BR122017024597B1 - método para introgressão de um alelo de resistência à podridão de raiz por phytophthora em uma planta de soja - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se ao campo de melhoramento vegetal e resistência à doença. mais especificamente, a invenção inclui um méto-do para melhoramento de plantas de soja contendo loci de traço quantitativo (qtl) para resistência à podridão de raiz por phytophthora (prr) causado por phytophthora sojae. a invenção inclui ainda o uso de marcadores moleculares na introgressão de qtl de resistência à prr em plantas de soja.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO PARA INTROGRESSÃO DE UM ALELO DE RESISTÊNCIA À PODRIDÃO DE RAIZ POR PHYTOPHTHORA EM UMA PLANTA DE SOJA.

[001] Dividido do PI0810240-6, depositado em 16.04.2008. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS [002] Este pedido de patente reivindica o benefício sob U.S.C. 35 § 119(e) do Pedido de Patente Provisória US N° 60/925.475, depositado em 20 de abril de 2007, descrição da qual o pedido de patente está incorporado neste pedido por referência em sua totalidade.

INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA [003] Uma listagem de sequência contendo o arquivo denominado Listagem de Sequências.txt que tem 52.115 bytes (medido no Windows® da Microsoft) e criado em 7 de abril de 2008, compreende 116 sequências nucleotídicas, e está neste pedido incorporada por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO [004] A presente invenção está no campo de melhoramento vegetal e resistência à doença. Mais especificamente, a invenção inclui um método de melhoramento de plantas do gênero Glycine contendo loci de traços quantitativos (QTL) que estão associados com resistência à doença pelo patógeno Phytophthora sojae (Kauffman & Gerdemann). A invenção refere-se ao uso de marcadores genéticos para identificar QTL de resistência à doença. A invenção refere-se ainda ao uso de marcadores genéticos para a introgressão de resistência a Phytophthora sojae no germoplasma de elite em um programa de melhoramento.

ANTECENDENTES DA INVENÇÃO [005] Phytophthora sojae (Kauffman & Gerdemann) é um patóPetição 870170088447, de 16/11/2017, pág. 10/128

2/69 geno oomiceto que causa grande prejuízo a raízes e caules de plantas de soja (Glycine max) (Zhang et al., MPMI, 19:1302-1310 (2006)). Os sintomas da Podridão de Raiz por Phytophthora (PRR) causado por P. sojae incluem amarelamento e murchamento de folhas e amarronzamento de caules e ramos mais baixos (Demirbas et al., Crop Sei. 41:1220-1227 (2001)). PRR resulta em perdas de colheita de soja mundiais anuais de US$ 1 a US$ 2 bilhões (Zhang et al., MPMI, 19: 1302-1310 (2006)). Resistência ou suscetibilidade à PRR de soja depende de um sistema de sinalização entre patógeno e hospedeiro. Certos loci de traços quantitativos (QTL) podem conferir resistência à PRR. Os loci de traços quantitativos de não virulência do patógeno (Avr) e resistência do hospedeiro (Rps) determinam a interação de diferentes raças de P. sojae e cultivares de soja (Valer et al., FEMS Microbiol Lett., 265:60-68 (2006)). Oito loci foram identificados os quais fornecem resistência raça-específica à PRR, e dois destes loci, Rps1 e Rps3, foram identificados como tendo alelos múltiplos que são indicados por uma letra depois do número do locus (Ferro et al., Crop Sei, 46:2427-2436 (2006)). O locus Rps1 inclui, por exemplo, Rpsla, Rpslb, Rpslc, Rpsld e Rpslk, e o locus Rps3 inclui, por exemplo, Rps3a, Rps3b e Rps3c. A clonagem com base em mapa tem tentado caracterizar a região Rpslk (Bhattacharyya, M.K. et al., Theor Appl Genet, 111:75-86 (2005), Patente U.S. 7.256.323). Cultivares de plantas de soja com genes de resistência raça-específica foram os meios primários de controle de PRR (Ferro et al., Crop Sei., 46:2427-2436 (2006)). Mais de cinquenta raças de P. sojae foram identificadas, e os loci Rps podem fornecer a resistência a mais de uma raça de P. sojae. Exemplos incluem, mas não são limitados ao seguinte: Rpslk pode fornecer resistência a raças 1 e 4 de P. sojae, Rpslc pode fornecer a resistência a raças 1 e 3 de P. sojae, e Rps8 pode fornecer a resistência a raças 1, 4, 7, e 25 de P. sojae. Melhoradores vegetais são capa

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3/69 zes de usar marcadores moleculares como um meio indireto de selecionar plantas com alelos resistentes a raças de PRR de interesse (Demirbas et al., Crop Sei. 41:1220-1227 (2001)).

[006] Melhoramento de sojas resistentes à PRR pode ser muito facilitado pelo uso de seleção assistida por marcador para alelos de resistência à PRR. Marcadores genéticos usados em programas de melhoramento de soja para detectar, selecionar, e introgredir plantas resistentes à PRR incluíram repetições de sequência simples (SSRs), polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLPs), e polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs). Marcadores de SSR e SNP foram fornecidos para loci de resistência à PRR em Grupos de Ligação B1, G, K, e M (Pedido de Patente U.S. Número de Série 11/199.819 (depositado em 8 de agosto de 2005)). Marcadores de RFLP, marcadores de SSR, e marcadores de isozima foram fornecidos para loci de resistência à PRR localizado no Grupo de Ligação A2 (Pedido de Patente U.S. Número de Série 10/436.376 (depositado em 12 de maio de 2003)). Marcadores de SSR foram fornecidos para loci de resistência à PRR localizado no Grupo de Ligação F (Pedido de Patente U.S. Número de Série 10/778.018 (depositado em 12 de fevereiro de 2004)). Grupos de ligação são descritos por Cregan et al. (Crop Sei. 39:1464-1490 (1999)). Até agora, um conjunto marcador baseado em SNP para Rps1 no Grupo de Ligação N, Rps3 no Grupo de Ligação F, e Rps8 no Grupo de Ligação F está em falta.

[007] Das classes de marcadores, SNPs têm características que os fazem preferenciais a outros marcadores genéticos em detecção, seleção, e introgressão de resistência à PRR em uma planta de soja. SNPs são preferenciais porque as tecnologias estão disponíveis para triagem automatizada, de alta quantidade de marcadores de SNP, que podem reduzir o tempo para selecionar e introgredir resistência à PRR em plantas de soja. Além disso, marcadores de SNP são ideais porque

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4/69 a probabilidade que um determinado SNP em alelo seja derivado de origens independentes na população existente de uma determinada espécie é muito baixa. Como tal, marcadores de SNP são úteis para rastrear e assistir a introgressão de alelos de resistência à PRR, particularmente no caso de haplótipos de resistência à PRR. Uma necessidade existe por um conjunto de marcadores com base em SNP para triar resistência a raças de PRR com importância agronômica. Rps1, Rps3 e Rps8 fornecem resistência a raças de PRR que são uma fonte significante de dano a colheitas de soja. A presente invenção fornece um conjunto de marcadores com base em SNP para Rps1 no Grupo de Ligação N, Rps3 no Grupo de Ligação F, e Rps8 no Grupo de Ligação F.

[008] A presente invenção fornece e inclui um método para triagem e seleção de uma planta de soja compreendendo pelo menos um QTL de resistência à PRR. A invenção inclui marcadores de SNP para detecção, seleção e introgressão de QTL de resistência à PRR a partir de plantas de soja resistentes à PRR.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [009] A presente invenção inclui um método de seleção e introgressão de um alelo em uma planta de soja compreendendo (A) cruzamento de pelo menos uma planta de soja resistente à PRR com pelo menos uma outra planta de soja a fim de formar uma população, (B) triagem da dita população com pelo menos um marcador de ácido nucleico selecionado a partir do grupo compreendendo SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 81 a SEQ ID NO: 84, (C) seleção da dita população de uma ou mais plantas de soja compreendendo pelo menos um genótipo correspondente a uma planta de soja resistente à PRR.

[0010] A presente invenção compreende ainda uma planta de soja de elite produzida por tal método.

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5/69 [0011] A presente invenção inclui um método de introgressão de um alelo em uma planta de soja compreendendo: (A) cruzamento de pelo menos uma planta de soja resistente à PRR com pelo menos uma outra planta de soja para formar uma população, (B) triagem da dita população com pelo menos um marcador de ácido nucleico, (C) seleção da dita população de uma ou mais plantas de soja compreendendo um haplótipo associado com resistência à PRR, em que o dito haplótipo de resistência à PRR é selecionado a partir do grupo composto de 1, 2, ou 3 loci resistentes à PRR onde um ou mais haplótipos em um ou mais loci são selecionados a partir do grupo de Rps1, Rps3 e Rps8, e um ou mais haplótipos são selecionados com base no haplótipo das plantas de soja resistentes à PRR.

[0012] A presente invenção compreende ainda uma planta de soja de elite produzida pelo dito método.

[0013] A presente invenção inclui uma molécula de ácido nucleico substancialmente purificada compreendendo uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo composto de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 116.

[0014] Além disso, a presente invenção fornece ensaios para detecção de QTLs de resistência à PRR, Rps1, Rps3, e Rps8.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS [0015] SEQ ID NO: 1 é uma sequência genômica derivada de Glycine max associada com o locus Rps1 de resistência à PRR.

[0016] SEQ ID NO: 2 é uma sequência genômica derivada de Glycine max associada com o locus Rps1 de resistência à PRR.

[0017] SEQ ID NO: 3 é uma sequência genômica derivada de Glycine max associada com o locus Rps1 de resistência à PRR.

[0018] SEQ ID NO: 4 é uma sequência genômica derivada de Glycine max associada com o locus Rps1 de resistência à PRR.

[0019] SEQ ID NO: 5 é uma sequência genômica derivada de

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6/69

Glycine max associada com o locus Rps1 de resistência à PRR. [0020] SEQ ID NO: 6 é uma sequência genômica derivada de

Glycine max associada com o locus Rps1 de resistência à PRR. [0021] SEQ ID NO: 7 é uma sequência genômica derivada de

Glycine max associada com o locus Rps1 de resistência à PRR. [0022] SEQ ID NO: 8 é uma sequência genômica derivada de

Glycine max associada com o locus Rps1 de resistência à PRR. [0023] SEQ ID NO: 9 é uma sequência genômica derivada de

Glycine max associada com o locus Rps1 de resistência à PRR. [0024] SEQ ID NO: 10 é uma sequência genômica derivada de

Glycine max associada com o locus Rps1 de resistência à PRR.

[0025] SEQ ID NO: 11 é uma sequência genômica derivada de Glycine max associada com os loci Rps3 e Rps8 de resistência à PRR. [0026] SEQ ID NO: 12 é uma sequência genômica derivada de Glycine max associada com os loci Rps3 e Rps8 de resistência à PRR. [0027] SEQ ID NO: 13 é uma sequência genômica derivada de Glycine max associada com os loci Rps3 e Rps8 de resistência à PRR. [0028] SEQ ID NO: 14 é uma sequência genômica derivada de Glycine max associada com os loci Rps3 e Rps8 de resistência à PRR. [0029] SEQ ID NO: 15 é uma sequência genômica derivada de Glycine max associada com os loci Rps3 e Rps8 de resistência à PRR. [0030] SEQ ID NO: 16 é uma sequência genômica derivada de Glycine max associada com os loci Rps3 e Rps8 de resistência à PRR. [0031] SEQ ID NO: 17 é um iniciador de PCR de sentido direto para amplificação da SEQ ID NO: 1.

[0032] SEQ ID NO: 18 é um iniciador de PCR de sentido reverso para amplificação da SEQ ID NO: 1.

[0033] SEQ ID NO: 19 é um iniciador de PCR de sentido direto para amplificação da SEQ ID NO: 2.

[0034] SEQ ID NO: 20 é um iniciador de PCR de sentido reverso

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7/69 para amplificação da SEQ ID NO: 2.

[0035] SEQ ID NO: 21 é um iniciador de PCR de sentido direto para amplificação da SEQ ID NO: 3.

[0036] SEQ ID NO: 22 é um iniciador de PCR de sentido reverso para amplificação da SEQ ID NO: 3.

[0037] SEQ ID NO: 23 é um iniciador de PCR de sentido direto para amplificação da SEQ ID NO: 4.

[0038] SEQ ID NO: 24 é um iniciador de PCR de sentido reverso para amplificação da SEQ ID NO: 4.

[0039] SEQ ID NO: 25 é um iniciador de PCR de sentido direto para amplificação da SEQ ID NO: 5.

[0040] SEQ ID NO: 26 é um iniciador de PCR de sentido reverso para amplificação da SEQ ID NO: 5.

[0041] SEQ ID NO: 27 é um iniciador de PCR de sentido direto para amplificação da SEQ ID NO: 6.

[0042] SEQ ID NO: 28 é um iniciador de PCR de sentido reverso para amplificação da SEQ ID NO: 6.

[0043] SEQ ID NO: 29 é um iniciador de PCR de sentido direto para amplificação da SEQ ID NO: 7.

[0044] SEQ ID NO: 30 é um iniciador de PCR de sentido reverso para amplificação da SEQ ID NO: 7.

[0045] SEQ ID NO: 31 é um iniciador de PCR de sentido direto para amplificação da SEQ ID NO: 8.

[0046] SEQ ID NO: 32 é um iniciador de PCR de sentido reverso para amplificação da SEQ ID NO: 8.

[0047] SEQ ID NO: 33 é um iniciador de PCR de sentido direto para amplificação da SEQ ID NO: 9.

[0048] SEQ ID NO: 34 é um iniciador de PCR de sentido reverso para amplificação da SEQ ID NO: 9.

[0049] SEQ ID NO: 35 é um iniciador de PCR de sentido direto paPetição 870170088447, de 16/11/2017, pág. 16/128

8/69 ra amplificação da SEQ ID NO: 10.

[0050] SEQ ID NO: 36 é um iniciador de PCR de sentido reverso para amplificação da SEQ ID NO: 10.

[0051] SEQ ID NO: 37 é um iniciador de PCR de sentido direto para amplificação da SEQ ID NO: 11.

[0052] SEQ ID NO: 38 é um iniciador de PCR de sentido reverso para amplificação da SEQ ID NO: 11.

[0053] SEQ ID NO: 39 é um iniciador de PCR de sentido direto para amplificação da SEQ ID NO: 12.

[0054] SEQ ID NO: 40 é um iniciador de PCR de sentido reverso para amplificação da SEQ ID NO: 12.

[0055] SEQ ID NO: 41 é um iniciador de PCR de sentido direto para amplificação da SEQ ID NO: 13.

[0056] SEQ ID NO: 42 é um iniciador de PCR de sentido reverso para amplificação da SEQ ID NO: 13.

[0057] SEQ ID NO: 43 é um iniciador de PCR de sentido direto para amplificação da SEQ ID NO: 14.

[0058] SEQ ID NO: 44 é um iniciador de PCR de sentido reverso para amplificação da SEQ ID NO: 14.

[0059] SEQ ID NO: 45 é um iniciador de PCR de sentido direto para amplificação da SEQ ID NO: 15.

[0060] SEQ ID NO: 46 é um iniciador de PCR de sentido reverso para amplificação da SEQ ID NO: 15.

[0061] SEQ ID NO: 47 é um iniciador de PCR de sentido direto para amplificação da SEQ ID NO: 16.

[0062] SEQ ID NO: 48 é um iniciador de PCR de sentido reverso para amplificação da SEQ ID NO: 16.

[0063] SEQ ID NO: 49 é uma sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 1.

[0064] SEQ ID NO: 50 é uma segunda sonda para detecção do

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9/69 locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 1.

[0065] SEQ ID NO: 51 é uma sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 2.

[0066] SEQ ID NO: 52 é uma segunda sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 2.

[0067] SEQ ID NO: 53 é uma sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 3.

[0068] SEQ ID NO: 54 é uma segunda sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 3.

[0069] SEQ ID NO: 55 é uma sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 4.

[0070] SEQ ID NO: 56 é uma segunda sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 4.

[0071] SEQ ID NO: 57 é uma sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 5.

[0072] SEQ ID NO: 58 é uma segunda sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 5.

[0073] SEQ ID NO: 59 é uma sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 6.

[0074] SEQ ID NO: 60 é uma segunda sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 6.

[0075] SEQ ID NO: 61 é uma sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 7.

[0076] SEQ ID NO: 62 é uma segunda sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 7.

[0077] SEQ ID NO: 63 é uma sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 8.

[0078] SEQ ID NO: 64 é uma segunda sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 8.

[0079] SEQ ID NO: 65 é uma sonda para detecção do locus de

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10/69 resistência à PRR da SEQ ID NO: 9.

[0080] SEQ ID NO: 66 é uma segunda sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 9.

[0081] SEQ ID NO: 67 é uma sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 10.

[0082] SEQ ID NO: 68 é uma segunda sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 10.

[0083] SEQ ID NO: 69 é uma sonda para detecção dos loci de resistência à PRR da SEQ ID NO: 11.

[0084] SEQ ID NO: 70 é uma segunda sonda para detecção dos loci de resistência à PRR da SEQ ID NO: 11.

[0085] SEQ ID NO: 71 é uma sonda para detecção dos loci de resistência à PRR da SEQ ID NO: 12.

[0086] SEQ ID NO: 72 é uma segunda sonda para detecção dos loci de resistência à PRR da SEQ ID NO: 12.

[0087] SEQ ID NO: 73 é uma sonda para detecção dos loci de resistência à PRR da SEQ ID NO: 13.

[0088] SEQ ID NO: 74 é uma segunda sonda para detecção dos loci de resistência à PRR da SEQ ID NO: 13.

[0089] SEQ ID NO: 75 é uma sonda para detecção dos loci de resistência à PRR da SEQ ID NO: 14.

[0090] SEQ ID NO: 76 é uma segunda sonda para detecção dos loci de resistência à PRR da SEQ ID NO: 14.

[0091] SEQ ID NO: 77 é uma sonda para detecção dos loci de resistência à PRR da SEQ ID NO: 15.

[0092] SEQ ID NO: 78 é uma segunda sonda para detecção dos loci de resistência à PRR da SEQ ID NO: 15.

[0093] SEQ ID NO: 79 é uma sonda para detecção dos loci de resistência à PRR da SEQ ID NO: 16.

[0094] SEQ ID NO: 80 é uma segunda sonda para detecção dos

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11/69 loci de resistência à PRR da SEQ ID NO: 16.

[0095] SEQ ID NO: 81 é uma sequência genômica derivada de

Glycine max associada com o locus Rps1 de resistência à PRR.

[0096] SEQ ID NO: 82 é uma sequência genômica derivada de

Glycine max associada com o locus Rps1 de resistência à PRR.

[0097] SEQ ID NO: 83 é uma sequência genômica derivada de Glycine max associada com o locus Rps1 de resistência à PRR.

[0098] SEQ ID NO: 84 é uma sequência genômica derivada de Glycine max associada com o locus Rps1 de resistência à PRR.

[0099] SEQ ID NO: 85 é um iniciador de PCR de sentido direto para amplificação da SEQ ID NO: 81.

[00100] SEQ ID NO: 86 é um iniciador de PCR de sentido reverso para amplificação da SEQ ID NO: 81.

[00101] SEQ ID NO: 87 é um iniciador de PCR de sentido direto para amplificação da SEQ ID NO: 82.

[00102] SEQ ID NO: 88 é um iniciador de PCR de sentido reverso para amplificação da SEQ ID NO: 82.

[00103] SEQ ID NO: 89 é um iniciador de PCR de sentido direto para amplificação da SEQ ID NO: 83.

[00104] SEQ ID NO: 90 é um iniciador de PCR de sentido reverso para amplificação da SEQ ID NO: 83.

[00105] SEQ ID NO: 91 é um iniciador de PCR de sentido direto para amplificação da SEQ ID NO: 84.

[00106] SEQ ID NO: 92 é um iniciador de PCR de sentido reverso para amplificação da SEQ ID NO: 84.

[00107] SEQ ID NO: 93 é uma sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 81.

[00108] SEQ ID NO: 94 é uma segunda sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 81.

[00109] SEQ ID NO: 95 é uma sonda para detecção do locus de

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12/69 resistência à PRR da SEQ ID NO: 82.

[00110] SEQ ID NO: 96 é uma segunda sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 82.

[00111] SEQ ID NO: 97 é uma sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 83.

[00112] SEQ ID NO: 98 é uma segunda sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 83.

[00113] SEQ ID NO: 99 é uma sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 84.

[00114] SEQ ID NO: 100 é uma segunda sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 84.

[00115] SEQ ID NO: 101 é uma terceira sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 8.

[00116] SEQ ID NO: 102 é uma quarta sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 8.

[00117] SEQ ID NO: 103 é uma terceira sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 10.

[00118] SEQ ID NO: 104 é uma quarta sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 10.

[00119] SEQ ID NO: 105 é uma terceira sonda para detecção dos loci de resistência à PRR da SEQ ID NO: 14.

[00120] SEQ ID NO: 106 é uma quarta sonda para detecção dos loci de resistência à PRR da SEQ ID NO: 14.

[00121] SEQ ID NO: 107 é uma terceira sonda para detecção dos loci de resistência à PRR da SEQ ID NO: 15.

[00122] SEQ ID NO: 108 é uma quarta sonda para detecção dos loci de resistência à PRR da SEQ ID NO: 15.

[00123] SEQ ID NO: 109 é uma quinta sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 8.

[00124] SEQ ID NO: 110 é uma sexta sonda para detecção do loPetição 870170088447, de 16/11/2017, pág. 21/128

13/69 cus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 8.

[00125] SEQ ID NO: 111 é uma quinta sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 10.

[00126] SEQ ID NO: 112 é uma sexta sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 10.

[00127] SEQ ID NO: 113 é uma quinta sonda para detecção dos loci de resistência à PRR da SEQ ID NO: 14.

[00128] SEQ ID NO: 114 é uma sexta sonda para detecção dos loci de resistência à PRR da SEQ ID NO: 14.

[00129] SEQ ID NO: 115 é uma quinta sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 15.

[00130] SEQ ID NO: 116 é uma sexta sonda para detecção do locus de resistência à PRR da SEQ ID NO: 15.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [00131] As definições e métodos fornecidos definem a presente invenção e guiam aqueles versados ordinários na técnica na prática da presente invenção. A menos que de outra maneira observada, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional por aqueles versados ordinários na técnica pertinente. Definições de termos comuns em biologia molecular também podem ser encontradas em Alberts et al., Molecular Biology of The Cell, 3^rd Edition, Garland Publishing, Inc: New York, 1994; Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5^th edition, Springer-Verlag: New York, 1991; e Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994. A nomenclatura de bases de DNA como apresentadas em CFR 37 § 1.822 é usada.

[00132] Um alelo refere-se a uma sequência alternativa em um determinado locus; o comprimento de um alelo pode ser tão pequeno como 1 base nucleotídica, mas é tipicamente maior.

[00133] Um locus é uma posição em relação a uma sequência

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14/69 genômica que é normalmente encontrada por um ponto de referência; por exemplo, uma sequência de DNA curta que é um gene, ou parte de um gene ou região intergênica. Os loci desta invenção compreendem um ou mais polimorfismos em uma população; isto é, alelos alternativos presentes em alguns indivíduos.

[00134] Como usado neste pedido, polimorfismo significa a presença de uma ou mais variações de uma sequência de ácido nucleico em um ou mais loci em uma população de um ou mais indivíduos. A variação pode compreender mas não é limitada a uma ou mais modificações de base, a inserção de um ou mais nucleotídeos ou a deleção de um ou mais nucleotídeos. Um polimorfismo pode resultar de processos randômicos na replicação de ácido nucleico, através de mutagênese, como um resultado de elementos genômicos móveis, a partir da variação do número de cópias e durante o processo de meiose, tal como crossing-over desigual, duplicação de genoma, e quebras e fusões de cromossomo. A variação pode ser comumente encontrada ou pode existir em baixa frequência em uma população, o precedente tendo grande utilidade no melhoramento vegetal geral e o último pode ser associado com a variação fenotípica rara mas importante. Polimorfismos úteis podem incluir polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), inserções ou deleções em sequência de DNA (Indels), repetições de sequência simples da sequência de DNA (SSRs), um polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição, e uma marca SNP. Um marcador genético, um gene, uma sequência derivada de DNA, um haplótipo, uma sequência derivada de RNA, um promotor, uma região 5' não traduzida de um gene, uma região 3' não traduzida de um gene, microRNA, siRNA, um QTL, um marcador satélite, um transgene, mRNA, ds mRNA, um perfil transcricional, e um padrão de metilação podem compreender polimorfismos.

[00135] Como usado neste pedido, marcador significa uma se

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15/69 quência de ácido nucleico polimórfica ou característica de ácido nucleico. Um marcador pode ser representado por uma ou mais determinadas sequências de variantes, ou por uma sequência consenso. Em outro sentido, um marcador é uma variante isolada ou consenso de tal sequência. Em um aspecto mais amplo, um marcador pode ser uma característica detectável que pode ser usada para discriminar entre diferenças herdáveis entre organismos. Exemplos de tais características podem incluir marcadores genéticos, composição proteicas, níveis proteicos, composição de óleo, níveis de óleo, composição de carboidrato, níveis de carboidrato, composição de ácido graxo, níveis de ácido graxo, composição de aminoácido, níveis de aminoácido, biopolímeros, produtos farmacêuticos, composição de amido, níveis de amido, amido fermentável, rendimento de fermentação, eficiência de fermentação, rendimento de energia, compostos secundários, metabolitos, características morfológicas e características agronômicas.

[00136] Como usado neste pedido, ensaio para marcador significa um método para detectar um polimorfismo em um determinado locus usando um determinado método, por exemplo, mensuração de pelo menos um fenótipo (tal como cor de semente, cor de flor, ou outro traço visualmente detectável), polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), extensão de base única, eletroforese, alinhamento de sequência, hibridização de oligonucleotídeo específica alélica (ASO), DNA polimórfico amplificado randômico (RAPD), tecnologias baseadas em microarranjo e tecnologias de sequenciamento de ácido nucleico etc. Como usado neste pedido, tipagem refere-se a qualquer método pelo qual a forma alélica específica de um dado polimorfismo genômico de soja é determinada. Por exemplo, um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) é tipado pela determinação de qual nucleotídeo está presente (isto é, um A, G, T, ou C). Inserção/deleções (Indels) são determinadas pela determinação se a Indel está presente.

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Indels podem ser tipadas por vários ensaios incluindo, mas não limitado a ensaios para marcador.

[00137] Como usado neste pedido, o termo adjacente, quando usado para descrever uma molécula de ácido nucleico que se hibridiza ao DNA contendo um polimorfismo, refere-se a um ácido nucleico que se hibridiza a sequências de DNA que diretamente estão contíguas a posição de base de nucleotídeo polimórfica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que pode ser usada em um ensaio de extensão de base única está adjacente ao polimorfismo.

[00138] Como usado neste pedido, posição de interrogação refere-se a uma posição física em relação a um suporte sólido que pode ser questionado para obter dados de genotipagem de um ou mais polimorfismos genômicos predeterminados.

[00139] Como usado neste pedido, sequência consenso refere-se a uma sequência de DNA construída que identifica SNP e polimorfismos Indel em alelos em um locus. Sequência consenso pode ser baseada em qualquer fita de DNA no locus e determina a base nucleotídica de qualquer um de cada SNP no locus e as bases nucleotídicas de todas as Indels no locus. Dessa forma, embora uma sequência consenso possa não ser uma cópia de uma sequência de DNA real, uma sequência consenso é útil para desenhar precisamente iniciadores e sondas para polimorfismos reais no locus.

[00140] Como usado neste pedido, o termo polimorfismo de nucleotídeo único, também mencionado pela abreviatura SNP, significa um polimorfismo em um sítio único em que o dito polimorfismo constitui uma modificação de par de base única, uma inserção de um ou mais pares de bases, ou uma deleção de um ou mais pares de bases.

[00141] Como usado neste pedido, o termo haplótipo significa uma região cromossômica em uma janela haplotípica definida por pelo menos um marcador molecular polimórfico. As combinações de im

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17/69 pressões digitais de marcador únicas em cada janela haplotípica definem haplótipos individuais para aquela janela. Além disso, modificações em um haplótipo, ocasionadas pela recombinação, por exemplo, podem resultar na modificação de um haplótipo para que compreenda somente uma porção do haplótipo original (parental) operacionalmente ligado ao traço, por exemplo, através da ligação física a um gene, QTL, ou transgene. Qualquer tal modificação em um haplótipo estaria incluída na definição do que constitui um haplótipo contanto que a integridade funcional daquela região genômica é inalterada ou melhorada.

[00142] Como usado neste pedido, o termo janela haplotípica significa uma região cromossômica que é estabelecida por análises estatísticas conhecidas àqueles versados na técnica e está em desequilíbrio de ligação. Dessa forma, identidade pela determinação entre dois indivíduos puros (ou dois gametas) em um ou mais loci de marcadores moleculares localizados dentro desta região é tomada como evidência da identidade por descendência da região inteira. Cada janela haplotípica inclui pelo menos um marcador molecular polimórfico. Janelas haplotípicas podem ser mapeadas ao longo de cada cromossomo no genoma. Janelas haplotípicas não são fixadas por si e, dadas a densidade cada vez maior de marcadores moleculares, esta invenção prevê o número e o tamanho de janelas haplotípicas para desenvolver-se, com o número do aumento de janelas e sua respectiva redução de tamanhos, dessa forma resultando em um grau de confiança que aumenta cada vez mais de averiguação de identidade por descendência com base na identidade pelo estado nos loci de marcadores.

[00143] Como usado neste pedido, genótipo significa o componente genético do fenótipo e pode ser indiretamente caracterizado usando marcadores ou diretamente caracterizado pelo sequenciamento de ácido nucleico. Marcadores adequados incluem um caráter fenoPetição 870170088447, de 16/11/2017, pág. 26/128

18/69 típico, um perfil metabólico, um marcador genético, ou algum outro tipo de marcador. Um genótipo pode constituir um alelo de pelo menos um locus de marcador genético ou um haplótipo de pelo menos uma janela haplotípica. Em algumas modalidades, um genótipo pode representar um locus único e em outras pode representar um conjunto de loci por todo o genoma. Em outra modalidade, o genótipo pode refletir a sequência de uma porção de um cromossomo, um cromossomo inteiro, uma porção do genoma e o genoma inteiro.

[00144] Como usado neste pedido, fenótipo significa as características detectáveis de uma célula ou organismo que podem ser influenciadas pela expressão gênica.

[00145] Como usado neste pedido, ligação refere-se à frequência relativa na qual os tipos de gametas são produzidos em um cruzamento. Por exemplo, se o locus A tem genes A ou a e locus B tem genes B ou b e um cruzamento entre parental I com AABB e o parental B com aabb produzirá quatro gametas possíveis onde os genes são segregados em AB, Ab, aB e ab. A hipótese nula consiste em que haverá segregação igual independente em cada um dos quatro genótipos possíveis, isto é, sem % de ligação dos gametas à disposição de cada genótipo. Segregação de gametas em genótipos que se diferenciam a partir de % é atribuída à ligação.

[00146] Como usado neste pedido, desequilíbrio de ligação é definido no contexto da frequência relativa de tipos de gameta em uma população de muitos indivíduos em uma geração única. Se a frequência do alelo A for p, a é p', B é q e b é q', então a frequência esperada (sem desequilíbrio de ligação) do genótipo AB é pq, Ab é pq', aB é p'q e ab é p'q'. Qualquer desvio da frequência esperada é chamado de desequilíbrio de ligação. Dois loci são ditos geneticamente ligados quando estão em desequilíbrio de ligação.

[00147] Como usado neste pedido, locus de traço quantitativo

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19/69 (QTL) significa um locus que controla numericamente até certo grau traços representáveis que são normalmente continuamente distribuídos.

[00148] Como usado neste pedido, alelo de resistência significa a sequência de ácido nucleico isolada que inclui o alelo polimórfico associado com a resistência à PRR.

[00149] Como usado neste pedido, o termo soja significa Glycine max e inclui todas as variedades vegetais que podem ser melhoradas com soja, incluindo espécies de soja selvagens.

[00150] Como usado neste pedido, o termo compreendendo significa incluindo mas não limitado a.

[00151] Como usado neste pedido, o termo linhagem de elite significa qualquer linhagem que resultou a partir de melhoramento e seleção para desempenho agronômico superior. Uma planta de elite é qualquer planta de uma linhagem de elite. Exemplos não-limitantes das variedades de soja de elite que estão comercial mente disponíveis para agricultores ou melhoradores de soja incluem AG00802, A0868, AG0902, A1923, AG2403, A2824, A3704, A4324, A5404, AG5903 e AG6202 (Asgrow Seeds, Des Moines, lowa, USA); BPR0144RR, BPR 4077NRR e BPR 4390NRR (Bio Plant Research, Camp Point, lllinois, USA); DKB17-51 e DKB37-51 (DeKalb Genetics, DeKalb, lllinois, USA); e DP 4546 RR, e DP 7870 RR (Delta & Pine Land Company, Lubbock, Texas, USA); JG 03R501, JG 32R606C ADD e JG 55R503C (JGL Inc, Greencastle, Indiana, USA); NKS13-K2 (NK Division of Syngenta Seeds, Golden Valley, Minnesota, USA); 90M01, 91M30, 92M33, 93M11, 94M30, 95M30 e 97B52 (Pioneer Hi-Bred International, Johnston, lowa, USA); SG4771NRR e SG5161NRR/STS (Soygenetics, LLC, Lafayette, Indiana, USA); S00-K5, S11-L2, S28-Y2, S43B1, S53-A1, S76-L9 e S78-G6 (Syngenta Seeds, Henderson, Kentucky, USA). Uma planta de elite é uma planta representativa de uma

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20/69 variedade de elite.

[00152] A presente invenção fornece marcadores genéticos de SNP úteis para triagem e seleção para resistência à PRR no locus Rps1 localizado no Grupo de Ligação N (LG N) (Cregan, et al. Crop Sei. 39:1464-1490 (1999)). A presente invenção também fornece marcadores de SNP de DNA úteis para triagem e seleção para resistência à PRR no locus Rps3 localizado no Grupo de Ligação F (LG F) e o locus Rps8 localizado no Grupo de Ligação F (LG F) (Cregan, et al. Crop Sei. 39:1464-1490 (1999)). Os marcadores de SNP são úteis para monitorar a seleção e introgressão dos loci de resistência à PRR de fontes resistentes à PRR. Como usado neste pedido, o locus Rps1 inclui, por exemplo, Rpsla, Rpslb, Rpslc, Rpsld e Rpslk. Além disso, como usado neste pedido, o locus Rps3 inclui, por exemplo, Rps3a, Rps3b, e Rps3c.

[00153] A presente invenção também inclui um método de seleção ou introgressão de um alelo resistente à PRR em uma planta de soja compreendendo: (A) cruzamento de pelo menos uma planta de soja resistente à PRR com pelo menos uma outra planta de soja a fim de formar uma população; (B) triagem da população com um ou mais marcadores de ácidos nucleicos para determinar se uma ou mais plantas de soja da população contém o alelo da fonte de resistência à PRR.

[00154] Marcadores de SNP usados para monitorar a seleção ou introgressão do locus 1 de resistência à PRR (Rps1) incluem aqueles selecionados a partir do grupo composto de NS0099413, NS0102174, NS0118166, NS0102920, NS0114258, NS0118976, NS0119981, NS0119335, NS0201536, NS0138011, NS0202603, NS0203225, NS0129030 e NS0127084. Fontes de Rps1 incluem ambos os germoplasmas de acesso, tais como introduções vegetais e germoplasma de elite. Fontes incluem, mas não são limitadas a Williams 82, L75-3735,

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21/69 e variedades de elite com resistência à PRR demonstrada. Sequências de DNA de SNP marcador de resistência à PRR (SEQ ID NO: 1 a 10 e SEQ ID NO: 81 a 84) podem ser amplificadas usando os iniciadores indicados como SEQ ID NO: 17 a 36 e SEQ ID NO: 85 a 92 e detectados com sondas indicadas como SEQ ID NO: 49 a 68 e SEQ ID NO: 93 a 100, em que os conjuntos de iniciador e sonda correspondentes fornecem ensaios para detecção de resistência à PRR ou suscetibilidade em Glycine max. A determinação da resistência ou suscetibilidade de uma planta a um determinado patógeno é óbvia para alguém versado na técnica.

[00155] Na presente invenção, um locus 3 de resistência à PRR (Rps3) é localizado no Grupo de Ligação F (Cregan, et al. Crop Sei. 39:1464-1490 (1999)). marcadores de SNP usados para monitorar a introgressão de Rps3 podem ser selecionados a partir do grupo composto de NS0114683, NS0101324, NS0102483, NS0119333,

NS0102262 e NS0116265. Fontes de Rps3 incluem ambos germoplasma de acesso e de elite. Fontes de Rps3 incluem, mas não são limitadas a, L83-570, L89-1541, L92-7857, Ivory, e variedades de elite com resistência à PRR demonstrada. Na presente invenção, um locus 8 de resistência à PRR (Rps8) é localizado no Grupo de Ligação F (Cregan, et al. Crop Sei. 39:1464-1490 (1999)). marcadores de SNP usados para monitorar a introgressão do locus 8 de resistência à PRR podem ser selecionados a partir do grupo composto de NS0114683, NS0101324, NS0102483, NS0119333, NS0102262 e NS0116265. Fontes de Rps8 incluem o germoplasma de acesso. Fontes de Rps8 incluem, mas não são limitadas a PI399703 e outras variedades com resistência conhecida à PRR.

[00156] Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos e composições para triagem de plantas de soja para resistência ou suscetibilidade à PRR, causada pela espécie Phytophthora sojae. Em ou

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22/69 tro aspecto, a presente invenção fornece métodos e composições para seleção de plantas resistentes à PRR. Em um aspecto preferencial, a presente invenção fornece métodos e composições para seleção e introgressão de resistência à PRR em plantas de soja. Os alelos de resistência à PRR da presente invenção podem ser introduzidos em uma linhagem de Glycine max de elite.

[00157] Como usado neste pedido, PRR refere-se a qualquer raça de PRR, variante ou isolada. Uma planta de soja da presente invenção pode ser resistente a um ou mais oomicetos capazes de causar ou induzir PRR. Em um aspecto, a presente invenção fornece plantas resistentes e métodos e composições para triagem de plantas de soja para resistência ou suscetibilidade a raças 1 a 55 de Phytophthora sojae. Em outro aspecto, a presente invenção fornece plantas resistentes e métodos e composições para triagem de plantas de soja para resistência ou suscetibilidade à raça 1 de Phytophthora sojae. Em aspecto adicional, a presente invenção fornece plantas resistentes e métodos e composições para triagem de plantas de soja para resistência ou suscetibilidade à raça 3 de Phytophthora sojae. Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece plantas resistentes e métodos e composições para triagem de plantas de soja para resistência ou suscetibilidade à raça 4 de Phytophthora sojae. A invenção fornece ainda plantas resistentes e métodos e composições para triagem de plantas de soja para resistência ou suscetibilidade à raça 7 de Phytophthora sojae. A invenção fornece ainda plantas resistentes e métodos e composições para triagem de plantas de soja para resistência ou suscetibilidade à raça 17 de Phytophthora sojae. A invenção fornece ainda plantas resistentes e métodos e composições para triagem de plantas de soja para resistência ou suscetibilidade à raça 25 de Phytophthora sojae.

[00158] Os alelos de resistência à PRR da presente invenção também podem ser introduzidos em uma planta transgênica Glycine max

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23/69 de elite que contém um ou mais genes de tolerância a herbicida, rendimento aumentado, controle de inseto, resistência à doença fúngica, resistência a vírus, resistência a nematoide, resistência à doença bacteriana, resistência à doença de micoplasma, produção de óleos modificada, alta produção de óleo, alta produção de proteína, controle de germinação e crescimento de mudas, nutrição humana e animal aumentada, baixa rafinose, resistência a estresse ambiental, digestibilidade aumentada, enzimas industriais, proteínas farmacêuticas, peptídeos e pequenas moléculas, traços de processamento melhorados, sabor melhorado, fixação de nitrogênio, produção de semente híbrida, alergenicidade reduzida, biopolímeros, e biocombustíveis, entre outros. Estes traços agronômicos podem ser fornecidos pelos métodos de biotecnologia vegetal como transgenes em Glycine max.

[00159] Um alelo ou alelos de resistência à doença podem ser introduzidos a partir de qualquer planta que contém aquele alelo (doador) a qualquer planta de soja recipiente. Em um aspecto, a planta de soja recipiente pode conter loci adicionais de resistência à PRR. Em outro aspecto, a planta de soja recipiente pode conter um transgene. Em outro aspecto, enquanto mantém o alelo de resistência à PRR introduzido, a contribuição genética da planta fornecendo o alelo de resistência à doença pode ser reduzida pelo retrocruzamento ou outras abordagens adequadas. Em um aspecto, o material genético nuclear derivado do material doador na planta de soja pode ser menos do que ou aproximadamente 50%, menos do que ou aproximadamente 25%, menos do que ou aproximadamente 13%, menos do que ou aproximadamente 5%, 3%, 2% ou 1%, mas que o material genético contém o locus ou loci de interesse da resistência à PRR.

[00160] É ainda entendido que uma planta de soja da presente invenção pode exibir as características de qualquer grupo de maturidade relativa. Em um aspecto, o grupo de maturidade é selecionado a partir

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24/69 do grupo composto de 000, 00, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10.

[00161] A presente invenção também fornece partes das plantas da presente invenção. Partes de planta, sem restrição, incluem semente, endosperma, óvulo e pólen. Em um aspecto particularmente preferencial da presente invenção, a parte da planta é uma semente.

[00162] Plantas ou partes das mesmas da presente invenção podem ser cultivadas em cultura e regeneradas. Métodos para a regeneração de plantas Glycine max de vários tipos de tecido e métodos de cultura de tecido de Glycine max são conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, Widholm et al., In Vitro Selection and Culture-induced Variation in Soybean, In Soybean: Genetics, Molecular Biology and Biotechnology, Eds. Verma and Shoemaker, CAB International, Wallingford, Oxon, England (1996). Técnicas de regeneração para plantas, tais como Glycine max podem usar como material inicial vários tecidos ou tipos celulares. Com Glycine max em particular, foram desenvolvidos processos de regeneração que iniciam com certos tipos de tecido diferenciados, tais como meristemas, Cartha et al., Can. J. Bot. 59:1671-1679 (1981), seções do hipocótilo, Cameya et al., Plant Science Letters 21: 289-294 (1981), e segmentos nodais de caule, Saka et al., Plant Science Letters, 19: 193-201 (1980); Cheng et al., Plant Science Letters, 19: 91-99 (1980). Regeneração de plantas Glycine max totalmente maduras sexualmente a partir de embriões somáticos gerados de explantes de embriões de Glycine max imaturos foi relatada (Ranch et al., In Vitro Cellular & Developmental Biology 21: 653-658 (1985). Regeneração de plantas Glycine max maduras de cultura de tecido por organogênese e embriogênese também foi relatada (Barwale et al., Planta 167: 473-481 (1986); Wright et al., Plant Cell Reports 5: 150-154 (1986).

[00163] Plantas contendo um ou mais loci de resistência à PRR descritos podem ser plantas doadoras. Plantas de soja contendo loci

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25/69 de resistência, por exemplo, podem ser tríadas pelo uso de uma molécula de ácido nucleico capaz de detectar um polimorfismo marcador associado ou geneticamente ligado com cada um dos alelos de resistência.

[00164] Como usado neste pedido, um alelo de um locus de resistência à doença pode englobar mais de um gene ou outro fator genético onde cada gene individual ou componente genético é também capaz de exibir variação alélica e onde cada gene ou fator genético também é capaz de produzir um efeito fenotípico no traço quantitativo em questão. Em um aspecto da presente invenção, alelo de resistência compreende um ou mais genes ou outros fatores genéticos que são também capazes de exibir variação alélica. O uso do termo um alelo de resistência não exclui uma região genômica que compreende mais de um gene ou outro fator genético. Especificamente, um alelo de resistência à doença na presente na invenção pode denotar um alelo haplotípico em uma janela haplotípica ou região genômica em que um fenótipo associado com o dito alelo haplotípico pode ser de resistência à doença. Uma janela haplotípica é uma região genômica contígua que pode ser definida, e rastreada, com o conjunto de um ou mais marcadores polimórficos em que os polimorfismos indicam identidade por descendência. Um haplótipo dentro daquela janela pode ser definido pela impressão digital única de alelos em cada marcador. Quando todos os alelos presentes em um dado locus em um cromossomo são os mesmos, aquela planta é homozigota naquele locus. Se os alelos presentes em um dado locus em um cromossomo se diferenciarem, aquela planta é heterozigota naquele locus. Plantas da presente invenção podem ser homozigotas ou heterozigotas em qualquer locus particular de resistência à PRR ou para um marcador polimórfico particular.

[00165] A presente invenção inclui moléculas de ácidos nucleicos

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26/69 isoladas. Tais moléculas incluem aquelas moléculas de ácidos nucleicos capazes de detectar um polimorfismo geneticamente ou fisicamente ligado a um locus de resistência à PRR. Marcadores adicionais podem ser obtidos que são geneticamente ligados a Rps1, Rps3 e Rps8, por técnicas disponíveis. Em um aspecto, a molécula de ácido nucleico é capaz de detectar a presença ou ausência de um marcador localizado a menos de 30, 25, 20, 10, 5, 2, ou 1 centimorgans de um locus de resistência à PRR. Em outro aspecto, a molécula de ácido nucleico é capaz de detectar um marcador em um locus selecionado a partir do grupo Rps1, Rps3 e Rps8. Em um aspecto adicional, uma molécula de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo composto da SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 116, fragmentos da mesma, complementos da mesma e moléculas de ácidos nucleicos capazes de hibridizar especificamente a uma ou mais destas moléculas de ácidos nucleicos.

[00166] Em um aspecto preferencial, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção inclui aquelas que hibridizarão especificamente a uma ou mais das moléculas de ácidos nucleicos apresentadas nas SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 116 ou complementos das mesmas ou fragmentos quaisquer sob condições moderadamente estringentes, por exemplo em aproximadamente SSC 2,0 x e aproximadamente 65^. Em um aspecto particularmente prefere ncial, um ácido nucleico da presente invenção hibridizará especificamente a uma ou mais das moléculas de ácidos nucleicos apresentadas nas SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 116 ou complementos ou fragmentos quaisquer sob condições de alta estringência. Em um aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora preferencial da presente invenção tem sequência de ácido nucleico apresentada nas SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 116 ou complementos da mesma ou fragmentos de qualquer uma. Em outro aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora preferencial da presente

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27/69 invenção compartilha identidade de sequência entre 80% e 100% ou 90% e 100% com a sequência de ácido nucleico apresentada nas SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 116 ou complemento disso ou fragmentos de qualquer uma. Em um aspecto adicional da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora preferencial da presente invenção compartilha identidade de sequência entre 95% e 100% com a sequência apresentada nas SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 116 ou complemento da mesma ou fragmentos de qualquer uma. Em um aspecto mais preferencial da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora preferencial da presente invenção compartilha identidade de sequência entre 98% e 100% com a sequência de ácido nucleico apresentada nas SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 116 ou complemento da mesma ou fragmentos de qualquer uma.

[00167] Moléculas de ácidos nucleicos ou fragmentos das mesmas são capazes de hibridizar especificamente a outras moléculas de ácidos nucleicos sob certas circunstâncias. Como usado neste pedido, duas moléculas de ácidos nucleicos são capazes de hibridizar especificamente uma à outra se as duas moléculas forem capazes de formar uma estrutura de ácido nucleico dupla fita antiparalela. Uma molécula de ácido nucleico é o complemento de outra molécula de ácido nucleico se exibirem complementaridade completa. Como usado neste pedido, moléculas exibem complementaridade completa quando cada nucleotídeo de uma das moléculas é complementar a um nucleotídeo da outra. Duas moléculas são minimamente complementares se puderem hibridizar uma à outra com estabilidade suficiente para permitir-lhes permanecer aneladas uma à outra sob condições de baixa estringência pelo menos convencionais. Similarmente as moléculas são complementares se puderem hibridizar uma à outra com estabilidade suficiente para permitir-lhes permanecer aneladas uma à outra sob condições de alta estringência convencionais. Condições de estrin

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28/69 gência convencionais são descritas por Sambrook et al., em: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), e por Haymes et al., em: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Desvios de complementaridade completa são, por isso, permissíveis, enquanto tais desvios não impedem completamente a capacidade das moléculas de formarem uma estrutura de dupla fita. Para que uma molécula de ácido nucleico sirva como um iniciador ou sonda é necessário somente ser suficientemente complementar na sequência para ser capaz de formar uma estrutura de dupla fita estável sob as concentrações determinadas de solvente e sal empregadas. [00168] Como usado neste pedido, uma sequência substancialmente homóloga é uma sequência de ácido nucleico que hibridizará especificamente ao complemento da sequência de ácido nucleico com a qual está sendo comparada sob condições de alta estringência. As sondas e iniciadores de ácidos nucleicos da presente invenção podem hibridizar sob condições estringentes a uma sequência-alvo de DNA. O termo condições de hibridização estringentes é definido como condições sob as quais uma sonda ou iniciador hibridizam especificamente com uma sequência(s)-alvo e não com sequências não-alvo, como podem ser determinados empiricamente. O termo condições estringentes é funcionalmente definido no que diz respeito à hibridização de uma sonda de ácido nucleico e um ácido nucleico-alvo (isto é, a uma determinada sequência de ácido nucleico de interesse) pelo procedimento de hibridização específico discutido em Sambrook et al., 1989, em 9.52-9.55. Ver também, Sambrook et al., 1989 em 9.47-9.52, 9.569.58; Kanehisa 1984 Nucl. Acids Res. 12:203-213; e Wetmur et al. 1968 J. Mol. Biol. 31:349-370. Condições de estringência apropriadas que promovem a hibridização de DNA são, por exemplo, cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) 6,0 x a aproximadamente 45°C, seguido

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29/69 por lavagem de SSC 2,0 x a 50°C, são conhecidas aos versados na técnica ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1-6.3.6. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada de uma estringência baixa de aproximadamente SSC 2,0 x a 50°C a uma alta estringência de aproximadamente SSC 0,2 x a 50°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada de condições de baixa estringência à temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, a condições de alta estringência a aproximadamente 65°C. Ambos temperatura e sal podem ser variados, ou temperatura ou concentração de sal podem ser mantidas constantes enquanto a outra variável é modificada.

[00169] Por exemplo, a hibridização usando sondas ou iniciadores de DNA ou RNA pode ser realizada a 65Ό em SSC 6 x, SDS 0,5%, Denhardt 5 x, DNA não-específico 100 pg/mL (por exemplo, DNA de esperma de salmão sonicado) com lavagem em SSC 0,5 x, SDS 0,5% a 65Ό, para alta estringência.

[00170] É contemplado que as condições de hibridização de estringência mais baixas, tais como hibridização e/ou temperaturas de lavagem mais baixas podem ser usadas para identificar sequências relacionadas tendo um grau mais baixo da similaridade de sequência se a especificidade de ligação da sonda ou iniciador a sequência(s)-alvo for conservada. Consequentemente, as sequências nucleotídicas da presente invenção podem ser usadas para sua capacidade de formar seletivamente moléculas dúplexes com intervalos complementares de fragmentos de DNA, RNA, ou cDNA.

[00171] Um fragmento de uma molécula de ácido nucleico pode ser um fragmento de qualquer tamanho e fragmentos ilustrativos incluem fragmentos de sequências de ácidos nucleicos apresentadas nas SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 116 e complementos das mesmas. Em um as

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30/69 pecto, um fragmento pode estar entre 15 e 25, 15 e 30, 15 e 40, 15 e 50, 15 e 100, 20 e 25, 20 e 30, 20 e 40, 20 e 50, 20 e 100, 25 e 30, 25 e 40, 25 e 50, 25 e 100, 30 e 40, 30 e 50, e 30 e 100. Em outro aspecto, o fragmento pode ser maior do que 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, ou 250 nucleotídeos.

[00172] Marcadores genéticos adicionais podem ser usados para selecionar plantas com um alelo de um QTL associado com resistência à doença da soja da presente invenção. Exemplos de bancos de dados de marcador públicos incluem, por exemplo, Soybase, um Serviço de Pesquisa Agrícola, Departamento de Agricultura dos Estados Unidos.

[00173] Marcadores genéticos da presente invenção incluem marcadores dominantes ou codominantes. Marcadores codominantes revelam a presença de dois ou mais alelos (dois por indivíduo diploide). Marcadores dominantes revelam a presença de somente um alelo único. A presença do fenótipo de marcador dominante (por exemplo, uma banda de DNA) é uma indicação que um alelo está presente na condição homozigota ou heterozigota. A ausência do fenótipo de marcador dominante (por exemplo, ausência de uma banda de DNA) é simplesmente evidência que algum outro alelo indefinido está presente. No caso de populações, onde os indivíduos são predominantemente homozigotos e os loci são predominantemente dimórficos, marcadores dominantes e codominantes podem ser igualmente valiosos. Como as populações tornam-se mais heterozigotas e multialélicas, marcadores codominantes muitas vezes tornam-se mais informativos do genótipo do que marcadores dominantes.

[00174] Em outra modalidade, marcadores, tais como marcadores de repetição de sequência única (SSR), marcadores de AFLP, marcadores de RFLP, marcadores de RAPD, marcadores fenotípicos, marcadores de isozima, polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), inser

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31/69 ções ou deleções (Indels), polimorfismos de característica única (SFPs, por exemplo, como descrito em Borevitz et al. Gen. Res. 2003. 13:513-523), perfis de transcrição de microarranjo, sequências derivadas de DNA, e sequências derivadas de RNA que são geneticamente ligadas ou correlacionadas com alelos de um QTL da presente invenção podem ser utilizadas.

[00175] Em uma modalidade, análises baseadas em ácido nucleico para a presença ou ausência do polimorfismo genético podem ser usadas para a seleção de sementes em uma população de melhoramento. Uma larga variedade de marcadores genéticos para a análise de polimorfismos genéticos está disponível e conhecida àqueles versados na técnica. A análise pode ser usada para selecionar genes, QTL, alelos, ou regiões genômicas (haplótipos) que compreendem ou são ligados a um marcador genético.

[00176] Neste pedido, métodos de análise de ácidos nucleicos são conhecidos na técnica e incluem, mas não são limitados a métodos de detecção baseados em PCR (por exemplo, ensaios TaqMan), métodos de microarranjo e métodos de sequenciamento de ácidos nucleicos. Em uma modalidade, a detecção de sítios polimórficos em uma amostra de DNA, RNA, ou cDNA pode ser facilitada através do uso de métodos de amplificação de ácidos nucleicos. Tais métodos especificamente aumentam a concentração de polinucleotídeos que atravessam o sítio polimórfico, ou incluem aquele sítio e sequências localizadas distai ou proximal a ele. Tais moléculas amplificadas podem ser prontamente detectadas por eletroforese em gel, métodos de detecção por fluorescência ou outros meios.

[00177] Um método para alcançar tal amplificação emprega reação da polimerase em cadeia (PCR) (Mullis et al. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986); Patente Européia 50.424; Patente Européia 84.796; Patente Européia 258.017; Patente Européia

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237.362; Patente Européia 201.184; Patente U.S. 4.683.202; Patente U.S. 4.582.788; e Patente U.S. 4.683.194), usando pares de iniciadores que são capazes de hibridizar às sequências proximais que definem um polimorfismo em sua forma de dupla fita.

[00178] Polimorfismos em sequências de DNA podem ser detectados ou tipados por vários métodos eficazes bem conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados àqueles descritos nas Patentes Americanas 5.468.613 e 5.217.863; 5.210.015; 5.876.930; 6.030.787; 6.004.744; 6.013.431; 5.595.890; 5.762.876; 5.945.283; 5.468.613; 6.090.558; 5.800.944; e 5.616.464, todas as quais são incorporadas neste pedido por referência em suas totalidades. Entretanto, as composições e métodos da presente invenção podem ser usados em conjunto com qualquer método de tipagem de polimorfismo para tipar polimorfismos nas amostras de DNA genômico de soja. Estas amostras de DNA genômico de soja usadas incluem mas não são limitadas ao DNA genômico isolado de soja diretamente de uma planta de soja, DNA genômico clonado de soja, ou DNA genômico amplificado de soja.

[00179] Por exemplo, polimorfismos em sequências de DNA podem ser detectados pela hibridização de sondas de oligonucleotídeo aleloespecífica (ASO) como descrito nas Patentes Americanas 5.468.613 e 5.217.863. Patente U.S. 5.468.613 descreve hibridizações de oligonucleotídeo alelo-específicas em que variações de nucleotídeo únicas ou múltiplas na sequência de ácido nucleico podem ser detectadas em ácidos nucleicos por um processo no qual a sequência contendo a variação de nucleotídeo é amplificada, colocada em uma membrana e tratada com uma sonda de oligonucleotídeo específica para a sequência marcada. Sequência-alvo de ácido nucleico também pode ser detectada por métodos de ligação de sonda como descrito na Patente U.S. 5.800.944 em que a sequência de interesse é amplificada e hibri

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33/69 dizada a sondas seguidas pela ligação para detectar uma parte marcada da sonda.

[00180] Microarranjos também podem ser usados para detecção de polimorfismo, em que conjuntos de sonda oligonucleotídica são montados em uma forma sobreposta para representar uma sequência única tal que uma diferença na sequência alvo à certa altura resultasse na hibridização parcial de sonda (Borevitz et al., Genome Res. 13:513523 (2003); Cui et al., Bioinformatics 21:3852-3858 (2005). Em qualquer microarranjo, é esperado haver uma pluralidade de sequências alvo, que podem representar genes e/ou regiões de não codificação em que cada sequência alvo é representada por uma série de oligonucleotídeos sobrepostos, em vez de uma sonda única. Esta plataforma fornece alto rendimento na triagem de uma pluralidade de polimorfismos. Um polimorfismo de característica única (SFP) é um polimorfismo detectado por uma sonda única em um arranjo oligonucleotídico, em que uma característica é uma sonda no arranjo. A tipagem de sequências alvo por métodos com base em microarranjo é descrita nas Patentes Americanas 6.799.122; 6.913.879; e 6.996.476.

[00181] Sequência-alvo de ácido nucleico também pode ser detectada por métodos de ligação de sonda como descrito na Patente U.S. 5.616.464 empregando pelo menos um par de sondas que têm sequências homólogas a porções adjacentes da sequência alvo de ácido nucleico e têm cadeias laterais que se ligam não-covalentemente para formar um tronco nos pares de base das ditas sondas na dita sequência-alvo de ácido nucleico. Pelo menos uma das cadeias laterais tem um grupo fotoativável que pode formar uma ligação cruzada covalente com outro membro de cadeia lateral do tronco.

[00182] Outros métodos para detecção de SNPs e Indels incluem métodos de extensão de base única (SBE). Exemplos de métodos SBE incluem, mas não são limitados àqueles descritos nas Patentes

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Americanas 6.004.744; 6.013.431; 5.595.890; 5.762.876; e 5.945.283. Métodos SBE são baseados na extensão de um iniciador nucleotídico que está adjacente a um polimorfismo para incorporar um resíduo de nucleotídeo detectável na extensão do iniciador. Em certas modalidades, o método SBE usa três oligonucleotídeos sintéticos. Dois dos oligonucleotídeos servem como iniciadores de PCR e são complementares à sequência do locus do DNA genômico de soja que flanqueia uma região contendo o polimorfismo a ser analisado. A seguinte amplificação da região do genoma de soja contendo o polimorfismo, o produto de PCR é misturado com o terceiro oligonucleotídeo (chamado um iniciador de extensão) que é desenhado para hibridizar ao DNA amplificado adjacente ao polimorfismo na presença de DNA polimerase e dois didesoxinucleosideotrifosfatos diferencialmente marcados. Se o polimorfismo estiver presente no padrão, um dos didesoxinucleosideotrifosfatos marcados pode ser adicionado ao iniciador em uma extensão de cadeia de base única. O alelo presente então é inferido pela determinação de qual das duas marcações diferenciais foi adicionada ao iniciador de extensão. Amostras homozigotas resultarão em somente uma das duas bases marcadas que são incorporadas e dessa forma somente uma das duas marcas será detectada. Amostras heterozigotas têm ambos os alelos presentes, e dirigirão dessa forma a incorporação de ambas as marcas (em moléculas diferentes do iniciador de extensão) e dessa forma ambas as marcas serão detectadas.

[00183] Em um método preferencial para detecção de polimorfismos, SNPs e Indels podem ser detectados por métodos descritos nas Patentes Americanas 5.210.015; 5.876.930; e 6.030.787 nas quais uma sonda de oligonucleotídeo que tem um corante repórter fluorescente 5' e um apagador de corante 3' covalentemente ligado às extremidades 5' e 3' da sonda. Quando a sonda está intacta, a proximidade do corante repórter ao apagador de corante resulta na supressão da

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35/69 fluorescência do corante repórter, por exemplo, pela transferência de energia de tipo Forster. Durante a PCR, iniciadores de sentido direto e de sentido reverso hibridizam a uma sequência específica do DNA alvo que flanqueia um polimorfismo enquanto a sonda de hibridização hibridiza a sequência contendo o polimorfismo no produto de PCR amplificado. No ciclo de PCR subsequente, a DNA polimerase com atividade exonuclease 5' -o 3' cliva a sonda e separa o corante repórter do apagador corante resultando em fluorescência aumentada do repórter.

[00184] Com o objetivo de mapear QTL, os marcadores incluídos devem ser diagnósticos de origem para que inferências sejam feitas sobre populações subsequentes, marcadores de SNP são ideais para mapear porque a probabilidade que um determinado alelo SNP seja derivado de origens independentes nas populações existentes de uma determinada espécie é baixa, particularmente se múltiplos SNPs forem usados em sequência para definir um haplótipo. Como tal, marcadores de SNP são úteis para rastrear e assistir a introgressão de QTLs, particularmente no caso de haplótipos.

[00185] A ligação genética de moléculas de marcador adicionais pode ser estabelecida por um modelo de mapeamento gênico tal como, sem limitação, o modelo de marcador que flanqueia relatado por Lander et al. (Lander et al., Genetics, 121:185-199 (1989)), e o mapeamento do intervalo, com base em métodos de probabilidade máximos descritos no mesmo, e implementado no pacote de programas MAPMAKER/QTL (Lincoln and Lander, Mapping Genes Controlling Quantitatives Traits Using MAPMAKER/QTL, Whitehead Institute for Biomedical Research, Massachusetts, (1990)). O programa adicional inclui Qgene, Versão 2.23 (1996), Department of Plant Breeding and Biometry, 266 Emerson Hall, Cornell University, Ithaca, NY). O uso do programa Qgene é uma abordagem particularmente preferencial.

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36/69 [00186] Uma estimativa de probabilidade máxima (MLE) para a presença de um marcador é calculada, em conjunto com uma MLE assumindo nenhum efeito de QTL, para evitar falsos positivos. Um logio de um risco relativo (LOD) então é calculado como: LOD = logio (MLE para a presença de um dado QTL/MLE não ligado a QTL). O escore de LOD essencialmente indica quanto mais provavelmente os dados devem ter surgido assumindo a presença de um QTL versus sua ausência. O valor limiar de LOD para evitar um falso positivo com uma dada confiança, digamos 95%, depende do número de marcadores e o comprimento do genoma. Gráficos que indicam limiares de LOD são apresentados em Lander et al. (1989), e além disso descrito por Arús and Moreno-González, Plant Breeding, Hayward, Bosemark, Romagosa (eds.) Chapman & Hall, Londres, pp. 314-331 (1993).

[00187] Modelos adicionais podem ser usados. Muitas modificações e abordagens alternativas para mapeamento do intervalo foram relatados, incluindo o uso de métodos não-paramétricos (Kruglyak et al., Genetics, 139:1421-1428 (1995)). Métodos ou modelos de regressão múltipla podem ser também usados, nos quais o traço é regredido em um grande número de marcadores (Jansen, Biometrics in Plant Breed, van Oijen, Jansen (eds). Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding, Holanda, pp. 116-124 (1994); Weber and Wricke, Advances in Plant Breeding, Blackwell, Berlim, 16 (1994)). Procedimentos que combinam mapeamento de intervalo com análise de regressão, pelos quais o fenótipo é regredido para um QTL putativo único em um dado intervalo de marcador, e ao mesmo tempo para diversos marcadores que servem como 'cofatores', foram relatados por Jansen et al. (Jansen et al., Genetics, 136:14471455 (1994)) e Zeng (Zeng, Genetics 136:1457-1468 (1994)). Geralmente, o uso de cofatores reduz a distorção e erro de amostragem das posições QTL previstas (Utz and Melchinger, Biometrics in Plant Bree

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37/69 ding, van Oijen, Jansen (eds.) Proceedings of the Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding, Holanda, pp. 195-204 (1994), por meio disso melhorando a precisão e eficiência do mapeamento de QTL (Zeng 1994). Estes modelos podem ser estendidos a experimentos de multiambiente para analisar interações de ambientegenótipo (Jansen etal., Theor. Appl. Genet. 91:33-3 (1995)).

[00188] A seleção de populações de mapeamento apropriadas é importante para construção do mapa. A escolha de uma população de mapeamento apropriada depende do tipo de sistemas de marcador empregados (Tanksley et al., Molecular Mapping in plant cromossomes. cromossomes structure and function: Impact of new concepts J.P. Gustafson and R. Appels (eds). Plenum Press, New York, pp. 157173 (1988)). Consideração deve ser dada à fonte dos parentais (adaptada versus exótica) usada na população de mapeamento. O pareamento de cromossomos e as taxas de recombinação podem ser severamente perturbadas (suprimidas) em amplos cruzamentos (adaptado x exótico) e geralmente produz distâncias de ligação muito reduzidas. Amplos cruzamentos fornecerão normalmente populações de segregação de um arranjo relativamente grande de polimorfismos quando comparado à progênie em um cruzamento estreito (adaptado x adaptado).

[00189] Linhagens puras recombinantes (RIL) (linhagens geneticamente relacionadas; normalmente > F₅, desenvolvidas continuamente a partir de linhagens de autopolinização F₂ em direção a homozigosidade) podem ser usadas como uma população de mapeamento. A informação obtida de marcadores dominantes pode ser maximizada pelo uso de RIL porque todos ou quase todos os loci são homozigotos. Sob condições de ligação estreitas (isto é, aproximadamente < 10% de recombinação), marcadores dominantes e codominantes avaliados em populações RIL fornecem mais informação por indivíduo do que qual

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38/69 quer tipo de marcador em populações de retrocruzamento (Reiter et al., Proc. Natl. Acad. Sc/.(USA) 89:1477-1481 (1992)). Entretanto, como a distância entre marcadores torna-se maior (isto é, os loci tornamse mais independentes), a informação em populações RIL diminui dramaticamente.

[00190] Populações de retrocruzamento (por exemplo, geradas a partir de um cruzamento de uma variedade bem-sucedida (parental recorrente) e outra variedade (parental doador) carregando um traço não presente no anterior) podem ser utilizadas como uma população de mapeamento. Uma série de retrocruzamentos parentais recorrentes pode ser feita para recuperar a maior parte de seus traços desejáveis. Dessa forma, uma população é criada compondo-se de indivíduos quase como parental recorrente mas cada indivíduo carrega quantidades variadas ou mosaico de regiões genômicas do parental doador. Populações de retrocruzamento podem ser úteis para mapear marcadores dominantes se todos os loci parentais recorrentes forem homozigotos e o parental doador e recorrente tiverem alelos de marcador polimórfico contrastante (Reiter et al. (1992)). A informação obtida a partir de populações de retrocruzamento analisada usando marcadores codominantes ou dominantes é menor que aquela obtida de populações F₂ porque um, em vez de dois, gametas recombinantes são escolhidos por planta. Populações de retrocruzamento, entretanto, são mais informativas (em baixa saturação de marcador) quando comparadas com RILs já que a distância entre loci ligados aumenta em populações RIL (isto é, recombinação de aproximadamente 0,15%). Recombinação aumentada pode ser benéfica para a resolução de ligações estreitas, mas pode ser indesejável na construção de mapas com baixa saturação de marcador.

[00191] Linhagens próximas isogênicas (NIL) criadas por muitos retrocruzamentos para produzir um arranjo de indivíduos que são qua

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39/69 se idênticos na composição genética exceto por traço ou região genômica sob interrogação podem ser usadas como uma população de mapeamento. No mapeamento com NILs, somente uma porção dos loci polimórficos é esperada para mapear uma região selecionada. [00192] Análise de volume agregado (BSA) é um método desenvolvido para a rápida identificação da ligação entre marcadores e traços de interesse (Michelmore et al. 1991 Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 88:9828-9832). Em BSA, duas amostras de DNA agrupadas são tiradas de uma população de segregação que se origina de um cruzamento único. Estes volumes contêm indivíduos que são idênticos para um determinado traço (resistente ou suscetível à determinada doença) ou região genômica, mas arbitrária em regiões não-ligadas (isto é, heterozigoto). Regiões não ligadas à região alvo não se diferenciarão entre as amostras agrupadas de muitos indivíduos em BSA.

[00193] Plantas da presente invenção podem ser parte ou geradas a partir de um programa de melhoramento. A escolha do método de melhoramento depende do modo de reprodução vegetal, a herdabilidade do traço(s) que é melhorado, e o tipo de cultivar usado comercialmente (por exemplo, cultivar de híbrido cultivar de linhagem pura, etc.). Um cultivar é uma raça ou variedade de uma espécie vegetal que foi criada ou selecionada intencionalmente e mantida através de cultivo.

[00194] Abordagens selecionadas, não-limitadas para melhoramento das plantas da presente invenção são apresentadas abaixo. Um programa de melhoramento pode ser potencializado usando seleção assistida de marcador (MAS) na progênie de qualquer cruzamento. É ainda entendido que marcadores de ácidos nucleicos da presente invenção podem ser usados em um programa MAS (melhoramento). É entendido ainda que qualquer cultivar comercial e não comercial pode ser utilizado em um programa de melhoramento. Fatores tais como,

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40/69 por exemplo, vigor de emergência, vigor vegetativo, tolerância a estresse, resistência à doença, ramificação, florescência, produção de semente, tamanho de semente, densidade de semente, acamamento, e debulhamento etc. geralmente ditarão a escolha.

[00195] Para traços altamente hereditários, uma escolha de plantas individuais superiores avaliadas em uma posição única será eficaz, ao passo que para traços com baixa herdabilidade, a seleção deve ser baseada em valores médios obtidos de avaliações replicadas de famílias de plantas relacionadas. Métodos de seleção populares comumente incluem seleção de pedigree, seleção de pedigree modificado, seleção de massa e seleção recorrente. Em um aspecto preferencial, um retrocruzamento ou programa de melhoramento recorrente é empreendido.

[00196] A complexidade da herança influi na escolha do método de melhoramento. O melhoramento por retrocruzamento pode ser usado para transferir um ou alguns genes favoráveis de um traço altamente hereditário em um cultivar desejável. Esta abordagem foi usada extensivamente para produzir cultivares resistentes à doença. Várias técnicas de seleção recorrentes são usadas para melhorar traços quantitativamente herdados controlados por genes numerosos.

[00197] O melhoramento de linhagens pode ser testado e comparado com padrões apropriados em ambientes representativos das área(s) comerciais alvo de duas ou mais gerações. As melhores linhagens são candidatas para novos cultivares comerciais; aquelas ainda deficientes em traços podem ser usadas como parentais para produzir novas populações para seleção adicional.

[00198] Melhoramento de pedigree e métodos de melhoramento de seleção recorrentes podem ser usados para desenvolver cultivares a partir de populações de melhoramento. Programas de melhoramento combinam traços desejáveis de dois ou mais cultivares ou várias fon

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41/69 tes de ampla base no melhoramento de agrupamentos a partir dos quais cultivares são desenvolvidos por autopolinização e seleção de fenótipos desejados. Novos cultivares podem ser avaliados para determinar quais têm potencial comercial.

[00199] Melhoramento de retrocruzamento foi usado para transferir genes de um traço simplesmente herdado, altamente herdável em um cultivar homozigoto ou linhagem de melhoramento desejáveis, que é o parental recorrente. A fonte do traço a ser transferido é chamada de parental doador. Após cruzamento inicial, indivíduos que possuem o fenótipo do parental doador são selecionados e repetidamente cruzados (retrocruzados) ao parental recorrente. A planta resultante é esperada ter a maior parte de atributos do parental recorrente (por exemplo, cultivar) e, além disso, o traço desejável transferido a partir do parental doador.

[00200] O procedimento de descendência de semente única no sentido restrito refere-se à plantação de uma população de segregação, colheita de uma amostra de uma semente por planta, e utilização da amostra de uma semente para plantar a geração seguinte. Quando a população foi promovida a partir de F₂ ao nível desejado de melhoramento, as plantas das quais as linhagens são derivadas traçarão cada uma indivíduos F2 diferentes. O número de plantas em uma população diminui a cada geração devido à falha de algumas sementes para germinar ou algumas plantas para produzir pelo menos uma semente. Por conseguinte, nem todas as plantas F2 originalmente amostradas na população serão representadas por uma progênie quando o progresso na geração é concluído.

[00201] Descrições de outros métodos de melhoramento que são comumente usados para traços diferentes e colheitas podem ser encontradas em um dos vários livros de referência (Allard, Principies of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98

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42/69 (1960); Simmonds, Principies of crop improvement, Longman, Inc, NY, 369-399 (1979); Sneep and Hendriksen, Plant breeding perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979); Fehr, In: Soybeans: improvement, Production and Uses, 2nd Edition, Manograph., 16:249 (1987); Fehr, Principies of variety development, Theory and Technique, (Vol 1) e Crop Species of Soybean (Vol. 2), lowa State Univ., Macmillan. Pub. Co, NY, 360-376 (1987).

[00202] Uma alternativa ao mapeamento de QTL tradicional envolve a realização de resolução mais alta por mapeamento de haplótipos, contra marcadores individuais (Fan et al. Genetics 2006 172:663-686). Esta abordagem rastreia blocos de DNA conhecidos como haplótipos, como definidos por marcadores polimórficos, que são supostos serem idênticos pela descendência na população de mapeamento. Esta suposição resulta em um maior tamanho de amostra eficaz, oferecendo a maior resolução de QTL. Métodos para determinação da significância estatística de uma correlação entre um fenótipo e um genótipo, neste caso, um haplótipo, podem ser determinados por qualquer teste estatístico conhecido na técnica e com qualquer limiar aceito de significância estatística que é necessária. A aplicação de métodos particulares e limiares de significância estão dentro da habilidade do versado na técnica.

[00203] É entendido ainda, que a presente invenção fornece células bacterianas, virais, microbianas, de inseto, mamíferas e vegetais compreendendo as moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção. [00204] Como usado neste pedido, uma molécula de ácido nucleico, sendo uma molécula que ocorre naturalmente ou de outra maneira pode ser substancialmente purificada, se desejado, referindo-se a uma molécula separada substancialmente de todas as outras moléculas normal mente associadas com ela em seu estado nativo. Mais pre

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43/69 ferencialmente, uma molécula substancialmente purificada está presente em espécies predominantes em uma preparação. Uma molécula substancialmente purificada pode ser mais que 60% livres, preferencialmente 75% livres, mais preferencial mente 90% livres, e ainda mais preferencialmente 95% livres de outras moléculas (sem incluir solvente) presentes na mistura natural. O termo substancialmente purificado não é destinado a englobar moléculas presentes em seu estado nativo.

[00205] Os agentes da presente invenção serão preferencialmente biologicamente ativos com respeito a um atributo estrutural, tal como a capacidade de um ácido nucleico hibridizar a outra molécula de ácido nucleico, ou a capacidade de uma proteína ser ligada por um anticorpo (ou competir com outra molécula por tal ligação). Alternativamente, tal atributo pode ser catalítico, e dessa forma envolver a capacidade do agente de mediar uma reação química ou resposta.

[00206] Os agentes da presente invenção também podem ser recombinantes. Como usado neste pedido, o termo recombinante significa qualquer agente (por exemplo, DNA, peptídeo etc.), que é, ou resulta, entretanto indireto, da manipulação humana de uma molécula de ácido nucleico.

[00207] Os agentes da presente invenção podem ser marcados com reagentes que facilitam a detecção do agente (por exemplo, marcas fluorescentes (Prober et al., Science 238:336-340 (1987); Albarella etal., Patente Europeia 144914), marcas químicas (Sheldon et al., Patente U.S. 4.582.789; Albarella et al., Patente U.S. 4.563.417), bases modificadas (Miyoshi etal., Patente Europeia 119448).

[00208] Aparelhos e métodos para alto rendimento, amostragem não destrutiva de sementes foi descrita que superaria os obstáculos de amostras estatísticas levando em conta análise de semente individual. Por exemplo, o Pedido de Patente U.S. Número de Série 11/213.435

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44/69 (depositado em 26 de agosto de 2005) e Pedido de Patente U.S. Número de Série 11/680.611 (depositado em 2 de março de 2007), que são incorporados neste pedido por referência em sua totalidade, descrevem aparelho e sistemas de amostragem automatizada de sementes bem como métodos de amostragem, teste e agrupamento de sementes.

[00209] O efeito do QTL de resistência à doença pode variar com base no genótipo parental e nas condições ambientais nas quais o efeito de resistência à doença é medido. Está dentro da habilidade daqueles versados na técnica de melhoramento vegetal e sem experimentação indevida usar os métodos descritos neste pedido para selecionar a partir de uma população de plantas ou de uma coleção de genótipos parentais aqueles que quando contendo um locus de doença resultam na resistência à doença aumentada em relação ao genótipo parental.

[00210] Tendo agora descrito geralmente a invenção, a mesma será mais prontamente entendida por referência aos seguintes exemplos que são fornecidos por meio de ilustração, e não são destinados para limitar a presente invenção, a menos que especificado.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Validação de marcadores de SNP para introqressão de loci de resistência à PRR quando usado em conjunto com haplótipo de fonte de resistência conhecida [00211] Phytophthora sojae é o agente causai da podridão de raiz por Phytophthora (PRR) e contabiliza significante perda de rendimento de soja nos Estados Unidos. Plantação de variedades resistentes é um método eficaz para controlar PRR. Melhoramento de sojas resistentes à PRR pode ser muito facilitado pelo uso da seleção assistida por marcador para alelos de resistência à PRR. Populações de segregação foram geradas para validar marcadores de SNP que podem ser

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45/69 usados para detectar, selecionar, e introgredir loci de resistência à PRR em plantas.

[00212] A escala de avaliação fenotípica e definições usadas neste pedido para os seguintes Exemplos estão incluídas na Tabela 1. A porcentagem de plantas sobrevivendo após inoculação com P. sojae é usada para a classificação. Esta escala de classificação fornece a base de todas as avaliações de doença e determinações da resistência ou suscetibilidade nos seguintes Exemplos.

Tabela 1: Descrição de critérios de avaliação usados para fenotipaqem de PRR.

Resultados Fenotípicos	Classificação
de 0 a 25% Mortas	Resistente (R)
de 26 a 49% Mortas	Heterozigota (H)
> 50% Mortas	Suscetível (S)

[00213] Populações de segregação, envolvendo cruzamento entre um cultivar suscetível e uma série de isolinhagens contendo alelos de resistência Rps, foram desenvolvidas para o mapeamento genético no verão de 2004 (Tabela 2). Plantas individuais F2 foram amostradas e triadas por tecido com marcadores polimórficos para o locus resistente Rps associado com a fonte de resistência. Semente F2:3 das plantas F2 colhidas foi analisada para a reação à PRR. Resultados a partir da validação de experimentos demonstrando utilidade dos marcadores são fornecidas nas Tabelas 3 a 10.

Tabela 2: Populações de Classificação para reação à PRR

Parental Resistente	Locus resistente	Parental Suscetível
L75-3735	Rpslc	MV0030
Williams 82	Rpslk	MV0030
L83-570	Rps3a	MV0030
L89-1541	Rps3b	MV0030
L92-7857	Rps3c	MV0030
PI399703	Rps8	Williams

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46/69 [00214] L75-3735 é uma fonte conhecida de Rpslc. Da população

L75-3735/MV0030, um total de 322 plantas F2 foram amostradas para a triagem com marcador. A semente colhida a partir de cada planta foi usada para plantar e plantas F3 de fenótipo individual de cada família derivada de F2 para reação à PRR. Plantas exibindo uma reação resistente foram encontradas tendo um haplótipo diferente daquele de plantas suscetíveis quando tríadas com marcadores genéticos NS0102174, NS0118976, NS0118166, NS0099413, e NS0119335. O número total de famílias a partir da população L75-3735/MV0030 com o mesmo haplótipo que o parental resistente foi 41, e destas famílias, todas as 41 tiveram uma reação resistente quando fenotipadas. De cada família, uma média de 10 plantas F3 derivadas de F2 (famílias F2) foram fenotipadas. A Tabela 3 fornece um exemplo da reação à PRR e o haplótipo de duas famílias a partir da população L753735/MV0030.

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NS- 0119335	TT	5
NS- 0099413	CC	TT
NS- 0118166	TT	CC
NS- 0118976	TT	CC
NS- 0102174	GG	CC
Pedigree	L75-3735/MV0030	L75-3735/MV0030
Reação	θ'	ω
Plantas Susc.	o	o
Total de Plantas	CN	-
Família	-	CN

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48/69 [00215] Williams 82 é uma fonte conhecida de Rpslk. A partir da população Williams82/MV0030, um total de 205 plantas F2 foram amostradas por tecido para triagem com marcador. A semente colhida de cada planta foi usada para plantar e plantas F3 de fenótipo individual a partir de cada família derivada de F2 para reação à PRR. Plantas exibindo uma reação de resistência foram encontradas tendo um haplótipo diferente daquele de plantas suscetíveis quando tríadas com marcadores genéticos NS0118166, NS0102920, NS0114258, NS0102174, NS0119981, e NS0201536. O número total de famílias a partir da população Williams 82/MV0030 com o mesmo haplótipo que o parental resistente foi 24, e destas famílias, todas as 24 tiveram uma reação resistente quando fenotipadas. A Tabela 4 fornece um exemplo da reação à PRR e o haplótipo de duas famílias a partir da população williams82/MV0030.

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NS- 0201536	CGAG	* * * *
NS- 0119981	CC	5
NS- 0102174	GG	CC
NS- 0118976	TT	CC
NS- 0114258	TT	CC
NS- 0102920	CC	TT
NS- 0118166	TT	CC
Pedigree	Williams82/ MV0030	Williams82/ MV0030
Reação	ct.	ω
Plantas Susc.	o	o
Total de Plantas	CN	o
Família	-	CN

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50/69 [00216] L83-570 é uma fonte conhecida de Rps3a. A partir da população L83-570/MV0030, um total de 297 plantas F2 foram amostradas por tecido para a triagem com marcador. A semente colhida de cada planta foi usada para plantar e plantas F3 de fenótipo individual a partir de cada família derivada de F2 para reação à PRR. Plantas exibindo uma reação resistente foram encontradas tendo um haplótipo diferente do que plantas suscetíveis quando tríadas com os marcadores genéticos NS0101324 e NS0116265. O número total de famílias a partir da população L83-570/MV0030 com o mesmo haplótipo que o parental resistente foi 64, e destas famílias, 58 foram encontradas tendo uma reação resistente quando fenotipadas. A Tabela 5 fornece um exemplo de reação à PRR e haplótipo de duas famílias a partir da população L83-570/MV0030.

Tabela 5. Validação de marcadores de SNP usados em conjunto com haplótipo de uma fonte Rps3a conhecida.

Família	Total de Plantas	Plantas Susc.	Reação	Pedigree	NS- 0101324	NS- 0116265
1	11	0	R	L83- 570/MV0030	AA	GG
2	10	9	S	L83- 570/MV0030	GG	TT

[00217] L89-1541 é uma fonte conhecida de Rps3b. A partir da população L89-1541/MV0030, um total de 345 plantas F2 foram amostradas por tecido para a triagem com marcador. A semente colhida de cada planta foi usada para plantar e plantas F3 de fenótipo individual a partir de cada família derivada de F2 para reação à PRR. Plantas exibindo uma reação resistente foram encontradas tendo um haplótipo diferente do que plantas suscetíveis quando tríadas com os marcadores genéticos NS0114683, NS0102483, NS0119333, e NS0102262. O número total de famílias a partir da população L89-1541/MV0030 com o mesmo haplótipo do parental resistente foi 88, e destas famílias, 47

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51/69 foram encontradas tendo uma reação resistente quando fenotipadas. A Tabela 6 fornece um exemplo da reação à PRR e o haplótipo de duas famílias a partir da população L89-1541/MV0030.

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52/69

NS-0102262	5	GG
NS-0119333	5	CC
NS-0102483	GG	5
NS-0114683	5	CC
Pedigree	L89-1541/MV0030	L89-1541/MV0030
Reação	CÉ	ω
Plantas Susc.	o	CN
Total de Plantas	C\|	C\|
Família	-	C\|

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53/69 [00218] L92-7857 é uma fonte conhecida de Rps3c. A partir da população L92-7857/MV0030, um total de 340 plantas F2 foram amostradas por tecido para triagem com marcador. A semente colhida de cada planta foi usada para plantar e plantas F3 de fenótipo individual a partir de cada família derivada de F2 para reação à PRR. Plantas exibindo reação resistente foram encontradas tendo um haplótipo diferente do que plantas suscetíveis quando triadas com marcadores genéticos NS0114683, NS0102483, NS0119333 e NS0102262. O número total de famílias a partir da população L92-7857/MV0030 com o mesmo haplótipo do parental resistente foi 112, e destas famílias, 87 foram encontradas tendo uma reação resistente quando fenotipadas. A Tabela 7 fornece um exemplo da reação à PRR e o haplótipo de duas famílias a partir da população L92-7857/MV0030.

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54/69 ο 00 φ

0£ φ Ό

Φ

4—» C 2 φ Ε ζ:

φ Ό

Ο

Ε ο

u

0_ ζ ω φ Ό

Φ Ε φ Ό

Ο ιφ

Φ Φ Ό

Ι<

Φ Φ Π

Φ ο

4—» C ZJ 'c ο

φ

Ε φ φ ο Ό

Φ Φ ZJ

NS-0102262	5	AG
NS-0119333	5	AC
NS-0102483	GG	AG
NS-0114683	5	AC
Pedigree	L92-7857/MV0030	L92-7857/MV0030
Reação	CÉ	ω
Plantas Susc.	o	-
Total de Plantas	-	CN
Família	-	C\|

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55/69 [00219] ΡΙ399703 é uma fonte conhecida de Rps8. A partir da população PI399703/Williams, um total de 223 plantas F2 foram amostradas por tecido para triagem com marcador. A semente colhida de cada planta foi usada para plantar e plantas F3 de fenótipo individual a partir de cada família derivada de F2 para reação à PRR. Plantas exibindo uma reação resistente foram encontradas tendo um haplótipo diferente do que plantas suscetíveis quando tríadas com marcadores genéticos NS0114683, NS0102483, NS011933, e NS0102262. O número total de famílias a partir da população PI399703/Williams com o mesmo haplótipo do parental resistente foi 39, e destas famílias, todas as 39 tiveram uma reação resistente quando fenotipadas. A Tabela 8 fornece um exemplo da reação à PRR e o haplótipo de duas famílias a partir da população PI399703/Williams.

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56/69

NS- 0119333	CC	5
NS- 0116265	GG	TT
NS- 0114683	CC	5
NS- 0102483	5	GG
NS- 0102262	GG	5
NS- 0101324	5	GG
Pedigree	PI399703/W illiams	PI399703/W illiams
Reação	CÉ	ω
Plantas Susc.	o
Total de Plantas	CD
Família	-	CN

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57/69 [00220] Um SNP marcador adicional, NS0138011, foi identificado para a detecção do locus Rpslc. Os resultados de genotipagem de 100 linhagens de soja que eram conhecidas tendo Rpsla, Rpslk, Rpslc, ou serem suscetíveis à PRR foram examinadas. Foi encontrado que linhagens com Rpslc tinham o alelo AA quando tríadas com o marcador NS0138011. Outras 85 linhagens, que tinham loci de resistência Rpsla, Rpslk à PRR ou foram suscetíveis à PRR, tinham o alelo CC como fornecido na Tabela 9. Por isso, triagem com o marcador genético NS0138011 pode ser usada para detectar o locus Rpslc em um programa de melhoramento de soja.

Tabela 9. Validação do SNP marcador NS0138011 em detecção de

Rpslc.

Alelo	Número de linhagens	Locus
CC	85	Rpsla, Rpslk ou suscetível
AA	15	Rpslc

[00221] A Tabela 10 sumariza experimentos de validação e inclui os marcadores de SNP encontrados sendo úteis no monitoramento da seleção ou introgressão do locus Rps1 de resistência à PRR, incluindo alelos Rpslc e Rpslk em uma planta de soja em um programa de melhoramento de soja. O haplótipo da fonte de resistência conhecida é usado para determinar qual alelo Rps1 é selecionado em um programa de melhoramento. A Tabela 10 também inclui marcadores de SNP úteis para monitorar a introgressão dos loci Rps3 e Rps8 de resistência à PRR em uma planta de soja em um programa de melhoramento de soja. O locus de resistência à PRR inclui Rps3, Rps3a, Rps3b e Rps3c. O haplótipo da fonte de resistência conhecida é usado para determinar qual alelo Rps3 é selecionado em um programa de melhoramento. marcadores de SNP encontrados sendo úteis para triagem para Rps1 incluem NS0099413, NS0102174, NS0118166,

NS0102920, NS0114258, NS0118976, NS0119981, NS0119335, NS0201536, NS0138011, NS0127084, NS0129030, NS0202603 e

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NS0203225. marcadores de SNP encontrados sendo úteis para triagem para Rps3 e Rps8 incluem NS0114683, NS010324, NS0102483, NS0119333, NS0102262, e NS0116265. Em um programa de melhoramento de soja, plantas genotipadas como homozigotas ou heterozigotas para os alelos parentais resistentes, podem ser selecionadas para o progresso.

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59/69 ω φ Η—»

C φ

Q E φ Cf ac o_ φ Ό c «D ω

Φ

Φ Ό

CO

có

Φ

ο Ό c φ ZJ σ φ ο ω φ Ό

SEQ ID da Sonda 2	50	52	54	56	58	09	62	64	94	00 CD	99	96	86	100
SEQ ID da Sonda 1	49	m	53	55	57	59	CD	63	93	67	65	95	97	66
SEQ ID do Iniciador de sentido reverso	00	20	22	24	26	28	30	32	CD 00	36	34	00 00	06	92
SEQ ID do Iniciador de sentido direto		CD	CN	23	25	27	29	CO	85	35	33	00	68	CD
Alelo 2	TT	GG	TT	TT	TT	TT	CC	TT	GG	CC	* * * *	TT	3	TT
Alelo 1	CC	CC	CC	CC	CC	CC	3	3	3	3	CGAG	3	cc	CC
Posição do SNP	242	563	259	163	324	460	516	310	ID	385	35-38	192	324	00 ID 00
SEQ ID	-	CN	CO		m	CD		00	00	o	CD	82	CO 00	00
Locus Rps	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Pos. no Cr.	25.0	25.0	25.0	25.0	25.0	25.0	28.7	29.5	31.1	32.2	33.0	33.2	34.7	41.4
LG*	z	z	z	z	z	z	z	z	z	z	z	z	z	z
Marcador	NS0099413	NS0102174	NS0118166	NS0102920	NS0114258	NS0118976	NS0119981	NS0119335	NS0202603	NS0138011	NS0201536	NS0203225	NS0129030	NS0127084

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SEQ ID da Sonda 2	70	72	74	76	CO	o CO
SEQ ID da Sonda 1	69		73	75	77	79
SEQ ID do Iniciador de sentido reverso	CO CO	40	42	44	46	CO
SEQ ID do Iniciador de sentido direto	37	39	5	43	45	47
Alelo 2	CC	GG	GG	CC	GG	TT
Alelo 1	3	AA	3	3	3	GG
Posição do SNP	368	CO	172	607	CO	719
SEQ ID	-	CN	CO		m	CD
Locus Rps	3.8	3.8	3.8	3.8	3.8	3.8
Pos. no Cr.	100.6	CO ó o	101.7	101.7	103.0	113.8
LG*	LL	LL	LL	LL	LL	LL
Marcador	NS0114683	NS0101324	NS0102483	NS0119333	NS0102262	NS0116265

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Exemplo 2: Uso de marcadores de SNP para selecionar dos locus Rpslkopue confere resistência à raça 4 de PRR.

[00222] Marcadores de SNP foram usados com o conhecimento do germoplasma resistente à PRR para melhoramento da resistência à PRR (Tabela 11). A população F3 derivada do cruzamento de duas fontes de resistência à PPR AG3602, uma fonte de Rpslc, e AG3505, uma fonte de Rpslk, foi triada com dois marcadores de SNP. Um total de 466 indivíduos foram triados. Os marcadores de SNP NS0119335 e NS0118166 foram usados para selecionar para Rpslk com base no haplótipo de AG3505, uma fonte de resistência à raça 4 de PRR. Fontes de resistência Rps1 incluem, mas não são limitadas a AG3602, AG3505, e DKB28-53.

Tabela 11. Haplótipos de duas fontes de resistência à PRR.

	Marcador 1	Marcador 2
Fonte	NS0119335	NS0118166
AG3602 (Rpslc)	TT	CC
AG3505 (Rpslk)	AA	TT

Exemplo 3. Uso de marcadores de SNP para monitorar a introqressão do locus Rpslk de resistência à PRR.

[00223] Indivíduos F3 derivados de um cruzamento entre duas linhagens de soja AG3602 (Rpslc) e AG3505 (Rpslk) foram genotipados. O locus Rpslk fornece resistência à raça 4 de PRR. Um total de 466 plantas F3 são tríadas com dois marcadores de SNP NS0119335 e NS0118160. A Tabela 12 relata os resultados da validação fenotípica da triagem genotípica para raça 4 de PRR. A triagem com NS0119335 foi de 85,7% preditiva da reação à PRR. A triagem com NS0118160 foi de 83,8% preditiva da reação à PRR.

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Tabela 12. Resultados a partir de triagem fenotípica seguinte a seleção com base em haplótipo de fonte de resistência.

Marcador	Haplótipo Favorável	Indivíduos selecionados com base no haplótipo	Indivíduos com Reação Res.	% Resistente	Origem
NS0119335	AA	182	156	85,7	AG3602/A G3505
NS0118160	TT	185	155	83,8	AG3602/A G3505
Exemplo 4. U	so de marcadores de SNP para selecionar Rds3 ou Rds8

que conferem resistência à raça 25 de PRR.

[00224] Plantas F3 derivadas das seguintes populações de melhoramento foram genotipadas com o SNP marcador NS0114683. Rps3 e Rps8 fornecem resistência à raça 25 de PRR. As populações de melhoramento incluíram uma fonte de Rps3 ou Rps8. A Tabela 13 relata os resultados da validação fenotípica da triagem genotípica para a raça 25 de PRR. A triagem com NS0114683 Rps3 foi de 96,4 a 100% preditiva da reação à PRR. A triagem com NS0114683 Rps8 foi de

72,4 a 80,8% preditiva da reação à PRR.

Tabela 13. SNP marcador NS-0114683 foi usado para selecionar plantas com o haplótipo que combina com a fonte de resistência. Triagem fenotípica com raça 25 de PRR então foi conduzida.

Haplótipo Favorável	Indivíduos selecionados com base no haplótipo	Indivíduos com Reação Res.	% Resistente	Rps	Origem
CC	17	17	100,0	Rps3	Ivory/ DKB28-53
CC	48	47	97,9	Rps3	MV0033/CFN3303E3R
CC	28	27	96,4	Rps3	Ivory/ MV0036
CC	26	21	80,8	Rps8	DKB28-53/((Darby/OX- 98317)/AG2703))
CC	29	21	72,4	Rps8	MV0039/((Darby/OX98317)/MV0028))

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Exemplo 5. Introgressão de raça resistente à PRR específica usando marcadores de SNP.

[00225] Neste exemplo, L75-3735 foi a fonte de locus Rpslc de resistência à PRR. Populações de um cruzamento de L75-3735 com MV0030, uma linhagem suscetível à raça 3 de PRR, foram analisadas. Dois marcadores, NS0099413 e NS0119335, foram usados para selecionar indivíduos com haplótipos que combinam com aquele do parental resistente. Indivíduos homozigotos para os alelos presentes na fonte resistente à PRR (L75-3735) foram escolhidos para o progresso (Tabela 14).

Tabela 14. Uso de dois marcadores de SNP para triar quanto a resistência ou suscetibilidade à raça 3 de PRR.

Pedigree	# Morte	Total	% Susc.	Reação	NS0099413	NS0119335
L75-3735 (Rpslc)	0	11	0	R	CC	TT
MV0030	9	10	90	S	TT	AA
MV0030	5	10	50	S	TT	AA
L753735/MVO 030	0	10	0	R	CC	TT
L75-3735/ MV0030	10	10	100	S	TT	AA
L75-3735/ MV0030	5	10	50	S	CT	AT
L75-3735/ MV0030	4	10	40	H	CT	AT

Exemplo 6. Uso de marcadores de SNP para selecionar resistência à

PRR [00226] Marcadores de SNP adicionais foram identificados os quais flanquearam marcador NS0138011. Os alelos de NS0138011 foram associados com Rpslc. Foi mostrado que o alelo A indica a presença de Rpslc e o alelo C indica a ausência de Rpslc. A combinação de

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64/69 marcadores NS0202603, NS0138011, e NS0203225 demonstra a utilidade para distinguir múltiplos alelos no locus Rps1 incluindo rps (suscetível), Rpsla, Rpslc, e Rpslk. Em um estudo de 239 linhagens de soja, os haplótipos de três marcadores foram eficazes na predição da reação à PRR de 88 a 100% do tempo (Tabela 15). Em um programa de melhoramento de soja, os três marcadores podem ser usados para identificar plantas com resistência Rpsla, Rpslc, e Rpslk, dessa forma levando em conta seleção assistida de marcador.

Tabela 15. Capacidade de haplótipos de marcador de NS0202603, NS0138011, e NS0203225 para predizer a configuração de alelo de Rps1 para resistência à PRR.

Alelo Predito Rps1	Haplótipo NS0202603NS0138011NS0203225	# linhagens com haplótipo	# linhagens que mostram fenótipo do alelo predito*	% congruência
rps	GG CCAA	9	9	100
Rpsla	AACC TT	9	8	89
Rpslc	AAAAAA	189	186	98
Rpslk	GG CC TT	32	28*	88

são heterozigotos com base no fenótipo.

Exemplo 7. Uso de marcadores de SNP e conhecimento do genótipo parental para identificar Plantas Resistentes Rpslc [00227] NS0129030 é útil para seleção do alelo Rpslc em populações parentais do Grupo de Maturidade 3 tardio que têm Rpslc e são cruzados com os parentais do Grupo de Maturidade 4 suscetível. Por exemplo, quando AG3802, AG3905, AOX3903B0C, CFN3802A1X, ou AG3602 são usados como doadores de Rpslc em cruzamentos com linhagens suscetíveis à PRR MV0097, MV0098, MV0099, ou MV0022, todos os parentais resistentes têm o alelo C em NS0129030, enquanto todos os parentais suscetíveis têm o alelo A. Conhecimento do genótipo de fonte resistente é importante uma vez que a associação

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65/69 do alelo C com Rpslc não está presente em todas outras linhagens, como as linhagens suscetíveis MV0101, MV0102, e MV0103 também têm o alelo C neste locus. Por isso, em um programa de melhoramento de soja, o marcador NS0129030 pode ser usado com conhecimento do genótipo de fonte resistente para selecionar plantas resistentes.

[00228] NS0127084 é também útil em muitas das mesmas populações. Por exemplo, os doadores Rpslc AG3802, AG3905, AOX3903B0C, CFN3802C1X, ou AG3602 todos têm o alelo C no locus NS0127084, enquanto as linhagens suscetíveis MV0097, MV0099, e MV0100 todas têm o alelo T. Entretanto, MV0098 também tem o alelo C, mas necessita de Rpslc. Por isso, em um programa de melhoramento de soja, o marcador NS0127084 pode ser usado com conhecimento do genótipo de fonte resistente para selecionar plantas resistentes.

Exemplo 8. Uso de marcadores de SNP para selecionar Rps3c [00229] Uma população foi fornecida a partir do cruzamento de MV0031/BFN3205A0R, com BFN3205A0R como fonte de heterozigoto de Rps3c que confere resistência à raça 25 de Phytophthora sojae. Os haplótipos dos parentais e aquele de CFN3303E3R, uma linhagem irmã homozigota de BFN3205A0R, são fornecidos na Tabela 16. Um total de 4.224 sementes F2 foi não destrutivamente amostrado e genotipado. Sementes individuais foram selecionadas as quais eram homozigotas favoráveis para Rps3c. Um total de 1018 sementes tinha o haplótipo CCGGGG nos loci de marcador NS0119333, NS0102262, NS0116265 e foram selecionadas para plantio. Sementes F2 genotipadas como homozigotas favoráveis para Rps3c foram plantadas na primavera de 2006. Sementes F2:3 de plantas selecionadas foram plantadas como linhas de progênie em 2006-2007. Semente F2:4 agrupada a partir de linhas de progênie selecionadas foi cultivada em

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66/69 testes de rendimento em 2007. Quatro linhagens selecionadas para rendimento superior foram avaliadas para resistência à raça 25 de PRR para confirmar a presença de Rps3c. Dados de patologia são fornecidos na Tabela 18. Teste de patologia confirmou que a seleção assistida de marcador para resistência à raça 25 de Phytophthora soJae. A partir deste exemplo, os marcadores fornecidos têm mostrado uso para seleção assistida de marcador para resistência à PRR da raça 25 de Phytophthora sojae.

Tabela 16. Haplótipos de MV0031, BFN3205A0R e CFN3303E3R.

Linhagem	NS0119333	NS0102262	NS0116265
MV0031	AA	AA	GG
BFN3205A0R	AC	AG	TT
CFN3303E3R	CC	GG	GG
Tabela 17. Triaqem quanto a patoloqia para Rose	com raça 25 de

Phytoohthora sojae.

Linhagem	Replicações	Total de Plantas	Plantas Suscetíveis
1	3	24	0
2	3	24	0
3	3	24	0
4	3	24	0

Exemplo 9. Sondas de hibridizacão de oliqonucleotídeo úteis para detectar plantas de soja com loci de resistência à PRR [00230] Oligonucleotídeos também podem ser usados para detectar ou tipar os polimorfismos associados com a resistência à PRR descrita neste pedido por métodos de detecção SNP com base em hibridização. Oligonucleotídeos capazes de se hibridizar a sequências isoladas de ácidos nucleicos que incluem o polimorfismo são fornecidos. Está dentro da habilidade da técnica de desenhar ensaios com estringência experimentalmente determinada para discriminar entre os estados alélicos dos polimorfismos apresentados neste pedido. Ensaios exempla

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67/69 res incluem Southern blots, Northern blots, microarranjos, hibridização in situ, e outros métodos de detecção de polimorfismo com base em hibridização. Oligonucleotídeos exemplares para uso na detecção SNP com base em hibridização são fornecidos na Tabela 18. Estes oligonucleotídeos podem ser marcados detectavelmente com marcas radioativas, fluoróforos, ou outro quimioluminescente significa facilitar a detecção da hibridização para amostras de ácidos nucleicos genômicos ou amplificados derivados de uma ou mais plantas de soja usando métodos conhecidos na técnica.

Tabela 18. Hibridização de Sondas de Oliqonucleotídeo*

Marcador	SEQ ID do Marcador	Posição do SNP	Sonda de Hibridização	SEQ ID da Sonda
NS0119335	8	310	TCTCAGAGTGGGTAGA	101
NS0119335	8	310	TCTCAGTGTGGGTAGA	102
NS0138011	10	385	GAATGAAAAATCTACT	103
NS0138011	10	385	GAATGACAAATCTACT	104
NS0119333	14	607	TAAGAACCCTCTCCAA	105
NS0119333	14	607	TAAGAAACCTCTCCAA	106
NS0102262	15	131	AAGCCTGACAATTGAT	107
NS0102262	15	131	AAGCCTAACAATTGAT	108
* extensão do SNP de 1	6mer

Exemplo 10. Sondas de oliqonucleotídeo úteis para detectar plantas de soja com loci de resistência à PRR por métodos de extensão de base única [00231] Oligonucleotídeos também podem ser usados para detectar ou tipar os polimorfismos associados com a resistência à PRR descrita neste pedido por métodos de detecção de SNP com base em extensão de base única (SBE). Oligonucleotídeos exemplares para uso na detecção de SNP com base em SBE são fornecidos na Tabela 19. Métodos de SBE são baseados na extensão de um iniciador nucleotídico que é hibridizado a sequências adjacentes a um polimorfismo para in

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68/69 corporar um resíduo de nucleotídeo detectável na extensão do iniciador. Também se espera que o método SBE possa usar três oligonucleotídeos sintéticos. Dois dos oligonucleotídeos servem como iniciadores PCR e são complementares à sequência do locus que flanqueia uma região contendo o polimorfismo a ser analisado. Iniciadores PCR exemplares que podem ser usados para tipar polimorfismos descritos nesta invenção são fornecidos na Tabela 10 nas colunas marcadas SEQ ID do Iniciador de sentido direto e SEQ ID do Iniciador de sentido reverso. Seguinte a amplificação da região contendo o polimorfismo, o produto de PCR é hibridizado com um iniciador de extensão que anela no DNA amplificado adjacente ao polimorfismo. DNA polimerase e dois didesoxinucleosídeotrifosfatos diferencialmente marcados então são fornecidos. Se o polimorfismo estiver presente no molde, um dos didesoxinucleosídeotrifosfatos marcados pode ser adicionado ao iniciador em uma extensão de cadeia de base única. O alelo presente então é inferido pela determinação de qual das duas marcas diferenciais foi adicionada ao iniciador de extensão. Amostras homozigotas resultarão em somente uma das duas bases marcadas que são incorporadas e dessa forma somente uma das duas marcas será detectada. Amostras heterozigotas têm ambos os alelos presentes, e dirigirão dessa forma a incorporação de ambas as marcas (em moléculas diferentes do iniciador de extensão) e dessa forma ambas as marcas serão detectadas.

Tabela 19. Sondas (iniciadores de extensão) para ensaios de Extensão de Base Única (SBE).

Marcador	SEQ ID do Marcador	Posição do SNP	Sonda para SBE	SEQ ID da Sonda
NS0119335	8	310	AGACTCTCTCTCTCAGA	109
NS0119335	8	310	ATTGGATTTCTACCCAC	110
NS0138011	10	385	AAATTCCTGTGAATGAA	111
NS0138011	10	385	TTATTCAAAGTAGATTT	112

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Marcador	SEQ ID do Marcador	Posição do SNP	Sonda para SBE	SEQ ID da Sonda
NS0119333	14	607	TTTTTTAAATTAAGAAC	113
NS0119333	14	607	TGAAAGTGTTGGAGAGG	114
NS0102262	15	131	AAGTACTCCCAAGCCTG	115
NS0102262	15	131	ACAAGACAATCAATTGT	116

[00232] Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente invenção, deve ser evidente para pessoas versadas na técnica que a invenção pode ser modificada em preparação e detalhe sem se afastar de tais princípios. Reivindica-se todas as modificações que estão dentro do espírito e escopo das reivindicações adicionadas.

[00233] Todas as publicações e documentos patentes publicados citados neste pedido de patente estão incorporados neste pedido por referência na mesma medida como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para introgressão de um alelo em uma planta de soja, caracterizado pelo fato de que compreende:

   a. cruzamento de pelo menos uma planta de soja resistente à Podridão de Raiz por Phytophthora (PRR) com pelo menos uma outra planta de soja para formar uma população;

   b. triagem da dita população com pelo menos um marcador de ácido nucleico;

   c. seleção a partir da dita população de uma ou mais plantas de soja compreendendo um haplótipo associado com resistência à PRR, em que o referido haplótipo de resistência à PRR correspondendo ao locus Rps3 compreende pelo menos um selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 11 com o alelo de resistência AA na posição 368, SEQ ID NO: 12 com o alelo de resistência AA na posição 84, SEQ ID NO: 13 com o alelo de resistência GG na posição 187, SEQ ID NO: 14 com o alelo de resistência AA na posição 607, SEQ ID NO: 15 com o alelo de resistência AA na posição 131, e SEQ ID NO: 16 com o alelo de resistência GG na posição 719;

   em que pelo menos uma das plantas parentais é uma planta transgênica.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Rps3 compreende a Rps3a, Rps3b, e Rps3c.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a fonte de Rps3 é germoplasma de elite.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a fonte de Rps3 é germoplasma de acesso.