CN112029870A - 柑橘全爪螨对双甲脒抗性的分子标记及其应用和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了柑橘全爪螨对双甲脒抗性的分子标记及其在柑橘全爪螨对双甲脒敏感品系和抗性品系的分类中的应用，所述分子标记为柑橘全爪螨β‑2R章鱼胺受体基因SNP突变T752C；还公开了所述分子标记的检测方法：先提取待测柑橘全爪螨的总DNA，以总DNA为模板用特异性正反向引物进行PCR扩增，得到包含突变区域的β‑2R章鱼胺受体基因片段，将得到的基因片段与该分子标记进行序列比对，即可判断该品系是对双甲脒的敏感品系还是抗性品系。所述特异性正反向引物序列为：F：5’‑AACCTTCAGAATCAGTGTAATCATC‑3’；R：5’‑CTTCCATAGATTGTTGTTGTTGTTG‑3’。

Description

柑橘全爪螨对双甲脒抗性的分子标记及其应用和检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种分子标记，尤其涉及一种柑橘全爪螨对双甲脒抗性的分子标记及其应用和检测方法。

背景技术

柑橘全爪螨(Panonychus citri)为世界性柑橘害螨，在中国季节性爆发的现象越来越频繁，主要原因在于果园害螨种群动态监控不得当，缺乏预警机制，加之杀螨剂使用不规范所造成的害螨抗药性问题，使得化学防控效果减弱。柑橘全爪螨已对联苯肼酯、螺螨酯、阿维菌素、噻螨酮等多种化学杀螨剂产生不同程度抗性。由于新型、高效杀螨剂市场更新迭代过慢，目前已经难以满足生产者对害螨有效防控的要求。

双甲脒为一种广谱性杀虫/螨剂，常用于家畜、宠物表皮寄生虫防治，此外，该药剂对蚜虫、木虱、蜱虫，害螨也表现出良好的致死效果，近年来常用于防控柑橘全爪螨，以缓解其他类型杀螨剂由于抗药性造成的防效下降问题。根据杀虫剂抗性执行委员会(Insecticide Resistance Action Committee,IRAC)分类，双甲脒属于章鱼胺受体激动剂，主要作用于章鱼胺受体，刺激害虫不断产生兴奋而死。目前对该药剂抗性机理研究主要集中在寄生蜱虫β-adrenergic章鱼胺受体和OCT/Tyr受体基因突变，单胺氧化酶(MO)及ABC转运蛋白活性的改变等。而叶螨科害螨对双甲脒的抗性分子机制，还未有学者报道。

发明内容

针对上述领域的需求和存在的问题，本发明在敏感品系的基础上，通过室内长期药剂筛选，获得柑橘全爪螨双甲脒抗性品系，并通过基因组重测序技术以及田间抗性种群突变频率分析，探究柑橘全爪螨对双甲脒的抗药性分子机制，为柑橘全爪螨抗药性治理提供理论依据，以期更好地监控和延缓害螨对双甲脒抗药性。具体技术方案概括如下：

一种柑橘全爪螨对双甲脒抗性的分子标记，所述分子标记为柑橘全爪螨β-2R章鱼胺受体基因SNP突变T752C。

所述的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID No:5所示。

上述的分子标记在柑橘全爪螨对双甲脒敏感品系和抗性品系的分类中的应用。

检测上述的分子标记的特异性正反向引物，所述引物序列如下：

F：5’-AACCTTCAGAATCAGTGTAATCATC-3’；

R：5’-CTTCCATAGATTGTTGTTGTTGTTG-3’。

一种柑橘全爪螨对双甲脒抗性的分子标记的检测方法：先提取待测柑橘全爪螨的总DNA，以总DNA为模板用权利要求4中的特异性正反向引物进行PCR扩增，得到包含突变区域的β-2R章鱼胺受体基因片段，将得到的基因片段与权利要求1中的柑橘全爪螨对双甲脒的分子标记进行序列比对，即可判断该品系是对双甲脒的敏感品系还是抗性品系。

所述PCR扩增的反应体系为：2×Phanta Max Master Mix 25μL，浓度10μM的正反向引物各2μL，待测样本DNA模板2μL，补充ddH₂O至50μL。

所述PCR的扩增程序为：95℃预变性3min；然后95℃变性15sec，54℃退火15sec，72℃延伸10sec，40个循环；最后72℃延伸5min。

本发明的有益效果是：

1)本发明通过基因组重测序技术—BSA性状定位(Bulked Segregant Analysis)发掘了柑橘全爪螨对双甲脒抗性的分子标记，并在田间种群中得到了验证。该标记的特异性强、稳定性高，通过对柑橘全爪螨待测样本的该分子标记的突变频率分析，即可得知待测样本是对双甲脒的敏感品系还是抗性品系，可随时监测田间柑橘全爪螨的抗药性水平，做好害螨抗药性治理工作，对于减少化学农药的使用、环境保护、果园可持续发展有重要意义。

2)本发明提供了柑橘全爪螨对双甲脒抗性的分子标记的特异性正反向引物，还提供了优化的PCR体系和扩增程序，可以成功快速地从柑橘全爪螨中扩增出一条220bp的DNA条带，该条带即是与柑橘全爪螨对双甲脒抗性密切相关的序列，该方法操作简便快捷，检测特异性强、灵敏度高。

附图说明

图1是柑橘全爪螨混池基因组DNA琼脂糖电泳图，其中，M:λ-Hind III digest,1,2,3,4分别为P(SS)、P(RR)、F(SS)、F(RR)。

图2是候选区间内与性状相关的SNPs分布、突变类型及基因注释。

图3是ΔSNP-index和ED值评估候选SNPs与性状的关联度结果。

图4是柑橘全爪螨抗、敏品系中β-2R章鱼胺受体基因突变位点(T752C)所处位置，图中，SS为敏感品系，RR为抗性品系。

图5是柑橘全爪螨β-2R章鱼胺受体第752位三种基因型Sanger测序结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

1.材料

1.1供试螨源

供试螨源

敏感品系(SS)：实验室柑橘全爪螨原始种群为2005年采自柑桔研究所(重庆·北碚)果园边多年未施药的枳壳上，在实验室内不接触农药，用枳橙连续继代饲养至今，视为杀螨剂-敏感品系。

抗性品系(RR)：挑取3000头敏感品系柑橘全爪螨雌成螨，放置于30张平整的柠檬叶片上，每张叶片100头螨。将叶片放置于含有海绵-水的玻璃皿中，叶片周边用湿棉线包围，防止螨逃逸。将饲养装置放置于波特喷雾塔下，对螨喷洒稀释1000倍的双甲脒乳油，喷洒体积为1mL，然后将饲养装置放置于温度为25±1℃，相对湿度为70％-80％，光周期14L∶10D的光照培养箱中。药剂处理24小时后，将存活的螨接种到无虫枳壳植株上进行扩大、隔离饲养。待螨种群扩大后，适时喷洒双甲脒乳油进行压力筛选，逐步建立抗性种群(RR)。经过多代筛选，柑橘全爪螨对双甲脒的LC₅₀由29.03mg/L提高到了2361.45mg/L，其抗性品系较敏感品系增长了81.35倍。此后每隔一段时间视其种群密度对其进行药剂处理，保证其抗性不会出现衰退。

1.2主要试剂来源

无毒核酸染液Gel-Red(苏州恒宇生物科技有限公司，货号：S2001)，

TAE电泳缓冲液速溶颗粒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：G102)，

2×Phanta Max Master Mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：P515)，

20％双甲脒乳油(爱利思达生物化学品(上海)有限公司)，

Mollusc DNA Kit(Omega Bio-Tek公司，货号：D3373)，

Tissue Ex-Amp PCR Kit(Applied Biological Materials Inc，货号G927)。

2.方法

2.1柑橘全爪螨抗敏品系杂交及性状分离

挑取约200头敏感柑橘全爪螨(SS)到柠檬叶片上饲养，叶片置于含有海绵的培养皿中，用湿棉线包围叶片防止螨逃逸，饲养装置置于25℃光照培养箱(L14：D10)中饲养3天，获得足够数量的卵。待卵孵化后，将雄性螨从饲养装置清除，只剩雌性螨，继续培养至交配前期(静伏期)备用。

挑取约200头双甲脒抗性柑橘全爪螨(RR)，按照上述方法获取足够数量的卵。待卵孵化后，将雄性螨从饲养装置清除，只剩雌性螨。继续培养至发育成雌成螨，并通过孤雌生殖产卵。卵孵化后，即获得足够数量的雄性螨。

约500头交配前期的敏感雌性螨(SS♀)与约600头双甲脒抗性雄性螨(RR♂)平均分配于多个饲养装置中混合饲养，并自主杂交、产卵，获得F₁代。F₁代孵化后，将种群转移至茂盛的无虫的枳壳苗上，苗木套入独立的网室，隔离饲养种群。培养环境为温室并保证充足的光源、水源与营养。

苗木上杂交种群繁衍至F₅代后，种群数量足够多，并且出现了性状分离。基于前期实验基础，选用100mg/L和2500mg/L的双甲脒溶液将柑橘全爪螨敏感表型和抗性表型区分开来，收集两个表型样本至1.5mL离心管中，编号为F(SS)，F(RR)。同时收集亲本2种表型的柑橘全爪螨，编号为P(SS)和P(RR)。

2.2 BSA性状定位

利用Mollusc DNA Kit试剂盒(OMEGA)对P(SS)、P(RR)、F(SS)、F(RR)四个样本的基因组进行提取，并通过核酸蛋白仪及琼脂糖凝胶电泳，检测样本提取的质量。DNA提取并评估良好后，通过超声波击碎完整的DNA长链，成为350bp的短片段文库，DNA末端经过加尾、修复、提纯、PCR等对基因文库进行构建(步骤按照Illumina公司提供的标准操作说明书进行)。构建完成并质量检测通过后，在Illumina HiSeq平台对柑橘全爪螨基因组进行重测序。利用Illunima Casava 1.8软件进行碱基识别(Base Calling)分析。测序获得的RawReads进行筛选纯化，获得Clean Reads，用于后续信息分析。利用bwa软件对测序reads比对到柑橘全爪螨基因组，通过分析Clean Reads在柑橘全爪螨基因组中所在的位点，统计各个测序样本的基因组覆盖程度、测序的深度等，并进行变异的检测。

根据Clean Reads在参考基因组的定位结果，使用Picard(http://sourceforge.net/projects/picard/)进行去重复(Mark Duplicates)、GATK进行局部重比对(Local Realignment)、碱基质量值校正(Base Recalibration)等预处理，以保证检测得到的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)准确性，再使用GATK进行SNP的检测，过滤，并得到最终的SNP位点集。通过测序样本的过滤Reads，在柑橘全爪螨基因组中进行比对分析，评估测序样本DNA与柑橘全爪螨基因组之间的差异，检测核酸片段的缺失与插入(Small InDel：1-5bp)。

应用SnpEff软件注释变异(SNP、Small InDel)并预测变异影响。根据筛查到的突变SNP在柑橘全爪螨基因组中的定位及所在基因的定位，获得突变SNP在基因组中的注释信息(CDS区或基因区或间区等)，突变是否导致了基因的同义突变、非同义突变等。

通过过滤筛选，得到高质量的可信SNP位点，通过欧式距离(Euclidean Distance，ED)和SNP-index两种方法对所得SNP进行抗性性状关联分析，最终获得性状相关度最高的SNP。

2.3候选SNP验证及突变频率分析

在四川眉山(SC-MS)、云南牛山(YN-NS)、云南新村(YN-XC)、广西玉林(GX-YL)、江西赣州(JX-GZ)等地采集对双甲脒不同抗性水平的柑橘全爪螨种群。采集的柑橘全爪螨种群首先进行室内生物测定并计算种群抗性倍数(相比于敏感品系的LC₅₀值)。选取约20～30头不同地点的柑橘全爪螨，对候选区域进行PCR扩增，sanger测序分析以及基因突变频率计算，PCR扩增引物通过Primer premier 6软件设计：

F：5’-AACCTTCAGAATCAGTGTAATCATC-3’(SEQ ID No:1),

R：5’-CTTCCATAGATTGTTGTTGTTGTTG-3’(SEQ ID No:2)。

DNA模板通过Tissue Ex-Amp PCR Kit(Applied Biological Materials Inc，Vancouver，Canada)制备。单头螨的DNA模板制取方法如下：取约20～30头柑橘全爪螨，每头螨置于200μL PCR管中，用无菌牙签对样本进行研磨，然后加入20μL Tissue Ex-Amp PCRKit裂解液，置于PCR仪，55℃加热10min，95℃加热5min。吸取2μL DNA模板，利用特异性引物对含有SNPs的区域进行PCR扩增，PCR反应体系是：2×Phanta Max Master Mix 25μL，浓度10μM的正反向引物各2μL，待测样本DNA模板2μL，补充ddH₂O至50μL。PCR的扩增程序为：95℃预变性3min；然后95℃变性15sec，54℃退火15sec，72℃延伸10sec，40个循环；最后72℃延伸5min。

扩增产物进行Sanger测序。根据测序结果对SNP的基因型进行分析并计数，突变频率的计算方法如下，f为突变频率，n为测试螨的个数：

3.结果

3.1基因组提取

亲本及子代四个样本P(SS)、P(RR)、F(SS)、F(RR)的DNA提取后，通过凝胶电泳检测发现，DNA条带清晰，没有发生严重的降解及杂质污染(如图1所示)。通过核酸蛋白仪检测，268/280值在1.80附近，总量在2μg以上，符合BSA测序对浓度和纯度的要求。

3.2 SNP与性状关联分析

对收集的亲本和子代的4个DNA样本进行基因组重测序，共获得76.86Gbp的原始数据。在亲本中，敏感P(SS)和抗性P(RR)之间存在66718个SNP位点，在子代中，敏感F(SS)和抗性F(RR)之间存在68285个SNP位点。通过SNP-index和ED关联分析，P(SS)VSP(RR)与F(SS)VSF(RR)共同拥有且与性状相关的SNPs有38个，包括29个非同义突变(NON_SYNONYMOUS_CODING)，9个5’端非编码区突变(UTR_5_PRIME)，如图2所示。

利用ΔSNP-index和ED的数值对候选的SNPs进一步的筛查分析，若ED值越大，ΔSNP-index值越靠近1，则SNPs与性状的关联度越强。在contig00033区间，与性状相关性最高的SNP位于797168位点(ΔSNP-index＝1，ED＝1.55)，该位点位于EVM0004493.1基因(测得柑橘全爪螨双甲脒敏感品系中该基因序列如SEQ ID No:3所示，柑橘全爪螨双甲脒抗性品系中该基因序列如SEQ ID No:4所示)的UTR_5_PRIME区域，即5’端非编码区(5’UTR)(如图3所示)。

通过基因注释发现，该基因为β-2R章鱼胺受体，该基因长度为4595bp，包含5’端非翻译区，CDS编码区和3’非翻译区三部分(如图4所示)。CDS编码区为连续的外显子，没有内含子打断。SNP位于在ORF上游的5’非翻译区(5’UTR)，第752碱基处，T碱基突变为C碱基(T752C)。

3.3柑橘全爪螨田间种群SNP突变频率验证

针对实验室筛选的抗敏品系之间存在的T752CSNP，从四川眉山(SC-MS)、云南牛山(YN-NS)、云南新村(YN-XC)、广西玉林(GX-YL)、江西赣州(JX-GZ)等地采集了对双甲脒不同抗性水平的柑橘全爪螨，检测是否同样存在T752C突变。

结果如表1所示，对双甲脒抗性最高的田间种群为广西玉林种群(GX-YL)，抗性倍数为75.64，其次为云南新村种群(YN-XC)，抗性倍数为51.05。抗性倍数相对较低的种群为云南牛山种群(YN-NS)和四川眉山种群(SC-MS)，分别为7.55和10.56倍。Sanger测序发现，在双甲脒抗性品系(RR)中，候选位点均为C碱基，敏感品系(SS)中均为T碱基；在田间种群中，抗性倍数最高的广西玉林种群(GX-YL)，T752C突变频率为100％，基因型为C/C纯合子，云南新村(YN-XC)种群的突变频率为96.67％。而抗性倍数较低的云南牛山种群(YN-NS)，T752C突变频率为36.67％，Sanger测序发现了T/T,T/C,C/C三种基因型(如图5所示，碱基波峰为单峰表示为纯合子，碱基波峰为双峰表示为杂合子)，四川眉山种群(SC-MS)中也发现了三种基因型，T752C突变频率为36.67％。抗性倍数与突变频率之间的相关性分析采用SPSS软件Pearson correlation进行评估，分析发现，两者相关性为94.40％，说明该突变位点与抗性有直接的相关性。

表1不同地区柑橘全爪螨β-2R章鱼胺受体基因T752C突变频率统计

注：抗性倍数为双甲脒对不同地区柑橘全爪螨的LC₅₀与敏感品系LC₅₀的比值；n为对柑橘全爪螨进行Sanger测序的头数；Pearson correlation表示抗性倍数和T752C突变频率的相关性程度，Sig.<0.05表示差异显著。

序列表

<110> 西南大学

<120> 柑橘全爪螨对双甲脒抗性的分子标记及其应用和检测方法

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaccttcaga atcagtgtaa tcatc 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cttccataga ttgttgttgt tgttg 25

<210> 3

<211> 4595

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctctctctct ctctctctct tctaatatca aaacctctcc cgtcgaacct cctcctcctc 60

ctcccaccac cgaactcact ctatcctttt tatcatccaa ttctctctct ctccgaaaat 120

aatttctctc tttttttttc atatattcag ttccaacatg atgaaagtta ccatgacttg 180

atcactttgt accttgtgaa agttatatat acacatatat acatatatta ataaagagtt 240

ttggaaaaac aattaacctt attaagtttt gttattaata taattgttta tttaattata 300

agcaattaag ttttgtgtca atccatcatc aatctaatct tcatcatcaa cttgaacatc 360

accaaatcat catcatcaca attaatctca ctcactcact cactcactct ctctctctct 420

ctctctctct ctctctctca atcatcttta tattttaatt ttctttcgtt gattaacttg 480

tttaactctc aacaacatca acaatcaaca atcaacttcc acttttctta tgaaaccaac 540

aacaacaaca acacaccaac aattaatata ttaaattaca acaaattaac cattgaattg 600

atattatatc aattgatcca ggagaagaaa aaaaaaggaa atacaataaa aggaaattgg 660

attaaaggtt aagtgatatt ctaatttaat aataataaca attaattttc aaccttcaga 720

atcagtgtaa tcatctttgg tcattatttg gtcaacatca atatcaatta tataacgaaa 780

gtgtctctct cttgataact tttgtttact atcaacatca ctgtttgtaa acaaatacaa 840

atacacagaa agtgagagag ggacttcaag tgattaatca aattaaataa atacaacaac 900

aacaacaaca acaacaacaa tctatggaag attaattgtt ttgtcaaact gatcaacacc 960

aattcatcat tgatagatga acattaaaat tatttgcttg aaagatttaa tatcttgaat 1020

gaacataatt acacctctgc aaatcctcct ggttaatcag caacaatcaa catcattagt 1080

aatcaacgtt catcatcaac acccatgtag ttacacacaa atagtgagag agagggagag 1140

tgagagagaa agtgaaagaa aacatagaat ttaaatcaat ttggaaattt atcaacgaaa 1200

aatcgaacaa aaacaaactc gataagaata aaataataat tttctcttca gttttttcta 1260

tcccaatgtt atcatgttcg tgtgtgtgtc tcggtgttgg tgtcagggtt gagaaagtga 1320

aaggaaggaa ataggaagga aaaagaagaa gaaaaatttc aaagtaaaac caaagtgaaa 1380

tttcatctcg attctcatca tcctcatcct tagaatcttc atcttcatct tgatcatcat 1440

catcattgaa tttcaaccaa acaacgagat tgaggaaact tttgagagaa aaataaaatt 1500

actctctctt tctctttctc tctccaataa tattttacta tcatcatcat tatcattatc 1560

atcaatatct agaagagtaa aatgaatcaa ctggaaatca ttggaagaaa aaatcaatca 1620

tgataagtag tagcatctga aagtcacaag cagaaagata ttgatttaat ttggttgcaa 1680

gagaaaaggc aaaaataata acagaaagag agaaacaaac aaacaaaaaa gatgaagaga 1740

tgatgataaa gatgaagatg gaaagtgaaa ttcaacctct tcatcctcca ttcatcttgt 1800

tgatcaattg ttagcatctc tctctctctc tttctctctc aacctttaca accacctaca 1860

cctccttgtc ttgctcatca tcaaattatc aacatcatca tcaagctact gttaatattg 1920

aatcatgtca acagagccaa aaaataatca caatcaaaaa gttttcttca tcaataataa 1980

tcatcatcag taattgaata aaacaaacac accaacagaa attaaaagtg ttcaattcaa 2040

attcaaggaa tcagttaatt aatctctatt aaggtttata aatcattatc attattaatt 2100

gtgatatatt gtctgagtgt ttttattatt atggtgatga aattttttcc aagttaattg 2160

tgacaattta acgtcttttt ttttgctggt gatgactaaa gaaaatgtga tttccagtta 2220

atccttaatg atgaatacat gatgattaca ccatcatttg atttctatta taatttaagt 2280

gtaatcatct ggaatcctgg ttatctatta attaccagtc cacccacaac aacaattaaa 2340

cgttttctat taaattcaat accatcatca tcatcatcaa caacaacaat tgtatcatct 2400

ttgttaatat tattacctct tacaattaaa tcaccaataa atcaactgca accaaaactg 2460

attgaaaatc accaccaatt gatattaaca cagcaacaat ttacctcttc atctttatcc 2520

cctgaatcct caatatcagt gaaaaaatca ttatcatcat catacagaga aagaggtaat 2580

aatcatcatc atcatcatct ccatctccat catcatcctg aaacaaatct aattgataaa 2640

atctctagca tttcattatt atccaatttt tcaaattttt cgttacgttg gttaaccaaa 2700

ccaataacaa taataatggc tgactattca tcggctttat catctgttaa cgctgttgca 2760

gcttcagcag ccatggcagc attcacatca tcaatttcct cttcctttcc cggtgctggg 2820

ataagtaata gtaacagtat cggcaatggg tcaccgataa ccagggtaac ctcatcagtt 2880

ttaaattcaa gtgattcggg ttacgggtca cccagtgata ccttaattac ctggcaagag 2940

gtgacaattt tattattaaa gataataagc tgtggaagta taatattaat ggcaattttt 3000

ggtaatttat tgattattat aagtgtttat cgtcatcaac gattacgaat aacaaccaat 3060

tattttgttg tctcgttagc ctgtgccgat atccttgtcg ctctttttgc catgaccttt 3120

aaagcctccg tagcgataac tggccgctgg tttttgggta aattggtttg tgacttttgg 3180

aattcctgtg atgtactttt ctcaacggct tcaataatgc acctttgctg tatctcggtt 3240

gacagatact atgccatcat taaaccgtta gattatccaa tgaaaataac caatcgtgcg 3300

gtggccataa tgttagccgt tgtttggata agctcaactt taatctcatt tgtacccatt 3360

ttcactggac tttataccac aagtgaacac atgatctatc aacaatccca tccggatgag 3420

tgctcattca aagttaatct accctattca ttaatatcat catccgtctc attctggatt 3480

ccctgtactg tgatgttgtt tacctattgg aggatttatg ttgaagcaac taaacaggaa 3540

aaaatgttat ataaacacac ccaaatgata cccaaagtcc aacaaactca tcatcatcat 3600

catcatcatc accatcataa gcatcattat aatacatcat catctcatca tagccaacaa 3660

caacaacaat tacatactca aacaacaaat tattcaacag ggcccagtgt gggtggggga 3720

ggtacaacca ataataataa cactgctaat aacaataata ataaggataa taatattgtg 3780

acttgtggga ttggtacaaa tccctgtgct acaacaacaa caaccgccgc cgccgccgcg 3840

gccgtggcca caacgacaac aacggcgaca gcaacaacaa cacttactaa taccaatgat 3900

actggtaatg gttcctcatc atcaggatct catataacgg tacatgcacc acctcatcgt 3960

aattcacacg gcgatgatac tgaaagtgga caatcaacac caaccaaacg ttgtattaat 4020

aaaatgaaac gtgaacataa agcagctaaa acccttggta tcatcatggg tgcttttatc 4080

gcctgttggt tacccttttt tgttacatat gttactctat cagtgtgtgg tgattcttgt 4140

gttgattttc cagatattgt ggtggacaca cttttctggg tgggttattt taattctgcc 4200

attaatccag taatctatgc ttattttaat cgggaatttc gtgaagcctt caaggagacc 4260

atacaaaatg ttttctgttg ctgtcttcaa gttgaatgtt tacaaggtcc aaggaataat 4320

tcatcgatac actttaattg tacctacagg tcaacccaag atattggcct ggtcgaaaat 4380

aagtatgtaa aagattgaca aatggtgtaa aagaaaaaca gaaaaagaaa cccttccatc 4440

acccttgacc tctccaaact gaccactact ctctctctct ccctctctcc cagaaaaaga 4500

cacaaacacc aacagctaac tacgactaaa aacaagctga aaacttatac atataaatga 4560

atatatacaa atatatatat attatagtta ttaat 4595

<210> 4

<211> 4595

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctctctctct ctctctctct tctaatatca aaacctctcc cgtcgaacct cctcctcctc 60

ctcccaccac cgaactcact ctatcctttt tatcatccaa ttctctctct ctccgaaaat 120

aatttctctc tttttttttc atatattcag ttccaacatg atgaaagtta ccatgacttg 180

atcactttgt accttgtgaa agttatatat acacatatat acatatatta ataaagagtt 240

ttggaaaaac aattaacctt attaagtttt gttattaata taattgttta tttaattata 300

agcaattaag ttttgtgtca atccatcatc aatctaatct tcatcatcaa cttgaacatc 360

accaaatcat catcatcaca attaatctca ctcactcact cactcactct ctctctctct 420

ctctctctct ctctctctca atcatcttta tattttaatt ttctttcgtt gattaacttg 480

tttaactctc aacaacatca acaatcaaca atcaacttcc acttttctta tgaaaccaac 540

aacaacaaca acacaccaac aattaatata ttaaattaca acaaattaac cattgaattg 600

atattatatc aattgatcca ggagaagaaa aaaaaaggaa atacaataaa aggaaattgg 660

attaaaggtt aagtgatatt ctaatttaat aataataaca attaattttc aaccttcaga 720

atcagtgtaa tcatctttgg tcattatttg gccaacatca atatcaatta tataacgaaa 780

gtgtctctct cttgataact tttgtttact atcaacatca ctgtttgtaa acaaatacaa 840

atacacagaa agtgagagag ggacttcaag tgattaatca aattaaataa atacaacaac 900

aacaacaaca acaacaacaa tctatggaag attaattgtt ttgtcaaact gatcaacacc 960

aattcatcat tgatagatga acattaaaat tatttgcttg aaagatttaa tatcttgaat 1020

gaacataatt acacctctgc aaatcctcct ggttaatcag caacaatcaa catcattagt 1080

aatcaacgtt catcatcaac acccatgtag ttacacacaa atagtgagag agagggagag 1140

tgagagagaa agtgaaagaa aacatagaat ttaaatcaat ttggaaattt atcaacgaaa 1200

aatcgaacaa aaacaaactc gataagaata aaataataat tttctcttca gttttttcta 1260

tcccaatgtt atcatgttcg tgtgtgtgtc tcggtgttgg tgtcagggtt gagaaagtga 1320

aaggaaggaa ataggaagga aaaagaagaa gaaaaatttc aaagtaaaac caaagtgaaa 1380

tttcatctcg attctcatca tcctcatcct tagaatcttc atcttcatct tgatcatcat 1440

catcattgaa tttcaaccaa acaacgagat tgaggaaact tttgagagaa aaataaaatt 1500

actctctctt tctctttctc tctccaataa tattttacta tcatcatcat tatcattatc 1560

atcaatatct agaagagtaa aatgaatcaa ctggaaatca ttggaagaaa aaatcaatca 1620

tgataagtag tagcatctga aagtcacaag cagaaagata ttgatttaat ttggttgcaa 1680

gagaaaaggc aaaaataata acagaaagag agaaacaaac aaacaaaaaa gatgaagaga 1740

tgatgataaa gatgaagatg gaaagtgaaa ttcaacctct tcatcctcca ttcatcttgt 1800

tgatcaattg ttagcatctc tctctctctc tttctctctc aacctttaca accacctaca 1860

cctccttgtc ttgctcatca tcaaattatc aacatcatca tcaagctact gttaatattg 1920

aatcatgtca acagagccaa aaaataatca caatcaaaaa gttttcttca tcaataataa 1980

tcatcatcag taattgaata aaacaaacac accaacagaa attaaaagtg ttcaattcaa 2040

attcaaggaa tcagttaatt aatctctatt aaggtttata aatcattatc attattaatt 2100

gtgatatatt gtctgagtgt ttttattatt atggtgatga aattttttcc aagttaattg 2160

tgacaattta acgtcttttt ttttgctggt gatgactaaa gaaaatgtga tttccagtta 2220

atccttaatg atgaatacat gatgattaca ccatcatttg atttctatta taatttaagt 2280

gtaatcatct ggaatcctgg ttatctatta attaccagtc cacccacaac aacaattaaa 2340

cgttttctat taaattcaat accatcatca tcatcatcaa caacaacaat tgtatcatct 2400

ttgttaatat tattacctct tacaattaaa tcaccaataa atcaactgca accaaaactg 2460

attgaaaatc accaccaatt gatattaaca cagcaacaat ttacctcttc atctttatcc 2520

cctgaatcct caatatcagt gaaaaaatca ttatcatcat catacagaga aagaggtaat 2580

aatcatcatc atcatcatct ccatctccat catcatcctg aaacaaatct aattgataaa 2640

atctctagca tttcattatt atccaatttt tcaaattttt cgttacgttg gttaaccaaa 2700

ccaataacaa taataatggc tgactattca tcggctttat catctgttaa cgctgttgca 2760

gcttcagcag ccatggcagc attcacatca tcaatttcct cttcctttcc cggtgctggg 2820

ataagtaata gtaacagtat cggcaatggg tcaccgataa ccagggtaac ctcatcagtt 2880

ttaaattcaa gtgattcggg ttacgggtca cccagtgata ccttaattac ctggcaagag 2940

gtgacaattt tattattaaa gataataagc tgtggaagta taatattaat ggcaattttt 3000

ggtaatttat tgattattat aagtgtttat cgtcatcaac gattacgaat aacaaccaat 3060

tattttgttg tctcgttagc ctgtgccgat atccttgtcg ctctttttgc catgaccttt 3120

aaagcctccg tagcgataac tggccgctgg tttttgggta aattggtttg tgacttttgg 3180

aattcctgtg atgtactttt ctcaacggct tcaataatgc acctttgctg tatctcggtt 3240

gacagatact atgccatcat taaaccgtta gattatccaa tgaaaataac caatcgtgcg 3300

gtggccataa tgttagccgt tgtttggata agctcaactt taatctcatt tgtacccatt 3360

ttcactggac tttataccac aagtgaacac atgatctatc aacaatccca tccggatgag 3420

tgctcattca aagttaatct accctattca ttaatatcat catccgtctc attctggatt 3480

ccctgtactg tgatgttgtt tacctattgg aggatttatg ttgaagcaac taaacaggaa 3540

aaaatgttat ataaacacac ccaaatgata cccaaagtcc aacaaactca tcatcatcat 3600

catcatcatc accatcataa gcatcattat aatacatcat catctcatca tagccaacaa 3660

caacaacaat tacatactca aacaacaaat tattcaacag ggcccagtgt gggtggggga 3720

ggtacaacca ataataataa cactgctaat aacaataata ataaggataa taatattgtg 3780

acttgtggga ttggtacaaa tccctgtgct acaacaacaa caaccgccgc cgccgccgcg 3840

gccgtggcca caacgacaac aacggcgaca gcaacaacaa cacttactaa taccaatgat 3900

actggtaatg gttcctcatc atcaggatct catataacgg tacatgcacc acctcatcgt 3960

aattcacacg gcgatgatac tgaaagtgga caatcaacac caaccaaacg ttgtattaat 4020

aaaatgaaac gtgaacataa agcagctaaa acccttggta tcatcatggg tgcttttatc 4080

gcctgttggt tacccttttt tgttacatat gttactctat cagtgtgtgg tgattcttgt 4140

gttgattttc cagatattgt ggtggacaca cttttctggg tgggttattt taattctgcc 4200

attaatccag taatctatgc ttattttaat cgggaatttc gtgaagcctt caaggagacc 4260

atacaaaatg ttttctgttg ctgtcttcaa gttgaatgtt tacaaggtcc aaggaataat 4320

tcatcgatac actttaattg tacctacagg tcaacccaag atattggcct ggtcgaaaat 4380

aagtatgtaa aagattgaca aatggtgtaa aagaaaaaca gaaaaagaaa cccttccatc 4440

acccttgacc tctccaaact gaccactact ctctctctct ccctctctcc cagaaaaaga 4500

cacaaacacc aacagctaac tacgactaaa aacaagctga aaacttatac atataaatga 4560

atatatacaa atatatatat attatagtta ttaat 4595

<210> 5

<211> 220

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaccttcaga atcagtgtaa tcatctttgg tcattatttg gccaacatca atatcaatta 60

tataacgaaa gtgtctctct cttgataact tttgtttact atcaacatca ctgtttgtaa 120

acaaatacaa atacacagaa agtgagagag ggacttcaag tgattaatca aattaaataa 180

atacaacaac aacaacaaca acaacaacaa tctatggaag 220

Claims (7)

1.一种柑橘全爪螨对双甲脒抗性的分子标记，其特征在于：所述分子标记为柑橘全爪螨β-2R章鱼胺受体基因SNP突变T752C。

2.如权利要求1所述的分子标记，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No:5所示。

3.如权利要1或2所述的分子标记在柑橘全爪螨对双甲脒敏感品系和抗性品系的分类中的应用。

4.检测权利要求1或2所述的分子标记的特异性正反向引物，其特征在于：所述引物序列如下：

F：5’-AACCTTCAGAATCAGTGTAATCATC-3’；

R：5’-CTTCCATAGATTGTTGTTGTTGTTG-3’。

5.一种柑橘全爪螨对双甲脒抗性的分子标记的检测方法，其特征在于：先提取待测柑橘全爪螨的总DNA，以总DNA为模板用权利要求4中的特异性正反向引物进行PCR扩增，得到包含突变区域的β-2R章鱼胺受体基因片段，将得到的基因片段与权利要求1中的柑橘全爪螨对双甲脒的分子标记进行序列比对，即可判断该品系是对双甲脒的敏感品系还是抗性品系。

6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：2×PhantaMax Master Mix 25μL，浓度10μM的正反向引物各2μL，待测样本DNA模板2μL，补充ddH₂O至50μL。

7.如权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于：所述PCR的扩增程序为：95℃预变性3min；然后95℃变性15sec，54℃退火15sec，72℃延伸10sec，40个循环；最后72℃延伸5min。

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