CN103940919B - 一种在白术生长期检测抗性标志物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种在白术生长期检测其抗性标志物的方法。该方法是在白术土传病高发期，采集自然状态下感病植株与抗病植株；同时，采用伤根法接种白绢菌菌丝，待感染发病后分别采健康和发病植株，采用HPLC法测定样品植株中主要代谢物白术内酯类水平，进行组间差异比较，确定显著性差异组分，筛选与白术抗性有关的标志性代谢物，并以罗氏白绢小菌核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)为受试菌，进行该组分的毒力测试，证明白术内酯II的抑菌功效，以此获得抗性标志物，用于白术抗性评价、抗性品种选育等方面。

Description

一种在白术生长期检测抗性标志物的方法
技术领域
本发明涉及一种在白术生长期检测抗性标志物的方法，具体涉及一种白术次生代谢物白术内酯II做为与白术土传病害抗病性有关的标志物检测方法。
背景技术
白术(Atractylodis macrocephala Koidz.)为我国大宗中药材之一，全国先后约有20个省(市区)引种栽培，目前种植面积约1.3万公顷。然而，在土壤条件、栽培条件及气候条件适宜条件下，白术的土传病害发病的损失率严重时可达50％，甚至引起绝收。白术土传病害是白术种植生产的限制性因子，其主要有由罗氏白绢小菌核菌(SclerotiumrolfsiiSacc.)等致病菌引起。针对这种情况，研究白术抗病机理，寻找强抗逆性品种、筛选防病药剂，抵御白术病害的研究越来越受到重视。
尽管，国内有学者在白术的种质资源调查分析的基础上利用分子标记方法对国内不同产地白术药材的种质资源进行遗传变异分析，阐明了栽培白术保持较高的遗传多样性是保持药材优良品质和品种选育的基础，白术的良种选育有良好的种源条件。然而白术与其它药用植物一样缺乏大量序列数据信息，使得基因表达的系统分析、微阵列等转录轮廓分析方法及cDNA-ALFP技术难以应用于其各种生物学功能相关基因的表达分析研究，这些生物学功能包括白术的遗传、生育、抗病等方面，严重阻碍了白术大规模的基因发掘。在白术等药用植物抗病研究中更是如此。
植物代谢物具有抗病基因的放大表达作用，是细胞或组织的生物化学表现型，代谢物分析所提供的信息比转录组和蛋白质组分析所提供的的信息更有用，更能够揭示基因和表现型之间的关系，找到植物抗病的分子标志物，在植物的抗病育种、抗病机理研究中必然起到重大的作用。本发明提供一种方法，采用代谢物分析法明确了与白术土传病害抗性有关的特征标志代谢物，该标志物可用于白术抗性评价、抗性品种选育等方面。
发明内容
本发明公开了一种在白术生长期检测其抗性标志物的方法。该方法是在白术土传病高发期，采集自然状态下感病植株与抗病植株；同时，采用伤根法接种白绢菌菌丝，待感染发病后分别采健康和发病植株，采用HPLC法测定样品植株中主要代谢物白术内酯类水平，进行组间差异比较，确定显著性差异组分，筛选与白术抗性有关的标志性代谢物，并以罗氏白绢小菌核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)为受试菌，进行该组分的毒力测试，证明白术内酯II的抑菌功效，以此获得抗性标志物，用于白术抗性评价、抗性品种选育等方面。
本发明的目的是通过以下步骤实现的：
A种植白术，按常规进行田间管理，于5-7月白术土传病害高峰期采集自然状态下抗病植株A1与感病植株A2各30株以上，去除泥土，低温干燥，作为测试样品，备用；
B采用伤根法接种罗氏白绢小菌核菌，1-3周后分别采健康B1和发病植株B2各30株以上，去除泥土，低温干燥，作为测试样品，备用；
C采用HPLC法测定A步骤和B步骤的样品中白术内酯类的含量值，并采用单因素T检验分析A1与A2、B1与B2组间水平的差异，确定在白术抗病植株与健康植株中明显高表达的代谢物为白术内酯II，并进一步采用对照品追加法鉴定此代谢物为白术内酯II；
D采用体外抑菌实验验证候选标志物对白术致病菌的抑制活性，以罗氏白绢小菌核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)为受试菌种，分别测试对该致病菌的毒力，与白术内酯I、白术内酯III比较，明确白术内酯II有明显的抑制作用，实验证实代谢物白术内酯II为与白术抗病性有关的标志物。
上述检测在白术中与抗性相关的标志物的方法，采集白术感病植株和健康植株样品优选为6月份白术土传病害高发期。
通过以上方法获得白术抗性标志物，与农业领域里常用的转录组学和蛋白组学寻找分子标记物的方法比较，因为基因和蛋白表达的微小变化会在代谢物上得到放大，使得检测更容易，费用低，研究中采用的技术更通用，筛选出的抗性标志代谢物对白术抗病机理及育种有关的研究领域将会具有很大的利用价值。
附图说明
图1白术样品以及白术内酯I(A)、白术内酯II(B)和白术内酯III(C)的HPLC色谱图(1-白术内酯I、2-白术内酯II、3-白术内酯III、C-白术样品220nm检测、D-白术样品276nm检测)
图2白术内酯II的抑菌作用(第5天抑制率77％)。
具体实施方式
下面结合实施例来具体说明本方法。
实施例
本实施例中的具体步骤是：
A田间自然样本采集试验分别在浙江昌化和浙江天目山药材种植基地进行。2010年3月中旬种植白术，2011年6月中旬白绢病发病高峰期，采集自然条件下的抗病植株A1和感病植株A2各30株去除泥土，低温干燥，作为测试样品，备用。
B田间接种试验
分别在昌化和天目山药材种植基地进行。2010年3月中旬种植白术，2011年6月中旬白绢病发病高峰期采用伤根法接种白绢菌菌丝，待感染发病后分别采健康B1和发病植株B2各30株，去除泥土，低温干燥，作为测试样品，备用。
C白术内酯类成分测定
色谱条件色谱柱：Sun Fire C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱程序为0～16min，60％～76％A；16～18min，76％～100％A；18～30min，100％A。体积流量1mL/min，柱温25℃，白术内酯I、III检测波长为220nm、白术内酯II检测波长为276nm，进样量20μL。色谱图见图1。
对照品溶液的制备精密称取白术内酯I、II、III对照品适量，用甲醇配制成含有白术内酯I、II、III分别为0.266、0.100、0.341mg/mL的混合对照品溶液。
供试品溶液的制备精密称取白术样品粉末0.5g，加入8mL甲醇，超声30min，静置后用甲醇定容至10mL，摇匀，得50mg/mL的供试品溶液。
样品测定并采用对照品追加法鉴定白术内酯II。
结果与分析：采用单因素T检验分析A1与A2、B1与B2组间水平的差异，由表1可知，白术生长期其抗病植株中白术内酯II表达水平显著高于感病植株，而白术中内酯I和白术内酯III的表达水平在抗病植株与感病植株组间无显著差异。可以认为抗病植株中白术内酯II的高水平是白术抗病基因表达的放大表观，是白术抗土传病害的关键代谢物。由表2可知，白术接种白绢菌后，健康植株白术内酯II，III的表达呈现显著升高的趋势，其中白术内酯II水平在健康植株与发病植株中的表达呈现显著差异，而白术内酯I基本无变化。
表1.白术抗病样品(A1)和感病样品(A2)内酯的含量
不同字母表示显著差异
表2.接种病菌后健康植株(B1)和发病植株(B2)样品中白术内酯的水平
不同字母表示显著差异
C在本发明的实施例中，使用上述检测白术土传病害相关标志物的方法分离分析出了相关的内酯类标志代谢物，证明白术内酯II在抗病和健康植株中表达明显高于感病和发病植株，是候选的抗性标志代谢物，其体外抑菌验证方法步骤如下：
(a)分别取0.01ml不同浓度甲醇母液内酯I，II，III于10ml培养基中，使成200、100、50、25、12.5μg/ml的培养基。采用生长速率法进行毒力测定。以罗氏白绢小菌核菌为供试菌种。无菌条件，下在各个病原菌菌落边缘用打孔器打取菌饼直径分别接种于各处理培养基平板中央每皿接1个菌饼，每处理3次重复，25℃培养72小时，采用十字交叉法测量菌落直径，应用DPS软件进行统计分析，计算毒力回归方程、有效中浓度及相关系数。
(b)毒力测定结果分析，表3显示白术内酯II对罗氏白绢小菌核菌有着显著的抑制作用(见图2)，EC50为252.34μg/ml，在浓度为200μg/ml时抑制率达到77.23％；白术内酯III对罗氏白绢小菌核菌有一定的抑制作用，EC50为685.32μg/ml，在浓度为200μg/ml时抑制率为23.45％；而白术内酯I对罗氏白绢小菌核菌基本无影响。
表3白术内酯对白绢菌的毒力测定
体外抑菌试验也证实白术内酯II对白术土传病害的主要致病菌有显著的抑制作用，而白术内酯III在抑菌试验中仅表现出一定的抑制效果。综上得出白术内酯II是与白术抗土传病害有关的标志物。

Claims (3)

1.一种在白术生长期检测抗性标志物的方法，其特征在于：
A种植白术，按常规进行田间管理，于5-7月白术土传病害高峰期采集自然状态下抗病植株A1与感病植株A2各30株以上，去除泥土，低温干燥，作为测试样品，备用；
B采用伤根法接种罗氏白绢小菌核菌，1-3周后分别采健康B1和发病植株B2各30株以上，去除泥土，低温干燥，作为测试样品，备用；
C采用HPLC法测定A步骤和B步骤的样品中白术内酯类的含量值，并采用单因素T检验分析A1与A2、B1与B2组间水平的差异，确定在白术抗病植株与健康植株中明显高表达的代谢物为白术内酯II，并进一步采用对照品追加法鉴定此代谢物为白术内酯II；
HPLC法测定的条件为：色谱条件色谱柱：Sun Fire C18，250mm×4.6mm，5μm，流动相甲醇A-水B，梯度洗脱程序为0～16min，60％～76％A；16～18min，76％～100％A；18～30min，100％A；体积流量1mL/min，柱温25℃，白术内酯I、III检测波长为220nm、白术内酯II检测波长为276nm，进样量20μL；对照品溶液的制备：精密称取白术内酯I、II、III对照品适量，用甲醇配制成含有白术内酯I、II、III分别为0.266、0.100、0.341mg/mL的混合对照品溶液；供试品溶液的制备：精密称取白术样品粉末0.5g，加入8mL甲醇，超声30min，静置后用甲醇定容至10mL，摇匀，得50mg/mL的供试品溶液；
D采用体外抑菌实验验证候选标志物对白术致病菌的抑制活性，以罗氏白绢小菌核菌为受试菌种，分别测试对该致病菌的毒力，与白术内酯I、白术内酯III比较，明确白术内酯II有明显的抑制作用，实验证实代谢物白术内酯II为与白术抗病性有关的标志物；
其中体外抑菌验证方法步骤如下：分别取0.01ml不同浓度甲醇母液内酯I，II，III于10ml培养基中，使成200、100、50、25、12.5μg/ml的培养基；采用生长速率法进行毒力测定；以罗氏白绢小菌核菌为供试菌种；无菌条件下在各个病原菌菌落边缘用打孔器打取菌饼直径分别接种于各处理培养基平板中央每皿接1个菌饼，每处理3次重复，25℃培养72小时，采用十字交叉法测量菌落直径，应用DPS软件进行统计分析，计算毒力回归方程、有效中浓度及相关系数。
2.根据权利要求1所述的在白术生长期检测抗性标志物的方法，其特征在于：白术内酯II在具有抗病能力的白术中明显高表达，并与白术抗土传病害相关。
3.根据权利要求1所述的在白术生长期检测抗性标志物的方法，其特征在于：采集白术感病植株和健康植株样品为6月份白术土传病害高发期。
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