta invenção são refletidas nos enunciados das reivindicações, que formam parte da descrição da invenção.
31/43 [0064] Os exemplos que se seguem ilustram a invenção, e não são providos para limitarem a mesma ou a proteção buscada. A listagem de sequências referidas nos Exemplos, as reivindicações e a descrição é como se segue:
Listagem de sequências:
SEQ ID No. 1 - sequência de aminoácidos e DNA de proteína Cry2Ae e DNA
SEQ ID No. 2 - sequência de aminoácidos de proteína Cry2Ae.
SEQ ID No. 3 - sequência de aminoácidos e DNA de proteína Cry2Af e DNA.
SEQ ID NO. 4 - sequência de aminoácidos de proteína Cry2Af.
SEQ ID No. 5 - sequência de aminoácidos e DNA de proteína Cry2Ag e DNA.
SEQ ID No.6 - sequência de aminoácidos de proteína Cry2Ag
SEQ ID No. 7 - sequência de DNA cry2Ae artificial para expressão em algodão.
SEQ ID N. 8 - sequência de aminoácidos de proteína Cry2Ae codificada pelo DNA de SEQ ID No. 7.
SEQ ID No. 9 - sequência de DNA cry2Ae artificial para expressão em milho.
[0065] A menos que de outro modo estabelecido nos exemplos, todos os procedimentos para obtenção e manipulação de DNA recombinante são realizados através dos procedimentos padrões descritos em Sambrook et ai., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989), e em Volumes 1 e 2 de Ausubel et ai. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Materiais padrões e processos para trabalho de biologia molecular de planta são descritos em Plant Molecular BiologyLabfax (1993) por R.R.D. Cray, publicado em conjunto com BIOS Scientific Publications Ltd (UK) e Blackwell Scientific Publications (UK).
32/43
Procedimentos para tecnologia de PCR podem ser encontrados em PCR protocols: a guide to methods and applications, Editado por M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky e T.J. White (Academic Press, Inc., 1990).
Exemplos
Exemplo 1: Caracterização das linhagens [0066] As linhagens BTS02761A e BTS01099E foram isoladas de pó de grão coletado nas Filipinas (South Tagalog) e Bélgica (Deerlijk), respectivamente.
[0067] Cada cepa pode ser cultivada sobre meios padrões convencionais, preferivelmente meio T3 (triptona 3 g/l, triptose 2 g/l, extrato de levedura 1,5 g/l, MnCI2 5 mg, Na2HPO4.2H2O 0,05 M, NaH2PO4.H2O 0,05M, pH 6,8 e ágar 1,5%), preferivelmente a 28°C. Para estocagem de longo termo, é preferido misturar um igual volume de uma suspensão esporo - cristal com um igual volume de glicerol 50% e estocar a 70°C ou liofilizar uma suspensão esporo - cristal. Para esporulação, crescimento sobre meio T3 é preferido por 72 horas a 28°C, seguido por estocagem a 4°C. As proteínas cristais produzidas pelas linhagens durante esporulação são empacotadas em cristais.
Exemplo 2: Atividade inseticida das linhagens BTS02761A e
BTS01099E contra espécies selecionadas de insetos lepidópteros [0068] Ensaios de toxidez foram realizados sobre larvas recémnascidas de Helicoverpa zea, Helicoverpa armigera, Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugiperda, e Sesamia nonagrioides alimentadas sobre uma dieta artificial em camadas com extrato alcalino não-diluído (pH 12) de misturas esporo - cristal de tanto BTS01099E como BTS02761A.
[0069] A dieta artificial (Vanderzant, 1962) foi dispensada em cavidades de placas de 48 cavidades Costar. 25 microlitros do extrato sobre a superfície da dieta e secos em um fluxo de ar laminar. Uma larva
33/43 foi colocada em cada cavidade e 18 larvas foram usadas por amostra. Larvas vivas e mortas foram contadas no sétimo dia. A porcentagem de larvas mortas é mostrada na Tabela I abaixo.
[0070] Misturas de esporos / cristais de cada uma das linhagens BTS02761A e BTS01099E foi testada em bioensaios e rendeu os seguintes resultados:
Tabela I:
| Linhagem | Mortalidade (%) | ||||
| Hz | Hv | Sf | On | Sn | |
| BTS02761A | 17* | 94 | 5 | 88 | 77 |
| BTS01099E | 70 | 100 | NT | 90 | NT |
*: larvas sobrevivendo levemente afetadas em seu crescimento [0071] Controles negativos (dieta padrão): Hz: 6% M, Hv: 17%M, Sf: 0% M.
[0072] HZ: helicoverpa zea; Hv: Heliothis virescens; Sf: spodoptera frugiperda; On: Ostrinia nubiialis; Sn: Sesamia nonagroides (Nt significa não testado).
Exemplo 3: Identificação e caracterização de novos genes cry2A de linhagens Bt BTS01099E e BTS02761A.
[0073] Usando-se iniciadores apropriados, uma porção do gene(s) cry2A das linhagens BTS02761A e BTS01099E foi amplificada; subsequentemente estes produtos de amplificação foram digeridos com enzimas de restrição. O padrão obtido foi então comparado com o padrão que é obtido quando tais digestões são realizadas sobre produtos de amplificação derivados de linhagens contendo genes cry2A conhecidos. Baseado no padrão de digestão de restrição, os genes cry2A de linhagens BTS02761A e BTS01099E pareceram ser novos. Por isso, o produto de amplificação foi sequenciado. Isto confirmou que os fragmentos amplificados foram derivados de novos genes cry2A\ cepa BTS02761A conteve um novo gene semelhante-cry2A, enquanto cepa
34/43
1099Ε contiveram dois novos genes semelhantes-cry2A.
[0074] DNA total de linhagens BTS02761A e BTS01099E foram tratadas com Sau3A, fracionado em tamanho e fragmentos de 7 a 10 kb foram ligados em pUC19l (um derivado de pUC19), cortados com BamHI e tratados com TsAP (fosfatase alcalina termoestável). Esta mistura de ligação foi eletroporada em E. coli XL1 Blue.
[0075] Hibridizações de colônia, usando os fragmentos de PCR rotulados-DIG como sondas, identificaram clones positivos. As linhagens de E. coli recombinantes foram depositadas em 6 de outubro de 2000 no Vakgroep voor Moleculaire Biologie-Plasmidencollectie, Universiteit Gent, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Belgium (daqui por diante abreviada como BCCM-LMBP) sob os seguintes números de acesso: BCCM-LMBP 4247 para cepa
XL1Blue:pUC1099E/cry2clone 1, que codifica uma proteína chamada Cry2Af; BCCM-LMBP 4248 para cepa XL1Blue:pUC1099E/cry2clone7, que codifica uma proteína chamada Cry2Ae; e BCCM-LMBP 4249 para cepa XL1Blue:pUC2761A/cry2clone141, que codifica uma proteína chamada Cry2Ag. Os genes podem ser isolados a partir destes clones depositados através de uma digestão Notl-Fsel. A inserção a partir destes clones foi subclonada em vetor lançador pSL401. O resultante plasmídeo foi primeiro transformado em E. coli GM2163. Uma prep de plasmídeo a partir desta cepa foi então eletroporada em B.thuringiensis cristal-minus variedade cepa 1715 berliner.
[0076] Um extrato alcalino preparado de uma mistura de esporo / cristal a partir das linhagens Bt recombinantes foi então usado em bioensaios para avaliar-se a toxidez das novas proteínas Cry2A. Este extrato foi testado no ensaio como descrito acima no Exemplo 1. Os resultados são mostrados na Tabela II:
35/43
| Toxina | Cone. | Mortalidade (%) | |||||
| Ha | Sf | On | Sn | Hz | Hv | ||
| CryAe | 1930 | 83 | 44 | Nt | 100 | 100 | NT |
| CryAg | 1160 | 0 | 0 | 78 | 50 | 29 | 100 |
| CryAa | 470 | 61 | 55 | 50 | 94 | 95 | 100 |
| [0077] | Cone. | concenl | tração to1 | tal de proteína de extrato de cepa |
usando-se o processo Bradford (microgr/ml); Há: Heliothis armigera, as outras abreviaturas são como usadas acima na Tabela I; os controles incluídos (dieta normal, adição de PBS-BSA ou Bt cepa 1715 cristal-minus não-transformada) não proporcionam mortalidade significativa.
[0078] Também, o clone recombinante expressando a proteína Cry2Af mostra uma significante mortalidade quando testado sobre insetos lepidópteros selecionados.
[0079] Também, foi feita uma análise para determinar os valores LC50 e LC90 para a proteína Cry2Ae produzida recombinantemente, em comparação com as proteínas Cry2Aa e Cry2Ab conhecidas.
[0080] Para este ensaio, dieta artificial específica - inseto foi dispensada em cavidades de placas de 24 cavidades Costar. 50 microlitros de extrato alcalino (pH 12) de misturas de esporos - cristais da cepa recombinante Bt contendo o gene cry2Ae originando de XL1Blue:pUC1099Eclone7, foram aplicados sobre a superfície da dieta e secos em um fluxo de ar laminar. A dieta para S.frugioerda em O. nubilalis conteve: 1000 ml de água; ágar: 20 g; farinha de milho: 112 g; germe de trigo: 28 g; levedura: 30 g; ácido ascórbico: 4,8 g; ácido benzóico: 1,2 g; nipagina: 1 g; aureomicina: 0,0 6 g; nistatina: 0,03 g. A dieta para H. virescens em H. zea conteve: 1000 ml de água; ágar: 20 g; farinha de soja: 81 g; germe de trigo: 36 g; sucrose: 14,7 g; óleo de milho: 5 ml; mistura de sal de Wesson: 10 g; mistura de vitaminas de Vanderzant: 9,5 g; ácido ascórbico: 1,1 g; nipagina: 1 g; aureomicina:
36/43
0,34 g; nistatina: 0,06 g. Diferentes concentrações de proteína foram testadas de modo que um valor LC50 pode ser determinado. Para testes sobre H. zea, H. virescens e S. frugiperda, uma larva foi colocada em cada cavidade e 20 larvas foram usadas por amostra. Para testes sobre O. nubilalis, duas larvas foram colocadas em cada cavidade e 24 larvas foram usadas por amostra. Larvas vivas e mortas foram contadas no sétimo dia (no sexto dia para S. frugiperda, no quinto dia para O. nubilalis). Os valores de LC50 e LC90 foram calculados com análises probit (programa POLO, LeOra Software, 1987, POLO-PC. A user’s guide to probit or logic analysis. Berkeley, Califórnia). Os resultados são mostrados na Tabela III abaixo.
Tabela III:
| Toxina | Cone. | Valores LC50(LC90) Ambos em ng/cm2 | |||
| Sf | Hz | Hv | On | ||
| CryAe | 1160 (*1930) | 1154 (3708) | 62 (655) | 10(20) | 188 (1383) |
| CryAa | 2910 (*470) | 2906 (10945) | 1921 (7740) | 35 (138) | 294 (*2854) |
| CryAb | 1290 | 1498 (8150) | 448 (2152) | 82 (248) | NT |
[0081] NT: não testado; Cone.: concentração total de proteína em extrato alcalino de cepa Bt recombinante de proteína relevante em micrograma/ml; um asterisco representa que o resultado para O. nubilalis foi obtido com uma diferente batelada tendo uma diferente concentração de proteína (indicada entre parênteses sob a coluna Cone.); controles (dieta normal, adicionado PBS-BSA ou cepa Bt controle cristalminus) não rendem mais que 0-5% de mortalidade.
[0082] Usando a mesma montagem experimental como acima para Ostrinia nubilalis, mas usando proteína Cry2Ae purificada contra a lagarta velvetbean, Anticarsia gemmatalis, (testando 20 cavidades com 1 larva por concentração) uma alta atividade desta proteína contra es37/43 te importante inseto de peste de soja foi verificada. O valor LC50 para a proteína Cry2Ae purificada para este inseto foi verificada ser 0,44 ng/cm2 (em 95% de nível de confiança; este valor LC50 é o valor médio de 2 ensaios de diferentes bio-bateladas de proteína purificada), o valore LCgo foi verificado ser 7,79 ng/cm2 (no nível de confiança de 95%; este valor LC90 é o valor médio de 2 bioensaios de diferentes bateladas de proteína purificada). Usando a mesma montagem experimental como acima para Ostrinia com proteína Cry2Ae purificada, a significante toxidez desta proteína para Helicoverpa Zea e Ostrinia nubilalis foi confirmada (valores LC50 para estes insetos foram verificados serem 145,1 e 48,31 ng/cm2, respectivamente (em 95% de nível de confiança, estes valores LC50 são os valores médios de 2 bioensaios de diferentes bateladas de proteína purificada sobre cada respectivo inseto)).
[0083] Estes resultados mostram que as novas proteínas Cry da invenção, e particularmente a proteína Cry2Ae, são proteínas úteis com alta atividade para relevantes pestes de insetos Lepidópteros, particularmente para Heliothis zea, Ostrinia nubilalis, Anticarsia gemmatalis, e Helicoverpa zea que são pestes de insetos de dano comercial para plantas tais como soja, algodão e milho.
[0084] As sequências determinadas para os genes cry2A isolados da invenção, e a sequência de aminoácidos determinada são mostradas na Listagem de Sequências inclusa. Alinhamentos emparelhados usando o programa GAP no pacote Wisconsin de GCG indicaram os níveis de identidade de sequência com outras sequências Cry2A (para as sequências das proteínas Cry2A conhecidas e DNAs, ver Crickmore et al. (1998) e o website internet recitado acima), como mostrado na Tabela IVA e IVB (defaults GCG foram usados dentro do programa GAP; para as comparações de sequências de aminoácidos, a matriz escore blosum62 foi usada, para as comparações de sequências de
38/43
DNA, a matriz de escore nwsgapdna foi usada).
Tabela IV.A. Porcentagem de identidade de sequência no nível de proteína:
| Cry2Ae1 | Cry2Af1 | Cry2Ag1 | |
| Cry2Aa1 | 90.837 | 88.942 | 78.905 |
| Cry2Ab1 | 89.889 | 94.471 | 77.331 |
| Cry2Ac1 | 80.547 | 80.386 | 79.869 |
| Cry2Ad1 | 87.362 | 91.943 | 76.849 |
| Cry2Ae1 | 93.365 | 79.871 | |
| Cry2Af1 | 79.549 |
Tabela IV.B. Porcentagem de identidade de sequências no nível de DNA:
| cry2Aa1 | cry2Af1 | cry2Ag1 | |
| cry2Aa1 | 91.206 | 89.995 | 81.994 |
| cry2Ab1 | 91.890 | 94.839 | 81.404 |
| cry2Ac1 | 84.298 | 85.209 | 84.041 |
| cry2Ad1 | 90.627 | 93.470 | 81.136 |
| cry2Ae1 | 94.576 | 81.589 | |
| cry2Af1 | 82.233 |
Exemplo 4: Produção das novas proteínas Cry em plantas transformadas [0085] Genes quiméricos cada um codificando proteínas Cry2Ae, Cry2Af e Cry2Ag são fabricadas usando-se procedimentos bem conhecidos, usando-se promotores tais como os promotores CaMV 35S (Hull and Howell, 1987) e ubiquitina (Christensen et al., 1992). Preferivelmente, a utilização de códon do quadro de leitura aberto é adaptada àquela da planta hospedeira de modo a otimizar eficiência de expressão, como descrito em pedido de patente PCT publicado
39/43
WO94/12264. Também, em alguns genes quiméricos sequências de DNA codificando um peptídeo de trânsito (como descrito na descrição) são incluídas para terem como alvo a proteína Cry2A da invenção para os cloroplastos de planta.
[0086] Para transformação de milho e algodão com um gene quimérico codificando a proteína Cry2Ae, várias construções de gene quimérico foram inseridas em plasmídeos de cepa Agrobacterium. Estas construções incluíram: construções pACS9 e pACS11 onde a sequência codificando cry2Ae de SEQ ID No. 7 foi ligada funcionalmente ao promotor 35S2 de Vírus Mosaico de Couve-Flor (Odell et al., 1985), uma sequência líder a partir do gene de proteína de ligação a clorofila a/b de Petúnia (Harpster et al., 1988), e uma região 3’ de terminação de transcrito e poliadenilação do gene 35S de Vírus Mosaico de Couve-flor (Sanfacon et al., 1991), e construções pACS12 e pACS13 com as mesmas regiões reguladoras e a mesma região codificando cry2Ae, exceto que também uma sequência de DNA codificando o peptídeo de trânsito TpssuAt permitindo endereçamento de cloroplasto (Krebbers et al., 1988) foi inserida na extremidade 5’ da região codificando cry2Ae, de modo que uma proteína de fusão de peptídeo de trânsito é produzida. Estas construções também incluíram tanto uma sequência de DNA codificando uma proteína de resistência a herbicida glifosato (descrita em pedido de patente PCT publicado W097/04103, ligada a um peptídeo de trânsito otimizado (patente US 5 635 618)) ou uma sequência de DNA codificando uma proteína de resistência a herbicida glufosinato (Thompson et al., 1987) como marcador selecionável sob o controle do promotor CsVMV do vírus mosaico de nervura de mandioca (Verdaguer et al., 1996, 1998) e a região de poliadenilação e término de transcrito 3’ do gene nopalina sintase (Depicker et al., 1982). Células de milho foram transformadas com as construções pACS9, pACS11, pACS12 e pACS13 por transformação mediada por Agrobac40/43 terium como descrito na patente US 6 140 553, incorporada por referência. Células de algodão foram estavelmente transformadas nas construções pACS9, pACS11, pACS12 e pACS13 usando-se o processo de transformação descrito em publicação de patente PCT WO 00/71733, aqui incorporada por referência. Células de arroz são estavelmente transformadas com o processo descrito no pedido de patente PCT publicado WO 92/09696. Células de tabaco foram estavelmente transformadas com as construções pACS11 e pACS12 usando transformação mediada com Agrobacterium, essencialmente como descrito em patente EP0116718ou Deblaere et al. (1987).
[0087] As células transformadas e plântulas regeneradas das mesmas são crescidas em meios contendo os agentes seletivos fosfinotricina ou glifosato, de modo que maioria se não todas as plantas regeneradas serão transformadas.
[0088] Plantas de tabaco, milho, algodão e arroz transformadas regeneradas são selecionadas por Cry2A ELISA, Northern e Southern blot e de acordo com eciácia inseticida e características agronômicas. Plantas de progênie contendo gene cry2A quimérico mostram aperfeiçoada resistência a insetos comparadas a plantas de controles nãotransformadas com uma segregação apropriada do fenótipo transformado e de resistência a inseto. Medições de proteína e ARN mostram que plantas com aumentada resistência a inseto têm uma maior expressão da nova proteína Cry2A em suas células.
REFERÊNCIAS CITADAS
Adang et al. (1985). Gene 36, 289.
An et al. (1996). Plant J. 10. 107.
Bennetzen & Hall. (1982). J. Biol. Chem. 257, 3026-3031.
Berhard, K. and Utz, R., Production of Bacillus thuringiensis insecticides for experimental and commercial uses, In Bacillus Thuringiensis, An Environmental Biopesticide: Theory and Practice, pp.255-267, eds.
41/43
Entwistle, P.F., Cory, J.S., Bailey, M.J. and Higgs, S., John Wiley and Sons, New York (1993).
Bih et al. (1999), J. Biol. Chem. 274, 22884-22894.
Choi et al., GenBank accession number AF200816 (1999).
Christensen et al. (1992) Plant mol. Biol. 18, 675-689.
Christou et al. (1990). Trends Biotechnology 8, 145.
Cordera et al. (194) The Plant Journal 6, 141.
Cornejo et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23, 567-581.
Cornelissen et al. (1986) EMBO j. 5, 37-40.
Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol ver. 62(3), 807-13.
Datta et al., Bio/Technology 8, 736-740 (1990).
Deblaere et al. (1987) Methods in Enzymology 153, 277-292.
De Pater et al., 1992, Plant J. 2, 834-844.
Depickeretal., 1982, J. Molec. Appl. Genetics 1, 561-573.
Dulmage, H.T., Production of Bactéria for Biological Control of Insects in Biological Control in Crop Production, Ed Paparizas, D.C., Osmun Publishers, Totowa, N.J., USA, pp. 129-141 (1981).
English et al., insect Biochem. Molec. Biol. 24, 1025-1035 (1994). Estruch et al., (1996), Proc Natl Acad Sei USA 93, 5389-94.
Franck et al., Cell 21, 285-294 (1980)
French et al., Anal.Biochem. 156, 417-423 (1986).
Ffrench-Constant and Bowen (2000) Cell Mol Life Sei 57, 828-33. Fromm et al., Bio/technology 8, 833-839 (1990).
Gardner et al., Nucleic acids Research 9, 2871-2887 (1981)
Ge et al., J. Biol. Chem. 266, 17954-17958 (1991)
Gielen et al., EMBO j 3, 835-845 (1984).
Gordon-Kamm et al., The Plant cell 2, 603-618 (1990).
Gould et al., Plant Physiol. 95, 426-434 (1991).
Harpster et al., (1988), molecular and General Genetics 212,182-190. Hesse et al. (1989), EMBO J. 8 2453-2461.
42/43
Hinchee et al. (1988) Bio/Technology 6, 915.
Ho et al. (1989). Gene 77, 51-59.
Hõfte et al., Appl. And Environm. Microbiol. 54, 2010-2017 (1988) Hõfte and Whiteley, Microbiological Review 53, 242-255 (1989).
Hull and Howell, Virology 86, 482-493 (1987)
Itakura etal. (1977). Science 198, 1056-1063.
Jansens et al. (1997) Crop Science 37, 1616-1624.
Keil et al. (1986), Nucl. Acids Res. 14, 5641-5650.
Klõsgen etal. (1989), Mol Gen. Genet. 217, 155-161.
Klõsgen and Weil (1991), Mol. Gen. Genet. 225, 297-304.
Kota et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96, 1840-1845.
Krebbers et al. (1988) Plant Molec. Biol. 11, 745-759.
Last et al. (1990) Theor. Appl. Genet. 81, 581-588.
Lereclus et al., Biol/Technology 10, 418 (1992).
Mahillon et al, FEMS Microbiol. Letters 60, 205-210 (1989).
Maxam and Gilbert, Methods in Enzymol. 65, 499-560 (1980). McBride et al., 1995, Bio/Technology 13, 362
Morris et al. (1999), Biochem. Biophys,. Res. Commun. 255, 328-333. Murray et al., M., Nucleic Acids Research 17(2), 477-498 (1989). Neuhaus & Rogers (1998), Plant Mol. Biol. 38, 127-144.
Odell et al. (1985) Nature 313, 810-812.
Oelmulleret al., Mol. Gen. Genet. 237, 261-272 (1993).
Park et al. (1997), J. Biol. Chem. 272, 6876-6881.
Sanfacon et al. (1991), Genes and Development 5, 141-149. Sangeret al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 74(12), 5463-5467 (1977). Schnepf et al. (1985). Journal of Biological chemistry 260, 6264. Schnepf et al. (1998). Microbiol. Mol. Biol. Ver. 62(3), 775-806. Shcherban et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sei USA 92, 9245-9249. Shimamoto et al., Nature 338, 274-276 (1989).
Stanssens et al., Nucleic Acids Research 12, 4441-4454 (1989).
43/43
Sutliff etal. (1991) Plant Molec. Biol. 16, 579-591.
Tavladoraki et al. (1998), FEBS Lett. 426, 62-66.
Terashima et al. (1999), Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 516-523. Thompson et al. (1987) EMBO J. 6, 2519-2523.
Vaeck et al., 1987, Nature 328, 33-37.
Van Den Broeck et al., 1985, Nature 313, 358.
Vanderzant, J. Econ. Entomol. 55, p. 140 (1962).
Van Rie et al., Science 247, 72 (1990).
Velten et al., J., EMBO J 3, 2723-2730 (1984).
Velten and Schell, Nucleic Acids Research 13, 6981-6998 (1985) Verdagueretal., Plant Mol. Biol. 31, 1129-1139 (1996). Verdagueretal., Plant Mol. Biol. 37, 1055-1067 (1998)
Visser et al., Domain-Strcture Studies of Bacillus Thuringiensis Crystal Proteins:
A Genetic Approach In, Bacillus Thuringiensis, An Environmetal Biopesticide: Theory and Practice, pp 71-88, eds. Entwistle, P.F., Cory, J.S., Bailey, M.J. and Higgs, S., John Wiley and Sons, New York (1993).
Wada etal. (1990). Nucl. Acids Res. 18, 2367-1411.
Waterfield et al. (2001) Trends Microbiol 9,185-91.
White et al. (1989). Trends in Genet. 5, 185-189.
Wong et al. (1992), Plant Molec. Biol. 20, 81-93.
Zhang et al. (1991) The Plant Cell 3, 1155-1165
1/3
Claims (15)
- REIVINDICAÇÕES1. DNA, caracterizado pelo fato de que consiste na sequência de ácidos nucléicos de SEQ ID NO: 7 ou 9 a partir da posição de nucleotídeo 3 à posição de nucleotídeo 1901, opcionalmente compreendendo uma deleção de um ou mais dos 49 códons na ponta 5’, em que o referido DNA codifica uma proteína inseticida Cry2Ae.
- 2. DNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência que codifica a proteína inseticida Cry2Ae é fusionada a uma sequência de nucleotídeo que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto.
- 3. DNA, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que possui um DNA de peptídeo de trânsito de cloroplasto TpssuAt inserido na lado 5’ da sequência que codifica a proteína Cry2Ae.
- 4. DNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o primeiro códon é ATG e o segundo códon é selecionado de (i) GAT, (ii) GAC, (iii) GCT, (iv) GCC, (v) GCA e (vi) GCG, inserido à jusante do códon de iniciação como um novo segundo códon, para iniciação ótima da tradução.
- 5. DNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um segundo gene quimérico consistindo em um DNA codificando uma proteína de resistência a herbicida, ou um DNA codificando uma proteína de resistência a glufosinato, sob controle do promotor CsVMV do vírus mosaico da nervura de Cassava e a região 3’ de terminação e de poliadenilação de transcrito do gene nopalina sintase.
- 6. Proteína inseticida, caracterizada pelo fato de que apresenta:(a) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, (b) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 possuin2/3 do um peptídeo de trânsito de cloroplasto inserido em sua ponta Nterminal, (c) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, opcionalmente compreendendo a deleção de um ou mais dos 49 aminoácidos na ponta N-terminal, possuindo um peptídeo de trânsito de cloroplasto inserido em sua ponta N-terminal, ou (d) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, opcionalmente compreendendo a deleção de um ou mais dos 49 aminoácidos na ponta N-terminal, fusionada em sua ponta N-terminal a um dipeptídeo Met-Ala ou Met-Asp para iniciação ótima da tradução.
- 7. Proteína, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a referida sequência de aminoácidos começa com um dipeptídeo Met-Ala ou Met-Asp para iniciação ótima da tradução.
- 8. Gene quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende o DNA, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, sob o controle de um promotor expressável em planta.
- 9. Gene quimérico, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) um promotor 35S derivado do Vírus do Mosaico daCouve-flor, (b) uma sequência líder do gene da proteína de ligação a clorofila a/b de Petúnia, e (c) uma região 3’ de terminação de transcrito e poliadenilação do gene 35S de Vírus Mosaico de Couve-flor.
- 10. Micro-organismo, caracterizado pelo fato de que é transformado para compreender o DNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
- 11. Processo para tornar uma planta resistente a um inseto lepidóptero, caracterizado pelo fato de que compreende:transformar células de planta com o gene quimérico, como3/3 definido na reivindicação 8 ou 9, e regenerar plantas transformadas a partir de tais células que são resistentes a insetos lepidópteros.
- 12. Processo para tornar uma planta resistente a um inseto lepidóptero, caracterizado pelo fato de que compreende:transformar células de planta com o gene quimérico, como definido na reivindicação 8 ou 9, regenerar plantas transformadas a partir de tais células que são resistentes a insetos lepidópteros, e obter plantas de progênie que são resistentes a insetos lepidópteros, que compreendem o referido gene quimérico.
- 13. Processo, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que o referido inseto é selecionado do grupo consistindo em: Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Helicoverpa armigera, Anticarsia gemmatalis e Ostrinia nubilalis.
- 14. Uso de uma proteína inseticida consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, opcionalmente compreendendo a deleção de um ou mais dos 49 aminoácidos na ponta N-terminal, ou uma proteína inseticida consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, ou a proteína, como definida na reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que é para controlar insetos selecionados do grupo consistindo em Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Helicoverpa armigera, Anticarsia gemmatalis e Ostrinia nubilalis.
- 15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que uma proteína Cry1A, Cry1F ou VIP3Aa também é usada para controlar os referidos insetos.1/1
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BR122015003517-1A BR122015003517B1 (pt) | 2001-01-09 | 2002-01-08 | gene quimérico codificando a proteína inseticida cry2ae, micro-organismo transformado com os mesmos, proteína inseticida, uso da mesma, bem como processo para tornar uma planta resistente a um inseto lepidóptero |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US75629601A | 2001-01-09 | 2001-01-09 | |
| US09/756,296 | 2001-01-09 | ||
| PCT/EP2002/000298 WO2002057664A2 (en) | 2001-01-09 | 2002-01-08 | Bacillus thuringiensis insecticidal proteins |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI0206346B1 true BRPI0206346B1 (pt) | 2018-04-03 |
Family
ID=25042854
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0206346-8A BRPI0206346B1 (pt) | 2001-01-09 | 2002-01-08 | Dna que codifica uma proteína inseticida cry2ae, gene quimérico compreendendo o mesmo, proteína inseticida, uso da mesma, micro-organismo, bem como processo para tornar uma planta resistente a um inseto lepidóptero |
| BR0206346-8A BR0206346A (pt) | 2001-01-09 | 2002-01-08 | Proteìnas inseticidas de bacillus thuringiensis |
| BR122015003517-1A BR122015003517B1 (pt) | 2001-01-09 | 2002-01-08 | gene quimérico codificando a proteína inseticida cry2ae, micro-organismo transformado com os mesmos, proteína inseticida, uso da mesma, bem como processo para tornar uma planta resistente a um inseto lepidóptero |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BR0206346-8A BR0206346A (pt) | 2001-01-09 | 2002-01-08 | Proteìnas inseticidas de bacillus thuringiensis |
| BR122015003517-1A BR122015003517B1 (pt) | 2001-01-09 | 2002-01-08 | gene quimérico codificando a proteína inseticida cry2ae, micro-organismo transformado com os mesmos, proteína inseticida, uso da mesma, bem como processo para tornar uma planta resistente a um inseto lepidóptero |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1352068B1 (pt) |
| JP (1) | JP4404549B2 (pt) |
| CN (1) | CN1234867C (pt) |
| AR (2) | AR032231A1 (pt) |
| AT (1) | ATE409231T1 (pt) |
| AU (1) | AU2002252974B2 (pt) |
| BR (3) | BRPI0206346B1 (pt) |
| CA (2) | CA2771117C (pt) |
| DE (1) | DE60229037D1 (pt) |
| ES (1) | ES2315360T3 (pt) |
| MX (1) | MXPA03006130A (pt) |
| PT (1) | PT1352068E (pt) |
| SI (1) | SI1352068T1 (pt) |
| WO (1) | WO2002057664A2 (pt) |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2384967A1 (en) | 1999-09-15 | 2001-03-22 | Monsanto Technology Llc | Lepidopteran-active bacillus thuringiensis .delta.-endotoxin compositions and methods of use |
| CN100497378C (zh) | 2002-03-22 | 2009-06-10 | 拜尔生物科学公司 | 新的苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白质 |
| KR20120035233A (ko) | 2004-02-25 | 2012-04-13 | 파이어니어 하이 부렛드 인터내쇼날 인코포레이팃드 | 신규한 바실루스 투링기엔시스 결정 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 및 이의 조성물 |
| CN101238215A (zh) * | 2005-04-05 | 2008-08-06 | 先锋高级育种国际公司 | 利用植物病毒密码子偏爱性设计用于在植物中的多肽表达的核酸分子的方法和组合物 |
| EP1904521B1 (en) | 2005-07-08 | 2013-08-21 | Universidad Nacional Autonoma De Mexico Instituto | Novel bacterial proteins with pesticidal activity |
| PL1999141T3 (pl) * | 2006-03-21 | 2011-10-31 | Bayer Cropscience Nv | Nowe geny kodujące białka owadobójcze |
| US9994621B2 (en) | 2007-06-01 | 2018-06-12 | Bayer Cropscience N.V. | Genes encoding insecticidal proteins |
| CN101680000B (zh) * | 2007-06-11 | 2014-06-11 | 拜尔作物科学公司 | 包含优良事件ee-gh6的抗虫棉花植物及其鉴定方法 |
| US7772465B2 (en) | 2007-06-26 | 2010-08-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
| CA2956841A1 (en) * | 2007-10-16 | 2009-04-23 | Athenix Corporation | Axmi-066 and axmi-076: delta-endotoxin proteins and methods for their use |
| CA2727637A1 (en) * | 2008-06-13 | 2009-12-17 | Bayer Bioscience N.V. | Bollworm insect resistance management in transgenic plants |
| CA2754845A1 (en) * | 2009-03-11 | 2010-12-09 | Athenix Corporation | Axmi-030 insecticidal protein from bacillus thuringiensis and methods for use |
| MX348991B (es) * | 2009-12-16 | 2017-07-05 | Dow Agrosciences Llc | Combinaciones de proteínas insecticidas que se unen a sitios receptores únicos en el cogollero del maíz y el taladrador del maíz europeo útiles para prevenir el desarrollo de resistencia a insectos. |
| EA201290560A1 (ru) | 2009-12-23 | 2014-05-30 | Байер Интеллектуэль Проперти Гмбх | Растения, устойчивые к гербицидам - ингибиторам hppd |
| CN102869769A (zh) | 2009-12-23 | 2013-01-09 | 拜尔知识产权有限公司 | 耐受hppd抑制剂型除草剂的植物 |
| CN102906252A (zh) | 2009-12-23 | 2013-01-30 | 拜尔知识产权有限公司 | 对hppd抑制剂型除草剂耐受的植物 |
| ES2668198T3 (es) | 2009-12-23 | 2018-05-17 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de HPPD |
| AR079882A1 (es) | 2009-12-23 | 2012-02-29 | Bayer Cropscience Ag | Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd |
| EP2669372B1 (en) | 2010-11-10 | 2016-07-06 | Bayer CropScience AG | Hppd variants and methods of use |
| US8648230B2 (en) | 2011-03-18 | 2014-02-11 | Ms Technologies, Llc | Regulatory regions preferentially expressing in non-pollen plant tissue |
| AU2012234449B2 (en) | 2011-03-25 | 2016-05-12 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Use of N-(tetrazol-4-yl)- or N-(triazol-3-yl)arylcarboxamides or their salts for controlling unwanted plants in areas of transgenic crop plants being tolerant to hppd inhibitor herbicides |
| CA2830802A1 (en) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Use of n-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)benzamides for controlling unwanted plants in areas of transgenic crop plants being tolerant to hppd inhibitor herbicides |
| US11692016B2 (en) | 2012-03-09 | 2023-07-04 | Vestaron Corporation | High gene expression yeast strain |
| JP6308955B2 (ja) | 2012-03-09 | 2018-04-11 | ベスタロン コーポレイション | 毒性ペプチドの製造、植物におけるペプチドの発現、およびシステインリッチペプチドの組み合わせ |
| CN103571853B (zh) * | 2012-08-08 | 2016-01-20 | 中国科学院亚热带农业生态研究所 | 密码子优化的Cry2Aa基因与重组载体以及改变作物抗性的方法 |
| UA119532C2 (uk) | 2012-09-14 | 2019-07-10 | Байєр Кропсайєнс Лп | Варіант hppd та спосіб його застосування |
| BR112015021651B1 (pt) | 2013-03-07 | 2021-12-28 | Bayer Cropscience Lp | Molécula de ácido nucleico recombinante, cassete de expressão, célula hospedeira de bactéria, polipeptídeo recombinante, composição e métodos para aplicação dos mesmos |
| CN103290130B (zh) * | 2013-06-13 | 2015-02-04 | 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 | 转基因产品中Cry2Ae基因的检测方法及其试剂盒 |
| MX2016011745A (es) | 2014-03-11 | 2017-09-01 | Bayer Cropscience Lp | Variantes de hppd y metodos de uso. |
| CN104286014B (zh) * | 2014-08-27 | 2016-03-23 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 杀虫蛋白的用途 |
| CN105367633B (zh) * | 2014-08-28 | 2018-11-30 | 四川农业大学 | 一种BT蛋白CRY2Ab32、其编码基因及应用 |
| AR105155A1 (es) * | 2015-07-07 | 2017-09-13 | Syngenta Participations Ag | Composiciones y métodos para controlar plagas de plantas |
| WO2017042259A1 (en) | 2015-09-11 | 2017-03-16 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Hppd variants and methods of use |
| US11447531B2 (en) | 2016-10-21 | 2022-09-20 | Vestaron Corporation | Cleavable peptides and insecticidal and nematicidal proteins comprising same |
| WO2018098214A1 (en) | 2016-11-23 | 2018-05-31 | Bayer Cropscience Lp | Axmi669 and axmi991 toxin genes and methods for their use |
| AU2017382305A1 (en) | 2016-12-22 | 2019-07-18 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Use of CRY14 for the control of nematode pests |
| UY37571A (es) | 2017-01-18 | 2018-08-31 | Bayer Cropscience Lp | Gen de toxina bp005 y procedimientos para su uso |
| BR112019014720A2 (pt) | 2017-01-18 | 2020-04-07 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | métodos para conferir resistência a doença em uma planta e para aumentar o rendimento em uma planta |
| BR112019018056A2 (pt) | 2017-03-07 | 2020-08-11 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | molécula de ácido nucleico recombinante, cassete de expressão, célula hospedeira, plantas, sementes transgênicas, polipeptídeo recombinante, métodos para conferir tolerância e para controlar ervas daninhas, produto de utilidade e uso da sequência de nucleotídeos |
| US11279944B2 (en) | 2017-10-24 | 2022-03-22 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Of herbicide tolerance to 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) inhibitors by down-regulation of HPPD expression in soybean |
| US20210032651A1 (en) | 2017-10-24 | 2021-02-04 | Basf Se | Improvement of herbicide tolerance to hppd inhibitors by down-regulation of putative 4-hydroxyphenylpyruvate reductases in soybean |
| WO2020217252A1 (en) * | 2019-04-24 | 2020-10-29 | Dcm Shriram Limited | Codon optimized synthetic nucleotide sequences encoding cry2ai protein and uses thereof |
| CN114096669B (zh) * | 2019-07-30 | 2024-05-31 | Dcm施雷姆有限责任公司 | 编码杀虫晶体蛋白的合成核苷酸序列及其用途 |
| CN111334586A (zh) * | 2020-04-02 | 2020-06-26 | 南京农业大学 | 基于as-pcr技术快速检测二化螟鱼尼丁受体基因突变的方法 |
| CN114717256A (zh) * | 2022-02-19 | 2022-07-08 | 四川农业大学 | 在水稻中高效表达Bt蛋自Cry2Ag1抗草地贪夜蛾的方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL177516C (nl) | 1978-09-12 | 1985-10-01 | Pidou Bv | Afdichtmanchet. |
| NL8700204A (nl) | 1987-01-28 | 1988-08-16 | Pidou Bv | Afdichtinrichting. |
| US6107278A (en) * | 1997-03-13 | 2000-08-22 | Mycogen Corporation | Polynucleotide encoding lepidopteran active toxin PS86I2 derived from Bacillus thuringiensis and methods of using PS86I2 |
| US6489542B1 (en) * | 1998-11-04 | 2002-12-03 | Monsanto Technology Llc | Methods for transforming plants to express Cry2Ab δ-endotoxins targeted to the plastids |
| CA2384967A1 (en) * | 1999-09-15 | 2001-03-22 | Monsanto Technology Llc | Lepidopteran-active bacillus thuringiensis .delta.-endotoxin compositions and methods of use |
-
2002
- 2002-01-08 JP JP2002557703A patent/JP4404549B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-08 CA CA2771117A patent/CA2771117C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-08 AU AU2002252974A patent/AU2002252974B2/en not_active Expired
- 2002-01-08 CA CA2433817A patent/CA2433817C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-08 ES ES02722023T patent/ES2315360T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-08 BR BRPI0206346-8A patent/BRPI0206346B1/pt unknown
- 2002-01-08 AT AT02722023T patent/ATE409231T1/de active
- 2002-01-08 MX MXPA03006130A patent/MXPA03006130A/es active IP Right Grant
- 2002-01-08 CN CNB028035674A patent/CN1234867C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-08 SI SI200230777T patent/SI1352068T1/sl unknown
- 2002-01-08 BR BR0206346-8A patent/BR0206346A/pt active IP Right Grant
- 2002-01-08 DE DE60229037T patent/DE60229037D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-08 BR BR122015003517-1A patent/BR122015003517B1/pt active IP Right Grant
- 2002-01-08 EP EP02722023A patent/EP1352068B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-08 PT PT02722023T patent/PT1352068E/pt unknown
- 2002-01-08 WO PCT/EP2002/000298 patent/WO2002057664A2/en active IP Right Grant
- 2002-01-09 AR ARP020100051A patent/AR032231A1/es active IP Right Grant
-
2014
- 2014-04-15 AR ARP140101586A patent/AR096027A2/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2433817A1 (en) | 2002-07-25 |
| BR0206346A (pt) | 2003-10-28 |
| JP4404549B2 (ja) | 2010-01-27 |
| AU2002252974B2 (en) | 2006-12-14 |
| JP2004522437A (ja) | 2004-07-29 |
| WO2002057664A3 (en) | 2003-04-17 |
| MXPA03006130A (es) | 2005-02-14 |
| ATE409231T1 (de) | 2008-10-15 |
| CA2771117C (en) | 2015-03-17 |
| BR122015003517B1 (pt) | 2021-02-02 |
| CN1484702A (zh) | 2004-03-24 |
| EP1352068B1 (en) | 2008-09-24 |
| CA2433817C (en) | 2012-05-22 |
| AR096027A2 (es) | 2015-12-02 |
| WO2002057664A2 (en) | 2002-07-25 |
| SI1352068T1 (sl) | 2009-02-28 |
| AR032231A1 (es) | 2003-10-29 |
| EP1352068A2 (en) | 2003-10-15 |
| CA2771117A1 (en) | 2002-07-25 |
| CN1234867C (zh) | 2006-01-04 |
| ES2315360T3 (es) | 2009-04-01 |
| DE60229037D1 (de) | 2008-11-06 |
| PT1352068E (pt) | 2009-01-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2315360T3 (es) | Proteinas insecticidas de bacillus thuringiensis. | |
| US7265269B2 (en) | Nucleic acids encoding a novel Cry2Ae bacillus thuringiensis insecticidal protein | |
| EP1255773B1 (en) | Insecticidal proteins from bacillus thuringiensis | |
| AU2011250674B2 (en) | Novel Bacillus thuringiensis insecticidal proteins | |
| AU2002252974A1 (en) | Bacillus thuringiensis insecticidal proteins | |
| EP1490397B1 (en) | Novel bacillus thuringiensis insecticidal proteins |