CN105256026B - 一种快速鉴定野生草菇Vn单孢分离株同核体与异核体的方法 - Google Patents

一种快速鉴定野生草菇Vn单孢分离株同核体与异核体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种快速鉴定野生草菇Vn单孢分离株同核体与异核体的方法，包括：(1)野生草菇Vn菌株孢子的收集；(2)单孢分离株的获取；(3)单孢分离株同核体与异核体的鉴定。本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验等方法相比，具有操作简便、检测时间短、准确性高等优点，可以用于草菇杂交工作中亲本菌株的同核体与异核体判断，从而大幅度提高草菇育种效率，加快草菇新品种的研发，具有良好的应用前景。

Description

一种快速鉴定野生草菇Vn单孢分离株同核体与异核体的方法
技术领域
本发明属于草菇菌株标记及检测领域，特别涉及一种快速鉴定野生草菇Vn单孢分离株同核体与异核体的方法。
背景技术
草菇(Volvariella volvacea(Bull ex Fr.)Sing)又名稻草菇、中国菇，属担子菌纲，伞菌目，光柄菇科，小包脚菇属。草菇味道鲜美，营养丰富，鲜品中含蛋白质2.66％，脂肪2.24％，还原糖1.66％，转化糖0.95％，灰分0.91％。在草菇蛋白质中含有18种氨基酸，包含人体不能够合成的8种必需氨基酸。除食用价值外，草菇还具有提高人体免疫力、抑制癌细胞生长、解毒等功效。在草菇栽培出菇中，完全使用天然原料(如稻草、玉米芯、棉籽壳等)，符合现代人对绿色食品的要求。因此草菇一直深受人们的喜爱，是我国传统的出口创汇产品，远销至美国、加拿大、英国、日本、新加坡、马来西亚等国家和地区。
由于草菇被认为是一种初级同宗结合的真菌，其菌丝细胞多核且无锁状联合，使得育种者无法从形态上区分同核体与异核体，导致草菇遗传育种研究进展十分缓慢，只能借助传统的驯化、组织分离、孢子分离等自然选择方法育种，造成草菇生产用种单一，严重阻碍了产业的快速发展。面对这种情况，迫切需要开发一种快速鉴定草菇单孢分离株同核体与异核体的检测方法，从而大大缩短草菇杂交育种进程，加快草菇新品种的研发。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速鉴定野生草菇Vn单孢分离株同核体与异核体的方法，该方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验等方法相比，具有操作简便、检测时间短、准确性高等优点；该方法可用于草菇杂交工作中亲本菌株同核体与异核体的判断，从而大幅度提高草菇育种效率，促进草菇新品种的研发。
本发明的一种快速鉴定野生草菇Vn单孢分离株同核体与异核体的方法，包括：
(1)采用常规方法进行栽培出菇，待草菇Vn菌株的子实体进入成熟期后，将子实体置于孢子收集器中，孢子收集器置于30-32℃培养箱中收集Vn菌株的孢子；
(2)挑取收集到的孢子，用无菌水稀释，血球计数板计数，然后进行梯度稀释，在加有氨苄青霉素的PDA平板上涂布，置于30-32℃培养箱中培养；待孢子刚萌发时，挑取单个菌落于新的PDA平板上培养，获得Vn单孢分离株；
(3)提取Vn单孢分离株的基因组DNA，然后以特异性检测标记引物为扩增引物，进行PCR扩增，所得PCR产物经电泳检测后，即可区分Vn单孢分离株为同核体或异核体；其中，特异性检测标记引物为A3F：GGAATGGTGCCCGACACGATACAG；
A3R：GGGTGTTGTTGAGGTTCGGTTGC；
A4F：TTGGTGCGGTCATCAACATTAG；
A4R：GTGAGCGGGTGATGTTGACGAT。
所述步骤(1)中的孢子收集器内放有灭菌好的滤纸。
所述步骤(3)中的PCR扩增反应体系为：总体积25μL，12.5μL扩增混合液，待扩增基因特异性引物对各0.5μL，50ng/μL DNA模板0.5μL，ddH2O 11μL(选用北京天恩泽基因科技有限公司的即用型PCR试剂盒)。
所述步骤(3)中的PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃补平10min。
所述步骤(3)中的电泳检测具体为：将PCR扩增产物与等体积的6×溴酚蓝上样缓冲液充分混匀，取5μL混合液在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳；电压设为100V，电泳时间为0.5h，待电泳结束后使用EB染色，并在紫外凝胶成像系统上进行拍照。
所述步骤(3)中的区分同核体或异核体的标准为：同核体扩增出其中一条条带，异核体扩增出两条条带。
本发明通过克隆野生草菇Vn菌株的交配型基因序列，并分析序列的保守性，建立以交配型基因为分子标记的快速鉴定野生草菇Vn单孢分离株同核体与异核体的方法。A3F/A3R、A4F/A4R引物扩增出的DNA序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
有益效果
(1)本发明的鉴定方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验等方法相比，具有操作简便、检测时间短、准确性高等优点；
(2)利用本发明可以鉴定野生草菇Vn单孢分离菌株的同核体与异核体，应用于草菇单孢杂交工作中亲本的筛选，从而大大缩短育种周期，加快草菇新品种的研发。
附图说明
图1为野生草菇Vn单孢分离菌株为同核体，其中1、2、3单孢分离株为A3类型的同核体，4、5、6单孢分离株为A4类型的同核体；
图2为野生草菇Vn单孢分离菌株为异核体，其中1、2单孢分离株为A3/A4类型的异核体。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
野生草菇Vn菌株孢子的收集
制备野生草菇Vn菌株的栽培种，采用常规方法进行栽培出菇，待Vn菌株的子实体进入成熟期后，将子实体置于孢子收集器中，孢子收集器内放有灭菌好的滤纸，置于32℃恒温培养箱中收集Vn菌株的孢子。
草菇Vn菌株常规栽培出菇的操作步骤如下：
(1)将棉籽壳和生石灰按照95：5(W)的比例混匀，润湿后堆制发酵3d作为培养料；
(2)将发酵好的培养料移至实验菇房的床架上，巴氏灭菌9h，冷却至31℃接种Vn菌株；
(3)在草菇Vn菌株子实体生长期间，实验菇房的温度保持在30-32℃。
野生草菇Vn单孢分离株的获取
用灭菌的枪头挑取少量收集到的孢子，用无菌水稀释，血球计数板计数，并进行梯度稀释，在加有氨苄青霉素的PDA平板上涂布，置于32℃恒温培养箱中培养。待孢子刚萌发时，挑取单个菌落于新的PDA平板上培养，获得Vn的单孢分离株。
单孢分离株同核体的鉴定
提取Vn单孢分离株的基因组DNA，并以下述的特异性检测标记引物为扩增引物，引物的序列如下：
A3F：GGAATGGTGCCCGACACGATACAG；
A3R：GGGTGTTGTTGAGGTTCGGTTGC；
A4F：TTGGTGCGGTCATCAACATTAG；
A4R：GTGAGCGGGTGATGTTGACGAT。
进行PCR扩增，其中PCR扩增反应体系(25μL)：北京天恩泽基因科技有限公司的即用型PCR试剂盒扩增混合液12.5μL，待扩增特异性检测标记引物对各0.5μL，DNA模板(50ng/μL)0.5μL，ddH2O 11μL。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃补平10min。
将PCR扩增产物与等体积的6×溴酚蓝上样缓冲液充分混匀，取5μL混合液在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳；电压设为100V，电泳时间为0.5h，待电泳结束后使用EB染色，并在紫外凝胶成像系统上拍照。若凝胶图像上显示只扩增出其中一条条带，即可鉴定Vn的单孢分离株为同核体，如图1所示。
实施例2
野生草菇Vn菌株孢子的收集
制备野生草菇Vn菌株的栽培种，采用常规方法进行栽培出菇，待Vn菌株的子实体进入成熟期后，将子实体置于孢子收集器中，孢子收集器内放有灭菌好的滤纸，置于32℃恒温培养箱中收集Vn菌株的孢子。
草菇Vn菌株常规栽培出菇的操作步骤如下：
(1)将棉籽壳和生石灰按照95：5(W)的比例混匀，润湿后堆制发酵2d作为培养料；
(2)将发酵好的培养料移至实验菇房的床架上，巴氏灭菌10h，冷却至32℃接种Vn菌株；
(3)在草菇Vn菌株子实体生长期间，实验菇房的温度保持在30-32℃。
野生草菇Vn单孢分离株的获取
用灭菌的枪头挑取收集到的孢子少量，用无菌水稀释，血球计数板计数，并进行梯度稀释，在加有氨苄青霉素的PDA平板上涂布，置于32℃恒温培养箱中培养。待孢子刚萌发时，挑取单个菌落于新的PDA平板上培养，获得Vn的单孢分离株。
单孢分离株异核体的鉴定
提取Vn单孢分离株的基因组DNA，并以下述的特异性检测标记引物为扩增引物，引物的序列如下：
A3F：GGAATGGTGCCCGACACGATACAG；
A3R：GGGTGTTGTTGAGGTTCGGTTGC；
A4F：TTGGTGCGGTCATCAACATTAG；
A4R：GTGAGCGGGTGATGTTGACGAT。
进行PCR扩增，其中PCR扩增反应体系(25μL)：北京天恩泽基因科技有限公司的即用型PCR试剂盒扩增混合液12.5μL，待扩增特异性检测标记引物对各0.5μL，DNA模板(50ng/μL)0.5μL，ddH2O 11μL。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃补平10min。
将PCR扩增产物与等体积的6×溴酚蓝上样缓冲液充分混匀，取5μL混合液在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳；电压设为100V，电泳时间为0.5h，待电泳结束后使用EB染色，并在紫外凝胶成像系统上拍照。若凝胶图像上显示扩增出两条条带，即可鉴定Vn的单孢分离株为异核体，如图2所示。

Claims (6)

1.一种快速鉴定野生草菇Vn单孢分离株同核体与异核体的方法，包括：
(1)采用常规方法进行栽培出菇，待草菇Vn菌株的子实体进入成熟期后，将子实体置于孢子收集器中，孢子收集器置于30-32℃培养箱中收集Vn菌株的孢子；
(2)挑取收集到的孢子，用无菌水稀释，血球计数板计数，然后进行梯度稀释，在加有氨苄青霉素的PDA平板上涂布，置于30-32℃培养箱中培养；待孢子刚萌发时，挑取单个菌落于新的PDA平板上培养，获得Vn单孢分离株；
(3)提取Vn单孢分离株的基因组DNA，然后以特异性检测标记引物为扩增引物，进行PCR扩增，所得PCR产物经电泳检测后，即可区分Vn单孢分离株为同核体或异核体；其中，特异性检测标记引物为A3F：GGAATGGTGCCCGACACGATACAG；
A3R：GGGTGTTGTTGAGGTTCGGTTGC；
A4F：TTGGTGCGGTCATCAACATTAG；
A4R：GTGAGCGGGTGATGTTGACGAT；A3F/A3R、A4F/A4R引物扩增出的DNA序列如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定野生草菇Vn单孢分离株同核体与异核体的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的孢子收集器内放有灭菌好的滤纸。
3.根据权利要求1所述的一种快速鉴定野生草菇Vn单孢分离株同核体与异核体的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的PCR扩增反应体系为：总体积25μL，12.5μL扩增混合液，待扩增基因特异性引物对各0.5μL，50ng/μL DNA模板0.5μL，ddH2O 11μL。
4.根据权利要求1所述的一种快速鉴定野生草菇Vn单孢分离株同核体与异核体的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃补平10min。
5.根据权利要求1所述的一种快速鉴定野生草菇Vn单孢分离株同核体与异核体的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的电泳检测具体为：将PCR扩增产物与等体积的6×溴酚蓝上样缓冲液充分混匀，取5μL混合液在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳；电压设为100V，电泳时间为0.5h，待电泳结束后使用EB染色，并在紫外凝胶成像系统上进行拍照。
6.根据权利要求1所述的一种快速鉴定野生草菇Vn单孢分离株同核体与异核体的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的区分同核体或异核体的标准为：同核体扩增出其中一条条带，异核体扩增出两条条带。
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