CN109750034A - 利用管盖内切虫快速提取单条线虫dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用管盖内切虫快速提取单条线虫DNA的方法，主要是在EP管盖内加入裂解液，然后将单条线虫置于裂解液中；再用注射器针头在管盖内划一凹槽，将线虫顺放于凹槽中，接着用注射器针头垂直将线虫切为两段，将管体倒盖到管盖上，瞬时离心，并置于60℃反应5min，98℃反应2min，即得单条线虫DNA。本发明还公开了一种鉴定线虫的方法。与现有的PCR管内切虫相比，本发明方法操作更为简单，且不需要高超技巧和专业训练，切虫时间大大缩短，切虫效率高；而且与现有1‑10小时的提取时间相比，本发明方法提取时间仅15分钟，提取时间短；本发明方法重复性和稳定性好，成本低，适于大规模的筛选和鉴定。
Description
技术领域
本发明属于线虫DNA的提取方法领域，具体涉及一种利用管盖内切虫快速提取单条线虫DNA的方法；还涉及一种鉴定线虫的方法。
背景技术
植物寄生线虫是重要的植物病原物，每年给世界农业生产造成的经济损失达1000亿美元以上。在我国常见的有滑刃线虫属(Aphelenchoides)、茎线虫属(Ditylenchus)、孢囊线虫属(Heterodera)，根结线虫属(Meloidogyne)和根腐线虫属(Pratylenchus)等线虫。这些线虫寄主范围广，给粮食作物、园艺作物和林业树木等造成严重危害，很多有害线虫已被我国列为检疫对象。
为降低植物寄生线虫对农业生产造成的损失，以及为便于对线虫进行检疫，首先需要对线虫进行分类鉴定。传统的线虫鉴定方法主要依赖于形态学观察，主观依赖性较强，要求鉴定者具有极为丰富的经验和技巧，尤其是在一些近似种的鉴定上比较困难。近几年，分子生物学技术在线虫的鉴定分类上已得到广泛应用。而实现分子水平上鉴定的首要条件就是要获得线虫DNA。目前获得线虫DNA的方法主要分为大量线虫DNA提取和单条线虫DNA提取两种。由于实际从田间受害作物和病土中分离获得的线虫通常是多个种类的混合种群。因此，利用单条线虫对线虫进行鉴定分类的方法更为准确和可靠，对于线虫的检疫和防治也更具意义。
对单条线虫进行分子鉴定，首先需要提取单条线虫的基因组DNA。化学裂解法和物理裂解法曾用于对单条线虫DNA的提取，但是由于这些方法存在操作步骤复杂、花费时间长等缺点，逐渐被酶解法所取代，酶解法主要是利用蛋白酶K的降解作用来提取单条线虫基因组DNA。目前，用昆虫针或解剖刀在PCR管内切割线虫，然后加入裂解液提取线虫基因组DNA的方法(CN103014157A；CN103602668A；容万韬等.华北农学报，2014.29(2):127-132)因无需转管、无需冻融等操作，具有相对简单、且提取成功率高等优点，将线虫DNA的提取提高到较高的水平，但是其在管内切割线虫的方法对操作人员要求高，切割操作难度大，非专业人士需要反复练习后才能掌握，大大限制了该技术的推广应用，另外利用这些方法提取线虫DNA的时间比较长，因此，应该寻找操作更加简单、提取时间更短的提取线虫DNA的方法，以满足防治研究和检疫的需求。
发明内容
针对管内切虫提取线虫DNA方法存在的对操作人员要求高，切割操作难度大、且提取时间长等问题，本发明目的在于提供一种利用管盖内切虫快速提取单条线虫DNA的方法；与现有方法相比，该方法具有简单易行、对操作人员要求低，提取速度快，且成本低等优点。
本发明另一目的在于提供一种鉴定线虫的方法。
为实现以上目的，本发明的技术方案如下：
一种利用管盖内切虫快速提取单条线虫DNA的方法，包括如下步骤：
(1)、线虫洗涤：在灭菌的表面皿或洁净载玻片上滴加灭菌的双蒸水，用灭菌的挑针将线虫挑入到所述的双蒸水中洗涤；
(2)、线虫的切割：在200μl平盖EP(Eppendorf)管的管盖内加入10μl裂解液，然后从步骤(1)已洗涤的线虫中挑取单条线虫放于该裂解液中；接着手握EP管体并将管盖平放于体式显微镜下，另一只手用注射器针头在管盖内先划出一道小凹槽，然后将线虫顺放于管盖内的凹槽内，接着用注射器针头垂直将线虫切为两段，再轻轻将管体倒盖到管盖上，掌上离心机瞬时离心，将裂解液与被切割的线虫一同收集到管底；
(3)、线虫的裂解及DNA的释放：将步骤(2)中的包含被切割线虫的裂解液置于60℃反应5min，98℃反应2min，在掌上离心机上瞬时离心；即得单条线虫DNA粗提液。
上述方法步骤(2)中所述的注射器针头为≤7号的针头。
上述方法步骤(2)中所述的裂解液由裂解缓冲液和蛋白酶k组成；其体积比为：裂解缓冲液：蛋白酶K＝100:1。所述的裂解缓冲液和蛋白酶K均为来自TAKARA公司的LysisBuffer for PCR产品。
本发明还提供了一种鉴定线虫的方法，包括如下步骤：
(1)、线虫洗涤：在灭菌的表面皿或洁净载玻片上滴加灭菌的双蒸水，用灭菌的挑针将线虫挑入到所述的双蒸水中洗涤；
(2)、线虫的切割：在200μl平盖EP(Eppendorf)管的管盖内加入10μl裂解液，然后从步骤(1)已洗涤的线虫中挑取单条线虫放于该裂解液中；接着手握EP管体并将管盖平放于体式显微镜下，另一只手用注射器针头在管盖内先划出一道小凹槽，然后将线虫顺放于管盖内的凹槽内，接着用注射器针头垂直将线虫切为两段，再轻轻将管体倒盖到管盖上，掌上离心机瞬时离心，将裂解液与被切割的线虫一同收集到管底；
(3)、线虫的裂解及DNA的释放：将步骤(2)中的包含被切割线虫的裂解液置于60℃反应5min，98℃反应2min，在掌上离心机上瞬时离心；即得单条线虫DNA粗提液；
(4)、以步骤(3)所得的线虫DNA为模板，以通用引物TW81/AB28为引物进行PCR扩增；将所得PCR产物进行分析，从而确定线虫的种类；其中所述的通用引物序列为：
TW81：5′-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3′
AB28：5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′
上述方法步骤(4)所述PCR扩增的反应体系为：2×Es Taq酶15μl；正反向引物各1μl；线虫基因组DNA 1μl；用ddH2O补足至30μl；所述PCR扩增的反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min。
上述方法步骤(4)所述的对PCR产物的分析包括凝胶电泳、测序、序列比对分析等。
本发明具有的优点和有益效果：(1)与现有的在PCR管内切虫相比，本发明先用注射器针头在EP管盖内划一凹槽，再把线虫顺放于凹槽内切虫的操作过程更为简便，且不需要高超的技巧，不需要任何专业训练，很易于上手，切虫时间大大缩短，切虫效率大大提高；(2)本发明方法切虫时间短，并且裂解所需时间短，整个单条线虫基因组DNA的提取过程所需时间不超过15分钟，而现有方法的整个提取过程一般要1～10小时，因而本发明提取效率大大提高，提取时间大大缩短；(3)本发明提取方法不需要转管，避免了DNA的损失；(4)本发明方法所需的所有耗材和试剂均为廉价的商品，不需要特殊的器具，也不需要自己配制复杂的裂解液，成本低；(5)本发明方法更为简便，操作重复性和稳定性好，而且所提取的不同种类线虫基因组DNA的数量和质量均好，利于推广应用。
附图说明
图1.以本发明方法提取的6种线虫基因组DNA为模板进行的PCR扩增的电泳图谱，其中1为马铃薯腐烂茎线虫，2为南方根结线虫，3为禾谷孢囊线虫，4为斯氏线虫，5为落选短体线虫，6为嗜菌异小杆线虫，M为DNA Marker。
图2.以本发明方法提取的取自土壤的13种线虫基因组DNA为模板进行的PCR扩增电泳图谱，其中1～13为待测线虫，14为马铃薯腐烂茎线虫(阳性对照)，CK为空白对照，M为DNA Marker。
具体实施方式
实施例1、利用平盖EP管盖内切虫快速提取单条线虫DNA试验
(一)、试验材料
1、供试线虫：马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)、落选短体线虫(Pratylenchus neglectus)、夜蛾斯氏线虫(Steinernema feltiae)、嗜菌异小杆线虫(Heterorhabditis bacteriophora)，均来自河北省农林科学院植物保护研究所农业线虫实验室。
2、裂解液的组成成分为：裂解缓冲液：蛋白酶K＝100:1，其中裂解缓冲液和蛋白酶K均来自TAKARA公司的Lysis Buffer for PCR产品(货号：9170A)。
3、PCR管为普通200μl平盖EP(Eppendorf)管；注射器针头为≤7号的针头；表面皿和载玻片均为普通玻璃器皿。
(二)、试验方法
单条线虫DNA的提取，按照如下步骤进行：
(1)在灭菌的表面皿或洁净载玻片上滴加灭菌的双蒸水，将待测DNA的线虫挑入到所述的双蒸水中洗涤；
(2)在200μl平盖EP(Eppendorf)管的管盖内加入10μl裂解液，然后从步骤(1)已洗涤的线虫中挑取单条线虫放于该裂解液中；
(3)手握EP管体并将管盖平放于体式显微镜下，另一只手用注射器针头在管盖内先划出一道小凹槽，然后将线虫顺放于管盖内的凹槽内，接着用注射器针头垂直将线虫切为两段，再轻轻将管体倒盖到管盖上，掌上离心机瞬时离心，将裂解液与被切割的线虫一同收集到管底；
(4)将步骤(3)中包含被切割线虫的裂解液置于60℃反应5min，98℃反应2min，掌上离心机瞬时离心，即得单条线虫DNA粗提液；
(5)PCR验证：以线虫rDNA-ITS区通用引物TW81/AB28为引物，以步骤(4)所得基因组DNA为模板进行PCR扩增；所述的通用引物为：
TW81：5′-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3′
AB28：5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′
PCR的反应体系为：2×Es Taq MasterMix(康为世纪)15μl；正反向引物各1μl；线虫基因组DNA 1μl；用ddH2O补足至30μl。PCR的反应程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min。取PCR扩增产物5μl，用1％琼脂糖凝胶进行电泳。
结果(见图1)利用本发明方法提取的6种线虫的基因组DNA均能通过PCR成功扩增获得目的条带，且条带明亮，说明本发明方法可以高效的获得高质量、稳定的单条线虫基因组DNA，且操作方法简便，不需要任何专业训练即可操作，提取时间短。
实施例2、利用本发明方法提取的单条线虫DNA对田间土壤中采集的线虫的鉴定试验
(一)、试验材料
1、待测线虫：从田间采集的土样中，通过浅盘法分离获得了大量混合线虫群体，随机从这些混合群体中挑选了13条不同形态的线虫，对待测线虫按照1～13顺序编号。
2、其它试验材料与实施例1同。
(二)、试验方法
(1)、单条线虫DNA的提取方法与实施例1相同。
(2)、以所提取的单条线虫DNA为模板，以TW81/AB28为引物进行PCR扩增，PCR反应体系、反应条件等同实施例1。
(3)、将PCR扩增产物取5μl进行凝胶电泳，剩余的PCR产物送交上海生工进行测序，然后将测得序列进行Blast比对分析。
结果(见图2)利用本发明方法提取的13条土壤线虫的DNA均能通过PCR成功扩增获得目的条带，且条带明亮，说明利用本发明方法可以高效的获得高质量、稳定的单条线虫基因组DNA，并且方法简单，成功率高。
同时经上海生工进行测序，并进行拼接和去除测序质量不好的两头序列后最终得到的各样品序列大小分别为1号695bp、2号694bp、3号918bp、4号690bp、5号574bp、6号723bp、7号617bp、8号902bp、9号627bp、10号573bp、11号668bp、12号578bp和13号576bp。通过将获得的这些DNA序列进行Blast比对分析，结果1号、2号和6号与茎线虫属线虫(Ditylenchus spp.)亲缘关系最近；3号与短茅属线虫(Tylencholaimellidae spp.)亲缘关系最近；4号与拟短体线虫(Pratylenchoides ritteri)亲缘关系最近；5号、12号和13号为北方根结线虫(Meloidogyne hapla)，7号和10号与中杆属线虫(Mesorhabditis spp.)亲缘关系最近，8号为禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)，9号与短体线虫(Pratylenchusgoodeyi)亲缘关系最近，11号与乔森纳姆线虫属线虫(Geocenamus spp.)亲缘关系最近。由于土壤中线虫种类繁多，且GenBank中并未包含所有线虫种类的DNA序列信息，所以部分土壤线虫通过分子方法未能鉴定到种，可能是因为这些土壤线虫并非农作物的主要病原线虫，所以未能引起人们的重视，对其的研究也就少，GenBank中登录的相应的DNA信息也就更少了。
上述试验说明本发明方法提取的单条线虫DNA质量高，可用于对线虫进行鉴定分类。
Claims (6)
1.一种利用管盖内切虫快速提取单条线虫DNA的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)、线虫洗涤：在灭菌的表面皿或洁净载玻片上滴加灭菌的双蒸水，用灭菌的挑针将线虫挑入到所述的双蒸水中洗涤；
(2)、线虫的切割：在200μl平盖EP(Eppendorf)管的管盖内加入10μl裂解液，然后从步骤(1)已洗涤的线虫中挑取单条线虫放于该裂解液中；接着手握EP管体并将管盖平放于体式显微镜下，另一只手用注射器针头在管盖内先划出一道小凹槽，然后将线虫顺放于管盖内的凹槽内，接着用注射器针头垂直将线虫切为两段，再轻轻将管体倒盖到管盖上，掌上离心机瞬时离心，将裂解液与被切割的线虫一同收集到管底；
(3)、线虫的裂解及DNA的释放：将步骤(2)中的包含被切割线虫的裂解液置于60℃反应5min，98℃反应2min，在掌上离心机上瞬时离心；即得单条线虫DNA粗提液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其步骤(2)中所述的注射器针头为≤7号的针头。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其步骤(2)中所述的裂解液由裂解缓冲液和蛋白酶k组成；其体积比为：裂解缓冲液：蛋白酶K＝100:1。
4.一种鉴定线虫的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)、线虫洗涤：在灭菌的表面皿或洁净载玻片上滴加灭菌的双蒸水，用灭菌的挑针将线虫挑入到所述的双蒸水中洗涤；
(2)、线虫的切割：在200μl平盖EP(Eppendorf)管的管盖内加入10μl裂解液，然后从步骤(1)已洗涤的线虫中挑取单条线虫放于该裂解液中；接着手握EP管体并将管盖平放于体式显微镜下，另一只手用注射器针头在管盖内先划出一道小凹槽，然后将线虫顺放于管盖内的凹槽内，接着用注射器针头垂直将线虫切为两段，再轻轻将管体倒盖到管盖上，掌上离心机瞬时离心，将裂解液与被切割的线虫一同收集到管底；
(3)、线虫的裂解及DNA的释放：将步骤(2)中的包含被切割线虫的裂解液置于60℃反应5min，98℃反应2min，在掌上离心机上瞬时离心；即得单条线虫DNA粗提液；
(4)、以步骤(3)所得的线虫DNA为模板，以通用引物TW81/AB28为引物进行PCR扩增；将所得PCR产物进行分析，从而确定线虫的种类；其中所述的通用引物序列为：
TW81：5′-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3′
AB28：5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于其步骤(4)所述PCR扩增的反应体系为：2×Es Taq酶15μl；正反向引物各1μl；线虫基因组DNA1μl；用ddH2O补足至30μl；所述PCR扩增的反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于其步骤(4)所述的对PCR产物的分析包括凝胶电泳、测序和序列比对分析。
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