CN105755144A - 一种二化螟对氯虫苯甲酰胺抗性的分子检测方法及其专用引物 - Google Patents

一种二化螟对氯虫苯甲酰胺抗性的分子检测方法及其专用引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种二化螟对氯虫苯甲酰胺抗性的分子检测方法及其专用引物。本发明提供了一种特异性引物组合物，由序列表中的序列1、序列2及序列3所示单链DNA分子组成。所述特异引物组合物可用于检测氯虫苯甲酰胺的作用位点鱼尼丁受体是否发生了基因G4946E突变，所述二化螟鱼尼丁受体基因的G4946E突变是指位于鱼尼丁受体基因的开放阅读框5’末端第14837位核苷酸由G突变为A，从而检测二化螟对氯虫苯甲酰胺的抗性。本发明提供的特异性引物组合物及其应用对于监测二化螟田间种群对氯虫苯甲酰胺抗性发展动态、指导合理用药，延缓抗性发展，制定抗性治理方针及时调整防治策略具有重要意义。

Description

一种二化螟对氯虫苯甲酰胺抗性的分子检测方法及其专用引物
技术领域
本发明涉及一种二化螟对氯虫苯甲酰胺抗性的分子检测方法及其专用引物。
技术背景
二化螟Chilosuppressalis属于鳞翅目Lepidoptera螟蛾科Pyralidae，是水稻钻蛀性害虫，俗称钻心虫，是大部分水稻产区的螟虫优势种。东亚地区发生主要分布在中国、韩国、日本，直接威胁农业生产。二化螟在苗期为害水稻可造成枯鞘、枯心，在孕穗期和穗期为害可造成枯孕穗、白穗和虫伤株等，严重影响水稻的质量和产量。近些年来，随着种植结构和耕作制度调整，杂交水稻面积逐年增加，使得越冬代有效虫源面积扩大，更加剧了螟虫的危害。目前，对于二化螟的防治，我国多采用化学药剂、。但是，化学农药的不合理使用，导致螟虫抗药性水平不断提高，田间防效下降，残虫数量大增，从而加大了螟虫的猖獗危害。同时，化学农药带来的环境污染、农产品药物残留超标等问题日益突出。
氯虫苯甲酰胺属双酰胺类杀虫剂，对鳞翅目害虫有非常突出的防效。其作用机制新颖，能够激活鱼尼丁受体，使细胞内钙释放通道，导致贮存钙离子的失控性释放，导致昆虫瘫痪死亡，是目前为数不多的作用于昆虫细胞鱼尼丁(Ryanodine)受体的化合物。氯虫苯甲酰胺自2008年在中国正式登记后，快速大面积用于防治二化螟等多种鳞翅目害虫。但是，2013年，在浙江瑞安水稻二化螟种群对该药产生了十几倍的抗性，2015年，在浙江龙游、乐清、余姚等地发现二化螟抗性已升高到100多倍，最高200多倍。
虽然有发明专利报道过鉴定小菜蛾鱼尼丁受体基因突变的方法和专用引物(例如中国发明专利申请，申请号：2012105375461)，但是二化螟和小菜蛾分属于鳞翅目不同的科，二化螟属于螟蛾科，小菜蛾属于菜蛾科Plutellidae，包含该鱼尼丁受体基因突变位点的基因序列也不尽相同，因此本发明提供的方法和专用引物更具针对性且特异性更强。
发明内容
本发明提供一种二化螟对氯虫苯甲酰胺抗性的分子检测方法及其专用引物。本发明提供了一种特异性引物组合物，由序列表的序列1所示单链DNA分子、序列2所示单链DNA分子和序列3所示单链DNA分子组成。
优选的，引物1为敏感型专用上游引物，引物2为抗性专用上游引物，引物3为敏感型/抗性专用下游引物；引物1的3’末端第1位双下划线核苷酸与突变前的核苷酸一致，引物2的3’末端第1位双下划线核苷酸与突变后的核苷酸一致；引物1和引物2的3’末端第3位和第4位核苷酸引入了错配碱基C和A(见波浪下划线)；其中，引物1和引物3为敏感引物对，引物2和引物3为抗性引物对
本发明提供一种特异性引物组合物，所述引物用途为如下：检测二化螟鱼尼丁受体基因是否发生了G4946E突变，所述鱼尼丁受体基因的G4946E突变指的是鱼尼丁受体基因的开放阅读框从5’末端第14837位核苷酸由G突变为A，从而检测二化螟对氯虫苯甲酰胺的抗性。
本发明还保护一种检测二化螟针对G4946E突变的基因型的方法，包括以下步骤：以待检测二化螟基因组DNA为模板，分别采用敏感引物对和抗性引物对进行PCR扩增，获得以下结果：如果采用敏感引物对时扩增得到了70bp左右的扩增产物而同时采用抗性引物对没有扩增到70bp左右的扩增产物，则待检测二化螟为GG基因型，即敏感基因型；如果采用敏感引物对时没有扩增得到70bp左右的扩增产物而同时采用抗性引物对扩增得到了70bp左右的扩增产物，则待检测二化螟为AA基因型，即抗性基因型；如果采用敏感引物对时扩增得到了70bp左右的扩增产物而同时采用抗性引物对也扩增得到了70bp左右的扩增产物，则待检测二化螟为GA基因型，即敏感和抗性杂合基因型。
所述敏感引物对由序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成；所述抗性引物对由序列表的序列2所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成；所述鱼尼丁受体基因的G4946E突变指的是鱼尼丁受体基因的开放阅读框从5’末端第14837位核苷酸由G突变为A。
本发明还保护一种检测二化螟对氯虫苯甲酰胺抗性的方法，包括以下步骤：以待检测二化螟基因组DNA为模板，分别采用敏感引物对和抗性引物对进行PCR扩增，获得以下结果：如果采用敏感引物对时扩增得到了70bp左右的扩增产物而同时采用抗性引物对没有扩增到70bp左右的扩增产物，则待检测二化螟疑似对氯虫苯甲酰胺敏感；如果采用敏感引物对时没有扩增得到70bp左右的扩增产物而同时采用抗性引物对扩增得到了70bp左右的扩增产物，则待检测二化螟疑似对氯虫苯甲酰胺具有抗性；如果采用敏感引物对时扩增得到了70bp左右的扩增产物而同时采用抗性引物对也扩增得到了70bp左右的扩增产物，则待检测二化螟疑似对氯虫苯甲酰胺敏感，但有产生抗性的趋势。
所述敏感引物对由序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成；所述抗性引物对由序列表的序列2所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成。
以上任一所述二化螟的鱼尼丁受体基因的开放阅读框为序列表中序列4为5’末端第1位到15402位的DNA分子序列。
有益效果
本发明提供的特异性引物组合物能够有效鉴定出二化螟的鱼尼丁受体基因是否发生了G4946E突变，从而判断二化螟对氯虫苯甲酰胺的敏感度或抗药性，具有快速、高效、灵敏度高等特点，对于监测二化螟田间种群对氯虫苯甲酰胺的抗性基因频率和抗性发生动态，及时调整防治策略，指导合理用药，延缓抗性发展具有重要意义。
附图说明
图1为以二化螟对氯虫苯甲酰胺敏感个体、抗性个体为模板，分别采用敏感引物对或抗性引物对进行PCR扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中M代表Marker，S代表敏感引物对扩增出的条带，R代表抗性引物对扩增出的条带，+表示扩增出相应的条带，-表示未扩增出相应的条带。
具体实施方式
以下的实施例目的是更好地理解本发明，但并不限定本发明。以下所有实施例中的实验方法，均为常规方法。
实施例1：专用引物在浙江省萧山地区二化螟抗性个体检测中的应用
引物设计
根据二化螟鱼尼丁受体基因序列(序列1)，自行设计等位基因特异性PCR引物如下：
引物1：5’-TACTAGACGTCGCTGACGG-3’
引物2：5’-TACTAGACGTCGCTGACGA-3’
引物3：5’-TGTTTCCCATTATGGGTGAC-3’
本发明引物设计未借助于任何引物设计软件，而是根据所要扩增的鱼尼丁受体基因片段和引物设计的基本原则自行设计。其中，引物1为敏感型专用上游引物，引物2为抗性专用上游引物，引物3为敏感型/抗性专用下游引物。引物1的3’末端第1位核苷酸(见双下划线)与突变前的核苷酸一致，引物2的3’末端第1位核苷酸(见双下划线)与突变后的核苷酸一致。此外，为了增加等位基因特异性PCR方法的特异性，引物1和引物2的3’末端第3位和第4位核苷酸引入了错配碱基C和A(见波浪下划线)。其中，引物1和引物3为敏感引物对，引物2和引物3为抗性引物对。
提取浙江省萧山地区随机采集的30个二化螟个体的DNA，试剂盒采用TIANampGenomicDNAKit(TIANGEN)，提取步骤参照试剂盒说明书。
利用敏感引物对和抗性引物对，分别对所有二化螟个体DNA进行PCR扩增。PCR反应体系：共20μL，包含1μL的基因组DNA，10μL2XTaqPCRMasterMix(TIANGEN)，10uM的正/反向引物各1μL，双蒸水7μL；PCR反应条件：95℃1min，95℃20S，58℃20S，72℃20S共35个循环，72℃3min。利用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并将PCR产物送公司测序(上海生工)。如果采用敏感引物对检测结果得到了70bp左右的DNA条带而同时采用抗性引物对没有检测到70bp左右的DNA条带，则待检测二化螟疑似对氯虫苯甲酰胺敏感；如果采用敏感引物对时检测结果没有得到70bp左右的DNA条带而同时采用抗性引物对检测到了70bp左右的DNA条带，则待检测二化螟疑似对氯虫苯甲酰胺具有抗性；如果采用敏感引物对时检测结果得到了70bp左右的DNA条带而同时采用抗性引物对也检测到了70bp左右的DNA条带，则待检测二化螟疑似对氯虫苯甲酰胺敏感，但有产生抗性的趋势。
对2016年采自浙江省萧山地区的30个二化螟个体的鱼尼丁受体进行PCR扩增及测序验证，结果表明：发生G4946E突变的纯合个体，即氯虫苯甲酰胺高抗型个体数量为0；未发生G4946E突变的纯合个体，即氯虫苯甲酰胺敏感型个体数量为21，频率为70.0％；杂合性个体为介于氯虫苯甲酰胺敏感型与高抗型之间的个体数量为9，频率为30.0％(表1)。
另外，通过本发明基因突变的方法检测的这些30个二化螟个体与实际田间表现出来的抗性水平相符，即该方法可以真实检测二化螟个体的鱼尼丁受体的突变频率，从而可以更好的防治二化螟的危害。
实施例2：专用引物在浙江省金华地区二化螟抗性个体检测中的应用
与实施例子1相比，除了二化螟个体来源的地区不同，所采用的引物和方法与实施例子1相同。对2016年采自浙江省金华地区的30个二化螟个体的鱼尼丁受体进行PCR扩增及测序验证(方法同实施例1)，结果表明：发生G4946E突变的纯合个体，即氯虫苯甲酰胺高抗型个体数量为1，突变频率为3.3％；未发生G4946E突变的纯合个体，即氯虫苯甲酰胺敏感型个体数量为13，频率为43.3％；杂合性个体为介于氯虫苯甲酰胺敏感型与高抗型之间的个体数量为16，频率为53.3％(表1)。另外，通过本发明基因突变的方法检测的这些30个二化螟个体与实际田间表现出来的抗性水平相符。
实施例3：专用引物在浙江省衢州地区二化螟抗性个体检测中的应用
与实施例子1相比，除了二化螟个体来源的地区不同，所采用的引物和方法与实施例子1相同。对2016年采自浙江省衢州地区的30个二化螟个体的鱼尼丁受体进行PCR扩增及测序验证(方法同实施例1)，结果表明：发生G4946E突变的纯合个体，即氯虫苯甲酰胺高抗型个体数量为0；未发生G4946E突变的纯合个体，即氯虫苯甲酰胺敏感型个体数量为10，频率为33.3％；杂合性个体为介于氯虫苯甲酰胺敏感型与高抗型之间的个体数量为20，频率为66.7％(表1)。另外，通过本发明基因突变的方法检测的这些30个二化螟个体与实际田间表现出来的抗性水平基本相符。
实施例4：专用引物在浙江省龙游地区二化螟抗性个体检测中的应用
与实施例子1相比，除了二化螟个体来源的地区不同，所采用的引物和方法与实施例子1相同。对2016年采自浙江省龙游地区的30个二化螟个体的鱼尼丁受体进行PCR扩增及测序验证(方法同实施例1)，结果表明：发生G4946E突变的纯合个体，即氯虫苯甲酰胺高抗型个体数量为6，突变频率为20.0％；未发生G4946E突变的纯合个体，即氯虫苯甲酰胺敏感型个体数量为0；杂合性个体为介于氯虫苯甲酰胺敏感型与高抗型之间的个体数量为24，频率为80.0％(表1)。另外，通过本发明基因突变的方法检测的这些30个二化螟个体与实际田间表现出来的抗性水平相符。
实施例5：专用引物在浙江省乐清地区二化螟抗性个体检测中的应用
与实施例子1相比，除了二化螟个体来源的地区不同，所采用的引物和方法与实施例子1相同。对2016年采自浙江省乐清地区的30个二化螟个体的鱼尼丁受体进行PCR扩增及测序验证(方法同实施例1)，结果表明：发生G4946E突变的纯合个体，即氯虫苯甲酰胺高抗型个体数量为5，突变频率为16.7％；未发生G4946E突变的纯合个体，即氯虫苯甲酰胺敏感型个体数量为0；杂合性个体为介于氯虫苯甲酰胺敏感型与高抗型之间的个体数量为25，频率为83.3％(表1)。另外，通过本发明基因突变的方法检测的这些30个二化螟个体与实际田间表现出来的抗性水平相符。
实施例6：专用引物在浙江省温岭地区二化螟抗性个体检测中的应用
与实施例子1相比，除了二化螟个体来源的地区不同，所采用的引物和方法与实施例子1相同。对2016年采自浙江省温岭地区的30个二化螟个体的鱼尼丁受体进行PCR扩增及测序验证(方法同实施例1)，结果表明：发生G4946E突变的纯合个体，即氯虫苯甲酰胺高抗型个体数量为4，突变频率为13.3％；未发生G4946E突变的纯合个体，即氯虫苯甲酰胺敏感型个体数量为0；杂合性个体为介于氯虫苯甲酰胺敏感型与高抗型之间的个体数量为26，频率为86.7(表1)。另外，通过本发明基因突变的方法检测的这些30个二化螟个体与实际田间表现出来的抗性水平相符。
实施例7：专用引物在湖南省衡阳地区二化螟抗性个体检测中的应用
与实施例子1相比，除了二化螟个体来源的地区不同，所采用的引物和方法与实施例子1相同。对2016年采自湖南省衡阳地区的30个二化螟个体的鱼尼丁受体进行PCR扩增及测序验证(方法同实施例1)，结果表明：发生G4946E突变的纯合个体，即氯虫苯甲酰胺高抗型个体数量为2，突变频率为6.7％；未发生G4946E突变的纯合个体，即氯虫苯甲酰胺敏感型个体数量为6，频率为20.0％；杂合性个体为介于氯虫苯甲酰胺敏感型与高抗型之间的个体数量为22，频率为73.3％(表1)。另外，通过本发明基因突变的方法检测的这些30个二化螟个体与实际田间表现出来的抗性水平相符。
表1不同地区二化螟G4946E突变频率检测
实施例8：专用引物在河南省信阳地区二化螟抗性个体检测中的应用
与实施例子1相比，除了二化螟个体来源的地区不同，所采用的引物和方法与实施例子1相同。对2016年采自河南省信阳地区的30个二化螟个体的鱼尼丁受体进行PCR扩增及测序验证(方法同实施例1)，结果表明：发生G4946E突变的纯合个体，即氯虫苯甲酰胺高抗型个体数量为1，突变频率为3.3％；未发生G4946E突变的纯合个体，即氯虫苯甲酰胺敏感型个体数量为6，频率为20.0％；杂合性个体为介于氯虫苯甲酰胺敏感型与高抗型之间的个体数量为23，频率为76.7％(表1)。另外，通过本发明基因突变的方法检测的这些30个二化螟个体与实际田间表现出来的抗性水平相符。
近几年，二化螟田间抗性监测结果表明：2013年，在浙江瑞安水稻二化螟种群对该药产生了十几倍的抗性，2015年，在浙江龙游、乐清、余姚等地发现二化螟抗性已升高到100多倍，最高200多倍。通过本发明方法检测的结果，与实际田间实际的抗性监测结果一致，都显示二化螟对氯虫苯甲酰胺已初步产生抗性。说明本发明提供的检测方法和专用引物可靠有效。
实施例9
采用中国专利申请号:2012105375461中扩增小菜蛾的鱼尼丁受体的三个引物按照本发明的方法或者按照该公开的中国发明的方法都不能在二化螟个体上扩增出任何片段(按照表1中不同地方的二化螟个体)(具体实验过程略)，更谈不上计算突变频率问题。
从而说明，如果检测不同物种的鱼尼丁受体基因的突变位点，只能有针对性地设计特定的引物，不同昆虫的引物序列具有一定程度的特异性，并不具备通用性。
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<212>Type:DNA
<211>Length:15402
SequenceName:二化螟受体基因
SequenceDescription:

Claims (3)

1.特异性引物组合物作为制备检测二化螟对氯虫苯甲酰胺抗性的试剂上的用途，其中所述的专用引物由下列序列组成：引物1：5’-TACTAGACGTCGCTGACG-3’；引物2：5’-TACTAGACGTCGCTGACG-3’；引物3：5’-TGTTTCCCATTATGGGTGAC-3’；其中，引物1为敏感型专用上游引物，引物2为抗性专用上游引物，引物3为敏感型/抗性专用下游引物；引物1的3’末端第1位双下划线核苷酸与突变前的核苷酸一致，引物2的3’末端第1位双下划线核苷酸与突变后的核苷酸一致；引物1和引物2的3’末端第3位和第4位核苷酸引入了错配碱基C和A(见波浪下划线)；其中，引物1和引物3为敏感引物对，引物2和引物3为抗性引物对。
2.根据权利要求2所述的应用，检测二化螟氯虫苯甲酰胺作用位点鱼尼丁受体基因是否发生了G4946E突变，所述鱼尼丁受体基因的G4946E突变指的是鱼尼丁受体基因的开放阅读框从5’末端第14837位核苷酸由G突变为A，从而检测二化螟对氯虫苯甲酰胺的抗性。
3.一种检测二化螟鱼尼丁受体G4946E突变的基因型的方法，包括以下步骤：
以待检测二化螟基因组DNA为模板，分别采用如权利要求1所述的敏感引物对和抗性引物对进行PCR扩增，获得以下结果：如果采用敏感引物对时扩增得到了70bp左右的扩增产物而同时采用抗性引物对没有扩增到70bp左右的扩增产物，则待检测二化螟为GG基因型，即敏感基因型；如果采用敏感引物对时没有扩增得到70bp左右的扩增产物而同时采用抗性引物对扩增得到了70bp左右的扩增产物，则待检测二化螟为AA基因型，及抗性基因型；如果采用敏感引物对时扩增得到了70bp左右的扩增产物而同时采用抗性引物对也扩增得到了70bp左右的扩增产物，则待检测二化螟为GA基因型，及敏感和抗性杂合基因型。
CN201610270757.1A 2016-04-27 2016-04-27 一种二化螟对氯虫苯甲酰胺抗性的分子检测方法及其专用引物 Pending CN105755144A (zh)

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CN111334586A (zh) * 2020-04-02 2020-06-26 南京农业大学 基于as-pcr技术快速检测二化螟鱼尼丁受体基因突变的方法

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