CN104391060A - Gc-ms研究灰葡萄孢菌代谢组的样品前处理及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于气相色谱-质谱联用(GC-MS)研究灰葡萄孢菌代谢组的样品前处理方法和代谢组检测方法。本发明提供的对灰葡萄孢菌样品前处理方法如下：在铺有玻璃纸的PDA平板上培养灰葡萄孢菌，培养2～4d(优选3d)后收集菌丝，液氮灭活后超低温冰箱保存备用。冷冻研磨破碎菌丝样品，代谢组提取采用冷冻过的甲醇水混合物以使酶失活。离心干燥后，经过肟化(或腙化)和硅烷化两步衍生化反应后用于GC-MS检测。本发明还提供了利用GC-MS对上述样品进行的检测方法，检测条件如下：选用HP-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；进样量1μL；程序升温；离子源温度230℃，全扫描范围m/z20～650。采用本发明的提取及检测方法能得到重现性较好的代谢组检测结果。

Description

GC-MS研究灰葡萄孢菌代谢组的样品前处理及检测方法

技术领域

本发明提供了一种采用GC-MS分析技术研究灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)代谢组的样品前处理方法及检测方法，涉及微生物学和仪器分析技术领域。 

背景技术

随着人类基因组测序工作完成，基因功能的研究成为热点，各种“组学”相继出现，代谢组学继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后应运而生。与其它组学有所不同，代谢组学是研究生物体系(细胞，组织或生物体)受外部刺激所产生的所有代谢产物的变化的科学，因此代谢组学作为中心法则信息流的下游产物，往往更好地反映了生物体内动态的化学变化过程。 

草莓灰霉病是目前草莓生产中的重要病害之一，它常常造成草莓采后和储运过程中大量的经济损失。引发草莓灰霉病的病原菌灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)为子囊菌门葡萄孢属，其腐生能力强，寄主范围广，能侵染包括茄科、葫芦科、蔷薇科、豆科、葡萄科等中的200余种植物。病原菌主要以菌丝体在腐烂的植物残体中或者以菌核在土壤中越冬；翌年春季条件适宜时，越冬的菌丝体或菌核可以产生大量的分生孢子，可侵染植株叶片、花萼、果实等，借助气流、雨水、农事操作等完成再侵染。病原菌在0-10℃的低温条件下仍具有侵染活性，所以在低温高湿条件下常引起贮藏期果实的严重损失。 

对于灰葡萄孢菌菌丝样品的代谢组学进行研究，建立一种高效、快速、重现性好的代谢组样品前处理及检测方法，对于揭示灰葡萄孢菌生长发育密切相关的代谢信息，探索病原菌侵染植物过程中的重要代谢物及代谢过程，以及基于病原与寄主互作的研究结果分析和发现潜在的药物靶标等方面具有重要的意义。但目前有关灰葡萄孢菌代谢组学的研究国内外鲜有报道，尤其是基于GC-MS的代谢组检测，样品前处理和检测尚缺乏系统可靠的方法。 

虽然有关医学样品、植物样品和一些微生物样品国内外已有不少相关的代谢组分析方法的报道，但是，每一类生物样品的代谢组都要求建立有特殊针对性的前处理和检测方法，否则，获得的检测结果是不可靠的。关于灰葡萄孢菌的代谢组学研究，由于缺少相应的GC-MS分析方法，对使用何种物质作为内标不清楚，严重影响着分析系统的误差。笔者发现，文献报道中经常被用到的核糖醇、肌醇、1，3-丙二醇等内标物质在灰霉菌丝代谢组中均可被检出，不能用作灰葡萄孢菌代谢组分析的内标物质。而同位素类内标物质通常价格昂贵，需要寻找另外一种本底中不含有的物质作为内标来添加。此外，提取溶剂的选择决定了获得的代谢物的数目和丰度，衍生化反应试剂的选择和反应时间、温度等条件则对最终GC-MS的分析范围和方法的重现性具有重要的影响作用。而关于灰葡萄孢菌的代谢组分析中这些参数均有待于通过研究确定。 

发明内容

本发明的目的是提供一种基于GC-MS研究灰葡萄孢菌代谢组的样品前处理及检测方法。 

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于GC-MS研究灰葡萄孢菌代谢组菌丝样品的培养、收集、灭活和保存的方法。 

所述培养方法为：将灰葡萄孢菌的菌丝组织于PDA固体培养基上17℃～23℃培养(优选20℃)，将培养2～4d(优选3d)的灰葡萄孢菌落按同心圆外缘打取菌饼，接至铺有玻璃纸的PDA平板上，17℃～23℃(优选20℃)培养2～4d(优选3d)，得菌丝培养物； 

所述收集方法具有以下特征：用刮刀刮取玻璃纸上的菌丝培养物，去除接种的菌饼，收集至离心管中； 

所述灭活处理为：将装有菌丝的离心管置于液氮中速冻3～5min； 

所述保存方法为：将按上述方法培养、收集、灭活的菌丝样品用封口膜密封后，置于超低温冰箱保存(优选-80℃)。 

本发明还同时提供了对通过上述方法获得的灰葡萄孢菌菌丝样品进行代谢组提取、干燥和衍生化的方法。 

所述提取方法包括以下步骤： 

1)冷冻研磨破碎：灭活后的菌丝在液氮条件下研磨，或采用球磨仪研磨破碎处理，得菌丝粉末； 

2)代谢组提取：称取100.0±0.5mg的菌丝粉末，准确加入4mL溶解5μg/mL内标物质的提取溶剂，采用涡旋振荡1min后，继续超声提取20min； 

3)离心处理：将2)提取获得的代谢组溶液在4000～12000rpm(优选12000rpm)下进行离心5～15min(优选10min)，弃去沉淀，得代谢组提取液； 

所述的干燥方法为抽真空离心干燥，特点是准确移取0.6mL上清液至0.6mL离心管中，45℃抽真空离心干燥4～8h，直至质量恒定； 

所述的衍生化方法包括肟化(或腙化)和三甲基硅烷化两步衍生化反应，步骤如下： 

1)吸取100μL衍生化试剂1加入已离心干燥好的样品管中，封口，超声15min，涡旋1min溶解，稍微离心后30℃条件下肟化(或腙化)衍生化反应2h； 

2)加入100μL的衍生化试剂2至样品管中，封口，超声20min，稍微离心，37℃条件下硅烷化衍生反应4～10h(优选6h)； 

3)衍生化获得的样品在转速10000～15000r/min(优选12000r/min)下离心15min，吸取上清液至GC样品玻璃管中，获得用于GC-MS检测的灰葡萄孢菌菌丝代谢组样品。 

所述提取方法步骤2)所述提取溶剂为：甲醇与水混合溶液，甲醇与水混合体积比为9.5∶0.5～5∶5，优选8∶2； 

所述提取方法步骤2)所述内标物质为：水杨苷(D(-)-Salicin)； 

所述的衍生化方法步骤1)所述衍生化试剂1为：甲氧基胺盐酸盐溶解于吡啶获得的溶液，浓度为10～40mg/mL，优选20mg/mL； 

所述的衍生化方法步骤2)所述衍生化试剂2为：三甲基氯硅烷、N，O-双三甲硅基乙酰胺、三甲基咪唑、N，O-双三甲硅基三氟乙酰胺、N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺、六甲基二硅胺烷、N-甲基-N-三甲硅基乙酰胺中的任意一种。 

此外，本发明还同时提供了一种利用上述前处理方法获得的代谢组样品进行检测法的方法，其特征是： 

选用HP-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25m)；进样体积1μL；流速1mL/min；程序升温；离子源和传输线温度分别为230℃和280℃；氦气为载气，恒压模式；质谱EI电离源电子能量70eV，全扫描扫描范围m/z 20～650，频率0.2s/scan；溶剂延迟时间5.5min。 

为了实现对灰葡萄孢菌代谢组学的研究，本发明提供一种基于GC-MS研究灰葡萄孢菌代谢组学的样品前处理方法，包括样品的培养、收集、灭活及保存等，并对影响代谢物提取效果的四个因素(提取溶剂成分、提取剂用量)在多个水平上进行设计，从而找出了最适的代谢物提取方法。同时提供了一种适用于灰葡萄孢菌丝代谢组气质分析的内标物质和衍生化试剂组合，对影响检测结果准确性的衍生化条件(衍生时间和衍生温度)在多个水平上进行设计，从而找出了最适的代谢物衍生方法。 

本发明的优点是： 

1、在样品前处理方面，所采用的灰葡萄孢菌菌丝培养和收集过程最大程度的扣除了培养基质的干扰；液氮灭活配合低温有机溶剂提取确保了菌丝中相关酶系的灭活，保证了菌丝样品适时代谢组的获得；所选内标物可以降低灰葡萄孢菌丝代谢组GC-MS分析系统的误差；所用的衍生化方法可以检测到氨基酸、糖类、酚类、有机酸、萜烯类等代谢物质，最大程度地提供代谢组的信息。 

2、在样品检测方面，进行了各种影响因素组合效果的检测，得出了最适提取方法，并进一步优化了衍生条件，使色谱峰随保留时间得到有效分离且峰形质量好，可以达到目标峰峰面积的准确积分的要求，实例验证该方法操作快速简单、提取效率高、重现性好。 

附图说明

结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。 

图1本发明工艺流程图 

图2不同提取溶剂对菌丝代物提取效果典型TIC图 

图3提取溶剂剂量对灰葡萄孢菌S28菌丝代谢组分析的影响 

图4衍生化温度和时间对灰葡萄孢菌S28菌丝代谢组分析的影响 

图5灰葡萄孢菌S28菌丝代谢组GC-MS分析优化方法的重现性 

图6灰葡萄孢菌S28菌核代谢组典型TIC图 

具体实施方式

实施例1基于GC-MS对灰葡萄孢菌S28代谢组进行检测分析 

采用的工艺流程如图1所示，具体实施如下： 

一、基于GC-MS研究灰葡萄孢菌S28代谢组的样品前处理 

1)灰葡萄孢菌的培养 

取生长3d的灰葡萄孢菌S28的PDA培养基平板，在超净工作台中，用0.5cm打孔器沿着菌落外沿打取菌饼，用挑针挑取菌饼并接到铺有玻璃纸的固体PDA培养基平板上，19.5～20.5℃条件下培养3d，得菌丝培养物； 

2)灰葡萄孢菌菌丝收集：用灭菌的刮刀刮取玻璃纸上生长的菌丝培养物，去除接种的菌饼，收集于2mL离心管中。 

3)液氮灭活处理：将装有菌丝的离心管迅速置于液氮中速冻3～5min。 

4)菌丝样品保存：将按上述方法培养、收集、灭活的菌丝样品用封口膜密封后，置于-80℃冰箱保存。 

5)研磨破碎：取液氮灭活处理的菌丝样品，采用球磨仪以30次/s的频率研磨2min进行破碎处理，得菌丝粉末。 

6)不同溶剂对代谢组提取效果比较 

按照表1-1分别配制溶剂极性强、中、弱三种代谢组提取溶剂I、II和III： 

表1-1代谢组提取溶剂组成 

称取100.0±0.5mg的菌丝粉末于离心管中，分别加入1.5mL上述提取溶剂，得到灰葡萄孢菌三种不同极性溶剂的代谢组提取液，涡旋振荡1min后，继续超声提取20min。 

7)离心及干燥：将提取获得的代谢组溶液在12000rpm下进行离心10min， 

准确移取0.6mL上清液至离心管中，45℃抽真空离心干燥4h至质量恒定。 

8)衍生化 

包括N，O-双三甲硅基三氟乙酰胺和甲氧基胺盐酸盐两步衍生化反应： 

吸取100μL衍生化试剂甲氧基胺盐酸盐溶液(溶解于吡啶中，浓度20mg/mL)加入已离心干燥好的样品管中，封口，超声15min，涡旋1min溶解，稍微离心后30℃衍生化反应2h； 

加入100μL的衍生化试剂N，O-双三甲硅基三氟乙酰胺至样品管中，封口，超声20min， 稍微离心，37℃衍生化反应6h进行下述步骤3)； 

获得的衍生化样品在离心转速12000r/min下离心15min，吸取160μL至GC样品玻璃管中，获得用于GC-MS检测的灰葡萄孢菌菌丝代谢组样品。 

二、基于GC-MS研究灰葡萄孢菌S28代谢组的样品检测 

进行GC-MS检测，仪器型号为：气相为7890A，质谱为5975C。具体采用的检测条件为：HP-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；进样体积1μL；流速1mL/min；离子源和传输线温度分别为230℃和280℃；氦气为载气，恒压模式；质谱EI电离源70eV，全扫描扫描范围m/z 20～650，频率0.2s/scan；溶剂延迟时间5.5min。 

升温程序参数见表1-2： 

表1-2色谱柱梯度升温程序参数 

升温速度(℃/min)	温度(℃)	保持时间(min)
				65	2
5	185	0
			1	200	0
15	280	25

三、提取溶剂极性对灰葡萄孢菌代谢组检测结果的影响 

采用极性不同的提取溶剂I、II和III提取S82菌丝代谢组，经衍生化和GC-MS检测获得总离子流图如图2所示。 

经检测，提取溶剂I提取获得159个化合物，提取溶剂II获得127个化合物，提取溶剂III获得72个化合物。而且，提取溶剂II和III提取到的代谢物完全包含于提取溶剂I中。结果表明，不同的溶剂相比较，以极性最强的甲醇/水的供试组合获得代谢物质的数目最多，远大于乙酸乙酯提取到的代谢物数量，并且可以覆盖甲醇/乙酸乙酯和乙酸乙酯两种溶剂提取到的代谢物谱。 

通过NIST谱库检索，由供试甲醇/水的组合提取到的灰葡萄孢菌代谢组主要组成成分为葡萄糖、氨基酸、有机酸、酚类等物质。而乙酸乙酯提取代谢组的总离子流图上缺少的物质峰主要是一些氨基酸类和糖类物质，说明乙酸乙酯对氨基酸类和糖类物质提取效果差。 

实施例2基于GC-MS对灰葡萄孢菌S28菌丝代谢组进行检测分析 

采用的工艺流程和方法详见实施例1，其中GC-MS仪器型号为：气相为6890A，质谱为5973C。重点对提取溶剂剂量、衍生化2反应的温度和时间进行了优选试验。 

一、提取溶剂剂量对灰葡萄孢菌S28菌丝代谢组分析的影响 

采用提取溶剂I，按照表1-3的剂量分别对100.0±0.5mg的菌丝培养物进行代谢组的提取和检测，获得的典型总离子流图如图3所示。代谢物质峰强分析表明，在提取溶剂I供试的水 平1-3下，随提取溶剂剂量增加而提取效率增加，而水平4和5没有显著性差异。故推荐每100mg灰葡萄孢菌丝培养物以4mL甲醇/水＝80/20(v/v)进行提取，获得的代谢组提取效果最佳。 

表1-3提取溶剂I使用剂量水平 

二、基于GC-MS研究灰葡萄孢菌S28代谢组的样品检测 

采用4mL甲醇/水＝80/20(v/v)提取溶剂对100mg灰葡萄孢菌S28菌丝培养物进行代谢组的提取，获得的提取液经离心干燥和第一步衍生化反应(同实施例1)。在第二步衍生化反应过程中，设计系列反应温度和反应时间组合，根据代谢组各物质峰总离子流强度筛选最佳的组合。反应温度为37℃、50℃和70℃，反应时间为1h、2h、3h、4h、6h、8h和10h，详见表1-4。 

表1-4硅烷化衍生反应条件组合 

在不同时间和温度组合的衍生化条件下，GC-MS检测到的大部分代谢物质表现出相似的变化规律。以阿拉伯呋喃糖(Arabinofuranose)为例(图4)进行说明，在37℃反应温度下，1～3h内随着衍生化时间的增加，代谢物相对含量逐渐增加；而反应4h～10h内相对含量变化不显著。50℃和70℃反应条件下，大部分物质在经过2h反应后达到平衡，代谢物相对含量趋于稳定。而少数代谢物在较高反应温度50℃和70℃条件下，经过4h反应后发生了降解。 

根据上述衍生化条件对代谢物相对含量检测结果的影响分析，采用BSTFA进行衍生化反应过程中，推荐采用37℃衍生化4h～10h，或者在50℃或70℃下衍生化2～4h为宜。 

三、方法重现性分析 

基于GC-MS对灰葡萄孢菌S28代谢组进行检测分析，采用的工艺流程和方法详见实施例1，其中GC-MS仪器型号为：气相为6890A，质谱为5973C，提取溶剂剂量为4mL，衍生化2反应的温度为37℃，反应时间为6h。灰葡萄孢菌S28菌丝样品的TIC图见图5，5份平行样品的 谱图出峰保留时间和峰强重现性好，表明该方法稳定可靠、适用性强。 

实施例3灰葡萄孢菌S28菌核代谢组分析 

采用实施例1和2中所述的最佳方法分析灰葡萄孢菌S28菌核代谢组，具体如下： 

1)灰葡萄孢菌菌核的培养：取生长3d的灰葡萄孢菌S28的PDA培养基平板，25℃培养至菌丝长满皿后，20℃培养15d。 

2)灰葡萄孢菌菌核收集：挑取PDA平板上的菌核，称取100mg至2mL离心管中。 

3)液氮灭活处理：将装有菌核的离心管迅速置于液氮中速冻3～5min。 

4)菌核样品保存：将按上述方法培养、收集、灭活的菌核样品用封口膜密封后，置于-80℃冰箱保存。 

5)研磨破碎：取液氮灭活处理的菌核样品，采用球磨仪以30次/s的频率研磨2min进行破碎处理，得菌核粉末。 

6)溶剂提取：称取100.0±0.5mg的菌核粉末于离心管中，分别加入4mL上述提取溶剂，得到灰葡萄孢菌三种不同极性溶剂的代谢组提取液，涡旋振荡1min后，继续超声提取20min。 

7)离心及干燥：将提取获得的代谢组溶液在12000rpm下进行离心10min，准确移取0.6mL上清液至离心管中，45℃抽真空离心干燥4h至质量恒定。 

8)衍生化：吸取100μL衍生化试剂甲氧基胺盐酸盐溶液(溶解于吡啶中，浓度20mg/mL)加入已离心干燥好的样品管中，封口，超声15min，涡旋1min溶解，稍微离心后30℃衍生化反应2h； 

加入100μL的衍生化试剂N，O-双三甲硅基三氟乙酰胺至样品管中，封口，超声20min，稍微离心，37℃衍生化反应6h进行下述步骤； 

获得的衍生化样品在离心转速12000r/min下离心15min，吸取160μL至GC样品玻璃管中，获得用于GC-MS检测的灰葡萄孢菌菌核代谢组样品。 

9)GC-MS检测：仪器型号为气相为7890A，质谱为5975C。具体采用的检测条件为：HP-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；进样体积1μL；流速1mL/min；离子源和传输线温度分别为230℃和280℃；氦气为载气，恒压模式；质谱EI电离源70eV，全扫描扫描范围m/z20～650，频率0.2s/scan；溶剂延迟时间5.5min。 

所得结果具体如下：灰葡萄孢菌菌核样品的典型TIC图见图6，检测获得了157个代谢物峰，5份平行样品的谱图出峰保留时间和峰面积重现性好，表明该方法稳定可靠，适用性强，还可用于菌核样品的分析。 

Claims (5)

1.灰葡萄孢菌代谢组样品前处理方法，包括以下方法并依次进行：菌丝的培养、收集、灭活、保存、代谢组的提取、干燥和衍生化。

2.权利要求1所述灰葡萄孢菌菌丝样品的培养、收集、灭活和保存方法，其特征是：

所述培养方法为：将灰葡萄孢菌的菌丝组织于PDA固体培养基上17～23℃培养(优选20℃)，将培养2～4d(优选3d)的灰葡萄孢菌落按同心圆外缘打取菌饼，接至铺有玻璃纸的PDA平板上，17～23℃(优选20℃)培养2～4d(优选3d)，得菌丝培养物；

所述收集方法具有以下特征：用刮刀刮取玻璃纸上的菌丝培养物，去除接种的菌柄，收集至离心管中；

所述灭活处理为：将装有菌丝的离心管置于液氮中速冻3～5min；

所述保存方法为：将按上述方法培养、收集、灭活的菌丝样品用封口膜密封后，置于超低温冰箱保存(优选-80℃)。

3.权利要求1所述灰葡萄孢菌菌丝代谢组的提取、干燥和衍生化方法，其特征是：

所述提取方法包括以下步骤：

1)冷冻研磨破碎：灭活后的菌丝在液氮条件下研磨，或采用球磨仪研磨破碎处理，得菌丝粉末；

2)代谢组提取：称取100.0±0.5mg的菌丝粉末，准确加入4mL溶解5μg/mL内标物质的提取溶剂，采用涡旋振荡1min后，继续超声提取20min

3)离心处理：将2)提取获得的代谢组溶液在4000～12000rpm(优选12000rpm)下进行离心5～15min(优选10min)，弃去沉淀，得代谢组提取液；

所述的干燥方法为抽真空离心干燥，特点是准确移取0.6mL上清液至0.6mL离心管中，45℃抽真空离心干燥4～8h，直至质量恒定；

所述的衍生化方法包括肟化(或腙化)和三甲基硅烷化两步衍生化反应，步骤如下：

1)吸取100μL衍生化试剂1加入已离心干燥好的样品管中，封口，超声15min，涡旋1min溶解，稍微离心后30℃条件下肟化(或腙化)衍生化反应2h；

2)加入100μL的衍生化试剂2至样品管中，封口，超声20min，稍微离心，37℃条件下硅烷化衍生反应4～10h(优选6h)；

3)衍生化获得的样品在转速10000～15000r/min(优选12000r/min)下离心15min，吸取上清液至GC样品玻璃管中，获得用于GC-MS检测的灰葡萄孢菌菌丝代谢组样品。

4.权利要求3所述的提取溶剂、内标物质和衍生化反应所用的试剂组合：

所述提取溶剂为：甲醇与水混合溶液，甲醇与水混合体积比为9.5∶0.5～5∶5，优选8∶2；

所述的内标物质为：水杨苷(D(-)-Salicin)；

所述衍生化试剂1为：甲氧基胺盐酸盐溶解于吡啶获得的溶液，浓度为10～40mg/mL，优选20mg/mL；

所述的衍生化试剂2为：三甲基氯硅烷、N，O-双三甲硅基乙酰胺、三甲基咪唑、N，O-双三甲硅基三氟乙酰胺、N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺、六甲基二硅胺烷、N-甲基-N-三甲硅基乙酰胺中的任意一种。

5.利用如权利要求1-4所述方法获得样品进行的检测法，其特征是：

选用HP-5MS毛细管柱，程序升温，离子源和传输线温度分别为230℃和280℃，采用EI电离源，全扫描范围m/z20～650。