CN102952889B

CN102952889B - 快速鉴定小菜蛾鱼尼丁受体基因突变的方法及其专用引物

Info

Publication number: CN102952889B
Application number: CN201210537546.1A
Authority: CN
Inventors: 梁沛; 郭磊; 高希武; 史雪岩; 宋敦伦
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2012-12-12
Filing date: 2012-12-12
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2032-12-12
Also published as: CN102952889A

Abstract

本发明公开了一种快速鉴定小菜蛾鱼尼丁受体基因突变的方法及其专用引物。本发明提供了一种特异引物组合物，由序列表的序列1所示单链DNA分子、序列2所示单链DNA分子和序列3所示单链DNA分子组成。所述特异引物组合物可用以如下（a）或（b）：（a）鉴定小菜蛾是否发生了鱼尼丁受体基因的G4899E突变；所述鱼尼丁受体基因的G4899E突变指的是鱼尼丁受体基因的开放阅读框自5’末端第14696位核苷酸由G突变为A；（b）辅助鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗性。本发明提供的特异引物组合物及其应用对于监测小菜蛾田间种群对双酰胺类杀虫剂的抗性基因频率和对双酰胺类杀虫剂抗药性发生发展动态，及时调整小菜蛾防治策略，指导合理用药、延缓抗性发展具有重要意义。

Description

快速鉴定小菜蛾鱼尼丁受体基因突变的方法及其专用引物

技术领域

本发明涉及一种快速鉴定小菜蛾鱼尼丁受体基因突变的方法及其专用引物。

背景技术

小菜蛾(Plutella xylostella)属于鳞翅目菜蛾科，英文名为“Diamondback moth”，是一种对十字花科植物危害极大的害虫，全国各地均有分布，在我国南方地区常年造成严重危害。目前对小菜蛾的防治仍以化学农药为主，由于杀虫药剂的不合理使用及小菜蛾本身的生物学特性，导致其对几乎所有常用杀虫剂均产生了抗性。

以氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺为代表品种的双酰胺类杀虫剂对鳞翅目害虫有很好的防治效果。其作用机制独特，通过激活昆虫鱼尼丁受体，导致细胞质钙库中的钙离子大量释放，引起肌肉强烈收缩，从而使害虫立即停止取食，活动能力减弱，肌肉瘫痪最终导致死亡。

氯虫苯甲酰胺自2008年在中国正式登记后，很快被大面积用于防治包括小菜蛾在内的多种鳞翅目害虫。但2010年就已经发现广州田间小菜蛾种群对该药产生了数十倍的抗性，2011年更发现抗性高达2000多倍。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速鉴定小菜蛾鱼尼丁受体基因突变的方法及其专用引物。

本发明提供了一种特异引物组合物，由序列表的序列1所示单链DNA分子、序列表的序列2所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成。

本发明还保护所述特异引物组合物在制备试剂盒中的应用；所示试剂盒的用途为如下（a）或（b）：（a）鉴定小菜蛾是否发生了鱼尼丁受体基因的G4899E突变；所述鱼尼丁受体基因的G4899E突变指的是鱼尼丁受体基因的开放阅读框自5’末端第14696位核苷酸由G突变为A；（b）辅助鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗性。

所述双酰胺类杀虫剂可为氯虫苯甲酰胺和/或氟虫双酰胺。

本发明还保护包括所述特异引物组合物的试剂盒；所示试剂盒的用途为如下（a）或（b）：（a）鉴定小菜蛾是否发生了鱼尼丁受体基因的G4899E突变；所述鱼尼丁受体基因的G4899E突变指的是鱼尼丁受体基因的开放阅读框自5’末端第14696位核苷酸由G突变为A；（b）辅助鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗性。所述双酰胺类杀虫剂可为氯虫苯甲酰胺和/或氟虫双酰胺。

本发明还保护所述特异引物组合物的应用，为如下（a）或（b）：（a）鉴定小菜蛾是否发生了鱼尼丁受体基因的G4899E突变；所述鱼尼丁受体基因的G4899E突变指的是鱼尼丁受体基因的开放阅读框自5’末端第14696位核苷酸由G突变为A；（b）辅助鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗性。所述双酰胺类杀虫剂可为氯虫苯甲酰胺和/或氟虫双酰胺。

本发明还保护一种鉴定小菜蛾针对G4899E突变的基因型的方法，包括以下步骤：以待测小菜蛾的基因组DNA为模板，分别采用敏感引物对和抗性引物对进行PCR扩增；如果采用所述敏感引物对时扩增得到了70±5bp（如70bp）的扩增产物同时采用所述抗性引物对时没有扩增得到70±5bp（如70bp）的扩增产物，待测小菜蛾为GG基因型；如果采用所述抗性引物对时扩增得到了70±5bp（如70bp）的扩增产物同时采用所述敏感引物对时没有扩增得到70±5bp（如70bp）的扩增产物，待测小菜蛾为AA基因型；如果采用所述敏感引物对时扩增得到了70±5bp（如70bp）的扩增产物且采用所述抗性引物对时扩增得到70±5bp（如70bp）的扩增产物，待测小菜蛾为GA基因型；所述敏感引物对由序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成；所述抗性引物对由序列表的序列2所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成；所述G4899E突变指的是鱼尼丁受体基因的开放阅读框自5’末端第14696位核苷酸由G突变为A。GG基因型的小菜蛾疑似对双酰胺类杀虫剂敏感。AA基因型的小菜蛾疑似对双酰胺类杀虫剂具有抗性。GA基因型的小菜蛾疑似对双酰胺类杀虫剂敏感。AA基因型的小菜蛾对于双酰胺类杀虫剂的抗性高于GG基因型的小菜蛾和GA基因型的小菜蛾。

本发明还保护一种辅助鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗性的方法，包括以下步骤：以待测小菜蛾的基因组DNA为模板，分别采用敏感引物对和抗性引物对进行PCR扩增；如果采用所述敏感引物对时扩增得到了70±5bp（如70bp）的扩增产物同时采用所述抗性引物对时没有扩增得到70±5bp（如70bp）的扩增产物，待测小菜蛾疑似对双酰胺类杀虫剂敏感；如果采用所述抗性引物对时扩增得到了70±5bp（如70bp）的扩增产物同时采用所述敏感引物对时没有扩增得到70±5bp（如70bp）的扩增产物，待测小菜蛾疑似对双酰胺类杀虫剂具有抗性；如果采用所述敏感引物对时扩增得到了70±5bp（如70bp）的扩增产物且采用所述抗性引物对时扩增得到70±5bp（如70bp）的扩增产物，待测小菜蛾疑似对双酰胺类杀虫敏感；所述敏感引物对由序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成；所述抗性引物对由序列表的序列2所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成。

所述双酰胺类杀虫剂可为氯虫苯甲酰胺和/或氟虫双酰胺。

所述对双酰胺类杀虫剂敏感指的是待测小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的LC₅₀值低于0.1mg/L。所述对双酰胺类杀虫剂具有抗性指的是待测小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的LC₅₀值高于0.1mg/L、高于1mg/L、高于10mg/L或高于38mg/L。

以上任一所述小菜蛾的鱼尼丁受体基因的开放阅读框可为如下如下1）或2）或3）的DNA分子：

1）序列表中序列4自5’末端第313至15666位核苷酸所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。

本发明提供的特异引物组合物能够有效鉴定出小菜蛾是否发生了鱼尼丁受体基因的G4899E突变，从而判断小菜蛾对于双酰胺类杀虫剂的抗性或敏感性，具有快速有效、灵敏度高、能处理大批样本的优点，对于监测小菜蛾田间种群对双酰胺类杀虫剂的抗性基因频率和对双酰胺类杀虫剂抗药性发生发展动态，及时调整小菜蛾防治策略，指导合理用药、延缓抗性发展具有重要意义。

附图说明

图1为以第一组小菜蛾的个体（氯虫苯甲酰胺敏感型个体）为模板，分别采用敏感引物对或抗性引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为以第二组小菜蛾的个体（氯虫苯甲酰胺高抗型个体）为模板，分别采用敏感引物对或抗性引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、分析对双酰胺类杀虫剂抗感性不同的小菜蛾个体的鱼尼丁受体基因，从而发现并验证鱼尼丁受体基因G4899E突变与抗感性的关系

对2011年采自广东省广州市田间的100个小菜蛾个体进行鱼尼丁受体基因的PCR扩增及测序验证。测序结果表明，小菜蛾的鱼尼丁受体基因中存在一个SNP位点，即抗双酰胺类杀虫剂的小菜蛾的鱼尼丁受体基因的开放阅读框自5'末端起第14696位核苷酸由G突变为A，导致鱼尼丁受体自N末端第4899位氨基酸残基由甘氨酸(G)突变为谷氨酸(E)，即G4899E突变。小菜蛾的鱼尼丁受体基因如序列表的序列4所示，其开放阅读框为序列表的序列4自5’末端第313至15666位核苷酸。

对随机取样的30个小菜蛾双酰胺类杀虫剂敏感品系和30个小菜蛾双酰胺类杀虫剂抗性品系的个体的鱼尼丁受体基因进行测序，根据其G4899E突变进行基因分型，敏感品系个体全部为敏感纯合个体(SS)，抗性品系个体全部为抗性纯合个体(RR)。

对菲律宾和泰国双酰胺类杀虫剂抗性小菜蛾的研究证明，抗性种群中鱼尼丁受体白N末端第4899位氨基酸残基由甘氨酸突变为谷氨酸(G4899E突变)是导致其产生高倍抗性的主要机制。

发生G4899E突变的纯合个体为双酰胺类杀虫剂高抗型，未发生G4899E突变的纯合个体为双酰胺类杀虫剂敏感型，杂合型个体为双酰胺类杀虫剂敏感型。

实施例2、引物设计

基于实施例1的发现，设计等位基因特异性PCR引物如下：

引物1(序列表的序列1)：5’-TGTTGGACGTGGCTGT

GG-3’；

引物2(序列表的序列2)：5’-TGTTGGACGTGGCTGT

GA-3’；

引物3(序列表的序列3)：5’-TGTTTCCCGTTATGCGTGAC-3’。

引物1为专用敏感引物，引物2为专用抗性引物，引物3为PCR检测时与专用敏感引物或专用抗性引物配套使用的下游引物。引物1的3’末端第1位核苷酸(见下划线标注)与突变前的核苷酸一致，引物2的3’末端第1位核苷酸(见下划线标注)与突变后的核苷酸一致。此外，为了增加等位基因特异性PCR方法的特异性，引物1和引物2的3’端末第三位核苷酸均引入了错配碱基A(见方框标注)。引物1和引物3组成敏感引物对。引物2和引物3组成抗性引物对。

实施例3、敏感引物对和抗性引物对的应用

一、检测小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性

检测小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性的方法如下：

1、将氯虫苯甲酰胺原药(纯度95％，上海杜邦农化有限公司)溶于丙酮，配成10000mg/L的母液(浓度以有效成分计)。

2、用0.1g/100mL的Triton X-100水溶液将步骤1的母液稀释成系列浓度的稀释液。

3、将清洗干净并去除表面蜡质的圆白菜叶片在步骤2得到的稀释液中浸泡10秒，然后在室温条件下悬挂晾干，然后放入垫有滤纸的塑料培养皿中(直径9em)，每个培养皿接入3龄末期的小菜蛾幼虫10-15头，每个浓度的稀释液设置3个培养皿进行试验，96小时后检测幼虫的死亡率。死亡标准为：用毛笔轻触虫体无反应判定为死亡。所得数据用POLO软件(LeOra Software Inc.，Calilornia，USA)计算斜率值、LC₅₀值及其95%的置信区间。

将两组小菜蛾群体分别进行上述鉴定，第一组小菜蛾群体为实验室连续传代饲养10年的未接触过任何杀虫药剂的小菜蛾，第二组小菜蛾群体为从连续3年使用氯虫苯甲酰胺的田间采集的小菜蛾，小菜蛾个体均随机取样。

两组小菜蛾群体对氯虫苯甲酰胺的抗性检测结果见表1。

表1两组小菜蛾群体对氯虫苯甲酰胺的抗性检测结果

结果表明，第二组小菜蛾的LC₅₀值显著高于第一组小菜蛾的LC₅₀值，即第一组小菜蛾均为氯虫苯甲酰胺敏感型，第二组小菜蛾均为氯虫苯甲酰胺高抗型。

将第一组小菜蛾的LC₅₀值作为1，计算第二组小菜蛾的LC₅₀值与第一组小菜蛾的LC₅₀值的比值，即为第二组小菜蛾的抗性指数。第二组小菜蛾的抗性指数为414.9。

通常来说，将待测小菜蛾对氯虫苯甲酰胺（或氟虫双酰胺）的LC₅₀值除以氯虫苯甲酰胺敏感型小菜蛾对氯虫苯甲酰胺（或氟虫双酰胺）的LC₅₀值，作为RR值，RR值<10为低水平抗性；10<RR值<100为中等水平抗性；RR值>100为高水平抗性。

二、敏感引物对和抗性引物对的应用

随机从第一组小菜蛾群体中取60个个体，随机从第二组小菜蛾群体中取60个个体，进行如下检测：提取个体的基因组DNA，将基因组DNA作为模板，采用敏感引物对或抗性引物对进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

采用敏感引物对进行PCR扩增的反应体系（25μl）：10×PCR Buffer 2.5μl、dNTPsMixture(2.5mM each dNTP)2μl、引物1(10μM)0.5μl、引物3(10μM)0.5μl、模板1μl、rTaq DNA Polymerase(5U/μl)0.5μl，用ddH₂O补足至25μl。

采用抗性引物对进行PCR扩增的反应体系（25μl）：10×PCR Buffer 2.5μl、dNTPsMixture(2.5mM each dNTP)2μl、引物2(10μM)0.5μl、引物3(10μM)0.5μl、模板1μl、rTaq DNA Polymerase(5U/μl)0.5μl，用ddH₂O补足至25μl。

采用敏感引物对进行PCR扩增的反应条件和采用抗性引物对进行PCR扩增的反应条件一致，均为如下过程：94℃3min；94℃20s、55℃20s、72℃20s，30个循环；72℃2min；4℃保存。

以第一组小菜蛾的个体（氯虫苯甲酰胺敏感型个体）为模板，分别采用敏感引物对或抗性引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1。采用敏感引物对时，以60个小菜蛾个体的基因组DNA为模板均可以得到约为70bp的特异性PCR扩增产物。采用抗性引物对时，以60个小菜蛾个体的基因组DNA为模板均没有得到所述特异性PCR扩增产物。

以第二组小菜蛾的个体（氯虫苯甲酰胺高抗型个体）为模板，分别采用敏感引物对或抗性引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图2。采用抗性引物对时，均可以得到约为70bp的特异性PCR扩增产物。采用敏感引物对时，均没有得到所述特异性PCR扩增产物。

三、结果验证

分别回收步骤二中的各个特异性条带并进行测序验证。

测序结果表明，以第一组小菜蛾的60个个体的基因组DNA为模板，采用敏感引物对时得到的PCR扩增产物均为70bp，其核苷酸序列均如序列表的序列5所示，即均未发生G4899E突变。

测序结果表明，以第二组小菜蛾的60个个体的基因组DNA为模板，采用抗性引物对时得到的PCR扩增产物均为70bp，其核苷酸序列均如序列表的序列6所示，即均发生了G4899E突变。

结果表明：敏感引物对只对敏感个体的基因组DNA进行特异性扩增并得到约70bp的扩增产物，可用于辅助鉴定对双酰胺类杀虫剂敏感的小菜蛾；抗性引物对只对抗性个体的基因组DNA进行特异性扩增并得到约70bp的扩增产物，可用于辅助鉴定对双酰胺类杀虫剂抗性的小菜蛾；本发明提供的敏感引物对和抗性引物对能很好地区分鱼尼丁受体基因的G4899E等位基因，特异性检测小菜蛾是否发生了鱼尼丁受体基因G4899E突变，进而判断小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗、感性。

Claims

1.特异引物组合物，由序列表的序列1所示单链DNA分子、序列表的序列2所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成；其中，由序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成敏感引物对；由序列表的序列2所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成抗性引物对。

2.权利要求1所述特异引物组合物在制备试剂盒中的应用；所示试剂盒的用途为如下（a）或（b）：

（a）鉴定小菜蛾是否发生了鱼尼丁受体基因的G4899E突变；所述鱼尼丁受体基因的G4899E突变指的是鱼尼丁受体基因的开放阅读框自5’末端第14696位核苷酸由G突变为A；所述小菜蛾的鱼尼丁受体基因的开放阅读框为序列表中序列4自5’末端第313至15666位核苷酸所示的DNA分子；

（b）辅助鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗性。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述双酰胺类杀虫剂为氯虫苯甲酰胺和/或氟虫双酰胺。

4.包括权利要求1所述特异引物组合物的试剂盒；所示试剂盒的用途为如下（a）或（b）：

（b）辅助鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗性。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述双酰胺类杀虫剂为氯虫苯甲酰胺和/或氟虫双酰胺。

6.权利要求1所述特异引物组合物的应用，为如下（a）或（b）：

（b）辅助鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗性。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述双酰胺类杀虫剂为氯虫苯甲酰胺和/或氟虫双酰胺。

8.一种鉴定小菜蛾针对G4899E突变的基因型的方法，包括以下步骤：以待测小菜蛾的基因组DNA为模板，分别采用敏感引物对和抗性引物对进行PCR扩增；如果采用所述敏感引物对时扩增得到了70±5bp的扩增产物同时采用所述抗性引物对时没有扩增得到70±5bp的扩增产物，待测小菜蛾为GG基因型；如果采用所述抗性引物对时扩增得到了70±5bp的扩增产物同时采用所述敏感引物对时没有扩增得到70±5bp的扩增产物，待测小菜蛾为AA基因型；如果采用所述敏感引物对时扩增得到了70±5bp的扩增产物且采用所述抗性引物对时扩增得到70±5bp的扩增产物，待测小菜蛾为GA基因型；

所述敏感引物对由序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成；所述抗性引物对由序列表的序列2所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成；

所述G4899E突变指的是鱼尼丁受体基因的开放阅读框自5’末端第14696位核苷酸由G突变为A；所述小菜蛾的鱼尼丁受体基因的开放阅读框为序列表中序列4自5’末端第313至15666位核苷酸所示的DNA分子。

9.一种辅助鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗性的方法，包括以下步骤：以待测小菜蛾的基因组DNA为模板，分别采用敏感引物对和抗性引物对进行PCR扩增；如果采用所述敏感引物对时扩增得到了70±5bp的扩增产物同时采用所述抗性引物对时没有扩增得到70±5bp的扩增产物，待测小菜蛾疑似对双酰胺类杀虫剂敏感；如果采用所述抗性引物对时扩增得到了70±5bp的扩增产物同时采用所述敏感引物对时没有扩增得到70±5bp的扩增产物，待测小菜蛾疑似对双酰胺类杀虫剂具有抗性；如果采用所述敏感引物对时扩增得到了70±5bp的扩增产物且采用所述抗性引物对时扩增得到70±5bp的扩增产物，待测小菜蛾疑似对双酰胺类杀虫剂敏感；

所述敏感引物对由序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成；所述抗性引物对由序列表的序列2所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述双酰胺类杀虫剂为氯虫苯甲酰胺和/或氟虫双酰胺。