KR20180028410A

KR20180028410A - 대두에서의 파이토프토라 뿌리 및 줄기 썩음 관련 유전자 좌

Info

Publication number: KR20180028410A
Application number: KR1020177035774A
Authority: KR
Inventors: 지안신 마; 지에킹 핑; 조슈아 씨 피츠제럴드; 춘바오 장; 펭 린; 용허 베이; 마크수드 레만; 오스왈드 크라스타; 라자트 아가왈; 아난타 아차리아
Original assignee: 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨; 퍼듀 리서치 파운데이션
Priority date: 2015-06-03
Filing date: 2016-06-02
Publication date: 2018-03-16
Also published as: AU2016270918B2; CA2987333A1; IL255956A; WO2016196787A1; JP2018516088A; CN108366539B; RU2017143393A3; MX2017015148A; RU2748688C2; AR104914A1; US20180030550A1; EP3302031A4; US10995377B2; EP3302031A1; CN108366539A; RU2017143393A; BR102016012586B1; CL2017003034A1; BR102016012586A2; AU2016270918A1

Abstract

본 기술 주제는 증가된 역병균 뿌리 및 줄기 썩음 내성을 가지는 대두 식물을 확인하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 방법들은 분자 마커를 사용해서, 증가된 역병균 뿌리 및 줄기 썩음 내성을 가지는 식물을 확인하고 선택하거나 감소된 역병균 뿌리 및 줄기 썩음 내성을 가지는 식물을 확인하고 선택해제한다. 또한 개시된 방법들에 의해 생성된 대두 식물이 본 기술 주제의 특징이다.

Description

대두의 역병균 뿌리 및 줄기 썩음과 관련된 유전자좌

관련 특허 출원의 상호 참조

본 출원은 2015년 6월 3일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 62/170,441의 우선권을 주장하며, 이의 개시 내용은 그 전체가 참조로써 본원에 포함되어 있다.

컴퓨터로 제출된 서열 목록에 대한 참조

서열 목록의 공식적인 복사본은 06/01/2016에 생성되고 15.7 kb의 크기를 가진, 파일명 "77970-WO-PCT_ST25_SEQUENCE_LISTING.txt"의 ASCII 포맷의 서열 목록으로서 EFS-Web을 통해 컴퓨터로 제출되었고, 명세서와 동시에 출원되었다. 이 ASCII 포맷의 서류에 포함된 서열 목록은 명세서의 일부이고, 그것의 전체내용은 참조로써 본원에 포함된다.

발명의 분야

현재 개시된 기술 주제는 대두 식물에서 역병균(Phytophthora) 뿌리 및 줄기 썩음에 대한 내성을 증가시키는데 유용한 방법에 관한 것이다.

토양 전염 병원균 역병균 소자에(Phytophthora sojae) 에 의해 유발된 역병균 뿌리 및 줄기 썩음(PRSR)은, 1948년에 인디아나주에서 처음 주지되고 다시 1951년에 오하이오주에서 주지된 이래로 전세계적으로 대부분의 대두 경작 지역에서 보고되었다(Dorrance 등 2007; Erwin and Ribeiro 1996; Kaufmann and Gerdemann 1958; Schmitthenner 1985). PRSR은 1996년부터 2009년까지 미국에서 대두 수확량을 억제하고, 년간 4천4백7십만 부셸의 수확량 손실을 유발한 대두 시스트 선충(SCN) 이후에 두 번째로 가장 파괴적인 대두 질병으로 부상하였다(Koenning and Wrather 2010; Wrather and Koenning 2009).

인종-특이적 내성 대두 품종의 개발은 그것이 역병균 질병으로부터 대두 수확량 손실을 감소시키는 데 매우 효과적이고 경제적으로 및 환경적으로 안전하기 때문에, PRSR의 관리를 위한 주된 전략이 되었다(Dorrance 등 2007; Dorrance and Schmitthenner 2000; Schmitthenner 1999). 지금까지, 8개의 상이한 염색체 전체에서 19개의 유전자좌에 분포하는, 대략 25종의 Rps 유전자/대립유전자가 확인되었다. 염색체 3(Chr. 3)(MLG N)은 가장 많은 지도화된 Rps 유전자/대립유전자를 가지는데, Rps1a, Rps1b, Rps1c, Rps1d, Rps1k, Rps7, Rps9, RpsUN1, RpsYu25, RpsYD29, 및 일본 품종 '와세시로게(Waseshiroge)'로 보고된 무명의 Rps 유전자를 포함한다(Demirbas 등 2001; Fan 등 2009; Gao 등 2005; Lin 등 2013; Sugimoto 등 2011; Sun 등 2011; Weng 등 2001; Wu 등 2011a; Yao 등 2010; Zhang 등 2013). 2개의 Rps 유전자, Rps2 및 RpsUN2는 잘 알려져 있는 내성 유전자 클러스터 영역인 Chr. 16(MLG J)의 단부에서 지도가 작성되었다(Kanazin 등 1996; Lin 등 2013; Polzin 등 1994) . 흥미롭게도, Rps3 (3개의 대립유전자 3-a, 3-b, 3-c를 함유함) 및 Rps 8 은 Chr. 13(MLG F)상의 또 다른 내성 유전자 풍부 영역에 대해 지도가 작성되었다 (Demirbas 등 2001; Gordon 등 2006). 최근에 확인된 Rps 유전자인 RpsJS는 Rps4, Rps5 및 Rps6과 결합되어 있고, 이것들은 모두 Chr. 18(MLG G)의 짧은 아암에 위치한다(Demirbas 등 2001; Sandhu 등 2004; Sun 등 2014). 또한, RpsYB30, Rps ZS18, RpsSu 및 Rps10 은 각각 Chr. 19(MLG L), Chr. 2 (MLG D1b), Chr. 10 (MLG O) 및 Chr. 17(MLG D2)에 대해 지도가 작성되었다(Wu 등 2011b; Yao 등 2010; Zhang 등 2013; Zhu 등 2007).

이들 Rps 유전자 중 많은 것이 이미 PRSR을 제어하기 위한 대두 재배 프로그램에서 성공적으로 개발되었다. 그럼에도 불구하고, 이들 유전자는 도태 압력 하에서 병원균의 신속하고 연속적인 진화로 인해 단지 8 내지 15년 동안만 효과적일 수 있다 (Schmitthenner 1985) . 또한, 알려진 Rps 유전자들을 단일 품종으로 피라미드화하는 것은 재조합된 병원균 집단이 육성자가 내성 유전자들을 스택할 수 있는 만큼 빠르게 독성 대립유전자들의 새로운 조합을 생성할 수 있기 때문에 효과적인 장기간 재배 전략이 아닐 수 있다 (McDonald and Linde 2002) . 그러므로, 역병균 질병을 효과적으로 관리하기 위해서는 신규한 Rps 유전자를 확인하는 것이 여전히 필요하다.

신규한 역병균 내성 유전자좌가 본 개시에서 확인된다. 또한, 개시된 신규한 역병균 내성 유전자좌에 결합된 마커들이 또한 확인된다. 신규한 역병균 내성 유전자좌에 결합된 마커들은 SSR, InDel 및 SNP 마커를 포함한다. 본 개시에서 확인된 마커들은 재배 프로그램을 지지하기 위한 역병균 내성 유전자형 분석에 사용될 수 있다. 재배 프로그램의 지지에서 역병균 내성 유전자형 분석을 수행하기 위해 현재 개시된 마커들을 사용하는 것은, 다른 유익들 중에서도, 비용 및 시간 절감; 원하는 자손의 조기 선택; 및 역병균 내성 대두 변종의 보다 정확하고 신속한 상업화를 제공한다. 본원에 개시된 신규한 역병균 내성 유전자좌에 대한 표현형의 기저에 있는 후보 유전자들이 또한 기술된다.

한 실시양태에서, 대두 식물의 생식질에서 마커 유전자좌의 적어도 하나의 대립유전자를 검출하는 단계를 포함하는, PRSR에 대해 증가된 내성을 나타내는 대두 식물을 확인하는 방법이 제공된다. 마커 유전자좌는 염색체 7 상에 있고, BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C를 양 옆에 포함하는 염색체 간격(chromosomal interval) 내에 위치하며, 적어도 하나의 대립유전자는 PRSR에 대한 증가된 내성과 관련된다. 일부 특정 실시양태에서, 마커 유전자좌는 다음의 마커 유전자좌들 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다: BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T, BARCSOYSSR_07_0286, BARCSOYSSR_07_0289, BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C, BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T, Gm07_5480878_G_A, BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C, BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, InDel_2, InDel_1, BARCSOYSSR_07_0297, BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G, BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C, BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T, BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C, BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A, BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C, BARCSOYSSR_07_0300 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C, 뿐만 아니라 이들 마커에 결합된 임의의 다른 마커. 일부 실시양태에서, 마커 유전자좌는 염색체 7 상에 있고, BARCSOYSSR_07_0295 및 InDel_1을 양 옆에 포함하는 간격 내에 위치하며, PRSR에 대한 증가된 내성과 관련된 적어도 하나의 대립유전자를 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 마커 유전자좌는 다음의 마커 유전자좌들 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다: BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, InDel2 및 InDel_1, 뿐만 아니라 이들 마커와 결합된 임의의 다른 마커. 일부 실시양태에서, 마커 유전자좌는 Glyma.07G62500, Glyma.07G62600, Glyma.07G62700, Glyma.07G62800 및 Glyma.07G62900으로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자를 포함한다. 이 방법에 의해 확인된 대두 식물 또한 관심의 대상이다.

다른 실시양태에서, 대두 식물의 생식질에서 하플로타입을 검출함으로써 PRSR에 대한 증가된 내성을 가진 대두 식물을 확인하는 방법이 제공된다. 하플로타입은 하나 이상의 마커 유전자좌에서 대립유전자를 포함하고, 여기서 하나 이상의 마커 유전자좌는 양 옆에 BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C를 포함하는 간격 내에서 염색체 7 상에서 발견된다. 일부 특정 실시양태에서, 마커 유전자좌는 다음의 마커 유전자좌들 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다: BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T, BARCSOYSSR_07_0286, BARCSOYSSR_07_0289, BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C, BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T, Gm07_5480878_G_A, BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C, BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, InDel_2, InDel_1, BARCSOYSSR_07_0297, BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G, BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C, BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T, BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C, BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A, BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C, BARCSOYSSR_07_0300 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C, 뿐만 아니라 이들 마커에 결합된 임의의 다른 마커. 일부 실시양태에서, 하플로타입은 하나 이상의 마커 유전자좌에서 대립유전자를 포함하며, 여기서 하나 이상의 마커 유전자좌는 양 옆에 BARCSOYSSR_07_0295 및 InDel_1을 포함하는 간격 내에서 염색체 7 상에서 발견된다. 일부 특정 실시양태에서, 마커 유전자좌는 다음의 마커 유전자좌들 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다: BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, InDel_1 및 InDel_1, 뿐만 아니라 이들 마커에 결합된 임의의 다른 마커. 하플로타입은 PRSR에 대한 증가된 내성과 관련된다. 일부 실시양태에서, 마커 유전자좌는 Glyma.07G62500, Glyma.07G62600, Glyma.07G62700, Glyma.07G62800 및 Glyma.07G62900으로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자를 포함한다. 이 방법에 의해 확인된 대두 식물 또한 관심의 대상이다.

추가의 실시양태에서, PRSR에 대해 증가된 내성을 가진 식물을 선택하는 방법이 제공된다. 한 측면으로, 마커 유전자좌의 적어도 하나의 대립유전자를 가지는 제1 대두 식물이 얻어지고, 이때 대립유전자는 PRSR에 대한 증가된 내성과 연관된다. 마커 유전자좌는 양 옆에 BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C를 포함하는 간격 내에서, 염색체 7 상에서 발견될 수 있고, 일부 특정 실시양태에서 마커 유전자좌는 양 옆에 BARCSOYSSR_07_0295 및 InDel_1을 포함하는 간격 내에서 발견될 수 있다. 제1 대두 식물은 제2 대두 식물과 교배될 수 있고, 교배로부터 유래되는 자손은 제1 대두 식물의 대립유전자에 대해 평가될 수 있다. 제1 대두 식물로부터의 대립유전자를 가진 자손 식물은 PRSR에 대한 증가된 내성을 가지는 것으로서 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 마커 유전자좌는 Glyma.07G62500, Glyma.07G62600, Glyma.07G62700, Glyma.07G62800 및 Glyma.07G62900으로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자를 포함한다. 이 방법에 의해 선택된 대두 식물 또한 관심의 대상이다.

본 기술 주제는 다음의 상세한 설명 및 본 출원의 일부를 형성하는 수반되는 도면 및 서열 목록으로부터 더 충분하게 이해될 수 있다. 서열 목록은 Nucleic Acids Research 13:3021-3030 (1985) 및 Biochemical Journal 219 (No. 2): 345-373 (1984)(전체 내용이 참조로서 본원에 포함됨)에서 기술된 IUPAC-IUBMB 표준에 따라 규정된 것과 같이 뉴클레오티드 서열 형질에 대한 한 문자 코드 및 아미노산에 대한 세 문자 코드를 함유한다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 데이터에 대해 사용된 기호 및 포맷은 37 C.F.R. §1.822에서 진술된 규칙을 따른다.
도 1은 내성 및 취약성 벌크 사이의 다른 SNP 분포를 기반으로 한 Rps 11 에 대한 위치를 도시한다. y-축은 Chr. 07 상의 3가지 상이한 유형의 SNP를 나타낸다. T1은 Williams에서 취약성 대립유전자와 동형접합성인 SNP를 나타낸다. T3은 PI 594527에서 내성 대립유전자와 동형접합성인 SNP를 나타낸다. T2는 양 부모로부터의 대립유전자와 이종접합성인 SNP를 나타낸다. x-축은 SNP들의 물리적 위치를 보여준다. a와 b 사이의 간격은 Rps 11에 대한 잠재적 영역을 가리킨다.
도 2는 Chr. 7 상의 Rps 11의 유전자 및 물리적 지도를 도시한다. 도 2(a)는 Rps 11의 유전자 결합 지도이다. 마커 명칭은 좌측에 나열되고 유전자 거리(cM)는 우측에 있다. *'BARCSOYSSR_07_0241'에 대한 약어. 도 2(b)는 SoyBase 웹사이트 상의 대두 참조 게놈(Glyma1.1)에 대한 프라이머 서열을 탐색하는 BLAST에 의해 결정된 SSR 마커들의 물리적 위치를 보여준다. 괄호 안의 숫자들은 염기쌍(bp)의 마커들의 출발 위치를 나타낸다. Rps 11의 간격은 검은색으로 강조된다. 도 2(c)는 Williams 82 참조 게놈의 Rps 11 간격의 물리적 위치를 보여준다. 막대는 Chr. 07의 두 아암을 가리키고, 원형은 동원체 영역의 대략적 위치를 가리킨다.
도 3은 Rps 11 유전자좌, 연관된 마커들 및 그 영역에서 예측된 5개의 유전자 모델을 함유한 염색체 7 상의 61 kb 영역을 도시한다. 10개의 F3 재조합체의 지도가 도시된다.
서열번호 1 내지 33 및 54는 SoySNP8K BeadChip 상에서 및/또는 KASPTM 유전자형 분석에 대한 분석을 디자인하기 위해 사용된 SNP를 양 옆에 포함하는 서열들이다.
서열번호 34 내지 53 및 55 내지 60은 염색체 7에 대해 지도가 작성된 SSR 마커들에 대한 순방향 및 역방향 프라이머들이다.

본 기술 주제는 PRSR에 대한 증가된 내성을 가지는 대두 식물을 확인 및 선택하는 방법을 제공한다. 다음의 정의는 본원에 개시된 기술 주제를 이해하기 위한 보조로서 제공된다.

정의

용어 "대립유전자"는 특이적 유전자좌에서 일어나는 둘 이상의 상이한 뉴클레오티드 서열 중 하나를 나타낸다. 대립유전자는 형질과 결합되어 있을 때 및 대립유전자의 존재가 원하는 형질 또는 형질 형태가 그 대립유전자를 포함하는 식물에서 발생할 것을 나타내는 표시자일 때 형질"과 연관"된다.

"역교배"는 핵산 서열을 식물에 도입하기 위해 사용된 과정을 나타낸다. 역교배 기술은 새로운 형질을 식물에 도입하기 위해 수십년 동안 광범위하게 사용되어 왔다. Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988. 전형적인 역교배 프로토콜에서, 원래의 관심의 다양성(반복성 부모)이 전달될 관심의 유전자를 운반하는 제2 다양성(비-반복성 부모)와 교배된다. 이 교배로부터 유래된 자손은 다음에 다시 반복성 부모와 교배되고, 그 과정은, 비-반복성 부모로부터 전달된 유전자에 더불어, 반복성 식물의 본질적으로 모든 원하는 형태적 및 생리적 특징이 개종된 식물에서 회수될 때까지 반복된다.

센티모건("cM")은 재조합 빈도의 측정 단위이다. 1 cM은 한 유전자좌에서의 마커가 단일 세대에서의 교차로 인해 제2 유전자좌에서의 마커로부터 분리될 1%의 기회와 같다.

"염색체 간격"은 단일 염색체상에서 식물계에 상주하는 게놈 DNA의 연속적인 선형 범위를 나타낸다. 단일 염색체 간격에 위치한 유전자 요소들 또는 유전자들은 물리적으로 결합되어 있다. 염색체 간격의 크기는 특히 제한되지 않는다. 일부 측면으로, 단일 염색체 간격 내에 위치한 유전자 요소들은, 전형적으로 예를 들면 20 cM 이하, 또는 다르게는 10 cM 이하의 유전자 재조합 거리로, 유전적으로 결합되어 있다. 즉, 단일 염색체 간격 내의 두 유전자 요소는 20% 또는 10% 이하의 빈도로 재조합을 진행한다.

용어 "염색체 간격"은 현재 개시된 기술 주제에서 진술된 마커들 중 임의의 것에 의해 규정된 임의의 및 모든 간격을 나타낸다. PRSR에 대한 증가된 내성과 상관이 있는 염색체 간격이 제공된다. 염색체 7 상에 위치한 이 간격은 BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C를 양 옆에 포함한다. 염색체 간격 BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C의 하위간격은 BARCSOYSSR_07_0295 및 InDel_1이다.

용어 "보체"는 주어진 뉴클레오티드 서열에 상보하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다, 즉 서열은 염기-쌍 규칙에 의해 연관된다.

용어 "연속적인 DNA"는 중복되는 연속적인 유전자 단편을 나타낸다.

용어 "교배된" 또는 "교배"는 자손(예컨대 세포, 씨 또는 식물)을 생성하기 위해 수분을 통해 생식세포들이 융합되는 것을 의미한다. 이 용어는 양성 교배(한 식물과 다른 식물에 의한 수분(pollination)) 및 자가 수정(자가-수분, 예컨대 꽃가루와 밑씨가 동일한 식물로부터 유래됨)을 포함한다. 용어 "교배하는"은 자손을 생성하기 위한 수분을 통한 생식세포들의 융합 행위를 나타낸다.

"유리한(favorable) 대립유전자"는 바람직한 표현형, 예컨대 PRSR에 대한 증가된 내성을 부여하는, 또는 기여하는 특정 유전자좌의 대립유전자, 또는 다르게는, 재배 프로그램 또는 식수(planting)로부터 제거될 수 있는 PRSR에 대한 감소된 내성을 가진 식물의 확인을 허용하는("역선택") 대립유전자이다. 마커의 유리한 대립유전자는 유리한 표현형으로 분리되는, 또는 다르게는, 불리한 식물 표현형으로 분리되고, 따라서 식물을 확인하는 유익을 제공하는 마커 대립유전자이다.

"유전자 지도"는 주어진 종 내에서 하나 이상의 염색체(또는 염색체들) 상의 유전자좌들 중에서 유전자 결합 관계를 나타내고, 일반적으로 도표 또는 표 형태로 도시된다. 각각의 유전자 지도에 대해, 유전자좌 사이의 거리는 유전자좌 사이의 재조합 빈도에 의해 측정되고, 유전자좌 사이의 재조합은 다양한 분자 유전자 마커("분자 마커", "유전자 마커" 또는 단순히 "마커"로도 불림)를 사용하여 검출될 수 있다. 유전자 지도는 지도 작성 집단, 사용된 마커 유형 및 상이한 집단 사이의 각 마커의 다형태 잠재력의 산물이다. 유전자좌 사이의 순서 및 유전자 거리는 유전자 지도마다 상이할 수 있다. 그러나, 마커 위치 및 순서와 같은 정보는, 예를 들면 SoyBase 웹사이트상에서 공공연하게 이용할 수 있는 Glyma1.1과 같은 대두 참조 게놈을 사용하여, 관심의 염색체 상의 마커들의 물리적 위치를 측정함으로써 지도 사이에서 상관이 있을 수 있다. 기술분야의 숙련자는 염색체상의 마커들의 물리적 위치를 측정하기 위해 공공연하게 이용할 수 있는 게놈 브라우저를 사용할 수 있다.

용어 "유전자 마커"는, 한정하는 것은 아니지만 제한 단편 길이 다형태(RFLP), 단순 서열 반복부(SSR), 무작위 증폭된 다형태 DNA(RAPD), 절단된 증폭된 다형태 서열(CAPS) (Rafalski and Tingey, 1993, Trends in Genetics 9:275-280), 증폭된 단편 길이 다형태(AFLP)(Vos 등, 1995, Nucleic Acids Res. 23:4407-4414), 단일 뉴클레오티드 다형태(SNP)(Brookes, 1999, Gene 234:177-186), 서열 특성화된 증폭된 영역(SCAR)(Pecan and Michelmore, 1993, Theor. Appl. Genet, 85:985-993), 서열 태그된 부위(STS)(Onozaki 등 2004, Euphytica 138:255-262), 단일 가닥 형태 다형태(SSCP)(Orita 등, 1989, Proc Natl Aced Sci USA 86:2766-2770)를 포함하여, 임의의 유형의 핵산 기반 마커를 나타낼 것이다. 내부-단순 서열 반복부(ISR)(Blair 등 1999, Theor. Appl. Genet. 98:780-792), 내부-레트로트랜스포존 증폭된 다형태(IRAP), 레트로트랜스포존-미소부수체 증폭된 다형태(REMAP)(Kalendar 등, 1999, Theor. Appl. Genet 98:704-711), RNA 절단 생성물(예컨대 Lynx 태그) 등.

"유전자 재조합 빈도"는 두 유전자좌 사이의 교차 사건(재조합)의 빈도이다. 재조합 빈도는 감수분열 후 마커들 및/또는 형질들의 분리 후에 관찰될 수 있다.

"게놈"은 염색체 또는 염색체 세트에 의해 운반된 총 DNA, 또는 전체 유전자 세트를 나타낸다.

용어 "유전자형"은 관찰된 형질(표현형)과 대비되는, 하나 이상의 유전자좌에서 개체(또는 개체들의 그룹)의 유전자 구성이다. 유전자형은 개체가 그의 부모로부터 유전된 하나 이상의 알려진 유전자좌의 대립유전자(들)에 의해 규정된다. 용어 유전자형은 단일 유전자좌, 다중 led에서 개체의 유전자 구성을 나타내기 위해 사용될 수 있고, 또는 보다 일반적으로, 용어 유전자형은 개체의 게놈의 모든 유전자에 대한 개체의 유전자 구성을 나타내기 위해 사용될 수 있다.

"생식질"은 개체(예컨대 식물), 개체의 그룹(예컨대 식물 라인(line), 변종 또는 과(family)) 또는 라인, 변종, 종 또는 배양으로부터 유도된 클론의 또는 그것으로부터의 유전자 물질을 나타낸다. 생식질은 유기체 또는 세포의 부분일 수 있고, 또는 유기체 또는 세포로부터 분리될 수 있다. 일반적으로, 생식질은 유기체 또는 세포 배양의 유전적 품질의 일부 또는 전부에 대한 물리적 기초를 제공하는 특이한 분자 구성을 유전자 물질에 제공한다. 본원에서 사용되는 생식질은 그것으로부터 새로운 식물 또는 식물 부분, 예컨대 잎, 줄기, 꽃가루 또는 전체 식물로 배양될 수 있는 세포가 성장될 수 있는 세포, 씨 또는 조직을 포함한다.

"하플로타입"은 복수의 유전자좌에서의 개체의 유전자형, 즉 대립유전자의 조합이다. 전형적으로, 하플로타입에 의해 기술되는 유전자좌는 물리적으로 및 유전적으로, 즉 동일한 염색체 분절상에서 결합된다. 용어 "하플로타입"은 특정 유전자좌, 예컨대 단일 마커 유전자좌에서의 서열 다형태, 또는 주어진 게놈에서 염색체 분절을 따르는 다중 유전자좌에서의 서열 다형태를 나타낼 수 있다. 전자는 또한 "마커 하플로타입" 또는 "마커 대립유전자"로서 언급될 수 있는 한편, 후자는 "장-범위 하플로타입"으로 언급될 수 있다.

용어 "이형접합성"은 상이한 대립유전자들이 상동성 염색체상의 해당하는 유전자좌에 상주하는 유전자 상태를 의미한다.

용어 "동형접합성"은 동일한 대립유전자들이 상동성 염색체상의 해당하는 유전자좌에 상주하는 유전자 상태를 의미한다.

"혼성화" 또는 "핵산 혼성화"는 상보하는 DNA 단일 가닥들의 쌍을 이루는 것뿐 아니라 상보하는 RNA 및 DNA 가닥의 쌍을 이루는 것을 나타낸다.

용어 "혼성화하다"는 핵산 가닥들의 상보하는 영역 사이의 염기쌍의 형성을 의미한다.

용어 "유전자이입" 또는 "유전자이입하는"은 한 유전자 배경으로부터 다른 유전자 배경으로의 유전자좌의 원하는 대립유전자의 전파를 나타낸다. 예를 들어, 특이적 유전자좌에서의 원하는 대립유전자의 유전자이입은 적어도 하나의 자손에 동일 종의 두 부모 사이의 성적 교배를 통해 전파될 수 있고, 이때 부모 중 적어도 한 쪽은 그것의 게놈에 원하는 대립유전자를 가진다. 다르게는, 예를 들면 대립유전자의 전파는, 예를 들면 융합된 원형질에서, 두 공여자 게놈 사이의 재조합에 의해 일어날 수 있고, 이때 공여자 원형질체 중 적어도 하나는 그것의 게놈에 원하는 대립유전자를 가진다. 원하는 대립유전자는, 예컨대 마커의 선택된 대립유전자, 정량적 형질 유전자좌(QTL), 이식유전자 등일 수 있다. 어느 경우든지, 원하는 대립유전자를 포함하는 자손은 원하는 유전자 배경을 가진 라인에 반복적으로 역교배되고 원하는 대립유전자에 대해 선택될 수 있어서, 대립유전자가 선택된 유전자 배경에 고정되는 결과를 초래한다. 예를 들어, 본원에서 기술된 염색체 7 유전자좌는 PRSR에 취약한 반복성 부모로 유전자이입될 수 있다. 그러면 유전자이입된 유전자 또는 유전자좌를 가진 반복성 부모 라인은 PRSR에 대해 증가된 내성을 가진다.

본원에서 사용되는 용어 "결합" 또는 "결합된"은 한 마커 유전자좌가 또 다른 마커 유전자좌 또는 일부 다른 유전자좌(예를 들면 PRSR 유전자좌)와 연관된 정도를 기술하기 위해 사용된다. 분자 마커와 표현형 사이의 결합 관계는 "가능성" 또는 "조정된 가능성"으로서 제시된다. 결합은 원하는 한계 또는 범위로서 표현될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 임의의 마커는 마커들이 cM에 대해 50, 40, 30, 25, 20 또는 15 미만의 지도 유닛만큼 분리될 때 임의의 다른 마커에 결합된다(유전적으로 및 물리적으로). 일부 측면으로, 결합의 괄호로 묶은 범위, 예를 들어 10 내지 20 cM, 10 내지 30 cM 또는 10 내지 40 cM을 규정하는 것이 유익하다. 마커가 제2 유전자좌에 보다 밀접하게 결합될수록, 제2 유전자좌에 대한 표시자가 그 마커가 되는 것이 더 낫다. 그러므로, "밀접하게 결합된 유전자좌", 예컨대 마커 유전자좌 및 제2 유전자좌는 10% 이하, 바람직하게는 약 9% 이하, 더 바람직하게는 약 8% 이하, 보다 더 바람직하게는 약 7% 이하, 더욱 바람직하게는 약 6% 이하, 보다 더 바람직하게는 약 5% 이하, 더욱 더 바람직하게는 약 4% 이하, 더욱 바람직하게는 약 3% 이하, 보다 더 바람직하게는 약 2% 이하의 내부-유전자좌 재조합 빈도를 나타낸다. 고도로 바람직한 실시양태에서, 관련 유전자좌는 약 1% 이하, 예컨대 약 0.75% 이하, 더 바람직하게는 약 0.5% 이하 또는 보다 더 바람직하게는 약 0.25% 이하의 재조합 빈도를 나타낸다. 동일한 염색체에 국한되고, 그런 거리에서 두 유전자좌 사이의 재조합이 10 미만(예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.75%, 0.5%, 0.25% 또는 그 미만)의 빈도로 일어나는 두 유전자좌는 또한 서로에 대해 "근접한" 것으로 말할 수 있다. 1 cM이 1%의 재조합 빈도를 보이는 두 마커 사이의 거리이기 때문에, 임의의 마커는 밀접한 근접성, 예컨대 10 cM 이하의 거리에 있는 임의의 다른 마커에 밀접하게 결합된다(유전적으로 및 물리적으로). 동일 염색체상의 2개의 밀접하게 결합된 마커는 서로로부터 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.75, 0.5 또는 0.25 cM 이하의 거리에 위치할 수 있다.

용어 "결합 불균형"은 유전자좌 또는 형질 둘 다에 대한 비-무작위 분리를 나타낸다. 둘 중 어느 하나의 경우에, 결합 불균형은 관련 유전자좌들이 염색체의 길이를 따라 물리적으로 충분한 근접성 내에 있어서 그것들이 무작위보다 큰(즉 비-무작위) 빈도로 함께 분리되는 것을 함축한다(공동-분리되는 형질의 경우에, 형질의 기저에 있는 유전자좌들은 서로에 대해 충분히 근접해 있다) 결합 불균형을 나타내는 마커들은 결합된 것으로 여겨진다. 결합된 유전자좌들은 50% 이상의 횟수, 예컨대 약 51% 내지 약 100%의 횟수로 공동-분리된다. 달리 표현하면, 공동 분리되는 두 마커는 50% 미만의 재조합 빈도를 가진다(그리고 정의에 의해, 동일 염색체상에서 50 cM 미만으로 떨어져 있다). 본원에서 사용되는 결합은 두 마커 사이에, 또는 다르게는 마커와 표현형 사이에 있을 수 있다. 마커 유전자좌는 형질"과 연관"(에 결합)될 수 있다, 예컨대 PRSR에 대한 내성이 증가될 수 있다. 분자 마커의 표현형 형질에 대한 결합 정도는 예컨대 그 분자 마커가 표현형과 공동-분리될 통계학적 가능성으로서 측정된다.

결합 불균형은 척도 r²을 사용하여 가장 흔하게 평가되는데, 그것은 Hill, W. G. 및 Robertson, A, Theor Appl. Genet 38:226-231 (1988)에 의해 기술된 식을 사용하여 계산된다. r²=1일 때, 완전한 LD가 두 마커 유전자좌 사이에 존재하고, 그것은 마커들이 재조합에 의해 분리되지 않고 동일한 대립유전자 빈도를 가지는 것을 의미한다. 1/3을 초과하는 r²에 대한 값은 충분히 강한 LD가 지도 작성에 유용할 것임을 나타낸다(Ardlie 등, Nature Reviews Genetics 3:299-309 (2002)). 그러므로, 대립유전자는 쌍방식 마커 유전자 사이의 r² 값이 0.33, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0 이상일 때 결합 불균형이다.

본원에서 사용되는 "결합 균형"은 두 마커가 독립적으로 분리되는, 즉 자손 중에서 무작위로 분류되는 상황을 기술한다. 결합 균형을 나타내는 마커들은 결합되지 않은 것으로 여겨진다(마커들이 동일한 염색체상에 있든 아니든간에).

"한쪽의 로그(LOD) 값" 또는 "LOD 득점"(Risch, Science 255:803-804 (1992))은 두 마커 유전자좌 사이의 결합 정도를 기술하기 위해 간격 지도 작성에 사용된다. 두 마커 사이의 3의 LOD 득점은 결합이 없는 것보다 결합이 1000배 더 많을 가능성이 있는 것을 가리키는 한편, 2의 LOD 득점은 결합이 없는 것보다 결합이 100배 더 많을 가능성이 있는 것을 가리킨다. 2 이상의 LOD 득점은 결합을 검출하기 위해 사용될 수 있다.

"유전자좌" 및 "마커 유전자좌"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 유전자 및/또는 마커가 위치한 염색체상의 위치를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "지도 작성 집단"은 유전자 지도 작성을 위해 사용된 식물 집단을 나타낼 수 있다. 지도 작성 집단은 전형적으로 부모 유전자형의 제어된 교배로부터 얻어진다. 지도 작성 집단의 발달을 위한 부모의 선택 및 짝짓기 디자인, 및 사용된 마커의 유형에 대한 결정은 지도가 작성될 유전자, 마커의 이용성 및 분자 지도에 따라 좌우된다. 지도 작성 집단 내의 식물의 부모는 핵산 서열 및 표현형 수준 둘 다에서 관심의 형질(들)에 대해 충분한 변이를 가져야 한다. 부모의 핵산 서열의 변이는 지도 작성 집단의 식물에서의 재조합 사건을 추적하기 위해 사용된다. 유익한 다형태 마커의 이용성은 핵산 서열 변이의 양에 좌우된다.

"마커"는 참조 지점으로서 사용된 뉴클레오티드 서열 또는 그것의 코드화된 생성물(예컨대 단백질)이다. 재조합을 검출하는 데 유익할 마커에 대해, 마커는 모니터링되는 집단 내에서, 차이 또는 다형태가 검출될 것을 필요로 한다. 분자 마커에 대해, 이것은 폴리뉴클레오티드 서열 차이(예컨대 SSR, RFLP, FLP, SNP)로 인한 DNA 수준에서의 차이를 의미한다. 게놈 변이성은 임의의 기원, 예를 들면 삽입, 결실, 중복, 반복적 요소, 점 돌연변이, 재조합 사건 또는 교환 가능한 요소들의 존재 및 서열의 것일 수 있다. 분자 마커는 게놈의 또는 발현된 핵산(예컨대 EST)으로부터 유도될 수 있고 또한 PCR-기반 방법의 사용을 통해 서열 단편을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로서 사용된 핵산을 나타낼 수 있다. 대다수의 대두 분자 마커가 기술분야에 알려져 있고, 다양한 공급원, 예컨대 SoyBase 인터넷 자원으로부터 공개되거나 이용할 수 있다.

집단의 구성원들 사이의 유전자 다형태에 해당하는 마커들은 기술분야에서 잘 수립되어 있는 방법들에 의해 검출될 수 있다. 이것들은 예컨대 DNA 서열분석, PCR-기반 서열 특이적 증폭 방법, 제한 단편 길이 다형태(RFLP)의 검출, 아이소자임 마커의 검출, 대립유전자 특이적 혼성화(ASH)에 의한 폴리뉴클레오티드 다형태의 검출, 식물 게놈의 증폭된 가변 서열의 검출, 자체-지속된 서열 복제의 검출, 단순 서열 반복(SSR)의 검출, 단일 뉴클레오티드 다형태(SNP)의 검출 또는 증폭된 단편 길이 다형태(AFLP)의 검출을 포함한다. EST 서열 및 무작위로 증폭된 다형태 DNA(RAPD)로부터 유도된 발현된 서열 태그(EST) 및 SSR 마커의 검출에 대해 잘 수립된 방법들이 또한 알려져 있다.

"마커 대립유전자", 다르게는 "마커 유전자의 대립유전자"는 마커 유전자좌에 대해 다형태인 집단에서 마커 유전자좌에서 발견된 복수의 다형태 뉴클레오티드 서열 중 하나를 나타낼 수 있다.

"마커 보조 선택(Marker assisted selection)"(또는 MAS)은 그것에 의해 표현형이 마커 유전자형을 기반으로 선택되는 과정이다.

"마커 보조 역-선택"은 그것에 의해 마커 유전자형이 선택되지 않을 식물을 확인하기 위해 사용되어 그 식물들이 재배 프로그램 또는 식수로부터 제거되는 것을 허용하는 과정이다.

"마커 유전자좌"는 특이적 마커가 발견될 수 있을 때의 종의 게놈의 특이적 염색체 위치이다. 마커 유전자좌는 제2 결합된 유전자좌, 예컨대 표현형 형질의 발현을 코드화하거나 기여하는 결합하는 유전자좌의 존재를 추적하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 마커 유전자좌는 그 마커 유전자좌에 유전적으로 또는 물리적으로 결합되는 유전자좌에서의 대립유전자, 예컨대 QTL 또는 단일 유전자의 분리를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다.

"마커 프로브"는 마커 유전자좌의 존재를 확인하기 위해 사용될 수 있는 핵산 서열 또는 분자, 예컨대 핵산 혼성화를 통해 마커 유전자좌 서열에 상보하는 핵산 프로브이다. 마커 유전자좌의 30개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 마커 프로브(마커 유전자좌 서열의 "전부 또는 부분")는 핵산 혼성화를 위해 사용될 수 있다. 다르게는, 일부 측면으로, 마커 프로브는 마커 유전자좌에서 존재하는 특정 대립유전자를 구별할 수 있는 임의의 유형(즉 유전자형)의 프로브를 나타낸다.

용어 "분자 마커"는 결합된 유전자좌를 확인할 때 참조 지점으로서 사용된, 상기에서 정의된 유전자 마커 또는 그것의 코드화된 생성물(예컨대 단백질)을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 마커는 게놈 뉴클레오티드 서열로부터 또는 발현된 뉴클레오티드 서열로부터(예컨대 스플라이싱된 RNA, cDNA 등으로부터) 또는 코드화된 폴리펩티드로부터 유도될 수 있다. 용어는 또한 마커 서열에 상보하는 또는 양 옆의 핵산 서열, 예컨대 마커 서열을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로서 사용된 핵산을 나타낸다. "분자 마커 프로브"는 마커 유전자좌의 존재를 확인하기 위해 사용될 수 있는 핵산 서열 또는 분자, 예컨대 마커 유전자좌 서열에 상보하는 핵산 프로브이다. 다르게는, 일부 측면으로, 마커 프로브는 마커 유전자좌에서 존재하는 특정 대립유전자를 구별할 수 있는 임의의 유형(즉 유전자형)의 프로브를 나타낸다. 핵산은 그것이 예컨대 왓슨-크릭 염기쌍 이루기 규칙을 따라 용액에서 특이적으로 혼성화할 때 "상보적이다". 본원에서 기술된 마커들의 일부는 또한 indel 영역, 예컨대 본원에 기술된 비-동일선상의 영역에 위치할 때 혼성화 마커로서 언급된다. 이것은 삽입 영역이, 정의에 의하면, 삽입이 없는 식물에 관한 다형태이기 때문이다. 그러므로, 마커 요구는 단지 indel 영역이 존재하는지 또는 없는지만을 가리킨다. 임의의 적합한 마커 검출 기술이 그런 혼성화 마커를 확인하기 위해 사용될 수 있는데, 예컨대 SNP 기술이 본원에서 제공된 실시예에서 사용된다.

"뉴클레오티드 서열", "폴리뉴클레오티드", "핵산 서열" 및 "핵산 서열" 및 "핵산 단편"은 상호교환적으로 사용되고 단일- 또는 이중-가닥의, 선택적으로 합성, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드 염기를 함유하는 RNA 또는 DNA의 중합체를 나타낸다. "뉴클레오티드"는 그것으로부터 DNA 또는 RNA 중합체가 구성되고, 퓨린 또는 피리미딘 염기, 펜토오스 및 인산기로 이루어지는 단량체 유닛이다. 뉴클레오티드(통상적으로 5'-모노포스페이트 형태로 발견됨)는 다음과 같이 그것들의 한 문자 표시에 의해 언급된다: 아데닐레이트 또는 데옥시아데닐레이트(각각 RNA 또는 DNA에 대해)에 대해 "A", 시티딜레이트 또는 데옥시시티딜레이트에 대해 "C". 구아닐레이트 또는 데옥시구아닐레이트에 대해 "G". 우리딜레이트에 대해 "U", 데옥시티미딜레이트에 대해 "T", 퓨린(A 또는 G)에 대해 "R", 피리미딘(C 또는 T)에 대해 "Y", G 또는 T에 대해 "K", A 또는 C 또는 T에 대해 "H", 이노신에 대해 "I" 및 임의의 뉴클레오티드에 대해 "N".

용어 "표현형" 또는 "표현형 형질" 또는 "형질"은 유기체의 하나 이상의 형질을 나타낸다. 표현형은 육안으로, 또는 기술분야에 알려져 있는 임의의 다른 평가 수단, 예컨대 현미경, 생화학적 분석 또는 전자기계적 분석에 의해 관찰될 수 있다. 일부 경우에, 표현형은 단일 유전자 또는 유전자좌, 즉 "단일 유전자 형질"에 의해 직접 제어된다. 다른 경우에, 표현형은 여러 유전자의 결과이다.

게놈의 "물리적 지도"는 염색체 DNA 상에서 확인 가능한 랜드마크(유전자, 마커 등을 포함함)의 선형 순서를 보여주는 지도이다. 그러나, 유전자 지도와 대조적으로, 랜드마크들 사이의 거리는 절대적이고(예를 들어, 염기쌍으로 측정되거나 분리되고 중복되는 연속적인 유전자 단편들) 유전자 재조합을 기반으로 하지 않는다.

"식물"은 전체 식물, 그것의 임의의 부분 또는 식물로부터 유도된 세포 또는 조직 배양물일 수 있다. 그러므로, 용어 "식물"은 전체 식물, 식물 성분 또는 기관(예컨대 잎, 줄기, 뿌리 등), 식물 조직, 씨, 식물 세포 및/또는 그것들의 자손 중 임의의 것을 나타낼 수 있다. 식물 세포는 식물로부터 취해진, 또는 식물로부터 취해진 세포로부터의 배양을 통해 유도된 식물의 세포이다.

"다형태"는 단순히 새로운 돌연변이로 인한 것이라고 하기에는 너무 흔한 DNA의 변이이다. 다형태는 집단에서 적어도 1%의 빈도를 가져야 한다. 다형태는 단일 뉴클레오티드 다형태, 또는 SNP, 또는 본원에서 "indel"로서 언급되는 삽입/결실 다형태일 수 있다.

"가능성 값" 또는 "p-값"은 표현형과 특정 마커 대립유전자의 존재 또는 부재의 특정 조합이 무작위일 통계학적 가능성이다. 그러므로, 가능성 득점이 낮을수록, 표현형과 특정 마커가 공동으로 분리될 가능성은 더 크다. 일부 측면으로, 가능성 득점은 "유의미한" 또는 "비-유의미한"으로 여겨진다. 일부 실시양태에서, 무작위 모음의 0.05의 가능성 득점(p=0.05, 또는 5% 가능성)은 공동-분리의 유의미한 표시로 여겨진다. 그러나, 허용되는 가능성은 50% 미만의 임의의 가능성일 수 있다(p=0.5). 예를 들어, 유의미한 가능성은 0.25 미만, 0.20 미만, 0.15 미만, 0.1 미만, 0.05 미만, 0.01 미만 또는 0.001 미만일 수 있다.

용어 "자손"은 교배로부터 생성된 자손을 나타낸다.

"자손 식물"은 두 식물 사이의 교배로부터 생성된다.

"참조 서열"은 서열 비교를 위한 기본으로서 사용된 규정된 서열이다. 참조 서열은 유전자좌에서 많은 라인의 유전자형을 분석하고, 뉴클레오티드 서열을 서열 배열 프로그램(예컨대 서열분석기)으로 배열한 후, 배열의 일치 서열을 얻음으로써 얻어진다.

"단일 뉴클레오티드 다형태(SNP)"는 게놈의 단일 뉴클레오티드 -A, T, C 또는 G- (또는 다른 공유 서열)가 생물학적 종의 구성원들 또는 개체에서 쌍을 이룬 염색체 사이에서 상이할 때 발생하는 DNA 서열 변이이다. 예를 들어, 상이한 개체로부터의 2개의 서열 분석된 DNA 단편, AAGCCTA에서 AAGCTTA까지는 단일 뉴클레오티드의 차이를 함유한다.

용어 "대두 식물"은 전체 대두(Glycine max) 식물, 대두 식물 세포, 대두 식물 원형질체, 대두 식물 세포 또는 그것으로부터 대두 식물이 재생될 수 있는 대두 조직 배양물, 대두 식물 캘리, 및 대두 식물 또는 대두 식물의 부분에서 무상인 대두 식물 세포, 예컨대 대두 씨, 대두 꼬투리, 대두 꽃, 대두 떡잎, 대두 잎, 대두 줄기, 대두 싹, 대두 뿌리, 대두 근단 등을 포함한다.

구절 "엄격한 조건 하에서"는 프로브 또는 폴리뉴클레오티드가, 전형적으로 핵산의 복잡한 혼합물에서, 본질적으로 다른 서열이 아닌 특이적 핵산 서열에 혼성화할 조건을 나타낸다. 엄격한 조건은 서열-의존성이며 상이한 환경에서는 다를 것이다.

더 긴 서열이 고온에서 특이적으로 혼성화한다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 pH에서 특이적 서열에 대한 열적 용융점(Tm)보다 약 5 내지 10℃ 낮도록 선택된다. Tm은 표적에 상보하는 프로브의 50%가 평형에서(표적 서열이 과량으로 존재하기 때문에, Tm에서, 프로브의 50%가 평형에서 점유됨) 표적 서열에 혼성화하는 온도(규정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에서)이고, 엄격한 조건은 염 농도가 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온, 전형적으로 pH 7.0 내지 8.3에서 농도로 약 0.01 내지 1.0 M 나트륨(또는 다른 염)이며, 온도는 짧은 프로브(예컨대 10 내지 50개의 뉴클레오티드)에 대해 적어도 약 30℃이고 긴 프로브(예컨대 50개보다 많은 뉴클레오티드)에 대해 적어도 약 60℃이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가로 이루어질 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화에 대해, 양성 신호는 적어도 2배 배경, 바람직하게는 10배 배경 혼성화이다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 자주 다음과 같다: 50% 포름아미드, 5xSSC 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이션, 또는 5xSSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이션, 0.2xSSC 및 0.1% SDS에서 65℃에서 세척함. PCR에 대해, 비록 어닐링 온도가 프라이머 길이에 따라 약 32℃ 내지 48℃ 사이로 다를 수 있긴 하지만, 약 36℃의 온도가 낮은 엄격성 증폭에 대해 전형적이다. 혼성화 매개변수들을 측정하기 위한 추가의 지침은 많은 참고문헌들에서 제공된다.

서열 배열 및 퍼센트 동일성 계산은 한정하는 것은 아니지만, LASERGENE® 생물정보학 컴퓨팅 스위트(DNASTAR® Inc., Madison, Wis.)의 MEGALIGN® 프로그램을 포함하여, 상동성 서열을 검출하기 위해 디자인된 다양한 비교 방법들을 사용하여 측정될 수 있다. 다르게 진술되지 않는 한, 본원에서 제공된 서열들의 다중 배열은 배열의 Clustal V 방법(Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989))을 사용하여 수행되었고, 이때 디폴트 매개변수는 (갭 페널티=10, 갭 길이 페널티=10)이고, Clustal V 방법을 사용하는 쌍방식 배열 및 단백질 서열들의 퍼센트 동일성의 계산을 위한 디폴트 매개변수들은 KTUPLE=1, 갭 페널티=3, 윈도우=5 및 DIAGONALS SAVED=5이다. 핵산에 대해 이들 매개변수는 KTUPLE=2, 갭 페널티=5, 윈도우=4 및 DIAGONALS SAVED=4이다. Clustal V 프로그램을 사용하여 서열의 배열 후에, 동일 프로그램상의 "서열 거리" 표를 보고 "퍼센트 동일성" 및 "다이버전스" 값을 얻는 것이 가능하다; 다르게 진술되지 않는 한, 본원에서 제공되고 청구된 퍼센트 동일성 및 다이버전스는 이런 방식으로 계산되었다.

본 기술 주제를 상세하게 기술하기 전에, 본 발명이 특정 실시양태들에 한정되지 않는다는 것이 인지되어야 한다. 또한 본원에 사용된 용어는 특정 실시양태들을 기술할 목적이며, 한정하는 것으로 의도되지 않은 것이 인지되어야 한다. 본원에서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는, 예를 들어 단일 형태를 나타내는 것으로 사용된 용어들은 내용이 분명하게 다른 것을 나타내지 않는 한 복수의 기술 주제를 포함한다. 그러므로, 예를 들어 "식물"에 대한 언급은 어떤 형태로든 복수의 식물을 또한 포함한다. 맥락에 따라, 용어 "식물"의 사용은 또한 유전적으로 유사한 또는 동일한 그 식물의 자손을 포함할 수 있다. 용어 "핵산"의 사용은 선택적으로 그 핵산 분자의 많은 복사물을 포함한다.

유전자 지도 작성

아주 때때로 특정 표현형, 예컨대 PRSR에 대한 증가된 내성과 상관이 있는 특이적 유전자좌가 유기체의 게놈에서 지도 작성될 수 있는 것이 인지되었다. 식물 재배자는 결합 불균형으로서 표시된, 원하는 표현형과 공동-분리될 통계학적으로 유의미한 가능성을 보이는 마커 대립유전자를 검출함으로써 원하는 개체를 확인하기 위해 유익하게도 분자 마커를 사용할 수 있다. 관심의 형질과 공동-분리되는 분자 마커 또는 분자 마커들의 클러스터를 확인함으로써, 재배자는 적절한 분자 마커 대립유전자를 선택함으로써 원하는 표현형을 신속하게 선택할 수 있다(마커-보조된 선택, 또는 "MAS"로 불리는 과정).

관심의 형질, 예컨대 PRSR에 대한 증가된 내성과 공동-분리되는 분자 마커 또는 분자 마커들의 클러스터를 검출하기 위해 이용할 수 있는 다양한 방법들이 기술분야에 잘 알려져 있다. 이들 방법의 기저에 있는 기본적인 개념은 마커의 검출이고, 그것에 대해 대체 유전자형(또는 대립유전자)은 유의미하게 상이한 평균 표현형을 가진다. 그러므로, 당업자는 대체 유전자형들(또는 대립유전자들) 중의 차이의 크기 또는 그 차이의 유의미성의 수준의 마커 유전자좌들 중에서 비교를 수행한다. 형질 유전자들은 가장 크게 연관된 유전자형 차이를 가지는 마커(들)에 가장 가깝게 위치했을 것으로 추론된다.

관심의 형질 유전자좌를 검출하기 위해 사용된 두 가지 그런 방법은 다음과 같다: 1) 집단-기반 회합(association) 분석 및 2) 전통적인 결합 분석. 집단-기반 회합 분석에서, 라인은 다수의 발견자를 가지는 기존 집단, 예컨대 엘리트 사육 라인으로부터 얻어진다. 집단-기반 회합 분석은 결합 불균형(LD)의 쇠퇴 및 비구조화 집단에서, 관심의 형질을 조절하는 유전자들과 그런 유전자들과 밀접하게 결합된 마커들 사이의 상관관계만이 매우 많은 세대의 무작위 교배 후에도 남아있을 것이라는 개념에 의존한다. 실제로는, 대부분의 기존 집단은 집단 하위구조를 가진다. 그러므로, 구조화된 회합 접근법의 사용은 게놈 전체에 걸쳐 무작위로 분포된 마커들로부터 얻어진 데이터를 사용하여 개체들을 집단으로 할당하고, 그로써 개별적인 집단(하위집단으로도 불림) 내의 집단 구조로 인한 불균형을 최소화함으로써 집단 구조를 제어하는 것을 돕는다. 표현형 값은 하위집단의 각 라인에 대하여 각각의 마커 유전자좌에서 유전자형(대립유전자)과 비교된다. 유의미한 마커-형질 회합은 마커 유전자좌와 그 형질의 발현에 포함된 하나 이상의 유전자좌 사이의 용량 근접성을 가리킨다.

동일한 원리가 전통적 결합 분석의 기저에 있다; 그러나, LD는 소수의 발견자들로부터 집단을 생성함으로써 생성된다. 발견자들은 구성된 집단 내에서 다형태의 수준을 최대화하기 위해 선택되고, 다형태 부위들은 주어진 표현형과의 공동분리의 수준에 대해 평가된다. 많은 통계학적 방법이 유의미한 마커-형질 회합을 확인하기 위해 사용되었다. 한 가지 그런 방법은 간격 지도 작성 접근법(Lander and Botstein, Genetics 121:185-199 (1989))으로, 방법에서 유전자 지도를 따라 많은 위치(1 cM 간격으로 불림)의 각각은 관심의 형질을 제어하는 유전자가 그 위치에 위치할 가능성에 대해 시험된다. 유전자형/표현형 데이터는 각각의 시험 위치에 대해 LOD 득점(가능성 비율의 로그)을 계산하기 위해 사용된다. LOD 득점이 한계값을 초과할 때, 유전자 지도(두 특정 마커 유전자좌 사이에 속할 것임) 상의 그 위치에서 관심의 형질을 제어하는 유전자의 위치에 대한 유의미한 증거가 있다.

PRSR 내성과 연관된 마커들

PRSR 내성과 연관된 마커들은 본원에서 확인된다. 방법은 대두 식물의 생식질에서 증대된 내성과 연관된 적어도 하나의 마커 대립유전자의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 마커 유전자좌는 BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A 및 InDel_1, 및 이들 마커에 결합된 임의의 다른 마커(결합된 마커들은 공공연하게 이용할 수 있는 SoyBase 자원으로부터 측정될 수 있다)를 포함하여, 표 6에 제공된 마커 유전자좌들 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다. 마커 유전자좌는 BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T, BARCSOYSSR_07_0286, BARCSOYSSR_07_0289, BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C, BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T, Gm07_5480878_G_A, BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C, BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, InDel_2, InDel_1, BARCSOYSSR_07_0297, BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G, BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C, BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T, BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C, BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A, BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C, BARCSOYSSR_07_0300 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C 및 이 마커에 결합된 임의의 다른 마커(결합된 마커들은 SoyBase 자원으로부터 측정될 수 있다)를 포함하여, 표 6에 제공된 마커 유전자좌들 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다.

단일 염색체 상의 게놈 DNA의 연속적인 선형 범위에 위치한 유전자 요소들 또는 유전자들은 물리적으로 결합된다. BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C는 둘 다 PRSR 내성과 고도로 연관되고, PRSR 내성 유전자좌를 묘사한다. 서열번호 6(BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T에 대한 SNP 공급원 서열)과 서열번호 24(BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C에 대한 SNP 공급원 서열) 사이에 있고 이것들을 포함하는 연속적인 DNA로 조립하는 임의의 폴리뉴클레오티드는 PRSR 내성과 연관된 마커 유전자좌들을 수용할 수 있다.

단일 염색체상의 게놈 DNA의 연속적인 선형 범위에 위치한 유전자 요소들 또는 유전자들은 BARCSOYSSR_07_0295 및 InDel_1의 하위간격에 대해 물리적으로 결합된다. BARCSOYSSR_07_0295 및 InDel_1은 둘 다 PRSR 내성과 고도로 연관되고, PRSR 내성 유전자좌를 묘사한다. 서열번호 43(BARCSOYSSR_07_0295에 대한 순방향 프라이머 서열)과 서열번호 58(Indel_1에 대한 역방향 프라이머 서열) 사이에 있고 이것들을 포함하는 연속적인 DNA로 조립하는 임의의 폴리뉴클레오티드는 PRSR 내성과 연관된 마커 유전자좌들을 수용할 수 있다.

결합의 공통 척도는 형질과 공동분리되는 빈도이다. 이것은 공동분리의 백분율(재조합 빈도)로서 또는 센티모건(cM)으로 표시될 수 있다. CM은 유전자 재조합 빈도의 측정 단위이다. 1 cM은 단일 세대에서의 교차로 인해 한 유전자좌에서의 형질이 다른 유전자좌에서의 형질로부터 분리될 1%의 기회와 같다(형질이 시간의 99%와 함께 분리되는 것을 의미함). 염색체상의 거리가 형질들 사이의 교차 사건의 빈도에 대략적으로 비례하기 때문에, 재조합 빈도와 상관이 있는 대략적인 물리적 거리가 있다.

마커 유전자좌들은 그 자체로 형질이고 분리 중에 마커 유전자좌들을 추적함으로써 표준 결합 분석에 따라 평가될 수 있다. 그러므로, 1 cM은 마커 유전자좌가 단일 세대에서의 교차로 인해 다른 유전자좌로부터 분리될 1%의 기회와 같다.

표 4에 열거된 마커들에 결합된 다른 마커들이 대두 식물에서 PRSR 내성을 예측하는 데 사용될 수 있다. 이것은 50 cM 미만(예컨대 약 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0.75 cM, 0.5 cM 또는 0.25 cM 이하)의, PRSR 내성과 연관된 마커들인 BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T, BARCSOYSSR_07_0286, BARCSOYSSR_07_0289, BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C, BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T, Gm07_5480878_G_A, BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C, BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, InDel_2, InDel_1, BARCSOYSSR_07_0297, BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G, BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C, BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T, BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C, BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A, BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C, BARCSOYSSR_07_0300 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C 내에 있는 임의의 마커를 포함한다. 마커가 관심의 형질을 제어하는 유전자에 더 가까울수록, 원하는 형질에 대한 표시자로서 마커는 더 효과적이고 유익하다. 밀접하게 결합된 유전자좌들은 약 10% 이하, 바람직하게는 약 9% 이하, 더 바람직하게는 약 8% 이하, 보다 더 바람직하게는 약 7% 이하, 더욱 더 바람직하게는 약 6% 이하, 보다 더 바람직하게는 약 5% 이하, 더욱 더 바람직하게는 약 4% 이하, 더 바람직하게는 약 3% 이하, 여전히 더 바람직하게는 약 2% 이하의 내부-유전자좌 교차 빈도를 나타낸다. 고도로 바람직한 실시양태들에서, 관련된 유전자좌들(예컨대 마커 유전자좌 및 표적 유전자좌)은 약 1% 이하, 예컨대 약 0.75% 이하, 더 바람직하게는 약 0.5% 이하, 또는 더욱 바람직하게는 약 0.25% 이하의 재조합 빈도를 나타낸다. 그러므로, 유전자좌들은 약 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0.75 cM, 0.5 cM 또는 0.25 cM 이하로 떨어져 있다. 다른 방법을 보면, 동일한 염색체에 국한되고, 그런 거리에서 두 유전자좌 사이의 재조합이 10% 미만(예컨대 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.75%, 0.5%, 0.25% 이하)의 빈도에서 일어나는 두 유전자좌는 서로에 대해 "근접한 것"으로 말할 수 있다.

특정 마커 대립유전자가 PRSR에 대한 증가된 내성으로 공동-분리를 나타낼 수 있더라도, 마커 유전자좌가 본질적으로는 PRSR 내성 표현형의 발현의 원인이 아니라는 것을 주지하는 것이 중요하다. 예를 들어, 마커 폴리뉴클레오티드 서열이 PRSR에 대한 증가된 내성을 부여하는 유전자의 일부가 되는 것이 필요조건은 아니다(예를 들어, 유전자 오픈 리딩 프레임의 부분임). 특이적 마커 대립유전자와 증가된 PRSR 내성 표현형 사이의 회합은 마커 대립유전자와 대립유전자가 기원하는 조상의 대두 라인의 대립유전자 사이의 원래의 "커플링" 결합 단계로 인한 것이다. 궁극적으로, 반복된 재조합으로, 마커와 유전자좌 사이의 교차 사건은 이런 방향을 변화시킬 수 있다. 이런 이유로, 유리한 마커 대립유전자는 분리 집단을 생성하기 위해 사용된 내성 부모 내에 존재하는 결합 단계에 좌우되는 변화일 수 있다. 이것은 마커가 표현형의 분리를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다는 사실을 변화시키지 않는다. 그것은 단지 어떤 마커 대립유전자가 주어진 분리 집단에서 유리한 것으로 여겨지는지를 변화시킬 뿐이다.

용어 "염색체 간격"은 본 개시에서 진술되는 마커들 중 임의의 것에 의해 규정된 임의의 및 모든 간격을 나타낸다. PRSR 내성과 상관이 있는 염색체 간격이 제공된다. 염색체 7 상에 위치한 이 간격은 BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C를 양 옆에 포함한다. 염색체 간격 BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C의 하위간격은 BARCSOYSSR_07_0295 및 InDel_1이다.

기술분야에 잘 알려져 있는 다양한 방법들이 염색체 간격을 확인하는 데 활용될 수 있다. 그런 염색체 간격의 경계는 관심의 형질을 제어하는 유전자에 결합될 마커들을 포함하기 위해 유도된다. 달리 표현하면, 염색체 간격은 그 간격 내에 있는 임의의 마커(간격의 경계를 규정하는 말단 마커들을 포함함)가 PRSR 내성에 대한 마커로서 사용될 수 있도록 유도된다. 상기 기술된 간격은 PRSR 내성과 공동-분리되는 마커들의 클러스터를 포함한다. 마커들의 클러스터링은 염색체 상의 상대적으로 작은 도메인에서 발생하고, 그것은 그런 염색체 영역에서 관심의 형질을 제어하는 유전자의 존재를 가리킨다. 간격은 PRSR 내성과 공동-분리되는 마커들을 포함하기 위해 유도되었다. 간격은 말단을 규정하는 마커들뿐 아니라 간격 내에서 지도가 작성되는 마커들을 포함한다. 예를 들어, 간격 BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C는 Glyma2.0 참조 게놈을 기반으로 368,797 bp만큼 떨어져 있고, PRSR 내성과 공동-분리되는 마커들의 클러스터를 포함하는 염색체 간격을 규정한다. 제2 실례는 Glyma2.0 참조 게놈을 기반으로 61,874 bp만큼 떨어져 있는 하위간격, BARCSOYSSR_07_0295 및 InDel_1을 포함하고, 그것은 PRSR 내성과 공동-분리되는 마커들의 클러스터를 포함하는 염색체 간격을 규정한다. 간격의 종점을 규정하는 말단 마커들에 의해 기술된 간격은 그런 마커들이 현재 알려져 있거나 알려져 있지 않거나 간에, 말단 마커들 및 그 염색체 도메인 내에 국한된 임의의 마커를 포함할 것이다.

염색체 간격은 또한 관심의 마커에 결합된(관심의 마커로 결합 불균형을 나타내는) 마커들에 의해 규정될 수 있고, 회합 연구의 맥락에서 결합 불균형(LD)의 공통 척도이다. 만약 BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C의 간격, BARCSOYSSR_07_0295 및 InDel_1의 하위간격, 또는 BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C의 임의의 다른 하위간격 내에 놓여있는 임의의 염색체 7 마커 유전자좌와, 증가된 PRSR 내성과 관련된 대립유전자를 가지는 그 간격 내의 확인된 마커 사이의 LD의 r² 값이 1/3보다 크면(Ardlie 등 Nature Reviews Genetics 3:299-309 (2002)), 유전자좌들이 결합된다.

본원에 개시된 기술 주제의 마커는 또한 마커 유전자좌에 있는 대립유전자들의 조합일 수 있거나, 그렇지 않으면 하플로타입으로서 알려져 있다. 숙련된 당업자는 본원에서 확인된 염색체 7 마커에 및 그 주변에 있는 마커 유전자좌들에 추가의 다형태 부위들이 있을 것으로 예상할 수 있을 것이고, 이때 하나, 또는 더 많은 다형태 부위는 증가된 PRSR 내성과 관련된 대립유전자와 결합 불균형(LD) 상태에 있다. 상이한 다형태 부위에 있는 두 특정 대립유전자는 부위들 중 한 부위에 대립유전자의 존재가 동일 염색체 상의 다른 부위에 있는 대립유전자의 존재를 예측하는 경향이 있다면 LD에 있는 것으로 말할 수 있다(Stevens, Mol. Diag. 4:309-17 (1999)).

마커 보조 선택

분자 마커는 다양한 식물 재배 적용에 사용될 수 있다(예컨대 Staub 등 (1996) Hortscience 729-741; Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Reporter 1: 3-8 참조). 관심의 주요 지역들 중 하나는 마커-보조된 선택(MAS)을 사용하여 유전자를 역교배 및 유전자이입하는 효율을 증가시키는 것이다. 원하는 표현형 형질에 영향을 미치는 유전자좌와의 결합을 증명하는 분자 마커는 식물 집단의 형질의 선택을 위한 유용한 도구를 제공한다. 이것은 표현형이 분석하기 어려운 경우에, 예컨대 많은 질병 내성 형질, 또는 식물 발달의 후기 단계에서 일어나는 경우에, 예컨대 씨 특성의 경우에 특히 사실이다. DNA 마커 분석이 덜 힘들고 필드 표현형분석보다 적은 물리적 공간을 차지하기 때문에, 훨씬 더 큰 집단이 분석될 수 있고, 수령체 라인으로 이동된 공여자 라인으로부터의 표적 분절을 가지는 재조합체를 발견하는 기회가 증가된다. 결합이 더 밀접할수록 마커는 더 유용한데, 재조합이 마커와 형질을 유발하는 유전자 사이에서 일어날 가능성이 더 적기 때문이며, 그것은 거짓 양성을 초래할 수 있다. 양 옆의 마커를 가지는 것은 거짓 양성 선택이 필요할 수 있는 이중 재조합 사건으로서 일어날 기회를 감소시킨다. 이상적인 상황은 유전자 자체에서 마커를 가지는 것이고, 그로써 재조합이 마커와 유전자 사이에서 일어날 수 없는 것이다. 그런 마커는 '완벽한 마커'로 불린다.

유전자가 MAS에 의해 유전자이입될 때, 그것은 도입되는 유전자일뿐 아니라 측면 영역이다(Gepts. (2002). Crop Sci; 42: 1780-1790). 이것은 "결합 드래그"로서 언급된다. 공여자 식물이 수령체 식물과 고도로 관련되지 않는 경우에, 이들 측면 영역은 작물학적으로 바람직하지 못한 형질을 코딩할 수 있는 추가의 유전자들을 운반한다. 이 "결합 드래그"는 또한 엘리트 대두 라인으로 역교배되는 다중 사이클 후에도 감소된 수확량 또는 다른 부정적인 작물학적 특성을 초래할 수 있다. 이것은 또한 때때로 "수확량 드래그"로서 언급된다. 측면 영역의 크기는 추가의 역교배에 의해 감소될 수 있지만, 재배자가 영역의 크기 또는 재조합 파괴점 이상으로 제어하지 못하기 때문에, 이것이 언제나 성공적인 것은 아니다(Young 등, (1998) Genetics 120:579-585). 고전적 재배에서 공여자 분절의 크기의 감소에 기여하는 재조합이 선택될 기회에 의해서만 보편적이다(Tanksley 등 (1989). Biotechnology 7: 257-264). 이 유형의 역교배에서 20회의 역교배 후에도, 당업자는 선택되는 유전자에 여전히 결합된 공여자 염색체의 상당한 조각을 발견할 것으로 예상할 수 있다. 그러나 마커를 보면, 관심의 유전자 근처에서 재조합을 경험한 그런 드문 개체를 선택하는 것이 가능하다. 150개의 역교배 식물에서, 적어도 한 식물이 단일 감수분열 지도 거리를 기준으로, 유전자의 1 cM 내에서 교차를 경험할 기회가 95% 있다. 마커들은 그런 개체들의 명백한 확인을 공언할 것이다. 300개의 식물의 하나의 추가의 역교배로, 유전자의 다른 쪽의 1 cM의 단일 감수분열 지도 거리 내에서 교차의 기회가 95% 있고, 그로 인해 단일 감수분열 지도 거리를 기준으로 2 cM 미만의 표적 유전자 주변에 분절이 생성된다. 이것은 마커들을 사용하여 두 세대 안에 이루어질 수 있는 한편, 마커들이 없으면 평균 100 세대를 필요로 할 것이다(Tanksley 등 참조, 상기동일). 유전자의 정확한 위치가 알려져 있을 때, 유전자를 둘러싸고 있는 측면 마커들이 상이한 집단 크기의 재조합에 대한 선택을 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 더 작은 집단 크기에서, 재조합은 유전자로부터 한층 더 멀리 있을 것으로 예상될 수 있고, 그로써 더 먼 쪽의 측면 마커들이 재조합을 검출하기 위해 필요할 것이다.

대두 참조 게놈의 이용성 및 증가하는 밀도의 공공연한 대두 마커들을 함유하는 대두 게놈의 일치 결합 지도는 대두 유전자 지도 작성 및 MAS를 용이하게 하였다. 예컨대 어셈블리 Glyma1.1 및 Glyma2.0 및 비교용 Glycine max Consensus 4.0 참조(이것들은 SoyBase 웹사이트상에서 온라인으로 이용 가능함).

MAS의 함축에 대한 핵심 성분은 (i) 그 안에서 마커-형질 회합이 측정되고, 분리 집단, 또는 무작위 또는 구조화된 집단일 수 있는 집단을 규정하고; (ii) 형질에 대하여 다형태 마커들의 분리 또는 회합을 모니터링하고, 통계학적 방법을 사용하여 결합 또는 회합을 측정하며; (iii) 통계학적 분석의 결과를 기반으로 바람직한 마커들의 세트를 규정하고, 및 (iv) 마커-기반 선택 결정이 이루어지는 것을 가능하게 하기 위한 재배 생식질의 현재 세트에 대한 이런 정보의 사용 및/또는 외삽이다. 본 개시에서 기술된 마커들, 뿐만 아니라 FLP와 같은 다른 마커 유형들이 마커 보조 선택 프로토콜에서 사용될 수 있다.

SSR은 6 bp 미만의 길이를 가지는 나란히 반복된 DNA의 상대적으로 짧은 작동으로서 규정될 수 있다(Tautz (1989) Nucleic Acid Research 17: 6463-6471; Wang 등 (1994) Theoretical and Applied Genetics, 88:1-6). 다형태는 아마도 DNA 복제 중에 불이행에 의해 유발된 많은 반복 유닛의 변이로 인해 발생한다(Levinson and Gutman (1987) Mol Biol Evol 4: 203-221). 반복 길이의 변이는 보존된 비-반복적 측면 영역에 대해 PCR 프라이머를 디자인함으로써 검출될 수 있고(Weber and May (1989) Am J Hum Genet. 44:388-396), SSR은 그것이 다중-대립유전자이고, 공동 우성이며, 재생 가능하고 쉽게 고처리량 자동화가 될 수 있기 때문에 지도 작성 및 MAS에 아주 잘 맞는다(Rafalski 등 (1996) Generating and using DNA markers in plants. In Non-mammalian genomic analysis: a practical guide. Academic Press, pp 75-135).

다양한 유형의 SSR 마커가 생성될 수 있고, 내성 라인들로부터의 SSR 프로파일은 증폭 생성물의 겔 전기영동에 의해 얻어질 수 있다. 마커 유전자형의 득점은 증폭된 단편의 크기를 기준으로 한다. 대두에 대한 SSR 작업은 캐나다 퀘벡 소재의 Saint-Jean-sur-Richelieu의 DNA 랜드마크에 의한 계약을 근거로 대중이 이용할 수 있다.

다양한 유형의 FLP 마커들이 또한 생성될 수 있다. 가장 통상적으로는, 증폭 프라이머가 단편 길이 다형태를 생성하기 위해 사용된다. 그런 FLP 마커들은 많은 방법에서 SSR 마커들과 유사하고, 단 프라이머들에 의해 증폭된 영역은 전형적으로 고도로 반복적인 영역이 아니다. 여전히, 증폭된 영역 또는 암플리콘은 자주 삽입 또는 결실로 인해, 생식질 중에서 충분한 가변성을 가질 것이어서, 증폭 프라이머들에 의해 생성된 단편들이 다형태 개체들 중에서 구별될 수 있고, 그런 indel은 대두에서 빈번하게 일어나는 것으로 알려진다(Bhattramakki 등 (2002). Plant Mol Biol 48, 539-547; Rafalski (2002b), 상기 동일).

SNP 마커들은 단일 염기쌍 뉴클레오티드 치환을 검출한다. 모든 분자 마커 유형 중에서, SNP는 가장 풍부하고, 그로써 최고의 유전자 지도 해결을 제공할 수 있는 가능성을 가진다(Bhattramakki 등 2002 Plant Molecular Biology 48:539-547). SNP는 SSR보다 더 높은 수준의 처리량, 소위 '초-고-처리량'에서도 분석될 수 있는데, SNP가 대량의 DNA를 필요로 하지 않고 분석의 자동화가 복잡하지 않을 수 있기 때문이다. SNP는 또한 상대적으로 저렴한 비용 시스템이라는 전망이 있다. 이들 세 가지 인자는 함께 SNP를 MAS에 사용하기에 고도로 매력적으로 만든다. SNP 유전자형 분석을 위해, 한정하는 것은 아니지만, 혼성화, 프라이머 연장, 올리고뉴클레오티드 결찰, 뉴클레아제 절단, 미니서열분석 및 코딩된 스피어를 포함한, 여러 방법이 이용될 수 있다. 그런 방법은: Gut (2001) Hum Mutat 17 pp, 475-492: Shi (2001) Clin Chem 47, pp. 164-172; Kwok (2000) Pharmacogenomics 1, pp. 95-100: Bhattramakki and Rafalski (2001) Discovery and application of single nucleotide polymorphism markers in plants에서 개관된다. 또: R, J Henry, Ed, Plant Genotyping: The DNA Fingerprinting of Plants, CABI Publishing, VVallingford에서 개관된다. 광범위한 상업적으로 이용 가능한 기술들은 SNP에서 정보를 얻기 위해 이들 및 다른 방법들을 활용하는데, Masscode^TM (Qiagen), Invader® (Third Wave Technologies), SnapShot® (Applied Biosystems), Taqman® (Applied Biosystems) 및 Beadarrays^TM(Illumina)이 여기에 포함된다.

서열 내에서 많은 SNP는 함께, 또는 결합된 서열 전체에서, 임의의 특정 유전자형에 대해 하플로타입을 기술하기 위해 사용될 수 있다(Ching 등 (2002), BMC Genet. 3:19 pp Gupta 등 2001, Rafalski (2002b), Plant Science 162:329-333). 하플로타입은 단일 SNP보다 더 많은 정보를 알려줄 수 있고 임의의 특정 유전자형을 더 잘 설명해줄 수 있다. 예를 들어, 단일 SNP는 증가된 PRSR 내성을 가진 특이적 라인 또는 여러 가지에 대해 대립유전자 'T'일 수 있지만, 대립유전자 'T'는 또한 반복되는 부모에 대해 활용되는 대두 재배 집단에서 일어나야 한다. 이 경우에, 하플로타입, 예컨대 결합된 SNP 마커들에서 대립유전자들의 조합은 더 많은 정보를 알려줄 수 있다. 일단 독특한 하플로타입이 공여자 염색체 영역에 배정되면, 그 하플로타입은 그 집단에서 또는 그것의 임의의 하위세트에서 어떤 개체가 특정 유전자를 가지는 지를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면 WO2003054229 참조. 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 사람들에게 알려져 있는 자동화된 고 처리량 마커 검출 플랫폼을 사용하는 것은 이 방법을 고도로 효율적이고 효과적으로 만든다.

표 6에 열거된 마커들에 대한 서열들은 본 개시에서 기술된 염색체 간격 내에서 추가의 다형태 SNP(및 다른 마커들)를 얻기 위해 쉽게 사용될 수 있다. 기술된 지도 영역 내의 마커들은 기술된 마커들과 동일한 대략적인 위치에서 새로운 서열들을 발견하기 위해 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 다른 게놈 라이브러리에 혼성화될 수 있고, 또는 게놈 서열들과 전자적으로 배열될 수 있다.

상기 기술된 SSR, FLP 및 SNP에 더불어, 한정하는 것은 아니지만 발현된 서열 태그(EST), EST 서열들로부터 유도된 SSR 마커들, 무작위로 증폭된 다형태 DNA(RAPD) 및 다른 핵산 기반 마커들을 포함하여, 다른 유형의 분자 마커들이 또한 광범위하게 사용된다.

아이소자임 프로파일 및 결합된 형태학적 특성들은, 일부 경우에, 또한 직접 마커로서 사용될 수 있다. 그것들이 직접적으로 DNA 차이를 검출할 수 없을지라도, 그것들은 자주 특이적 유전적 차이에 의해 영향을 받을 수 있다. 그러나, DNA 변이를 검출하는 마커들은 훨씬 더 많은 숫자이고 아이소자임 또는 형태학적 마커들보다 다형태적이다(Tanksley (1983) Plant Molecular Biology Reporter 1:3-8).

서열 배열 또는 콘티그는 또한 본원에 열거된 특이적 마커의 상류 또는 하류의 서열들을 찾기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기술된 마커들에 가까운, 이들 새로운 서열들은 다음에 기능적으로 동등한 마커들을 발견하고 개발하기 위해 사용된다. 예를 들어, 상이한 물리적 및/또는 유전자 지도는 본 개시 내에서는 기술되지 않지만 유사한 영역 내에 동등한 마커들을 위치시키기 위하여 배열된다. 이들 지도는 대두 종 내에 또는 유전적으로 또는 물리적으로 대두와 배열된 다른 종, 예컨대 녹두, 동부콩 또는 강낭콩 전체에서도 있을 수 있다.

일반적으로, MAS는 PRSR 내성과 공동-분리될 유의미한 가능성을 가지는 것으로서 확인된 다형태 마커들을 사용한다. 그런 마커들은 식물에 그것의 PRSR 내성 표현형을 제공하는 유전자 또는 유전자들 가까이에서 지도가 작성되는 것으로 간주되고, 원하는 형질, 또는 마커들에 대한 표시자로 여겨진다. 식물은 마커에서 원하는 대립유전자의 존재에 대해 시험되고, 원하는 유전자형을 하나 이상의 유전자좌에서 함유하는 식물들은 원하는 유전자형을 원하는 표현형을 따라 그들의 자손에게 전달하는 것으로 예상된다. 본원에 기술된 마커 유전자좌들 중 임의의 하나, 이를테면 BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T, BARCSOYSSR_07_0286, BARCSOYSSR_07_0289, BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C, BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T, Gm07_5480878_G_A, BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C, BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, InDel_2, nDel_1, BARCSOYSSR_07_0297, BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G, BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C, BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T, BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C, BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A, BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C, BARCSOYSSR_07_0300 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C에서 명시된 대립유전자를 가지는 식물들을 확인함으로써 증가된 PRSR 내성을 가지는 대두 식물을 확인하기 위한 수단.

본원에 제공된 간격은 증가된 PRSR 내성을 증명하는 식물들을 선택하기 위해 MAS에서 사용될 수 있다. 이 목적에 대해 BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C에 의해 규정되고 이것들을 포함하는 염색체 7 간격 내에서 지도를 작성하는 임의의 마커가 사용될 수 있다. 또한, BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C에 의해 규정되고 이것들을 포함하는 염색체 7 간격 내의 하나 이상의 마커 유전자좌에서 대립유전자를 포함하는 하플로타입이 증가된 PRSR 내성을 대두 라인 또는 변종에 도입시키기 위해 사용될 수 있다. 증가된 PRSR 내성과 관련된 대립유전자와 결합 불균형에 있는 임의의 대립유전자 또는 하플로타입이 증가된 PRSR 내성을 가진 식물들을 선택하기 위해 MAS에 사용될 수 있다.

Rps 11의 기저에 있는 후보 유전자들

재배 프로그램을 지지하는 역병균 내성 유전자형 분석을 수행하기 위해 분자 마커를 개발하는 것은 다른 유익들 중에서도: 비용 및 시간 절감; 원하는 자손의 조기 선택; 및 역병균 내성 대두 변종의 보다 정확하고 신속한 상업화를 제공한다. 상업용 식물 재배자를 위해 다양한 집단에서 스크리닝될 수 있는 고품질의 유전자 마커의 이용성이면 충분하다. 그러나, 원인이 되는 유전자(들) 및 그것들의 대립유전자 변이의 확인 및 역병균 내성 표현형 형질의 기저에 있는 작용 모드는 추가의 유익을 제공한다. 표현형 형질 기저에 있는, 또는 그것과 관련된, 원인이 되는 유전자(들)의 확인은 주요 유전자 또는 QTL과 관련된 분자 마커들을 사용하는 마커 보조 재배의 한계들을 극복할 수 있다. 예를 들어, QTL 또는 한 집단에서 확인된 관심의 유전자에 결합된 분자 마커들은 상이한 유전자 기원으로부터의 물질을 재배함에 있어 다형태가 아니거나 밀착되게 결합되지 않을 수 있다. 본원에는 기술된 신규한 Rps11 내성 표현형의 기저에 잠재적으로 있는 후보 유전자들이 제시된다.

실시예

다음의 실시예들은 첨부된 청구범위를, 제한하는 것이 아닌 예시하기 위해 제공된다. 본원에 기술된 실시예 및 실시양태들은 단지 예시의 목적이고 기술분야의 숙련자들은 발명의 사상 또는 첨부된 청구범위의 범주로부터 벗어나지 않으면서 변경될 수 있는 다양한 시약 또는 매개변수들을 인지할 것임이 인지된다.

실시예 1: 역병균 소자에의 식물 물질 및 단리물

PRSR을 부여하는 것으로 알려진 총 204개의 대두 라인을 초기 평가를 위해 USDA-ARS 대두 콜렉션으로부터 선택하였다. 제1 라운드의 스크리닝 후에, 총 72개의 라인을 품종 17 및 품종 25 둘 다에 대한 내성을 운반하는 것으로 확인하였다. 두 품종 17 및 품종 25에 대한 내성은 지금까지 보고된 단일 Rps 유전자들 중에서는 드물고, 그래서 이들 라인을 다중-품종 내성에 대한 유망주로서 선택하였다. 72개의 라인을 추가의 P. 소자에 단리물로 접종한 후에 광범위한 PRSR을 보인 23개의 라인으로 한층 더 좁혔다. 추가의 분석 후에, 식물 도입(PI) 594527을 P. 소자에에 대한 그것의 강력하고 광범위한 내성 때문에 유망한 내성 라인으로서 확인하였다.

지도 작성 집단은 취약한 품종 'Williams'와 발명자들에 의해 확인된 내성 라인, PI 594527 사이의 교배로부터 유도된 58개의 F2 개체 및 209개의 F2:3 패밀리로 구성되었다. PI 594527은 USDA 대두 생식질 콜렉션에 의해 유지되고 중국 푸젠성으로부터 기증받은 대두 라인이다. PI 594527은 USDA에 의해 품종 1, 품종 3, 품종 7 및 품종 25를 포함한 많은 P. 소자에 단리물에 대한 강력한 내성을 부여하는 것으로서 보고되지만, 그 내성의 유전적 공급원은 이전에는 알려지지 않았다. F1 식물들을 온실에서 F2 집단을 생성하기 위해 자체-수분시켰다. 소량의 F2 씨를 초기 분석을 위해 유지한 한편 나머지를 밭에서 자체-수분시켜 표현형 및 유전자형 평가 둘 다를 위한 F2:3 지도 작성 패밀리를 개발하였다.

한 세트의 대두 차등을 적절한 감염을 수행한, 단리물을 보장하기 위한 모든 접종 실험에서 표준 대조표준으로서 사용하였다(Lin 등 2013). 이들 차등 체크는 Union(Rps1-a), Harosoy 13xx (Rps1-b), Williams79 (Rps1-c), PI 103091 (Rps1-d), Williams82 (Rps1-k), L76-1988 (Rps2), L83-570 (Rps3-a), PRx146-36 (Rps3-b), PRx145-48 (Rps3-c), L85-2352 (Rps4), L85-3059 (Rps5), Harosoy 62xx (Rps6), Harosoy (Rps7), PI 399073 (Rps8) 및 취약성 품종 Williams(rps)였다.

상이한 병독성을 가진 총 8개의 P. 소자에 단리물을 먼저 사용하여 대두 라인 PI 594527의 내성을 평가하였다. 이들 단리물은 ISA19A-1, ISA71D-1, ISA33O-8, 124C-1 (품종 1), pmg(10)-1 (품종 10), pmg (13)-1 (품종 13), pmg (17)-1 (품종 17), pmg (25)-1 (품종 25) 및 96-13S-106A (품종 28)였다. 대량 분리 분석 및 유전자 지도 작성을 위해, P. sojae의 단리물 124C-1 (품종 1)을 사용하여 F2 개체 및 F2:3 패밀리의 표현형 데이터를 얻었다. 단리물을 리마콩 아가(LBA) 배지(150 g/L 리마콩, 2% 아가)에서 유지하였다.

PI 594527을 그것이 품종 1, 품종 10, 품종 13, 품종 17, 품종 25, 품종 28 및 병원형이 임의의 공지된 품종 표시(표 1)와 매치되지 않는 3개의 다른 단리물을 포함하여, P. 소자에에 대해 강력하고 광범위한 내성을 가지기 때문에 유망한 내성 라인으로서 확인하였다.

표 1. P. 소자에의 상이한 단리물들과의 상호작용에 대한 대두 라인 PI 594527의 평가

실시예 2: 질병 접종 및 평가

변형된 배축 접종 기법을 모든 실험에서 질병 접종을 위해 배치하였다(Dorrance 등 2008). 짧게 설명하며, 씨를 심고 평균 온도 25℃의 온실에서 성장시켰다. 씨를 심은 후 제7 일에, 1/2 LBA상에서 성장된 14-일 배양으로부터의 균사체 슬러리를 묘목의 배축에 주입하였다(떡잎의 ~1 cm 아래). 접종 후에, 묘목을 플라스틱 뚜껑으로 12시간 이상 덮어서 감염 동안 높은 상대 습도를 확보하였다(햇빛은 직접 쪼이지 않음). 뚜껑을 제거하고 평가 전에 질병이 5 내지 7일(최대 10일) 동안 전개되도록 허용하였다.

반응을 만약 묘목이 병변의 팽창 없이 살아 있다면 내성으로서, 또는 묘목이 갈색 배축을 보이며 죽었다면 취약성으로서 기록하였다. 각 F2:3 패밀리에 대해, 12 내지 36개의 자손을 기록하였다. 12개보다 적은 묘목을 가진 임의의 패밀리를 데이터 분석으로부터 제거하였다. 패밀리를 만약 80% 이상의 자손이 생존하였다면 동형접합성 내성(R)으로서, 만약 20% 미만의 묘목이 살아있다면 동형접합성 취약성(S)으로서, 또는 만약 21 내지 79%가 죽지 않았다면 분리성(Rs)으로서 분류하였다(Gordon 등 2006; Zhang 등 2013).

PI 594527과 취약성 품종 'Williams'의 교배로부터 발생된 개별적인 F2 자손들을 대부분의 Rps 유전자들에 대해 무독성인 단리물 품종 1을 사용하여 시험하였다. 58개의 F2 자손 중에서, 45개가 내성이었고 13개가 취약성이었다. 45:13의 분리 비율은 3:1의 멘델비와 잘 맞았다(χ² = 0.21, p = 0.65)(표 2). F2 자손들의 보다 정확한 표현형 결과 및 이형접합성 내성 정보를 얻기 위하여, 본 발명자들은 따라서 F2 집단의 나머지를 F2:3 세대로 진행시키고, 계속해서 각 F2 식물로부터의 ~12 내지 36개의 F3 묘목의 득점을 매겼다. 분리 비율을 F2:3 지도 작성 집단에서 한층 더 조사하였다. R(동형접합성 내성)의 관찰된 비율: Rs(분리성): S(동형접합성 취약성)은 59:102:48이었고, 이것은 또한 1:2:1의 예상된 비율과 잘 맞았다(χ² = 1.28, p = 0.53). 모든 이들 결과는 PI 594527에서 품종 1에 대한 내성이 발명자들이 Rps11로 표시한 단일 우성 신규 내성 유전자에 의해 제어되었음을 시사하였다.

실시예 3: 샘플 수집 및 DNA 단리

어린 잎 조직을 온실에서 수집하고 사용 전에 액체 질소에 유지하거나 -80℃ 냉동고에 보관할 때까지 얼음에서 유지하였다. F2:3 패밀리에 대해, 동등한 양의 잎 조직의 혼합물을 대략 12 내지 20개의 F3 묘목으로부터 수집하였다. 그런 혼합물은 어느 정도까지는, 각각의 F2 조상 식물을 나타냈다. 게놈 DNA를 사소한 변형이 포함된 세틸 트라이메틸 암모늄 브로마이드(CTAB) 방법을 사용하여 추출하였다(Allen 등 2006). DNA 농도를 Nanodrop ND-1000 분광광도계 (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, DE)를 사용하여 측정하였다. 최종 DNA 농도를 50 ng/μl로 조정하였다.

실시예 4: 대량 분리 분석을 SNP 유전자형 분석과 결합시켰다

Rps 표현형과 관련된 유전자좌의 위치를 빠르게 확인하기 위하여 대량 분리물 분석(BSA) 방법을 F2 분리 집단에 적용하였다(Michelmore 등 1991). 내성 및 취약성 벌크를 접종 결과를 기준으로 10개의 내성 또는 10개의 취약성 F2 개체의 동량의 DNA 샘플을 모음으로써 형성하였다. 내성 및 취약성 부모 라인을 또한 SNP 유전자형 분석에 포함시켰다. SNP 유전자형 분석을 미시간 주립대학교에서 Illumina iScan 플랫폼(Illumina, Inc. San Diego, CA)을 통해 SoySNP8K BeadChip을 사용하여 수행하였다. 상세한 인피늄 II 분석 프로토콜은 Song에 의해 기술되었다(Song 등 2013). GenomeStudio 유전자형 분석 모듈 v1.8.4(Illumina, Inc. San Diego, CA)를 사용하여 SNP 대립유전자로 불렸다.

실시예 5: SSR 마커 및 PCR 분석

SSR 프라이머를 Song(Song 등 2010)으로부터 얻은 후 Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA)에 의해 합성하였다. 두 부모 라인 사이의 다형태 SSR 마커를 실험에 사용하였다. PCR 증폭을 Ping 등 2014에 따라 약간 변형시켜 수행하였다. 간단히 말하면, 각각의 PCR 반응은 총 20 μl의 부피에 100 ng의 주형 DNA, 10xPCR 완충액(2.5 mM Mg2+), 0.2 mM dNTP, 0.2 μM 순방향 및 역방향 프라이머 및 1.0 U의 Taq DNA 중합효소를 함유하였다. 95℃에서 3분 동안 초기 변성, 이어서 95℃에서 30초 동안, 55 내지 60℃에서 30초 동안 및 72℃에서 30초 동안의 35 사이클, 그리고 72℃에서 10분 동안 최종 연장하는 것으로 구성된 반응을 MyCycler 열 사이클러(Bio-Rad Lab, Hercules, CA)에서 수행하였다. PCR 생성물을 6x 로딩 완충액과 혼합하였고 에티듐 브로마이드로 염색된 4% 아가로오스 겔(DOT Scientific Inc., Burton, MI)에 의해 분리한 후 분자 영상기 겔 Doc XR 시스템(Bio-Rad Lab, Hercules, CA)에서 가시화하였다. 다음에 SSR 밴드를 겔 영상으로부터 수동으로 득점을 매겼다.

실시예 6: 데이터 분석 및 결합 지도 구성

카이-제곱(χ²분석을 수행하여 유의미성 한계값이 P = 0.05인 SPSS 22.0 소프트웨어(SPSS, Chicago, USA)를 사용하여 예상된 멘델비에 대한 적합도에 대한 표현형 데이터 및 유전자형 데이터를 시험하였다. 예상된 멘델비로부터 유의미한 분리 왜곡을 보인 마커들을 지도 구성으로부터 배제하였다. 유전자 결합 지도를 Joinmap 4.1 소프트웨어(Van Ooijen 2011)를 사용하여 구성하였다. 결합 그룹을 3.0의 한쪽 로그(LOD) 한계값을 사용하여 측정하였다.

20개의 염색체 중에서 무작위로 분포된, 총 2588개의 SNP를 두 부모 라인 사이에서 확인하였다. 단일 유전자의 유산 가설을 기반으로, 취약성 F2 벌크에서 검출된 유전자의 SNP 및 그것의 측면 영역들은 취약성 'Williams'로부터 유전된 취약성 대립유전자에 대해 동형접합성인 것으로 예상된 한편, 다른 영역은 두 대립유전자가 부모로부터 수령될 수 있기 때문에 이형접합성일 것으로 예상되었다. 그러나, 내성 F2 벌크의 SNP는 DNA 푸울에 존재한 두 동형접합성 내성 및 이형접합성 내성의 F2 자손들로 인해 언제나 이형접합성이어야 한다. 그러므로, 두 벌크는 표적 영역에서 유전적으로 유사하지 않았던 한편 모든 다른 영역에서 이형접합성이었다. 이 접근법을 사용하여, 염색체 7(MLG M) 상에서 3 Mb에서 시작하여 8 Mb까지 대략 5 Mb의 총 게놈 영역을 원인이 되는 유전자좌의 잠재적인 위치로서 확인하였다(도 1). 이 영역에서 확인된 SNP를 표 2에 나타낸다.

신규한 Rps11 유전자좌의 지도를 더 잘 작성하기 위하여, 결합 분석 및 유전자 지도 작성을 교배로부터 유도된 209개의 F2:3 패밀리를 사용하여 수행하였다. BSA 결과를 기반으로, 14개의 무작위로 분포된 SSR 프라이머를 잠정적인 지도 작성 영역으로부터 선택하였다(Song 등 2010). 4개의 다형태 SSR 마커 BARCSOYSSR_07_0223, BARCSOYSSR_07_0266, BARCSOYSSR_07_0278 및 BARCSOYSSR_07_0459를 지도 작성 집단의 두 부모 사이에서 확인하였다. 다음에 이들 4개의 마커를 사용하여 F2:3 패밀리 중 50개의 유전자형을 분석하였다. 9, 2, 0 및 14 재조합체를 각각 확인하였고, 그것은 Rps11 유전자좌가 BARCSOYSSR_07_0223과 BARCSOYSSR_07_0459 사이에 있고 BARCSOYSSR_07_0266 및 BARCSOYSSR_07_0278에 더 많이 결합되었음을 나타낸다. 예비 분석 또한 SNP-Chip 분석으로부터의 지도 작성 결과를 추가로 확인시켜 주었다.

계속해서, SSR_07_0223과 SSR_07_0459 사이에 위치한 9개의 다형태 SSR 마커를 선택하여 전체 집단의 유전자형을 분석하였다. 209개의 F2:3 패밀리로부터의 유전자형 분석 데이터의 카이-제곱 분석 결과 9개의 모든 다형태 마커가 예상한 1:2:1 분리 비율에 맞는 것으로 나타났다(표 3). 그러므로, 9개의 SSR 마커와 Rps11로 구성된 유전자 지도를 Joinmap 4.1 소프트웨어(Van Ooijen 2011)를 사용하여 구성하였다. 이 접근법에서, Rps 유전자좌를 Glyma1.1 참조 게놈에 따라 226 kb에 걸쳐 있고, SSR 마커 BARCSOYSSR_07_0286 및 BARCSOYSSR_07_0300이 양 옆에 있는 0.5 cM 영역에 대해 지도를 작성하였다(도 2). SSR 마커 BARCSOYSSR_07_0295는 유전자좌와 공동분리하는 것으로 밝혀졌다.

표 2. 염색체 7 상의 PRSR 내성 염색체 간격에서 확인된 SNP 마커. 부모 및 취약성 및 내성 벌크의 유전자형이 나열된다. 마커의 물리적 위치는 Glyma1.1 대두 참조 지도를 기준으로 한다.

표 3. PI 594527 x Williams로부터 유도된 F_2:3지도 작성 집단의 9개의 SSR 마커에 대한 카이-제곱(χ²) 적합도 시험.

^a "a"는 내성 PI 594527로부터의 마커 대립유전자에 대해 동형접합성임; "b"는 취약성 Williams로부터의 마커 대립유전자에 대해 동형접합성임; "h"는 양 부모로부터의 마커 대립유전자에 대해 이형접합성임.

실시예 7: Rps11 QTL 영역의 미세 지도 작성 및 후보 유전자 예측

미세 지도 작성 집단은 Williams와 PI594527 사이의 초기 교배로부터 유도된 2640개의 F3 개체로 구성된다. 잎 샘플을 표준 세틸 트라이메틸 암모늄 브로마이드(CTAB) 방법을 사용하는 DNA 단리를 위해 필드의 각 개체로부터 수집하였다. P. 소자에 품종 1을 재조합체의 내성 평가를 위해 사용하였다. 모든 접종 작업을 Lin 등(2013)에 의해 기술된 표준 배축 접종 방법을 사용하여 수행하였다. F3:4 패밀리는 80% 이상의 자손이 생존한다면 동형접합성 내성이고, 21 내지 79%가 생존한다면 이형접합성 내성이며, 20% 미만이 생존한다면 취약성인 것으로 여겨졌다.

SSR 마커 BARCSOYSSR_07_0286 및 BARCSOYSSR_07_0300은 염색체 7 상에서 Rps11 QTL의 양 옆에 있고, Glyma1.1 참조 게놈을 기준으로 225 kb의 물리적 거리만큼 분리되어 있다(Ping 등, 2015). 이들 측면 마커를 사용하여 전체 F3 집단을 스캔하여 재조합체를 확인하였고, 그 결과 10개의 새로운 재조합체를 확인하였다. SSR 마커에 더불어, KASP^TM 마커 및 삽입/결실(InDel) 마커 또한 재조합체의 유전자형을 분석하기 위해 개발하였다. Rps11을 SSR 마커 BARCSOYSSR_07_0295 및 InDel 마커 InDel_1에 의해 규정된 61 kb 영역으로 지도 작성하였다(도 3; 표 4). 61 kb 영역 내에서, 5개의 유전자 모델이 새로운 Glyma2.0 참조 게놈에 따라 예측되었다(표 5). 유전자 주석을 기반으로, Glyma.07G062900이 NB-ARC 도메인-함유 질병 내성 단백질을 코드화할 수 있는 유일한 유전자였다.

표 4. 마커를 염색체 7 상의 PRSR 내성에 대한 348 kb 간격에 대해 지도를 작성하였다. 부모들의 유전자형을 열거한다. 61 kb 간격에 대해 미세 지도 작성된 마커들은 진하게 그리고 회색 음영으로 표시된다. 마커들의 물리적 위치는 Glyma2.0 참조 게놈을 기준으로 한다.

표 5. 대두 참조 게놈(Glyma2.0)에 따른 61 kb의 지도 작성된 영역의 유전자 주석.

마커 프레임워크 및 마커 보조 선택을 위한 사용

한 세트의 공통 마커를 염색체 간격에서 마커들을 확인하기 위한 프레임워크를 수립하기 위해 사용할 수 있다. 표 4는 염색체 7의 유도된 유전자 결합에 대해 서로에 비해 일관된 위치에 있는 마커들을 보여준다. SSR 마커들의 물리적 위치는 SoyBase 웹사이트에서 공공연하게 이용할 수 있는 대두 참조 게놈, Glyma1.1 또는 Glyma2.0에 대한 프라이머 서열을 탐색하는 BLAST에 의해 측정된다.

관심의 유전자좌에서 유리한 대립유전자와 결합 불균형에 있는 대립유전자들을 가지는 그 유전자좌 양 옆에 밀접하게 결합된 마커들은 증가된 PRSR 내성을 가지는 자손 식물을 선택하기 위해 효과적으로 사용될 수 있다. 그러므로, 본원에 기술된 마커들, 예컨대 표 6에 열거된 것들, 뿐만 아니라 동일한 염색체 분절에 대해 유전적으로 또는 물리적으로 지도가 작성된 다른 마커들이 증가된 PRSR 내성을 가지는 대두 식물을 선택하기 위해 사용될 수 있다. 전형적으로, 이들 마커의 한 세트(예컨대 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상)가 관심의 유전자좌 양 옆의 영역에서 사용될 것이다. 선택적으로, 실제의 유전자 및/또는 유전자좌 내의 마커가 사용될 수 있다.

표 6. 염색체 7 상의 PRSR 내성 간격의 분자 마커 및 그것들의 공여자 대립유전자. 염색체 간격 내의 마커들이 마커 보조 선택에 바람직하다.

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<400> 19 ctgttccagt atttcttgct gatatctgtg gatggggttg gatggttata taggtttccg 60 yggcgacaac aatatcatcg cagatatccc gaattttctt gacaaatctg atgcaaaggt 120 a 121 <210> 20 <211> 121 <212> DNA <213> Glycine max <400> 20 cagaatttat tttagagact agctatagca aggcttgtgg ctaagccagt taccttcctg 60 mgagtgaact tgagaaagta cagaggctag ctaaggtagg tattagtcta cctaaacctg 120 a 121 <210> 21 <211> 121 <212> DNA <213> Glycine max <400> 21 gaagacatta tcgggtccac tgtaaaatta attgtttgtt ctactattgt ggacaacaca 60 ractccattc tttcagcttg attttcttgt acagtgacta catctcttct cgaaataaaa 120 a 121 <210> 22 <211> 121 <212> DNA <213> Glycine max <400> 22 gcggtttgaa ggtggcggtg gtgaggtcct gtcttggtgt tctaggtatt ttgaaggaga 60 rgagaatggg gatggtgtag ctcttgccat gtggttgggg tttggcacga ggtcatgatg 120 g 121 <210> 23 <211> 121 <212> DNA <213> Glycine max <400> 23 caaaaaaact tcatctggac tagtggctcc atatcttatg caagttaatt ggagataaat 60 ycacgctctc taaaatttcg catttttaac ttacaagcac gtgcacattt gaattactct 120 g 121 <210> 24 <211> 121 <212> DNA <213> Glycine max <400> 24 gttttgaagc ttgccgcttt gggtaagggg ccaacagtaa agacacagta gatatattga 60 maagatctct ggtggtcatg cggaacaggt ttatccacca aatctttttt tttttttttt 120 t 121 <210> 25 <211> 121 <212> DNA <213> Glycine max <400> 25 tccttaacac ccttaccgca gttacttgcc gcctcaatcc attgctgaaa tgaatgctca 60 yaaataaata tatttgcagg ctacgaatct ctgctcctag atttttgttt cttaattatt 120 t 121 <210> 26 <211> 121 <212> DNA <213> Glycine max <400> 26 aacaaacgaa ttcttggact tgttgctatg tacagtctag caactttaag aaacacgggt 60 ygtagtaagc atgacactat tacaaaagtc cttttaaaga tacttttcac aatagttcgc 120 c 121 <210> 27 <211> 121 <212> DNA <213> Glycine max <400> 27 taaaatattt aaaagaaaaa gaaaaagaaa tgagggttta aaatagaagt acaaattaaa 60 mattatcgaa aaatgaaatt agtatgcaat ataataaatg gaaccatttt cactttcacc 120 a 121 <210> 28 <211> 121 <212> DNA <213> Glycine max <400> 28 acaacttgaa gagtttattt aatcaatgtc aatcatggca aagggtgagg aatggcttgg 60 rttaaatggg atttggttgc ttcacccatt gacatggggg gttggggatt aaaaatttag 120 a 121 <210> 29 <211> 121 <212> DNA <213> Glycine max <400> 29 ttgccgtgag attcactgga aatggtttac attagtatgt gtcgagaaac aattagttcc 60 rattatcctt gcttttttaa actgttgtcc atgctatcat cttctttgaa ccatattgta 120 a 121 <210> 30 <211> 121 <212> DNA <213> Glycine max <400> 30 gcatgcatac actggtatac atgtcaatgc ttgaattgtt ttgatcacag tggtttttgt 60 rtatcttttc agattggctt atcttcatga aggtcttgaa ccaaaagttg tccaccgaga 120 t 121 <210> 31 <211> 121 <212> DNA <213> Glycine max <400> 31 atagaaggtg gtagaatctg gctgaaggca tggcagcagg cagctgtggc agtgggttcc 60 rcggtggggg cgttgttgga ccctcgaaga gcagatttga tagcagctct tggtgagacc 120 a 121 <210> 32 <211> 121 <212> DNA <213> Glycine max <400> 32 aatcagttaa gatttctgga cacgtacaaa gaaggttaca agaaatgctt atgaggaatg 60 yagattagaa gatttctagt catataaaag gatagaagga ggagaccaag aagaatgtta 120 a 121 <210> 33 <211> 121 <212> DNA <213> Glycine max <400> 33 cttgcctatc ggcagtccat catagttctc gcctatattg gcacctcgcc tatatcagcg 60 rcatctatga aggggaatgt tagaaagtct cacacgcctg attcgttctt tggatgcaac 120 t 121 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 'BARCSOYSSR_07_0241 forward primer <400> 34 caaacaaggc cgcttaaatc 20 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARCSOYSSR_07_0241 reverse primer <400> 35 tccttaaaac atgctcatgg aa 22 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARCSOYSSR_07_0266 forward primer <400> 36 ctgtcaagtg aggcaccaaa 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARCSOYSSR_07_0266 reverse primer <400> 37 cccccatgct tgttctctta 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARCSOYSSR_07_0275 forward primer <400> 38 actactcacc ggccaaaatg 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARCSOYSSR_07_0275 reverse primer <400> 39 cacactcgat cgatatccca 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARCSOYSSR_07_0278 forward primer <400> 40 ggggatcgaa aatgtcttcc 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARCSOYSSR_07_0278 reverse primer <400> 41 gacaaccgtc catcatgaca 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARCSOYSSR_07_0286 forward primer <400> 42 aaaaatcagc acccatcgac 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARCSOYSSR_07_0286 reverse primer <400> 43 agccctggcc ttattttgtt 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARCSOYSSR_07_0295 forward primer <400> 44 ctctcctttc attccccaca 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARCSOYSSR_07_0295 reverse primer <400> 45 ttcttggagc ttcggaggta 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARCSOYSSR_07_0300 forward primer <400> 46 tcgcaatatt ggctacgatg 20 <210> 47 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARCSOYSSR_07_0300 reverse primer <400> 47 ctgaaaacaa aataaaagag aacaaa 26 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARCSOYSSR_07_0320 forward primer <400> 48 tttaactgaa aatactccgg ca 22 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARCSOYSSR_07_0320 reverse primer <400> 49 tcataattta agagaccaaa ccga 24 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARCSOYSSR_07_0339 forward primer <400> 50 cgcaaggtct aatattcact cg 22 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARCSOYSSR_07_0339 reverse primer <400> 51 aaaactgatt gcaggagatt agc 23 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARCSOYSSR_07_0289 forward primer <400> 52 ggcaaaaggt aaaaagggtt t 21 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARCSOYSSR_07_0289 reverse primer <400> 53 tccccaaact ttcatcatgt 20 <210> 54 <211> 121 <212> DNA <213> Glycine max <400> 54 gtagttttga acttttgata actacaattt cgctatcaat aaaagtgtat gccctttaat 60 yatagagcag tacttccctt tcttggttat caaaatggat ggtgataaat tgtcttattt 120 t 121 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> InDel_2 forward primer <400> 55 ctccattctt ttgagtcgag t 21 <210> 56 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> InDel_2 reverse primer <400> 56 actcagggcg gatcccaaag tg 22 <210> 57 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> InDel_1 forward primer <400> 57 aataaattta ttttggaatg tatc 24 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> InDel_1 reverse primer <400> 58 tttatgttga tcccaacatg ta 22 <210> 59 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARCSOYSSR_07_0297 forward primer <400> 59 ttgtctatca aaatttaacc acgaa 25 <210> 60 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BARCSOYSSR_07_0297 reverse primer <400> 60 tccacatgtg cactgttagt gt 22

Claims

증가된 역병균 뿌리 및 줄기 썩음 내성 (PRSR)을 나타내는 대두 식물을 확인하는 방법으로, 상기 방법은 상기 대두 식물의 생식질에서 마커 유전자좌의 적어도 하나의 대립유전자를 검출하는 단계를 포함하고, 여기서
a. 상기 마커 유전자좌는 BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C를 양 옆에 포함하는 염색체 간격(chromosomal interval) 내에 위치하고; 그리고
b. 상기 적어도 하나의 대립유전자는 증가된 PRSR과 연관되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 마커 유전자좌는 BARCSOYSSR_07_0295 및 InDel_1를 양 옆에 포함하는 염색체 간격(chromosomal interval) 내에 위치하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 마커 유전자좌는 BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T, BARCSOYSSR_07_0286, BARCSOYSSR_07_0289, BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C, BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T, Gm07_5480878_G_A, BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C, BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, InDel_2, InDel_1, BARCSOYSSR_07_0297, BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G, BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C, BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T, BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C, BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A, BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C, BARCSOYSSR_07_0300, 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항의 방법에 의해 확인된 대두 식물.
제1항에 있어서, 상기 마커 유전자좌는 Glyma.07G62500, Glyma.07G62600, Glyma.07G62700, Glyma.07G62800 및 Glyma.07G62900으로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자를 포함하는, 방법.
제5항에 있어서, 상기 유전자는 Glyma.07G62900인, 방법.
증가된 역병균 뿌리 및 줄기 썩음 내성 (PRSR)을 나타내는 대두 식물을 확인하는 방법으로, 상기 방법은 하나 이상의 마커 유전자좌에서 대립유전자를 포함하는 하플로타입을 상기 대두 식물의 생식질에서 검출하는 단계를 포함하고, 여기서
a. 상기 하나 이상의 마커 유전자좌는 BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C를 양 옆에 포함하는 염색체 간격(chromosomal interval) 내에 위치하고; 그리고
b. 상기 하플로타입은 증가된 PRSR과 연관되는, 방법.
제7항에 있어서, 상기 하나 이상의 마커 유전자좌는 BARCSOYSSR_07_0295 및 InDel_1를 양 옆에 포함하는 염색체 간격(chromosomal interval) 내에 위치하는, 방법.
제7항에 있어서, 상기 마커 유전자좌는 BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T, BARCSOYSSR_07_0286, BARCSOYSSR_07_0289, BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C, BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T, Gm07_5480878_G_A, BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C, BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, InDel_2, InDel_1, BARCSOYSSR_07_0297, BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G, BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C, BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T, BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C, BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A, BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C, BARCSOYSSR_07_0300, 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제7항의 방법에 의해 확인된 대두 식물로, 상기 대두 식물은 증가된 PRSR과 연관되는 하플로타입을 그것의 생식질 내에서 포함하고, 여기서 상기 하플로타입은 BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C을 양 옆에 포함하는 염색체 간격 내에서 하나 이상의 마커 유전자좌에서 대립유전자를 포함하는, 대두 식물.
제7항에 있어서, 상기 마커 유전자좌는 Glyma.07G62500, Glyma.07G62600, Glyma.07G62700, Glyma.07G62800 및 Glyma.07G62900으로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자를 포함하는, 방법.
제11항에 있어서, 상기 유전자는 Glyma.07G62900인, 방법.
마커 보조 선택 방법으로,
a. 마커 유전자좌의 적어도 하나의 대립유전자를 가지는 제1 대두 식물을 획득하고, 여기서 상기 마커 유전자좌는 BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C를 양 옆에 포함하는 염색체 간격 내에 위치하고, 상기 마커 유전자좌의 대립유전자는 증가된 역병균 뿌리 및 줄기 썩음 내성 (PRSR)과 연관되는, 단계;
b. 상기 제1 대두 식물을 제2 대두 식물과 교배시키는 단계;
c. 자손을 상기 적어도 하나의 대립유전자에 대해 평가하는 단계; 및
d. 상기 적어도 하나의 대립유전자를 가진 자손 식물을 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
제13항에 있어서, 상기 마커 유전자좌는 BARCSOYSSR_07_0295 및 InDel_1를 양 옆에 포함하는 염색체 간격(chromosomal interval) 내에 위치하는, 방법.
제13항에 있어서, 상기 마커 유전자좌는 BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T, BARCSOYSSR_07_0286, BARCSOYSSR_07_0289, BARC_1_01_Gm07_5442375_T_C, BARC_1_01_Gm07_5457696_C_T, Gm07_5480878_G_A, BARC_1_01_Gm07_5481829_T_C, BARCSOYSSR_07_0295, BARC_1_01_Gm07_5488504_A_G, BARC_1_01_Gm07_5490895_G_T, BARC_1_01_Gm07_5495895_G_A, BARC_1_01_Gm07_5500269_T_G, BARC_1_01_Gm07_5504994_G_T, BARC_1_01_Gm07_5519521_G_A, InDel_2, InDel_1, BARCSOYSSR_07_0297, BARC_1_01_Gm07_5555040_T_G, BARC_1_01_Gm07_5580414_T_C, BARC_1_01_Gm07_5762798_C_T, BARC_1_01_Gm07_5599140_A_C, BARC_1_01_Gm07_5601844_G_A, BARC_1_01_Gm07_5610838_T_C, BARCSOYSSR_07_0300, 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제13항의 방법에 의해 선택된 대두 자손 식물로, 상기 식물은 마커 유전자좌의 적어도 하나의 대립유전자를 가지고, 여기서 상기 마커 유전자좌는 BARC_1_01_Gm07_5383355_C_T 및 BARC_1_01_Gm07_5629128_A_C을 양 옆에 포함하는 염색체 간격 내에서 위치하는, 대두 자손 식물.
제13항에 있어서, 상기 마커 유전자좌는 Glyma.07G62500, Glyma.07G62600, Glyma.07G62700, Glyma.07G62800 및 Glyma.07G62900으로 이루어지는 군으로부터 선택된 유전자를 포함하는, 방법.
제17항에 있어서, 상기 유전자는 Glyma.07G62900인, 방법.