CN101717818B - 一种筛选产多不饱和脂肪酸微生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速筛选产多不饱和脂肪酸的方法，该方法以多不饱和脂肪酸合成的关键酶基因作为分子标记，基于PCR扩增技术快速定向筛选产多不饱和脂肪酸微生物，它根据已经报道的Δ6脂肪酸脱饱和酶(D6)和Δ5脂肪酸脱饱和酶基因(D5)的保守区设计引物，对从土壤或水体中分离得到的微生物依次进行扩增筛选，可以扩增出D6基因的微生物产GLA，可以同时扩增出D6和D5基因的产AA和EPA，然后对可以扩增出D6基因以及D6和D5基因的微生物进行发酵培养并提取脂肪酸，用GC和MS对微生物合成的脂肪酸进行分析，并最终确定产多不饱和脂肪酸的微生物。本发明为实现利用微生物发酵生产多不饱和脂肪酸提供了有效的菌种或藻种分离筛选方法及一批有效的出发菌株或藻种。
Description
技术领域
本发明属于微生物生物技术和生物制药技术领域，具体涉及一种筛选产多不饱和脂肪酸微生物的方法。
背景技术
多不饱和脂肪酸在机体内具有较广泛的生理功能和生物学效应，而且双键愈多，不饱和程度愈高，营养价值也愈高。多不饱和脂肪酸具有维护生物膜的结构和功能、治疗心血管疾病、抗炎、抗癌以及促进大脑发育、减肥、增加动物的产仔率和成活率等生理功能。多不饱和脂肪酸通常来源于高等植物、动物内脏和鱼油。但是，上述来源都存在产量不能满足市场需求、价格昂贵的不足，利用微生物发酵生产多不饱和脂肪酸是解决这些不足的一个有效方法。
利用微生物尤其是真菌或藻类生产多不饱和脂肪酸，首先要筛选产多不饱和脂肪酸的微生物。筛选产油脂菌株的初筛方法有多种，如脂肪粒计数法、苏丹III菌泥染色法、碳饥饿检出法等。碳饥饿检出法准确性较高，但过于繁琐；脂肪粒计数法虽简便，但缺乏准确性，使用时必须同时考虑脂肪粒的大小；苏丹III菌泥染色法虽然有较高的准确性，但需要显微镜观察，操作仍显繁琐，如果对几十株、上百株甚至上千株微生物都进行检测、筛选，将是一个十分耗时的工作。而且上述方法的一个共同缺点是不能定向快速高通量筛选产多不饱和脂肪酸的微生物，使用这些方法筛选到的含油脂菌株并不清楚是否含有所需要的目标多不饱和脂肪酸。
选育适于工业化生产的产脂菌株是一项十分艰巨和繁重的工作，因此，必须建立一个能准确、高通量、快速地把产目标多不饱和脂肪酸的菌株从所在的菌群中分离出来的初筛方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种筛选产多不饱和脂肪酸微生物的方法，该方法具有筛选量大、速度快、筛选率高、可定向筛选的优点，有助于更好地开发利用产多不饱和脂肪酸的微生物资源。
本发明提供的快速高通量筛选产多不饱和脂肪酸微生物的方法，包括以下步骤：
一种筛选产多不饱和脂肪酸微生物的方法，包括以下步骤：
第1步从土壤或水体中分离、纯化保藏真菌或藻类微生物；
第2步进行Δ6脂肪酸脱饱和酶(Delta6 Fatty Acid Desaturase，D6)基因片段的扩增检测：
第2.1步将第1步分离、纯化得到的微生物每株接种到30～100mL的土豆葡萄糖PDA液体培养基或f/2培养基中，18℃～30℃、120～220rpm培养3～7天，收集微生物，再提取微生物基因组DNA，然后以该微生物基因组DNA为模板，按照下述要求进行D6基因片段的扩增检测：
扩增检测使用的引物为简并引物， 序列为：D6-F5’-GGAAGG(A)AC(T)AAG(AT)CAC(T)AACA(G)C(T)T(G)CAC(T)CA -3’D6-R5’-TGGTTCA(T或C)C(T或A)G(C)GGTGGA(T)TTGAACTA-3’；
所述扩增检测中采用的PCR反应体系组成包括上述提取的微生物基因组DNA，25～200μM D6-F，25～200μM D6-R，50～200-dNTPs，5μL10×PCR反应缓冲液，0.5～2.5 units Taq DNA聚合酶，最后用灭菌ddH2O补足到50μL；
所述扩增检测中PCR扩增条件为：93℃～96℃、2～6min； 93℃～95℃、30sec～1min，50℃～60℃、30sec～1min，68℃～72℃、45sec～1min，共进行28～35个循环；之后，68℃～72℃再延伸6～10min；
第2.2步扩增检测所得到的产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，选择能够扩增出D6基因片段的微生物筛选组，继续进行分组筛选或对筛选组内的每个微生物进行D6基因片段的扩增检测；最终，通过琼脂糖凝胶电泳分析，收集所有能够扩增出D6基因片段的微生物，能够扩增到D6基因片段说明该微生物生产γ-亚麻酸(GLA)；
第3步.将第2步中得到的含有D6基因片段的微生物筛选组或单个微生物按下述条件进行Δ5脂肪酸脱饱和酶(Delta5 Fatty Acid Desaturase，D5)基因片段的扩增检测：
扩增检测D5基因片段使用的引物为简并引物，序列为：D5-F 5’-CAC(T)CACA(C)T(C)C(A)TAT(C)ACG(A或C)AAC(T)GT-3’D5-R 5’-GTG(T或C)A(G)C(T)C(G或T)CACCAC(T)CTG(C或T)TTCCC-3’
D5基因片段的扩增检测所采用的反应体系为标准的PCR反应体系，包括含有D6基因的微生物的基因组DNA，30～150μM D5-F，30～100μM D5-R，50～200μM dNTPs，5μL 10×PCR反应缓冲液，1～2.5units Taq DNA聚合酶，最后用灭菌ddH2O补足到50μL；
D5基因的扩增检测的PCR扩增条件为：93℃～96℃、2～6min；93℃～95℃、30sec～1min，50℃～55℃、45sec～1min，68℃～72℃、45sec～1.5min，共进行30～35个循环；之后，68℃～72℃再延伸6～9min；
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，最终收集扩增有D5基因片段的单个微生物，得到产花生四烯酸(AA)和二十碳五烯酸(EPA)的微生物。
本发明是关于以多不饱和脂肪酸合成的关键酶基因做分子标记(molecular markers)，基于PCR扩增技术快速、定向筛选产多不饱和脂肪酸微生物的方法。它根据已经报道的Δ6脂肪酸脱饱和酶(D6)和Δ5脂肪酸脱饱和酶(D5)基因的保守区设计引物，对从土壤或水体中分离得到的真菌或藻类依次进行扩增筛选，然后对可以扩增出D6基因以及D6和D5基因的微生物进行发酵培养，提取脂肪酸并甲酯化，用气相色谱(gas chromatography，GC)和质谱(mass spectroscopy，MS)对脂肪酸进行分析，并最终确定产γ-亚麻酸(GLA)、花生四烯酸(AA)和二十碳五烯酸(EPA)的微生物。
本发明的有益效果包括：(1)利用PCR技术，以多不饱和脂肪酸合成的关键酶基因D6和D5为分子标记，建立了一种快速有效的高通量定向筛选产多不饱和脂肪酸微生物的方法；(2)和传统筛选方法相比，几十个甚至上百个微生物的筛选只需3～5天的时间，而传统筛选方法因时间过长实际上有可能始终无法筛选获得所需的微生物，经过筛选后，只有少数几个微生物需要进一步用GC-MS等方法进行确定，极大地简化了筛选过程，提高了筛选效率，突破了传统筛选方法耗时费力却不易取得结果的不足；(3)相对于多不饱和脂肪酸合成的其它酶基因，应用D6和D5做分子标记筛选产多不饱和脂肪酸的微生物更具有判断性(diagnostic)，可以实现定向筛选，其中，含有D6基因的微生物可生产GLA，而含有D6和D5基因的可生产AA和EPA，相对于传统筛选方法只能了产油脂的微生物而言，该发明方法可明确知道微生物是否产所需的目标多不饱和脂肪酸；(4)通过该方法从土壤中快速筛选获得了8株产GLA的真菌，4株产AA和EPA的真菌；从海水中筛选到7种产GLA的藻类，4种产AA和EPA的藻类。
附图说明
图1为本发明方法的流程示意图。
具体实施方式
目前，多不饱和脂肪酸的生物合成途径已经清楚，AA和EPA合成的主要途径是，前体亚油酸(LA)与α-亚麻酸(ALA)经Δ6脱饱和步骤分别生成GLA和stearidonic acid(SDA)，负责这一反应的是Δ6脂肪酸脱饱和酶(D6)；然后由Δ6延长酶进行Δ6位特异的C2延长；再由Δ5脂肪酸脱饱和酶(D5)进行脱饱和，生成AA和EPA(Sprecher et al.，1995，J LipidRes，36：2471-2477)。所以，可根据已报道的D6和D5基因的保守区设计引物，基于PCR扩增技术筛选产多不饱和脂肪酸的微生物。对利用该方法筛选获得的微生物的发酵物进行GC-MS分析，结果表明，这些微生物可以产多不饱和脂肪酸。这些结果说明了该方法的可行性。
如图1所示，本发明方法的具体步骤包括：
1.微生物的分离、纯化和保藏
此步骤有两种实施方式，第一种方式是基于D6基因扩增对采集的各种样品进行初筛后，再对其中含有D6基因的样品进行各种微生物的分离、纯化和保藏；第二种方式是先直接对采集的各种样品分别进行微生物的分离、纯化和保藏。
第一种方式具体如下：取土样或水样，若是水样，则先对水体微生物进行富集，再使用微生物基因组提取试剂盒或SDS法或CTAB法或SDS-CTAB法提取样品中微生物基因组DNA，以提取的DNA为模版，进行Δ6脂肪酸脱饱和酶(Delta6 FattyAcid Desaturase，D6)基因片段的扩增检测，使用的引物为简并引物，序列为：
D6-F 5’-GGAAGG(A)AC(T)AAG(AT)CAC(T)AACA(G)C(T)T(G)CAC(T)CA-3’
D6-R 5’-TGGTTCA(T或C)C(T或A)G(C)GGTGGA(T)TTGAACTA-3’
所述扩增检测中采用的PCR反应体系组成包括提取的微生物基因组DNA，25～200μM D6-F，25～200μM D6-R，50～200μM dNTPs，5μL10×PCR反应缓冲液，0.5～2.5units Taq DNA聚合酶，最后用灭菌ddH2O补足到50μL；
所述扩增检测中PCR扩增条件为：93℃～96℃、2～6min；93℃～95℃、30sec～1min，50℃～60℃、30sec～1min，68℃～72℃、45sec～1min，共进行28～35个循环；之后，68℃～72℃再延伸6～10min；
扩增检测所得到的产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，若能够扩增出D6基因片段，则对该土样或水样中的真菌或藻类进行分离、纯化和保藏。
第二种方式，直接从采集到的土壤或水体样品中先分离、纯化真菌或藻类微生物，得到一系列真菌菌株或藻类进行保藏。
土壤微生物的分离、纯化具体步骤如下：
将土样放于无菌空培养皿内，喷洒无菌水保持高湿度，然后将表面灭好菌的诱物：黄瓜，土豆，黄豆，花生，胡萝卜等切成1cm3大小的小块，每皿3块，均匀放置于土上(使部分埋于土内)，见诱物上有菌丝体长出，立即移植到加入硫酸链霉素和青霉素钠的土豆葡萄糖琼脂(PDA)平板上培养，在18℃～30℃的培养箱中静置培养，根据微生物生长情况，采用菌丝顶端分离纯化法将形态不同的微生物分离到新的PDA培养基平板上。分离后的微生物在18℃～30℃培养传代并检测纯度，直至获得单克隆。纯化后的微生物接种到PDA斜面进行保藏，同时进行进行低温保藏。
从水体中分离、纯化藻类的具体方法如下：
把采集的海水喷洒在培养基平面上，形成分布均匀的薄层水珠。接种后，放在适宜的光、温条件下培养。培养基上长出互相隔离的藻类群落后，用消毒过的接种环将群落移植到另一平板培养基培养，然后再移植到装有f/2培养基并经过灭菌的小三角烧瓶中进行培养。
2.产多不饱和脂肪酸微生物的筛选
(1)D6基因的扩增检测
将上述步骤1中分离、纯化后保藏的微生物接种在30～100mL的PDA液体培养基或f/2培养基中，18℃～30℃、120～220rpm培养3～7天，将5～100株微生物混合在一起作为一组(若待筛选的微生物很多，也可以增加每组包含的微生物数目)，采用DNA提取试剂盒或SDS(十二烷基硫酸钠)法、CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)法、SDS-CTAB法等各种方法提取该组微生物基因组DNA，取该组微生物基因组DNA作为模板，进行D6基因片段的扩增检测。也可以将单个微生物分别提取DNA，然后每5～100株微生物基因组DNA作为一个筛选组(若筛选的微生物很多，也可以增加每个筛选组包含的微生物数目)，在每个筛选组中按每株微生物取0.1～0.5μL基因组DNA混合，得到混合微生物基因组DNA，取混合微生物基因组DNA作为模板，进行D6基因片段的扩增检测。所述D6基因片段的扩增检测方法同步骤1。
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，选择扩增有D6基因片段条带的微生物筛选组，继续进行筛选。若第一次筛出的筛选组包含的微生物数目较多，则将筛出的筛选组再次进行分组扩增检测D6基因片段，如此重复，直到每个筛选组包含有较少个数的微生物，再直接对筛选组内的每个微生物进行D6基因片段的扩增检测；若第一次筛出的筛选组包含的微生物数目较少，则可直接对筛选组内的每个微生物进行D6基因片段的扩增检测；通过对扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析，收集所有能够扩增出D6基因片段的微生物，能够扩增到D6基因片段说明该微生物产GLA，然后再对能扩增出D6基因片段的微生物进行D5基因的扩增筛选。
(2)D5基因的扩增检测
对能够扩增出D6基因片段的微生物再进行Δ5脂肪酸脱饱和酶(D5)基因片段的扩增检测。D5基因片段的扩增检测可以有两种方式。第一种方式：对上述步骤(1)中能扩增出D6基因片段的微生物筛选组进行Δ5脂肪酸脱饱和酶基因片段的扩增检测，选择能够扩增出D5基因片段的微生物筛选组，继续进行筛选。若筛选组包含的微生物个数较少，则直接对筛选组内的每个微生物进行D5基因片段的扩增检测；若筛选组包含的微生物数目较多，则再次分组扩增检测D5基因片段，直到每个筛选组包含的微生物较少时，再直接对筛选组内的每个微生物进行D5基因片段的扩增检测。第二种方式：对上述步骤(1)中能扩增出D6基因片段的单个微生物直接进行D5基因片段的扩增检测。
D5基因片段扩增检测所用引物为简并引物，序列为：
D5-F 5’-CAC(T)CACA(C)T(C)C(A)TAT(C)ACG(A或C)AAC(T)GT-3’
D5-R 5’-GTG(T或C)A(G)C(T)C(G或T)CACCAC(T)CTG(C或T)TTCCC-3’
反应体系采用标准的PCR反应体系，包括微生物基因组DNA，30～150μM D5-F和30～100μM D5-R，50～200μM dNTPs，5μL 10×PCR反应缓冲液，1～2.5units Taq DNA聚合酶，用灭菌ddH2O补足到50μL；
PCR扩增条件为：93℃～96℃、2～6min；93℃～95℃、30sec～1min，50℃～55℃、45sec～1min，68℃～72℃、45sec～1.5min，共进行30～35个循环；之后，68℃～72℃再延伸6～9min；
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，最终收集能够扩增出D5基因片段的单个微生物，即产AA和EPA的微生物，保藏后留作下一步分析。
3.微生物产多不饱和脂肪酸的分析
接种上述步骤2中筛选得到的有D6基因以及既有D6也有D5基因的真菌或藻类到200～500mL PDA液体培养基或f/2培养基中，18℃～30℃、120～220rpm条件下培养10～15天。收集培养的真菌或藻类，蒸馏水洗3遍，50℃烘干并研磨成粉，称取1g粉末置于10ml离心管中，用3ml石油醚(30-60沸程)抽提2次，蒸干溶剂，测定油脂含量。取油脂0.05g，置于10ml具塞试管中，加入0.5mol/L的KOH甲醇溶液1mL，60℃水浴中皂化15min，冷却后加入14％三氟化硼乙醚甲醇溶液2ml，于60℃水浴中振荡2min，放至室温，加入正己烷1ml，振荡，加入饱和氯化钠溶液1ml，静置，取上清液进样。使用安捷伦6890A/5973N气质联用仪进行检测，用GLA、AA和EPA标准品作为对照，气相检测条件如下：
色谱柱DB-Wax30m×0.25mm×0.25um
50∶1分流，1μL进样
载气H2，53kPa恒压
柱温180℃保持1min
180-200℃，25℃/min；200-230℃，3℃/min，230℃保持18min
质谱检测条件如下：
接口温度230℃，EI电离源，电子能量70eV，离子源温度230℃，四极杆温度150℃。
气相色谱结果显示，样品中有与标准品GLA、AA和EPA相一致的峰存在，使用质谱分析表明这些峰确实是GLA、AA和EPA的峰。气质联用分析的结果证实筛选得到的真菌或藻类能够产GLA或者AA和EPA。
使用GLA、AA和EPA标准品作为对照，气相色谱显示有GLA、AA和EPA的峰存在，质谱分析表明这些峰确实是GLA、AA和EPA的峰。这些结果说明筛选得到的真菌或藻类能够产GLA或者AA和EPA。
下面通过借助实施例将更加详细说明本发明，且以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施例的限制。
[实施例1]
从华中科技大学喻珈山采集土壤，用清洁工具铲去表土，取5-15cm处土壤约150克装在灭菌瓶里。采得的土样用土壤微生物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，以提取的DNA为模版，进行D6基因片段扩增。PCR反应体系组成包括提取的微生物基因组DNA，50μM D6-F和50μM D6-R，100μM dNTPs，5μL 10×PCR反应缓冲液，1units Taq DNA聚合酶，用灭菌ddH2O补足到50μL。PCR扩增条件为：94℃、6min；94℃、1min，50℃、45sec，72℃、1min共进行32个循环；之后，72℃再延伸8min。琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，土样DNA中有D6基因。
采用常规的微生物分离方法对采集的土样的微生物进行分离。将土样放于无菌空培养皿内，放入诱物，见诱物上有菌丝体长出，立即移植到加入链霉素和青霉素的PDA平板上培养。在22℃的培养箱中静置培养，根据微生物生长情况，采用菌丝顶端分离纯化法分离、纯化获得132株微生物。
132株微生物分别接种到50mL的PDA液体培养基，20℃、120rpm培养3天，采用SDS-CTAB法提取微生物基因组DNA，40株微生物基因组DNA各0.2μL混合为一个筛选组，有A、B两组，另有一个包含52株微生物基因组DNA各0.2μL的C筛选组。以混合微生物基因组DNA为模板进行D6基因片段扩增。
PCR反应体系组成包括用于一个筛选组的混合微生物基因组DNA，50μM D6-F和50μM D6-R，100μM dNTPs，5μL10×PCR反应缓冲液，1unitsTaq DNA聚合酶，用灭菌ddH2O补足到50μL。
PCR扩增条件为：94℃、6min；94℃、1min，50℃、45sec，72℃、1min共进行32个循环；之后，72℃再延伸8min。
琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，其中B筛选组和C筛选组可以扩增出和预计大小相同的约600bp的D6基因片段。
对R筛选组微生物再次进行分组，每10株微牛物基因组DNA为一个筛选组，有B1-B4共4个筛选组；对C筛选组微生物再次进行分组，每10株微生物基因组DNA为一个筛选组，有C1-C44个筛选组和一个包含12株微生物基因组DNA的筛选组C5，依上述D6扩增条件进行扩增，琼脂糖凝胶电泳分析后发现：B2和C4两个筛选组可以扩增出和预计大小相同的约600bp的D6基因片段。
分别以B2和C4两个筛选组的20株微生物基因组DNA为模板，依上述D6基因扩增条件进行扩增，琼脂糖凝胶电泳分析后发现，其中有5株微生物的基因组DNA可以扩增出和预计大小相同的约600bp的D6基因片段。
对上述能够扩增出D6基因的B筛选组和C筛选组微生物进行D5基因的扩增检测。对B筛选组微生物再次进行分组，每10株微生物基因组DNA为一个筛选组，有B1-B4共4个筛选组；对C筛选组微生物再次进行分组，每10株微生物基因组DNA为一个筛选组，有C1-C44个筛选组和一个包含12株微生物基因组DNA的筛选组C5，对这些筛选组进行D5基因片段的扩增检测。
PCR反应体系组成包括20ng混合微生物基因组DNA，50μM D5-F和50μM D5-R，100μM dNTPs，5μL 10×PCR反应缓冲液，1units Taq DNA聚合酶，用灭菌ddH2O补足到50μL。
PCR扩增条件为：94℃、5min；94℃、1min，50℃、1min，72℃、1min，共进行32个循环；之后，72℃再延伸8min。
经琼脂糖凝胶电泳分析发现，其中C4组可以扩增出D5基因片段。分别以C4筛选组的10株微生物基因组DNA为模板，依上述D5基因扩增条件进行扩增，琼脂糖凝胶电泳分析后发现，有2株微生物的基因组DNA能够扩增出与预计大小相同的约300bp的D5基因片段。将含有D6基因及D5基因的2株微生物接种到400mL PDA液体培养基中，20℃、120rpm条件下培养10天，提取脂肪酸并进行GC-MS分析，结果表明，2株微生物可以产AA和EPA，同时产GLA；3株只产GLA。
SDS-CTAB法提取微生物基因组DNA方法：
称取0.5g烘干的微生物，液氮研磨，在研磨的过程中加少量的石英砂。研磨成均匀粉状后加入到预热的700μL提取缓冲液[100mmol/L Tris(三羟基氨基甲烷)-HCL，pH 8.0；50mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸二钠盐)，pH8.0；1.0mol/L NaCL；2％SDS；2％PVP40(聚乙烯基吡咯烷酮40)]中，加100μL β-mercaptoethanol(β-巯基乙醇)，振荡混匀，于65℃水浴1h左右。加人1/3体积的5mol/L KAC(pH 4.8)，-20℃冰浴0.5-1h。4℃，12000r/min离心10min。取上清，加人1/5体积的2×CTAB(100mmol/L Tris-HCL，pH 8.0；20mmol/LEDTA；1.4mol/L NaCL；2％CTAB)，充分混匀，65℃水浴10-20min。冷却至室温后，加人等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提3次，4℃，12000r/min离心10min。取上清，加入2/3体积的预冷的异丙醇，充分混匀，-20℃放置0.5-1h，12000r/min 4℃离心10min。去上清，用70％乙醇洗涤沉淀2次。风干沉淀，加50μL灭菌水溶解，4℃保存备用。
[实施例2]
从华中农业大学校园花圃采集土壤。采用常规的微生物分离方法对土壤中的微生物进行分离。将土样放于无菌空培养皿内，放入诱物，见诱物上有菌丝体长出，立即移植到加入链霉素和青霉素的PDA平板上培养。在22℃的培养箱中静置培养，根据微生物生长情况，采用菌丝顶端分离纯化法分离、纯化获得35株微生物。
35株微生物分别接种到40mL的PDA液体培养基，25℃、160rpm培养5天，提取这些微生物的基因组DNA，各取0.3μL进行分组筛选，每10株微生物基因组DNA为一个筛选组，有A、B两组，另有一个包含15株微生物基因组DNA的C筛选组。以混合微生物基因组DNA为模板进行D6基因片段扩增。
PCR反应体系组成包括用于一个筛选组的混合微生物基因组DNA、75μM D6-F、75μM D6-R、150μM dNTPs、5μL 10×PCR反应缓冲液、2unitsTaq DNA聚合酶，用灭菌ddH2O补足到50μL。
PCR扩增条件为：95℃、4min；93℃、45sec，53℃、30sec，72℃、1min，共进行35个循环；之后，68℃再延伸7min。
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析表明，其中B筛选组可以扩增出和预计大小相同的约600bp的D6基因片段。
依上述D6基因扩增条件，对B筛选组的10株微生物基因组DNA分别进行D6基因的扩增，琼脂糖凝胶电泳分析后发现，有2株微生物的基因组DNA可以扩增出和预计大小相同的约600bp的D6基因片段。
之后，对这2株微生物进行D5基因片段的扩增。PCR反应体系组成包括50ng微生物基因组DNA，75μM D5-F和75μM D5-R，150μM dNTPs，5μL 10×PCR反应缓冲液，1.5units Taq DNA聚合酶，用灭菌ddH2O补足到50μL。
PCR扩增条件为：95℃、4min；93℃、1min，55℃、45sec，68℃、1.2min，共进行35个循环；之后，68℃再延伸7min。
经琼脂糖凝胶电泳分析发现，这两株微生物可以扩增出与预计大小相同的约300bp的D5基因片段。将这1株微生物接种到300mL PDA液体培养基中，25℃、160rpm条件下培养10天后，提取脂肪酸并进行GC-MS分析，结果表明，这两株微生物可以产AA和EPA，同时产GLA。
[实施例3]
从武汉市洪山区花山镇菜园采集土壤，采用常规的微生物的分离法分离微生物。无菌条件下，挑取0.1-0.25mg土粒放在加入抗生素的PDA平板表面，每皿放置3处，呈三角形。30℃、220rpm培养5天，，见有菌丝长出，立即移植到加入链霉素和青霉素的PDA平板上培养。根据微生物生长情况，采用菌丝顶端分离纯化法分离、纯化获得42株微生物。
42株微生物分别接种到60mL的PDA液体培养基，30℃、220rpm培养5天，提取这些微生物的基因组DNA，各取0.5μL进行分组筛选，每5株微生物基因组DNA为一个筛选组，有A～H共8组，其中H组7株，以混合微生物基因组DNA为模板进行D6基因片段扩增。
PCR反应体系组成包括用于一个筛选组的混合微生物基因组DNA，200μM D6-F，200μM D6-R，200μM dNTPs，5μL 10×PCR反应缓冲液，2.5units Taq DNA聚合酶，用灭菌ddH2O补足到50μL。
PCR扩增条件为：96℃、3min；94℃、1min，58℃、1min，68℃、1min，共进行35个循环；之后，68℃再延伸10min。
凝胶电泳检测分析，其中有B、E筛选组可以扩增出和预计大小相同的约600bp的D6基因片段。
依上述D6扩增条件，对B、E筛选组共10株微生物基因组DNA分别进行D6基因的扩增，琼脂糖凝胶电泳分析后发现，有2株微生物的基因组DNA可以扩增出和预计大小相同的约600bp的D6基因片段。
对这2株微生物进行D5基因的扩增。PCR反应体系组成包括80ng微生物基因组DNA，100μM D5-F，100μM D5-R，200μM dNTPs，5μL10×PCR反应缓冲液，2units Taq DNA聚合酶，用灭菌ddH2O补足到50μL。
PCR扩增条件为：95℃、5min；94℃、55sec，53℃、1min，72℃、1.5min，共进行35个循环；之后，72℃再延伸9min。
经琼脂糖凝胶电泳分析发现，这两株微生物可以扩增出与预计大小相同的约300bp的D5基因片段。将这2株微生物接种到500mL PDA液体培养基中，30℃、220rpm条件下培养12天后，提取脂肪酸并进行GC-MS分析，结果表明，这2株微生物可以产AA和EPA，同时产GLA。
[实施例4]
从上海附近海域采集海水水样，采用平板分离法分离藻种。把采集的海水喷洒在培养基平面上，形成分布均匀的薄层水珠。接种后，放在适宜的光、温条件下培养。培养基上长出互相隔离的藻类群落后，用消毒过的接种环将群落移植到另一平板培养基培养，然后再移植到装有f/2培养基并经过灭菌的小三角烧瓶中进行培养。共分离到27株藻类。27株藻类分别接种到30mL的f/2培养基中，24℃、170rpm培养4天，提取这些藻类的基因组DNA，各取0.2μL进行分组筛选，每7株微生物基因组DNA为一个筛选组，有A～D共4组，其中D组6株，以混合微生物基因组DNA为模板进行D6基因片段扩增。
PCR反应体系组成包括用于一个筛选组的混合微生物基因组DNA、150μM D6-F、150μM D6-R、50μM dNTPs、5μL 10×PCR反应缓冲液、1units Taq DNA聚合酶，用灭菌ddH2O补足到50μL。
PCR扩增条件为：94℃、4min；93℃、1min，53℃、45sec，72℃、1min，共进行33个循环；之后，68℃再延伸6min。
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析表明，其中A、C、D筛选组可以扩增出和预计大小相同的约600bp的D6基因片段。
依上述D6扩增条件，对A、C、D筛选组的20个藻类基因组DNA分别进行D6基因的扩增，琼脂糖凝胶电泳分析后发现，有5株藻类的基因组DNA可以扩增出和预计大小相同的约600bp的D6基因片段。
之后，对这5株藻类进行D5基因片段的扩增。PCR反应体系组成包括40ng微生物基因组DNA，30μM D5-F和30μM D5-R，75μM dNTPs，5μL 10×PCR反应缓冲液，1units Taq DNA聚合酶，用灭菌ddH2O补足到50μL。
PCR扩增条件为：93℃、5min；93℃、45sec，55℃、1min，72℃、1min，共进行33个循环；之后，72℃再延伸7min。
经琼脂糖凝胶电泳分析发现，有2株藻类可以扩增出与预计大小相同的约300bp的D5基因片段。将筛选到的含D6基因以及含D6和D5基因的藻类接种到300mL f/2培养基中，24℃、170rpm条件下培养6天后，提取脂肪酸并进行GC-MS分析，结果表明，只含D6基因的藻类只产GLA，而同时含D6及D5基因的藻类可以产AA和EPA。
[实施例5]
从青岛附近海域采集海水水样，将海水样品中的微生物进行富集，采用SDS-CTAB法提取富集后的微生物的DNA，以提取的DNA为模板进行D6基因片段扩增。
PCR反应体系组成包括用于一个筛选组的混合微生物基因组DNA、25μM D6-F、25μM D6-R、75μM dNTPs、5μL 10×PCR反应缓冲液、0.5unitsTaq DNA聚合酶，用灭菌ddH2O补足到50μL。
PCR扩增条件为：93℃、2min；95℃、0.5min，60℃、30sec，68℃、45sec，共进行28个循环；之后，72℃再延伸6min。
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析表明，从提取的DNA中能够扩增到D6基因片段。
采用平板分离法分离海水水样中的藻种。把采集的海水喷洒在培养基平面上，形成分布均匀的薄层水珠。接种后，放在适宜的光、温条件下培养。培养基上长出互相隔离的藻类群落后，用消毒过的接种环将群落移植到另一平板培养基培养，然后再移植到装有f/2培养基并经过灭菌的小三角烧瓶中进行培养。共分离到46株藻类。46株藻类分别接种到100mL的f/2培养基中，18℃、220rpm培养7天，提取这些藻类的基因组DNA，各取0.1μL进行分组筛选，每9株微生物基因组DNA为一个筛选组，有A～E共5组，其中E组10株，以混合微生物基因组DNA为模板进行D6基因片段扩增，扩增检测的条件同上述。
其中B、C、E筛选组可以扩增出和预计大小相同的约600bp的D6基因片段。
依上述D6扩增条件，对B、C、E筛选组的28个藻类基因组DNA分别进行D6基因的扩增，琼脂糖凝胶电泳分析后发现，有7株藻类的基因组DNA可以扩增出和预计大小相同的约600bp的D6基因片段。
之后，对这7株藻类进行D5基因片段的扩增。PCR反应体系组成包括40ng微生物基因组DNA，150μM D5-F和150μM D5-R，50μM dNTPs，5μL 10×PCR反应缓冲液，2.5units Taq DNA聚合酶，用灭菌ddH2O补足到50μL。
PCR扩增条件为：96℃、2min；95℃、30sec，52℃、50sec，72℃、45sec，共进行30个循环；之后，68℃再延伸6min。
经琼脂糖凝胶电泳分析发现，有3株藻类可以扩增出与预计大小相同的约300bp的D5基因片段。将筛选到的含D6基因以及含D6和D5基因的藻类接种到300mL f/2培养基中，18℃、170rpm条件下培养8天后，提取脂肪酸并进行GC-MS分析，结果表明，只含D6基因的藻类只产GLA，而同时含D6及D5基因的藻类可以产AA和EPA。
Claims (4)
1.一种筛选产多不饱和脂肪酸微生物的方法，包括以下步骤：
第1步从土壤或水体中分离、纯化保藏真菌或藻类微生物；
第2步进行Δ6脂肪酸脱饱和酶(Delta6Fatty Acid Desaturase，D6)基因片段的扩增检测：
第2.1步将第1步分离、纯化得到的微生物每株接种到30～100mL的土豆葡萄糖PDA液体培养基或f/2培养基中，18℃～30℃、120～220rpm培养3～7天，收集微生物，再提取微生物基因组DNA，然后以该微生物基因组DNA为模板，按照下述要求进行D6基因片段的扩增检测：
扩增检测使用的引物为简并引物，序列为：D6-F 5’-GGAAGG(A)AC(T)AAG(AT)CAC(T)AACA(G)C(T)T(G)CAC(T)CA -3’D6-R 5’-TGGTTCA(T或C)C(T或A)G(C)GGTGGA(T)TTGAACTA-3’；
所述扩增检测中采用的PCR反应体系组成包括上述提取的微生物基因组DNA，25～200μM D6-F，25～200μM D6-R，50～200μM dNTPs，5μL10×PCR反应缓冲液，0.5～2.5units Taq DNA聚合酶，最后用灭菌ddH2O补足到50μL；
所述扩增检测中PCR扩增条件为：93℃～96℃、2～6min；93℃～95℃、30sec～1min，50℃～60℃、30sec～1min，68℃～72℃、45sec～1min，共进行28～35个循环；之后，68℃～72℃再延伸6～10min；
所述提取微生物基因组DNA的过程为下述二种方式之一：
方式一：将微生物分组，并将每组内微生物混合在一起，再提取该组微生物基因组DNA；
方式二：将单个微生物分别提取基因组DNA，然后将微生物基因组DNA分成筛选组，在每个筛选组中按每株微生物取0.1～0.5μL基因组DNA混合，得到混合的微生物基因组DNA；
第2.2步扩增检测所得到的产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，选择能够扩增出D6基因片段的微生物筛选组，继续进行分组筛选或对筛选组内的每个微生物进行D6基因片段的扩增检测；最终，通过琼脂糖凝胶电泳分析，收集所有能够扩增出D6基因片段的微生物，能够扩增到D6基因片段说明该微生物生产γ-亚麻酸(GLA)；
第3步.将第2步中得到的含有D6基因片段的微生物筛选组或单个微生物按下述条件进行Δ5脂肪酸脱饱和酶(Delta5Fatty Acid Desaturase，D5)基因片段的扩增检测：
扩增检测D5基因片段使用的引物为简并引物，序列为：D5-F 5’-CAC(T)CACA(C)T(C)C(A)TAT(C)ACG(A或C)AAC(T)GT-3’D5-R 5’-GTG(T或C)A(G)C(T)C(G或T)CACCAC(T)CTG(C或T)TTCCC-3’
D5基因片段的扩增检测所采用的反应体系为标准的PCR反应体系，包括含有D6基因的微生物的基因组DNA，30～150μM D5-F，30～100μM D5-R，50～200μM dNTPs，5μL10×PCR反应缓冲液，1～2.5units Taq DNA聚合酶，最后用灭菌ddH2O补足到50μL；
D5基因的扩增检测的PCR扩增条件为：93℃～96℃、2～6min；93℃～95℃、30sec～1min，50℃～55℃、45sec～1min，68℃～72℃、45sec～1.5min，共进行30～35个循环；之后，68℃～72℃再延伸6～9min；
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，最终收集扩增有D5基因片段的单个微生物，得到产花生四烯酸(AA)和二十碳五烯酸(EPA)的微生物。
2.根据权利要求1所述的筛选产多不饱和脂肪酸微生物的方法，其特征在于：第1步是直接对采集的各种样品分别进行微生物的分离、纯化和保藏。
3.根据权利要求1所述的筛选产多不饱和脂肪酸微生物的方法，其特征在于：第1步先采用第2步中所述的扩增检测方式进行基于D6基因片段的扩增，对采集的各种样品进行初筛，再对其中含有D6基因片段的样品进行各种微生物的分离、纯化和保藏。
4.根据权利要求1所述的筛选产多不饱和脂肪酸微生物的方法，其特征在于：第3步中，对步骤2中能扩增出D6基因片段的微生物筛选组进行D5基因片段的扩增检测，并对能扩增出D5基因片段的微生物筛选组再次分组进行D5基因片段的扩增筛选或逐株进行D5基因片段的扩增筛选。
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