CN104032002B - 植物寄生线虫核糖体its区通用扩增引物新组合及其使用方法 - Google Patents

植物寄生线虫核糖体its区通用扩增引物新组合及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了2对植物寄生线虫核糖体ITS区通用扩增引物新组合及其用于PCR扩增的使用方法，所述方法的关键创新点为新的引物组合用于植物寄生线虫ITS区PCR扩增后，新建立的PCR扩增体系能够扩增的植物线虫种类更加广谱，扩增效率和成功率显著提高，有效地解决了以前植物线虫鉴定中ITS区扩增存在的诸多问题。利用本发明中的方法扩增获得的PCR扩增产物满足线虫DNA条码鉴定、RFLP酶切鉴定等分子检测技术的需求，可在我国口岸及农林部门检疫鉴定中推广应用。

Description

植物寄生线虫核糖体ITS区通用扩增引物新组合及其使用方法
技术领域
本发明涉及植物线虫检疫鉴定领域，提供了2对植物寄生线虫核糖体ITS区通用扩增引物新组合及其使用方法，具体而言，所述方法通过使用新的ITS区PCR扩增通用引物组合，显著提高了所建立的PCR体系的扩增效率和成功率，能够扩增的植物寄生线虫种类也更加广谱，有效地解决了以前植物寄生线虫ITS区扩增中存在的诸多问题，适用于口岸及农林业相关检疫鉴定实验室应用。
背景技术
对植物线虫进行准确鉴定是研究线虫生物学习性及其发病规律的重要基础，对进一步制定有效的防治措施具有重要意义。传统的植物线虫鉴定方法主要依赖于形态特征和形态测量值，要求鉴定者要有极为丰富的经验和技巧。基于DNA的分子鉴定方法对鉴定者的要求相对较低，是形态鉴定的重要辅助手段，目前在线虫的分类鉴定中应用广泛。
在植物寄生线虫分子鉴定中，核糖体内部转录间隔区(ITS)是重要的分子标记之一。自上世纪90年代初以来，以核糖体ITS区核酸序列为分子标记对植物寄生线虫进行分类鉴定的研究有大量的文献报道(Vrain等，1992；Ferris等，1993；Hoyer等，1998；Waeyenberge等，2000；Subbotin等，2005；Burgermeister等，2009；DeLuca等，2010)。分析发现，所有这些研究所使用的引物主要有3对，分别为pxb101和pxb481(Vrain等，1992)、F194和F195(Ferris等，1993)、Tw81和AB28(Subbotin等，2005)，而引物PRATTW81则是TW81略微修改获得(DeLuca等，2010)。
虽然上述引物通过轮换使用在很大程度上能够解决大部分植物寄生线虫的ITS区扩增问题，但扩增效率和成功率不高是很多线虫学者面临的问题，尤其是对单条线虫进行扩增时更是如此。同时，研究发现有的引物对扩增的线虫种类具有一定的偏好性，比如TW81和AB28在扩增短体线虫时效果较好，但在扩增伞滑刃线虫和滑刃线虫时则完全失败，等等。
本研究在以前学者研究的基础上，对上述所报道的3对加1条引物进行重组，获得了12对引物组合，然后使用这12对引物分别对多种植物寄生线虫的ITS区进行扩增实验，以筛选出高效、稳定、广谱的植物寄生线虫ITS区通用扩增引物，为植物寄生线虫的检疫鉴定提供部分的技术支持。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中植物寄生线虫核糖体ITS区扩增存在的效率低、成功率低、广谱性低等缺陷，提供2对植物寄生线虫核糖体ITS区PCR扩增通用的引物组合及其使用方法，所述引物组合和使用方法的步骤如下：
所述2对引物组合序列为：
引物组合1：
上游引物PXB101：5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′
下游引物AB28：5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′
引物组合2：
上游引物F194：5′-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3′
下游引物AB28：5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′
所述2对引物组合使用方法包括如下步骤：
步骤一、线虫DNA的提取：
首先用双蒸水将线虫清洗干净，然后挑取单条线虫放入含8μLddH2O的PCR管中，再反复冻融2次后，加入2μL裂解液，最后56℃保温1h，95℃加热10min即可。经所述步骤提取获得的上清液可用于后续的分子实验；所述冻融为液氮处理1min，65℃水浴2min；所述裂解液为10×PCRBuffer、双蒸水与20mg/mL蛋白酶K的混合液，三者的体积比为10∶9∶1；
步骤二、核糖体ITS区的PCR扩增：
PCR扩增体系(25μL)：10×PCRBuffer(Mg2+)2.5μL，dNTP(2.5mmol/L)1μL，上游引物(10μmol/L)0.5μL，下游引物(10μmol/L)0.5μL，rTaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，模板DNA5μL，双蒸水15.3μL；PCR反应条件：94℃预变性3min；40个循环反应：94℃变性40sec，55℃退火40sec，72℃延伸1.5min；最后72℃保温5min，使反应物充分延伸；
步骤三、PCR产物的电泳检测：
每个样品取3μL扩增产物，使用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，设置电压160V，电泳30min后将凝胶放入EB染液中染色15min，随后置于凝胶成像系统中观察并拍照。
优选地，本申请的2对引物新组合的使用方法中，步骤二中PCR反应条件要求退火温度为55℃。
所述双蒸水即为经过两次蒸馏的无菌水，其通常用于分子生物学实验。
所述裂解液中的10×PCRBuffer和20mg/mL的蛋白酶K均为TAKARA公司生产，商品编号分别为R001B和9033。
本申请的方法适用于多种植物线虫的核糖体ITS区扩增，特别地，适用于穿刺短体线虫(Pratylenchuspenetrans)、玻利维亚短体线虫(Pratylenchusbolivianus)、斯氏短体线虫(Pratylenchusscribneri)、朱顶红短体线虫(Pratylenchushippeastri)、松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)、拟松材线虫(B.mucronatus)、豆伞滑刃线虫(Bursaphelenchusdoui)、阿苏里伞滑刃线虫(Bursaphelenchusarthui)、水稻干尖线虫(Aphelenchoidesbesseyi)。
与现有技术相比，本发明的进步在于：新的引物组合使用后，植物寄生线虫ITS区PCR扩增体系能够扩增的植物线虫种类更加广谱，扩增效率和成功率显著提高，有效地解决了以前植物线虫鉴定中存在的ITS区扩增诸多问题。利用本发明中的方法扩增获得的PCR扩增产物满足线虫物种DNA条码鉴定、RFLP酶切鉴定等分子检测技术的需求，可在我国口岸及农林部门检疫鉴定中推广应用。
附图说明
图1使用12对引物组合对穿刺短体线虫(Pp1301)ITS区进行PCR扩增检测结果；
图2使用12对引物组合对玻利维亚短体线虫(Pb1301)ITS区进行PCR扩增检测结果；
图3使用12对引物组合对斯氏短体线虫(Ps1301)ITS区进行PCR扩增检测结果；
图4使用12对引物组合对朱顶红短体线虫(Ph1201)ITS区进行PCR扩增检测结果；
图5使用12对引物组合对松材线虫(Bx1308)ITS区进行PCR扩增检测结果；
图6使用12对引物组合对拟松材线虫(Bm1303)ITS区进行PCR扩增检测结果；
图7使用12对引物组合对豆伞滑线虫(Bd1303)ITS区进行PCR扩增检测结果；
图8使用12对引物组合对阿苏里伞滑刃线虫(Ba1301)ITS区进行PCR扩增检测结果；
图9使用12对引物组合对阿联酋伞滑线虫(Bs1201)ITS区进行PCR扩增检测结果；
图10使用12对引物组合美国伞滑刃线虫(Bs1301)ITS区进行PCR扩增检测结果；
图11使用12对引物组合对水稻干尖线虫(NJAb120231)ITS区进行PCR扩增检测结果；
图中各字母含义如下：泳道1、2：引物组合PXB101和PXB481；泳道3、4：引物组合PRATTW81和PXB481；泳道5、6：引物组合TW81和PXB481；泳道7、8：引物组合F194和F195；泳道9、10：引物组合TW81和AB28；泳道11、12：引物组合PXB101和AB28；泳道13、14：引物组合F194和AB28；泳道15、16：引物组合TW81和F195；泳道17、18：引物组合PRATTW81和AB28；泳道19、20：引物组合PXB101和F195；泳道21、22：引物组合PRATTW811和F195；泳道23、24：引物组合F194和PXB481。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹举以下实施例，并配合附图详细说明如下：
标本来源
本实验测试了11个线虫群体，其中包括1个穿刺短体线虫群体，1个玻利维亚短体线虫群体，1个斯氏短体线虫群体，1个朱顶红短体线虫群体，1个松材线虫群体，1个拟松材线虫群体，1个豆伞滑刃线虫群体、1个阿苏里伞滑刃线虫群体，1个阿联酋伞滑刃线虫群体，1个美国伞滑刃线虫群体，1个水稻干尖线虫群体。详情见下表：
实施例1、使用12对引物组合对11个线虫群体的核糖体ITS区进行PCR扩增效果评价
单条线虫DNA提取：用双蒸水将线虫清洗干净，挑取单条线虫放入含8μLddH2O的PCR管中，反复冻融2次(液氮处理1min，65℃水浴2min)后，加入2μL裂解液(所述裂解液为10×PCRBuffer、双蒸水与20mg/mL蛋白酶K的混合液(体积比10∶9∶1)，10×PCRBuffer与20mg/mL蛋白酶K均购自TAKARA公司)，56℃保温1h，95℃加热10min，瞬时离心后上清液可用于后续的分子检测。
不同引物组合用于PCR扩增的效果评价：
1.所用引物组合
引物组合1(泳道11和12)：
PXB101：5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′：
AB28：5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′：
引物组合2(泳道13和14)：
F194：5′-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3′：
AB28：5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′：
引物组合3(泳道5和6)：
TW81：5′-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3′：
PXB481：5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′：
引物组合4(泳道7和8)：
F194：5′-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3′：
F195：5′-TCCTCCGCTAAATGATATG-3′：
引物组合5(泳道9和10)：
TW81：5′-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3′：
AB28：5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′：
引物组合6(泳道1和2)：
PXB101：5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′：
PXB481：5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′：
引物组合7(泳道3和4)：
PRATW81：5′-GTAGGTGAACCTGCTGCTG-3′：
PXB481(5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′)：
引物组合8(泳道15和16)：
TW81：5′-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3′：
F195：5′-TCCTCCGCTAAATGATATG-3′：
引物组合9(泳道17和18)：
PRATW81：5′-GTAGGTGAACCTGCTGCTG-3′：
AB28：5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′：
引物组合10(泳道19和20)：
PXB101：5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′：
F195：5′-TCCTCCGCTAAATGATATG-3′：
引物组合11(泳道21和22)：
PRATW81：5′-GTAGGTGAACCTGCTGCTG-3′：
F195(5′-TCCTCCGCTAAATGATATG-3′：
引物组合12(泳道23和24)：
F194：5′-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3′：
PXB481：5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′。
2.PCR扩增：
PCR扩增体系(25μL)：10×PCRBuffer(Mg2+)2.5μL，dNTP(2.5mmol/L)1μL，上游引物(10μmol/L)0.5μL，下游引物(10μmol/L)0.5μL，rTaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，模板DNA5μL，双蒸水15.3μL。
PCR反应条件：94℃预变性3min；40个循环反应：94℃变性40sec，55℃退火40sec，72℃延伸1.5min；最后72℃保温5min，使反应物充分延伸。
3.电泳检测
每个样品取3μL扩增产物，使用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，设置电压160V，电泳30min后将凝胶放入EB染液中染色15min，随后置于凝胶成像系统中观察并拍照。
4.不同引物组合的扩增效果
从PCR扩增结果来看(图1-11)，使用本发明的2对引物组合(泳道11、12：引物组合PXB101和AB28；泳道13、14：引物组合F194和AB28)建立的PCR扩增体系可对所有11个线虫群体的核糖体ITS区进行高效扩增，扩增成功率为100％。对穿刺短体来说，除了泳道11-14外，泳道7、8(引物组合F194和F195)、泳道9、10(引物组合TW81和AB28)、泳道15、16(引物组合TW81和F195)、泳道17、18(引物组合PRATTW81和AB28)的扩增效果较好，而其它泳道扩增结果为阴性，说明除了本发明的2对扩增引物(泳道11-14)外，还有4对引物组合可用于穿刺短体线虫ITS区的PCR扩增。就玻利维亚短体线虫(图2)、斯氏短体线虫(图3)、朱顶红短体线虫(图4)而言，除了泳道23、24(引物组合F194和PXB481)以外，其它引物组合均能较好的扩增这3种线虫的ITS序列；而对于松材线虫(图5)、拟松材线虫(图6)、豆伞滑刃线虫(图7)、阿苏里伞滑刃线虫(图8)、阿联酋伞滑刃线虫(图9)、美国伞滑刃线虫(图10)来说，除了本发明的2对引物(泳道11-14)外，泳道17、18(引物组合PRATTW81和AB28)、泳道19、20(引物组合PXB101和F195)扩增效果较好，泳道9、10(引物组合TW81和AB28)对所有线虫材料的扩增结果为阴性，泳道15、16(引物组合TW81和F195)对松材线虫(图5)、拟松材线虫(图6)、豆伞滑刃线虫(图7)、阿苏里伞滑刃线虫(图8)、阿联酋伞滑刃线虫(图9)的扩增结果为阴性，说明引物组合TW81和AB28与引物组合TW81和F195不适合伞滑刃线虫的ITS区扩增；对于水稻干尖线虫而言，除了本发明的2对引物组合(泳道11-14)外，泳道9、10(引物组合TW81和AB28)、泳道15、16(引物组合TW81和F195)、泳道19、20(引物组合PXB101和F195)、泳道21、22(引物组合PRATTW811和F195)扩增效果较好，而泳道1、2(引物组合PXB101和PXB481)、泳道3、4(引物组合PRATTW81和PXB481)、泳道5、6(引物组合TW81和PXB481)、泳道17、18(引物组合PRATTW81和AB28)、泳道23、24(引物组合F194和PXB481)扩增结果为阴性，泳道7、8(引物组合F194和F195)只有有较弱的扩增条带。
5.结论
综合以上12对引物组合对3类11个线虫群体的扩增结果，发现不同引物组合的扩增效率以及所能扩增的线虫种类存在显著的差异，除了引物组合F194和F195(泳道7、8)、引物组合PXB101和AB28(泳道11、12)、引物组合F194和AB28(泳道13、14)这3对引物能够扩增所有供试的线虫材料外，其它9对引物组合在扩增中均存在一定的偏好性，而引物组合F194和F195(泳道7、8)对伞滑刃线虫(图5-10)和滑刃线虫(图11)的扩增效率较低，说明本发明的2对引物组合(PXB101和AB28、F194和AB28)是植物寄生线虫核糖体ITS区扩增的最佳引物组合。
本发明的植物寄生线虫核糖体ITS区通用扩增引物新组合及其使用方法已经通过具体的实例进行了描述，本领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。

Claims (2)

1.一种植物寄生线虫核糖体ITS区通用扩增的引物组合，所述引物组合包括2对引物，其序列为：
引物组合1：
上游引物PXB101：5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′
下游引物AB28：5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′
引物组合2：
上游引物F194：5′-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3′
下游引物AB28：5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′。
2.根据权利要求1所述的引物组合的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、线虫DNA的提取：
首先用双蒸水将线虫清洗干净，然后挑取单条线虫放入含8μLddH2O的PCR管中，再反复冻融2次后，加入2μL裂解液，最后56℃保温1h，95℃加热10min即可；经所述步骤提取获得的上清液可用于后续的分子实验；所述冻融为液氮处理1min，65℃水浴2min；所述裂解液为10×PCRBuffer、双蒸水与20mg/mL蛋白酶K的混合液，三者的体积比为10：9：1；
步骤二、核糖体ITS区的PCR扩增：
PCR扩增体系，所述扩增体系为25μL：10×PCRBuffer2.5μL；dNTP1μL，所述dNTP为2.5mmol/L；上游引物0.5μL，所述上游引物为10μmol/L；下游引物0.5μL，所述下游引物为10μmol/L；rTaqDNA聚合酶0.2μL，所述聚合酶为5U/μL；模板DNA5μL，双蒸水15.3μL；PCR反应条件：94℃预变性3min；40个循环反应：94℃变性40sec，55℃退火40sec，72℃延伸1.5min；最后72℃保温5min，使反应物充分延伸；
步骤三、PCR产物的电泳检测：
每个样品取3μL扩增产物，使用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，设置电压160V，电泳30min后将凝胶放入EB染液中染色15min，随后置于凝胶成像系统中观察并拍照；所述步骤二中PCR反应条件要求退火温度为55℃；所述线虫为穿刺短体线虫(Pratylenchuspenetrans)、玻利维亚短体线虫(Pratylenchusbolivianus)、斯氏短体线虫(Pratylenchusscribneri)、朱顶红短体线虫(Pratylenchushippeastri)、松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)、拟松材线虫(B.mucronatus)、豆伞滑刃线虫(Bursaphelenchusdoui)、阿苏里伞滑刃线虫(Bursaphelenchusarthui)或水稻干尖线虫(Aphelenchoidesbesseyi)。
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CN1763193A (zh) * 2005-08-19 2006-04-26 中国农业科学院植物保护研究所 马铃薯腐烂茎线虫rDNA－ITS序列、特异性检测引物及一步双重PCR检测方法
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CN103602668A (zh) * 2013-11-29 2014-02-26 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 一种利用管内切虫来提取单条植物线虫基因组dna的方法

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