CN104745687A - 快速检测柑橘全爪螨拟除虫菊酯抗性的分子标记方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一种快速检测柑橘全爪螨拟除虫菊酯抗性的分子标记方法，包括如下步骤：1)制备PCR扩增模板：以单头柑橘全爪螨为样品；2)进行巢式PCR扩增：第一轮PCR：以步骤1制备的样品作为扩增模板，使用引物A、B进行PCR扩增；第二轮PCR：以第一轮PCR产物作为扩增模板，使用引物C、D进行PCR扩增；3)酶切：取第二轮PCR产物用BclI酶进行酶切反应；4)电泳：将步骤3中酶切后的反应液用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，观察307bp和281bp处是否有条带。本发明方法避免了DNA提取这一步骤，直接利用巢式PCR和酶切的方法快速检测单头柑橘全爪螨F1538I突变。

Description

快速检测柑橘全爪螨拟除虫菊酯抗性的分子标记方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种分子标记，尤其涉及一种快速检测柑橘全爪螨拟除虫菊酯抗性的分子标记方法。
背景技术
柑橘全爪螨是一种世界性害螨，对柑橘产量和品质影响较大，因其分布广、危害重以及抗性发展迅速等特点受到广泛关注。目前化学防治仍是控制柑橘全爪螨的重要措施。但是化学农药施用不当，不仅影响果品安全，同时还会导致严重的抗性药。拟除虫菊酯类药剂是一类杀虫(螨)效果好、毒性低和环境友好型农药，在害虫防治中广泛使用。然而，柑橘全爪螨对这类药剂产生了较为严重的抗药性，大大降低了这类杀虫(螨)剂的防治效果。
昆虫钠离子通道是神经细胞传导兴奋的基础，同时，钠离子通道基因还与昆虫产生击倒抗性有关。研究表明，电压门控钠离子通道突变可以降低柑橘全爪螨对拟除虫菊酯类药剂的敏感性，从而介导抗性的产生。F1538I这一突变已在多种蜱、螨类害虫中报道与拟除虫菊酯类药剂的抗性相关。研究发现，在万州柑橘全爪螨种群中已经发现F1538I的突变，且这种突变与其对拟除虫菊酯抗性相关。但是目前还没有一种快速有效的方法来诊断柑橘全爪螨对拟除虫菊酯抗性的分子标记。且目前相关的分子诊断技术均需要先提取样品的DNA，单头 螨提取DNA十分困难，这大大增加了操作的时间和复杂性。此外，目前还没有针对柑橘全爪螨钠离子通道基因抗性相关突变位点的检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服已有技术的缺陷，提供一种不用事先单独提取DNA、利用巢式PCR方法、以单头柑橘全爪螨为样品并结合双酶切的快速检测柑橘全爪螨拟除虫菊酯抗性的分子标记方法。
本发明的技术方案如下：
一种快速检测柑橘全爪螨拟除虫菊酯抗性的分子标记方法，包括如下步骤：
1)制备PCR扩增模板：以单头柑橘全爪螨为样品，分别将每个样品放入PCR管中，加入3μL ddH2O后研磨螨虫体，将研磨好的样品作为第一轮PCR扩增的模板；
2)进行巢式PCR扩增：
第一轮PCR：以3μL步骤1制备的样品作为扩增模板，使用引物A、B进行PCR扩增；
第二轮PCR：以第一轮PCR产物作为扩增模板，使用引物C、D进行PCR扩增；
所述引物A、B、C、D是根据柑橘全抓螨钠离子通道基因(GenBank ID:KF646792.1)设计的，引物A、B、C、D的序列如下：
A:TATTATGGACCATGCGATTGA；
B:CAAAGACGTTCCAAGGTTCTC；
C:GTATTTTTTATCATTTTCGGCTCATTG；
D:CCTGGTAGTGGTCAAGGGACAT；
3)酶切：取步骤2中得到的第二轮PCR产物用BclI酶进行酶切反应。
4)电泳：将步骤3中酶切后的反应液用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，观察307bp和281bp处是否有条带：如果只在307bp处有条带，说明该螨在1538位点为纯合子，基因型为TTC；如果在307bp和281bp处均有条带，说明该螨的基因型为杂合子，等位基因分别为TTC和ATC；如果只在281bp处有条带，则说明该螨的基因型为纯合子，基因型为ATC。
所述步骤1中研磨螨虫体的方法为：将10μL枪头的枪头口在火上烧成封闭的球状，冷却，用制备好的小枪头研磨PCR管中的柑橘全爪螨直到没有明显的组织即可。
所述步骤2中第一轮PCR的反应体系为：10μL 2×Phire动物组织PCR缓冲液、1μL引物A、1μL引物B、0.4μL Phire热启动II DNA聚合酶、3μL步骤1制备的PCR扩增模板、用ddH2O补充至20μL。反应条件：98℃起始变性5min，98℃变性5s、58℃退火5s、72℃延伸20s、循环40次，最后72℃延伸1min；
第二轮PCR的反应体系为：PrimeSTAR Max premix(2×)12.5μL，引物C 1μL、引物D 1μL、第一轮PCR产物1μL、加ddH2O补充至25μL；反应条件：98℃变性15s、60℃退火30s、循环35次，延伸5min。
所述步骤3中的酶切反应方法为：取步骤2中得到的第二轮PCR产物15μL进行酶切，酶切体系：15μL PCR产物、2μL 10×FastDigest Green Buffer、1μL BclI酶、加水补充至30μL；反应条件：37℃反应10min，65℃反应5min。
本发明的技术原理是：已有研究表明，对拟除虫菊酯敏感的柑橘全爪螨种群中电压门控钠离子通道在1538位点对应的氨基酸为F，由TTC编码；而对拟 除虫菊酯具有抗性的柑橘全爪螨种群中在该位点对应的氨基酸为I，由ATC编码。因此，抗性种群中对应的氨基酸是由TTC发生碱基颠换形成ATC，基于这一个位点的差异，通过引物C的设计形成一个限制性内切酶BclI的识别位点TGATCA。进行巢式PCR，第一轮PCR旨在提高第二轮PCR的模板丰度和增加第二轮PCR产物的特异性。第一轮PCR直接以柑橘全爪螨整虫为模板，引物分别为A和B，分别设计在F1538位点的上游和下游，扩增产物长为518bp；第二轮PCR的引物设计在第一轮的产物内，分别为引物C和D，第二轮的扩增产物为307bp。进行酶切后，如果只在307bp处有条带，说明该螨在1538位点为纯合子，基因型为TTC，没有突变的存在。如果在307bp和281bp处均有条带，说明该螨的基因型为杂合子，等位基因分别为TTC和ATC。如果只在281bp处有条带，则说明该位点为突变后的纯合子，为ATC。通过对1538位点基因型的检测和分析，结合检测样品对拟除虫菊酯的抗性表现，可以分析出该突变与柑橘全爪螨对拟除虫菊酯抗性的相关程度。
本发明的有益效果是：避免了DNA提取这一步骤，直接利用巢式PCR和酶切的方法快速检测单头柑橘全爪螨F1538I突变，建立了一种方便有效的分子标记技术。在DNA提取中需要使用一些有机溶剂，这些试剂常具有挥发性，对人的身体健康具有一定危害，本发明方法可以有效的避免这一缺陷，且节省了时间和检测成本；本发明方法操作简便，所有反应均在PCR仪内完成，能够检测单头样品，一次同时检测的样品量大，可以快速有效的检测柑橘全爪螨田间种群在F1538位点的基因型，可以快速有效地评估突变位点在某个种群中的频率，为柑橘全爪螨对拟除虫菊酯类药剂的田间抗性检测提供分子工具。
附图说明
图1是本发明实施例中酶切后的琼脂糖凝胶电泳图
具体实施方式
本发明实施例中所用试剂来源如下：
2×Phire动物组织PCR缓冲液(Thermo Scientific公司，美国)
Phire热启动II DNA聚合酶(Thermo Scientific公司，美国)
FastDigest Green Buffer(Thermo Scientific公司，美国)
BclI酶(Thermo Scientific公司，美国)
PrimeSTAR Max premix(2×)(Takara公司,日本)
快速诊断柑橘全爪螨拟除虫菊酯抗性相关基因的分子标记方法，按照如下步骤操作：
1)制备PCR扩增模板：以单头柑橘全爪螨为样品，分别将每个样品放入200μL的PCR管中，加入3μL ddH2O。准备10μL小枪头，将枪头口在火上烧成封闭的球状，冷却。用制备好的小枪头将PCR管中的柑橘全爪螨研磨，到没有明显的组织即可。将研磨好的样品作为第一轮PCR扩增的模板，共计3μL。
2)进行巢式PCR扩增：
第一轮PCR：反应体系：10μL 2×Phire动物组织PCR缓冲液、1μL引物A、1μL引物B、0.4μL Phire热启动II DNA聚合酶、3μL步骤1制备的PCR扩增模板、用ddH2O补充至20μL。反应条件：98℃起始变性5min，98℃变性5s、58℃退火5s、72℃延伸20s、循环40次，最后72℃延伸1min，4℃保存。
第二轮PCR：反应体系：PrimeSTAR Max premix(2×)12.5μL，引物C 1μL、引物D 1μL、第一轮PCR产物1μL、加ddH2O补充至25μL。反应条件：98℃变性15s、60℃退火30s、循环35次，延伸5min，4℃保存。
所述引物A、B、C、D的序列如下：
A:TATTATGGACCATGCGATTGA；
B:CAAAGACGTTCCAAGGTTCTC；
C:GTATTTTTTATCATTTTCGGCTCATTG；
D:CCTGGTAGTGGTCAAGGGACAT。
3)酶切：取步骤2中得到的第二轮PCR产物15μL进行酶切反应，酶切体系：15μL PCR产物、2μL 10×FastDigest Green Buffer、1μL BclI酶、加水补充至30μL。反应条件：37℃反应10min，65℃反应5min，4℃保存。
4)电泳：将步骤3中酶切后的反应液用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳。结果如图1所示，泳道2-8为7个柑橘全爪螨样品进行检测后的结果，其中第1条泳道为未进行酶切的PCR产物，为307bp。泳道2-8是BclI酶切后的结果，显示只有第8泳道中有两条带307bp和281bp的存在，说明该样品为杂合子，存在TTC和ATC两种类型的等位基因。泳道2-7只在307bp有条带，说明这6个柑橘全抓螨样品在1538位点的基因型为TTC。通过对1538位点基因型的检测和分析，结合检测样品对拟除虫菊酯的抗性表现，可以分析出该基因与柑橘全爪螨对拟除虫菊酯抗性的相关程度。

Claims (4)

1.一种快速检测柑橘全爪螨拟除虫菊酯抗性的分子标记方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)制备PCR扩增模板：以单头柑橘全爪螨为样品，分别将每个样品放入PCR管中，加入3μL ddH2O后研磨螨虫体，将研磨好的样品作为第一轮PCR扩增的模板；
2)进行巢式PCR扩增：
第一轮PCR：以3μL步骤1制备的样品作为扩增模板，使用引物A、B进行PCR扩增；
第二轮PCR：以第一轮PCR产物作为扩增模板，使用引物C、D进行PCR扩增；
所述引物A、B、C、D的序列如下：
A:TATTATGGACCATGCGATTGA；
B:CAAAGACGTTCCAAGGTTCTC；
C:GTATTTTTTATCATTTTCGGCTCATTG；
D:CCTGGTAGTGGTCAAGGGACAT；
3)酶切：取步骤2中得到的第二轮PCR产物用BclI酶进行酶切反应；
4)电泳：将步骤3中酶切后的反应液用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，观察307bp和281bp处是否有条带：如果只在307bp处有条带，说明该螨在1538位点为纯合子，基因型为TTC；如果在307bp和281bp处均有条带，说明该螨的基因型为杂合子，等位基因分别为TTC和ATC；如果只在281bp处有条带，则说明该螨的基因型为纯合子，基因型为ATC。
2.如权利要求1所述的快速检测柑橘全爪螨拟除虫菊酯抗性的分子标记方法，其特征在于：所述步骤1中研磨螨虫体的方法为：将10μL枪头的枪头口在火上烧成封闭的球状，冷却，用制备好的小枪头研磨PCR管中的柑橘全爪螨直到没有明显的组织即可。
3.如权利要求1或2所述的快速检测柑橘全爪螨拟除虫菊酯抗性的分子标记方法，其特征在于：所述步骤2中第一轮PCR的反应体系为：10μL 2×Phire动物组织PCR缓冲液、1μL引物A、1μL引物B、0.4μL Phire热启动II DNA聚合酶、3μL步骤1制备的PCR扩增模板、用ddH2O补充至20μL。反应条件：98℃起始变性5min，98℃变性5s、58℃退火5s、72℃延伸20s、循环40次，最后72℃延伸1min；
第二轮PCR的反应体系为：PrimeSTAR Max premix(2×)12.5μL，引物C1μL、引物D1μL、第一轮PCR产物1μL、加ddH2O补充至25μL；反应条件：98℃变性15s、60℃退火30s、循环35次，延伸5min。
4.如权利要求1或2所述的快速检测柑橘全爪螨拟除虫菊酯抗性的分子标记方法，其特征在于：所述步骤3中的酶切反应方法为：取步骤2中得到的第二轮PCR产物15μL进行酶切，酶切体系：15μL PCR产物、2μL 10×FastDigestGreen Buffer、1μL BclI酶、加水补充至30μL；反应条件：37℃反应10min，65℃反应5min。
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