CN104032028A

CN104032028A - 二斑叶螨对菊酯类杀虫剂抗药性的快速分子检测方法

Info

Publication number: CN104032028A
Application number: CN201410310778.2A
Authority: CN
Inventors: 王少丽; 王玲; 张友军; 吴青君; 谢文; 徐宝云
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-07-01
Filing date: 2014-07-01
Publication date: 2014-09-10

Abstract

本发明公开了一种二斑叶螨种群对联苯菊酯抗药性的检测方法：以待测二斑叶螨基因组DNA为模板，分别采用敏感特异性引物对进行PCR扩增，如果采用敏感引物对扩增得到了177bp的扩增片段，而同时采用抗性引物对未得到该扩增产物，则待测二斑叶螨为纯合敏感个体；如果采用抗性引物对得到了177bp的扩增产物，而同时采用敏感引物未得到该扩增产物，则待测二斑叶螨为纯合抗性个体；如果采用敏感引物对和抗性引物对都分别获得了177bp的扩增产物，则待测二斑叶螨为基因杂合型。本发明根据条带的有无直接判别二斑叶螨个体（种群）对联苯菊酯是否产生了抗药性，该方法简便、快速，可实现二斑叶螨种群对联苯菊酯抗药性的高通量检测。

Description

二斑叶螨对菊酯类杀虫剂抗药性的快速分子检测方法

技术领域

本发明属于生物领域，涉及二斑叶螨对菊酯类杀虫剂抗药性的快速分子检测方法。

背景技术

二斑叶螨Tetranychus urticae属于蜘蛛纲蜱螨亚纲真螨目叶螨科，俗称红蜘蛛，是世界性的重要农业害螨，为害包括果树、蔬菜和棉花、小麦等多种重要农作物。叶螨以成螨和幼若螨聚集在植物叶片的背面进行刺吸为害，造成叶片上出现失绿斑点，严重时造成叶片干枯脱落，极大地影响作物的产量和品质。

由于叶螨体型微小、发生世代多、繁殖速度快、发育历期短的特点，该螨极易产生抗药性。二斑叶螨于20世纪80年代传入我国时就对多种农药已经产生了抗性，加之国内防治上主要依赖化学农药，这使得二斑叶螨的抗药性发展更加迅速，为害也日趋严重。

联苯菊酯作为一种菊酯类的杀虫杀螨剂，具有触杀、胃毒作用，杀虫谱广，因此应用广泛。联苯菊酯在我国的使用历史较长，大量、单一和连续使用，使二斑叶螨等各种害均产生了抗药性；各地区的用药情况存在差异，导致各地二斑叶螨对联苯菊酯的抗性也不同，有些地区联苯菊酯的抗性水平达到高抗到极高抗水平，但联苯菊酯仍然在被农户采用。为了更好地指导农民科学合理用药，就需要明确二斑叶螨对联苯菊酯的抗药性。然而，传统的叶螨抗药性监测采用玻片浸渍法、叶片浸渍法或喷雾法，但试虫微小操作技术不易掌握，且需要测试虫量很大(至少700头)，至少24小时后才能观察测试结果，通过与相对敏感品系的对比，才可知其对药剂的抗药性水平，因此耗费时间很长。

研究已经证明，害虫对菊酯类杀虫剂产生抗药性之后，拟除虫菊酯类杀虫剂作用于昆虫神经系统的钠离子通道，延长钠离子通道开放时间，引起重复后放。昆虫对该类杀虫剂最常见的抗药性机制之一是神经靶标的敏感性下降，即击倒抗性(Knock down resistance，简称为kdr)。目前已经在多种昆虫中发现了与击倒抗性有关的钠离子通道基因发生点突变的报道(Soderlund and Knipple,2003；王利华和吴益东，2004；Dong,2007；John and Kathleen,2013)。二斑叶螨抗联苯菊酯抗性种群中首先发现了Kdr基因的第III结构域中的α螺旋S6跨膜片段中，出现了F1538I的点突变，与菊酯类杀虫剂的抗药性相关(Tsagkarakou et al.,2009)，随后在朱砂叶螨T.cinnabarinus甲氰菊酯抗性品系中验证了该点突变的存在及其与菊酯类杀虫剂抗药性之间的相关关系(Xu et al.,2013)；然而，田间叶螨种群是否存在该点突变尚需要对该基因进行克隆及序列测定及比对才能进行，耗时费力且成本较高；开发简便易操作、成本低的快速检测技术对于及时明确二斑叶螨对菊酯类杀虫剂的抗药性非常重要。

发明内容

本发明针对上述点突变，在获得室内相对敏感品系和田间抗药性品系的基础上，设计二斑叶螨抗性和敏感种群中包含该点突变位点的特异性片段，采用特异性等位基因PCR扩增技术(PCR amplification of specific alleles，PASA，也称allele-specific PCR，AS-PCR)分别从抗性和敏感种群中扩增出特异性条带，根据条带的有无直接判别二斑叶螨个体(种群)对联苯菊酯是否产生了抗药性，本发明方法简便、快速，可实现二斑叶螨种群对联苯菊酯抗药性的高通量检测。

本发明提供的技术方案是：一种二斑叶螨种群对联苯菊酯抗药性的检测方法：

以待测二斑叶螨基因组DNA为模板，分别采用敏感特异性引物对和抗性特异性引物对进行PCR扩增，如果采用敏感引物对扩增得到了177bp的扩增片段，而同时采用抗性引物对未得到该扩增产物，则待测二斑叶螨为纯合敏感个体(SS)；如果采用抗性引物对得到了177bp的扩增产物，而同时采用敏感引物未得到该扩增产物，则待测二斑叶螨为纯合抗性个体(RR)；如果采用敏感引物对和抗性引物对都分别获得了177bp的扩增产物，则待测二斑叶螨为基因杂合型；

其中敏感特异性引物对正反向引物分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO：2所示；其中抗性特异性引物对正反向引物分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供另一种二斑叶螨种群对联苯菊酯抗药性的检测方法：

以待测二斑叶螨基因组DNA为模板，采用抗性特异性引物对进行PCR扩增，如果获得了177bp的扩增产物，则待测二斑叶螨为抗性个体，其中所述引物对正反向引物分别如SEQID NO:1和SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供一种可用于二斑叶螨种群对联苯菊酯抗药性的分子标记：该位点在二斑叶螨kdr全序列的开放阅读框中的4614位核苷酸，其中由T突变为A，导致二斑叶螨对联苯菊酯产生抗药性。

同时，本发明还提供一种用于检测二斑叶螨种群对联苯菊酯抗药性的引物，所述引物对正反向引物分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO：2所示。

本发明提供的两对特异引物组合及其检测方法能够快速有效地鉴定出二斑叶螨种群是否发生了钠离子通道(kdr)基因的F1538I的点突变，通过对二斑叶螨体内kdr基因突变的检测，从而判断二斑叶螨对于联苯菊酯的抗性发展程度，该方法具有快速、有效、灵敏度高、能够实现对大批样品的高通量检测等优点，对于监测二斑叶螨田间种群对联苯菊酯的抗性基因频率及抗药性发展动态、及时调整二斑叶螨的防治策略，指导合理用药、延缓抗性发展的作用。

附图说明

图1：特异性引物扩增抗性和敏感二斑叶螨种群的Kdr基因片段，其中，Marker：Marker I；3个R泳道代表田间抗性种群；3个S泳道代表室内相对敏感种群；CK代表清水为模板的阴性对照。

图2抗性和敏感二斑叶螨中Kdr基因片段的核苷酸序列比对，其中，R1－R3是抗性种群不同克隆的kdr扩增片段序列，S1－S3是敏感种群不同克隆的kdr扩增片段序列。

图3二斑叶螨抗性和敏感种群中的突变位点监测，其中，M：Marker I；1-8：二斑叶螨室内敏感种群，扩增引物对为kdr-SF+kdr-Rv；9-16：二斑叶螨抗性种群，扩增引物对为kdr-RF+kdr-Rv。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步描述与说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

1.试虫、药剂和试剂

二斑叶螨室内种群由南京农业大学植物保护学院洪晓月教授馈赠，自2009年在室内人工气候箱内采用海绵叶盘法，由“碧丰”品种的无虫菜豆苗叶片作为寄主进行继代饲养，期间未接触任何杀虫剂，作为室内的相对敏感种群。饲养条件为26±1℃，光周期为L:D＝16h:8h。田间抗性种群分别采集自北京通县、海南三亚的草莓和西瓜寄主上，室内饲养一代后进行测定。

杀螨剂为10％联苯菊酯乳油，美国富美实(FMC)公司产品。

所用引物由上海英竣生物工程公司合成，序列测序由北京擎科生物工程有限公司进行。PCR扩增中使用的聚合酶为2×Taq 10 MASTER Mix(0.1U TaqE/μl)购自北京奥赛博科技发展有限公司。叶螨的基因组DNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司。DNA标记为MarkerII，购自天根生化科技(北京)有限公司

2.叶螨雌成螨的生物测定

叶螨的室内毒力测定参照联合国粮农组织推荐的标准方法－玻片浸渍法(Slide-dipmethod)(FAO，1980)进行。将双面胶带剪成2～3cm长，贴在载玻片的一端，用镊子揭去双面胶带上的纸片，用零号毛笔挑选大小一致、体色鲜艳、行动活泼的雌成螨，将其背部粘在双面胶带上，不要粘住螨足、螨须和口器，每片胶带粘3行，每行大约粘15～20头叶螨。在温度为26±1℃、光周期16h:8h(L:D)、相对湿度60％的昆虫生化培养箱中放置4h后，用Olympus双目解剖镜观察，严格剔除死亡或不太活泼以及体位不合适的叶螨个体。各药剂在预备试验的基础上稀释5～7个浓度，将带螨玻片的一端浸入药液中，轻轻摇动5s后取出，迅速用吸水纸吸干螨体及其周围多余的药液。铺一层湿润纱布在白色瓷缸内，浸过药液的玻片放置于大瓷盘内，在瓷缸上面再覆盖一层湿润纱布，再盖上玻璃板以达到保湿的效果，且防止纱布下滑落入玻片上。以带螨玻片浸渍清水作为对照，每个处理重复3～4次。24h后用双目解剖镜检查结果，分别记录存活和死亡的叶螨数量。用毛笔轻触螨体，以螨足不动者为死亡，对照处理死亡率在10％以下为有效试验。试验数据采用Probit软件(Feng et al.,Pest Management Science,2010,66(3):313-318.)进行处理，计算药剂的斜率、SE值、LC50值及其95％置信限等，计算各抗性种群的抗性倍数，结果如下表1。

表1二斑叶螨敏感和抗性种群对联苯菊酯的敏感度测定结果

由表1可以看出，室内相对敏感种群对联苯菊酯的敏感度较低，LC₅₀值为330.291mg/L，北京通州海南三亚的二斑叶螨田间种群对联苯菊酯的抗药性分别为6.00倍和8.38倍。

3.叶螨基因组DNA的提取

单头雌成螨的基因组DNA提取方法采用北京百泰克有限公司的DNA提取试剂盒(溶液型)，方法参照试剂盒说明书进行。(1)将单头叶螨置于滴有10μl裂解液中的Parafilm膜上，以0.2ml的PCR管底部作为匀浆器充分研磨，用另40μl裂解液清洗匀浆器2次，合并混匀；然后以微量移液器移入1.5ml离心管；(2)加入蛋白酶K2μl，混匀后，55℃条件下水浴4小时；(3)短暂电动离心后，加入RNase2.5μl，置于37℃烘箱15～30min；(4)取出后晾至室温，加入蛋白沉淀液25μl，漩涡振荡器上高速震荡25s；冰浴5min沉淀蛋白；(5)室温13000r/min离心5min；小心吸取上清液到另一个新管中(不要吸入沉淀)，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀30次，置于-20℃10min；(6)室温12000r/min离心10min，弃上清；(7)加入1ml70％乙醇漂洗DNA沉淀，室温12000r/min离心2min，弃上清；(8)加入1ml无水乙醇漂洗DNA沉淀，室温12000r/min离心2min，弃上清；(9)加入20μl DNA溶解液，于65℃下水浴60min，放于-20℃保存。单头叶螨基因组DNA的浓度由Nanodrop2000c测得为7.20ng/μl。

4.叶螨基因组的PCR扩增及测序

根据文献报道的叶螨敏感与抗性种群中的kdr序列中点突变位点(Tsagkarakou et al.,2009；Xu et al.,2013)，设计包含此点突变的kdr片段的引物对：上游引物kdr-Fw：AAGTGG CAA CAT TCA AAG GTT，下游引物kdr-Rv：GAT GGC TTT CAT TGG TTT CTT(SEQ ID NO：2)，扩增室内和田间抗性二斑叶螨种群的基因组DNA。PCR扩增体系为：2×Taq10MASTERM i x为10μl，DNA模板为1μl，上游和下游引物(各为10μM)分别加入1μl，最后用水补充至20μl。设定的PCR扩增程序为：首先95℃预变性3min；然后进行35个循环(95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min)，最后在72℃条件下延伸10min。取PCR产物8μl在1.2％琼脂糖凝胶电泳上检测。获得的特异性PCR产物经过Qiagen纯化试剂盒纯化后，送北京擎科生物技术有限公司采用上游和下游引物(kdr-Fw和kdr-Rv)进行双向序列测定。采用上述扩增kdr的特异性引物对扩增二斑叶螨敏感和抗性种群的基因组DNA，均获得一条292bp大小的特异性片段(请参见图1)。

5.抗性和敏感种群的点突变检测

对阿维菌素抗性和敏感种群的kdr片段测序结果采用DNAMAN进行序列分析比较，对发生点突变的位点上游设置PASA引物，抗性和敏感种群的检测用上游引物分别设计为：kdr-RF：5’-TTC ATC ATT TTT GGC TCT TT A-3’(SEQ ID NO：1)和kdr-SF：5’-TTCATC ATT TTT GGC TCT TT T-3’(SEQ ID NO：3)。kdr-RF引物的3‘末端第一位核苷酸(见下划线标注)与突变后的核苷酸一致，引物kdr-SF引物的3‘末端第一位核苷酸(见下划线标注)与突变前的核苷酸一致，此外，为了增加等位基因特异性PCR扩增的特异性，引物kdr-RF和kdr-SF的3’末端的倒数第三位核苷酸引入错配碱基C，见方框标注。

PCR扩增时和公用的下游引物(kdr-Rv)(SEQ ID NO：2)分别配对进行扩增。Kdr-RF和kdr-Rv组成抗性引物对，kdr-SF和kdr-Rv组成敏感引物对。PCR扩增体系如下：上下游引物(10μM)分别加入0.5μl，DNA模板1μl，2×Es Mix(0.1U TaqE/μl)为10μl，最后加ddH2O补足至25μl。扩增程序为：94℃预变性3min，随后进行30个循环(94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸30s)，最后在72℃条件下延伸3min。取样8μl在1.5％电泳检测抗性引物对和敏感引物对扩增不同种群二斑叶螨个体的基因DNA的结果。

对联苯菊酯田间抗性和相对敏感种群的kdr片段进行测序，结果采用DNAMAN5.0版本进行序列分析比较，发现在该扩增片段中在137位出现一个点突变(由敏感种群中的T突变为抗性种群中的A)(图2)，也就是二斑叶螨kdr全序列的开放阅读框(ORF)中的4614位核苷酸发生了变化(由T突变为A)，该点突变导致其ORF的1538位的氨基酸序列由苯丙氨酸(F)突变为异亮氨酸(I)。

将检测田间抗性和敏感二斑叶螨种群的上述kdr-RF引物和kdr-SF引物与公用的下游引物(kdr-Rv)分别配对，扩增二斑叶螨的抗性和敏感种群，结果见图3。由图3可以看出，引物对kdr-SF+kdr-Rv对室内敏感种群扩增时，可以稳定出现一条177bp左右的条带，而扩增抗性种群时无带；引物对kdr-RF+kdr-Rv扩增抗性种群时，可以出现一条177bp的条带，而扩增敏感种群时无带。进一步测序结果也表明这条177bp条带是上述292bp中的一部分序列，也是预期扩增的条带。说明上述设计的针对抗性和敏感种群的引物对和扩增条件都是可行而且稳定的，可以用于下一步不同种群的抗性基因频率检测。

对北京通州和海南三亚的二斑叶螨抗性种群，随机抽取30头叶螨样品，采用上述建立的两对突变位点检测引物对分别进行PCR扩增，检测各抗性种群中抗性基因的突变频率，结果见表2。可以看出，室内敏感二斑叶螨种群中，大部分个体为SS敏感基因型，存在少量的RS杂合基因型，抗性基因突变频率为10％；北京通州和海南三亚两个田间抗性种群，抗性基因突变频率分别为50％和53.33％。该结果也通过测序得到了验证。

表2二斑叶螨不同种群中kdr基因突变频率检测结果

种群	样本数	SS	RS	RR	抗性基因突变频率(％)
						相对敏感种群	30	24	6	0	10.00
北京通州种群	30	2	26	2	50.00
						海南三亚种群	30	0	28	2	53.33

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 二斑叶螨对菊酯类杀虫剂抗药性的快速分子检测方法

<160> 3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 二斑叶螨

<400> 1

TTC ATC ATT TTT GGC TCT TCT A 22

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 二斑叶螨

<400> 2

GAT GGC TTT CAT TGG TTT CTT 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 二斑叶螨

<400> 3

TTC ATC ATT TTT GGC TCT TCT T

Claims

1.一种二斑叶螨种群对联苯菊酯抗药性的检测方法，其特征在于：

以待测二斑叶螨基因组DNA为模板，分别采用敏感特异性引物对和抗性特异性引物对进行PCR扩增，如果采用敏感引物对扩增得到了177bp的扩增片段，而同时采用抗性引物对未得到该扩增产物，则待测二斑叶螨为纯合敏感个体；如果采用抗性引物对得到了177bp的扩增产物，而同时采用敏感引物未得到该扩增产物，则待测二斑叶螨为纯合抗性个体；如果采用敏感引物对和抗性引物对都分别获得了177bp的扩增产物，则待测二斑叶螨为基因杂合型；

2. 一种二斑叶螨种群对联苯菊酯抗药性的检测方法，其特征在于：

以待测二斑叶螨基因组DNA为模板，采用抗性特异性引物对进行PCR扩增，如果获得了177bp的扩增产物，则待测二斑叶螨为抗性个体，其中所述引物对正反向引物分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO：2所示。

3. 一种可用于二斑叶螨种群对联苯菊酯抗药性的分子标记，其特征在于：该位点

在二斑叶螨kdr全序列的开放阅读框中的4614位核苷酸，其中由T突变为A，导致二斑叶螨对联苯菊酯产生抗药性。

4. 一种用于检测二斑叶螨种群对联苯菊酯抗药性的引物，其特征在于：所述引物对正反向引物分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO：2所示。