CN112176078B

CN112176078B - 柑桔全爪螨对阿维菌素抗性的分子标记及其应用和检测方法

Info

Publication number: CN112176078B
Application number: CN202011285271.8A
Authority: CN
Inventors: 王进军; 潘登; 豆威; 袁国瑞; 刘巽燕
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2020-11-17
Filing date: 2020-11-17
Publication date: 2022-02-15
Anticipated expiration: 2040-11-17
Also published as: CN112176078A

Abstract

本发明公开了一种柑桔全爪螨对阿维菌素抗性的分子标记及其在柑桔全爪螨对阿维菌素敏感种群和抗性种群分类中的应用，所述分子标记为PcGluCl1_G314E突变或PcGluCl3_G310R突变。还公开了一种扩增述分子标记的特异性引物对和所述分子标记的检测方法：先提取待测柑桔全爪螨的总DNA，以总DNA为模板用特异性引物对进行PCR扩增，得到扩增产物GluCl1或GluCl3基因片段，分析PCR扩增产物是否含所述的分子标记，即可判断取待测柑桔全爪螨是对阿维菌素的敏感种群还是抗性种群。本发明首次确定了柑桔全爪螨对阿维菌素抗性的分子标记，为柑桔全爪螨对阿维菌素类的田间抗性提供一种快速的分子检测手段。

Description

柑桔全爪螨对阿维菌素抗性的分子标记及其应用和检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种分子标记，尤其涉及一种柑桔全爪螨对阿维菌素抗性的分子标记及其应用和检测方法。

背景技术

柑桔全爪螨，Panonychus citri(McGregor)，作为一种世界性害螨，年发生量大，严重影响柑桔的品质，甚至威胁柑桔产业的健康发展。对柑桔全爪螨的防治仍然依靠化学杀螨剂。因柑桔全爪螨自身特性加之田间施药频繁等原因，其对多种杀螨剂已产生抗药性且抗性发展迅速。

阿维菌素是一种从链霉菌Streptomyces avermitilis MA-4680(NRRL8165)发酵菌丝中提取出的具有杀虫、杀螨和杀线虫活性的天然产物，在农业领域被广泛应用。作为一种广谱的杀虫、杀螨剂，随着阿维菌素类杀虫、杀螨剂在世界上被长期大量使用，导致害虫害螨的抗药性快速发展。在无脊椎动物中，该类药剂通过作用于特有的谷氨酸门控氯离子通道(GluCl)发挥毒杀活性。而在田间抗性监测过程中，发现柑桔全爪螨南宁种群的LC₅₀值达102.04mg/L，相对于室内敏感品系(LC₅₀：0.010mg/L)，已表现出极高抗水平。目前对于叶螨类对阿维菌素抗性的产生普遍认为是其靶标GluCl基因发生突变导致，但还没有关于柑桔全爪螨对于阿维菌素抗性的分子标记的报道。

发明内容

本发明根据柑桔全爪螨对阿维菌素敏感和抗性品系分类领域的空白，提供一种柑桔全爪螨对阿维菌素抗性的分子标记，所述分子标记为PcGluCl1_G314E突变或PcGluCl3_G310R突变。

所述PcGluCl1_G314E突变中野生型PcGluCl1基因的CDS序列如SEQ ID No:1所示；所述PcGluCl3_G310R突变中野生型PcGluCl3基因的CDS序列如SEQ ID No:2所示。

编码所述PcGluCl1_G314E突变的基因序列如SEQ ID No:7所示，编码所述PcGluCl3_G310R突变的基因序列如SEQ ID No:8所示。

本发明的另一目的是提供上述任一的分子标记在柑桔全爪螨对阿维菌素敏感种群和抗性种群分类中的应用。

本发明的再一目的是提供一种上述任一分子标记的特异性引物对，所述引物对为Pc_GluCl1_F/Pc_GluCl1_R，或者Pc_GluCl3_F/Pc_GluCl3_R，引物序列如下：

Pc_GluCl1_F：5’-TATGTTGGTCATCGTCTCTTG-3’，

Pc_GluCl1_R：5’-CTTTGTTTACCCGCTTTAAC-3’；

Pc_GluCl3_F：5’-TTGTTATCGTCTCATGGGTT-3’，

Pc_GluCl3_R：5’-GTGTTCCTGGTGTCGTTTAC-3’。

本发明的再一目的是提供一种柑桔全爪螨对阿维菌素抗性的分子标记的检测方法：先提取待测柑桔全爪螨的总DNA，以总DNA为模板用上述的特异性引物对进行PCR扩增，得到扩增产物GluCl1或GluCl3基因片段，分析PCR扩增产物是否含有前述的分子标记，即可判断取待测柑桔全爪螨是对阿维菌素的敏感种群还是抗性种群。

所述的分析PCR扩增产物是否含有前述的分子标记的具体方法为:

将PCR扩增产物进行测序，与上述的柑桔全爪螨对阿维菌素抗性的分子标记进行序列比对，如果PCR扩增产物为PcGluCl1_G314E突变或PcGluCl3_G310R突变，说明检测的柑桔全爪螨为阿维菌素抗性种群。

作为优先地，提取待测柑桔全爪螨的总DNA的方法为：将待测柑桔全爪螨放入离心管中，加入STE Buffer和proteinase K，用研磨棒充分研磨螨体，37℃水浴孵育30min，震荡30s后，95℃水浴5min，离心，所获得上清作为PCR扩增模板。

作为优先地，所述PCR扩增的反应体系为12.5μL 2×PrimeSTAR Max Premix、引物对的正、反向引物各1μL、2μL DNA模板，补充ddH₂O至25μL。

作为优先地，所述PCR扩增的反应条件为：98℃预变性2min；98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸20s、30次循环；最后72℃延伸5min。

本发明的有益效果是：首次确定了柑桔全爪螨对阿维菌素抗性的分子标记，建立了快速检测柑桔全爪螨对阿维菌素抗性的分子标记的方法，本发明方法避免了传统DNA提取步骤的复杂及危险性，消除了传统DNA纯化过程中所必需的耗时耗力的去蛋白、有机溶剂提取、透析以及乙醇沉淀等实验步骤，避免了有机试剂对人体的危害，本发明方法操作简单，可同时检测大量样本，可快速有效的检测柑桔全爪螨田间种群是否存在G314E和G310R突变及突变比例，可快速有效的评估相应位点在某地理种群中的突变频率，为柑桔全爪螨对阿维菌素类杀螨剂的田间抗性提供一种分子检测手段。

附图说明

图1是柑桔全爪螨PcGluCl1和PcGluCl3基因PCR扩增电泳检测结果图。

图2是柑桔全爪螨阿维菌素抗性种群PcGluCl1基因突变分析。

图3是柑桔全爪螨阿维菌素抗性种群PcGluCl3基因突变分析。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

本发明实施例中主要试剂来源如下：

TruSeq^TMNano DNA LT Sample Prep Kit：品牌：Illumina；

STE Buffer：100mM NaCl、10mM Tris-HCl、1mM EDTA。

Tris-HCl(Sigma-Aldrich公司，德国)

EDTA(Sigma-Aldrich公司，德国)

Proteinase K：(QIAGEN公司，德国)

2×PrimeSTAR Max premix(Takara公司，日本)

其余试剂如未表明，均为本领域常规试剂，均可商购获得。

实施例1柑桔全爪螨对阿维菌素敏感性检测

敏感品系：室内敏感品系2016年采自于西南大学柑橘研究所苗圃内，并在实验室长期多代饲养，期间未接触任何药剂，其对阿维菌素的LC₅₀值保持较低水平，为0.010mg/L。

田间种群：选取我国南方主要柑桔产区：四川(大英，安岳)、重庆万州、湖北秭归、广西(南宁，桂林)和云南玉溪共7个地区的田间柑桔全爪螨进行检测，具体地理位置及寄主信息见下表1。每个园区随机选取至少10棵树，采集多于5000头用于生物测定并同时采集500头以上雌成螨保存于无水乙醇中用于后续DNA的提取。对敏感品系和前述7个田间种群进行生物测定，结果如表2所示，相对于室内敏感品系，南宁、桂林和玉溪三个种群表现出高抗水平，其抗性倍数分别为；10203，1088.1和129倍。

表1

表2

实施例2田间快速检测柑桔全爪螨对阿维菌素的抗性

在实施例1得到从田间采集的不同地区田间柑桔全爪螨。我们又根据近似物种抗性突变位点所处的位置，对柑桔全爪螨进行抗性标记检测：

1)制备PCR扩增模板：将采集的柑桔全爪螨雌成螨(500头以上)置于1.5ml无核酶离心管中作为样本，并12000rpm，1min离心至管底，加入50μL STE Buffer(DNA提取液：100mM NaCl，10mM Tris-HCl，1mM EDTA)和2μLProteinase K(50mg/ml)，用研磨棒充分研磨螨体，37℃水浴孵育30min，震荡30s后，95℃水浴5min，12000rpm离心3min，所获得上清作为PCR扩增模板。

2)PCR扩增：PCR反应体系：12.5μL 2×PrimeSTAR Max Premix、8.5μL无核酸酶水、引物对的正、反向引物各1μL、2μL步骤1)制备的PCR扩增模板，共25μL。反应条件：98℃预变性2min，98℃变性10s，55℃退火15s、72℃延伸20s，30次循环、最后72℃延伸5min，12℃保存。

通过人工查找，在柑桔全爪螨基因组数据库中找到谷氨酸门控氯离子通道基因PcGluCl1和PcGluCl3。野生型柑桔全爪螨谷氨酸门控氯离子通道基因PcGluCl1的CDS序列为SEQ ID No:1所示，野生型PcGluCl3基因的CDS序列为SEQ ID No:2所示。

反应体系中所用引物对是基于柑桔全爪螨谷氨酸门控氯离子通道基因PcGluCl1和PcGluCl3设计的，引物对为Pc_GluCl1_F/Pc_GluCl1_R，或者Pc_GluCl3_F/Pc_GluCl3_R，引物序列如下：

Pc_GluCl1_F：5’-TATGTTGGTCATCGTCTCTTG-3’(SEQ ID No:3)，

Pc_GluCl1_R：5’-CTTTGTTTACCCGCTTTAAC-3’(SEQ ID No:4)；

Pc_GluCl3_F：5’-TTGTTATCGTCTCATGGGTT-3’(SEQ ID No:5)，

Pc_GluCl3_R：5’-GTGTTCCTGGTGTCGTTTAC-3’(SEQ ID No:6)。

3)凝胶电泳：吸取少量PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测。

结果如图1所示，泳道出现目的条带：具有PcGluCl1(261bp)条带和PcGluCl3(269bp)条带，从左至右泳道依次为：安岳、大英、桂林、南宁、万州、玉溪和秭归。

4)PCR产物测序及突变分析：将剩余PCR产物送华大基因公司进行测序，分析测序结果，对比分析如图2、3所示，在玉溪、南宁和桂林三个柑桔全爪螨阿维菌素抗性种群中出现与抗性相关的位点突变，PcGluCl1氨基酸序列检测到314-G突变为E，PcGluCl3氨基酸序列检测到310-G突变为R。PCR产物经过测序得到：编码PcGluCl1_G314E突变的基因序列如SEQ ID No:7所示，编码PcGluCl3_G310R突变的基因序列如SEQ ID No:8所示。

5)重复步骤1)至步骤3)，将获得的PCR产物用NanoDrop One微量核酸浓度检测仪(ThermoFisher)测浓度，随后将不同地区的相同基因的PCR产物等量混合，送至上海凌恩生物公司进行扩增子测序，根据其反馈结果文件分析该位点突变及计算相应突变频率。

本实施例中，通过PCR扩增，可以将目的DNA片段进行富集。扩增之前，将特异Barcode(每个地区对应一个Barcode，如表1中所示)插入到每条引物的5’端，则各地区样本的PCR产物可获得特异性的测序接头，可直接将各PCR产物进行混池测序并构建混合文库。通过特异性Barcode筛分不同地区的扩增片段，比对基因组序列，统计分析特定位置的突变及突变比例。

采用TruSeq^TMNano DNA LT Sample Prep Kit构建文库，使用软件trimmomatic(http://www.usadellab.org/cms/uploads/supplementary/Trimmomatic)去除接头序列Barcode、低质量读段、N率较高序列及长度过短序列。根据表1中的barcode区分不同地理种群的数据(Seqtk_demultiplex)，使用flash软件合并双端数据(最小：10bp重叠，最大100bp重叠)。参考柑桔全爪螨基因组，使用bwa比对参考基因组，筛选获得能比对上基因组的GluCl基因的片段序列，并用FASTX-toolkit软件对获得的片段序列进行聚类并过滤掉tagdep<10的序列，得到样品的单倍型信息，在ClustalO软件中分析位点突变及不同的突变比例，结果见表3。在玉溪和南宁种群中G314E的突变频率分别为12.1％和49％，在桂林和南宁两个种群中G310R的突变频率分别为97.6％和54.4％，而在其余种群未发现相应突变。

表3

序列表

<110> 西南大学

<120> 柑桔全爪螨对阿维菌素抗性的分子标记及其应用和检测方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaatgatt tactaacaat tatattctcg tacattttaa ttgctgcttt ttcaataaca 60

tcagtaagag gttcggccag ttttcgacag gctgagaaaa agattctcga taaaataatc 120

ggcaaaggag tttacgatcc aaggataaga ccttcggggg caaatgccac attcgacggt 180

gatgaacctt gcatagttaa agtgaatata ttcatcagaa gtatatctcg aatcgatgat 240

gttacaatgg aatatgctac tcagataaca ttcagagagg aatggagaga cagtcgactt 300

gtattcgatg acatgggagg aaggattcga ttcttggttc taactgaccc agagaaatta 360

tggaaacccg atttgttttt ttccaatgag aaatatggtc atttccatga tattatcatg 420

cctaatgttt tattaagaat atttcccaat ggcgatatcc tctattccat tcgtatctct 480

ttaaacctct tctgtccaat ggaccttaaa tattttccat tagatataca aaattgttcc 540

attcgaatgg ccagttatgg ttatacaacc gaggatttgg ttttcctgtg gagagccggt 600

gatccagttc agatcaccaa gtcacttcat cttccaagat ttaccttgat gaaatatctg 660

accagttatt gtacaagtaa aacaaatact ggggaatata gttgcctcaa agtggaatta 720

gtttttaaac gtgaatttag ttactatcta ttcttaatct atgttccctg ttgtatgttg 780

gtcatcgtct cttgggtctc tttttggatt gacccaaact ctgccgctgc tcgagtcctt 840

ctcggtgtaa catctttact cacaatgtcc cgacaaatct ctggtattaa cgcttctcta 900

ccaccggtca gttataccaa agcggtggat gtttggacag gatgttgttt aatctttgtc 960

tttggtgctc tcattgaatt tgcgatagta aattatgttt ctcgaactga tgccgttaaa 1020

gcgggtaaac aaaggctacg tcggaatcag gggattgtcg gtgctcgaaa aaagtttgac 1080

acagctaaag attcgggtat tgaatcgtcc gatgttgaag atggtcccat tgggtatgct 1140

aaagctctag ggtcaactaa attgccccga aaaaggccac cgaaaggaaa tttcttctca 1200

agttggttat caagattcac gacaagatcc aagaaaatcg atgtcacctc acgaattgtg 1260

ttcccatttc tatttgccat tttcaatgcc ttttattgga caaagtatct tctcagagat 1320

gagctaatgg gattatga 1338

<210> 2

<211> 1596

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgttgtgtt tacctgcacc aaagtgtgag ttcatcatct acatgtgggt ctatttttcc 60

gattttttta tcattccctg gcttcttaac cttcccttca gctcagcgtc cgtaagcttc 120

cgagagcaag agaaaaagat tctcgattca atcatcggtc agggtgctta cgatagacgc 180

atcagaccct ctgggcaaaa tgcaaccgcc gatggagatg gaccctgtat agtttcaatt 240

aatatttatc ttcgaagtat aagtaaaata agtgatctag atatggaata ttctgtacaa 300

ataactttca gggaggaatg gaaagactct cgtcttcaat atcgagatcc aagtgaaaaa 360

attcgctatt tgaccttaac ggatcccgat cgaatttgga aacccgatgt tttctttacc 420

aatgaaaaag aaggtcactt tcataacatc ataatgccca atgttgtcgt taatattatc 480

ctgccaatga accttaaata ttatccattg gataagcaaa attgttatat caaaatggcc 540

agttatggct acacaacaga ggatttggtt ttcgtttgga aaaaaactga tccagttcaa 600

gttactaagc aacttcatct tccgacattc gctttatctg attatattac cgaatattgt 660

acttcccgaa caaacacagg tgaatatagt tgtgtccaag taaagttaat ttttcgccgt 720

gaatttagtt actatttgtt tcaaatctat attccctgta taatgcttgt tatcgtctca 780

tgggtttcat tctggttaga cccgaatgct attcccgccc gggttagtct tggtgttacc 840

actttactca caatggcaac ccaaatatcc ggtattaatg cctcacttcc gccagtcagt 900

tacattaaag caattgatgt ttggaccgga gtttgccttt tctttgtttt tggtgccctc 960

cttgagtttg cccttgtaaa ttatgcttct cgaagtgatg cccaccgggc agcacgtaaa 1020

cgacaccagg aacaccaaca gcaacaagtt caacaagtat tagggggagg aggtgctggt 1080

ggtggtggtc ttggtgtggg aaccggtgga tttggtaatc ctggtggtat tggaggtggt 1140

ggtggtttgg gacctacagg atttggtatg gctgctggtt tccctccacc tccacccaaa 1200

tgggattcag ccatgggttg ggaaccacat caaccacttc caccccaccc tggatcaatg 1260

gagcctcaac ccaccaaatg ggaggctcga gttgacatga aaccaagagg tttccaatat 1320

tcatctgata atttccattc atcaagagca tcttatgtaa tgaaaccagt acttcgtgga 1380

ccggccccat cgccgaaccc gccggtgtcc agtaataaat tccgtcaagt ggaagttcgc 1440

actgcccctt ataatcagaa ctttttatct cgttggttct cagcgtttca aactcgatcc 1500

aaacgtattg atgttttagc acgaatttta tttcctctaa tgttcagtct gttcaatgtc 1560

gtttattgga taacttatgt cgtgatattg ggctaa 1596

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tatgttggtc atcgtctctt g 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctttgtttac ccgctttaac 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttgttatcgt ctcatgggtt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtgttcctgg tgtcgtttac 20

<210> 7

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgaatgatt tactaacaat tatattctcg tacattttaa ttgctgcttt ttcaataaca 60

tcagtaagag gttcggccag ttttcgacag gctgagaaaa agattctcga taaaataatc 120

ggcaaaggag tttacgatcc aaggataaga ccttcggggg caaatgccac attcgacggt 180

gatgaacctt gcatagttaa agtgaatata ttcatcagaa gtatatctcg aatcgatgat 240

gttacaatgg aatatgctac tcagataaca ttcagagagg aatggagaga cagtcgactt 300

gtattcgatg acatgggagg aaggattcga ttcttggttc taactgaccc agagaaatta 360

tggaaacccg atttgttttt ttccaatgag aaatatggtc atttccatga tattatcatg 420

cctaatgttt tattaagaat atttcccaat ggcgatatcc tctattccat tcgtatctct 480

ttaaacctct tctgtccaat ggaccttaaa tattttccat tagatataca aaattgttcc 540

attcgaatgg ccagttatgg ttatacaacc gaggatttgg ttttcctgtg gagagccggt 600

gatccagttc agatcaccaa gtcacttcat cttccaagat ttaccttgat gaaatatctg 660

accagttatt gtacaagtaa aacaaatact ggggaatata gttgcctcaa agtggaatta 720

gtttttaaac gtgaatttag ttactatcta ttcttaatct atgttccctg ttgtatgttg 780

gtcatcgtct cttgggtctc tttttggatt gacccaaact ctgccgctgc tcgagtcctt 840

ctcggtgtaa catctttact cacaatgtcc cgacaaatct ctggtattaa cgcttctcta 900

ccaccggtca gttataccaa agcggtggat gtttggacag aatgttgttt aatctttgtc 960

tttggtgctc tcattgaatt tgcgatagta aattatgttt ctcgaactga tgccgttaaa 1020

gcgggtaaac aaaggctacg tcggaatcag gggattgtcg gtgctcgaaa aaagtttgac 1080

acagctaaag attcgggtat tgaatcgtcc gatgttgaag atggtcccat tgggtatgct 1140

aaagctctag ggtcaactaa attgccccga aaaaggccac cgaaaggaaa tttcttctca 1200

agttggttat caagattcac gacaagatcc aagaaaatcg atgtcacctc acgaattgtg 1260

ttcccatttc tatttgccat tttcaatgcc ttttattgga caaagtatct tctcagagat 1320

gagctaatgg gattatga 1338

<210> 8

<211> 1596

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgttgtgtt tacctgcacc aaagtgtgag ttcatcatct acatgtgggt ctatttttcc 60

gattttttta tcattccctg gcttcttaac cttcccttca gctcagcgtc cgtaagcttc 120

cgagagcaag agaaaaagat tctcgattca atcatcggtc agggtgctta cgatagacgc 180

atcagaccct ctgggcaaaa tgcaaccgcc gatggagatg gaccctgtat agtttcaatt 240

aatatttatc ttcgaagtat aagtaaaata agtgatctag atatggaata ttctgtacaa 300

ataactttca gggaggaatg gaaagactct cgtcttcaat atcgagatcc aagtgaaaaa 360

attcgctatt tgaccttaac ggatcccgat cgaatttgga aacccgatgt tttctttacc 420

aatgaaaaag aaggtcactt tcataacatc ataatgccca atgttgtcgt taatattatc 480

ctgccaatga accttaaata ttatccattg gataagcaaa attgttatat caaaatggcc 540

agttatggct acacaacaga ggatttggtt ttcgtttgga aaaaaactga tccagttcaa 600

gttactaagc aacttcatct tccgacattc gctttatctg attatattac cgaatattgt 660

acttcccgaa caaacacagg tgaatatagt tgtgtccaag taaagttaat ttttcgccgt 720

gaatttagtt actatttgtt tcaaatctat attccctgta taatgcttgt tatcgtctca 780

tgggtttcat tctggttaga cccgaatgct attcccgccc gggttagtct tggtgttacc 840

actttactca caatggcaac ccaaatatcc ggtattaatg cctcacttcc gccagtcagt 900

tacattaaag caattgatgt ttggacccga gtttgccttt tctttgtttt tggtgccctc 960

cttgagtttg cccttgtaaa ttatgcttct cgaagtgatg cccaccgggc agcacgtaaa 1020

cgacaccagg aacaccaaca gcaacaagtt caacaagtat tagggggagg aggtgctggt 1080

ggtggtggtc ttggtgtggg aaccggtgga tttggtaatc ctggtggtat tggaggtggt 1140

ggtggtttgg gacctacagg atttggtatg gctgctggtt tccctccacc tccacccaaa 1200

tgggattcag ccatgggttg ggaaccacat caaccacttc caccccaccc tggatcaatg 1260

gagcctcaac ccaccaaatg ggaggctcga gttgacatga aaccaagagg tttccaatat 1320

tcatctgata atttccattc atcaagagca tcttatgtaa tgaaaccagt acttcgtgga 1380

ccggccccat cgccgaaccc gccggtgtcc agtaataaat tccgtcaagt ggaagttcgc 1440

actgcccctt ataatcagaa ctttttatct cgttggttct cagcgtttca aactcgatcc 1500

aaacgtattg atgttttagc acgaatttta tttcctctaa tgttcagtct gttcaatgtc 1560

gtttattgga taacttatgt cgtgatattg ggctaa 1596

Claims

1.一种柑桔全爪螨对阿维菌素抗性的分子标记，其特征在于：所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No:7或者SEQ ID No:8所示。

2.权利要求1所述的分子标记在柑桔全爪螨对阿维菌素敏感种群和抗性种群分类中的应用。

3.一种扩增权利要求1所述分子标记的特异性引物对，其特征在于：所述引物对为Pc_GluCl1_F/Pc_GluCl1_R，或者Pc_GluCl3_F/Pc_GluCl3_R，引物序列如下：

Pc_GluCl1_F：5’-TATGTTGGTCATCGTCTCTTG-3’，

Pc_GluCl1_R：5’-CTTTGTTTACCCGCTTTAAC-3’；

Pc_GluCl3_F：5’-TTGTTATCGTCTCATGGGTT-3’，

Pc_GluCl3_R：5’-GTGTTCCTGGTGTCGTTTAC-3’。

4.一种柑桔全爪螨对阿维菌素抗性的分子标记的检测方法，其特征在于：先提取待测柑桔全爪螨的总DNA，以总DNA为模板用权利要求3中的特异性引物对进行PCR扩增，得到扩增产物片段，分析PCR扩增产物是否含有权利要求1所述的分子标记，即可判断待测柑桔全爪螨是对阿维菌素的敏感种群还是抗性种群。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：分析PCR扩增产物是否含有权利要求1所述的分子标记的具体方法为:

将PCR扩增产物进行测序，与权利要求1中的柑桔全爪螨对阿维菌素抗性的分子标记进行序列比对。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：提取待测柑桔全爪螨的总DNA的方法为：将待测柑桔全爪螨放入离心管中，加入STE Buffer和proteinase K，用研磨棒充分研磨螨体，37℃水浴孵育30min，震荡30s后，95℃水浴5min，离心，所获得上清作为PCR扩增模板。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为12.5μL 2×PrimeSTAR Max Premix、引物对的正、反向引物各1μL、2μL DNA模板，补充ddH₂O至25μL。

8.根据权利要求4或7所述的检测方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应条件为：98℃预变性2min；98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸20s、30次循环；最后72℃延伸5min。