CN111334586A - 基于as-pcr技术快速检测二化螟鱼尼丁受体基因突变的方法 - Google Patents

基于as-pcr技术快速检测二化螟鱼尼丁受体基因突变的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111334586A
CN111334586A CN202010253906.XA CN202010253906A CN111334586A CN 111334586 A CN111334586 A CN 111334586A CN 202010253906 A CN202010253906 A CN 202010253906A CN 111334586 A CN111334586 A CN 111334586A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
seq
nucleotide sequence
sensitive
upstream
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010253906.XA
Other languages
English (en)
Inventor
高聪芬
黄镜梅
吴顺凡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Agricultural University
Original Assignee
Nanjing Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Agricultural University filed Critical Nanjing Agricultural University
Priority to CN202010253906.XA priority Critical patent/CN111334586A/zh
Publication of CN111334586A publication Critical patent/CN111334586A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858Allele-specific amplification
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种基于AS‑PCR技术快速检测二化螟鱼尼丁受体基因突变的方法,涉及基因突变鉴定技术领域;所述引物组分别根据Y4667C/D、I4758M和Y4891F四个位点设计,包括敏感引物、抗性引物和共用的下游引物。在进行检测时,以待测二化螟基因组DNA为模板,分别采用敏感引物对和抗性引物对进行PCR扩增,通过对扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果来判断二化螟对双酰胺类杀虫剂的敏感性,操作简易,试验周期短,虫量需求小。

Description

基于AS-PCR技术快速检测二化螟鱼尼丁受体基因突变的方法
技术领域
本发明属于基因突变鉴定技术领域,具体涉及一种基于AS-PCR技术快速检测二化螟鱼尼丁受体基因突变的方法。
背景技术
二化螟(Chilo suppressalis,Walker)属于鳞翅目螟蛾科(Lepidoptera:Pyrlidae),是我国水稻上危害最为严重的害虫之一。长期以来,二化螟的防治主要依靠化学防治。双酰胺类杀虫剂作用于昆虫RyR(ryanodine receptor,RyR),使昆虫RyR的Ca2+通道打开,促使Ca2+从内质网膜中释放出来,引起细胞质中钙离子浓度上升,使肌肉细胞完成一次收缩,且持续的Ca2+释放导致虫体不断收缩,进而停止进食、抽搐、呕吐、致昏,最终死亡。由于其独特的杀虫机制和对鳞翅目害虫具有良好的防治效果,同时对哺乳动物安全,且与其它常用杀虫药剂间无交互抗性,逐步成为我国防治二化螟的首选药剂,在水稻上推广使用。
但由于不合理使用,使其存在很大的抗性风险,多种害虫的田间种群出现该类药剂防治效果下降和对其产生了抗药性。如田间小菜蛾(Plutella xylostella)、茶小卷夜蛾(Adoxophyes honmai)、番茄潜叶蛾(Tuta absoluta)和二化螟已经对双酰胺类杀虫剂产生了抗性。近年来已经在一些鳞翅目害虫中发现导致其对双酰胺类抗性发展的靶标突变位点。目前关于二化螟抗药性的监测大都局限于室内药剂毒力生物测定,尚未见到相关快速检测的报道,然而,生测结果并不能对靶标抗性产生精准判断,并且存在实验周期长,虫量需求大等缺点,因此在生产实践中需要一种能够快速检测二化螟抗性突变的方法。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的引物组及其鉴定方法,基于AS-PCR技术即可进行快速鉴定,通过对扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果来判断二化螟对双酰胺类杀虫剂的敏感性,稳定性好,准确性高,且试验周期短,虫量需求小。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一组鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的引物组,所述引物组包括独立包装的4组AS-PCR引物,所述引物组针对Y4667C、Y4667D、I4758M和Y4891F位点设计得到;
每组所述AS-PCR引物包括抗性引物对和敏感引物对,所述敏感引物对包括上游抗性引物F-RR和下游引物R;所述敏感引物对包括上游敏感引物F-SS和下游引物R;所述抗性引物对和敏感引物对的下游引物R相同;
其中针对Y4667C设计的上游敏感引物Y4667C F-SS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,上游抗性引物Y4667C F-RR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,下游引物Y4667C R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
针对Y4667D设计的上游敏感引物Y4667D F-SS的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,上游抗性引物Y4667D F-RR的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,下游引物Y4667D R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
针对I4758M设计的上游敏感引物I4758M F-SS的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示,上游抗性引物I4758M F-RR的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,下游引物I4758M R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示;
针对Y4891F设计的上游敏感引物Y4891F F-SS的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示,上游抗性引物Y4891F F-RR的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示,下游引物Y4891F R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明提供了一种鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的试剂,所述试剂中包括所述引物组的水溶液。
本发明提供了一种鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的试剂盒,所述试剂盒中包括所述引物组或所述试剂。
本发明提供了一种鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的方法,包括以下步骤:以二化螟基因组DNA为模板,分别以所述引物组为引物进行AS-PCR,对得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳;当只有敏感引物对的扩曾产物的电泳条带显示出有条带,而抗性引物对的电泳条带显示无条带时,说明检测的模板为未突变个体;当敏感引物对和抗性引物对的电泳条带都显示条带时,说明检测的模板为杂合突变个体;当敏感引物对的电泳条带显示无条带,而抗性引物对的电泳显示有条带时,说明检测的模板为纯合突变个体。
优选的,所述AS-PCR的体系以25μL计,包括:10×Ex Taq Buffer 2.5μL,dNTPMixture 2μL,上游抗性引物F-RR或上游敏感引物F-SS 0.5μL,下游引物R 0.5μL,模板DNA1μL,Ex Taq DNA聚合酶0.25μL和ddH2O 18.25μL。
优选的,所述AS-PCR的程序包括:94℃预变性3min;94℃变性20s,57℃退火20s,72℃延伸20s,30个循环;72℃延伸2min。
优选的,在判断出二化螟鱼尼丁受体基因是否突变后,还包括扩增鉴定,所述扩增的引物对分别包括上游引物F和下游引物R;
其中根据Y4667C或Y4667D设计的引物Y4667C F或Y4667D F的核苷酸序列如SEQID NO.12所示,Y4667C R或Y4667D R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
根据I4758M设计的引物I4758M F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示,I4758M R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示;
根据Y4891F设计的引物Y4891F F的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示,Y4891F R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明提供了一组鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的引物组,以待测二化螟基因组DNA为模板,分别采用敏感引物对和抗性引物对进行PCR扩增,通过对扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果来判断二化螟对双酰胺类杀虫剂的敏感性。本发明所述引物组基于Y4667C/D、I4758M和Y4891F四个位点设计,克隆片段长度分别为198bp、133bp和146bp。在本发明实施例中,对单头二化螟基因组进行PCR扩增,测序后结果显示,敏感/抗性纯合子在突变位置为单一峰图,而杂合子为双峰,与AS-PCR检测结果一致。
附图说明
图1为利用Y4667C设计的引物进行的鉴定结果图,其中A为田间抗性品系和敏感品系的二化螟个体为模板,分别采用CsRyRY4667C敏感引物对和抗性引物对进行PCR扩增,PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图;B为二化螟基因组鱼尼丁受体基因Y4667C扩增产物测序的峰图;敏感/抗性纯合子在突变位置TAC(TA/GC)为单一峰图,而杂合子为双峰,与AS-PCR检测结果一致;
图2为利用Y4667D设计的引物进行的鉴定结果图,其中A为田间抗性品系和敏感品系的二化螟个体为模板,分别采用CsRyRY4667D敏感引物对和抗性引物对进行PCR扩增,PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图;B为二化螟基因组鱼尼丁受体基因Y4667D扩增产物测序的峰图,敏感/抗性纯合子在突变位置TAC(T/GAC)为单一峰图,而杂合子为双峰,与AS-PCR检测结果一致;
图3为利用I4758M设计的引物进行的鉴定结果图,其中A为田间抗性品系和敏感品系的二化螟个体为模板,分别采用CsRyR I4758M敏感引物对和抗性引物对进行PCR扩增,PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图;B为二化螟基因组鱼尼丁受体基因I4758M扩增产物测序的峰图,敏感/抗性纯合子在突变位置ATA(ATA/G)为单一峰图,而杂合子为双峰,这与AS-PCR检测结果一致;
图4为利用Y4891F设计的引物进行的鉴定结果图,其中A为田间抗性品系和敏感品系的二化螟个体为模板,分别采用CsRyRY4891F敏感引物对和抗性引物对进行PCR扩增,PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图;B为二化螟基因组鱼尼丁受体基因Y4891F扩增产物测序的峰图,敏感/抗性纯合子在突变位置TAC(TA/TC)为单一峰图,而杂合子为双峰,与AS-PCR检测结果一致。
具体实施方式
本发明提供了一组鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的引物组,所述引物组包括独立包装的4组AS-PCR引物,所述引物组针对Y4667C、Y4667D、I4758M和Y4891F位点设计得到;
每组所述AS-PCR引物包括抗性引物对和敏感引物对,所述敏感引物对包括上游抗性引物F-RR和下游引物R;所述敏感引物对包括上游敏感引物F-SS和下游引物R;所述抗性引物对和敏感引物对的下游引物R相同;
其中针对Y4667C设计的上游敏感引物Y4667C F-SS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,上游抗性引物Y4667C F-RR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,下游引物Y4667C R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
针对Y4667D设计的上游敏感引物Y4667D F-SS的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,上游抗性引物Y4667D F-RR的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,下游引物Y4667D R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
针对I4758M设计的上游敏感引物I4758M F-SS的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示,上游抗性引物I4758M F-RR的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,下游引物I4758M R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示;
针对Y4891F设计的上游敏感引物Y4891F F-SS的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示,上游抗性引物Y4891F F-RR的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示,下游引物Y4891F R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明所述引物组的信息具体如表1所示:
表1引物组信息
名称 序列 SEQ ID NO
Y4667C F-SS CGAAACTTCTACAACCTGAACTA 1
Y4667C F-RR CGAAACTTCTACAACCTGAACTG 2
Y4667C R CTGCTCCTACACTTCTGATAT 3
Y4667D F-SS CGAAACTTCTACAACCTGAGGT 4
Y4667D F-RR CGAAACTTCTACAACCTGAGGG 5
Y4667D R CTGCTCCTACACTTCTGATAT 3
I4758M F-SS CTATCGTGTCTCTGGCCGTA 6
I4758M F-RR CTATCGTGTCTCTGGCCGTG 7
I4758M R TTGCGGTGATAATGGGCAGT 8
Y4891F F-SS CGTTCCTCTACTCTCTATGCTA 9
Y4891F F-RR CGTTCCTCTACTCTCTATGCTT 10
Y4891F R CTGTTTCCCATTATGGGTGACA 11
本发明利用所述Y4667C或Y4667D位点设计的引物组进行的AS-PCR的扩增条带优选为198bp,其序列优选如SEQ IDNO.15所示:CGAAACTTCTACAACCTGAAGTACGTCGCGTTAGTGCTCGCCTTCTGCATCAACTTCGTACTGCTGTTTTATAAGGTGAGTAAGTTTATTATTTCGTGGGGGAATTATACATGAAAGATTATTCGCTTTTTTTACATAAGAATGAGACTAGGAATTATTTTGGAGGAAAACAGTCGCATATCAGAAGTGTAGGAGCAG;
利用I4758M位点设计得到的引物组进行的AS-PCR的扩增条带优选为133bp,其序列优选如SEQ ID NO.16所示:CTATCGTGTCTCTGGCCATACTCATAGGATACTATCATCTCAAGGTGAGAACTAAAATAGACCATAGAGCAGTGTTATAAAAATCATTACTTTTTTTGTGTATATGGAAGAAAACTGCCCATTATCACCGCAA;
利用Y4891F位点设计得到的引物组进行的AS-PCR的扩增条带优选为146bp,其序列优选如SEQ IDNO.17所示:CGTTCCTCTACTCTCTATGGTACTTCTCGTTCTCTGTCATGGGCAACTTCAACAACTTCTTCTTCGCCGCCCATTTACTAGACGTCGCTGTGGGATTCAAGACCTTGAGGACCATATTGCAGTCTGTCACCCATAATGGGAAACAG。
本发明提供了一种鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的试剂,所述试剂中包括所述引物组的水溶液。本发明所述试剂的工作浓度优选为10μM。
本发明还提供了一种鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的试剂盒,所述试剂盒中包括所述引物组或所述试剂。本发明所述试剂盒中优选还包括10×Ex Taq Buffer、dNTPMixture和Ex Taq DNA聚合酶。
本发明还提供了一种鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的方法,包括以下步骤:以二化螟基因组DNA为模板DNA,以所述引物组为引物进行AS-PCR,对得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,当只有敏感引物对的扩曾产物的电泳条带显示出有条带,而抗性引物对的电泳条带显示无条带时,说明检测的模板为未突变个体;当敏感引物对和抗性引物对的电泳条带都显示条带时,说明检测的模板为杂合突变个体;当敏感引物对的电泳条带显示无条带,而抗性引物对的电泳显示有条带时,说明检测的模板为纯合突变个体。以Y4667C为例,当只有敏感引物对(由上游敏感引物Y4667C F-SS和下游引物Y4667C R组成)的扩曾产物电泳条带显示有条带,而抗性引物对(由上游抗性引物Y4667C F-RR和下游引物Y4667C R组成)的电泳条带显示无条带时,检测模板为未突变个体;当敏感引物对(由上游敏感引物Y4667C F-SS和下游引物Y4667C R组成)和抗性引物对(由上游抗性引物Y4667C F-RR和下游引物Y4667C R组成)的扩曾产物的电泳条带都显示有条带时,检测的模板为杂合突变个体;当只有抗性引物对的扩曾产物电泳条带显示有条带,而敏感引物对(由上游敏感引物Y4667C F-SS和下游引物Y4667C R组成)电泳条带显示无条带时,检测模板为纯合突变个体。
本发明对所述二化螟基因组DNA的提取方法并没有特殊限定,利用本领域的常规DNA提取方法即可。
本发明进行所述AS-PCR时,分别独立进行,所述AS-PCR的体系以25μL计,优选包括:10×Ex TaqBuffer 2.5μL,dNTP Mixture 2μL,上游抗性引物F-RR或上游敏感引物F-SS0.5μL,下游引物R 0.5μL,模板DNA 1μL,Ex Taq DNA聚合酶0.25μL和ddH2O 18.25μL。
本发明所述AS-PCR的程序优选包括:94℃预变性3min;94℃变性20s,57℃退火20s,72℃延伸20s,30个循环;72℃延伸2min。
本发明在判断出二化螟鱼尼丁受体基因是否突变后,优选还包括扩增鉴定,所述扩增的引物对分别包括上游引物F和下游引物R;
其中针对Y4667C或Y4667D设计的引物Y4667C F或Y4667D F的核苷酸序列如SEQID NO.12所示:TCTAATACAACAGGCGGTCCAAG,Y4667CR或Y4667D R的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示:CCACGAAATAATAAACTTACTCACC;
针对I14758M设计的引物I4758M F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示:AGTGGTTCACATAGACGAGGAC,I4758M R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示:CAAGCCTGCGTGCTATCTCT;
针对Y4891F设计的引物Y4891F F的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示:TGGCGTTACCAAGTGTGGAAGG,Y4891F R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示:CTGTTTCCCATTATGGGTGACA。
本发明所述扩增鉴定的PCR体系和程序分别与上述AS-PCR的体系和程序相同,在此不再赘述,将得到的扩增产物进行测序,敏感/抗性纯合子在突变位置为单一峰图,而杂合子为双峰。
下面结合实施例对本发明提供的一组鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的引物组及鉴定方法进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、单头二化螟基因组DNA的提取
(1)配制提取液A:1%(g/mL)SDS,50mmol/LTris·HCl,25mmol/L NaCl,25mmol/LEDTA;提取液B:3mol/L KAC,pH=7.2。上述两提取液的溶剂均为超纯水,室温保存;
(2)将单头二化螟试虫置于无菌2.0mL的EP离心管中,放入灭菌后的钢珠,加入200μL的提取液A,用研磨仪进行研磨;
(3)将匀浆后的样品65℃水浴1h,每隔15min震荡混匀,加速组织裂解;
(4)加入等体积(200μL)的提取液B,涡旋震荡混匀,冰浴2h;
(5)10000×g离心15min,小心将上清液转移到另一个无菌1.5mL EP离心管中;
(6)加入3倍体积(600μL)预冷的无水乙醇,涡旋震荡混匀,-20℃放置2h;
(7)10000×g离心15min,弃尽上清液,用70%(mL/mL)乙醇(现配现用)清洗两次;
(8)用移液器吸尽管底70%(mL/mL)乙醇,空气干燥沉淀20min,加入30μL灭菌水溶解,-20℃保存备用。
2、等位基因特异性PCR扩增及电泳检测
(1)在200μL灭菌PCR管中建立总体积为25μL的反应体系(表2):
表2 AS-PCR反应体系
Figure BDA0002436510710000081
Figure BDA0002436510710000091
其中引物序列分别如表1中所示。
(2)按以下程序进行PCR扩增:94℃预变性3min;30轮循环:94℃变性20s,57℃退火20s,72℃延伸20s;72℃延伸2min。
(3)电泳检测:取10μL扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶进行电泳,电泳缓冲液为1×TAE,恒压(120mV)电泳30min,DNAMarker(2000bp),用紫外凝胶成像系统进行观察并拍照保存,结果如图1~4中的A所示,其中图1的1、2、3为Y4667C的杂合子,4、5、6为纯合子,7为未突变个体;图2的1、2、3为未突变个体,4、5为纯合子,6为杂合子;图3的1、2为未突变个体,3、4、5为杂合子,6、7为纯合子;图4的1为未突变个体,2为纯合子,3为杂合子。
3、测序验证结果准确性
对已用电泳鉴定出的单头二化螟基因组进行PCR扩增,
PCR引物分别如表3所示:
表3扩增鉴定PCR引物
名称 序列 SEQ ID NO
Y4667D/C-F TCTAATACAACAGGCGGTCCAAG 12
Y4667D/C-R CCACGAAATAATAAACTTACTCACC 3
I4758M-F AGTGGTTCACATAGACGAGGAC 13
I4758M-R CAAGCCTGCGTGCTATCTCT 8
Y4891F-F TGGCGTTACCAAGTGTGGAAGG 14
Y4891F-R CTGTTTCCCATTATGGGTGACA 11
具体方法如2所示,取3μL电泳后单一条带即可送测,测序结果如附图1~4中的B所示,敏感/抗性纯合子在突变位置为单一峰图,而杂合子为双峰,与AS-PCR检测结果一致。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 基于AS-PCR技术快速检测二化螟鱼尼丁受体基因突变的方法
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgaaacttct acaacctgaa cta 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgaaacttct acaacctgaa ctg 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgctcctac acttctgata t 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgaaacttct acaacctgag gt 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgaaacttct acaacctgag gg 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctatcgtgtc tctggccgta 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctatcgtgtc tctggccgtg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttgcggtgat aatgggcagt 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgttcctcta ctctctatgc ta 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgttcctcta ctctctatgc tt 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctgtttccca ttatgggtga ca 22
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tctaatacaa caggcggtcc aag 23
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agtggttcac atagacgagg ac 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tggcgttacc aagtgtggaa gg 22
<210> 15
<211> 198
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgaaacttct acaacctgaa gtacgtcgcg ttagtgctcg ccttctgcat caacttcgta 60
ctgctgtttt ataaggtgag taagtttatt atttcgtggg ggaattatac atgaaagatt 120
attcgctttt tttacataag aatgagacta ggaattattt tggaggaaaa cagtcgcata 180
tcagaagtgt aggagcag 198
<210> 16
<211> 133
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctatcgtgtc tctggccata ctcataggat actatcatct caaggtgaga actaaaatag 60
accatagagc agtgttataa aaatcattac tttttttgtg tatatggaag aaaactgccc 120
attatcaccg caa 133
<210> 17
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgttcctcta ctctctatgg tacttctcgt tctctgtcat gggcaacttc aacaacttct 60
tcttcgccgc ccatttacta gacgtcgctg tgggattcaa gaccttgagg accatattgc 120
agtctgtcac ccataatggg aaacag 146

Claims (7)

1.一组鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的引物组,其特征在于,所述引物组包括独立包装的4组AS-PCR引物,所述引物组针对Y4667C、Y4667D、I4758M和Y4891F位点设计得到;
每组所述AS-PCR引物包括抗性引物对和敏感引物对,所述敏感引物对包括上游抗性引物F-RR和下游引物R;所述敏感引物对包括上游敏感引物F-SS和下游引物R;所述抗性引物对和敏感引物对的下游引物R相同;
其中针对Y4667C设计的上游敏感引物Y4667C F-SS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,上游抗性引物Y4667C F-RR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,下游引物Y4667C R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
针对Y4667D设计的上游敏感引物Y4667D F-SS的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,上游抗性引物Y4667D F-RR的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,下游引物Y4667D R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
针对I4758M设计的上游敏感引物I4758M F-SS的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示,上游抗性引物I4758M F-RR的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,下游引物I4758M R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示;
针对Y4891F设计的上游敏感引物Y4891F F-SS的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示,上游抗性引物Y4891F F-RR的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示,下游引物Y4891F R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
2.一种鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的试剂,其特征在于,所述试剂中包括权利要求1所述引物组的水溶液。
3.一种鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中包括权利要求1所述引物组或权利要求2所述试剂。
4.一种鉴定二化螟鱼尼丁受体基因突变的方法,其特征在于,包括以下步骤:以二化螟基因组DNA为模板,分别以权利要求1中所述引物组为引物进行AS-PCR,对得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳;当只有敏感引物对的扩曾产物的电泳条带显示出有条带,而抗性引物对的电泳条带显示无条带时,说明检测的模板为未突变个体;当敏感引物对和抗性引物对的电泳条带都显示条带时,说明检测的模板为杂合突变个体;当敏感引物对的电泳条带显示无条带,而抗性引物对的电泳显示有条带时,说明检测的模板为纯合突变个体。
5.根据权利要求4所述方法,其特征在于,所述AS-PCR的体系以25μL计,包括:10×ExTaq Buffer2.5μL,dNTP Mixture 2μL,上游抗性引物F-RR或上游敏感引物F-SS 0.5μL,下游引物R 0.5μL,模板DNA 1μL,Ex Taq DNA聚合酶0.25μL和ddH2O 18.25μL。
6.根据权利要求4所述方法,其特征在于,所述AS-PCR的程序包括:94℃预变性3min;94℃变性20s,57℃退火20s,72℃延伸20s,30个循环;72℃延伸2min。
7.根据权利要求4所述方法,其特征在于,在判断出二化螟鱼尼丁受体基因是否突变后,还包括扩增鉴定,所述扩增的引物对分别包括上游引物F和下游引物R;
其中根据Y4667C或Y4667D设计的引物Y4667C F或Y4667D F的核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示,Y4667C R或Y4667D R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
根据I4758M设计的引物I4758M F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示,I4758M R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示;
根据Y4891F设计的引物Y4891F F的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示,Y4891F R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
CN202010253906.XA 2020-04-02 2020-04-02 基于as-pcr技术快速检测二化螟鱼尼丁受体基因突变的方法 Pending CN111334586A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010253906.XA CN111334586A (zh) 2020-04-02 2020-04-02 基于as-pcr技术快速检测二化螟鱼尼丁受体基因突变的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010253906.XA CN111334586A (zh) 2020-04-02 2020-04-02 基于as-pcr技术快速检测二化螟鱼尼丁受体基因突变的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111334586A true CN111334586A (zh) 2020-06-26

Family

ID=71178700

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010253906.XA Pending CN111334586A (zh) 2020-04-02 2020-04-02 基于as-pcr技术快速检测二化螟鱼尼丁受体基因突变的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111334586A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2771117A1 (en) * 2001-01-09 2002-07-25 Bayer Cropscience Nv Bacillus thuringiensis insecticidal proteins
CN101363059A (zh) * 2008-09-24 2009-02-11 南京农业大学 二化螟对三唑磷靶标抗性的分子检测方法
CN102628049A (zh) * 2012-04-05 2012-08-08 浙江大学 二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR及其编码的蛋白和应用
CN102952889A (zh) * 2012-12-12 2013-03-06 中国农业大学 快速鉴定小菜蛾鱼尼丁受体基因突变的方法及其专用引物
CN105755144A (zh) * 2016-04-27 2016-07-13 浙江省农业科学院 一种二化螟对氯虫苯甲酰胺抗性的分子检测方法及其专用引物

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2771117A1 (en) * 2001-01-09 2002-07-25 Bayer Cropscience Nv Bacillus thuringiensis insecticidal proteins
CN101363059A (zh) * 2008-09-24 2009-02-11 南京农业大学 二化螟对三唑磷靶标抗性的分子检测方法
CN102628049A (zh) * 2012-04-05 2012-08-08 浙江大学 二化螟鱼尼丁受体基因CsRyR及其编码的蛋白和应用
CN102952889A (zh) * 2012-12-12 2013-03-06 中国农业大学 快速鉴定小菜蛾鱼尼丁受体基因突变的方法及其专用引物
CN105755144A (zh) * 2016-04-27 2016-07-13 浙江省农业科学院 一种二化螟对氯虫苯甲酰胺抗性的分子检测方法及其专用引物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JING-MEI HUANG等: "Multiple target-site mutations occurring in lepidopterans confer resistance to diamide insecticides", 《INSECT BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY》 *
徐刚等: "二化螟生理生化与分子生物学研究进展", 《浙江农业科学》 *
赵丹丹等: "二化螟对双酰胺类杀虫剂的抗药性监测和交互抗性研究", 《中国水稻科学》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wondji et al. Two duplicated P450 genes are associated with pyrethroid resistance in Anopheles funestus, a major malaria vector
Meksem et al. Conversion of AFLP bands into high-throughput DNA markers
Sakamoto et al. Linkage analysis of quantitative trait loci associated with spawning time in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)
Liu et al. Assessing the genetic structure of three Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) stocks by microsatellite markers
CN109182545B (zh) 一种大黄鱼哈维氏弧菌病关联的snp标记及其引物和应用
Yoon et al. Genetic similarity and variation in the cultured and wild crucian carp (Carassius carassius) estimated with random amplified polymorphic DNA
KR101970264B1 (ko) 고추 풋마름병 저항성 품종 판별용 caps 마커 및 이의 용도
Pester et al. Genetic diversity of jointed goatgrass (Aegilops cylindrica) determined with RAPD and AFLP markers
Yan et al. Sampling strategy within a wild soybean population based on its genetic variation detected by ISSR markers
CN111635959B (zh) 一种Fluoxapiprolin抗性基因型G700V辣椒疫霉的LAMP引物及应用
CN104450697A (zh) 一种与牡蛎抗病毒特性相关的snp标记及其应用
CN104313177A (zh) 一种快速鉴定灰葡萄孢菌对多菌灵抗性基因型f200y菌株的分子检测方法
CN112176081A (zh) 与鸡球虫癸氧喹酯耐药性相关的snp分子标记及其应用
CN111334586A (zh) 基于as-pcr技术快速检测二化螟鱼尼丁受体基因突变的方法
CN104293971B (zh) 一种基于lamp技术对多菌灵高抗灰葡萄孢菌株的快速检测方法
Sun et al. Comparison of complete mitochondrial DNA sequences between old and new world strains of the cowpea aphid, Aphis craccivora (Hemiptera: Aphididae)
Wang et al. Population structure of the blood clam (Tegillarca granosa) in China based on microsatellite markers
Wei et al. Linkage and mapping analyses of the normal marking gene+ P in the silkworm (Bombyx mori) using SSR markers
Riaz et al. Development and characterization of a large set of microsatellite markers for grape phylloxera (Daktulosphaira vitifoliae Fitch)
Greyling et al. Development of a high-throughput microsatellite typing approach for forensic and population genetic analysis of wild and domestic African Bovini.
CN112210607B (zh) 与水牛白毛色表型相关的分子标记及应用
CN105713959B (zh) 小菜蛾对阿维菌素靶标抗性的分子检测方法
KR101401980B1 (ko) 역병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 특이 프라이머 및 이의 용도
Soldánová et al. Newly discovered genes for resistance to powdery mildew in the subtelomeric region of the short arm of barley chromosome 7H
Moreira et al. Characterization of nine transferred SSR markers in the tropical tree species Enterolobium contortisiliquum (Fabaceae)

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200626