CN105713959B - 小菜蛾对阿维菌素靶标抗性的分子检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了小菜蛾对阿维菌素靶标抗性的分子检测方法。采用根据小菜蛾谷氨酸氯离子通道基因序列设计的特异性引物，以提取的小菜蛾单头基因组DNA为模板，进行谷氨酸氯离子通道基因片段的PCR扩增，分析目标片段纯化产物直接测序色谱图即可区分小菜蛾个体的基因型(敏感纯合子SS、抗性杂合子RS和抗性纯合子RR)，检测种群样本的抗性等位基因突变频率。本发明涵盖小菜蛾谷氨酸氯离子通道基因A309V突变的检测方法及专用引物序列，该方法具有快速简便、准确性高的优点，可用于监测小菜蛾田间种群对阿维菌素的抗性等位基因频率和抗药性发生发展动态，为调整小菜蛾化学防治策略、制订延缓抗性发展措施提供重要依据。

Description

小菜蛾对阿维菌素靶标抗性的分子检测方法

技术领域

本发明涉及小菜蛾对阿维菌素靶标抗性的分子检测方法，属于生物技术领域，专用于小菜蛾对广谱杀虫杀螨剂阿维菌素(由Avermectin B1a和Avermectin B1b混合组成)靶标抗性的高灵敏度、快速分子检测。

技术背景

据统计，近年来我国蔬菜种植面积接近3亿亩/年，已是世界第一大十字花科蔬菜种植和生产国，因小菜蛾为害造成的蔬菜减产和治理费用极其高昂。小菜蛾属于鳞翅目菜蛾科，是世界范围内一种重要的十字花科蔬菜害虫，每年造成的经济损失达40～50亿美元。该物种寄主植物种类达40多种，由于其繁殖周期短、适应能力强、世代重叠严重及田间混乱用药，使小菜蛾至少已对92种杀虫活性成份产生了不同程度的抗性，几乎涉及目前所有的防治用药，其中包括多种新型药剂如阿维菌素。小菜蛾抗药性进化问题给十字花科蔬菜的产量和质量带来严重威胁和巨大挑战，科学有效的防治小菜蛾已成为植保工作者的肩头重任，开发快速准确的杀虫剂抗性检测技术迫在眉睫。

阿维菌素(Avermectin)是日本北里研究所于1975年从土壤中分离的阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵液中分离出来得到的一种大环内酯化合物，1981年由美国默克公司商品化作为兽药投放市场并获得良好业绩。阿维菌素于20世纪90年代初进入我国并很快实现了自主生产，该药剂杀虫谱广，具有杀虫杀螨杀线虫活性，能有效防治鳞翅目、蜱螨目、半翅目以及线虫等农林害虫，曾在害虫种群控制方面发挥了积极作用。但是，随着使用量的增加和使用年限的延长，昆虫自身也对阿维菌素逐渐演化出抗药性，在我国多个省份呈现逐年加重的趋势。谷氨酸配体门控氯离子通道(GluCl)是阿维菌素的主要作用靶标，在线虫Caenorhabditiselegans中研究比较广泛而深入，果蝇DmGluCla亚基的第二跨膜区存在P299S点突变，通过外源表达证实该氨基酸替换导致果蝇对球孢子酸、伊维菌素和谷氨酸的敏感性降低了10倍，为球孢子酸和伊维菌素作用于DmGluCl通道提供了直接证据(Kane等，2000)。在抗阿维菌素的二斑叶螨Tetranychusurticae品系中研究人员发现TuGluCl存在G323D点突变，这一点突变在回交后代的个体中证实与阿维菌素抗性相关(Kwon等，2010)。Dermauw等(2012)通过对二斑叶螨的基因组测序，注释了多个cysLGIC家族的基因，并进一步利用遗传学方法对GluCl的序列进行分析，发现TuGluCl1(G314D)和TuGluCl3(G326E)中存在阿维菌素抗性突变位点，认为TuGluCl1和TuGluCl3是阿维菌素对二斑叶螨的主要作用靶点。

目前，世界多地区的田间小菜蛾已对阿维菌素产生了严重的抗药性，但国内外尚未建立小菜蛾谷氨酸配体门控氯离子通道(PxGluCl)突变导致的靶标抗性的分子检测方法，基于该靶标基因的抗性检测技术局限于荧光定量PCR检测方法(专利号CN102154468B，下简称对比文件)。CN102154468B根据梁延坡在2009提交的GluClα亚基基因序列(GQ221939.1)设计了一序列GluClα亚基基因的特异性引物，并根据特异性引物对小菜蛾抗性与GluClα亚基基因表达量之间的关系进行研究，发现GluClα亚基基因表达量与小菜蛾对阿维菌素的抗性呈正相关。根据这一结果，将选得的一对特异性引物F16结合荧光实时定量PCR技术及统计学方法提供一种鉴定小菜蛾抗性种群的方法：测定小菜蛾的GluClα亚基基因表达量，并与与阴性对照的基因表达量比较是否具有显著差异，有显著差异说明待测小菜蛾为抗性种群。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中小菜蛾对阿维菌素抗性检测方法灵敏度低、周期长、材料要求高等问题，根据我们对小菜蛾阿维菌素抗药性分子机理的研究结果，建立小菜蛾对阿维菌素抗性靶标突变的快速、准确的分子检测方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

根据我们克隆的小菜蛾谷氨酸氯离子通道基因序列(GenBank登录号JX014231.1)设计的特异性引物，以单头小菜蛾的基因组DNA为模板，进行谷氨酸氯离子通道基因TM2和TM3区域的PCR扩增，通过对目标片段纯化产物直接测序色谱图的分析，可以区分小菜蛾个体的基因型(敏感纯合子SS、抗性杂合子RS和抗性纯合子RR)，检测种群样本的抗性等位基因频率。本发明涉及小菜蛾谷氨酸氯离子通道A309V抗性点突变的检测方法和专用引物序列。

一种小菜蛾对阿维菌素靶标抗性的分子检测方法，用SEQ ID NO.1所示的特异性正向引物PxGluCl-Seq-F和SEQ ID NO.2所示的特异性反向引物PxGluCl-Seq-R对谷氨酸氯离子通道基因PxGluCl进行PCR扩增，对PCR纯化产物直接测序，根据直接测序色谱图鉴定小菜蛾个体PxGluCl基因在309位氨基酸是否突变及其具体类型，一次性区分该个体为对阿维菌素的敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子。

本发明涉及的小菜蛾野生型谷氨酸氯离子通道基因因PxGluClcDNA序列全长2074bp(GenBank登录号为JX014231.1)，我们研究发现：阿维菌素敏感型基因序列第926位核苷酸由C突变为T(附图1：Abm-R)，其编码的蛋白质由A突变为V，并发现该突变频率与种群对阿维菌素的抗药性(LC₅₀值)相关，即该突变导致小菜蛾对阿维菌素的高水平靶标抗性。所述的根据直接测序色谱图准确鉴定小菜蛾个体谷氨酸氯离子通道在309位氨基酸是否突变及其具体类型，一次性区分该位点敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子的方法为：如果识别序列(5′-CATAGACG-3′)前一位碱基为C单峰色谱(附图2.A)，则表明该小菜蛾个体为不携带谷氨酸氯离子通道突变的敏感纯合子；如果识别序列前一位碱基为T/C双峰色谱(附图2.B)，则表明该小菜蛾个体为携带309位氨基酸突变的杂合子；如果识别序列前一位碱基为T单峰色谱(附图2.C)，则表明该小菜蛾个体为携带309位氨基酸突变的纯合子。

所述的分子检测方法，优选包含如下三个步骤：

(1)提取小菜蛾单头幼虫或成虫样本的基因组DNA；

(2)利用SEQ ID NO.1所示的引物PxGluCl-Seq-F和SEQ ID NO.2所示的引物PxGluCl-Seq-R，对上一步提取的小菜蛾基因组DNA进行PCR扩增；

(3)将上一步获得的PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，对目的片段纯化回收后进行直接测序，测序引物为SEQ ID NO.2所示的引物R，通过检测编码PxGluCl基因309位氨基酸的核苷酸测序色谱图，一次性区分在该位点为敏感纯合、抗性杂合和抗性纯合基因型的个体。

其中，PCR反应体系优选50ul：10ul 5×PrimeSTAR Buffer，4ul 2.5mM dNTPs，10mM的正、反向引物各1ul，1ul单头小菜蛾样本的基因组DNA，1.25U PrimeSTAR HS DNA聚合酶，加双蒸水至反应总体积为50ul。PCR反应程序优选：98℃变性10秒；52℃退火15秒；72℃延伸30秒；热循环数为30，之后72℃延伸10分钟。

用于分子检测小菜蛾对阿维菌素靶标抗性的引物对，正向引物PxGluCl-Seq-F如SEQ ID NO.1所示，反向引物PxGluCl-Seq-R如SEQ ID NO.2所示。

一种用于检测小菜蛾对阿维菌素抗性的试剂盒，包含本发明所述的引物对。

本发明所述的引物对在分子检测小菜蛾对阿维菌素靶标抗性中的应用。

本发明所述的试剂盒对在分子检测小菜蛾对阿维菌素靶标抗性中的应用。

有益效果

我们在小菜蛾抗阿维菌素的近等基因系材料中，首次发现PxGluCl基因的TM2和TM3之间的Loop结构上存在A309V氨基酸突变，且该突变与小菜蛾对阿维菌素的高水平抗性密切相关。该基因突变位点的发现可用于监测不同地理种群携带的阿维菌素抗性等位基因频率，并为小菜蛾抗药性治理提供高效、准确的分子检测方法。

CN102154468B中所述的检测方法为根据GluClα亚基表达量的高低判定种群抗性(实施在基因转录水平，即检测mRNA表达多少，该基因的一级结构未变化，属于量变范畴)，为阿维菌素抗性检测提供了一种参考方法，但其扩增产物不进行核苷酸测序、亦不包含本发明首次发现的A309V位突变位点。本发明的发明点在于首次发现PxGluCl基因的一级结构发生了抗性突变(实施在基因组水平，即检测gDNA的等位基因序列，属于质变范畴)，与CN102154468B中的检测方法有本质差异，涉及PxGluCl基因核苷酸突变介导的与阿维菌素结合能力下降或亲和性降低的抗性机制，是对基因的不同等位基因进行核苷酸序列检测，属于对基因质变的检测手段；且CN102154468B所述方法无法检测本发明发现的PxGluCl基因A309V突变情况。本发明与CN102154468B所述的检测方法所要解决的科学问题不同，且本发明优选的检测技术可判定不同种群中突变个体的基因型，计算出与抗性有关的等位基因突变频率(常规生物测定技术和现有专利技术均不可实现)。通过一定数量的个体的检测，可以确定某个种群中敏感纯合子、杂合子和抗性纯合子的频率，为抗药性早期预警和害虫综合治理提供了最直接的依据。

与传统的抗性监测技术(生物测定)相比，本发明涉及方法无需将田间试虫饲养至适宜虫龄再进行生物测定以确定抗性水平。若采集不同地理种群调查抗性基因的发生频率则需要更长时间，对生产实际用药的指导意义滞后、不便于针对性开展化学防控。而本发明方法不需饲养试虫，节省劳动力和资源，可以快速、准确检测出小菜蛾对阿维菌素抗性的突变类型和种群携带抗性基因频率。本发明优选的检测方法有益效果表现在：(1)快速准确：生物测定技术要求试虫标准化，取样误差和虫体之间的差异对结果影响很大，造成结果的不稳定性；本发明可直接检测田间小菜蛾个体(幼虫或成虫)，从取得样本到获得检测结果在12个小时以内(若送公司测序也仅需2天时间)。(2)材料要求少：生物测定技术中测定一个标准曲线至少需要200-300头标准试虫，而本发明对一个种群的检测只需要50头左右。(3)灵敏度高：生物测定检测技术是一种相对粗略检测抗性水平的方法，不能检测早期抗性或低频率抗性纯合子或杂合子，本发明利用特异性引物扩增目的片段，根据测序色谱图可以直接判断个体的基因型。

附图说明

图1小菜蛾谷氨酸氯离子通道基因突变区域的核苷酸和氨基酸序列

图示小菜蛾谷氨酸氯离子通道基因跨膜区部分序列，其中ROTH-S序列来自小菜蛾敏感品系，该基因cDNA序列第926位核苷酸为C，编码氨基酸为A；Abm-R序列来自抗阿维菌素的ROTH-Abm近等基因系，该基因cDNA序列第926位核苷酸为T，编码氨基酸为V。

图2小菜蛾谷氨酸氯离子通道基因突变区域的直接测序色谱图

A：PxGluCl基因第926位碱基为C单峰色谱，表明该小菜蛾个体为不携带谷氨酸氯离子通道突变的敏感纯合子；B：PxGluCl基因第926位碱基为T/C双峰色谱，表明该小菜蛾个体为携带309位氨基酸突变的杂合子；C：PxGluCl基因第926位碱基为T单峰色谱，表明该小菜蛾个体为携带309位氨基酸突变的纯合子。

具体实施方式

实施例1

本实例选取了三组小菜蛾进行了生物测定，其中ROTH品系为实验室饲养多年的对杀虫剂敏感的对照品系，本例以该材料对阿维菌素的致死中浓度为基线，测定其他品系对阿维菌素的抗性水平；ROTH-Abm品系为建立的抗阿维菌素近等基因系材料，其对阿维菌素的抗性水平达10100倍；Abm-Unsel品系为ROTH-Abm试虫在不接触任何药剂情况下饲养一年以上，其抗性明显降低至1695倍。相关生物测定数据如下：

根据本发明优选的分析检测技术，其具体实施步骤包括：

1.分别从ROTH、ROTH-Abm和Abm-Unsel品系中随机选取17头、19头和26头四龄幼虫，提取基因组DNA(本方法采用AXYprepTM Multisource Genomic DNA Miniprep Kit基因组试剂盒)。

2.利用第一步中提取的基因DNA模板进行谷氨酸氯离子通道基因目的片段的PCR扩增：

(1)设计小菜蛾谷氨酸氯离子通道基因的特异性引物，上游引物PxGluCl-Seq-F序列为:5'-CATCAGGCATCAACGCGTCACT-3'(SEQ ID NO.1)、下游引物PxGluCl-Seq-R序列为:5'-TCATATTCTCCCTATGCATGTCAG-3'(SEQ ID NO.2),引物合成由上海Invitrogen公司完成。

(2)在0.2ml的PCR管中完成总反应体积为50μl的目的片段扩增：

(3)PCR反应程序为：98℃变性10秒；52℃退火15秒；72℃延伸30秒。循环数为30，最后72℃延伸10分钟。

3.对第二步得到的PCR产物纯化后进行直接测序：

(1)制备1.5％(g/ml)的琼脂糖凝胶，取50μl PCR扩增产物进行电泳，稳流120mA，20分钟后在紫外光下观察。

(2)对目的片段(约180bp)进行切胶回收，在制备管的滤膜中央加入30ul去离子水溶解DNA，产物送上海Invitrogen公司由引物PxGluCl-Seq-R(SEQ ID NO.2)完成直接测序。

(3)分析直接测序色谱图，根据对应于谷氨酸氯离子通道第926位碱基峰图的情况判定个体是否发生了基因突变。一次性区分该位点敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子的方法为：如果识别序列(5′-CATAGACG-3′)前一位碱基为C单峰色谱，则表明该小菜蛾个体为不携带谷氨酸氯离子通道突变的敏感纯合子；如果识别序列前一位碱基为T/C双峰色谱，则表明该小菜蛾个体为携带309位氨基酸突变的杂合子；如果识别序列前一位碱基为T单峰色谱，则表明该小菜蛾个体为携带309位氨基酸突变的纯合子。检测结果显示：

从上述检测结果可以看出：敏感品系小菜蛾ROTH样本不携带抗性基因，阿维菌素抗性最高的ROTH-Abm样本基本全部为309位氨基酸突变的纯合子，阿维菌素抗性中等的Abm-Unsel样本敏感纯合子居多，有少部分杂合子，没有抗性纯合子。并且，本发明优选的检测技术可以直接计算出ROTH、ROTH-Abm和Abm-Unsel品系抗性等位基因的频率分别为0％、94.7％和11.5％。

实施例2

本例说明本发明优选的技术方案用于检测小菜蛾Abm-Unsel品系在不同药剂处理浓度下携带PxGluCl基因309位突变基因频率的检测方法。

1.单头小菜蛾幼虫基因组DNA的提取：随机挑取Abm-Unsel品系的小菜蛾3龄幼虫，分别使用80ppm、20ppm和0ppm的阿维菌素处理一批试虫，48h后检查结果，正常存活的幼虫使用AXYprep^TM Multisource Genomic DNA Miniprep Kit基因组试剂盒提取全基因组DNA。

2.以各浓度阿维菌素处理后存活的小菜蛾基因DNA模板(3组)进行谷氨酸氯离子通道基因目的片段的PCR扩增。

(1)设计小菜蛾谷氨酸氯离子通道基因的特异性引物，上游引物PxGluCl-Seq-F序列为:5＇-CATCAGGCATCAACGCGTCACT-3＇(SEQ ID NO.1)、下游引物PxGluCl-Seq-R序列为:5＇-TCATATTCTCCCTATGCATGTCAG-3＇(SEQ ID NO.2),引物合成由上海Invitrogen公司完成。

(2)在0.2ml的PCR管中完成总反应体积为50μl的目的片段扩增：

(3)PCR反应程序为：98℃变性10秒；52℃退火15秒；72℃延伸30秒。循环数为30，最后72℃延伸10分钟。

3.对第二步得到的PCR产物纯化后进行直接测序：

(1)制备1.5％(g/ml)的琼脂糖凝胶，取50μl PCR扩增产物进行电泳，稳流120mA，20分钟后在紫外光下观察。

(2)对目的片段(约180bp)进行切胶回收，在制备管的滤膜中央加入30ul去离子水溶解DNA，产物送上海Invitrogen公司由引物PxGluCl-Seq-R(SEQ ID NO.2)完成直接测序。

(3)分析直接测序色谱图，根据对应于谷氨酸氯离子通道第926位碱基峰图的情况判定个体是否发生了基因突变。一次性区分该位点敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子的方法为：如果识别序列(5′-CATAGACG-3′)前一位碱基为C单峰色谱，则表明该小菜蛾个体为不携带谷氨酸氯离子通道突变的敏感纯合子；如果识别序列前一位碱基为T/C双峰色谱，则表明该小菜蛾个体为携带309位氨基酸突变的杂合子；如果识别序列前一位碱基为T单峰色谱，则表明该小菜蛾个体为携带309位氨基酸突变的纯合子。

4.计算耐受不同阿维菌素浓度的小菜蛾(3组)携带PxGluCl^A309V抗性等位基因的突变频率。

PxGluCl^A309V抗性等位基因频率的计算方法如下：

抗性等位基因频率(RF)＝(309位抗性纯合子个体数×2+309位抗性杂合子个体数)/(总检测个体数×2)

根据上述计算方法，测得本例三个处理组在309位的基因型和抗性等位基因突变频率如下：

根据上述检测结果，发现随着阿维菌素处理浓度的升高，即小菜蛾个体对阿维菌素的耐受能力增强，存活小菜蛾个体携带A309V等位基因突变的频率有明显升高。

Claims (8)

1.一种小菜蛾对阿维菌素靶标抗性的分子检测方法，其特征在于用SEQ ID NO.1所示的特异性正向引物PxGluCl-Seq-F和SEQ ID NO.2所示的特异性反向引物PxGluCl-Seq-R对谷氨酸氯离子通道基因PxGluCl进行PCR扩增，对PCR纯化产物直接测序，根据直接测序色谱图鉴定小菜蛾个体PxGluCl基因的309位氨基酸是否存在丙氨酸A到缬氨酸V的突变及其具体类型，一次性区分该个体为对阿维菌素的敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子。

2.根据权利要求1所述的分子检测方法，其特征在于所述的根据直接测序色谱图鉴定小菜蛾个体PxGluCl基因309位氨基酸是否突变及其具体类型，一次性区分该个体为对阿维菌素的敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子的具体方法为：如果直接测序色谱图中识别序列的前一位碱基为C单峰色谱，则表明该小菜蛾个体为不携带PxGluCl基因突变的阿维菌素敏感纯合子；如果识别序列前一位碱基为T/C双峰色谱，则表明该小菜蛾个体为携带PxGluCl基因309位氨基酸突变的抗阿维菌素杂合子；如果识别序列前一位碱基为T单峰色谱，则表明该小菜蛾个体为携带PxGluCl基因309位氨基酸突变的抗阿维菌素纯合子；其中，所述的识别序列为5′-CATAGACG-3。

3.根据权利要求2所述的分子检测方法，其特征在于该方法包含如下三个步骤：

（1）提取小菜蛾单头幼虫或成虫样本的基因组DNA；

（2）利用SEQ ID NO.1所示的引物PxGluCl-Seq-F和SEQ ID NO.2所示的引物PxGluCl-Seq-R，对上一步提取的小菜蛾基因组DNA进行PCR扩增；

（3）将上一步获得的PCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，对目的片段纯化回收后进行直接测序，测序引物为SEQ ID NO.2所示的引物PxGluCl-Seq-R，通过检测编码PxGluCl基因309位氨基酸的核苷酸测序色谱图，一次性区分在该位点为敏感纯合、抗性杂合和抗性纯合基因型的个体。

4.根据权利要求3所述的分子检测方法，其特征在于，PCR反应体系50ul：10ul 5×PrimeSTAR Buffer，4ul 2.5mM dNTPs，10mM的正、反向引物各1ul，1ul单头小菜蛾样本的基因组DNA，1.25U PrimeSTAR HS DNA聚合酶，加双蒸水至反应总体积为50ul，PCR反应程序：98℃变性10秒；52℃退火15秒；72℃延伸30秒；热循环数为30，之后72℃延伸10分钟。

5.用于分子检测小菜蛾对阿维菌素抗性的引物对，其特征在于正向引物PxGluCl-Seq-F如SEQ ID NO.1所示，反向引物PxGluCl-Seq-R如SEQ ID NO.2所示。

6.一种用于检测小菜蛾对阿维菌素靶标抗性的试剂盒，其特征在于包含权利要求5所述的引物对。

7.权利要求5所述的引物对在分子检测小菜蛾对阿维菌素靶标抗性中的应用。

8.权利要求6所述的试剂盒对在分子检测小菜蛾对阿维菌素靶标抗性中的应用。