CN102604841B

CN102604841B - 一株降解金霉素的木霉菌lj245

Info

Publication number: CN102604841B
Application number: CN201210049934.5A
Authority: CN
Inventors: 李艳菊; 肖思颖; 杨正礼; 杨世琦; 张晴雯; 张爱平
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT; Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculturem of CAAS
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT; Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculturem of CAAS
Priority date: 2012-02-29
Filing date: 2012-02-29
Publication date: 2014-06-25
Anticipated expiration: 2032-02-29
Also published as: CN102604841A

Abstract

本发明涉及一株能降解金霉素的木霉菌LJ245，属于微生物技术领域。经rDNA-ITS全序列测定，该菌株为哈茨木霉(Hypocrea lixii)，保藏编号为CGMCCNo.5753。该菌株生长快，菌丝呈白色柔毛状，后期因产生分生孢子而呈黄绿色；显微观察菌丝有隔，分生孢子梗由菌丝直立生出，无色，分生孢子球形。菌株LJ245具有降解菌渣与废水中残留金霉素的作用，可应用于金霉素生产企业废弃物的处理，也可望应用于金霉素污染环境的生物修复，特别是在金霉素为唯一碳源，且金霉素浓度为0.01g/L的低浓度条件下仍然能够很好生长，对最大限度地降低金霉素残留具有重要作用。同时，该菌株使用方便，还可作为金霉素降解菌剂的制备原料。

Description

一株降解金霉素的木霉菌LJ245

技术领域

本发明涉及一株能降解金霉素的木霉菌LJ245，属于微生物技术领域。

背景技术

金霉素为广谱型抗生素，主产我国。在金霉素发酵生产过程中会产生大量金霉素菌渣和废水。菌渣中因含有金霉素残留等原因，被国家列入《国家危险废物名录》，只能采用焚烧和填埋方法处置。焚烧需耗费大量能源，而且燃烧气体有可能造成二次污染。填埋则需要占用大量土地，且存在着抗生素物质发生渗露的潜在风险，对环境及人类健康构成潜在危害。废水中残留的金霉素，若排入周边水体和土壤，会对水体和土壤中的多种微生物产生抑制作用，破坏水体生态环境，影响土壤的养分循环，甚至有可能诱导出耐药性菌及耐药基因。因此，金霉素废弃物中抗生素残留的去除问题已成为我国环境热点问题之一，也是金霉素生产企业亟待解决的棘手问题。

利用生物降解金霉素残留是一种高效、快速、经济、安全和具有良好应用前景的一种污染处理方法。目前，国内外对金霉素高效降解菌株的筛选与利用高效菌株降解金霉素残留的研究刚刚起步，报导极少。2005年，何瑜利用筛选得到一株红曲霉B3菌株对金霉素生产废水进行了降解率研究，在以金霉素为唯一碳源条件下，其降解率为10％左右；在添加其它碳源和最适条件下培养，其对金霉素的降解率可达到51.5％。本专利涉及的菌株LJ245为哈茨木霉(Hypocrea lixii)，而有关哈茨木霉Hypocrea lixii具有降解金霉素功能的研究，国内外尚未见到报导。

发明内容

本发明的目的在于提供一株金霉素降解菌株LJ245。

本发明所提供的金霉素降解菌株LJ245，为哈茨木霉(Hypocrea lixii)。该菌株于2012年2月14日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号：CGMCC No.5753。该菌株rDNA-ITS全序列如下：

CCTGCGGAGG GATCATTACC GAGTTTACAA CTCCCAAACC CAATGTGAAC GTTACCAAAC 60

TGTTGCCTCG GCGGGATCTC TGCCCCGGGT GCGTCGCAGC CCCGGACCAA GGCGCCCGCC 120

GGAGGACCAA CCAAAACTCT TTTTGTATAC CCCCTCGCGG GTTTTTTATA ATCTGAGCCT 180

TCTCGGCGCC TCTCGTAGGC GTTTCGAAAA TGAATCAAAA CTTTCAACAA CGGATCTCTT 240

GGTTCTGGCA TCGATGAAGA ACGCAGCGAA ATGCGATAAG TAATGTGAAT TGCAGAATTC 300

AGTGAATCAT CGAATCTTTG AACGCACATT GCGCCCGCCA GTATTCTGGC GGGCATGCCT 360

GTCCGAGCGT CATTTCAACC CTCGAACCCC TCCGGGGGGT CGGCGTTGGG GATCGGCCCT 420

GCCTCTTGGC GGTGGCCGTC TCCGAAATAC AGTGGCGGTC TCGCCGCAGC CTCTCCTGCG 480

CAGTAGTTTG CACACTCGCA TCGGGAGCGC GGCGCGTCCA CAGCCGTTAA ACACCCAACT 540

TCTGAAATGT TGACCTCGGA TCAGGTAGGA ATACCCGCTG AACTTAAGCA TATCAATA 598

上述rDNA-ITS序列全长598个核苷酸。

本发明中的菌株LJ245的菌落形态为：

菌株LJ245在马丁氏平板培养基上生长快，菌丝层较厚，呈白色柔毛状，平坦，初期为白色，后期因产生分生孢子而呈黄绿色，产孢区常排列成同心轮纹状。菌丝透明，有隔，分生孢子梗由菌丝直立生出，无色，分生孢子球形。

本发明中的菌株LJ245可以在以金霉素为唯一碳源的培养基中生长，尤其是在金霉素浓度为0.01g/L-5.00g/L的低、中浓度条件下生长较好，可最大限度降低金霉素残留量；菌株LJ245在以金霉素唯一碳源且金霉素含量为4.0g/L的液体培养基中培养，该菌株对金霉素的降解率可达35.19％。

本发明中的菌株LJ245对金霉素生产废水中的金霉素有很好的去除效果，接种菌株LJ245于金霉素生产废水中培养4天，废水中金霉素去除率比对照提高了36.38％。

本发明中的菌株LJ245接种到pH约为2.0的新鲜菌渣中，能快速生长，耐酸性能高，在室温条件下，对菌渣中金霉素的降解率可达到50.09％。

本发明的有益效果：

菌株LJ245具有降解菌渣与废水中残留金霉素的作用，可应用于金霉素生产企业废弃物的处理，也可望应用于金霉素污染环境的生物修复。特别是菌株LJ245在金霉素为唯一碳源且金霉素浓度为0.01g/L的低浓度条件下能够很好生长，对最大限度地降低金霉素残留具有重要作用。菌株LJ245使用方便，还可作为金霉素降解菌剂的制备原料。

附图说明

图1为金霉素降解菌株LJ245的基因组DNA凝胶电泳图(从左向右第一泳道为Marker，第二泳道、第三泳道为LJ245的基因组DNA)；

图2为金霉素降解菌株LJ245的rDNA-ITS片段PCR产物凝胶电泳图(从左向右第一泳道为Marker，第二泳道为LJ245的ITS序列的PCR产物)；

图3为金霉素降解菌株LJ245的菌落形态图；

图4为金霉素降解菌株LJ245的显微形态图。

具体实施方式

实施例1

一、一株金霉素降解菌株LJ245的筛选方法

1、材料准备

菌样品来源：采自金霉素生产企业含活性污泥的废水。

培养基：

无机盐固体培养基：(NH4)₂SO₄ 2.0g，K₂HPO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄·7H2O0.5g，NaCl 0.2g，CaCl₂ 0.1g，FeSO₄ 0.01g，EDTA 0.015g，琼脂13g，葡萄糖2g/L，溶于1000ml蒸馏水中。115℃湿热灭菌20min后，添加2.0g/L金霉素。

马丁氏培养基：蛋白胨6g，葡萄糖10g，KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄·7H2O 0.5g，溶于1000ml蒸馏水中。115℃湿热灭菌20min。

活性测定培养基：(NH4)₂SO₄2.0g，K₂HPO₄0.5g，KH₂PO₄0.5g，MgSO₄·7H2O 0.5g，NaCl 0.2g，CaCl₂0.1g，FeSO₄0.01g，EDTA 0.015g，溶于1000ml蒸馏水中。115℃湿热灭菌20min后，添加4g/L金霉素。

2、实验仪器与设备

岛津LC-20A高效液相色谱仪，UNICO UV-2600A紫外可见光分光光度计，Mettler Toledo ML204分析天平、Mettler Toledo pH计、YT-CJ-1ND超净工作台、HZQ-F160全温振荡培养箱、TG16-W高速离心机、YX-280D手提式压力蒸汽灭菌器、Nicon Eclipse 80i荧光显微镜、DNA Engine PCR仪、DcodeTM变性梯度凝胶电泳仪、DHP-9082电热恒温培养箱、BOSCH冰箱、Champ Gel-3200凝胶成像系统等。

3、菌株筛选

操作步骤如下：

1)菌株分离与纯化

采用平板划线法进行分离与纯化。吸取400μL含活性污泥废水样，涂布于无机盐固体培养基平板上，置于28-30℃条件下遮光培养2-7天，得到不同菌落。然后，挑起单菌落，在无机盐固体培养基上划线进一步分离与纯化。此步骤重复1-2次，直至得到单一菌落。

2)初筛

将步骤1)得到单一菌落依次在以金霉素为唯一碳源的无机盐培养基平板上划线，28-30℃，培养2-6天。保存能够生长的菌株。

3)复筛

将步骤2)得到菌株接入马丁氏培养基中进行活化培养，然后将活化的菌液按2％的接种量转接到的活性测定培养基中，28-30℃，170r/min震荡暗培养，第3天和6天用高效液相色谱法测定各菌株对金霉素的降解率，获得了降解率较高菌株LJ245。

二、金霉素降解菌株LJ245的分子生物学鉴定

鉴定步骤如下：

1、基因组DNA的提取

菌丝体DNA的提取采用CTAB法，具体方法如下：

1)菌种活化：配制马铃薯汁培养基，分装高压灭菌，吸取500μL甘油管中保藏菌种至三角瓶中，28℃，170r/min培养24h。再将活化菌种转移至新培养基中28℃，170r/min培养48h。

2)将步骤1)培养的菌球放入研钵中用液氮充分研磨，将研磨后的粉末转入新的1.5ml EP管中，加600μl 65℃的CTAB于水浴锅中65℃保温15-30min。

3)向EP管中加等体积(600μl)氯仿/异戊醇混合液(24∶1)，使之充分混匀，4℃，10000r/min离心5min，取上清液至新EP管中。

4)向上清中加入1/10体积的3M NaAc和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀10min。4℃，10000r/min离心5min，弃上清。

5)70％冰乙醇(或无水乙醇)500μl洗涤DNA2-3次(洗涤时轻转EP管)，倒置晾干，加入100μl 1×TE溶解。

6)用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

7)凝胶成像系统观测，照相。图1为菌株LJ245基因组DNA的凝胶电泳图(从左向右第一泳道为Marker，第二泳道、第三泳道为LJ245的基因组DNA)。-20℃或-70℃保存提取的DNA。

2、ITS区序列扩增「

采用通用引物ITS1和ITS4，对菌株LJ245的rDNA基因的ITS片段进行PCR扩增。PCR扩增序列采用50μL反应体系：Mix 25μL，引物ITS1(10mmol/L)1μL，引物ITS4(10mmol/L)1μL，模板(约25mmol/L)2μL，ddH₂O 21μL。

PCR反应条件为：94℃预热5min，94℃30S，55℃45S，72℃1min，循环30次，72℃10min。扩增后的PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶成像系统照相。图2为金霉素降解菌株LJ245的rDNA-ITS片段PCR产物凝胶电泳图(从左向右第一泳道为LJ245的ITS序列的PCR产物，第二泳道为Marker)；

3、ITS区序列的测定

将扩增的ITS序列送北京诺赛基因组研究中心测序，得到菌株LJ245的ITS全序列如下：

CCTGCGGAGG GATCATTACC GAGTTTACAA CTCCCAAACC CAATGTGAAC GTTACCAAAC 60

TGTTGCCTCG GCGGGATCTC TGCCCCGGGT GCGTCGCAGC CCCGGACCAA GGCGCCCGCC 120

GGAGGACCAA CCAAAACTCT TTTTGTATAC CCCCTCGCGG GTTTTTTATA ATCTGAGCCT 180

TCTCGGCGCC TCTCGTAGGC GTTTCGAAAA TGAATCAAAA CTTTCAACAA CGGATCTCTT 240

GGTTCTGGCA TCGATGAAGA ACGCAGCGAA ATGCGATAAG TAATGTGAAT TGCAGAATTC 300

AGTGAATCAT CGAATCTTTG AACGCACATT GCGCCCGCCA GTATTCTGGC GGGCATGCCT 360

GTCCGAGCGT CATTTCAACC CTCGAACCCC TCCGGGGGGT CGGCGTTGGG GATCGGCCCT 420

GCCTCTTGGC GGTGGCCGTC TCCGAAATAC AGTGGCGGTC TCGCCGCAGC CTCTCCTGCG 480

CAGTAGTTTG CACACTCGCA TCGGGAGCGC GGCGCGTCCA CAGCCGTTAA ACACCCAACT 540

TCTGAAATGT TGACCTCGGA TCAGGTAGGA ATACCCGCTG AACTTAAGCA TATCAATA 598

三、菌落形态特征观察

菌株LJ245在马丁氏平板培养基上生长快，30℃培养三天，菌丝可铺满整个平板，菌丝层较厚，呈白色柔毛状，平坦，后期产孢子，孢子为黄绿色，产孢区排列成同心轮纹状，菌落背面白色。显微镜观察菌丝透明，有隔，菌丝分枝多且不规则，整体像树枝，菌丝间相互交叉覆盖。分生孢子梗由菌丝直立生出，无色，孢子梗瓶形，基部细，中间膨大。分生孢子球形。金霉素降解菌株LJ245菌落形态和显微形态见图3和图4。

四、菌株LJ245鉴定为一种新功能菌株

将测序结果与NCBI中的GenBank进行Blast比对，得到菌株LJ245与Hypocrea lixii的ITS序列的同源性为100％。根据菌株LJ245ITS序列分析结果以及形态特征，将其鉴定为哈茨木霉(Hypocrea lixii)。该菌株已于2012年2月14日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，保藏号：CGMCC No.5753，保藏日期为2012年2月14日。目前，国内外尚没有文献报导Hypocrea lixii具有降解金霉素的功能。因此，LJ245为一种新功能菌株。

实施例2

菌株LJ245对金霉素为唯一碳源的利用与降解实验

制备以金霉素为唯一碳源且金霉素浓度分别为0.01g/L，0.05g/L，0.10g/L，0.50g/L，5.00g/L，10.00g/L，15.00g/L的无机盐固体培养基。挑取LJ245菌落少许，在无机盐固体培养基平板上划线，置于30℃条件下避光培养2-6天。经观察得知，在培养第2天，在金霉素浓度为0.01g/L，0.05g/L，0.1g/L，0.5g/L和5.0g/L的培养基平板上长出了菌丝，且生长良好。说明菌株LJ245可以对极低浓度0.01g/L至中浓度5.0g/L金霉素起到较好的利用与降解效果。菌株LJ245能够利用低浓度乃至贫营养级浓度的金霉素，可以最大限度地降低金霉素残留量。

将菌株LJ245接入以金霉素为唯一碳源且金霉素含量为4.0g/L的无机盐液体培养基中，进行摇瓶培养，定时取样测定培养液中金霉素含量。测定方法为，取1mL培养液，加入5mL的甲醇，8000r/min离心5min，取上清液用22μm的滤膜过滤，通过高效液相色谱仪测定和计算得知LJ245对金霉素的降解率可达35.19％。

实施例3

菌株LJ245对金霉素废水处理实验

用马丁氏培养基对菌株LJ245进行活化培养，然后按照1％的接种量加入金霉素企业生产废水中，并以不接种微生物的原废水作为对照，分别置于28℃，170r/min的摇床中培养4天，测定废水中金霉素的残留量。经测定得知，接种菌株LJ245对金霉素去除率比对照提高了36.38％。

实施例4

菌株LJ245对金霉素菌渣处理实验

1)菌渣处理

用马丁氏培养基活化菌株LJ245，按3％的接种量接种到菌渣中，室温条件下进行暗培养。

2)菌渣中金霉素提取与测定

准确称取上述处理后的菌渣少许，用提取液充分提取。提取液组成为：丙酮∶盐酸溶液(4mol/L)∶水＝13∶1∶6。提取液经8000r/min离心5min后，取上清液，用22μm的滤膜过滤后，用高效液相色谱仪测定滤液中金霉素含量，LJ245在第5天对金霉素的降解率为50.09％。

Claims

1.一株降解金霉素的木霉菌LJ245，其特征在于：通过基因组DNA提取、rDNA-ITS序列扩增与比对，菌株LJ245为哈茨木霉（Hypocrea lixii），其保藏编号为CGMCC No.5753。

2.根据权利要求1所述的一株降解金霉素的木霉菌LJ245的应用，其特征在于：该菌株LJ245用于金霉素的降解中。

3.根据权利要求2所述的一株降解金霉素的木霉菌LJ245的应用，其特征在于：将菌株接种于以金霉素为唯一碳源的液体培养基中，其对金霉素的降解率达到35.19%，其步骤为：

制备以金霉素为唯一碳源且金霉素浓度分别为0.01g/L，0.05g/L，0.10g/L，0.50g/L，5.00g/L，10.00g/L，15.00g/L的无机盐固体培养基；挑取LJ245菌落，在无机盐固体培养基平板上划线，置于30℃条件下避光培养2-6天；在培养第2天，在金霉素浓度为0.01g/L，0.05g/L，0.1g/L，0.5g/L和5.0g/L的培养基平板上长出了菌丝，且生长良好；

将菌株LJ245接入以金霉素为唯一碳源且金霉素含量为4.0g/L的无机盐液体培养基中，进行摇瓶培养，定时取样测定培养液中金霉素含量；测定方法为，取1mL培养液，加入5mL的甲醇，8000r/min离心5min，取上清液用22μm的滤膜过滤，通过高效液相色谱仪测定和计算得知LJ245对金霉素的降解率可达35.19%。