CN107841539A - 一种检测叶螨对阿维菌素抗性相关基因突变的caps标记方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测叶螨对阿维菌素抗性相关基因突变的CAPS标记方法，通过对扩增待测叶螨种群GluCl 3基因包含G326E突变的基因片段，并进行酶切位点分析，其中敏感种群的扩增片段中存在Hinf I酶切位点，而抗性纯合种群中不存在该位点，抗性杂合种群既存在包含Hinf I酶切位点的扩增片段，也存在无该位点的扩增片段。本发明方法可替代传统的生物测定方法，所需人力及样品量少，检测数量大，而且灵敏度高、特异性强、快速简便和准确可靠，适合于二斑叶螨田间种群对阿维菌素抗性的快速诊断，同时可用于田间叶螨对阿维菌素抗性的实时监控和预警预报，对田间叶螨的阿维菌素抗性监测具有重要意义，应用前景广泛。

Description

一种检测叶螨对阿维菌素抗性相关基因突变的CAPS标记方法

技术领域

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种检测叶螨对阿维菌素抗性相关基因突变的CAPS标记方法。

背景技术

二斑叶螨Tetranychus urticae Koch是果树、蔬菜及其他农作物上的世界性重大农业害螨。二斑叶螨以成螨、若螨刺吸为害植物汁液，初期叶片变黄影响光合作用，严重者导致叶片枯死、落叶甚至整株枯死，对农作物健康生长及产品质量带来严重影响。

二斑叶螨由于体型微小、生活史短、世代重叠严重，田间化学药剂的频繁使用导致了其抗药性的出现。据报道，二斑叶螨田间种群已经对不同类型的杀虫剂均产生了不同程度的抗药性（Van Leeuwen et al.，2010；Tang et al., 2014，王玲等，2015），其中尤以对阿维菌素抗药性最为明显，部分地区二斑叶螨种群抗性水平达上千倍（Tang et al.,2014），包括卵期对阿维菌素的抗药性也显著升高（刘庆娟等，2012）。靶标抗性是害虫对杀虫剂产生抗性的重要抗性机制之一，谷氨酸门控氯离子通道（Glutamate-gated chloridechannel, GluCl）在叶螨对阿维菌素产生抗药性的相关靶标抗性基因，抗性种群中GluCl1基因第三跨膜区的G314D点突变是导致二斑叶螨对阿维菌素产生抗药性的重要分子机制（Kwon et al., 2010），该突变位点在我国二斑叶螨田间种群也存在，并且抗性基因频率很高（唐小凤等，2014年）。随后研究者又在希腊的一个频繁喷施阿维菌素的温室月季二斑叶螨MAR-AB种群中，发现了GluCl家族的GluCl3基因上存在G326E位点的突变，并证实了该突变也与二斑叶螨对阿维菌素抗性产生抗药性有关（Dernauw et al., 2012）。我国多地二斑叶螨田间种群对阿维菌素抗药性属高抗性或极高抗性水平（Tang et al., 2014），田间种群是否也存在该位点的突变以及突变频率高低尚不明确。

害虫/害螨中抗药性基因一旦发生了突变，即使停用该药剂，也不能回复叶螨对其的敏感性，因此检测抗性基因的突变与否、突变频率的高低，进而明确测试种群的抗药性，对于指导田间下一步药剂的科学选择和施用，很有必要性而且意义重大。常规的害螨抗药性监测方法是基于生物测定方法，比如FAO推荐的玻片浸渍法，应用普遍，但这种方法存在不少缺点：（1）操作过程很精细，需要极小心，才能保证测试叶螨不被伤害；（2）操作者需要较长一段时间来掌握该技术；（3）生物测定过程需要药剂处理后48h才能观察结果，进行害螨死亡率的判断。而基于PCR为基础的基因点突变检测方法需要通过以下几个步骤：基因扩增、片段测序和序列比对等过程来确定抗性相关基因是否发生了突变，但很明显这样的过程费时费力，也耗费更多物力。本实验室前期工作中，我们实验室对二斑叶螨抗性基因片段的序列进行分析比较，发现叶螨抗性和敏感种群之间的抗性基因GluCl3扩增片段由于一个核苷酸的突变导致的酶切位点变化，由此建立一种基于酶切扩增多态性序列（CleavedAmplified Polymorphic Sequences，简称CAPS）的分子标记技术。这种快速的检测方法更加经济高效，特异性强，节约人力和物力，还可明确测试害虫/螨种群对阿维菌素的抗药性，实现害虫/螨抗药性的早期发现和预警。

发明内容

为了实现对田间种群抗药性的快速检测，本发明克隆了二斑叶螨抗性和敏感种群的GluCl 3基因片段，比较分析二者序列差异的基础上，建立了一种基于抗性基因点突变位点检测的叶螨对阿维菌素抗药性的快速分子检测技术，即酶切扩增多态性序列标记（Cleaved Amplified Polymorphic Sequences，简称CAPS）技术，可以实现叶螨种群/个体抗药性的早期预警，有助于田间种群的抗药性治理和针对性高效防控。

本发明提供的技术方案是：一种检测叶螨对阿维菌素抗性相关基因突变的CAPS标记方法：通过扩增待测叶螨种群中GluCl 3基因包含G326E突变的基因片段，并进行酶切位点分析，其中敏感种群的扩增片段中存在Hinf I酶切位点，而抗性纯合种群中不存在该位点，抗性杂合种群既存在Hinf I酶切位点，也存在无该位点的扩增片段。

所述的检测方法，扩增所用的引物如下：

上游引物：5'-GATCCAAATGCTATTCCTGCC-3'，

下游引物：5'-GAGGGAAACCCATACCACCAC-3'。

所述的检测方法，采用的PCR 扩增体系：10 mL 的 2×Es Mix (0.1 U Taq E/mL)，1 mL 的 DNA 模板，10 mmol/L的上游和下游引物各 1 mL，最后用 dd H₂O 补充至 20mL。

所述的检测方法，所用的扩增程序为：95℃预变性 3 min；之后进行35 个循环（95℃变性 30 s，59℃退火 30 s，72℃延伸 1 min）；最后在 72℃条件下延伸 2 min。

所述的检测方法，扩增片段经Hinf I酶切，结果为抗性纯合子得到370bp左右的条带，敏感纯合子酶切成150bp和220bp左右的两条带，抗性杂合子则显示出150bp、220bp和370bp左右的三条带。

对PCR产物的酶切体系：10´NE Buffer：5 mL，Hinf I I mL，PCR产物10 mL，dd H₂O补足至50 mL，37℃条件下保持5~15 min。

一种利用上述的检测方法对叶螨田间种群进行抗性基因突变频率的检测方法，其特征在于：对田间种群的叶螨进行所述检测，并按下述计算抗性基因突变频率：点突变的基因突变频率（%）=[（抗性纯合子个体数/检测总数）+（抗性杂合子个体数/检测总数/2）]´100。

优选地，所述的检测方对田间种群的30头叶螨进行所述检测。

本发明首先是为了快速明确田间叶螨种群GluCl3基因中是否存在与阿维菌素抗药性相关的G326E点突变，也可以根据该点突变的存在与否判断该测定种群是否对阿维菌素产生了抗药性。与常规的点突变检测过程及传统的叶螨生物测定监测其抗药性的方法相比，本发明具有以下有益效果：

（1）特异性更强。本发明是利用二斑叶螨GluCl3基因的核苷酸序列，设计了一对特异性引物，扩增出可能包含G326E突变的附近序列，从而在PCR过程中可以对靶目标序列进行特异性扩增，并通过靶位点区域核苷酸序列的分析选定特异性的限制性内切酶，根据内切酶酶切产物在琼脂糖上呈现条带的数量和条带大小，即可判断样品中阿维菌素抗性相关基因GluCl3是否发生了点突变，进而也可以判定测试种群是否对阿维菌素产生了抗药性；而传统的阿维菌素抗药性测定方法是通过生物测定中对待测叶螨受到不同浓度阿维菌素处理后的死亡情况来粗略判定的，当然其判断的结果较基因检测方法的特异性要差很远。

（2）灵敏度和准确度更高。本发明中涉及的二斑叶螨对阿维菌素抗性判定方法是通过检测二斑叶螨种群中GluCl3基因是否发生点突变来判断二斑叶螨是否产生抗性，而PCR扩增产物进行酶切，之后在琼脂糖凝胶上的结果显现，相对于传统生物测定中通过人为观察判断试虫在不同阿维菌素浓度下死亡情况来粗略判断叶螨是否对阿维菌素产生抗性这种误判率及重复性较差的生测方法，抗性检测的灵敏度和准确度大大提高。

（3）检测周期短。本发明检测基因点突变的方法与常规基于PCR扩增结合测序和序列比对等方法来检测点突变的方法相比，节约大约一天时间，另外不涉及测序仪等贵重仪器的使用；同时，与传统的生测过程至少需要48小时的时间相比，而本发明方法仅需3-4小时即可完成判断，且一次可以同时检测多个样品，特别适合于大批量样品的快速检测。

（4）材料需求少。叶螨的生物测定中获一个标准曲线需要约700头标准试虫，这些试虫的饲养及挑取需要花费大量的人力、物力和财力。而本发明对一个种群的检测只需要30头左右的叶螨，甚至用单头雌成螨即可检测到。

综上所述，本发明的方法可替代传统的生物测定方法，该CAPS方法具有所需人力及样品量少，检测数量大的特点，而且灵敏度高、特异性强、快速简便和准确可靠，因而能有效的检测叶螨对阿维菌素的抗性，适合于二斑叶螨田间种群对阿维菌素抗性的快速诊断，同时可用于田间叶螨对阿维菌素抗性的实时监控和预警预报，对田间叶螨的阿维菌素抗性监测具有重要意义，应用前景广泛。

附图说明

图1 二斑叶螨GluCl 3基因的扩增，M：DNA Mark I；泳道1：二斑叶螨敏感种群；泳道2~3：二斑叶螨田间种群；CK：阴性对照。

图2 二斑叶螨敏感和田间种群的GluCl 3基因酶切结果，M：Marker I；泳道1：抗性纯合个体；泳道2：敏感个体；泳道3：抗性杂合个体；泳道4：空白对照。

具体实施方式

一、材料与方法

1、供试虫源

本发明采用的二斑叶螨种群包括: 室内敏感种群（Lab-SS）和北京密云（MY-BJ）、北京顺义（SY-BJ）、北京昌平种群（CP-BJ）和浙江宁波种群（NB-ZJ）。二斑叶螨室内敏感种群（Lab-SS）来自南京农业大学植物保护学院，自2009年在室内人工气候箱内采用海绵叶盘法，由“碧丰”品种的无虫菜豆苗叶片作为寄主进行继代饲养，期间未接触任何杀虫剂。饲养条件为26±1°C、光周期L: D＝16 h: 8 h。四个田间种群于2017年4月~7月采集于各地田间园艺作物生长期，室内饲养一代后备用。

、供试试剂和主要仪器

供试的1.8％阿维菌素（abamectin）乳油由北京中农大生物技术股份有限公司生产。Taq DNA聚合酶2×Es Taq MasterMix (0.1U TaqE/μL)为北京康为试剂生物科技有限公司产品。提取叶螨基因组DNA的KAPA试剂盒购买自北京普凯瑞生物科技有限公司，DNA纯化试剂盒和限制性内切酶Hinf I购买自北京友谊中联生物科技有限公司。所用引物及序列测序均在北京擎科生物工程有限公司进行。

智能型人工气候箱RXZ-380C为宁波江南仪器厂产品。伯乐S1000型PCR仪为美国Bio-Rad公司产品。

、二斑叶螨基因组DNA提取及抗性基因GluCl 3的PCR扩增

利用KAPA试剂进行二斑叶螨DNA提取，具体操作过程按照试剂盒说明书进行，提取后的所有DNA样本均保存于-20℃冰箱中。

根据GenBank 中已知的GluCl 3基因序列，采用Primer 5.0软件设计扩增包含该基因G326E位点的DNA片段。上游引物：5'-GATCCAAATGCTATTCCTGCC-3'，下游引物：5'-GAGGGAAACCCATACCACCAC-3'。采用的PCR 扩增体系：10 mL 的 2×Es Mix (0.1 U Taq E/mL)，1 mL 的 DNA 模板，上游和下游引物（各为 10 mmol/L）各 1 mL，最后用 dd H₂O 补充至 20 mL。在BIORAD S1000型的PCR仪上进行扩增，扩增程序为：95℃预变性 3 min；之后进行35 个循环（95℃变性 30 s，59℃退火 30 s，72℃延伸 1 min）；最后在 72℃条件下延伸2 min。反应完成后取5 mL扩增产物在1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，并将获得的特异性条带委托北京擎科生物科技有限公司进行序列测定。

对二斑叶螨敏感种群和田间种群进行PCR扩增，均获得一条单一条带，与分子量Marker相比，该条带大小为370bp。将敏感种群的GluCl 3基因通过BLAST序列比对，与GluCl 3基因的核苷酸序列完全一致，说明所扩增条带即为预期目的条带（请参见图1）。

、CAPS标记方法的建立及二斑叶螨田间种群基因突变频率检测

基于二斑叶螨GluCl 3序列上的突变位点，用Primer5对该片段序列进行限制性酶切位点分析，筛选出Hinf I限制性内切酶（酶切位点G’AGTC）。并根据扩增产物酶切位点的分析建立了抗性与敏感二斑叶螨种群的CAPS标记技术，即对PCR扩增产物进行Hinf I的酶切反应，PCR产物的酶切体系：10´NE Buffer：5 mL，Hinf I I mL，PCR产物10 mL，dd H₂O补足至50 mL，37℃条件下保持5~15 min。酶切产物在2.0 %的琼脂糖凝胶电泳检测，从而建立CAPS标记，来区分所检测个体为纯合抗性、杂合抗性或者纯合敏感个体，为了保证CAPS标记方法的准确性，将所检测叶螨个体酶切前的PCR扩增产物同时进行测序验证。

对PCR产物进行Hinf I酶切反应后，酶切产物在琼脂糖凝胶上出现了三种情况（图2）。第一，出现两条带：150bp和220bp，这表明了检测个体为敏感纯合个体（存在酶切位点）。第二，仅出现一条带，为370bp，为抗性纯合个体（不存在酶切位点）；第三，酶切后出现三条带，分别为370bp、220bp和150bp，为抗性杂合个体。同时对敏感纯合、抗性纯合和抗性杂合的个体进行测序分析后，发现敏感种群中扩增片段的150位的碱基G在田间种群的相应位点突变为A（氨基酸为G326E突变），有的个体在150位点存在双峰现象，分别为G/A，确认了酶切结果的可靠性。与GluCl 3完整序列相比，说明在我国二斑叶螨田间种群中存在G326E位点的突变，且具有纯合突变和杂合突变两种形式。

采用建立的CAPS标记方法对4个田间种群进行抗性基因突变频率的检测，每个种群检测30头，PCR扩增产物同时通过序列测定进行验证。点突变的基因突变频率（%）=[（抗性纯合子个体数/检测总数）+（抗性杂合子个体数/检测总数/2）]´100。

检测结果请见下表1，发现不同种群中该突变位点的抗性纯合子比例及总位点突变频率存在较大差异。其中北京昌平种群中，抗性纯合子比率达到80%，该位点突变频率则高达90%，而在北京密云和顺义种群中，位点突变频率均为26.67%，但密云种群中存在30%的抗性纯合子，而在北京顺义种群中则只有抗性杂合子存在。浙江宁波种群突变频率为5%，说明不同田间抗性种群中，GluCl 3基因均存在G326E突变，但该突变的发生频率不一致。

表1 二斑叶螨五个不同种群突变频率的检测

田间种群	采集地点	样本数N	抗性纯合子比率（%）	突变频率（%）
					MY-BJ	北京密云	30	30	26.67
SY-BJ	北京顺义	30	0	26.67
					CP-BJ	北京昌平	30	80	90
NB-ZJ	浙江宁波	30	0	5

5、二斑叶螨田间种群的生物测定

二斑叶螨生物测定参照Ding 等（2015）报道的琼脂浸叶法进行。操作步骤简述如下。用打孔器将菜豆叶片打出直径2.5 cm的圆形叶碟，在配好的杀虫剂梯度浓度药液中浸药10s中后，放在滤纸上晾干后，放于有0.2 %凝固琼脂的塑料皿中。挑入健康的、大小一致的二斑叶螨雌成螨，每皿内放置30头。按浓度从低到高的顺序重复上述操作，每处理4次重复，并设不含药剂的Triton水溶液作空白对照。盖上带有极细小孔的盖子后放置于人工气候箱内培养（培养条件同上）。经24 h后在OLYMPUS体视显微镜下检查记录二斑叶螨的死亡数和存活数。用毛笔尖轻触螨体，试虫仅有一只足动或者完全不动者视为死亡。试验数据采用PoloPlus 2.0软件进行处理，计算杀螨剂的斜率和SE值、致死中浓度LC₅₀值及其95%置信限等，并计算各田间种群的抗性倍数（田间种群的LC₅₀值/敏感种群的LC₅₀值）

北京密云、北京顺义、北京昌平和浙江宁波四个地区的二斑叶螨田间种群对阿维菌素的致死中浓度LC₅₀值分别为：639.062 mg/L、728.358 mg/L、466.838 mg/L、174.166 mg/L和995.227mg/L，与室内敏感种群Lab-SS相比，对阿维菌素的抗性倍数分别为1155.6、1317.1、844.2和314.9倍，达到高抗性或极高抗性水平（请见下表2）。

表2 二斑叶螨田间种群对阿维菌素的抗药性监测

种群	斜率（± 标准误）	LC50(mg/L) (95%置信区间)	抗性倍数
				Lab-SS	0.952±0.143	0.553（0.382,0.932）	1.0
MY-BJ	1.350±0.156	639.062(487.084,835.777)	1155.6
				SY-BJ	1.812±0.217	728.358（556.410,916.814）	1317.1
CP-BJ	1.507±0.175	466.838(364.242,595.122)	844.2
				NB-ZJ	1.481±0.145	174.166(135.208,220.433)	314.9

二斑叶螨的抗性发展严重，在生产中对该螨的预防和治理也极困难（van Leeuwen et al.，2010）。化学防治是主要防控手段，通过生物测定筛选高效药剂是科学选药的地第一步。传统的叶螨抗药性监测方法主要是通过玻片浸渍法、叶碟喷雾法、叶片残毒法等生物测定方法进行，该种方法不仅要求足够的供试虫量，也根据药剂的作用特性需要至少24 h后才能检查结果，而且无法判断出所检测个体的基因型（Vassiliou and Kitsis，2013；Dinget al.，2015）。分子生物学检测方法包括随机扩增多态性RAPD、等位基因特异性扩增PASA技术等，但这些技术与PCR所用试剂密切相关，易发生污染，检测结果稳定性较低。本研究中，基于二斑叶螨GluCl 3基因上的G326E突变也与阿维菌素抗性相关（Mermans et al.,2017）的报道，通过对检测不同叶螨种群GluCl 3基因进行酶切位点分析，发现敏感种群中存在Hinf I酶切位点，而抗性种群中不存在该位点，通过对不同基因型的个体进行酶切，抗性纯合子得到一条370bp左右的条带，敏感纯合子酶切成150bp和220bp左右的两条带，抗性杂合子则显示出150bp、220bp和370bp左右的三条带。这种CAPS鉴定方法操作更简便，PCR扩增出目标基因片段后，采用限制性内切酶酶切后，即可根据酶切结果进行抗性和敏感性的判定，花费时间短，而且即使有少量害虫也可进行检测和预警，因此可以实现田间种群的高通量检测。

阿维菌素作为螨类防治中的重要杀螨剂，近年来害螨对其产生高抗性的报道很多。刘庆娟等（2012）报道山东地区二斑叶螨卵对阿维菌素产生了高抗性，随后唐小凤等（2014）又检测到北京地区二斑叶螨对阿维菌素产生了上千倍的抗性。二斑叶螨对阿维菌素产生高抗性的机制涉及解毒酶活性的增强以及靶标位点基因的突变，如谷氨酸氯离子通道GluCl 1基因上的G314D突变，其突变也可导致二斑叶螨对阿维菌素产生高抗性（Kwon etal., 2010），而且随着阿维菌素抗性倍数升高，G314D突变频率也升高（唐小凤等，2014）。除了G314D突变，本发明基于点突变建立了一种CAPS标记技术，检测发现我国二斑叶螨田间种群另外一个阿维菌素抗性相关GluCl 3基因上还存在326位点上的G326E点突变，由该点突变也导致了害螨产生对阿维菌素的抗药性。

参考文献（References）

van Leeuwen T, Vontas J, Tsagkarakou A, et al. 2010. Acaricide resistancemechanisms in the two-spotted spider mite Tetranychus urticae and otherimportant Acari: A review. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 40(8):563-572

Tang XF, Zhang YJ, Wu QJ, Xie W, Wang SL. 2014. Stage-specific expressionof resistance to different acaricides in four field populations ofTetranychus urticae (Acari: Tetranychidae). Journal of Economic Entomology,107(5): 1900-1907

Kwon D H, Yoon K S, Clark J M, et al. 2010. A point mutation in aglutamate-gated chloride channel confers abamectin resistance in the two-spotted spider mite, Tetranychus urticae Koch. Insect Molecular Biology, 19(4): 583-591

Dermauw W, Ilias A, Riga M, Tsagkarakou A, Grbić M, Tirry L, Van LeeuwenT, Vontas J. 2012. The cys-loop ligand-gated ion channel gene family ofTetranychus urticae: implications foracaricide toxicology and a novelmutation associated with abamectin resistance. Insect Biochemistry andMolecular Biology, 42(7): 455-465.

Vassiliou VA, Kitsis P. Acaricide resistance in Tetranychus urticae(Acari: Tetranychidae) populations from Cyprus. Journal of EconomicEntomology 2013, 106(4): 1848-1854.

Ding TB, Zhong R, Jiang XZ, Liao CY, Xia WK, Liu B, Dou W, Wang JJ. 2015.Molecular characterisation of a sodium channel gene and identification of aPhe1538 to Ile mutation in citrus red mite, Panonychus citri. Pest ManagementScience, 71(2): 266-277.

Mermans C, Dermauw W, Geibel S, Van Leeuwen T. 2017. A G326E substitutionin the glutamate-gated chloride channel 3 (GluCl3) of the two-spotted spidermite Tetranychus urticae abolishes the agonistic activity of macrocycliclactones. Pest Management Science, doi:10.1002/ps.4677

王玲，张友军，吴青君，谢文，王少丽. 2015. 二斑叶螨对联苯菊酯抗药性的PASA快速检测技术建立与应用. 应用昆虫学报, 52(2): 510-518

刘庆娟，刘永杰，周仙红，张安盛，李丽莉，门兴元，张思聪，于毅. 2012. 四个二斑叶螨地理种群卵对10种杀螨剂的敏感性差异. 植物保护, 38(4): 178-180

唐小凤，王少丽，张友军，吴青君，谢文. 2014. 二斑叶螨对阿维菌素的抗药性及抗性基因的PASA检测技术. 植物保护学报, 41(1): 67-73。

Claims (8)

1.一种检测叶螨对阿维菌素抗性相关基因突变的CAPS标记方法，其特征在于：通过对扩增待测叶螨种群GluCl 3基因包含G326E突变的基因片段，并进行酶切位点分析，其中敏感种群的扩增片段中存在Hinf I酶切位点，而抗性纯合种群中不存在该位点，抗性杂合种群既存在包含Hinf I酶切位点的扩增片段，也存在无该位点的扩增片段。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：扩增所用的引物如下：

上游引物：5'-GATCCAAATGCTATTCCTGCC-3'，

下游引物：5'-GAGGGAAACCCATACCACCAC-3'。

3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：采用的PCR 扩增体系：10 mL 的 2×EsMix (0.1 U Taq E/mL)，1 mL 的 DNA 模板，10 mmol/L的上游和下游引物各 1 mL，最后用dd H₂O 补充至 20 mL。

4.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所用的扩增程序为：95℃预变性 3 min；之后进行35 个循环（95℃变性 30 s，59℃退火 30 s，72℃延伸 1 min）；最后在 72℃条件下延伸 2 min。

5.如权利要求1至4任一项所述的检测方法，其特征在于：扩增片段经Hinf I酶切，结果为抗性纯合子得到370bp左右的条带，敏感纯合子酶切成150bp和220bp左右的两条带，抗性杂合子则显示出150bp、220bp和370bp左右的三条带。

6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于：对PCR产物的酶切体系：10´NE Buffer：5mL，Hinf I I mL，PCR产物10 mL，dd H₂O补足至50 mL，37℃条件下保持5~15 min。

7.一种利用权利要求1至6任一项所述检测方法对叶螨田间种群进行抗性基因突变频率的检测方法，其特征在于：对田间种群的叶螨进行所述检测，并按下述计算抗性基因突变频率：点突变的基因突变频率（%）=[（抗性纯合子个体数/检测总数）+（抗性杂合子个体数/检测总数/2）]´100。

8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于：对田间种群的30头叶螨进行所述检测。