BR102016012586B1 - Métodos de identificação de uma planta de soja que exibe elevada resistência à podridão de raiz e caule de phytophthora, e de seleção assistida por marcador - Google Patents
Métodos de identificação de uma planta de soja que exibe elevada resistência à podridão de raiz e caule de phytophthora, e de seleção assistida por marcador Download PDFInfo
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Abstract
MÉTODOS DE SELEÇÃO ASSISTIDA E PARA IDENTIFICAR LOCUS GENÉTICO MARCADOR ASSOCIADO À PODRIDÃO DE RAIZ E CAULE DE PHYTOPHTHORA EM PLANTA DE SOJA, E USOS DAS DITAS PLANTAS DE SOJA. A presente invenção refere-se a métodos e composições para identificar plantas de soja que têm resistência elevada à podridão de raiz e caule de Phytophthora. Os métodos usam marcadores moleculares para identificar e para selecionar plantas com resistência elevada à podridão de raiz e caule de Phytophthora ou para identificar e desselecionar plantas com resistência reduzida à podridão de raiz e caule de Phytophthora. As plantas de soja geradas pelos métodos revelados também são um recurso da presente matéria.
Description
[001] O presente pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisório n° U.S. 62/170.441, depositado em 3 de junho de 2015, o qual é incorporado no presente documento, a título de referência, em sua totalidade.
[002] A cópia oficial da listagem de sequências é enviada eletronicamente através de EFS-Web como uma listagem de sequências em formato ASCII com um arquivo intitulado "77970-US- NP_20160601_Seq_Listing.txt", criado em 06/01/2016, e que tem o tamanho de 15,7 quilobytes, e é depositado concomitantemente com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida nesse documento em formato ASCII é parte do relatório descritivo, e é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.
[003] A matéria aqui revelada se refere a métodos úteis para aumentar a resistência à podridão de raiz e caule de Phytophthora em plantas de soja.
[004] A podridão de raiz e caule de Phytophthora (PRSR), causada pelo Phytophthora soja e patógeno transportado pelo solo, foi relatada na maioria das áreas de cultivo de soja por todo o mundo, visto que a mesma foi primeiro notada na Indiana, em 1948, e novamente em Ohio, em 1951 (Dorrance et al. 2007; Erwin e Ribeiro 1996; Kaufmann e Gerdemann 1958; Schmitthenner 1985). A PRSR foi classificada como a segunda doença de soja mais destrutiva após o nemátodo de cisto da soja (SCN) que suprimiu o rendimento de soja nos Estados Unidos de 1996 a 2009, o que causou as perdas de rendimento anual de 44,7 milhões bu (Koenning e Wrather 2010; Wrather e Koenning 2009).
[005] A implantação de cultivares de soja resistente a raça específica tem sido a estratégia primária para a administração de PRSR de modo que é altamente eficaz e economicamente e ambientalmente seguro em reduzir perdas de rendimento de soja de doença de Phytophthora (Dorrance et al. 2007; Dorrance e Schmitthenner 2000; Schmitthenner 1999). Até a presente data, aproximadamente 25 genes/alelos de Rps foram identificados, distribuídos em 19 loci por oito cromossomos diferentes. Cromossomo 3 (Chr. 3) (MLG N) tem a maior parte de genes/alelos de Rps mapeados, inclusive Rps1a, Rps1b, Rps1c, Rps1d, Rps1k, Rps7, Rps9, RpsUN1, RpsYu25, RpsYD29, e um gene de Rps anônimo relatado em uma cultivar japonesa "Waseshiroge" (Demirbas et al. 2001; Fan et al. 2009; Gao et al. 2005; Lin et al. 2013; Sugimoto et al. 2011; Sun et al. 2011; Weng et al. 2001; Wu et al. 2011a; Yao et al. 2010; Zhang et al. 2013). Dois genes de Rps, Rps2 e RpsUN2, foram mapeados no fim do Chr. 16 (MLG J), que é uma famosa região de aglomerado de gene de resistência (Kanazin et al. 1996; Lin et al. 2013; Polzin et al. 1994). Interessantemente, Rps3 (que contém três alelos 3-a, 3-b, 3-c) e Rps 8 foram mapeados para outra região rica em gene de resistência no Chr. 13 (MLG F) (Demirbas et al. 2001; Gordon et al. 2006). RpsJS, um gene de Rps recentemente identificado, é ligado com Rps4, Rps5, e Rps6 e todos os quais se localizam no curto braço do Chr. 18 (MLG G) (Demirbas et al. 2001; Sandhu et al. 2004; Sun et al. 2014). Em adição, RpsYB30, Rps ZS18, RpsSu e Rps10 foram mapeados para Chr. 19 (MLG L), Chr. 2 (MLG D1b), Chr. 10 (MLG O) e Chr. 17 (MLG D2), respectivamente (Wu et al. 2011b; Yao et al. 2010; Zhang et al. 2013; Zhu et al. 2007).
[006] Muitos desses genes de Rps já foram implantados de forma bem-sucedida em programas de criação de soja para controlar PRSR. No entanto, esses genes somente podem ser eficazes por 8 a 15 anos devido à evolução rápida e contínua do patógeno sob pressões de seleção (Schmitthenner 1985). Em adição, empiramidar genes de Rps conhecidos em um único cultivar pode não ser uma eficaz estratégia de criação a longo prazo devido ao fato de que uma população de patógeno recombinante poderia criar novas combinações de alelos de virulência tão rapidamente quanto criadores podem empilhar genes de resistência (McDonald and Linde 2002). Portanto, identificar genes de Rps inovadores ainda é necessário para administrar de forma eficaz a doença de Phytophthora.
[007] Um locus de resistência a Phytophthora inovador é identificado nesta revelação. Em adição, marcadores ligados ao locus de resistência a Phytophthora inovador revelado também são identificados. Os marcadores que são ligados ao locus de resistência a Phytophthora inovador incluem marcadores de SSR, InDel e SNP. Os marcadores identificados nesta revelação podem ser usados para determinação de genótipo de resistência a Phytophthora para suportar um programa de criação. Usar os marcadores aqui revelados para realizar a determinação de genótipo de resistência a Phytophthora no suporte de um programa de criação fornece, dentre outros benefícios: economias de custo e tempo; seleção precoce de progênie desejada; e comercialização mais rápida e precisa de variedades de soja resistente a Phytophthora. Os genes candidatos que se submetem ao fenótipo para o locus de resistência a Phytophthora inovador revelado no presente documento também são descritos.
[008] Em uma modalidade, os métodos para identificar uma planta de soja que exibe resistência elevada a PRSR, que compreende detectar no germoplasma da planta de soja pelo menos um alelo de um locus marcador são fornecidos. O locus marcador está no cromossomo 7, e se localiza dentro de um intervalo cromossômico que compreende e é BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C, e o pelo menos associado à resistência elevada a PRSR. Em algumas específicas, o locus marcador pode ser selecionado qualquer um dos loci BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T, BARCSOYSSR_07_0289, BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T, BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, InDel_2, InDel_1, BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G, BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T, BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A, BARCSOYSSR_07_0300 e marcadores a seguir: BARCSOYSSR_07_0286, BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C, Gm07_5480878_G_A, BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, BARCSOYSSR_07_0297, BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C, BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C, BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C, assim como qualquer outro marcador que é ligado a esses marcadores. Em algumas modalidades, o locus marcador está no cromossomo 7, e se localiza dentro do intervalo que compreende e é flanqueado por BARCSOYSSR_07_0295 e InDel_1, e compreende pelo menos um alelo que é associado à resistência elevada a PRSR. Em algumas modalidades específicas, o locus marcador pode ser selecionado a partir de qualquer um dos BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, qualquer outro marcador que é algumas modalidades, o locus selecionado a partir do grupo que consiste em Glyma.07G62500, Glyma.07G62600, Glyma.07G62700, Glyma.07G62800 e Glyma.07G62900. As plantas de soja identificadas por esse método também são de interesse.
[009] Em outra modalidade, os métodos para identificar plantas de soja com resistência elevada a PRSR através da detecção de um haplótipo no germoplasma da planta de soja são fornecidos. O haplótipo compreende alelos em um ou mais loci marcadores, em que os um ou mais loci marcadores são encontrados no cromossomo 7 dentro do intervalo que compreende e é flanqueado por BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T e BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C. Em algumas modalidades específicas, o locus marcador pode ser selecionado a partir de BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A, BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C, BARCSOYSSR_07_0300 e BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C, assim como qualquer outro marcador que é ligado a esses marcadores. Em algumas modalidades, o haplótipo compreende alelos em um ou mais loci marcadores, em que os um ou mais loci marcadores são encontrados no cromossomo 7 dentro do intervalo que compreende e é flanqueado por BARCSOYSSR_07_0295 e InDel_1. Em algumas modalidades específicas, o locus marcador pode ser selecionado a partir de qualquer um dos loci marcadores a seguir: BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, InDel_1 e InDel_1, assim como qualquer outro marcador que é ligado a esses marcadores. O haplótipo é associado à resistência elevada a PRSR. Em algumas modalidades, o locus marcador compreende um gene selecionado a partir do grupo que consiste em Glyma.07G62500, Glyma.07G62600, Glyma.07G62700, Glyma.07G62800 e Glyma.07G62900. As plantas de soja identificadas por esse método também são de interesse.
[0010] Em uma modalidade adicional, os métodos de selecionar plantas com resistência elevada a PRSR são fornecidos. Em um aspecto, uma primeira planta de soja é obtida que tem pelo menos um alelo de um locus marcador em que o alelo é associado à resistência elevada a PRSR. O locus marcador pode ser encontrado no cromossomo 7, dentro do intervalo que compreende e é flanqueado por BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T e BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C, e em algumas modalidades específicas o locus marcador pode ser encontrado dentro do intervalo que compreende e é flanqueado por BARCSOYSSR_07_0295 e InDel_1. A primeira planta de soja pode ser cruzada com uma segunda planta de soja, e a progênie resultante do cruzamento pode ser avaliada para o alelo da primeira planta de soja. As plantas progênitas que possuem o alelo da primeira planta de soja podem ser selecionadas como por ter resistência elevada a PRSR. Em algumas modalidades, o locus marcador compreende um gene selecionado a partir do grupo que consiste em Glyma.07G62500, Glyma.07G62600, Glyma.07G62700, Glyma.07G62800 e Glyma.07G62900. As plantas de soja selecionadas por esse método também são de interesse.
[0011] A presente matéria pode ser mais plenamente compreendida a partir da descrição detalhada a seguir e dos desenhos e listagem de sequências anexos os quais formam uma parte deste pedido. A listagem de sequências contém o código de letras para caracteres de sequência de nucleotídeo e os códigos de três letras para aminoácidos como definido em conformidade com os padrões de IUPAC-IUBMB descritos em Nucleic Acids Research 13:3021-3030 (1985) e no Biochemical Journal 219 (n° 2): 345-373 (1984) que são incorporados no presente documento a título de referência em suas totalidades. Os símbolos e formatos usados para nucleotídeo e dados de sequência de aminoácido satisfazem as regras definidas em 37 C.F.R. §1.822.
[0012] A Figura 1 ilustra o local para Rps11 com base na distribuição de SNP dissimilar entre os volumes resistentes e suscetíveis. O eixo y indica três tipos diferentes de SNPs no Chr. 07. T1 representa SNPs que são homozigotos como os alelos suscetíveis em Williams. T3 representa SNPs que são homozigotos como os alelos resistentes em PI 594527. T2 representa SNPs que são heterozigotos com alelos de ambos os precursores. O eixo x mostra a posição física dos SNPs. O intervalo entre a e b indica a região potencial para Rps11.
[0013] A Figura 2 ilustra os mapas genético e físico do Rps11 no Chr. 7. A Figura 2(a) é um mapa de ligação genética de Rps11. Os nomes de marcador são listados na esquerda e distâncias genéticas (cM) são na direita. *abreviação de "BARCSOYSSR_07_0241". A Figura 2(b) mostra posições físicas de marcadores de SSR determinadas por BLAST que buscam as próprias sequências iniciadoras em comparação com genoma de referência de soja (Glyma1.1) no site da web SoyBase. Os números em parênteses representam a posição inicial dos marcadores em pares básicos (bp). O intervalo de Rps11 é destacado com a cor preta. A Figura 2(c) mostra o local físico do intervalo de Rps11 no genoma de referência Williams 82. As barras indicam dois braços do Chr. 07, e o círculo indica a posição aproximada da região centrométrica.
[0014] A Figura 3 ilustra a região 61 kb no cromossomo 7 que contém o locus de Rps11, marcadores associados e cinco modelos de gene previstos na região. Os mapas de 10 recombinantes F3 são mostrados.
[0015] As SEQ ID NOs: 1 a 33, e 54 são o flanqueado de sequências e inclusive os SNPs usados para projetar ensaios no SoySNP8K BeadChip e/ou para determinação de genótipo KASP™.
[0016] As SEQ ID NOs: 34 a 53 e 55 a 60 são os iniciadores de avanço e reverso para os marcadores de SSR mapeados no cromossomo 7.
[0017] A presente matéria fornece métodos para identificar e selecionar plantas de soja com resistência elevada a PRSR. As definições a seguir são fornecidas como um auxílio para compreender a matéria revelada no presente documento.
[0018] O termo "alelo" se refere a uma dentre duas ou mais sequências de nucleotídeos diferentes que ocorrem em um locus específico. Um alelo é "associado a" um traço quando é ligado ao mesmo e quando a presença do alelo é um indicador de que o traço ou forma de traço desejada irá ocorrer em uma planta que compreende o alelo.
[0019] "Retrocruzamento" se refere ao processo usado para introduzir uma sequência de ácido nucleico em plantas. A técnica de retrocruzamento foi amplamente usada por décadas para introduzir novos traços em plantas. Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988. Em um protocolo de retrocruzamento típico, a variedade original de interesse (precursor recorrente) é cruzada com uma segunda variedade (precursor não recorrente) que transporta um gene de interesse a ser transferido. As progênies resultantes desse cruzamento são então cruzadas novamente com o precursor recorrente, e o processo é repetido até que uma planta seja obtida em que essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas desejadas da planta recorrente sejam recuperadas na planta convertida, em adição ao gene transferido do precursor não recorrente.
[0020] Um centimorgan ("cM") é uma unidade de medida de frequência de recombinação. Um cM é igual a uma chance de 1% de que um marcador em um locus genético será separado de um marcador em um segundo locus devido ao cruzamento em uma única geração.
[0021] O "intervalo cromossômico" designa uma amplitude linear contígua de DNA genômico que reside em planta em um único cromossomo. Os elementos genéticos ou genes localizados em um único intervalo cromossômico são fisicamente ligados. O tamanho de um intervalo cromossômico não é particularmente limitado. Em alguns aspectos, os elementos genéticos localizados dentro de um único intervalo cromossômico são geneticamente ligados, tipicamente com uma distância de recombinação genética de, por exemplo, menos que ou igual a 20 cM ou, alternativamente, menos que ou igual a 10 cM. Isto é, dois elementos genéticos dentro de um único intervalo cromossômico são submetidos a recombinação em uma frequência de menos que ou igual a 20% ou 10%.
[0022] O termo "intervalo cromossômico" designa qualquer e todos os intervalos definidos por qualquer um dos marcadores apresentados na matéria aqui revelada. Um intervalo cromossômico que se correlaciona com resistência elevada a PRSR é fornecido. Esse intervalo, localizado no cromossomo 7, compreende e é flanqueado por BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T e BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C. Um subintervalo de intervalo cromossômico BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T e BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C é BARCSOYSSR_07_0295 e InDel_1.
[0023] O termo "complementar" se refere a uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma dada sequência de nucleotídeo, isto é, as sequências se relacionam pelas regras de pareamento base.
[0024] O termo "DNA contíguo" se refere a sobrepor fragmentos genéticos contíguos.
[0025] O termo "cruzado" ou "cruzamento" significa a fusão de gametas através de polinização para produzir progênie (por exemplo, células, sementes ou plantas). O termo abrange ambos os cruzamentos sexuais (a polinização de uma planta por outra) e autossuficientes (autopolinização, por exemplo, quando o pólen e óvulo são da mesma planta). O termo "cruzar" se refere ao ato de fundir gametas através de polinização para produzir progênie.
[0026] Um "alelo favorável" é o alelo em um locus específico que confere, ou contribui para, um fenótipo desejável, por exemplo, resistência elevada a PRSR ou, alternativamente, é um alelo que permite a identificação de plantas com resistência reduzida a PRSR que podem ser removidas de um programa de criação ou plantio ("contrasseleção"). Um alelo favorável de um marcador é um alelo marcador que segrega com o fenótipo favorável ou, alternativamente, segrega com o fenótipo de planta desfavorável que, desse modo, fornece o benefício de identificar plantas.
[0027] Um "mapa genético" é uma descrição de relação de ligação genética dentre loci em um ou mais cromossomos (ou cromossomos) dentro de uma dada espécie, geralmente retratado em uma forma diagramática ou tabular. Para cada mapa genético, as distâncias entre loci são medidas pelas frequências de recombinação entre as mesmas, e recombinações entre loci podem ser detectadas com o uso de uma variedade de marcadores genéticos moleculares (também chamados de "marcadores moleculares", "marcadores genéticos" ou, simplesmente, "marcadores"). Um mapa genético é um produto da população de mapeamento, tipos de marcadores usados, e o potencial polimórfico de cada marcador entre diferentes populações. A ordem e as distâncias genéticas entre loci podem diferir de um mapa genético para outro. Entretanto, informações tal como posição e ordem de marcador podem ser correlacionadas entre mapas através da determinação do local físico dos marcadores no cromossomo de interesse, com o uso de um genoma de referência de soja, tal como por exemplo, Glyma1.1, que está publicamente disponível no site da web SoyBase. Um indivíduo de conhecimento comum na técnica pode usar um navegador de genoma publicamente disponível para determinar o local físico de marcadores em um cromossomo.
[0028] O termo "marcador genético" deve se referir a qualquer tipo de marcador com base em ácido nucleico, inclusive, mas não limitado a, Polimorfismo de Comprimento de Fragmento de Restrição (RFLP), DNA Polimórfico Amplificado Aleatório (RAPD) de Repetição de Sequência Simples (SSR), Sequências Polimórficas Amplificadas Clivadas (CAPS) (Rafalski e Tingey, 1993, Trends in Genetics 9:275 a 280), Polimorfismo de Comprimento de Fragmento Amplificado (AFLP) (Vos et al, 1995, Nucleic Acids Res. 23:4407 a 4414), Polimorfismo de Nucleotídeo Único (SNP) (Brookes, 1999, Gene 234:177 a 186), Região Amplificada Caracterizada em Sequência (SCAR) (Pecan e Michelmore, 1993, Theor. (PCT) Genet, 85:985 a 993), Site Etiquetado em Sequência (STS) (Onozaki et al. 2004, Euphytica 138:255 a 262), Polimorfismo Conformacional de Fita Único (SSCP) (Orita et al., 1989, Proc Natl Aced Sci EUA 86:2766 a 2770). Repetição de Sequência Intersimples (ISR) (Blair et al. 1999, Theor. (PCT) Genet. 98:780 a 792), Polimorfismo Amplificado de Interretrotransposão (IRAP), Polimorfismo Amplificado de Microssatélite de Retrotransposão (REMAP) (Kalendar et al., 1999, Theor. (PCT) Genet 98:704 a 711), um produto de clivagem de RNA (tal como uma etiqueta Lynx) e semelhantes.
[0029] A "frequência de recombinação genética" é a frequência de um evento de cruzamento (recombinação) entre dois loci genéticos. A frequência de recombinação pode ser observada por seguir a segregação de marcadores e/ou traços que seguem a meiose.
[0030] O "genoma" se refere ao DNA total, ou todo o conjunto de genes, transportado por um cromossomo ou conjunto de cromossomos.
[0031] O termo "genótipo" é a constituição genética de um indivíduo (ou grupo de indivíduos) em um ou mais loci genéticos, conforme contrastado com o traço observável (o fenótipo). O genótipo é definido pelo(s) alelo(s) de um ou mais loci conhecidos que o indivíduo herdou de seus precursores. O termo genótipo pode ser usado para se referir a uma constituição genética do indivíduo em um único locus, em múltiplas orientações, ou, de uma forma mais geral, o termo genótipo pode ser usado para se referir a uma constituição genética do indivíduo para todos os genes em seu genoma.
[0032] "Germoplasma" se refere a material genético de um ou do indivíduo (por exemplo, uma planta), um grupo de indivíduos (por exemplo, uma linha, variedade ou família de planta), ou um clone derivado de uma linha, variedade, espécie ou cultura. O germoplasma pode ser parte de um organismo ou célula, ou pode estar separado do organismo ou célula. Em geral, o germoplasma fornece material genético com uma constituição molecular específica que fornece uma fundação física para algumas ou todas as qualidades hereditárias de uma cultura de célula ou organismo. Conforme usado no presente documento, o germoplasma inclui células, semente ou tecidos dos quais novas plantas podem ser plantadas, ou partes de planta, tal como folhas, caules, pólen ou células que podem ser cultivadas em toda uma planta.
[0033] Um "haplótipo" é o genótipo de um indivíduo em uma pluralidade de loci genéticos, isto é, uma combinação de alelos. Tipicamente, os loci genéticos descritos por um haplótipo são fisicamente e geneticamente ligados, isto é, no mesmo segmento de cromossomo. O termo "haplótipo" pode se referir a polimorfismos em sequência em um locus específico, tal como um único locus marcador, ou polimorfismos em sequência em múltiplos loci ao longo de um segmento cromossômico em um dado genoma. O anterior também pode ser chamado de "haplótipos marcadores" ou "alelos marcadores", embora o último possa ser chamado de "haplótipos de longo alcance".
[0034] O termo "heterozigotos" significa uma condição genética em que diferentes alelos residem em loci correspondentes em cromossomos homólogos.
[0035] O termo "homozigotos" significa uma condição genética em que alelos idênticos residem em loci correspondentes em cromossomos homólogos.
[0036] A "hibridização" ou "hibridização de ácido nucleico" se refere ao pareamento de fitas de RNA e DNA complementares assim como o pareamento de fitas únicas de DNA complementar.
[0037] O termo "hibridizar" significa a formação de pares básicos entre regiões complementares de fitas de ácido nucleico.
[0038] O termo "introgreção" ou "introgredir" se refere à transmissão de um alelo desejado de um locus genético de um fundo genético para outro. Por exemplo, a introgreção de um alelo desejado em um locus especificado pode ser transmitida para pelo menos uma progênie através de um cruzamento sexual entre dois precursores da mesma espécie, em que pelo menos um dos precursores tem o alelo desejado em seu genoma. Alternativamente, por exemplo, a transmissão de um alelo pode ocorrer por recombinação entre dois genomas doadores, por exemplo, em um protoplasto fundido, em que pelo menos um dos protoplastos doadores tem o alelo desejado em seu genoma. O alelo desejado pode ser, por exemplo, um alelo selecionado de um marcador, loci de traço quantitativo (QTL), um transgene ou semelhantes. Em qualquer caso, a descendência que compreende o alelo desejado pode ser repetidamente retrocruzada com uma linha que tem um fundo genético desejado e selecionado para o alelo desejado, para resultar no alelo se tornar fixo em um fundo genético selecionado. Por exemplo, o locus de cromossomo 7 descrito no presente documento pode ser introgredido em um precursor recorrente que é suscetível a PRSR. A linha precursora recorrente com o gene ou locus introgredido então tem resistência elevada à PRSR.
[0039] Conforme usado no presente documento, o termo "ligação" ou "ligado" é usado para descrever o grau com que um locus marcador é associado a outro locus marcador ou algum outro locus (por exemplo, um locus de PRSR). A relação de ligação entre um marcador molecular e um fenótipo é dada como uma "probabilidade" ou "probabilidade ajustada". A ligação pode ser expressada como um limite ou alcance desejado. Por exemplo, em algumas modalidades, qualquer marcador é ligado (genética e fisicamente) a qualquer outro marcador quando os marcadores são separados por menos que 50, 40, 30, 25, 20 ou 15 unidades de mapa por cM). Em alguns aspectos, é vantajoso definir um alcance de ligação escalonado, por exemplo, entre 10 e 20 cM, entre 10 e 30 cM ou entre 10 e 40 cM. Quanto mais aproximadamente um marcador estiver ligado a um segundo locus, melhor um indicador para o segundo locus tal marcador se torna. Desse modo, "loci aproximadamente ligados" tal como um locus marcador e um segundo locus exibem uma frequência de recombinação interlocus de 10% ou menos, preferivelmente de cerca de 9% ou menos, ainda mais preferivelmente de cerca de 8% ou menos, mais preferivelmente ainda de cerca de 7% ou menos, ainda mais preferivelmente de cerca de 6% ou menos, mais preferivelmente ainda de cerca de 5% ou menos, ainda mais preferivelmente de cerca de 4% ou menos, mais preferivelmente ainda de cerca de 3% ou menos e ainda mais preferivelmente de cerca de 2% ou menos. Em modalidades altamente preferenciais, os loci relevantes exibem uma frequência de recombinação de cerca de 1% ou menos, por exemplo, cerca de 0,75% ou menos, mais preferivelmente de cerca de 0,5% ou menos ou mais preferivelmente ainda de cerca de 0,25% ou menos. Dois loci que se localizam no mesmo cromossomo, e em tal distância em que a recombinação entre os dois loci ocorre em uma frequência de menos que 10 (por exemplo, cerca de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25%, ou menos) também são ditos como "próximos" um ao outro. Visto que um cM é a distância entre dois marcadores que mostram uma frequência de recombinação de 1%, qualquer marcador é aproximadamente ligado (genética e fisicamente) a qualquer outro marcador que está em proximidade próxima, por exemplo, em ou menos que 10 cM de distância. Dois marcadores ligados aproximadamente no mesmo cromossomo podem ser posicionados a 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5 ou 0,25 cM ou menos um do outro.
[0040] O termo "desequilíbrio de ligação" se refere a uma segregação não aleatória de loci genéticos ou traços para ambos). Em qualquer dos casos, desequilíbrio de ligação implica que os loci relevantes estão dentro de proximidade física suficiente ao longo de um comprimento de um cromossomo de modo que os mesmos segreguem juntamente com frequência (no caso de traços de cossegregação, os loci que baseiam os traços estão em proximidade suficiente um ao outro) maior que aleatória (isto é, não aleatória). Marcadores que mostram desequilíbrio de ligação são considerados ligados. Os loci ligados cossegregam mais de 50% do tempo, por exemplo, a partir de cerca de 51% a cerca de 100% do tempo. Em outras palavras, dois marcadores que cossegregam têm uma frequência de recombinação de menos que 50% (e, por definição, são separados por menos que 50 cM no mesmo cromossomo). Conforme usado no presente documento, a ligação pode ser entre dois marcadores, ou alternativamente entre um marcador e um fenótipo. Um locus marcador pode ser "associado a" (ligado a) um traço, por exemplo, resistência elevada a PRSR. O grau de ligação de um marcador molecular para um traço fenotípico é medido, por exemplo, como uma probabilidade estatística de cossegregação de tal marcador molecular com o fenótipo.
[0041] O desequilíbrio de ligação é mais comumente avaliado com o uso da medida r2, que é calculada com o uso da formula descrita por Hill, W. G. e Robertson, A, Theor Appl. Genet 38:226 a 231 (1988). Quando r2=1, um LD completo existe entre os dois loci marcadores, o que significa que os marcadores não foram separados por recombinação e têm a mesma frequência de alelo. Os valores para r2 acima de 1/3 indicam que LD suficientemente forte é útil para mapeamento (Ardlie em al., Nature Reviews Genetics 3:299 a 309 (2002)). Então, alelos estão em desequilíbrio de ligação quando valores de r2 entre loci marcadores em pares são maiores que ou igual a 0,33, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, ou 1,0.
[0042] Conforme usado no presente documento, o "equilíbrio de ligação" descreve uma situação em que dois marcadores segregam, independentemente, isto é, escolhem dentre progênie aleatoriamente. Os marcadores que mostram equilíbrio de ligação são considerados desligados (estando ou não no mesmo cromossomo).
[0043] O "valor do logaritmo de probabilidades (LOD)" ou "pontuação LOD" (Risch, Science 255:803 a 804 (1992)) é usado em mapeamento de intervalo para descrever o grau de ligação entre dois loci marcadores. Uma pontuação LOD de três entre dois marcadores indica que a ligação é 1.000 vezes mais propensa que nenhuma ligação, enquanto que uma pontuação LOD de dois indica que a ligação é 100 vezes mais propensa que nenhuma ligação. As pontuações LOD maiores que ou iguais a dois podem ser usadas para detectar ligação.
[0044] "Locus" e "locus marcador" são usados intercambiavelmente no presente documento e significam uma posição em um cromossomo em que um gene e/ou marcador se localiza.
[0045] Conforme usado no presente documento, o termo "população de mapeamento" pode se referir a uma população de planta usada para mapeamento de gene. As populações de mapeamento são, tipicamente, obtidas a partir de cruzamentos controlados de genótipos precursores. As decisões na seleção de precursores e design de mapeamento para o desenvolvimento de uma população de mapeamento, e o tipo de marcadores usados, depende do gene a ser mapeado, da disponibilidade de marcadores e do mapa molecular. Os precursores de plantas dentro de uma população de mapeamento devem ter variação suficiente para o(s) traço(s) de interesse tanto na sequência de ácido nucleico como no nível de fenótipo. A variação da sequência de ácido nucleico dos precursores é usada para traçar eventos de recombinação nas plantas da população de mapeamento. A disponibilidade de marcadores polimórficos informativos depende de a quantidade de variação de sequência de ácido nucleico.
[0046] Um "marcador" é uma sequência de nucleotídeo ou produto codificado do mesmo (por exemplo, uma proteína) usado como um ponto de referência. Para que os marcadores sejam úteis em detectar recombinações, os mesmos precisam detectar diferenças, ou polimorfismos, dentro da população que é monitorada. Para marcadores moleculares, isso significa diferenças no nível de DNA devido a diferenças de sequência de polinucleotídeos (por exemplo, SSRs, RFLPs, FLPs, SNPs). A variabilidade genômica pode ser de qualquer origem, por exemplo, inserções, deleções, duplicações, elementos repetitivos, mutações de ponto, eventos de recombinação ou a presença e sequência de elementos transponíveis. Os marcadores moleculares podem ser derivados de ácidos nucleicos genômicos ou expressados (por exemplo, ESTs) e também podem se referir a ácidos nucleicos usados como sondas ou pares iniciadores com capacidade de amplificar fragmentos de sequência através do uso de métodos com base em PCR. Um grande número de marcadores moleculares de soja é conhecido na técnica, e estão publicados ou disponíveis a partir de várias fontes, tal como o recurso de internet SoyBase.
[0047] Os marcadores correspondentes a polimorfismos genéticos entre membros de uma população podem ser detectados por métodos bem estabelecidos na técnica. Esses incluem, por exemplo, sequenciamento de DNA, métodos de amplificação de sequência específicos com base em PCR, detecção de polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), detecção de marcadores de isozima, detecção de polimorfismos de polinucleotídeo por hibridização alelo-específica (ASH), detecção de sequências varáveis amplificadas do genoma da planta, detecção de replicação de sequência autossustentada, detecção de sequências simples repetidas (SSRs), detecção de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) ou detecção de polimorfismos de comprimento de fragmento amplificado (AFLPs). Os métodos bem estabelecidos também são conhecidos pela detecção de etiquetas de sequência expressada (ESTs) e marcadores de SSR derivados de sequências de EST e DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD).
[0048] Um "alelo marcador", alternativamente um "alelo de um locus marcador", pode se referir a um dentre uma pluralidade de sequências polimórficas de nucleotídeos encontrado em um locus marcador em uma população que é polimórfica para o locus marcador.
[0049] A "seleção assistida por marcador" (ou MAS) é um processo pelo qual fenótipos são selecionados com base em genótipos marcadores.
[0050] A "contrasseleção assistida por marcador" é um processo pelo qual genótipos marcadores são usados para identificar plantas que não serão selecionadas, o que permite que os mesmos sejam removidos de um programa de criação ou plantio.
[0051] Um "locus marcador" é um local de cromossomo específico no genoma de uma espécie quando um marcador específico pode ser encontrado. Um locus marcador pode ser usado para rastrear a presença de um segundo locus ligado, por exemplo, um locus ligado que codifica ou contribui para a expressão de um traço fenotípico. Por exemplo, um locus marcador pode ser usado para monitorar a segregação de alelos em um locus, tal como um QTL ou gene único, que são genética ou fisicamente ligados ao locus marcador.
[0052] Uma "sonda marcadora" é uma sequência de adição nucleica ou molécula que pode ser usada para identificar a presença de um locus marcador, por exemplo, uma sonda de ácido nucleico que é complementar a uma sequência de locus marcador, através de hibridização de adição nucleica. As sondas marcadoras que compreendem 30 ou mais nucleotídeos contíguos do locus marcador ("toda ou uma porção" da sequência de locus marcador) podem ser usadas para hibridização de ácido nucleico. Alternativamente, em alguns aspectos, uma sonda marcadora se refere a uma sonda de qualquer tipo que tem capacidade de distinguir (isto é, genótipo) o alelo específico que está presente em um locus marcador.
[0053] O termo "marcador molecular" pode ser usado para se referir a um marcador genético, como definido acima, ou um produto codificado do mesmo (por exemplo, uma proteína) usado como um ponto de referência durante a identificação de um locus ligado. Um marcador pode ser derivado de sequências de nucleotídeos genômicos ou de sequências de nucleotídeos expressados (por exemplo, de um RNA submetido a splicing, um cDNA, etc.), ou de um polipeptídeo codificado. O termo também se refere a sequências de ácido nucleico complementares a, ou que flanqueiam, as sequências de marcador, tal como ácidos nucleicos usados como sondas ou pares iniciadores com capacidade de amplificar a sequência de marcador. Uma "sonda marcadora molecular" é uma sequência de ácido nucleico ou molécula que pode ser usada para identificar a presença de um locus marcador, por exemplo, uma sonda de ácido nucleico que é complementar a uma sequência de locus marcador. Alternativamente, em alguns aspectos, uma sonda marcadora se refere a uma sonda de qualquer tipo que tem capacidade de distinguir (isto é, genótipo) o alelo específico que está presente em um locus marcador. Ácidos nucleicos são "complementares" quando os mesmos hibridizam especificamente em solução, por exemplo, de acordo com as regras de pareamento de base de Watson-Crick. Alguns dos marcadores descritos no presente documento também são chamados de marcadores de hibridização quando localizados em uma região InDel, tal como a região não colinear descrita no presente documento. Isso se deve ao fato de que a região de inserção é, por definição, um polimorfismo perante uma planta sem a inserção. Desse modo, o marcador somente precisa indicar se a região InDel está presente ou ausente. Qualquer tecnologia de detecção de marcador adequada pode ser usada para identificar tal marcador de hibridização, por exemplo, a tecnologia de SNP é usada nos exemplos fornecidos no presente documento.
[0054] "Sequência de nucleotídeo", "polinucleotídeo", "sequência de ácido nucleico" e "fragmento de ácido nucleico" são usados intercambiavelmente e se referem a um polímero de RNA ou DNA que tem fita única ou dupla, que contém, opcionalmente, bases de nucleotídeo sintético, não natural ou alterado. Um "nucleotídeo" é uma unidade monomérica da qual polímeros de DNA ou RNA são construídos, e consiste em uma base de purina ou pirimidina, uma pentose e um grupo de ácido fosfórico. Os nucleotídeos (normalmente encontrados na forma de monofosfato de 5') são chamados pela designação de letra única dos mesmos da seguinte forma: "A" para adenilato ou deoxiadenilato (para RNA ou DNA, respectivamente), "C" para citidilato ou deoxicitidilato. "G" para guanilato ou deoxiguanilato. "U" para uridilato, "T" para deoximidilato, "R" para purinas (A ou G), "Y" para pirimidinas (C ou T), "K" para G ou T, "H" para A ou C ou T, "I" para inosina, e "N" para qualquer nucleotídeo.
[0055] Os termos "fenótipo" ou "traço fenotípico" ou "traço" se referem a um ou mais traços de um organismo. O fenótipo pode ser observável a olho nu, ou por quaisquer outros meios de avaliação conhecidos na técnica, por exemplo, microscopia, análise bioquímica ou um ensaio eletromecânico. Em alguns casos, um fenótipo é diretamente controlado por um gene único ou locus genético, isto é, um "traço de gene único". Em outros casos, um fenótipo é o resultado de diversos genes.
[0056] Um "mapa físico" do genoma é um mapa que mostra a ordem linear de marcos identificáveis (inclusive genes, marcadores, etc.) em DNA de cromossomo. Entretanto, em contraste com mapas genéticos, as distâncias entre marcos são absolutas (por exemplo, medidas em pares básicos ou fragmentos genéticos contíguos em sobreposição e isolados) e não com base em recombinação genética.
[0057] Uma "planta" pode ser uma planta inteira, qualquer parte da mesma, ou uma célula ou cultura de tecido derivada de uma planta. Desse modo, o termo "planta" pode se referir a qualquer dentre: plantas inteiras, componentes de planta ou órgãos (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), tecidos de planta, sementes, células de planta e/ou progênie da mesma. Uma célula de planta é uma célula de uma planta, tirada de uma planta, ou derivada através de cultura de uma célula tirada de uma planta.
[0058] Um "polimorfismo" é uma variação no DNA que é muito comum para ser meramente devido a uma nova mutação. Um polimorfismo deve ter uma frequência de pelo menos 1% em uma população. Um polimorfismo pode ser um polimorfismo de nucleotídeo único, ou SNP, ou um polimorfismo por inserção/deleção, também chamado no presente documento de um "InDel".
[0059] O "valor de probabilidade" ou "valor p" é a probabilidade estatística de que a combinação específica de um fenótipo e a presença ou ausência de um alelo marcador específico é aleatória. Desse modo, quanto menor for a pontuação de probabilidade, maior será a probabilidade de que um fenótipo e um marcador específico irão cossegregar. Em alguns aspectos, a pontuação de probabilidade é considerada "significativa" ou "não significativa". Em algumas modalidades, uma pontuação de probabilidade de 0,05 (p=0,05, ou uma probabilidade de 5%) de sortimento aleatório é considerada como uma indicação significativa de cossegregação. Entretanto, uma probabilidade aceitável pode ser qualquer probabilidade de menos que 50% (p=0,5). Por exemplo, uma probabilidade significativa pode ser de menos que 0,25, menos que 0,20, menos que 0,15, menos que 0,1, menos que 0,05, menos que 0,01 ou menos que 0,001.
[0060] O termo "progênie" se refere à descendência gerada de um cruzamento.
[0061] Uma "planta progênita" é gerada de um cruzamento entre duas plantas.
[0062] Uma "sequência de referência" é uma sequência definida usada como uma base para comparação de sequência. A sequência de referência é obtida através da determinação de genótipo de diversas linhas no locus, do alinhamento das sequências de nucleotídeos em um programa de alinhamento de sequência (por exemplo, Sequencher) e, então, da obtenção da sequência de consenso do alinhamento.
[0063] Um "polimorfismo de nucleotídeo único (SNP)" é uma variação de sequência de DNA que ocorre quando um único nucleotídeo — A, T, C ou G — no genoma (ou outra sequência compartilhada) difere entre membros de uma espécie biológica ou cromossomos pareados em um indivíduo. Por exemplo, dois fragmentos de DNA em sequência a partir de indivíduos diferentes, AAGCCTA a AAGCTTA, contêm uma diferença em um único nucleotídeo.
[0064] O termo "planta de soja" inclui: plantas de soja (Glycine max) inteiras, células de planta de soja, protoplasto de planta de soja, célula de planta de soja ou culturas de tecido de soja das quais plantas de soja podem ser regeneradas, calo de planta de soja e células de planta de soja que estão intactas em plantas de soja ou partes de plantas de soja, tal como sementes de soja, cascos de soja, flores de soja, cotilédone de soja, folhas de soja, caules de soja, brotos de soja, raízes de soja, pontas de raiz de soja e semelhantes.
[0065] A frase "sob condições estringentes" se refere a condições sob as quais uma sonda ou polinucleotídeo irá hibridizar para uma sequência de ácido nucleico específica, tipicamente em uma mistura complexa de ácidos nucleicos, mas, essencialmente, para nenhuma outra sequência. As condições estringentes são dependentes de sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes.
[0066] As sequências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas mais altas. Geralmente, as condições estringentes são selecionadas para serem cerca de 5-10°C menores que o ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica em uma intensidade iônica definida pH. O Tm é a temperatura (sob intensidade iônica definida, pH, e concentração de ácido nucleico) em que 50% das sondas complementares ao alvo hibridizam para a sequência-alvo em equilíbrio (conforme as sequências-alvo estão presentes em excesso, em Tm, 50 das sondas são ocupadas em equilíbrio), condições estringentes serão aquelas em que a concentração de sal é de menos que cerca de 1,0 M de íon de sódio, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de sódio em concentração (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é de pelo menos cerca de 30° C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e de pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maior que 50 nucleotídeos). As condições estringentes também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes tal como formamida. Para hibridização seletiva ou específica, um sinal positivo é pelo menos duas vezes hibridização de plano de fundo, preferivelmente 10 vezes hibridização de plano de fundo. Condições exemplificativas de hibridização estringente são frequentemente: 50% de formamida, 5xSSC, e 1% de SDS, incubados a 42° C, ou, 5xSSC, 1% de SOS, incubados a 65°C, com lavagem em 0,2xSSC, e 0,1% de SDS a 65°C. Para PCR, uma temperatura de cerca de 36°C é típica para baixa amplificação de estringência, embora temperaturas de têmpera possam variar entre cerca de 32°C e 48°C, dependendo do comprimento iniciador. As linhas-guia adicionais para determinar parâmetros de hibridização são fornecidas em inúmeras referências.
[0067] Os cálculos de alinhamentos de sequência e porcentagem de identidade podem ser determinados com o uso de uma variedade de métodos de comparação projetados para detectar sequências homólogas, inclusive, mas não limitado a, o programa MEGALIGN® do pacote de computação de bioinformática LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Madison, Wis. EUA). Exceto onde especificado de outra forma, o alinhamento múltiplo das sequências fornecidas no presente documento foi realizado com o uso do método de alinhamento Clustal V (Higgins e Sharp, CABIOS. 5:151 a 153 (1989)) com os parâmetros padrões (PENALIDADE DE VÃO=10, PENALIDADE DE COMPRIMENTO DE VÃO=10), parâmetros padrões para alinhamentos em pares e cálculo de porcentagem de identidade de sequências de proteína com o uso do método Clustal V são KTUPLE=1, PENALIDADE DE VÃO=3, JANELA=5 e DIAGONAIS SALVAS=5. Para adições nucleicas esses parâmetros são KTUPLE=2, PENALIDADE DE VÃO=5, JANELA=4 e DIAGONAIS SALVAS=4. Após o alinhamento das sequências, com o uso do programa Clustal V, é possível obter valores de "porcentagem de identidade" e "divergência" através da visualização da tabela de "distâncias de sequência" no mesmo programa; exceto onde especificado de outra forma, porcentagens de identidades e divergências fornecidas e reivindicadas no presente documento foram calculadas desse modo.
[0068] Antes de descrever a presente matéria em detalhes, deve- se compreender que esta invenção não se limita a modalidades específicas. Também deve-se compreender que a terminologia usada no presente documento é para o propósito de descrever modalidades específicas, e não se destina a ser limitativa. Conforme usado no presente documento e nas reivindicações anexas, termos no singular e as formas singulares "um" e "o", por exemplo, incluem referências no plural a menos que o conteúdo dite claramente o contrário. Desse modo, por exemplo, referência para "planta", "a planta" ou "uma planta" também inclui uma pluralidade de plantas. Dependendo do contexto, o uso do termo "planta" também pode incluir progênie geneticamente similar ou idêntica de tal planta. O uso do termo "um ácido nucleico" inclui, opcionalmente, muitas cópias de tal molécula de ácido nucleico.
[0069] Reconheceu-se por um bom tempo que loci genéticos específicos correlacionados a fenótipos específicos, tal como resistência elevada a PRSR, podem ser mapeados em um genoma do organismo. O criador de planta pode usar, vantajosamente, marcadores moleculares para identificar indivíduos desejados através da detecção de alelos marcadores que mostram uma probabilidade estatisticamente significativa de cossegregação com um fenótipo desejado, manifestados como desequilíbrio de ligação. Através da identificação de um marcador molecular ou aglomerados de marcadores moleculares que cossegregam com um traço de interesse, o criador tem capacidade de selecionar rapidamente um fenótipo desejado através da seleção para o alelo marcador molecular apropriado (um processo chamado de seleção assistida por marcador, ou "MAS").
[0070] Uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica está disponível para detectar marcadores moleculares ou aglomerados de marcadores moleculares que cossegregam com um traço de interesse, tal como resistência elevada a PRSR. A ideia básica que se submete a esses métodos é a detecção de marcadores, aos quais genótipos alternativos (ou alelos) têm fenótipos médios significativamente diferentes. Desse modo, faz-se uma comparação entre loci marcadores da magnitude de diferença entre genótipos alternativos (ou alelos) ou o nível de significância de tal diferença. Genes de traço são inferidos a serem localizados mais próximos ao(s) marcador(es) que têm a maior diferença genotípica associada.
[0071] Dois dos tais métodos usados para detectar loci de traço de interesse são: 1) Análise de associação com base em população e 2) Análise de ligação tradicional. Em uma análise de associação com base em população, são obtidas linhas de populações pré-existentes com fundadores múltiplos, por exemplo, linhas de criação elite. As análises de associação com base em população dependem da decadência de desequilíbrio de ligação (LD) e da ideia de que, em uma população não estruturada, somente correlações entre genes que controlam um traço de interesse e marcadores aproximadamente ligados àqueles genes permanecerão após tantas gerações de acasalamento aleatório. Na realidade, mais populações pré-existentes têm subestrutura de população. Desse modo, o uso de uma abordagem de associação estruturada ajuda a controlar estrutura de população através da alocação de indivíduos em populações com o uso de dados obtidos a partir de marcadores aleatoriamente distribuídos pelo genoma, o que, desse modo, minimiza o desequilíbrio devido a estrutura de população dentro das populações de indivíduo (também chamado de subpopulações). Os valores fenotípicos são comparados aos genótipos (alelos) em cada locus marcador para cada linha na subpopulação. Uma associação significativa de traço marcador indica a proximidade de dose entre o locus marcador e um ou mais loci genéticos que estão envolvido na expressão de tal traço.
[0072] Os mesmos princípios estão subjacentes à análise de ligação tradicional; entretanto, LD é gerado através da criação de uma população de um pequeno número de fundadores. Os fundadores são selecionados para maximizar o nível de polimorfismo dentro da população construída, e sites polimórficos são avaliados pelo nível de cossegregação dos mesmos com um dado fenótipo. Diversos métodos estatísticos foram usados para identificar associações significativas de traço marcador. Tal método é um mapeamento de intervalo abordagem (Lander e Botstein, Genetics 121:185 a 199 (1989), em que cada dentre muitas posições ao longo de um mapa genético (diga- se, em intervalos de 1 cM) é testado em relação à probabilidade de que um gene que controla um traço de interesse se localiza em tal posição. Os dados de genótipo/fenótipo são usados para calcular, para cada posição de teste, uma pontuação LOD (log de razão de probabilidade). Quando a pontuação LOD excede um valor limiar, há uma evidência significativa em relação ao local de um gene que controla o traço de interesse em tal posição no mapa genético (que se encontrará entre dois loci marcadores específicos).
[0073] Marcadores associados à resistência a PRSR são identificados no presente documento. Os métodos envolvem detectar a presença de pelo menos um alelo marcador associado à resistência melhorada no germoplasma de uma planta de soja. O locus marcador pode ser selecionado a partir de qualquer um dos loci marcadores fornecidos na Tabela 6, inclusive BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A e InDel_1, e qualquer outro marcador ligado a esses marcadores (marcadores ligados podem ser determinados a partir do recurso SoyBase publicamente disponível). O locus marcador pode ser selecionado a partir de qualquer um dos loci marcadores fornecidos na esse marcador (marcadores ligados podem ser determinados a partir do recurso SoyBase).
[0074] Os elementos genéticos ou genes localizados em uma amplitude linear contígua de DNA genômico em um único cromossomo são fisicamente ligados. BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T e BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C, ambos altamente associados à resistência a PRSR, delineiam um locus de resistência de PRSR. Qualquer polinucleotídeo que se assemelhe ao DNA contíguo entre e inclusive SEQ ID NO:6 (a sequência de fonte de SNP para BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T) e SEQ ID NO:24 (a sequência de fonte de SNP para BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C) pode alojar loci marcadores que são associados à resistência a PRSR.
[0075] Os elementos genéticos ou genes localizados em uma amplitude linear contígua de DNA genômico em um único cromossomo são fisicamente ligados ao subintervalo de BARCSOYSSR_07_0295 e InDel_1. BARCSOYSSR_07_0295 e InDel_1, ambos altamente associados à resistência a PRSR, delineiam um locus de resistência de PRSR. Qualquer polinucleotídeo que se assemelhe ao DNA contíguo entre e inclusive SEQ ID NO:43 (a sequência iniciadora de avanço para BARCSOYSSR_07_0295) e SEQ ID NO:58 (a sequência iniciadora reversa para InDel_1) pode alojar loci marcadores que são associados à resistência a PRSR.
[0076] Uma medida comum de ligação é a frequência com que traços cossegregam. Isso pode ser expressado como uma porcentagem de cossegregação (frequência de recombinação) ou em centiMorgans (cM). O cM é uma unidade de medida de frequência de recombinação genética. Um cM é igual a uma chance de 1% de que um traço em um locus genético será separado de um traço em outro locus devido ao cruzamento em uma única geração (o que significa que os traços segregam juntos 99% do tempo). Devido ao fato de que a distância cromossômica é aproximadamente proporcional à frequência de eventos de cruzamento entre traços, há uma distância física aproximada que se correlaciona a frequência de recombinação.
[0077] Os loci marcadores são, por si só, traços e podem ser avaliados de acordo com análise de ligação padrão através do rastreamento dos loci marcadores durante segregação. Desse modo, um cM é igual a uma chance de 1% de que um locus marcador será separado de outro locus, devido ao cruzamento em uma única geração.
[0078] Outros marcadores ligados aos marcadores listados na Tabela 4 podem ser usados para prever resistência a PRSR em uma planta de soja. Isso inclui qualquer marcador dentro de menos que 50 cM (por exemplo, cerca de 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,75 cM, 0,5 BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T, BARCSOYSSR_07_0289, BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T, BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, InDel_2, InDel_1, BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G, BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T, BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A, BARCSOYSSR07 0300 mais eficaz e vantajoso tal marcador será como um indicador para o traço desejado. Os loci aproximadamente ligados exibem uma frequência de cruzamento interlocus de cerca de 10% ou menos, preferivelmente de cerca de 9% ou menos, ainda mais preferivelmente de cerca de 8% ou menos, mais preferivelmente ainda de cerca de 7% ou menos, ainda mais preferivelmente de cerca de 6% ou menos, mais preferivelmente ainda de cerca de 5% ou menos, ainda mais preferivelmente de cerca de 4% ou menos, mais preferivelmente ainda de cerca de 3% ou menos e ainda mais preferivelmente de cerca de 2% ou menos. Em modalidades altamente preferenciais, os loci relevantes (por exemplo, um locus marcador e um locus-alvo) exibem uma frequência de recombinação de cerca de 1% ou menos, por exemplo, cerca de 0,75% ou menos, mais preferivelmente de cerca de 0,5% ou menos ou mais preferivelmente ainda de cerca de 0,25% ou menos. Desse modo, os loci são separados cerca de 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,75 cM, 0,5 cM ou 0,25 cM ou menos. De outro modo, dois loci que se localizam no mesmo cromossomo, e em tal distância em que a recombinação entre os dois loci ocorre em uma frequência de menos que 10% (por exemplo, cerca de 9%, 8% 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25%, ou menos), são ditos como "próximos" um ao outro.
[0079] Embora alelos marcadores específicos possam mostrar cossegregação com resistência elevada a PRSR, é importante notar que o locus marcador não é necessariamente responsável pela expressão do fenótipo resistente a PRSR. Por exemplo, não é uma exigência que a sequência de marcador de polinucleotídeos seja parte de um gene que confere resistência elevada a PRSR (por exemplo, ser parte do quadro de leitura aberto de gene). A associação entre um alelo marcador específico e o fenótipo de resistência elevada a PRSR é devido à fase de ligação por "acoplagem" original entre o alelo marcador e o alelo na linha de soja ancestral da qual o alelo foi originado. Eventualmente, com recombinação repetida, eventos de cruzamento entre o marcador e locus genético podem mudar essa orientação. Por esse motivo, o alelo marcador favorável pode mudar dependendo da fase de ligação que existe dentro do precursor resistente usado para criar populações de segregação. Isso não muda o fato de que o marcador pode ser usado para monitorar a segregação do fenótipo. Somente muda qual alelo marcador é considerado favorável em uma dada população de segregação.
[0080] O termo "intervalo cromossômico" designa qualquer e todos os intervalos definidos por qualquer dos marcadores apresentados na presente revelação. Um intervalo cromossômico que se correlaciona com resistência a PRSR é fornecido. Esse intervalo, localizado no cromossomo 7, compreende e é flanqueado por BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T e BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C. Um subintervalo de intervalo cromossômico BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T e BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C é BARCSOYSSR_07_0295 e InDel_1.
[0081] Uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica está disponível para identificar intervalos cromossômicos. Os limites de tais intervalos cromossômicos são extraídos para englobar marcadores que serão ligados ao gene que controla o traço de interesse. Em outras palavras, o intervalo cromossômico é extraído de tal modo que qualquer marcador que se encontre dentro de tal intervalo (inclusive os marcadores terminais que definem os limites do intervalo) possa ser usado como um marcador para resistência a PRSR. O intervalo descrito acima abrange um aglomerado de marcadores que cossegregam com resistência a PRSR. O agrupamento de marcadores ocorre em domínios relativamente pequenos nos cromossomos, o que indica a presença de um gene que controla o traço de interesse naquelas regiões de cromossomo. O intervalo foi extraído para englobar os marcadores que cossegregam com resistência a PRSR. O intervalo abrange marcadores que mapeiam dentro do intervalo assim como os marcadores que definem as terminações. Por exemplo, o intervalo BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T e BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C, separado por 368,797 bp com base no genoma de referência Glyma2.0, que define um intervalo cromossômico que abrange um aglomerado de marcadores que cossegregam com resistência a PRSR. Um segundo exemplo inclui o subintervalo, BARCSOYSSR_07_0295 e InDel_1, separado por 61,874 bp com base no genoma de referência Glyma2.0, que define um intervalo cromossômico que abrange um aglomerado de marcadores que cossegregam com resistência a PRSR. Um intervalo descrito pelos marcadores terminais que definem os pontos finais do intervalo incluirá os marcadores terminais e qualquer marcador que se localiza dentro de tal domínio cromossômico, aqueles marcadores sendo atualmente conhecidos ou desconhecidos.
[0082] Os intervalos cromossômicos também podem ser definidos por marcadores que são ligados a (mostram desequilíbrio de ligação com) um marcador de interesse, e é uma medida comum de desequilíbrio de ligação (LD) no contexto de estudos de associação. Caso o valor r2 de LD entre qualquer locus de cromossomo 7 marcador que se encontra dentro do intervalo de BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T e BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C, o subintervalo de BARCSOYSSR_07_0295 e InDel_1, ou qualquer outro subintervalo de BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T e BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C, e um marcador identificado dentro de tal intervalo que tem um alelo associado à resistência a PRSR elevada seja maior que % (Ardlie et al. Nature Reviews Genetics 3:299 a 309 (2002)), os loci são ligados.
[0083] Um marcador da matéria revelada no presente documento também pode ser uma combinação de alelos em loci marcadores, de outro modo conhecido como um haplótipo. O indivíduo versado na técnica esperaria que pudessem haver sites polimórficos adicionais em loci marcadores em e ao redor dos marcadores de cromossomo 7 identificados no presente documento, em que um ou mais sites polimórficos estão em desequilíbrio de ligação (LD) com um alelo associado à resistência a PRSR elevada. Dois alelos específicos em diferentes sites polimórficos são ditos como em LD caso a presença do alelo em um dos sites tenda a prever a presença do alelo no outro site no mesmo cromossomo (Stevens, Mol. Diag. 4:309 a 317 (1999)).
[0084] Os marcadores moleculares podem ser usados em uma variedade de aplicações de criação de planta (por exemplo, consulte Staub et al. (1996) Hortscience 729 a 741; Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Reporter 1: 3 a 8). Uma das áreas de interesse principais é a de aumentar a eficiência de retrocruzamento e genes de introgressão com o uso de seleção assistida por marcador (MAS). Um marcador molecular que demonstra ligação com um locus que afeta um traço fenotípico desejado fornece uma ferramenta útil para a seleção do traço em uma população de planta. Isso é particularmente verdadeiro onde o fenótipo é difícil de testar, por exemplo, muitos traços de resistência a doença, ou, ocorre em um estágio posterior em desenvolvimento de planta, por exemplo, características de semente. Visto que ensaios marcadores de DNA são menos trabalhosos e ocupam menos espaço físico que fenotipagem de campo, populações muito maiores podem ser testadas, o que aumenta as chances de encontrar um recombinante com o segmento-alvo da linha de doador movida para a linha receptora. Quanto mais próxima a ligação, mais útil é o marcador, conforme a recombinação é menos propensa a ocorrer entre o marcador e o gene que causa o traço, que pode resultar em falsos positivos. Ter marcadores de flanqueamento diminui as chances de que a seleção de falso positivo irá ocorrer de modo que um evento de recombinação duplo seria necessário. A situação ideal é ter um marcador no próprio gene, de modo que a recombinação não possa ocorrer entre o marcador e o gene. Tal marcador é chamado de um "marcador perfeito".
[0085] Quando um gene é introgredido por MAS, não é somente o gene que é introduzido, mas também as regiões de flanqueamento (Gepts. (2002). Crop Sci; 42: 1780 a 1790). Isso é chamado de "arrasto de ligação". No caso em que a planta doadora é altamente não relacionada à planta receptora, essas regiões de flanqueamento transportam genes adicionais que podem codificar para traços agronomicamente indesejáveis. Esse "arrasto de ligação" também pode resultar em um rendimento reduzido ou outras características agronômicas negativas mesmo após múltiplos ciclos de retrocruzamento na linha de soja elite. Isso também é chamado às vezes de "arrasto de rendimento". O tamanho da região de flanqueamento pode ser diminuído por retrocruzamento adicional, embora isso não seja sempre bem-sucedido, como criadores não têm controle sobre o tamanho da região ou os pontos de interrupção de recombinação (Young et al, (1998) Genetics 120:579 a 585). Na criação clássica normalmente é somente por chance que recombinações são selecionadas que contribuem para uma redução no tamanho do segmento de doador (Tanksley et al. (1989). Biotechnology 7: 257 a 264). Mesmo após 20 retrocruzamentos em retrocruzamentos desse tipo, pode-se esperar encontrar uma peça comensurável do cromossomo doador ainda ligada ao gene que é selecionado. Com marcadores, entretanto, é possível selecionar aqueles raros indivíduos que vivenciaram recombinação próxima ao gene de interesse. Em 150 plantas retrocruzadas, há uma chance de 95% de que pelo menos uma planta terá vivenciado um cruzamento dentro de 1 cM do gene, com base em uma distância de mapa de meiose única. Os marcadores realizarão uma identificação inequivocável daqueles indivíduos. Com um retrocruzamento adicional de 300 plantas, haveria uma chance de 95% de um cruzamento dentro de distância de mapa de meiose única de 1 cM do outro lado do gene, o que geraria um segmento ao redor do gene-alvo de menos que 2 cM com base em uma distância de mapa de meiose única. Isso pode ser conseguido em duas gerações com marcadores, enquanto que exigiria em média 100 gerações sem marcadores (Consulte Tanksley et al., supra). Quando o local exato de um gene é conhecido, os marcadores de flanqueamento que circundam o gene podem ser utilizados para selecionar recombinações em diferentes tamanhos de população. Por exemplo, em tamanhos menores de população, as recombinações podem ser esperadas mais para longe do gene, de modo que marcadores de flanqueamento mais distais seriam exigidos para detectar a recombinação.
[0086] A disponibilidade do genoma de referência de soja e os mapas de ligação de consenso do genoma de soja que contém densidades crescentes de marcadores de soja públicos facilitou o mapeamento genético de soja e MAS. Consulte, por exemplo, montagens Glyma1.1 e Glyma2.0 e o Consenso Comparativo Glycine max 4.0, que estão disponíveis online no site da web SoyBase.
[0087] Os componentes-chave para a implantação de MAS são (i) definir a população dentro da qual a associação de traço marcador será determinada, que pode ser uma população de segregação, ou uma população aleatória ou estruturada; (ii) monitorar a segregação ou associação de marcadores polimórficos em relação ao traço, e determinar ligação ou associação com o uso de métodos estatísticos; (iii) definir um conjunto de marcadores desejáveis com base nos resultados da análise estatística, e (iv) o uso e/ou extrapolação dessas informações para o atual conjunto de germoplasma de criação para permitir que decisões de seleção com base em marcador sejam tomadas. Os marcadores descritos nesta revelação, assim como outros tipos de marcador tal como FLPs, podem ser usados em protocolos de seleção assistida por marcador.
[0088] SSRs podem ser definidos como execuções relativamente curtas de DNA repetido em tandem com comprimentos de 6 bp ou menos (Tautz (1989) Nucleic Acid Research 17: 6463 a 6471; Wang et al. (1994) Theoretical and Applied Genetics, 88:1 a 6). Os polimorfismos se elevam devido à variação no número de unidades de repetição, provavelmente causado por deslizamento durante replicação de DNA (Levinson e Gutman (1987) Mol Biol Evol 4: 203 a 221). A variação em comprimento de repetição pode ser detectada através do projeto de iniciadores de PCR para as regiões de flanqueamento conservadas não repetitivas (Weber e May (1989) Am J Hum Genet. 44:388 a 396), SSRs são altamente adequados para mapear e MAS de modo que os mesmos são multialélicos, codominantes, reproduzíveis e favoráveis para automação de alta produtividade (Rafalski et al. (1996) Generating and using DNA markers in plants. In Non-mammalian genomic analysis: a practical guide. Academic Press, páginas 75 a 135).
[0089] Vários tipos de marcadores de SSR podem ser gerados, e perfis de SSR de linhas resistentes podem ser obtidos por eletroforese em gel dos produtos de amplificação. A pontuação de genótipo de marcador tem base no tamanho do fragmento amplificado. Um serviço de SSR para soja está disponível para o público em uma base contratual por DNA Landmarks em Saint-Jean-sur-Richelieu, Quebec, Canadá.
[0090] Vários tipos de marcadores de FLP também podem ser gerados. Mais comumente, os iniciadores de amplificação são usados para gerar polimorfismos de comprimento de fragmento. Tais marcadores de FLP são, de vários modos, similares a marcadores de SSR, exceto pelo fato de que a região amplificada pelos iniciadores não é tipicamente uma região altamente repetitiva. Ainda, a região amplificada, ou amplicon, terá variabilidade suficiente entre germoplasma, frequentemente devido a inserções ou deleções, de tal modo que os fragmentos gerados pelos iniciadores de amplificação possam ser distinguidos entre indivíduos polimórficos, e sabe-se que tais InDels ocorrem frequentemente em soja (Bhattramakki et al. (2002). Plant Mol Biol 48, 539 a 547; Rafalski (2002b), supra).
[0091] Marcadores de SNP detectam substituições de nucleotídeo de par básico único. De todos os tipos de marcador molecular, os SNPs são os mais abundantes, que têm, desse modo, o potencial para fornecer a resolução de mapa genético mais alta (Bhattramakki et al. 2002 Plant Molecular Biology 48:539 a 547). Os SNPs podem ser testados em um mesmo nível mais alto de produtividade que SSRs, em um chamado modo de "produtividade ultra-alto", de modo que os mesmos não exijam que grandes quantidades de DNA e automação do ensaio possam ser simples. Os SNPs também têm a promessa de serem relativamente sistemas de baixo custo. Esses três fatores juntos tornam os SNPs altamente atraentes para o uso em MAS. Diversos métodos estão disponíveis para determinação de genótipo de SNP, inclusive, mas não limitado a, hibridização, extensão iniciadora, ligação de oligonucleotídeo, clivagem de nuclease, minissequenciamento e esferas codificadas. Tais métodos foram revistos em: Gut (2001) Hum Mutat 17, páginas 475 a 492: Shi (2001) Clin Chem 47, páginas 164 a 172; Kwok (2000) Pharmacogenomics 1, páginas 95 a 100: Bhattramakki e Rafalski (2001) Discovery and application of single nucleotide polymorphism markers in plants. Em: R, J Henry, Ed, Plant Genotyping: The DNA Fingerprinting of Plants, CABI Publishing, VVallingford. Uma ampla faixa de tecnologias comercialmente disponíveis utiliza esses e outros métodos para interrogar SNPs inclusive Masscode™. (Qiagen), Invader® (Third Wave Technologies), SnapShot® (Applied Biosystems), Taqman® (Applied Biosystems) e Beadarrays™ (Illumina).
[0092] Diversos SNPs juntos dentro de uma sequência, ou sequências ligadas através, podem ser usados para descrever um haplótipo para qualquer genótipo específico (Ching et al. (2002), BMC Genet. 3:19 pp Gupta et al. 2001, Rafalski (2002b), Plant Science 162:329 a 333). Os haplótipos podem ser mais informativos que SNPs únicos e podem ser mais descritivos de qualquer genótipo específico. Por exemplo, um SNP único pode ser o alelo 'T' para uma linha específica ou variedade com resistência a PRSR elevada, mas o alelo 'T' também pode ocorrer na criação de população de soja que é utilizada para precursores recorrentes. Nesse caso, um haplótipo, por exemplo, uma combinação de alelos em marcadores ligados de SNP, pode ser mais informativo. Uma vez que um haplótipo único tenha sido atribuído para uma região de doador cromossômico, tal haplótipo pode ser usado em tal população ou qualquer subconjunto dos mesmos para determinar se um indivíduo tem um gene específico. Consulte, por exemplo, o documento n° WO2003054229. Com o uso de plataformas de detecção de marcador de alta produtividade automatizadas conhecidas por aqueles de conhecimento comum na técnica torna esse processo altamente eficiente e eficaz.
[0093] As sequências para os marcadores listados na Tabela 6 podem ser prontamente usadas para obter SNPs polimórficos adicionais (e outros marcadores) dentro do intervalo cromossômico descrito nesta revelação. Os marcadores dentro da região de mapa descrita podem ser hibridizados para cromossomos artificiais bacterianos (BACs) ou outras bibliotecas genômicas, ou eletronicamente alinhado com sequências de genoma, para encontrar novas sequências no mesmo local aproximado como os marcadores descritos.
[0094] Em adição a SSRs, FLPs e SNPs, conforme descrito acima, outros tipos de marcadores moleculares também são amplamente usados, inclusive, mas não limitados a etiquetas de sequência expressada (ESTs), marcadores de SSR derivados de sequências de EST, DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD), e outros marcadores com base em ácido nucleico.
[0095] Perfis de isozima e características morfológicas ligadas também podem, em alguns casos, ser indiretamente usados como marcadores. Mesmo embora os mesmos não detectem diretamente diferenças de DNA, os mesmos são frequentemente influenciados por diferenças genéticas específicas. Entretanto, marcadores que detectam variação de DNA são muito mais numerosos e polimórficos que marcadores de isozima ou morfológicos (Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Reporter 1:3 a 8).
[0096] Os alinhamentos ou contiguidades de sequência também podem ser usados para encontrar sequências a jusante ou a montante dos marcadores específicos listados no presente documento. Essas novas sequências, próximas aos marcadores descritos no presente documento, são então usadas para descobrir e desenvolver marcadores de funcionalidade equivalente. Por exemplo, mapas físicos e/ou genéticos diferentes são alinhados para localizar marcadores equivalentes não descritos dentro desta revelação mas que estão dentro de regiões similares. Esses mapas podem estar dentro da espécie de soja, ou mesmo através de outras espécies que foram genética ou fisicamente alinhadas com soja, tal como feijão- mungo, feijão-caupi ou feijão-comum.
[0097] Em geral, MAS usa marcadores polimórficos que foram identificados como por terem uma probabilidade significativa de cossegregação com resistência a PRSR. Tais marcadores são pressupostos para mapear próximos a um gene ou genes que dão à planta seu fenótipo resistente a PRSR, e são considerados indicadores para o traço desejado, ou marcadores. As plantas são testadas em relação à presença de um alelo desejado no marcador, e espera-se que as plantas que contêm um genótipo desejado em um ou mais loci transfiram o genótipo desejado, em conjunto com um fenótipo desejado, para sua progênie. Os meios para identificar plantas de soja que têm resistência a PRSR elevada através da identificação de plantas que têm um especificado alelo em qualquer um dos loci marcadores descritos no presente documento, inclusive BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T, BARCSOYSSR_07_0286, BARCSOYSSR_07_0289, BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C, BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T, Gm07_5480878_G_A, BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C, BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, InDel_2, InDel_1, BARCSOYSSR_07_0297, BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G, BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C, BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T, BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C, BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A, BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C, BARCSOYSSR_07_0300 e BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C.
[0098] O intervalo apresentado no presente documento encontra uso em MAS para selecionar plantas que demonstram resistência a PRSR elevada. Qualquer marcador que mapie dentro do intervalo de cromossomo 7 definido por e inclusive BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T e BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C pode ser usado para esse propósito. Em adição, os haplótipos que compreendem alelos em um ou mais loci marcadores dentro do intervalo de cromossomo 7 definido por e inclusive BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T e BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C podem ser usados para introduzir resistência a PRSR elevada em linhas ou variedades de soja. Qualquer alelo ou haplótipo que esteja em desequilíbrio de ligação com um alelo associado à resistência a PRSR elevada pode ser usado em MAS para selecionar plantas com resistência a PRSR elevada.
[0099] O desenvolvimento de marcadores moleculares para realizar determinação de genótipo de resistência a Phytophthora no suporte de um programa de criação fornece, dentre outros benefícios: economias de custo e tempo; seleção precoce de progênie desejada; e comercialização mais rápida e precisa de variedades de soja resistente a Phytophthora. Para criadores comerciais de planta, a disponibilidade de marcadores genéticos de alta qualidade que podem ser exibidos em várias populações é suficiente. Entretanto, a identificação do(s) gene(s) responsável(is) e a variação alélica e modos de ação do(s) mesmo(s) que se submete ao traço fenotípico de resistência a Phytophthora fornecem benefícios adicionais. A identificação de gene(s) responsável(is) que se submete(m) a, ou associado(s) a, traço fenotípico pode superar as limitações de criação assistida por marcador com o uso de marcadores moleculares associados a um grande gene ou QTL. Por exemplo, marcadores moleculares ligados a um QTL ou gene de interesse que são identificados em uma população podem não ser polimórficos ou não tão ligados na criação de material de uma origem genética diferente. São apresentados, no presente documento, genes candidatos que potencialmente se submetem ao descrito fenótipo de resistência inovador Rps11.
[00100] Os exemplos a seguir são oferecidos para ilustrar, mas não para limitar, as reivindicações anexas. Compreende-se que os exemplos e modalidades descritos no presente documento são para propósitos somente ilustrativos e que pessoas versadas na técnica reconhecerão vários reagentes ou parâmetros que podem ser alterados sem se afastar do espírito da invenção ou o escopo das reivindicações anexas.
[00101] Um total de 204 linhas de soja que supostamente conferem PRSR foram selecionados a partir do USDA-ARS Soybean Collection para avaliação inicial. Após uma primeira rodada de triagem, um total de 72 linhas foram identificados transportando resistência tanto para a raça 17 como para a raça 25. A resistência tanto para a raça 17 como para a raça 25 é rara dentre genes de Rps únicos relatados até a presente data e, desse modo, essas linhas foram selecionadas como promissoras para resistência multirraça. As 72 linhas foram adicionalmente estreitadas para 23 linhas que mostraram PRSR de espectro amplo após inoculação com adicionais isolados de P. sojae. Após análise adicional, a introdução de planta (PI) 594527 foi identificada como uma linha resistente promissora devido a sua resistência forte e de espectro amplo a P. sojae.
[00102] A população de mapeamento consistiu em 58 F2 indivíduos e 209 famílias F2:3 derivadas de um cruzamento entre o cultivar suscetível "Williams" e a linha de resistência identificada pelos inventores, PI 594527. PI 594527 é uma linha de soja mantida pelo USDA Soybean Germplasm Collection e doada por Fujian, China. PI 594527 é relatada pela USDA como por conferir uma forte resistência a diversos isolados de P. sojae inclusive raça 1, raça 3, raça 7 e raça 25, mas a fonte genética de tal resistência era previamente desconhecida. Plantas F1 foram autopolinizadas para gerar a população F2 em estufa. Uma pequena quantidade de sementes F2 foi mantida para análise inicial enquanto o resto foi autopolinizado no campo para desenvolver famílias de mapeamento F2:3 para ambas avaliações de fenótipo e genótipo.
[00103] Um conjunto de diferenciais de soja foi usado como controle padrão em todos os experimentos de inoculação para garantir que os isolados realizem a infecção apropriada (Lin et al. 2013). Essas verificações de diferencial foram Union (Rps1-a), Harosoy 13xx (Rps1- b), Williams79 (Rps1-c), PI 103091 (Rps1-d), Williams82 (Rps1-k), L76-1988 (Rps2), L83-570 (Rps3-a), PRx146-36 (Rps3-b), PRx145-48 (Rps3-c), L85-2352 (Rps4), L85-3059 (Rps5), Harosoy 62xx (Rps6), Harosoy (Rps7), PI 399073 (Rps8) e o cultivar suscetível Williams (rps).
[00104] Um total de oito isolados de P. sojae com virulência diferente foram primeiro usados para avaliar a resistência de linha de soja PI 594527. Esses isolados foram ISA19A-1, ISA71D-1, ISA33O-8, 124C-1 (raça 1), pmg(10)-1 (raça 10), pmg (13)-1 (raça 13), pmg (17)1 (raça 17), pmg (25)-1 (raça 25) e 96-13S-106A (raça 28). Para análise de segregação de volume e mapeamento genético, o isolado 124C-1 (raça 1) de P. sojae foi usado para obter dados fenotípicos de indivíduos F2 e famílias F2:3. Os isolados foram mantidos em meio de ágar de feijão-de-lima (LBA)(150 g/l de feijões-de-lima, 2% de ágar).
[00105] PI 594527 foi identificada como uma linha resistente promissora visto que teve uma resistência forte e de espectro amplo a P. sojae, inclusive raça 1, raça 10, raça 13, raça 17, raça 25, raça 28 e três outros isolados dos quais os patótipos não se correlacionam a qualquer designação de raça conhecida (Tabela 1). TABELA 1. AVALIAÇÃO DE LINHA DE SOJA PI 594527 EM RELAÇÃO À INTERAÇÃO DA MESMA COM DIFERENTES ISOLADOS DE P. SOJAE.
* informações obtidas do Collection banco de dados da USDA-ARS Soybean
[00106] Uma técnica de inoculação de hipocótilo modificado foi implantada para inoculação de doença em todos os experimentos (Dorrance et al. 2008). Resumindo, sementes foram plantadas e cultivadas na estufa com uma temperatura média de 25 °C. No 7° dia de plantio de semente, a pasta aquosa de micelia de culturas de 14 dias de idade cultivadas em 1/2 LBA foi injetada no hipocótilo da plântula (~1 cm abaixo do cotilédone). Após inoculação, as plântulas foram cobertas com tampa plástica por mais de 12 horas para garantir uma alta umidade relativa durante infecção (fora de luz solar direta). A tampa foi removida e permitiu-se que a doença se desenvolvesse por 5 a 7 dias (10 dias no máximo) antes da avaliação.
[00107] As reações foram registradas como resistentes caso a plântula estivesse viva sem expandir a lesão, ou suscetível caso a plântula estivesse morta com hipocótilo marrom. Para cada uma das famílias F2:3, 12 a 36 progênies foram pontuados. Qualquer família com menos de 12 plântulas foi removida da análise de dados. Uma família foi classificada como resistente a homozigotos (R) caso mais de 80% das progênies tenham sobrevivido, suscetível a homozigotos (S) caso menos que 20% das plântulas estejam vivas, ou em segregação (Rs) caso 21 a 79 % não tenham morrido (Gordon et al. 2006; Zhang et al. 2013).
[00108] As progênies F2 individuais se desenvolveram a partir do cruzamento de PI 594527 e o cultivar suscetível "Williams" foram testados com o uso de raça isolada 1, que foi avirulenta para a maioria dos genes de Rps. Dentre as 58 progênies F2, 45 foram resistentes e 13 foram suscetíveis. Uma razão de segregação de 45:13 se encaixou bem com a razão Mendelian de 3:1 (x2 = 0,21, p = 0,65) (Tabela 2). De modo a conseguir resultados fenotípicos mais precisos e informações de resistência a heterozigotos das progênies F2, avançou-se, adicionalmente, o resto da população F2 para a geração F2:3, e subsequentemente ~12 a 36 plântulas F3 de cada planta F2 foram pontuadas. A razão de segregação foi adicionalmente investigada na população de mapeamento F2:3. A razão observada de R (resistente a homozigotos): Rs (de segregação): S (suscetível a homozigotos) foi 59:102:48, que também se encaixa bem com a razão esperada de 1:2:1 (x2 = 1,28, p = 0,53). Todos esses resultados sugeriram que a resistência à raça 1 em PI 594527 foi controlada por um único gene de resistência inovador dominante, que os inventores designaram Rps11.
[00109] Tecidos de folha jovens foram coletados na estufa e mantidos em gelo até que ou mantidos em nitrogênio líquido ou armazenados em um congelador a -80 °C antes do uso. Para famílias F2:3, uma mistura de quantidades equivalentes de tecidos de folha foi coletada das aproximadamente 12 a 20 plântulas F3. Aquelas misturas, para algum grau, representaram cada planta progenitora F2. O DNA genômico foi extraído com o uso do método de Brometo de Cetiltrimetilamônio (CTAB) com pequenas modificações (Allen et al. 2006). A concentração de DNA foi determinada com o uso de um espectrofotômetro Nanodrop ND-1.000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, DE, EUA). A concentração final de DNA foi ajustada para 50 ng/ul.
[00110] Para identificar rapidamente o local dos loci associados ao fenótipo de Rps, o método de análise segregante de volume (BSA) foi aplicado à população de segregação F2 (Michelmore et al. 1991). Os volumes resistentes e suscetíveis foram formados pela conjugação de quantidades iguais de amostras de DNA de tanto 10 indivíduos F2 resistentes como 10 indivíduos F2 suscetíveis com base nos resultados de inoculação. Linhas de precursor resistente e suscetível também foram incluídas na determinação de genótipo de SNP. A determinação de genótipo de SNP foi realizada com o uso do SoySNP8K BeadChip através da plataforma Illumina iScan (Illumina, Inc. San Diego, CA, EUA) na Michigan State University. O protocolo de ensaio Infinium II detalhado foi descrito por Song (Song et al. 2013). Os alelos de SNP foram denominados com o uso do Módulo de Determinação de Genótipo GenomeStudio v1.8.4 (Illumina, Inc. San Diego, CA, EUA).
[00111] Os iniciadores de SSR foram obtidos junto à Song (Song et al. 2010) e, então, sintetizados por Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, EUA). Os marcadores polimórficos de SSR entre duas linhas precursoras foram usados nos experimentos. A amplificação de PCR foi conduzida de acordo com Ping et al. 2014, com pequenas modificações. Resumindo, cada reação de PCR conteve 100 ng de DNA modelo, 10* armazenamento temporário de PCR (2,5 mM Mg2+), 0,2 mM de dNTP, 0,2 μM de iniciadores de avanço e reverso, e 1,0 U de polimerase de DNA Taq em um volume total de 20 μl. As reações foram realizados no termociclador MyCycler (Bio-Rad Lab, Hercules, CA, EUA) que consiste em uma desnaturação inicial em 95 °C por 3 min, seguida por 35 ciclos de 95 °C por 30s, 55~60 °C por 30 s e 72 °C por 30 s, com uma extensão final por 10 min a 72 °C. Os produtos de PCR foram misturados com 6* armazenamento temporário de carregamento e separado por 4% de gel de agarose (DOT Scientific Inc., Burton, MI, EUA) impregnado com brometo de etídio e então visualizado no sistema Molecular Imager Gel Doc XR (Bio-Rad Lab, Hercules, CA, EUA). As bandas de SSR foram então pontuadas manualmente a partir das imagens de gel.
[00112] A análise de qui-quadrado (x2) foi realizada para testar os dados fenotípicos e dados genotípicos para uma adequação de ajuste para a esperada razão Mendelian com o uso do software SPSS 22.0 (SPSS, Chicago, EUA) com um limiar de significância de P = 0,05. Os marcadores que mostraram distorção de segregação significativa das esperadas razões Mendelian foram excluídos da construção de mapa. Um mapa de ligação genética foi construído com o uso do software Joinmap 4.1 (Van Ooijen 2011). Grupos de ligação foram determinados com o uso de um logaritmo do limiar de probabilidades (LOD) de 3,0.
[00113] Um total de 2.588 SNPs, aleatoriamente distribuídos entre os 20 cromossomos, foram identificados entre as duas linhas de precursor. Com base na hipótese de herança monogênica, esperou-se que os SNPs do gene e suas regiões de flanqueamento detectadas nos volumes suscetíveis F2 fossem homozigotos para um alelo de suscetibilidade herdado do suscetível "Williams" enquanto outras regiões deveriam ser heterozigotos visto que ambos alelos poderiam receber dos precursores. Entretanto, os SNPs dos volumes resistentes F2 deveriam sempre ser heterozigotos devido a ambas as progênies resistentes a homozigotos e resistentes a heterozigotos F2 terem existido no agrupamento de DNA. Portanto, os dois volumes foram geneticamente dissimilares na região alvo enquanto heterozigotos em todas as outras regiões. Com o uso dessa abordagem, uma região genômica total de ~5Mb que se inicia de 3Mb a 8Mb no cromossomo 7 (MLG M) foi identificada como o local potencial do locus causador (Figura 1). Os SNPs identificados nessa região são mostrados na Tabela 2.
[00114] Para melhor mapear o locus de Rps11 inovador, as análises de ligação e mapeamento genético foram executadas com 209 famílias F2:3 derivadas do cruzamento. Com base nos resultados de BSA, 14 iniciadores de SSR aleatoriamente distribuídos foram escolhidos da região de mapeamento de tentativa (Song et al. 2010). Quatro marcadores polimórficos de SSR BARCSOYSSR_07_0223, BARCSOYSSR_07_0266, BARCSOYSSR_07_0278 e BARCSOYSSR_07_0459 foram identificados entre os dois precursores da população de mapeamento. Então esses quatro marcadores foram usados para genotipar 50 das famílias F2:3. 9, 2, 0 e 14 recombinantes foram identificados, respectivamente, o que indica que o locus Rps11 esteve entre BARCSOYSSR_07_0223 e BARCSOYSSR_07_0459 e mais ligado a BARCSOYSSR_07_0266 e BARCSOYSSR_07_0278. A análise preliminar também confirmou adicionalmente os resultados de mapeamento da análise de SNP- Chip.
[00115] Subsequentemente, 9 marcadores polimórficos de SSR localizados entre SSR_07_0223 e SSR_07_0459 foram selecionados para genotipar toda a população. A análise de qui-quadrado dos dados genotípicos das 209 famílias F2:3 revelou que todos os nove marcadores polimórficos se adequam à razão de segregação esperada de 1:2:1 (Tabela 3). Portanto, um mapa genético que consiste nos 9 marcadores de SSR e Rps11 foi construído com o uso do software Joinmap 4.1 (Van Ooijen 2011). Nessa abordagem, o locus de Rps foi mapeado para uma região de 0,5 cM, que abrange 226 kb de acordo com o genoma de referência Glyma1.1, e flanqueado por marcadores de SSR BARCSOYSSR_07_0286 e BARCSOYSSR_07_0300 (Figura 2). O marcador de SSR BARCSOYSSR_07_0295 foi encontrado para cossegregar com o locus. TABELA 2. MARCADORES DE SNP IDENTIFICADOS NO INTERVALO CROMOSSÔMICO DE RESISTÊNCIA A PRSR NO CROMOSSOMO 7. GENÓTIPOS DE PRECURSORES E VOLUMES SUSCETÍVEIS E DE RESISTÊNCIA SÃO LISTADOS. POSIÇÕES FÍSICAS DE MARCADORES TÊM BASE NO MAPA DE REFERÊNCIA DE SOJA GLYMA1.1.
TABELA 3. TESTE DE ADEQUAÇÃO DE AJUSTE DE QUI- QUADRADO (X2) PARA OS NOVE MARCADORES DE SSR EM POPULAÇÃO DE MAPEAMENTO F2:3 DERIVADA DE PI 594527 x WILLIAMS. a "a" é homozigótico para o alelo marcador do PI 594527 resistente; "b" é homozigótico para o alelo marcador do Williams suscetível; "h" é heterozigótico para os alelos marcadores de ambos os precursores.
[00116] A população de mapeamento detalhado consiste em 2.640 indivíduos F3 derivados de um cruzamento inicial entre Williams e PI594527. As amostras de folha foram coletadas de cada indivíduo no campo para isolamento de DNA com o uso de um método de brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) padrão. A raça P. sojae 1 foi usada para a avaliação de resistência dos recombinantes. Todo o trabalho de inoculação foi realizado com o uso do método de inoculação de hipocótilo padrão, conforme descrito por Lin et al. (2013). Uma família F3:4 foi considerada resistente a homozigotos caso mais de 80% das progênies tenham sobrevivido, resistente a heterozigotos caso 21% a 79% tenha sobrevivido e suscetível caso menos que 20% tenha sobrevivido.
[00117] Os marcadores de SSR BARCSOYSSR_07_0286 e BARCSOYSSR_07_0300, que flanqueiam o QTL de Rps11 no cromossomo 7 e são separados por uma distância física de 225 kb com base no genoma de referência Glyma1.1 (Ping et al., 2015). Esses marcadores de flanqueamento foram usados para escanear toda a população F3 para identificar recombinantes, resultante na identificação de 10 novos recombinantes. Em adição a marcadores de SSR, marcadores KASP™ e marcadores de inserção/deleção (InDel) também foram desenvolvidos para genotipar os recombinantes. Rps11 foi mapeado em uma região 61 kb definida pelo marcador de SSR BARCSOYSSR_07_0295 e um marcador de InDel InDel_1 (Figura 3; tabela 4). Dentro da região 61 kb, cinco modelos de gene foram previstos de acordo com o novo genoma de referência Glyma2.0 (Tabela 5). Com base na anotação de gene, Glyma.07G062900 foi o único gene que pôde codificar uma proteína de resistência a doença que contém domínio NB-ARC. TABELA 4. MARCADORES MAPEADOS PARA O INTERVALO 348 KB PARA RESISTÊNCIA A PRSR NO CROMOSSOMO 7. GENÓTIPOS DE PRECURSORES SÃO LISTADOS. MARCADORES MAPEADOS DETALHADAMENTE PARA O INTERVALO 61 KB ESTÃO EM NEGRITO E SOMBRADOS EM CINZA. POSIÇÕES FÍSICAS DE MARCADORES TÊM BASE EM GENOMA DE REFERÊNCIA GLYMA2.0.
TABELA 5. ANOTAÇÃO DE GENE NA REGIÃO MAPEADA 61 KB DE ACORDO COM O GENOMA DE REFERÊNCIA DE SOJA (GLYMA2.0).
[00118] Um conjunto de marcadores comuns pode ser usado para estabelecer uma estrutura para identificar marcadores no intervalo cromossômico. A Tabela 4 mostra marcadores que estão em posição consistente em relação um ao outro no mapa de ligação genética derivado de cromossomo 7. As posições físicas de marcadores de SSR são determinadas por BLAST que busca as sequências iniciadoras das mesmas em comparação com genomas de referência de soja, Glyma 1.1 ou Glyma2.0, que estão publicamente disponíveis no site da web SoyBase.
[00119] Os marcadores ligados que flanqueiam aproximadamente o locus de interesse que tem alelos em desequilíbrio de ligação com um alelo favorável em tal locus podem ser efetivamente usados para selecionar plantas progênitas com resistência a PRSR elevada. Desse modo, os marcadores descritos no presente documento, tal como aqueles listados na Tabela 6, assim como outros marcadores genética ou fisicamente mapeados para o mesmo segmento cromossômico, podem ser usados para selecionar plantas de soja com resistência a PRSR elevada. Tipicamente, um conjunto desses marcadores será usado (por exemplo, 2 ou mais, 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais) nas regiões que flanqueiam o locus de interesse. Opcionalmente, um marcador dentro do gene e/ou locus real pode ser usado. TABELA 6. MARCADORES MOLECULARES NO INTERVALO DE RESISTÊNCIA A PRSR NO CROMOSSOMO 7 E OS ALELO DOADOR DOS MESMOS. MARCADORES DENTRO DO INTERVALO CROMOSSÔMICO SÃO DESEJÁVEIS PARA SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADOR
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Claims (6)
1. Método de identificação de uma planta de soja que exibe elevada resistência à podridão de raiz e caule de Phytophthora (PRSR), caracterizado pelo fato de que compreende detectar, no germoplasma da planta de soja, pelo menos um alelo de um locus marcador que está associado com uma elevada resistência a PRSR, em que pelo menos um locus marcador que é associado com uma elevada resistência a PRSR compreende um T no marcador BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T, conforme contido na SEQ ID NO: 6; uma banda menor no marcador de SSR BARCSOYSSR_07_0286 quando detectada por amplificação utilizando iniciadores conforme definidos na SEQ ID NO: 41 e 42; uma banda menor no marcador de SSR BARCSOYSSR_07_0289 quando detectada por amplificação utilizando iniciadores conforme definidos na SEQ ID NO: 51 e 52; um C no marcador BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C, conforme contido na SEQ ID NO:8; um T no marcador BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T, conforme contido na SEQ ID NO: 9; um A no marcador Gm07_5480878_G_A, conforme contido na SEQ ID NO: 54; um C no marcador BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C, conforme contido na SEQ ID NO: 10; uma banda menor no marcador de SSR BARCSOYSSR_07_0295, quando detectada por amplificação utilizando iniciadores conforme definidos na SEQ ID NO: 43 e 44; um G no marcador BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, conforme contido na SEQ ID NO: 11; um T no marcador BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, conforme contido na SEQ ID NO: 12; um A no marcador BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, conforme contido na SEQ ID NO: 13; um G no marcador BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, conforme contido na SEQ ID NO: 14; um T no marcador BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, conforme contido na SEQ ID NO: 15; um A no marcador BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, conforme contido na SEQ ID NO: 16; uma banda maior no marcador InDel_2 quando detectada por amplificação utilizando iniciadores conforme definidos na SEQ ID NO: 55 e 56; uma banda maior no marcador InDel_1 quando detectada por amplificação utilizando iniciadores conforme definidos na SEQ ID NO: 57 e 58; uma banda menor no marcador de SSR BARCSOYSSR_07_0297 quando detectada por amplificação utilizando iniciadores conforme definidos na SEQ ID NO: 59 e 60; um G no marcador BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G, conforme contido na SEQ ID NO: 18; um C no marcador BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C, conforme contido na SEQ ID NO: 19, um T no marcador BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T, conforme contido na SEQ ID NO: 25; um C no marcador BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C, conforme contido na SEQ ID NO: 20; um A no marcador BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A, conforme contido na SEQ ID NO: 22; um C no marcador BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C, conforme contido na SEQ ID NO: 23; uma banda menor no marcador de SSR BARCSOYSSR_07_0300, quando detectada por amplificação utilizando iniciadores conforme definidos na SEQ ID NO: 45 e 46; e um C no marcador BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C, conforme contido na SEQ ID NO: 24.
2. Método de identificação de uma planta de soja que exibe elevada resistência à podridão de raiz e caule de Phytophthora (PRSR), caracterizado pelo fato de que compreende detectar, no germoplasma da planta de soja, um haplótipo que compreende alelos em um ou mais loci marcadores associados com uma elevada resistência a PRSR, em que o um ou mais locus marcador que é associado com uma elevada resistência a PRSR compreende um T no marcador BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T, conforme contido na SEQ ID NO: 6; uma banda menor no marcador de SSR BARCSOYSSR_07_0286 quando detectada por amplificação utilizando iniciadores conforme definidos na SEQ ID NO: 41 e 42; uma banda menor no marcador de SSR BARCSOYSSR_07_0289 quando detectada por amplificação utilizando iniciadores conforme definidos na SEQ ID NO: 51 e 52; um C no marcador BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C, conforme contido na SEQ ID NO:8; um T no marcador BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T, conforme contido na SEQ ID NO: 9; um A no marcador Gm07_5480878_G_A, conforme contido na SEQ ID NO: 54; um C no marcador BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C, conforme contido na SEQ ID NO: 10; uma banda menor no marcador de SSR BARCSOYSSR_07_0295, quando detectada por amplificação utilizando iniciadores conforme definidos na SEQ ID NO: 43 e 44; um G no marcador BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, conforme contido na SEQ ID NO: 11; um T no marcador BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, conforme contido na SEQ ID NO: 12; um A no marcador BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, conforme contido na SEQ ID NO: 13; um G no marcador BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, conforme contido na SEQ ID NO: 14; um T no marcador BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, conforme contido na SEQ ID NO: 15; um A no marcador BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, conforme contido na SEQ ID NO: 16; uma banda maior no marcador InDel_2 quando detectada por amplificação utilizando iniciadores conforme definidos na SEQ ID NO: 55 e 56; uma banda maior no marcador InDel_1 quando detectada por amplificação utilizando iniciadores conforme definidos na SEQ ID NO: 57 e 58; uma banda menor no marcador de SSR BARCSOYSSR_07_0297 quando detectada por amplificação utilizando iniciadores conforme definidos na SEQ ID NO: 59 e 60; um G no marcador BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G, conforme contido na SEQ ID NO: 18; um C no marcador BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C, conforme contido na SEQ ID NO: 19, um T no marcador BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T, conforme contido na SEQ ID NO: 25; um C no marcador BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C, conforme contido na SEQ ID NO: 20; um A no marcador BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A, conforme contido na SEQ ID NO: 22; um C no marcador BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C, conforme contido na SEQ ID NO: 23; uma banda menor no marcador de SSR BARCSOYSSR_07_0300, quando detectada por amplificação utilizando iniciadores conforme definidos na SEQ ID NO: 45 e 46; e um C no marcador BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C, conforme contido na SEQ ID NO: 24.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a detecção de pelo menos um alelo de um locus marcador que está associado a uma elevada resistência a PRSR compreende a amplificação de pelo menos um locus marcador ou uma porção do locus marcador e a detecção do amplicon marcador amplificado resultante.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a detecção de pelo menos um alelo de um locus marcador que está associado a uma resistência aumentada a PRSR compreende sequenciamento.
5. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a detecção do haplótipo compreende a amplificação de pelo menos um locus marcador ou uma porção do locus marcador e a detecção do amplicon marcador amplificado resultante.
6. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a detecção do haplótipo compreende sequenciamento.
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