CN110205272A - 一株能降解四环素的台湾假单胞菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株能降解四环素的台湾假单胞菌及其应用。该台湾假单胞菌的名称为Pseudomonas taiwanensis TC952，保藏编号为GDMCC NO：60636，该菌株于2019年4月23日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。本发明的台湾假单胞菌可通过共代谢方式对四环素进行降解，因此可将其应用于土壤和水体中低浓度四环素的降解，对中低浓度四环素的降解作用可以去除或降低四环素在环境中的残留；同时，该菌株还具有溶磷性能，应用于土壤时，还具有增加土壤磷营养元素，增强土壤肥力的作用。

Description

一株能降解四环素的台湾假单胞菌及其应用
技术领域
本发明属于有机污染物微生物修复技术领域，特别涉及一株能降解四环素的台湾假单胞菌及其应用。
背景技术
四环素(Tetracycline,TC)是一种广谱抗生素，用于治疗各种革兰氏阳性和阴性菌引起的感染，对某些立克次体，滤过性病毒和原虫具有作用。由于其良好的抑菌作用，已不断被应用于防治人体和动植物体疾病和促进动物生长。四环素被应用于机体后只有少部分被吸收，并且未完全代谢存在于组织中；而大部分不能被机体所吸收(35～90％)，以初始母体或代谢物的形式随尿液和粪便排出体外，最终直接或间接进入环境。研究表明，在多种介质中都检测到有四环素残留，如作物、土壤、动物粪便、灌溉用水以及自来水，更甚者在地下水中也检测到四环素污染；而四环素进入环境后，对人体健康、土壤肥效、植物生长、环境微生物多样性和生态安全都会造成潜在威胁。因此，消除或降低四环素在环境中的残留至关重要。
目前对环境中四环素降解主要研究集中于物理化学方法催化降解(如紫外照射、臭氧曝气等)、植物修复和电化学膜片技术等；而微生物单菌降解报道相对较少，但是微生物降解较其他方法的优点是降解产物毒性低。因此利用微生物方法降解环境中的四环素残留是一种极具广阔应用前景的方法。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株能降解四环素的台湾假单胞菌。
本发明的另一目的在于提供所述能降解四环素的台湾假单胞菌的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一株能降解四环素的台湾假单胞菌，名称为Pseudomonas taiwanensis(台湾假单胞菌)TC952，保藏编号为GDMCC NO：60636，该菌株于2019年4月23日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。
所述的能降解四环素的台湾假单胞菌的16S rDNA序列由1384个碱基(bp)组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种培养所述能降解四环素的台湾假单胞菌的方法，具体步骤为：将能降解四环素的台湾假单胞菌接种于培养基中，于30℃～37℃条件下进行培养。
所述的培养基为LB培养基。
所述的培养的温度优选为30℃。
所述的培养的时间为18～24h；优选为20～24h。
所述的能降解四环素的台湾假单胞菌在溶磷方面的应用。
所述的能降解四环素的台湾假单胞菌在提高土壤有效磷含量中的应用，该台湾假单胞菌具有溶磷的性能，因此能够提高土壤中有效磷含量，从而提高土壤肥力。
所述的能降解四环素的台湾假单胞菌在降解四环素中的应用。
所述的能降解四环素的台湾假单胞菌在降解四环素中的应用，是将上述能降解四环素的台湾假单胞菌加入到含有四环素的水体中，利用该台湾假单胞菌具有降解四环素的性能，降解水体中低浓度的四环素，从而去除或者降低四环素在环境中的残留，达到治理环境污染的效果。
所述的水体中四环素的浓度为5～50mg·L-1。
一种四环素生物降解菌剂，含有上述能降解四环素的台湾假单胞菌。
本发明中筛选得到的台湾假单胞菌在LB平板上生长24小时后，菌斑呈圆形，边缘呈半透明状，中间隆起呈米黄色，可在含有10mg·L-1的四环素的培养基中生长良好；其中，所述培养基为含有10g·L-1蛋白胨的MSM培养基。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明中的菌株TC952可通过共代谢方式对四环素进行降解，将菌株TC952接种于四环素浓度为5、10、20、50mg·L-1的含有10g·L-1蛋白胨的MSM培养基中，30℃，150r/min震荡培养6天。6d后未加菌的对照四环素发生水解，加菌TC952后，四环素降解作用明显加快加强。初始TC浓度为5、10、20、50ppm时水解率为32.70％、33.18％、23.26％、20.32％，可知随着TC初始浓度增加，自然水解率降低。加入TC952后TC降解速率加快，初始TC浓度为5、10、20、50ppm时TC降解效率(水解+生物降解)为69.64％、72.07％、69.05％、57.60％。说明菌株TC952具有降解四环素的性能，可应用于土壤和水体中低浓度四环素的降解，菌株TC952对中低浓度四环素的降解作用可以去除或降低四环素在环境中的残留。菌株TC952同时还具有溶磷性能，有助于提高土壤中有效磷浓度，增加土壤肥力。因此该菌株TC952可应用于液体和土壤中的残留四环素去除，同时应用于土壤时，还具有增加土壤磷营养元素，增强土壤肥力的作用。
附图说明
图1是菌株TC952的菌落形态图。
图2是菌株TC952的系统发育树图。
图3是菌株TC952在含磷酸钙的培养基上的生长情况图(菌落周围出现的水解圈即溶磷圈)。
图4是菌株TC952在含10g·L-1蛋白胨MSM培养基中对四环素的降解图(CK代表不加菌对照)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例1菌株TC952的筛选、分离纯化以及鉴定
一、四环素降解菌株TC952筛选方法
1.材料准备
菌株筛选污泥来源：取自湖南省株洲市茶陵县左垅村农家施肥菜地，土样用采样袋密封，4℃带回实验室保存并备用。
LB培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取粉5.0g，NaCl 10.0g，pH7.0～7.2，蒸馏水定容至1L，固体培养基另加18.0g琼脂粉。121℃灭菌15min。
无机盐培养基(MSM)：将5mL磷酸缓冲溶液(KH2PO4 8.5g·L-1、K2HPO4·H2O21.75g·L-1、Na2HPO4·12H2O 33.4g·L-1、NH4Cl 5.0g·L-1)，3.0mL22.5g·L-1的MgSO4溶液(MgSO4·7H2O 46.125g·L-1)，1.0mL 0.25g·L-1的FeCl3溶液(FeCl3·6H2O 0.42g·L-1)，1.0mL 36.4g·L-1的CaCl2溶液(CaCl2·2H2O 48.22 g·L-1)，1.0mL微量元素溶液(含39.9mg·L-1MnSO4·H2O；42.8mg·L-1ZnSO4·H2O；34.7mg·L-1(NH4)6Mo7O24·4H2O)混匀，调pH至7.0～7.2，用纯水定容至1L，121℃灭菌15min。
含有10g·L-1蛋白胨的MSM培养基：胰蛋白胨10.0g加入MSM培养基溶液中，调pH至7.0～7.2，用纯水定容至1L，121℃灭菌15min。
2.实验仪器与设备
立式压力蒸汽灭菌锅(BL-50A，上海静科实业有限公司)、便携式pH计(PHB-4，上海精密科学有限公司)、离心机(Centrifuge 5810R)、电热烘箱(DGG-9070A，上海森信实验仪器有限公司)、数显恒温水浴锅(HH系列，常州国宇仪器制造有限公司)、冰箱(RCD-205AG7，海信电器)、生化培养箱(PYX-208S-A，科力仪器)、超净工作台(SW-CJ-1F，苏净安泰空气技术有限公司)、涡旋混合器(XW-80A，上海精科实业有限公司)、MyCycler PCR(美国BIO-RAD公司)、电泳仪(DYY-6C，北京六一仪器厂)、Nano Drop核酸蛋白定量检测仪(德国Thermo)、凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)、落地恒温振荡器(HZQ-211C)。
3.四环素降解菌株富集筛选及分离纯化
(1)菌株的分离与纯化
称取采自湖南省株洲市茶陵县左垅村农家施肥菜地土壤1g，加至50mL 0.5mg·L- 1TC(四环素)的含有10g·L-1蛋白胨的MSM培养基中驯化培养，驯化两天后以2％的接种量转接至1mg·L-1TC的含有10g·L-1蛋白胨的MSM培养基驯化，然后依次2％转接至TC浓度为2.5、5和10mg·L-1TC的含有10g·L-1蛋白胨的MSM培养基中分别驯化3d。驯化筛选后，将菌液用培养基稀释至107倍，取稀释液0.2mL涂布于LB固体培养基，30℃培养至菌落形成；再将长出来的单菌落挑选出来，分离并纯化。
(2)菌株筛选
将步骤(1)中分离纯化得到的纯化菌株接种到LB液体培养基中进行扩大培养20-24h。活化后按2％(v/v)的比例加至含有5、10、20、50mg·L-1TC的含有10g·L-1蛋白胨的MSM培养基中，150r·min-1 30℃避光培养，0、2、6和9天后收集菌液。菌液以10000r·min-1离心1min，收集上清过0.22μm有机滤膜，滤液用高效液相色谱方法(HPLC)进行测定，筛选得到具有四环素降解能力菌株，以上所有实验步骤都尽量避光。得到能降解TC的菌株，命名为菌株TC952。
HPLC条件：液相色谱柱为CNW C18-WP(4.6×250mm，5μm)，A相为甲醇，B相为乙腈，C相为0.01mol·L-1草酸，V(A):V(B):V(C)＝15:15:70，流速为1mL·min-1，柱温31℃；进样量20μL；紫外检测器检测波长355nm。
二、菌落形态特征观察
菌株TC952在LB培养基上生长较快，可在30～37℃生长。菌斑呈圆形，边缘呈半透明状，中间隆起呈米黄色。可在四环素浓度为10mg·L-1的含有10g·L-1蛋白胨中生长良好(图1)。
2.16S rDNA扩增
以提取的菌株TC952的总DNA为模板，采用细菌16S rDNA通用引物扩增，正向引物为27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物为1492r：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(Stackebrandt et al.,1991)扩增16S rDNA基因序列。
PCR反应总体系为25μL：上、下游引物各2μL，模板DNA0.5μL，2×TaqPCR MasterMix 12.5μL，灭菌超纯水至总体积25μL。
PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性50s；56℃退火50s；72℃延伸50s，35个循环；最后72℃补充延伸5min。再用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(选择DL2000Marker)。凝胶成像系统下观察，其中在Marker 1000bp与2000bp条带中间范围出现了明显的条带。
3.16S rDNA序列的测定
将PCR扩增后产物送北京睿博兴科生物技术有限公司(广州分公司)测序，得到的菌株的16S rDNA基因序列如下(SEQ ID NO.1)：
AGTCGAGCGGATGACGGGAGCTTGCTCCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAATCCTTGAGATTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAAC。
上述序列由1384碱基(bp)组成。
将获得的16S rDNA基因序列提交至美国国立生物信息中心(NCBI)网页进行BLAST对比，与LPSN数据库(http://www.bacterio.net/index.html)中相关模式菌株的16S rDNA基因进行同源性比对分析，下载同源性较高的模式菌株序列在美国国立生物信息中心(NCBI)网站上对扩增产物序列进行BLAST比对和同源性分析，采用Mega 6.0软件，以Neighbour-Joining法构建系统发育树。经16S rDNA序列进行比较发现，菌株TC952与台湾假单胞菌(Pseudomonastaiwanensis)有99％的同源性(图2)。
四、菌株TC952鉴定为一种新功能菌株
根据菌株TC952菌落形态特征和分子生物学鉴定结果，将菌株TC952鉴定为台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)，并命名为台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)TC952。该菌株已保存于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为GDMCC NO：60636，该菌株于2019年4月23日。保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
目前，国内外尚无文献报道台湾假单胞菌具有降解四环素的功能。因此，台湾假单胞菌为一株具有降解四环素功能的新菌株。
实施例2菌株TC952的溶磷能力测定
菌株溶磷功能定性试验：将菌株TC952通过划线法接种至LB培养基中，于30℃培养箱条件下培养24h，然后挑取单菌落点接于PKO固体培养基上，设3个重复试验，置于37℃培养箱中5～7天，观察培养基中菌落周围有无溶磷水解形成的透明圈，并观察其透明圈大小，用直尺测量水解圈和菌落圈的直径，并拍照。根据水解圈与菌落圈直径比值来判断菌株是否有溶磷作用及溶磷能力的相对大小。其中，PKO培养基配方：葡萄糖10g·L-1，(NH4)2SO40.5g·L-1，NaCl 0.2g·L-1，MgSO4·7H2O 0.1g·L-1，KCl 0.3g·L-1，MnSO4·4H2O 0.03g·L-1，FeSO4 0.003g·L-1，Ca3(PO4)2 5.0g·L-1，酵母粉0.5g·L-1，琼脂粉20.0g·L-1，pH6.8～7.0。
结果表明，菌株TC952具有溶磷性能(图3)，溶磷圈与菌落圈的直径比为1.98。
实施例3菌株TC952在含有四环素和蛋白胨的无机盐培养基中对四环素的降解
将菌株TC952划线与LB平板上30℃培养20h后，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，30℃、150r·min-1的摇床中培养20h后，按2％(v/v)的比例接种至TC含量为5、10、20、50mg·L-1的含10g·L-1胰蛋白胨的MSM培养基中培养，并于6d(天)后取样；以不添加菌株TC952为对照(CK)。溶液过滤后HPLC测其TC的残留量(四环素测定方法同实施例1)。结果表明，6d后未加菌的对照四环素发生水解，加菌TC952后，四环素降解作用明显加快加强。初始TC浓度为5、10、20、50ppm时水解率为32.70％、33.18％、23.26％、20.32％，可知随着TC初始浓度增加，自然水解率降低。加入TC952后TC降解速率加快，初始TC浓度为5、10、20、50ppm时TC降解效率(水解+生物降解)为69.64％、72.07％、69.05％、57.60％。不同TC初始浓度自然水解或生物降解6天后四环素残余浓度见图4。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一株能降解四环素的台湾假单胞菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1384
<212> DNA
<213> Pseudomonas taiwanensis
<220>
<223> 16S rDNA
<400> 1
agtcgagcgg atgacgggag cttgctcctt gattcagcgg cggacgggtg agtaatgcct 60
aggaatctgc ctggtagtgg gggacaacgt ttcgaaagga acgctaatac cgcatacgtc 120
ctacgggaga aagcagggga ccttcgggcc ttgcgctatc agatgagcct aggtcggatt 180
agctagttgg tgaggtaatg gctcaccaag gcgacgatcc gtaactggtc tgagaggatg 240
atcagtcaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 300
attggacaat gggcgaaagc ctgatccagc catgccgcgt gtgtgaagaa ggtcttcgga 360
ttgtaaagca ctttaagttg ggaggaaggg cagtaagtta ataccttgct gttttgacgt 420
taccgacaga ataagcaccg gctaactctg tgccagcagc cgcggtaata cagagggtgc 480
aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgcgcgtagg tggttcgtta agttggatgt 540
gaaagccccg ggctcaacct gggaactgca tccaaaactg gcgagctaga gtacggtaga 600
gggtggtgga atttcctgtg tagcggtgaa atgcgtagat ataggaagga acaccagtgg 660
cgaaggcgac cacctggact gatactgaca ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag 720
gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgtcaa ctagccgttg gaatccttga 780
gattttagtg gcgcagctaa cgcattaagt tgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt 840
aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa 900
gcaacgcgaa gaaccttacc aggccttgac atgcagagaa ctttccagag atggattggt 960
gccttcggga actctgacac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1020
tgggttaagt cccgtaacga gcgcaaccct tgtccttagt taccagcacg ttatggtggg 1080
cactctaagg agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca 1140
tggcccttac ggcctgggct acacacgtgc tacaatggtc ggtacagagg gttgccaagc 1200
cgcgaggtgg agctaatctc acaaaaccga tcgtagtccg gatcgcagtc tgcaactcga 1260
ctgcgtgaag tcggaatcgc tagtaatcgc gaatcagaat gtcgcggtga atacgttccc 1320
gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagtgggt tgcaccagaa gtagctagtc 1380
taac 1384

Claims (10)

1.一株能降解四环素的台湾假单胞菌，其特征在于：名称为Pseudomonas taiwanensisTC952，保藏编号为GDMCC NO：60636，该菌株于2019年4月23日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。
2.根据权利要求1所述的能降解四环素的台湾假单胞菌，其特征在于：所述的能降解四环素的台湾假单胞菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种培养权利要求1或2所述的能降解四环素的台湾假单胞菌的方法，其特征在于，具体步骤为：将能降解四环素的台湾假单胞菌接种于培养基中，于30℃～37℃条件下进行培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的培养基为LB培养基；所述的培养的时间为18～24h。
5.权利要求1或2所述的能降解四环素的台湾假单胞菌在溶磷方面的应用。
6.权利要求1或2所述的能降解四环素的台湾假单胞菌在提高土壤有效磷含量中的应用。
7.权利要求1或2所述的能降解四环素的台湾假单胞菌在降解四环素中的应用。
8.根据权利要求7所述的能降解四环素的台湾假单胞菌在降解四环素中的应用，其特征在于：是将能降解四环素的台湾假单胞菌加入到含有四环素的水体中。
9.根据权利要求8所述的能降解四环素的台湾假单胞菌在降解四环素中的应用，其特征在于：
所述的水体中四环素的浓度为5～50mg·L-1。
10.一种四环素生物降解菌剂，其特征在于：含有权利要求1或2所述的能降解四环素的台湾假单胞菌。
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