CN103882121A - 基于dCAPS技术对日本看麦娘抗药性相关突变的分子检测方法 - Google Patents

基于dCAPS技术对日本看麦娘抗药性相关突变的分子检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于dCAPS技术检测导致日本看麦娘对ACCase抑制剂类除草剂产生抗性的相关突变的分子检测方法，可用于对日本看麦娘抗性相关突变进行快速准确的检测，本发明属于生物技术领域。根据日本看麦娘与抗性相关的ACCase基因，针对不同突变分别设计引物，以日本看麦娘基因组DNA为模板进行PCR扩增并获得扩增片段；选择相应的限制性内切酶对上述的PCR扩增片段进行酶切；酶切后根据琼脂糖凝胶电泳可判断日本看麦娘是否具有抗性相关突变及其突变的基因型。相对于传统的突变检测方法，本发明的特异性强，准确度高，方法更加快速简单，并且大大降低了检测成本，为日本看麦娘抗性相关突变的检测提供了一种优良的分子检测方法。

Description

基于dCAPS技术对日本看麦娘抗药性相关突变的分子检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于衍生酶切扩增多态性(derived cleaved amplifiedpolymorphic sequence，dCAPS)方法来检测导致日本看麦娘对乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl coenzyme Acarboxylase，ACCase)抑制剂类除草剂产生抗性的相关突变的分子检测方法。可用于对日本看麦娘抗性相关突变进行快速准确的检测。
背景技术
日本看麦娘(Alopecurus japonicus Steud.)是我国油菜田和麦田的恶性禾本科杂草，因其与作物争肥、争水、争阳光、争空间，而对油菜和小麦的产量及品质造成严重危害。
ACCase抑制剂类除草剂是一类包括芳氧苯氧基丙酸酯类，环己烯酮类，新苯基吡唑啉类的具有杀草活性高、杀草谱广和选择性强等优点的除草剂。自70年代后期在我国油菜田和小麦田开始广泛使用，一直是油菜田和小麦田防除一年生禾本科杂草的主导药剂。但是近年来，日本看麦娘对此类除草剂的抗药性问题逐步显现，对我国油菜和小麦的粮食生产生了严重威胁。因此，对日本看麦娘的抗药性检测对于保障我国粮食生产安全至关重要。研究表明，在日本看麦娘中编码ACCase氨基酸的某些位点突变会导致其对ACCase抑制剂类除草剂产生抗药性，这些氨基酸突变为Ile-1781-Leu，Trp-1999-Cys，Trp-1999-Leu，Trp-2027-Cys，Ile-2041-Asn，Asp-2078-Gly。
对抗性相关突变的检测对于抗性日本看麦娘的监控及治理具有重要意义。dCAPS技术是一种通过等位基因快速准确检测SNP位点的技术。该技术通过在引物中导入错配碱基，使扩增的序列在一种基因型中产生酶切位点，而在另一种没有，PCR产物再经过相应的限制性内切酶酶切，通过限制性图谱分析可知SNP位点是否存在，从而对突变位点进行快速准确的检测。该技术已经在其他抗性杂草的抗性突变检测中得到了应用，但是在我国恶性杂草日本看麦娘的抗性检测中尚无应用。
发明内容
为了对日本看麦娘抗ACCase抑制剂类除草剂的抗性相关突变进行检测，本发明建立了一套基于dCAPS技术对抗性相关突变进行快速准确检测的分子检测方法。为实现该方法，本发明针对不同突变设计了相应的引物，筛选了合适的限制性内切酶，并对PCR扩增条件、琼脂糖凝胶电泳条件进行了优化。
本发明所述分子检测方法通过以下技术方案实现：
(1)根据日本看麦娘编码ACCase基因中与抗性相关的不同的突变位点，分别设计一对引物进行PCR扩增，使扩增产物在不同的基因型之间产生不同的酶切位点。
PCR扩增所用的引物为：
(2)用相应的限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切。
酶切所用的限制性内切酶为：
Figure BSA0000101411120000022
(3)酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，对电泳图谱分析便可明确是否产生了抗性突变。
对Ile-1781-Leu突变的检测中，敏感基因型产生可见的320bp条带，抗性纯合突变产生可见的271bp和不可见的49bp条带，抗性杂合突变产生可见的320bp、271bp条带和不可见的49bp条带；对Trp-1999-Cys突变的检测中，敏感基因型产生可见的359bp和不可见的47bp条带，抗性纯合突变产生可见的406bp条带，抗性杂合突变产生可见的406bp、359bp条带和不可见的47bp条带；对Trp-1999-Leu突变的检测中，敏感基因型产生可见的390bp条带，抗性纯合突变产生可见的349bp和不可见的41bp条带，抗性杂合突变产生可见的390bp、349bp条带和不可见的41bp条带；对Trp-2027-Cys突变的检测中，敏感基因型产生可见的317bp条带，抗性纯合突变产生可见的267bp和不可见的50bp条带，抗性杂合突变产生可见的317bp、267bp条带和不可见的50bp条带；对Ile-2041-Asn突变的检测中，敏感基因型产生可见的391bp条带，抗性纯合突变产生可见的351bp和不可见的40bp条带，抗性杂合突变产生可见的391bp、351bp条带和不可见的40bp条带；对Asp-2078-Gly突变的检测中，敏感基因型产生可见的331bp条带，抗性纯合突变产生可见的283bp和不可见的48bp条带，抗性杂合突变产生可见的331bp、283bp条带和不可见的48bp条带。
本发明的有益效果是：(1)本发明相对于传统的突变检测方法，不需要昂贵的仪器，大大降低了试验成本，并且本发明所筛选的内切酶都是价格便宜容易获得的内切酶；(2)本发明提供的引物能够对目前发现的所有日本看麦娘抗药性相关突变进行检测，全面有效；(3)本发明能够方便快速，只需要三个半小时就可以对抗性突变进行检测；(4)本发明的检测准确率高，经过测试，检验准确率接近100％；(4)本发明是国内外首次采用dCAPS技术对日本看麦娘抗性相关突变进行检测的，该方法对抗性日本看麦娘的治理及其防除，指导农民科学合理用药，以及降低成本和减少环境污染具有重要意义。总之本发明对日本看麦娘抗性相关突变的检测提供了一种特异性强，准确度高，快速简单的低成本分子检测方法。
附图说明
图1是PCR扩增产物电泳图。
图中M.50bp ladder，1和2.引物L1781IF和L1781IR扩增产物，3和4.引物W1999CF和W1999CR扩增产物，5和6.引物W1999LF和W1999LR扩增产物，7和8.引物W2027CF和W2027CR扩增产物，9和10.引物I2041NF和I2041NR扩增产物，11和12.引物D2078GF和D2078GR扩增产物。
图2是利用dCAPS技术对Ile-1781-Leu突变的检测。
图中M.50bp ladder，1-8.抗性杂合突变。
图3是利用dCAPS技术对Trp-1999-Cys突变的检测。
图中M.50bp ladder，2、4.敏感基因型，1、3、5-8.抗性杂合突变。
图4是利用dCAPS技术对Trp-1999-Leu突变的检测。
图中M.50bp ladder，1、3-8.敏感基因型，2.抗性杂合突变。
图5是利用dCAPS技术对Trp-2027-Cys突变的检测。
图中M.50bp ladder，1和4.敏感基因型，2、3、5-8.抗性杂合突变。
图6是利用dCAPS技术对Ile-2041-Asn突变的检测。
图中M.50bp ladder，2.敏感基因型，1、3-8.抗性杂合突变。
图7是利用dCAPS技术对Asp-2078-Gly突变的检测。
图中M.50bp ladder，8.敏感基因型，1-7.抗性杂合突变。
具体实施方式
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下述实施例中所用的化学试剂、材料，若无特殊说明，均可以从商业途径得到。另外，若无特殊说明，实例均按照常规实验条件，如J.Sambrook等分子克隆手册(New York：Gold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。
实施例1引物设计
本发明通过分析日本看麦娘编码ACCase的基因序列，利用软件dCAPS finder2.0和Primer Primer5.0设计引物，并且经过多次筛选，选取了引物L1781I／F L1781IR，W1999CF／1999CR，W1999LF／W1999LR，W2027CF／W2027CR，I2041NF／I2041NR，D2078GF／D2078GR来进行PCR扩增。
实施例2总DNA的提取
参照天根公司产品Plant Genomic DNA Kit说明书进行，具体步骤如下：
(1)取植物新鲜组织约100mg，加入液氮充分研磨。
(2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL65℃预热的缓冲液GP1的离心管中，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管数次以混合样品。
(3)加入700μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min。小心地将上一步所得的上层水相转入新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。
(4)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃掉废液。
(5)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管。
(6)向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管。
(7)向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液。
(8)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。
(9)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL超纯水，室温放置2～5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管。-20℃保存。
实施例3PCR扩增
(1)PCR反应体系：
Figure BSA0000101411120000041
(2)PCR反应条件
预变性94℃、4min；再经过94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
实施例4限制性内切酶酶切
Figure BSA0000101411120000051
酶切反应条件为37℃，反应30min。
实施例5酶切产物电泳检测
酶切结束后，酶切产物经过3％琼脂糖凝胶，电泳60-70min。电泳结束后经过凝胶成像仪观察结果。例如，从图3可知用于检测Trp-1999-Cys突变的8个样本中，2和4为敏感基因型，而1、3、5-8具有该突变，并且为杂合抗性突变。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或者改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.一种快速准确检测抗ACCase抑制剂类除草剂的日本看麦娘、看麦娘、菵草等杂草中与抗性相关的突变位点(Ile-1781-Leu，Trp-1999-Cys，Trp-1999-Leu，Trp-2027-Cys，Ile-2041-Asn，Asp-2078-Gly)的分子检测方法，其特征是基于衍生酶切扩增多态性(dCAPS)技术对抗性相关突变的检测，该方法包括以下步骤：
步骤1：提取杂草DNA样本；
步骤2：进行PCR；
步骤3：用限制性内切酶酶切PCR产物；
步骤4：琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。
2.根据权利要求1所述的分子检测方法，其特征在于：
(1)步骤2中所述的用于PCR反应中的引物具有特异性，所述的引物分别为：
Figure FSA0000101411110000011
(2)步骤3中用于酶切的限制性内切酶具有特异性，所述的内切酶分别为：
3.根据权利要求1或2所述的分子检测方法，所述杂草可以是日本看麦娘、看麦娘、菵草、棒头草、硬草等禾本科杂草。
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