CN103266064B

CN103266064B - 一株降解金霉素的草酸青霉lj302

Info

Publication number: CN103266064B
Application number: CN201310035163.9A
Authority: CN
Inventors: 李艳菊; 杨正礼; 肖思颖
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2013-01-30
Filing date: 2013-01-30
Publication date: 2015-01-07
Anticipated expiration: 2033-01-30
Also published as: CN103266064A

Abstract

本发明涉及一株能够降解金霉素的草酸青霉LJ302，属于微生物技术领域。将其命名为草酸青霉（Penicillium oxalicum）LJ302。该菌株已于2012年12月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7019。本发明菌株LJ302的rDNA-ITS序列由572个碱基组成。菌株LJ302能在金霉素为唯一碳源的培养基中生长，对废弃物中残留的金霉素具有较好的降解作用。

Description

一株降解金霉素的草酸青霉LJ302

技术领域

本发明涉及一株能够降解金霉素的草酸青霉（Penicillium oxalicum）LJ302，属于微生物技术领域。

背景技术

金霉素属四环素类药物，主产我国，属于一种广谱性抗生素，主要抑制敏感微生物的蛋白质合成，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、螺旋体、立克次氏体、支原体、衣原体、部分原虫等有抑制作用，在医药、畜牧业等领域具有较广的用途。

在金霉素发酵生产过程中，会产生大量含有金霉素残留的菌渣和废水，若处理不当进入环境,将会对生态环境和和人类健康造成潜在危害。目前，金霉素废弃物的生物脱毒处理已成为生产企业亟待解决的重大问题。与此同时，金霉素菌渣中蛋白质含量较高，同时含有矿物质等多种营养成分，资源化利用潜力巨大。筛选并利用高效降解金霉素的微生物菌株，应用于企业废弃物与环境中金霉素污染修复处理，不仅可以减少金霉素对环境的危害，同时，可为菌渣的资源化利用和变废为宝提供基础条件。

目前，国内外对金霉素降解菌株的筛选以及利用高效菌株降解金霉素废弃物的研究报导极少。而有关草酸青霉降解金霉素方面的研究，国内外尚未见到报导。

发明内容

本发明的目的在于提供一株金霉素降解菌株草酸青霉LJ302以及基因。

本发明所提供的金霉素降解菌株LJ302，为草酸青霉（Penicilliumoxalicum）。该菌株已于2012年12月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏号为：CGMCC No.7019。

本发明的一株金霉素降解菌株LJ302的基因，是草酸青霉（Penicilliumoxalicum）LJ302的rDNA-ITS基因，通过基因组DNA的提取，rDNA-ITS序列的扩增，rDNA-ITS全序列测定和分析而获得。该菌株rDNA-ITS全序列如下：

GAACCTGCGG AAGGATCATT ACCGAGTGAG GGCCCTCTGG GTCCAACCTC CCACCCGTGT 60

TTATCGTACC TTGTTGCTTC GGCGGGCCCG CCTCACGGCC GCCGGGGGGC ATCCGCCCCC 120

GGGCCCGCGC CCGCCGAAGA CACACAAACG AACTCTTGTC TGAAGATTGC AGTCTGAGTA 180

CTTGACTAAA TCAGTTAAAA CTTTCAACAA CGGATCTCTT GGTTCCGGCA TCGATGAAGA 240

ACGCAGCGAA ATGCGATAAG TAATGTGAAT TGCAGAATTC AGTGAATCAT CGAGTCTTTG 300

AACGCACATT GCGCCCCCTG GTATTCCGGG GGGCATGCCT GTCCGAGCGT CATTGCTGCC 360

CTCAAGCACG GCTTGTGTGT TGGGCTCTCG CCCCCCGCTT CCGGGGGGCG GGCCCGAAAG 420

GCAGCGGCGG CACCGCGTCC GGTCCTCGAG CGTATGGGGC TTCGTCACCC GCTCTGTAGG 480

CCCGGCCGGC GCCCGCCGGC GAACACCATC AATCTTAACC AGGTTGACCT CGGATCAGGT 540

AGGGATACCC GCTGAACTTA AGCATATCAA TA 572

上述rDNA-ITS序列由572个碱基（bp）组成。

本发明中的菌株LJ302的菌落形态特征为：在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上培养3天，菌落直径为10-18mm，菌落中心草绿色至深绿色，表面常分泌出水珠，边缘菌丝白色呈绒毛状，菌落背面为浅肉色。该菌株在显微镜下观察，菌丝细胞丝状交织，有横隔，从菌丝体上生出分生孢子梗，具青霉属典型的帚状枝，最末级的小枝上生出成串的分生孢子，分生孢子椭圆形，光滑。

本发明中的金霉素降解菌株LJ302能够在以金霉素为唯一碳源的培养基中生长，在金霉素浓度为100mg/L-5000mg/L的浓度条件下生长较好；菌株LJ302在以金霉素为唯一碳源且金霉素浓度为500mg/L的液体培养基中进行培养，该菌株对金霉素的降解率可达84.26%。

本发明中的菌株LJ302对金霉素生产废水中的金霉素有一定的去除效果，接种菌株LJ302于金霉素生产废水中培养2天，废水中金霉素去除率比对照提高了25.64%。

本发明中的菌株LJ302对金霉素菌渣中残留的金霉素具有较好的降解作用，且对菌渣具有较好的适应性，将其接种到新鲜的菌渣中能快速生长，7天时对金霉素的降解率可达90.42%。该菌株可应用于金霉素生产企业废弃物的处理并可望应用于周边污染环境的生物修复。

本发明的有益效果：

本发明从金霉素生产企业的废弃物中筛选得到一株金霉素降解菌株LJ302，该菌株可以在以金霉素为唯一碳源的培养基中较好生长。菌株LJ302适生范围较广，能在新鲜的金霉素菌渣中快速生长，对菌渣中残留的金霉素具有较好的降解作用。同时，该菌株具有降解废水中残留金霉素的作用，可应用于金霉素生产企业废弃物的处理，也可望应用于金霉素污染环境的生物修复。另外，菌株LJ302还可作为金霉素降解菌剂的制备原料。

附图说明

图1为金霉素降解菌株LJ302的rDNA-ITS片段PCR产物凝胶电泳图（从左向右第一泳道为LJ302的ITS序列的PCR产物，第二泳道为Marker）；

图2为金霉素降解菌株LJ302的菌落形态图；

图3为金霉素降解菌株LJ302的菌丝显微形态图；

图4为金霉素降解菌株LJ302的孢子显微形态图。

具体实施方式

实施例1

1.一株降解金霉素的草酸青霉LJ302的筛选方法

1.1材料准备

菌样品来源：采自金霉素生产企业废弃物。

无机盐固体培养基：(NH4)₂SO₄2.00g，K₂HPO₄0.50g，KH₂PO₄0.50g，MgSO₄·7H2O0.50g，NaCl0.20g，CaCl₂0.1g，FeSO₄0.01g，EDTA0.015g，琼脂13.00g，葡萄糖2.00g/L，溶于1000ml蒸馏水中。115℃灭菌20min后，在超净工作台中添加2.00g/L金霉素。

马丁氏培养基：蛋白胨6.0g，葡萄糖10.0g，KH₂PO₄1.0g，MgSO₄·7H2O0.5g，溶于1000ml蒸馏水中。115℃灭菌20min。

选择培养基：(NH4)₂SO₄2.00，K₂HPO₄0.50，KH₂PO₄0.50，MgSO₄·7H2O0.50，NaCl0.20，CaCl₂0.10，FeSO₄0.01g，EDTA0.015g，溶于1000ml蒸馏水中。115℃灭菌20min，待冷却后，分别添加0.1g/L、1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L、4.0g/L、5.0g/L、10.0g/L金霉素。

1.2实验仪器与设备

岛津LC-20A高效液相色谱仪、HZQ-F160全温振荡培养箱、TG16-W高速离心机、LDZX-30KBS高压灭菌锅、Mettler Toledo ML204分析天平、YT-CJ-1ND超净工作台、Mettler Toledo pH计、SB3200DT超声波清洗机、DHP-9082电热恒温培养箱、Nicon Eclipse80i荧光显微镜、DNA Engine PCR仪、DcodeTM变性梯度凝胶电泳仪、BOSCH冰箱、ChampGel-3200凝胶成像系统等。

1.3菌株筛选

操作步骤如下：

1）菌株分离与纯化

采集金霉素菌渣与金霉素废水多份，分别吸取200μl菌渣浸出液与废水200μl，依次涂布于无机盐固体培养基上，置于28℃-30℃条件下遮光培养2-7天，挑选单菌落，在无机盐固体培养基上划线分离纯化。此步骤重复2-3次，直至得到单一菌落。

2）高效降解金霉素菌株的筛选

将步骤1）中得到的单菌落挑起依次接入马丁氏培养基中，置于28-30℃，170r/min震荡条件下培养2-3天，然后按2%的接种量转接到选择培养基中，在上述相同条件下进行暗培养，在第3天和第6天取样，用高效液相色谱法测定各个单一菌落对金霉素的降解率，从中筛选出降解率高的菌株LJ302。

2.对金霉素降解菌株LJ302的分子生物学鉴定

鉴定步骤如下：

2.1基因组DNA的提取

1）菌株活化培养：配制马丁氏培养基，分装后灭菌。按1%的接种量将菌株LJ302的种子液接种到马丁氏培养基中，28℃，170r/min培养24h，如此活化培养2-3次，收集菌体。

2）将步骤1）培养得到的菌球放入研钵中用液氮充分研磨，将研磨后的粉末转入新的1.5ml的EP管中，加入600μl 65℃的CTAB、蛋白酶K2μl，于水浴锅中65℃保温15-30min。期间轻摇。

3）向EP管中加入600μl苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混合液，使之充分混匀，4℃，10000r/min，离心10min，吸取上清液，转至新的EP管中。加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），充分混匀，4℃，10000r/min，离心10min，吸取上清液，转至新的EP管中。

4）向步骤3）得到的上清液中加入1/10体积的3M NaAc和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min。4℃，10000r/min离心10min，弃上清，得到DNA。

5）用70%冰乙醇500μl洗涤DNA2-3次,倒掉液体,倒置EP管晾干，然后加入100μl 1×TE溶解。用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA。

2.2ITS序列的扩增

采用通用引物ITS1和ITS4，对菌株LJ302的rDNA基因的ITS片段进行PCR扩增。反应体系50μL：10Xbuffer 5ul,dNTP 1ul,引物ITS1 2μL，引物ITS4 2μL，Template 5μL，ddH₂O 35μL。

PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。扩增后的PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测。图1为菌株LJ302的rDNA-ITS片段PCR产物凝胶电泳图，从左向右第一泳道为菌株LJ302的ITS序列的PCR产物，第二泳道为Marker。

2.3ITS序列的鉴定

将扩增的ITS序列送北京诺赛基因组研究中心测序，得到该菌株的rDNA-ITS序列组成：

GAACCTGCGG AAGGATCATT ACCGAGTGAG GGCCCTCTGG GTCCAACCTC CCACCCGTGT 60

TTATCGTACC TTGTTGCTTC GGCGGGCCCG CCTCACGGCC GCCGGGGGGC ATCCGCCCCC 120

GGGCCCGCGC CCGCCGAAGA CACACAAACG AACTCTTGTC TGAAGATTGC AGTCTGAGTA 180

CTTGACTAAA TCAGTTAAAA CTTTCAACAA CGGATCTCTT GGTTCCGGCA TCGATGAAGA 240

ACGCAGCGAA ATGCGATAAG TAATGTGAAT TGCAGAATTC AGTGAATCAT CGAGTCTTTG 300

AACGCACATT GCGCCCCCTG GTATTCCGGG GGGCATGCCT GTCCGAGCGT CATTGCTGCC 360

CTCAAGCACG GCTTGTGTGT TGGGCTCTCG CCCCCCGCTT CCGGGGGGCG GGCCCGAAAG 420

GCAGCGGCGG CACCGCGTCC GGTCCTCGAG CGTATGGGGC TTCGTCACCC GCTCTGTAGG 480

CCCGGCCGGC GCCCGCCGGC GAACACCATC AATCTTAACC AGGTTGACCT CGGATCAGGT 540

AGGGATACCC GCTGAACTTA AGCATATCAA TA 572

上述rDNA-ITS序列由572个碱基（bp）组成。

3.菌落形态特征观察

菌株LJ302在马丁氏、麦芽汁和马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上均能较好生长。该菌株在PDA培养基上培养3天，菌落直径为10-18mm，菌落中心草绿色至深绿色，表面常分泌出水珠，边缘菌丝白色呈绒毛状。菌落背面为浅肉色。显微镜下观察菌丝有横隔，菌丝细胞丝状交织，从菌丝体上生出分生孢子梗，具青霉属典型的帚状枝，最末级的小枝上生出成串的分生孢子，分生孢子呈椭圆形，光滑。菌株LJ302的菌落形态和显微形态见图2、图3和图4。

4.菌株LJ302鉴定为一种新功能菌株

将测序结果与NCBI中的GenBank进行Blast比对，得到LJ302与Penicillium oxalicum的ITS序列的同源性为100%。根据菌株LJ302的形态特征以及rDNA-ITS序列分析结果，将该菌株鉴定为草酸青霉（Penicilliumoxalicum），并命名为草酸青霉LJ302（Penicillium oxalicum LJ302）。该菌株已于2012年12月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.7019。目前，国内外尚没有文献报导草酸青霉（Penicillium oxalicum）具有降解金霉素的功能。因此，菌株LJ302属于一种新功能菌株。

实施例2

菌株LJ302在金霉素为唯一碳源培养基中生长与降解实验：

制备以金霉素为唯一碳源且金霉素浓度分别为0.1g/L，1.0g/L，5.0g/L，10.0g/L和15.0g/L的无机盐固体培养基。从活化的培养基中挑取LJ302菌落少许,在上述无机盐固体培养基平板上划线，避光培养，经观察得知，菌株LJ302在金霉素浓度为0.1g/L，1.0g/L和5.0g/L的平板上长出了菌丝。说明菌株LJ302可以在金霉素浓度为0.1g/L至5.0g/L的培养基中生长。

将活化菌株LJ302接入以金霉素为唯一碳源且金霉素含量为500mg/L的无机盐液体培养基中，在28℃，170r/min的摇床中培养，定期取样测定培养液中金霉素含量。通过测定得知，菌株LJ302对以金霉素为唯一碳源的降解率可达84.26%。测定方法为：取1mL培养液，用0.22μm有机滤膜过滤，利用高效液相色谱仪测定滤液中金霉素含量并计算出降解率。HPLC条件：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为乙二酸溶液(0.01mol/L):乙腈:甲醇体积比为10:3:2；流速为1.0ml/min；柱温为35℃；进样量为10μL；检测波长375nm。

实施例3

菌株LJ302对金霉素废水处理实验：

用马丁氏培养基对菌株LJ302进行活化培养，然后按照1%的接种量加入金霉素企业生产废水中，并以不接种微生物的原废水作为对照，分别置于28℃，170r/min的摇床中培养2天，测定废水中金霉素的残留量。经测定得知，接种菌株LJ302对金霉素去除率比对照提高了25.64%。

实施例4

菌株LJ302对金霉素菌渣处理实验：

用马丁氏培养基活化菌株LJ302，然后接种到新鲜的金霉素菌渣中进行暗培养，培养温度30℃。定期取样，利用高效液相色谱仪测定菌渣中金霉素的残留量。

测定方法为：准确称取菌渣2.0000g，加20mL丙酮提取液，充分搅匀，超声30min，用22μm的滤膜过滤，然后利用高效液相色谱仪测定滤液中金霉素含量并计算出的降解率。菌株LJ302在发酵的第7天,对菌渣中金霉素的降解率可达到为90.42%。

Claims

1.一株降解金霉素的草酸青霉LJ302，其特征在于：通过基因组DNA提取、rDNA-ITS序列扩增与比对以及形态特征观察，鉴定菌株LJ302为草酸青霉(Penicillium oxalicum)，命名为草酸青霉LJ302(Penicillium oxalicumLJ302)，现保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.7019；该草酸青霉菌株LJ302能够在以金霉素为唯一碳源的培养基中生长，在金霉素浓度为100mg/L-5000mg/L的条件下生长较好，并对唯一碳源金霉素具有较好的降解作用，应用于金霉素的降解。

2.根据权利要求1所述的一株降解金霉素的草酸青霉LJ302，其特征在于：菌株LJ302的rDNA-ITS序列由572个碱基(bp)组成：

3.根据权利要求1所述的一株降解金霉素的草酸青霉LJ302的应用，其特征在于：将菌株LJ302接种到以金霉素为唯一碳源且金霉素浓度为500mg/L的液体培养基中培养12天，它对金霉素的降解率可达84.26％。

4.根据权利要求1所述的一株降解金霉素的草酸青霉LJ302的应用，其特征在于：菌株LJ302对废水中的残留的金霉素有一定的去除效果：菌株LJ302接种于金霉素生产废水中培养2天，废水中金霉素去除率比对照提高了25.64％。

5.根据权利要求1所述的一株降解金霉素的草酸青霉LJ302的应用，其特征在于：菌株LJ302可在金霉素菌渣中较好生长，同时对菌渣中残留的金霉素具有较好的降解作用；将活化菌株LJ302接种到金霉素菌渣中暗培养7天，该菌株对金霉素的降解率可达90.42％。