CN103320512B - 一种草菇v14菌株分子特异性检测标记及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种草菇V14菌株分子特异性检测标记及其检测方法，特异性检测标记为：V14F：GAGCAACCGAACCTCAACAACAC；V14R：CGCCGTGTCCGTTCATACCAAGC。检测方法：将草菇V14菌株接种PDA平板培养基，32℃培养3-5d，刮取表面菌丝装入无菌离心管中，然后用改进的CTAB法提取基因组DNA，得到DNA；以上述提取的DNA为模板，特异性检测标记引物为扩增引物，进行PCR扩增，得PCR扩增产物，进行电泳检测。本发明方法与常规形态学检测、拮抗试验和出菇实验等方法相比，具有检测时间短，准确性高的优点。

Description

一种草菇V14菌株分子特异性检测标记及其检测方法
技术领域
本发明属于草菇菌株标记及检测领域，特别涉及一种草菇V14菌株分子特异性检测标记及其检测方法。
背景技术
草菇（Volvariella volvacea）栽培起源于中国，迄今已有300多年的栽培历史，在我国南方地区广泛栽培。草菇味道鲜美，不仅具有丰富的营养价值，而且还具有重要的医疗保健作用，深受广大消费者喜爱。草菇作为一种高温栽培食用菌，同其它食用菌相比，其显著的特点是生长速度极快，从播种到收获一般只需要2周的时间，其年产量在我国食用菌产业中一直位居前十位。
草菇菌丝不具有锁状联合，在经典遗传学研究中，草菇是食用菌中唯一的被认定为属于初级同宗结合繁殖模式的担子菌，虽然草菇V23菌株已经完成全基因组测序，但是目前对草菇的遗传学研究特别是繁殖模式的研究仍旧存在着很多争议。这些研究尚未明确探明草菇有性繁殖的模式，基础理论研究的不足制约了草菇育种工作的开展，为草菇新品种的选育带来了很多困难。
面对这种情况，迫切需要加快草菇菌株鉴定技术的研究，开发更为有效的菌株鉴定方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种草菇V14菌株分子特异性检测标记及其检测方法，该方法与常规形态学检测、拮抗试验和出菇实验等方法相比，具有检测时间短，准确性高的有点；利用所获得的分子标记鉴别草菇V14菌株，有利于草菇育种工作的开展，从而加快草菇新品种的研发工作。
本发明的一种草菇V14菌株分子特异性检测标记，所述特异性检测标记为特异性引物，其中引物序列为：
V14F：GAGCAACCGAACCTCAACAACAC
V14R：CGCCGTGTCCGTTCATACCAAGC。
本发明的一种草菇V14菌株分子特异性检测方法，包括：
（1）将草菇V14菌株接种PDA平板培养基，32℃培养3-5d，刮取表面菌丝装入无菌离心管中，然后用改进的CTAB法提取基因组DNA，得到DNA；
改进的CTAB方法的操作步骤如下：
1.将收集的菌丝放入灭菌过的预冷研钵中研成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液（2%CTAB；1.4M NaCl；100mM Tris.Cl，pH8.0；20mM EDTA，pH8.0），转入2mL离心管中，65℃水浴1h；
2.混合液12000rpm，4℃离心10min，取上清液加入等体积的苯酚：氯仿(1∶1)混合液，轻轻混匀，静置15min；
3.混合液12000rpm，4℃离心10min，取上清液加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)混合液，轻轻混匀；
4.混合液12000rpm，4℃离心10min，取上清液移入新离心管中，加入等体积的-20℃预冷的异丙醇和0.1倍体积醋酸钠（3M,pH5.2），轻轻摇动，-20℃静置30min；
5.混合液12000rpm，4℃离心10min，弃上清液，沉淀用75%乙醇洗涤2-3次，4℃，12000rpm，离心10min，弃去乙醇，自然晾干5min，加入50μL无菌双蒸水，轻轻敲打至DNA沉淀溶解；
6.DNA溶液加入1μL RNase（10mg/mL），37℃水浴1h，去除RNA，DNA-20℃贮藏备用。
（2）以上述提取的DNA为模板，特异性检测标记引物为扩增引物，进行PCR扩增，得PCR扩增产物，进行电泳检测，其中特异性检测标记引物为V14F：GAGCAACCGAACCTCAACAACAC；V14R：CGCCGTGTCCGTTCATACCAAGC。
所述步骤（2）中PCR扩增体系为：总体系为25μL，其中10×Ex Taq buffer II(Mg2+Plus)2.5μL；dNTP各2.5mM2uL；5U/μL Ex Taq DNA酶0.25μL；10μmol/L特异性检测标记引物各0.5μL；模板DNA浓度50ng/μL，0.5μL；ddH2O18.75μL。
所述PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃补平10min。
所述步骤（2）中电泳检测方法为：取PCR扩增产物6μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上拍照。
原理：
针对草菇V14菌株交配型位点的DNA序列，设计特异性引物，建立以交配型基因为分子标记的快速鉴别V14菌株分子生物学方法。采用特异性引物对草菇菌株进行PCR扩增，草菇V14菌株扩增出分子量约为250bp的条带，其它草菇菌株不能扩增出特异条带。
有益效果
（1）本发明检测方法与常规形态学检测、拮抗试验和出菇试验等方法相比，具有检测时间短，准确性高的优点；
（2）本发明利用所获得的分子标记鉴别草菇V14菌株，有利于草菇育种工作的开展，从而加快草菇新品种的研发工作。
附图说明
图1为草菇菌株特异条带扩增图，其中M:2000D Marker；1:草菇菌株V23；2:草菇菌株V14；3:草菇菌株3564；4.草菇菌株3565；5:草菇菌株3568；6:草菇菌株3570；7:草菇菌株V28；8:草菇菌株V238；9:草菇菌株丛生；9:草菇菌株V5。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
基因组DNA的提取
草菇V14菌株接种PDA平板培养基，32℃培养5d，刮取表面菌丝装入无菌离心管中，-70℃冰箱保存备用。用改进的CTAB法提取基因组DNA，DNA-20℃冰箱贮藏备用。
其中CTAB方法的操作步骤如下：
1.将收集的菌丝放入灭菌过的预冷研钵中研成粉末，加入65℃预热的2×CTAB抽提液（2%CTAB；1.4M NaCl；100mM Tris.Cl，pH8.0；20mM EDTA，pH8.0），转入2mL离心管中，65℃水浴1h；
2.混合液12000rpm，4℃离心10min，取上清液加入等体积的苯酚：氯仿(1∶1)混合液，轻轻混匀，静置15min；
3.混合液12000rpm，4℃离心10min，取上清液加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)混合液，轻轻混匀；
4.混合液12000rpm，4℃离心10min，取上清液移入新离心管中，加入等体积的-20℃预冷的异丙醇和0.1倍体积醋酸钠（3M,pH5.2），轻轻摇动，-20℃静置30min；
5.混合液12000rpm，4℃离心10min，弃上清液，沉淀用75%乙醇洗涤2-3次，4℃，12000rpm，离心10min，弃去乙醇，自然晾干5min，加入50μL无菌双蒸水，轻轻敲打至DNA沉淀溶解；
6.DNA溶液加入1μL RNase（10mg/mL），37℃水浴1h，去除RNA，DNA-20℃贮藏备用。
引物序列
V14F：GAGCAACCGAACCTCAACAACAC
V14R：CGCCGTGTCCGTTCATACCAAGC
PCR反应体系及条件
扩增体系总体积为：25μL，10×Ex Taq PCR buffer II(Mg2+Plus)2.5μL，dNTP（各2.5mM）2uL，5U/μL TaKaRa Ex Taq DNA酶0.25μL，10μmol/L特异性检测标记引物各0.5μL，模板DNA（浓度50ng/μL）0.5μL，ddH2O18.75μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃补平10min。
电泳检测
取上述PCR扩增产物6μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上拍照。
如图一所示：采用草菇V14菌株特异性引物对包括V14在内的10株草菇菌株进行PCR扩增，只有草菇V14菌株能扩增出分子量约为250bp的特异条带，其它草菇菌株不能扩增出特异条带。
250bp的特异条带：
GAGCAACCGAACCTCAACAACACCCTTCAAAGCCATTGCCACTTGAGCTTCCTCCGCTCCTAGACCTCCGTGACCATACTACTGGCCTCAGCTTATCAGAAGAAAGGGTTAATGCCCTGAGCGCGACCTTTCGTTCAAAGGAGGAAGAATTACGGAAAGTGATACAGTCTGCAACTTCCTCTGCTCTCACAAGTCGGCCACATGACGTGCAGCAAACCATCCGCAGTTCTAGCGTTGCTTGGTATGAACGGACACGGCG。

Claims (5)

1.一种草菇V14菌株分子特异性检测标记引物，其特征在于：所述特异性检测标记引物的序列为： 
V14F：GAGCAACCGAACCTCAACAACAC 
V14R：CGCCGTGTCCGTTCATACCAAGC。 
2.一种草菇V14菌株分子特异性检测方法，包括： 
(1)将草菇V14菌株接种PDA平板培养基，32℃培养3-5d，刮取表面菌丝装入无菌离心管中，然后用改进的CTAB法提取基因组DNA，得到DNA； 
(2)以上述提取的DNA为模板，特异性检测标记引物为扩增引物，进行PCR扩增，得PCR扩增产物，进行电泳检测，其中特异性检测标记引物为V14F：GAGCAACCGAACCTCAACAACAC；V14R：CGCCGTGTCCGTTCATACCAAGC。 
3.根据权利要求2所述的一种草菇V14菌株分子特异性检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR扩增体系为：总体系为25μL，其中含有Mg2+的10×Ex Taq buffer II 2.5μL；dNTP各2.5mM 2μL；5U/μL Ex Taq DNA酶0.25μL；10μmol/L特异性检测标记引物各0.5μL；模板DNA浓度50ng/μL，0.5μL；ddH2O 18.75μL。 
4.根据权利要求2或3所述的一种草菇V14菌株分子特异性检测方法，其特征在于：所述PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃补平10min。 
5.根据权利要求2所述的一种草菇V14菌株分子特异性检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中电泳检测方法为：取PCR扩增产物6μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上拍照。 
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草菇交配型A因子相关联的分子标记的获得及其在孢子后代中的分布初探;陈明杰等;《中国菌物学会第五届会员代表大会暨2011年学术年会论文摘要集》;20111231;摘要全文 *

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