CN107012111A - 一株台湾假单胞菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株台湾假单胞菌，具体为Pseudomonas taiwanensis C‑2，于2016年3月14日保藏于在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2016119。还公开了其在微生物强化采油中应用以及在原油、沥青、饱和烃、芳香烃和胶质降解中的应用。本发明提供的台湾假单胞菌Pseudomonas taiwanensis C‑2能以原油为唯一碳源生长，可产表面活性物质，能显著改善原油乳化性，降低原油的附着性及粘度，对沥青及原油中的重质组分有较强的降解能力，并具有良好的原油驱替能力，在MEOR中具有重要的应用潜力。

Description

一株台湾假单胞菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物强化采油及生物转化技术领域，具体涉及一株台湾假单胞菌及其应用。
背景技术
微生物强化采油(Microbial enhanced oil recovery，MEOR)是利用微生物及其代谢产物回收油藏中残油的三次采油技术。在对MEOR的研究中，代谢产物的运用及研究较为广泛，其中表面活性物质依靠其亲水亲油的两性基团能够大幅度降低表面及界面张力受到重视。用于MEOR的能够产生表面活性物质的菌种主要包括多种杆菌属细菌及假单胞菌属，其中对烃降解菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)所产表面活性物质鼠李糖脂研究较多。台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)分离自土壤，能够降解几丁质、产生抗虫毒素，其主要用于植物抗虫领域，对原油降解及强化采油能力未见报道。
沥青是原油的重要组成成分，在稠油中含量很高，对原油粘度影响很大。Uraizee等认为，高含量的沥青质阻碍油滴中可降解组分向油-菌界面传递，降低可降解组分的降解速率及降解程度。研究发现，微生物对沥青的降解率很低，而沥青降解将会大幅度降低原油粘度，提高原油采收率。但目前缺乏对沥青有较强降解能力及同时产表面活性物质的强化采油细菌。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一株台湾假单胞菌，能以原油为唯一碳源，对原油中沥青、胶质等重质分子有较强降解能力、合成表面活性物质且对原油具有良好驱替能力。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。
(一)一株台湾假单胞菌，具体为Pseudomonas taiwanensis C-2，于2016年3月14日保藏于在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2016119。
所述Pseudomonas taiwanensis C-2的16S rDNA序列SEQ ID No.1所示。
所述Pseudomonas taiwanensis C-2可产表面活性物质。
(二)台湾假单胞菌的应用
(1)Pseudomonas taiwanensis C-2在沥青降解中的应用。
(2)Pseudomonas taiwanensis C-2在胶质降解中的应用。
(3)Pseudomonas taiwanensis C-2在芳香烃降解中的应用。
(4)Pseudomonas taiwanensis C-2在原油降解中的应用。
(5)Pseudomonas taiwanensis C-2在微生物强化采油中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的台湾假单胞菌Pseudomonas taiwanensis C-2能以原油为唯一碳源生长，可产生表面活性物质，能显著改善原油乳化性，降低原油附着性及粘度，具有良好的原油驱替能力，在MEOR中具有重要的应用潜力；且对沥青及原油中的重质组分有较强的降解转化能力。
附图说明
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为台湾假单胞菌Pseudomonas taiwanensis C-2的菌落形态图；
图2为台湾假单胞菌Pseudomonas taiwanensis C-2放大5000倍后的细胞形态图；
图3为图2放大70000倍后的台湾假单胞菌Pseudomonas taiwanensis C-2的单个细胞形态图；
图4为台湾假单胞菌Pseudomonas taiwanensis C-2作用沥青玻片后沥青在玻片上的分布形态图；
图5为台湾假单胞菌Pseudomonas taiwanensis C-2处理原油滤纸后滤纸上残留原油的情况图；
图6为台湾假单胞菌Pseudomonas taiwanensis C-2发酵液对原油驱替时的驱油装置图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
本发明提供一株台湾假单胞菌Pseudomonas taiwanensis C-2，于2016年3月14日保藏于在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2016119，保藏单位地址为中国湖北省武汉市武昌珞珈山，邮编430072。
本实施例所用到的材料具体如下：
细菌分离源：中国陕北延长油田长6组井油油样及油井旁油污土壤。
原油滤纸：将直径8.5cm的定性滤纸蘸满原油后置于直径9cm培养皿中，121℃灭菌30min。
分离培养基：琼脂粉10g，NaCl 5.0g，水1L，121℃灭菌30min，倒皿，待培养基凝固后将灭菌原油滤纸紧贴在培养基表面。
菌种纯化及保藏培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
液体发酵培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养基。
初筛培养基：KNO3 5.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 1.0g，水1000mL，pH值中性，琼脂粉10.0g，原油20.0g，121℃灭菌30min，摇匀后倒皿。
复筛培养基：NaNO3 2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 2.0g，(NH4)2SO4 1.0g，水1000mL，pH值中性。取100mL分装至250mL细口玻璃瓶中，每瓶加入原油2.0g，121℃灭菌30min。
细菌种子液制备：用接种环从细菌斜面挑取1环菌体接种至100mL灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃，150r/min摇床振荡培养3d。
细菌发酵液制备：于600mL组培瓶中加入150mL牛肉膏蛋白胨液体培养基，121℃灭菌30min，待冷却后接种5mL细菌种子液，37℃，150r/min摇床振荡培养5d，4℃保存待用。
NDJ-79旋转粘度计：上海平轩科技仪器有限公司生产。
气相色谱仪：型号为Trace GC Ultra，Thermo Finnigan公司生产。
沥青：石油沥青，为陕西宝利沥青有限公司生产的重胶沥青，针入度91(0.1mm)，软化点46℃，延度于10℃时为45cm，15℃时为102cm。
原油：中国陕北延长油田长6组井油油样，饱和烃含量612.6g/kg，芳香烃83.6g/kg，胶质51.6g/kg，沥青54.3g/kg，其他成分69.1g/kg。35℃时粘度76.5mPa·s。
模拟驱油原油：采自中国陕北延长油田，该油样饱和烃含量为684.50g/kg，芳香烃含量108.33g/kg，胶质39.83g/kg，沥青质含量39.50g/kg，未知组分含量为77.00g/kg。
实施例1
菌株的筛选及鉴定
1、试验方法：
1.1 驱油细菌分离纯化
称取10.0g井口油污土壤加入至90mL无菌水中，手摇振荡15min，即得10-1浓度的土壤悬液，静置30s，吸取1mL土壤悬液加至9mL无菌水管中，连续稀释至10-3，涂布法将3个浓度的菌悬液分别接入分离培养基的原油滤纸上。37℃培养7d，挑取生长快、直径较大的细菌单菌落，采用稀释平皿涂抹法纯化，即可从原油污染土壤中获得能以原油为唯一碳源的细菌。
将原油摇匀后吸取0.1mL直接均匀涂布于分离培养基的原油滤纸上，用相同方法培养纯化，即可从原油中获得能以原油为唯一碳源的细菌。将所得菌株保存于牛肉膏蛋白胨琼脂斜面。
1.2 菌株初筛与复筛
初筛：将分离纯化后的菌株接入到初筛培养基中置于37℃，培养7d，观察并记录3～7d时菌株在初筛培养基上的生长状况。
复筛：选取初筛培养基上生长较好的菌株接入复筛培养基中，37℃，120r/min摇床培养10d，观察原油在瓶壁上的附着性，测定培养瓶中原油的乳化时间、培养液水相的排油圈直径及pH值。利用公式(1)计算各测定参数较对照的相对增率(Relative Growth Rate，⊿R％)。
式(1)中：Ws与Wck分别为处理与对照所对应的乳化时间，排油圈直径及pH值。
综合初筛与复筛结果，选取在初筛、复筛培养基上生长良好、乳化时间长及原油在瓶壁上附着少的菌株进行后续试验。
1.3 菌株鉴定
形态特征：菌落形态，通过稀释平皿涂抹法获得单菌落，观察菌落形态、大小、边缘状况、隆起程度、表面光泽、粘稠度及菌落颜色等特征。细胞形态：扫描电镜观察。16S rDNA序列分析获取序列后，在NCBI数据库中通过Blast程序进行相似度搜索，采用Mega 5.0软件中的Neighbor-joining法将同源性较高的菌株序列构建系统发育树。
2、试验结果：
从延长油田原油及油污土壤中共分离到32株细菌，其中有1株分离自原油的细菌C-2，在含原油培养基中生长良好，对原油的物理及化学性质影响显著。菌落形态和细胞形态如图1-图3所示，C-2菌落直径为3.2～4.0mm，菌落白色，半透明，颜色均匀，圆形，边缘整齐，表面湿润光滑，微凸起，细胞长0.8-1.2μm，宽0.4-0.6μm。
Pseudomonas taiwanensis C-2的16S rDNA序列如下：
ATGCAAGTCGAGCGGATGACGGGAGCTTGCTCCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAATCCTTGAGATTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTACC。
经鉴定，细菌C-2为Pseudomonas taiwanensis，在GenBank的登录号为KT189157。
实施例2
菌种的应用
1、试验方法
1.1 对原油的作用
将18.00g原油加入到500mL三角瓶中，每瓶加入200mL牛肉膏蛋白胨液体培养基，121℃灭菌30min，待冷却后接种100mL细菌种子液，以加300mL纯水代替发酵液为对照。37℃静置培养5d，期间每4小时摇动1次。处理结束后将培养瓶置4℃冰箱静置，待原油凝固后分别收集原油及发酵液水相，原油用于测定细菌处理原油理化性质，发酵液水相用于发酵液驱油特性测定。
1.2 驱油特性
发酵液pH：用雷磁PHS-3D型酸度计测定1.1收集的发酵液水相pH值。
排油圈直径：指培养瓶中液体培养液水相对液体石蜡的排油圈大小，采用排油圈法测定1.1收集的发酵液水相的排油圈直径。测值愈大，表示发酵液水相的表面活性愈强，细菌生长代谢产生的表面活性物质多或表面活性强。
附着性：①液体培养瓶壁上的附着状况，通过观察1.1中原油在瓶壁上附着的原油量确定。原油附着愈少、瓶壁愈干净，表示细菌发酵液对原油附着性的降低作用愈大，该发酵液用于原油生产时提高采收率的潜力愈大。②原油滤纸的附着状况，将快速定性滤纸裁剪成4.5cm×4.5cm的滤纸片，依照文献《Bacterial degradation of crude oil usingsolid formulations of bacillus strains isolated from oil-contaminated soiltowards microbial enhanced oil recovery application》中的方法测定发酵液对原油滤纸的脱附作用。回收取出原油滤纸后的水相，测定对照及细菌处理发酵液水相的pH值及排油圈直径。将滤纸解吸的原油量占滤纸初始吸附原油量的比率定义为滤纸吸附原油脱附率(Oil Removal Efficiency,ORE％)，按式(2)计算。
式(2)中：m0、m1及m2分别指滤纸片质量、滤纸与原油总质量及反应后残余原油与滤纸总质量。
乳化性：原油乳化时间，指将1.1培养瓶中的油水混合液体培养物充分摇匀后静置于实验台并开始计时，至油、水层分离且界限清晰所需时间。该值可反映细菌培养液对原油的乳化程度及其稳定性。
粘度：以1.1细菌处理后原油为材料，依照文献《Bacterial degradation ofcrude oil using solid formulations of bacillus strains isolated from oil-contaminated soil towards microbial enhanced oil recovery application》中的方法测定发酵液对原油粘度的影响。按式(3)计算驱油细菌的降黏率(Viscosity ReductionRate,VRR％)。
式中：Vs与Vck分别为处理与对照的粘度测值。
以上测定均重复3次。
1.3 细菌发酵液处理原油沥青质、胶质、饱和烃及芳香烃含量测定
沥青质：将2.00g经细菌处理后原油溶解于35mL正己烷中，静置沉降24h，3500r/min离心5min，分别收集沉淀和有机液相上清液。将沉淀置干燥器中干燥称重，即得沥青质质量。
胶质、饱和烃及芳香烃质量(族组成)：采用氧化铝柱层析法测定有机液相上清液中的胶质及烃类质量。
未知组分质量：柱层析结束后回收层析柱内氧化铝，脱脂棉及硫酸铵，烘干称重，计算层析结束后柱内氧化铝等吸附介质与初始质量的差值，即得洗脱过程中柱内氧化铝等吸附介质中残留的未知组分质量。据式(4)计算各组分在原油总质量中的含量P，据式(1)计算各组分较对照的相对增率。
式中：W2及W1分别表示组分接受瓶与瓶内某组分质量之和及空瓶质量，WCK为原油总质量。
1.4 细菌发酵液对纯沥青的降解
降解：准确称取3.000g纯沥青，溶解于30mL四氯化碳中制成均一的沥青溶液。加5滴沥青溶液于已称重载玻片(质量为m0)上，小心转动载玻片铺平沥青溶液，待四氯化碳自然挥发，纯沥青即均匀附着于载玻片上，此时沥青载玻片质量为m1。将沥青载玻片置紫外线照射下灭菌30min后，水平放置于已灭菌的含100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的500mL玻璃瓶中，待冷却后接种10mL细菌种子液，37℃培养35d，每天轻轻摇动组培瓶4次。待培养结束后，取出沥青载玻片，蒸馏水轻柔冲洗3次，自然风干，称取此时沥青载玻片质量m2；向培养液中加入100mL四氯化碳，充分摇匀，使作用过程中进入培养液的沥青溶于有机相，回收有机相，蒸干称重(m3)，则细菌发酵液对沥青的降解量为m1+m3-m2。试验每个处理重复3次。将发酵液对沥青的降解量占初始沥青附着质量的比率定义为沥青降解率(AsphaltDegradation Efficiency,ADE％)，据式(5)计算。据式(1)计算细菌发酵液处理较对照的增率。
族组成：将培养结束后沥青载玻片表面的沥青(质量为m2-m0)用30mL正己烷溶解，按照1.3方法测定细菌发酵液处理沥青族组成。
沥青微形态：将细菌作用后的沥青载玻片分别于放大2倍(反射光)，20倍(透射光)及40倍(透射光)拍照，观察载玻片表面附着沥青微形态变化。
1.5 细菌发酵液对原油的驱替
1.5.1 驱油材料及装置
模拟驱油用油：采自中国陕北延长油田，该油样饱和烃含量为684.50g/kg，芳香烃含量108.33g/kg，胶质39.83g/kg，沥青质含量39.50g/kg，未知组分含量为77.00g/kg。
Pseudomonas taiwanensis C-2发酵液(Fermentation Broth,FB)：于600mL组培瓶中加入150mL驱油用细菌培养基，121℃灭菌30min，待冷却后接种5mL Pseudomonastaiwanensis C-2种子液(用接种环从细菌斜面挑取1环菌体接种至100mL灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃，150r/min摇床振荡培养3d)，37℃，150r/min摇床振荡培养5d，4℃保存待用。
模拟驱油装置：包括驱油装置基本组成、驱油管结构和采气装置，具体为：压力表a1、压缩空气入口b1、压缩空气出口c1、模拟驱油管d1、上端进出阀门a2、下端进出阀门e2、驱替液贮存管b2、快装卡箍c2、油沙管d2、不锈钢滤板g2、棉质滤布h2、密封垫圈f2、采气管密封玻棒a3、采气注射器针头b3、驱油管上端出口连接的导管c3，各部件详见图6。
1.5.2 模拟驱油驱油管准备
油沙管填充材料：细沙，粒径0.15-0.25mm(60-100目)，其中，石英为78％，长石6％，重质矿物16％。用2mol/L稀盐酸溶液浸泡细沙12h，用大量自来水冲洗，以除掉其中的CaCO3等酸溶盐及水溶性盐，再用纯水除去残留的矿质离子；80℃烘干后用磁铁去除沙粒中的铁屑，密封装袋备用。用排水法测定真体积，计算得真密度ρ为2.56g/cm3。
油沙管准备及驱油管组装：在空油沙管下端铺好滤布、不锈钢滤板后加硅胶垫圈，与下端阀门准确对接后用快装卡箍将二者组合，垂直放置；将300.0g细沙分次从空油沙管上端均匀装填到油沙管中，每次装填后均用直径为24mm的平头圆木棒捣实。待全部细沙装填完毕，用木棒自下而上环油沙管均匀敲击油沙管外壁5min，保证管内细沙达到致密状态；在装满细沙的油沙管上端加滤布、不锈钢滤板及硅胶垫圈，再用快装卡箍将油沙管与驱替液贮存管及上端阀门连接，组装成完整的模拟驱油管。在制备好的油沙管中，沙芯柱高290mm，直径29mm，容重1.57g/cm3，根据公式(6)计算，沙芯柱的孔隙度为38.8％。沙芯孔隙体积(Pore Volume,PV)为74.3cm3。
原油填充：将100mL原油加入到200mL烧杯中，60℃水浴溶化，擦干烧杯外壁，称量烧杯与原油的初始总质量(m1)；关闭驱油管下端开关，将约100ml原油灌入驱替液贮存管；加垫圈后用快装卡箍将驱替液贮存管与上端阀门及压缩空气导管连接；将此烧杯置于油沙管下端出口，打开驱油管上下开关，从驱替液贮存管上端通入0.1MPa压缩空气，将驱替液贮存管内原油压入油沙管内，使原油进入沙芯孔隙中并附着在组成多孔体的沙粒载体表面；继续通入压缩空气，使油沙管内多余原油流入下端的接收烧杯中，直至出口不再有油滴滴下继续用压缩空气驱替30min，保证沙芯柱孔隙中的游离态原油尽可能被空气驱出。关闭驱油管上下开关，称量此时烧杯及杯内原油总质量(m2)，m1与m2之差为油沙管内沙芯多孔体吸附的原油质量。将驱油管置28℃培养箱老化24h，使油沙管沙芯多孔体中的原油进一步均匀分布于沙粒载体表面。
松结合态原油驱除：保温老化结束后取出驱油管，向驱替液贮存管中加入100mL45℃纯水，将已定量(m3)的250mL三角瓶C1置于油沙管下端出口，打开驱油管上下开关，从驱替液贮存管上端持续通入0.1MPa压缩空气，至驱油管下端出口不再有水滴流出时关闭空气压缩机，此时随纯水流出的原油为沙芯多孔体孔隙中可用水驱出的松结合态原油。将C1置于4℃冰箱中冷却，待原油凝固后小心倒出三角瓶C1内纯水，使原油附着到三角瓶C1瓶壁上，自然风干三角瓶C1，称取C1质量(m4)，m4与m3之差为水驱松结合态原油质量。(m2-m1)-(m4-m3)为油沙管初始含油量。
1.5.3 原油驱替
方案：对照组CK，连续2批次均为水驱；实验组C-2，连续2批次均为发酵液FB驱。每批次培养7d，温度40℃。
驱替方法：
FB驱替：向驱油管的驱替液贮存管中加入100mL FB，将已定量(m5)的250mL三角瓶C2置于油沙管下端出口下方，开打驱油管上下端开关，从驱油管上端缓慢通入0.1MPa压缩空气，待发酵液逐滴流出约20mL时关闭空气压缩机，将流出的FB再次返回驱替液贮存管，相同步骤重复3次，以保证FB充满沙芯多孔体孔隙中。向驱替液贮存管内加满驱替液，排净空气后关闭驱油管上下端开关，结束注入。将已完成FB充填的驱油管置于40℃培养箱，培养7d。
水驱(CK)：以100mL纯水代替FB，共进行2批次驱替，操作过程同FB。
1.5.4 驱出原油分析
原油收集及质量测定：将三角瓶C2放于油沙管下端，连续通入压缩空气至油沙管下端出口不再有发酵液流出时关闭空气压缩机。另取已定量(m6)的250mL三角瓶C3置于油沙管下端，依照同一步骤向驱替液贮存管加入100mL 45℃纯水，由驱替液贮存管上端持续通入0.1MPa压缩空气，以驱出油沙管内残余发酵液。将C2、C3置于4℃冰箱中冷却，待原油凝固后小心倒出三角瓶内水相。自然风干C2、C3，使原油附着到三角瓶壁上，称取C2质量(m7)，C3质量(m8)。质量m8+m7-m6-m5即为发酵液驱出的吸附态原油质量。驱油率ODR％(OilDisplacement Rate,ODR％)据式(7)计算，处理较水驱处理增率⊿CK％据式(8)计算：
式(8)中：MT和MCK分别表示处理与水驱处理的各参数值。
1.5.5 代谢产物分离及鉴定
取发酵液3.0L，按照文献《Isolation of proline-based cyclic dipeptidesfrom Bacillus sp.N strain associated with rhabitid entomopathogenic nematodeand its antimicrobial properties》中的方法萃取并鉴定代谢产物。
利用SAS 9.2(SAS Institute Inc,Cary,NC,USA)对所有数据进行相关性分析及差异显著性检验。
2 结果与分析
2.1 细菌发酵液对纯沥青的降解及微形态的影响
由表1看出，经过细菌发酵液处理，C-2对沥青载玻片上纯沥青的降解率为8.67％，为对照的37.7倍，与对照差异达到显著水平(P<0.05)。经细菌C-2发酵液处理，纯沥青中饱和烃较对照增加11.2％；芳香烃，胶质及未知组分含量较对照分别降低29.7％、30.2％(P<0.05)及27.9％。
图4为台湾假单胞菌Pseudomonas taiwanensis C-2作用沥青玻片后沥青在玻片上的分布形态图，由图4看出，细菌发酵液处理后载玻片附着沥青的微形态发生了显著变化。载玻片放大2倍时，对照载玻片表面附着的纯沥青呈均匀不透明黑色，C-2处理载玻片上附着的沥青表面出现较多透明斑。放大20倍时，对照仅有少量小透明斑，而C-2处理载玻片附着的沥青上透明斑面积远大于对照。放大40倍时，对照处理载玻片上附着的沥青呈薄而均匀状态，C-2处理载玻片上附着的沥青均呈不同程度的聚集隆起态。
表1 细菌发酵液处理后纯沥青降解率及族组成的变化
2.2 细菌发酵液对原油中沥青的降解及原油族组成的影响
族组成：由表2看出，经细菌发酵液处理，原油中沥青、胶质及未知组分含量较对照分别降低41.1％、19.4％及83.4％，芳香烃降低19.7％，饱和烃含量较对照增加3.8％(P＞0.05)，沥青及未知组分含量与对照的差异均达到显著水平(P＜0.05)。
表2 细菌发酵液处理后的原油族组成(g/kg)
2.3细菌发酵液的驱油特性
2.3.1表面活性及乳化性：从表3看出，在以原油为唯一碳源的液体培养体系中，细菌C-2能提高原油在油水共存体系中的乳化性。其中，C-2处理的乳化层稳定时间约为对照的5.4倍，且能有效降低原油在瓶壁上的附着性。C-2的排油圈直径达8.4cm，约为对照的10倍，即细菌C-2合成的表面活性物质较多或活性较强。C-2在原油为唯一碳源时，其培养液液相的pH为6.85。
2.3.2附着性：从表3看出，接种细菌C-2处理的液体培养瓶壁干净，原油附着少，原油与水相组成的体系乳化度高。细菌C-2在牛肉膏蛋白胨液体培养基中生长时产泡沫较为细腻，表明其形成的表面活性物质多或活性强。
表3 细菌发酵液排油圈直径及培养瓶壁上的原油附着量
注：原油附着量中“+++”、“++”及“+”分别表示瓶壁附着量为大量、少量及轻微。
2.3.3 细菌发酵液对滤纸吸附原油的脱附作用：由表4看出，经过细菌发酵液处理，C-2滤纸吸附态原油的脱附率为90.1％，为对照的3.1倍，与对照差异达到显著水平(P<0.05)。在细菌发酵液对滤纸吸附原油的作用过程中，细菌发酵液的pH显著下降(P<0.05)。图5为Pseudomonas taiwanensis C-2处理原油滤纸后滤纸上残留原油的情况图，从图5看出，细菌发酵液处理吸附原油的滤纸后，滤纸上的残存原油量大幅度减少，与对照CK差异显著(P<0.05)。
表4 细菌发酵液处理滤纸原油脱附率OER％
2.3.4 黏度与排油活性：由表5看出，经过细菌C-2发酵液作用，35℃时的原油粘度较对照显著降低(P<0.05)，降低幅度为34.6％；排油圈直径为对照的36.6倍；培养后发酵液pH下降2.4个单位，与对照差异显著(P<0.05)。
表5 细菌发酵液处理原油粘度、滤纸原油脱附率及发酵液反应前后pH变化
注：表中同列数据后不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。
2.3.5 产表面活性物质
经鉴定，细菌C-2可产生1种具有表面活性的代谢产物TD03，其结构及分子式如下：
TD03：30.9,48.6,114.5,127.3,141.0,154.9
4-methyl-phenol：分子式C7H8O；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:6.96(2H,d,J＝8.6Hz,H-2,H-3),6.61(2H,d,J＝8.6Hz,H-5,H-6),1.51(3H,s)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:154.9(),141.0(C-8),127.3(C-7),114.5(C-3,C-5),30.9(CH3)。以上数据与文献(Ma etal.,2006)报道基本一致，故鉴定为4-methyl-phenol。
2.4 驱油效果
2.4.1 驱油量和驱油率
由表6看出，C-2发酵液在驱替原油过程中总驱油率、总驱油量均显著高于对照水驱(P＜0.05)。在2批次驱替过程中，第1和第2批次发酵液处理的驱油率、驱油量均高于对照水驱，其中第2批次的差异达到显著水平(P＜0.05)。表明细菌发酵液有较强的原油驱出能力。
表6 2次驱替过程中驱油量及驱油率
上述实施例表明，台湾假单胞菌Pseudomonas taiwanensis C-2对原油中的沥青有强烈的降解作用，降解率为41.4％(P<0.05)；对纯沥青的降解率为8.8％。细菌C-2处理对残留纯沥青的族组成产生显著影响：饱和烃增加11.2％，芳香烃、胶质及大分子未知组分含量下降，其中胶质含量的降幅较对照达到显著水平(P<0.05)；改变了附着态纯沥青的微形态：玻片表面纯沥青的附着状态由均匀薄层转化为不均匀的聚集隆起态，同时出现大量无沥青透明斑。另外，供试细菌对原油中沥青的降解率远高于对纯沥青的降解，表明原油中其他轻质组分有助于提高沥青降解率，可能与这些组分对沥青的增溶作用有关。此外，原油中存在的疏水与亲水结构单元，有助于表面活性物质发挥作用，促进细菌对原油中重质组分的降解。供试细菌对沥青降解作用表明，该菌在高沥青含量的稠油油藏微生物强化采油中有较大的应用潜力。
从以上供试Pseudomonas taiwanensis C-2对纯沥青及原油中大分子组分有较强的降解作用可知，供试细菌可分泌能打开稠环化合物中芳香环系、环烷环系等单体之间化学键的酶类，将沥青质降解为胶质，再逐级降解为芳香烃、烷烃。
供试细菌Pseudomonas taiwanensis C-2处理可使35℃时的原油粘度下降34.6％(P<0.05)，且有较强的表面活性物质合成能力及产酸能力。生物表面活性物质能够降低油水界面张力，使原油的粘附能力大幅度降低。细菌在利用滤纸上的原油时会代谢产酸，产生的酸性物质也能够改善油水间的界面张力，进而改变原油的流动性，提升脱附率。
供试细菌Pseudomonas taiwanensis C-2的代谢产物4-methyl-phenol为醇类物质，可溶解油脂，Pseudomonas taiwanensis C-2能够乳化原油与4-methyl-phenol产生有关。驱油微生物的活动主要在油一水界面进行，石油的疏水性阻碍了油的分散程度，直接降低了微生物与油珠接触的表面积，降低了微生物对石油的作用效果。原油乳化可大幅度提高原油的分散程度，增加细菌细胞与油珠的接触机会，促进微生物对石油烃的吸收、降解及转化。
综上所述，本发明提供的台湾假单胞菌Pseudomonas taiwanensis C-2能以原油为唯一碳源生长，且能显著改善原油乳化性，降低原油附着性及粘度，对沥青及原油中的重质组分有较强的降解转化能力，能提高原油中轻质组分含量，具有良好的原油驱替及提高原油品质能力，在MEOR中具有重要应用潜力。
虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 陕西博秦生物工程有限公司 西北农林科技大学
<120> 一株台湾假单胞菌及其应用
<130> 2017
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1408
<212> DNA
<213> Pseudomonas taiwanensis
<400> 1
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tgcctaggaa tctgcctggt agtgggggac aacgtttcga aaggaacgct aataccgcat 120
acgtcctacg ggagaaagca ggggaccttc gggccttgcg ctatcagatg agcctaggtc 180
ggattagcta gttggtgggg taatggctca ccaaggcgac gatccgtaac tggtctgaga 240
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Claims (8)

1.一株台湾假单胞菌，具体为Pseudomonas taiwanensis C-2，于2016年3月14日保藏于在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2016119。
2.根据权利要求1所述的Pseudomonas taiwanensis C-2，其特征在于，所述台湾假单胞菌Pseudomonas taiwanensis C-2的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的Pseudomonas taiwanensis C-2，其特征在于，所述Pseudomonas taiwanensis C-2可产表面活性物质。
4.权利要求1或2所述的台湾假单胞菌在沥青降解中的应用。
5.权利要求1或2所述的台湾假单胞菌在胶质降解中的应用。
6.权利要求1或2所述的台湾假单胞菌在芳香烃降解中的应用。
7.权利要求1或2所述的台湾假单胞菌在原油降解中的应用。
8.权利要求1或2所述的台湾假单胞菌在微生物强化采油中的应用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110205272A (zh) * 2019-06-10 2019-09-06 华南农业大学 一株能降解四环素的台湾假单胞菌及其应用
CN110607264A (zh) * 2019-09-26 2019-12-24 中国科学院上海高等研究院 一株台湾假单胞菌及其应用
CN114369544A (zh) * 2021-12-18 2022-04-19 贵州大学 一种脱氮菌及其在含氮污水处理中的应用

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110205272A (zh) * 2019-06-10 2019-09-06 华南农业大学 一株能降解四环素的台湾假单胞菌及其应用
CN110205272B (zh) * 2019-06-10 2021-04-23 华南农业大学 一株能降解四环素的台湾假单胞菌及其应用
CN110607264A (zh) * 2019-09-26 2019-12-24 中国科学院上海高等研究院 一株台湾假单胞菌及其应用
CN110607264B (zh) * 2019-09-26 2020-10-27 中国科学院上海高等研究院 一株除臭台湾假单胞菌及其应用
CN114369544A (zh) * 2021-12-18 2022-04-19 贵州大学 一种脱氮菌及其在含氮污水处理中的应用
CN114369544B (zh) * 2021-12-18 2023-07-21 贵州大学 一种脱氮菌及其在含氮污水处理中的应用

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