CN107796884A - 一种基于代谢组学的杀菌剂作用机制研究方法 - Google Patents

一种基于代谢组学的杀菌剂作用机制研究方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于代谢组学的杀菌剂作用机制研究方法，基于GC‑MS技术对含杀菌剂和无药对照培养基上培养的病原菌菌丝进行代谢组检测，通过比较代谢组学研究法寻找差异代谢物，排除不同作用机制共有的代谢物，获得目标杀菌剂作用机制的特异性生物标志物，利用生物标志物含量的变化来实现对杀菌剂作用机制的识别及高通量分析。本发明还公开了琥珀酸脱氢酶抑制剂的生物标志物为琥珀酸。利用本发明提供的筛选杀菌剂作用机制生物标志物方法快速、可靠，获得的生物标志物特异性强。利用生物标志物特异性变化可以实现对活性物质作用机制的快速识别及高通量分析。

Description

一种基于代谢组学的杀菌剂作用机制研究方法
技术领域
本发明涉及杀菌剂药理学和代谢组分析技术领域，具体地说，涉及一种基于代谢组学的杀菌剂作用机制研究方法。
背景技术
杀菌剂在农业生产中是保障农作物免受病害损失的重要生产资料，随着病菌对常用杀菌剂抗性的产生以及人们对食品安全、生态健康的关注，要求研究人员不断寻找新的生物靶标蛋白和新型活性结构的化合物，从而发现了大批新型的低毒、高效、低残留的具有抑菌活性化合物，为田间病害的有效控制提供了优秀杀菌剂潜在资源。但是，一个药剂的成功开发，不仅需要关注其生物活性，研发者更需要关注化合物对有害生物的作用机制，以避免新化合物与已有商品化农药品种因作用机制类似带来的高抗药性风险。
杀菌剂作用机制研究难度较大，目前尚缺少快速研究方法。通常采用常规生物学方法如测定杀菌剂对病原菌不同发育阶段的抑菌效果、生化测定法、药剂与靶标蛋白对接预测、亲和层析的方法从组蛋白中筛选出可以与药剂相结合的蛋白等方法，也有研究通过交互抗性来预判化合物与已有药剂的相似性。这些方法通常研究难度较大，耗时较长。近年来随着组学技术的发展，人们开始尝试从蛋白组和转录组等角度尝试解析新化合物的作用机制，并获得了较好的结果。而代谢组学方法以其快速、可靠、信息挖掘能力强等特点在农药作用机制研究中受到越来越多的关注。
代谢组学是在特定条件下对生物系统大量代谢物的全面定性和定量分析。代谢组学研究主要包括代谢指纹分析、代谢轮廓分析和代谢组分析这3个层次。代谢指纹分析对不同处理下生物系统的代谢指纹进行模式判别分析。目前模式判别的方法主要有主成分分析PCA、层次聚类分析HCA、神经网络分析ANN及热图Heatmap等。模式判别可以表明不同处理下生物系统代谢组指纹异同，进而判定处理因素的异同。代谢轮廓分析可以表明特定处理下靶标生物系统特定代谢途径或特定类别的代谢物的量上的变化，即特定处理因素引起靶标生物系统代谢轮廓的变化。代谢组分析是指特定条件下对靶标生物系统所有的代谢物进行定性和定量分析，广泛应用于非靶标代谢研究中。
当前代谢组学已成为农药作用机制研究的强大工具。代谢组学通过农药作用下靶标生物代谢指纹变化规律与药剂作用机制相联系来推定新化合物作用机制，应用于除草剂、杀虫剂和杀菌剂作用机制的区组已有部分报道。通过代谢轮廓分析可以探明生物体系(细胞，组织或生物体)受外部刺激所发生调整的代谢标志物，但采用生物标志物的方法快速识别杀菌剂作用机制目前尚未见报道。
通过比较代谢组学研究，分析杀菌剂作用下病原菌代谢轮廓的差异，并获得与药剂作用机制密切相关的生物标志物，从而利用生物标志物进行活性化合物作用机制的快速识别，成为解决目前杀菌剂作用机制研究中存在的缺少快速识别方法问题的有效手段。但目前有关杀菌剂作用机制生物标志物及其研究方法国内外鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于代谢组学法寻找杀菌剂作用机制生物标志物和利用生物标志物快速识别活性物质作用机制的方法。
本发明的另一目的是提供琥珀酸脱氢酶抑制剂Succinate dehydrogenaseinhibitors(SDHIs)的作用机制生物标志物。
为了实现本发明目的，本发明提供一种基于代谢组学的杀菌剂作用机制研究方法，基于GC-MS技术对含杀菌剂和无药对照培养基上培养的病原菌(包括病原真菌和病原卵菌)菌丝进行代谢组检测，通过比较代谢组学研究法寻找差异代谢物，排除不同作用机制共有的代谢物，获得目标杀菌剂作用机制的特异性生物标志物，利用生物标志物含量的变化来实现对杀菌剂作用机制的识别及高通量分析。
所述方法包括以下步骤：
S1、菌丝培养、收集、灭活和保存；
S2、代谢组样品前处理和GC-MS检测；
S3、利用比较代谢组寻找生物标志物。
所述菌丝培养、收集、灭活和保存方法为：将病原菌的菌丝于固体培养基(例如马铃薯葡萄糖琼脂PDA、V8A、酵母葡萄糖琼脂YGA、胡萝卜琼脂CA或燕麦粉琼脂培养基OA等，根据病原菌选择合适的培养基)上于18～37℃培养1～7d，菌落外缘沿同心圆打取菌饼，接至铺有玻璃纸的含有抑制菌丝生长20％～80％浓度杀菌剂的培养基平板上，对照组添加等量有机溶剂。用刮刀刮取玻璃纸上的菌丝培养物，去除接种的菌饼，收集至离心管中。将装有菌丝的离心管置于液氮中速冻3～5min灭活，获得的菌丝样品置于超低温(优选-80℃)冰箱保存。
其中，所述有机溶剂选自二甲基亚砜(DMSO)、甲醇、丙酮中的至少一种。
所述代谢组样品前处理和GC-MS检测方法为：
(1)冷冻干燥及研磨破碎：灭活后的菌丝冷冻干燥后研磨，或采用球磨仪研磨破碎处理，得菌丝粉末；
(2)代谢物提取：称取30.0±0.2mg的菌丝粉末，准确加入1.8mL溶解0.1～100μg/mL内标物质的提取溶剂，采用涡旋振荡1min后，继续超声提取20min；其中，所述提取溶剂为甲醇和水混合溶液，甲醇与水的体积比为9.5:0.5-5:5(优选8:2)；所述内标物质为水杨苷(D(-)-Salicin)；
(3)离心干燥：将(2)提取获得的代谢物溶液在4000～12000r/min(优选12000r/min)下进行离心5～15min(优选10min)，弃去沉淀，得代谢物提取液；
所述的干燥方法为抽真空离心干燥：准确移取0.6mL上清液至0.6mL离心管中，45℃抽真空离心干燥4～8h，直至质量恒定；
(4)衍生化：包括肟化(或腙化)和三甲基硅烷化两步衍生化反应，步骤如下：
1)吸取100μL衍生化试剂1加入已离心干燥好的样品管中，封口，超声20min，涡旋1min溶解，稍微离心后30℃条件下肟化(或腙化)衍生化反应2h；
2)加入100μL的衍生化试剂2至样品管中，封口，超声20min，涡旋1min溶解，稍微离心，37℃条件下硅烷化衍生反应4～10h(优选6h)；
3)衍生化获得的样品在转速10000～15000r/min(优选12000r/min)下离心15min，吸取上清液至GC样品玻璃管中，获得用于GC-MS检测的病原菌菌丝代谢物样品。
所述的衍生化方法步骤1)所述衍生化试剂1为：甲氧基胺盐酸盐溶解于吡啶获得的溶液，浓度为10～40mg/mL(优选20mg/mL)；
所述的衍生化方法步骤2)所述衍生化试剂2选自三甲基氯硅烷、N,O-双三甲硅基乙酰胺、三甲基咪唑、N，O-双三甲硅基三氟乙酰胺、N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺、六甲基二硅胺烷、N-甲基-N-三甲硅基乙酰胺中的至少一种。
(5)GC-MS检测：采用HP-5MS毛细管柱，规格30m×0.25mm×0.25μm；进样体积1μL；流速1mL/min；程序升温；离子源温度为230～300℃，传输线温度为230～300℃；氦气为载气，恒流模式；采用EI电离源，全扫描扫描范围m/z 20～650，频率0.2s/scan；溶剂延迟时间5.9min。
所述利用比较代谢组寻找生物标志物是指对GC-MS检测获得的药剂处理组和空白对照组菌丝代谢组数据，采用PCA、PLS、OPLS和/或ANOVA分析筛选生物标志物，步骤如下：
(1)采用GC-MS数据分析软件根据代谢物质谱定量离子导出峰面积；
(2)采用ANOVA分析获得药剂处理组与对照组菌丝中差异显著的代谢物；
(3)采用PCA、PLS和/或OPLS等分析方法获得药剂处理组与对照组差异贡献较大的代谢物；
(4)对(2)和(3)分析结果交集中的代谢物采用质谱检索、质谱解析及标准物质保留时间和质谱图比对等方法进行定性，获得杀菌剂作用相关代谢物；
(5)对不同类型的典型机制药剂相关代谢物分析，排除不同作用机制共有的代谢物，筛选获得杀菌剂作用机制识别特异性生物标志物。
本发明还提供利用生物标志物进行活性化合物作用机制快速识别的方法，采用GC-MS对含药和无药对照培养基上生长的菌丝进行生物标志物的检测，根据药剂(即杀菌剂)处理组中生物标志物含量在p＝0.05水平上的显著变化进行作用机制的识别。
本发明还提供一种具有琥珀酸脱氢酶抑制作用的化合物作用机制识别的生物标志物，其为琥珀酸(Butanedioic acid，Succinic acid)，CAS号：110-15-6，化学结构：
本发明还提供利用琥珀酸进行活性化合物的琥珀酸脱氢酶抑制作用快速识别的方法，采用GC-MS对含药和对照培养基上生长的菌丝进行生物标志物的检测，根据药剂组琥珀酸含量的显著上调进行识别。所述琥珀酸脱氢酶抑制剂包括但不限于啶酰菌胺、萎锈灵、氟吡菌酰胺。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(一)基于GC-MS对含杀菌剂和无药对照培养基上培养的病原菌菌丝进行代谢组检测，通过比较代谢组学研究法，结合代谢物的准确定性，获得与杀菌剂作用密切相关的代谢物，通过排除其他典型作用机制药剂相关代谢物，获得目标作用机制药剂的特异性生物标志物。此种筛选杀菌剂作用机制生物标志物方法快速、可靠，获得的生物标志物特异性强。利用生物标志物特异性变化可以实现对活性物质作用机制的快速识别及高通量分析。
(二)本发明公开了琥珀酸脱氢酶抑制剂的生物标志物琥珀酸。琥珀酸作为琥珀酸脱氢酶抑制剂的作用机制生物标志物，其变化特征是在活性物质作用下菌体中琥珀酸含量显著上调，为琥珀酸脱氢酶抑制活性物质的快速识别提供了有效方法，从而为灰霉病、炭疽病和立枯丝核病等该类药剂有效控制病害防治中杀菌剂的开发中的抗性风险规避提供重要参考和方法依据，亦可为其它药剂作用机制生物标志物的发现提供有益借鉴。
附图说明
图1为本发明实施例1技术流程图。
图2为本发明实施例1中SDHIs啶酰菌胺处理下灰霉菌丝代谢组得分图。
图3为本发明实施例1中SDHIs啶酰菌胺处理下灰霉菌丝代谢组载荷图。
图4为本发明实施例1中SDHIs啶酰菌胺处理下灰霉菌SP2-6琥珀酸显著上调。
图5为本发明实施例1中非SDHIs嘧霉胺、嘧菌环胺和咯菌腈处理下灰霉病菌SP2-6琥珀酸显著下调。
图6为本发明实施例2中SDHIs萎锈灵和氟吡菌酰胺处理下灰霉病菌Bc52琥珀酸显著上调。
图7为本发明实施例3中SDHIs啶酰菌胺处理下立枯丝核病菌D179琥珀酸显著上调。
图8为本发明实施例4中SDHIs萎锈灵处理下炭疽病菌C12琥珀酸显著上调。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1琥珀酸脱氢酶抑制剂作用机制特异生物标志物筛选
采用的工艺流程如图1所示，具体实施方法如下：
一、灰霉菌丝样品前处理
1)灰霉病菌的培养
取生长3d的灰霉病菌SP2-6的PDA培养基平板，在超净工作台中，用0.5cm打孔器沿着菌落外沿打取菌饼，用挑针挑取菌饼接到铺有玻璃纸含EC50药剂浓度的固体PDA培养基平板上，即0.04μg mL-1多菌灵、0.4μg mL-1甲基硫菌灵、0.08μg mL-1啶酰菌胺、0.1μg mL-1醚菌酯、9.8μg mL-1氰霜唑、0.7μg mL-1嘧霉胺、0.5μg mL-1嘧菌环胺、0.01μg mL-1咯菌腈或4.6μgmL-1抑霉唑，以含有等量DMSO不含药剂的处理作为对照，17.5～18.5℃条件下培养3d，得菌丝培养物。
2)灰霉菌丝收集：用刮刀刮取玻璃纸上生长的菌丝培养物，去除接种的菌饼，收集于2mL离心管中。
3)液氮灭活处理：将装有菌丝的离心管迅速置于液氮中速冻3～5min。
4)菌丝样品保存：将按上述方法培养、收集、灭活的菌丝样品用封口膜密封后，置于-80℃冰箱保存。
5)冷冻干燥及研磨破碎：取液氮灭活处理的菌丝样品，冷冻干燥后采用球磨仪以30次/s的频率研磨1min进行破碎处理，得菌丝粉末。
6)代谢组提取
称取30.0±0.2mg的菌丝粉末于离心管中，分别加入1.8mL溶解5μg/mL内标物质的提取溶剂，得到灰霉病菌SP2-6的代谢组提取液，涡旋振荡1min后，继续超声提取20min。其中，所述提取溶剂为甲醇和水混合溶液，甲醇与水的体积比为8:2；所述内标物质为水杨苷。
7)离心干燥：将提取获得的代谢组溶液在12000r/min下进行离心15min，准确移取0.6mL上清液至离心管中，45℃抽真空离心干燥4h至质量恒定。
8)衍生化
包括甲氧基胺盐酸盐和N，O-双三甲硅基三氟乙酰胺两步衍生化反应：
吸取100μL衍生化试剂甲氧基胺盐酸盐溶液(溶解于吡啶中，浓度20mg/mL)加入已离心干燥好的样品管中，封口，超声20min，30℃衍生化反应2h；
加入100μL的衍生化试剂N，O-双三甲硅基三氟乙酰胺至样品管中，封口，超声20min，涡旋1min稍微离心，37℃衍生化反应6h；
获得的衍生化样品在离心转速12000r/min下离心15min，吸取160μL至GC样品玻璃管中，获得用于GC-MS检测的菌丝代谢组样品。
二、基于GC-MS灰霉病菌代谢组的检测
进行GC-MS检测，仪器型号为：气相为6890B，质谱为7200。具体采用的检测条件为：HP-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；进样体积1μL；流速1mL/min；离子源和传输线温度分别为230℃和280℃；氦气为载气，恒流模式；质谱EI电离源70eV，全扫描扫描范围m/z50～600，频率0.2s/scan；溶剂延迟时间5.9min。
升温程序参数见表1：
表1色谱柱梯度升温程序参数
三、比较代谢组学法筛选琥珀酸脱氢酶抑制剂作用机制生物标志物
1)灰霉菌丝代谢组定性定量数据的导出
灰霉病菌SP2-6菌丝样品经前处理和GC-MS检测获得总离子流图，采用GC-MS数据分析软件(Qualitative Analysis B.07.00)对GC-MS检测数据进行定性和定量数据的导出。在典型样品检测TIC图谱中，选取1个特征离子峰和2个参考离子峰作为定性离子，并以特征离子峰作为定量离子，编辑所有代谢物的信息。检索NIST 2005谱库，对TIC中色谱峰进行定性。导出包含保留时间、化合物、谱库匹配度等信息的峰组表。根据各类代谢物硅烷化反应规律和衍生化产物结构解析代谢物的原始结构。
2)琥珀酸脱氢酶抑制剂作用机制相关代谢物筛选
采用IBM SPSS Statistics 21软件ANOVA，比对药剂处理组与空白对照组中各代谢物的峰面积差异，获得p＝0.05水平的差异性代谢物。采用PCA比对分析药剂处理组与空白对照组中各代谢物的峰面积差异，根据得分图和载荷图获得在区组药剂处理组与空白对照组贡献大的差异性代谢物(图2和图3)。综合ANOVA和PCA差异性代谢物分析结果，啶酰菌胺处理引起甘油、甘油酸磷酯、甘油酸、苏氨酸、丙氨酸、琥珀酸等物质显著上调，引起甘露糖、山梨糖醇、松二糖等物质显著下调。而啶酰菌胺为琥珀酸脱氢酶抑制剂，阻断琥珀酸还原形成延胡索酸进而导致琥珀酸积累(图4)，因此琥珀酸与啶酰菌胺作用机制直接相关。
3)琥珀酸脱氢酶抑制剂作用机制特异生物标志物筛选
参照2)啶酰菌胺处理引起的差异性代谢物分析方法，采用ANOVA比对药剂处理组与空白对照组中琥珀酸含量变化，与对照组相比，蛋氨酸合成抑制剂嘧霉胺、嘧菌环胺和信号传导抑制剂咯菌腈处理下灰霉病菌SP2-6菌丝内琥珀酸含量显著下调(图5)，β-微管蛋白抑制剂多菌灵、甲基硫菌灵、复合物III细胞色素bc1(泛醌氧化酶)Qo位点抑制剂醚菌酯、复合物III细胞色素bc1(泛醌还原酶)Qi位点抑制剂氰霜唑或甾醇合成抑制剂抑霉唑处理下灰霉病菌SP2-6菌丝内琥珀酸含量无显著变化。
以上结果表明，不同作用机制的杀菌剂处理引起病原菌体内琥珀酸含量发生不同的变化，只有琥珀酸脱氢酶抑制剂啶酰菌胺作用下琥珀酸含量显著上调，而其它作用机制类别的杀菌剂作用下琥珀酸含量基本不变或者下调，分析认为琥珀酸脱氢酶抑制剂特异地阻碍了琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸形成延胡索酸的反应，从而导致琥珀酸积累。基于此，活性化合物处理下病原菌菌丝中琥珀酸可以作为琥珀酸脱氢酶抑制活性识别的特异生物标志物，其变化特征为含量显著上调。
实施例2琥珀酸在萎锈灵和氟吡菌酰胺对灰霉病菌作用机制识别中的应用
一、灰霉菌丝培养及菌丝中琥珀酸的GC-MS检测
采用的前处理方法及琥珀酸的检测方法详见实施例1，其中灰霉病菌Bc52的培养具体实施如下：
取生长6d的灰霉病菌Bc52的PDA培养基平板，在超净工作台中，用0.5cm打孔器沿着菌落外沿打取菌饼，用挑针挑取菌饼并接到铺有玻璃纸的带药(10μg mL-1萎锈灵或1μgmL-1氟吡菌酰胺，抑制菌丝生长50％)固体PDA培养基平板上，17.5～18.5℃条件下培养6d，得菌丝培养物。
二、萎锈灵和氟吡菌酰胺处理下灰霉病菌Bc52琥珀酸含量变化
萎锈灵和氟吡菌酰胺处理灰霉病菌Bc52经前处理和GC-MS检测获得总离子流图，经分析与对照组相比，萎锈灵和氟吡菌酰胺处理下灰霉Bc52菌丝内琥珀酸含量显著上调(图6)，倍数分别为1.4和3.1。
实施例3琥珀酸在啶酰菌胺对立枯丝核病菌作用机制识别中的应用
一、立枯丝核病菌菌丝培养及菌丝中琥珀酸的GC-MS检测
采用的前处理方法及琥珀酸的检测方法详见实施例1，其中立枯丝核病菌D179的培养具体实施如下：
取生长1d的立枯丝核病菌D179的PDA培养基平板，在超净工作台中，用0.5cm打孔器沿着菌落外沿打取菌饼，用挑针挑取菌饼并接到铺有玻璃纸的带药(0.93μg mL-1啶酰菌胺，抑制菌丝生长50％)固体PDA培养基平板上，24.5～25.5℃条件下培养1d，得菌丝培养物。
二、啶酰菌胺处理下立枯丝核病菌D179琥珀酸含量变化
啶酰菌胺处理立枯丝核病菌D179经前处理和GC-MS检测获得总离子流图，经分析与对照组相比，啶酰菌胺处理下立枯丝核病菌D179菌丝内琥珀酸含量显著上调(图7)，上调倍数为5.5。
实施例4琥珀酸在萎锈灵对炭疽病菌作用机制识别中的应用
一、炭疽病菌菌丝培养及菌丝中琥珀酸的GC-MS检测
采用的前处理方法及琥珀酸的检测方法详见实施例1，其中炭疽病菌C12的培养具体实施如下：
取生长5d的炭疽病菌C12的PDA培养基平板，在超净工作台中，用0.5cm打孔器沿着菌落外沿打取菌饼，用挑针挑取菌饼并接到铺有玻璃纸的带药(15μg mL-1萎锈灵，抑制菌丝生长50％)固体PDA培养基平板上，24.5～25.5℃条件下培养5d，得菌丝培养物。
二、萎锈灵处理下炭疽病菌C12琥珀酸含量变化
萎锈灵处理炭疽病菌C12经前处理和GC-MS检测获得总离子流图，经分析与对照组相比，萎锈灵处理下炭疽病菌C12菌丝内琥珀酸含量显著上调，上调了1.6倍(图8)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种基于代谢组学的杀菌剂作用机制研究方法，其特征在于，基于GC-MS技术对含杀菌剂和无药对照培养基上培养的病原菌菌丝进行代谢组检测，通过比较代谢组学研究法寻找差异代谢物，排除不同作用机制共有的代谢物，获得目标杀菌剂作用机制的特异性生物标志物，利用生物标志物含量的变化来实现对杀菌剂作用机制的识别及高通量分析；
其中，所述病原菌包括病原真菌和病原卵菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、菌丝培养、收集、灭活和保存；
S2、代谢组样品前处理和GC-MS检测；
S3、利用比较代谢组寻找生物标志物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1具体如下：
将病原菌的菌丝于固体培养基上于18～37℃培养～1～7d，菌落外缘沿同心圆打取菌饼，接至铺有玻璃纸的含有抑制菌丝生长20％～80％浓度杀菌剂的培养基平板上，对照组添加等量有机溶剂；用刮刀刮取玻璃纸上的菌丝培养物，去除接种的菌饼，收集至离心管中；将装有菌丝的离心管置于液氮中速冻3～5min灭活，获得的菌丝样品置于-80℃冰箱保存；
其中，所述固体培养基包括马铃薯葡萄糖琼脂PDA、V8A、酵母葡萄糖琼脂YGA、胡萝卜琼脂CA或燕麦粉琼脂培养基OA；
所述有机溶剂选自二甲基亚砜、甲醇、丙酮中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2具体如下：
S21、冷冻干燥及研磨破碎：灭活后的菌丝冷冻干燥后研磨，或采用球磨仪研磨破碎处理，得菌丝粉末；
S22、代谢物提取：称取30.0±0.2mg的菌丝粉末，加入1.8mL溶解0.1～100μg/mL内标物质的提取溶剂，采用涡旋振荡1min后，继续超声提取20min；
S23、离心干燥：将步骤S22中提取获得的代谢物溶液在4000～12000r/min下离心5～15min，弃去沉淀，得代谢物提取液；取0.6mL代谢物提取液至0.6mL离心管中，45℃抽真空离心干燥4～8h，直至质量恒定；
S24、衍生化：包括肟化或腙化以及三甲基硅烷化两步衍生化反应；
S25、GC-MS检测：采用HP-5MS毛细管柱，规格30m×0.25mm×0.25μm；进样体积1μL；流速1mL/min；程序升温；离子源温度为230～300℃，传输线温度为230～300℃；氦气为载气，恒流模式；采用EI电离源，全扫描扫描范围m/z 20～650，频率0.2s/scan；溶剂延迟时间5.9min。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S22中所述提取溶剂为甲醇和水混合溶液，甲醇与水的体积比为9.5:0.5-5:5；所述内标物质为水杨苷。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S24衍生化的操作步骤如下：
1)取100μL衍生化试剂1加入已离心干燥好的样品管中，封口，超声20min，涡旋1min溶解，稍微离心后30℃条件下进行肟化或腙化衍生化反应2h；
2)加入100μL的衍生化试剂2至样品管中，封口，超声20min，涡旋1min溶解，稍微离心，37℃条件下进行硅烷化衍生反应4～10h；
3)衍生化获得的样品在转速10000～15000r/min下离心15min，吸取上清液至GC样品玻璃管中，获得用于GC-MS检测的病原菌菌丝代谢物样品；
其中，步骤1)所述衍生化试剂1为甲氧基胺盐酸盐溶解于吡啶获得的溶液，浓度为10～40mg/mL；步骤2)所述衍生化试剂2选自三甲基氯硅烷、N,O-双三甲硅基乙酰胺、三甲基咪唑、N，O-双三甲硅基三氟乙酰胺、N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺、六甲基二硅胺烷、N-甲基-N-三甲硅基乙酰胺中的至少一种。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S3对GC-MS检测获得的杀菌剂处理组和无药对照组菌丝代谢组数据，采用PCA、PLS、OPLS和/或ANOVA分析筛选生物标志物，具体步骤如下：
(1)采用GC-MS数据分析软件根据代谢物质谱定量离子导出峰面积；
(2)采用ANOVA分析获得杀菌剂处理组与无药对照组菌丝中差异显著的代谢物；
(3)采用PCA、PLS和/或OPLS分析方法获得杀菌剂处理组与无药对照组差异较大的代谢物；
(4)对(2)和(3)分析结果交集中的代谢物采用质谱检索、质谱解析及标准物质保留时间和/或质谱图比对方法进行定性，获得杀菌剂作用相关代谢物；
(5)对不同类型的典型机制杀菌剂相关代谢物分析，排除不同作用机制共有的代谢物，筛选获得杀菌剂作用机制识别特异性生物标志物。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述杀菌剂为琥珀酸脱氢酶抑制剂，琥珀酸脱氢酶抑制剂作用机制特异生物标志物为琥珀酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述琥珀酸脱氢酶抑制剂包括啶酰菌胺、萎锈灵、氟吡菌酰胺。
10.琥珀酸脱氢酶抑制剂作用机制生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为琥珀酸。
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