CN101914442B

CN101914442B - 协同降解石油的复合菌液及其制备方法

Info

Publication number: CN101914442B
Application number: CN2010102234636A
Authority: CN
Inventors: 郑立; 崔志松; 陈宇; 高伟; 王绍良; 李倩; 吴亮; 朱生凤; 王东; 王胜; 周文俊
Original assignee: First Institute of Oceanography SOA; China Offshore Environmental Service Tianjin Co Ltd
Current assignee: First Institute of Oceanography SOA; China Offshore Environmental Service Tianjin Co Ltd
Priority date: 2010-07-04
Filing date: 2010-07-04
Publication date: 2011-12-28
Anticipated expiration: 2030-07-04
Also published as: CN101914442A

Abstract

本发明涉及一种协同降解石油的复合菌液及其制备方法。该复合菌液由两株食烷菌97CO-5、97CO-6和一株海杆菌PY97S的发酵培养液混合而成，细胞浓度均为10⁷～10⁹CFU/mL。制备方法是将食烷菌和海杆菌的种子液分别以5％的接种量接入M8培养基或乙酸钠培养基，在25℃、通气量0.25m³/h、搅拌速度150rpm、流加消泡剂消泡的条件下发酵培养，再将各发酵培养液混合即制得复合菌液，再离心制成5倍浓缩液后于4℃保藏。该复合菌液适合于较低环境温度的石油污染生物降解，对石油中烷烃组分和芳香烃组分的降解更充分，比单一降解菌的菌液具有更高的石油降解率，具有明显的协同降解效应。本发明的复合菌液应用于对海洋溢油污染的海岸线或滩涂的生物修复。

Description

协同降解石油的复合菌液及其制备方法

技术领域

本发明属于污染海洋环境生物修复技术领域，具体涉及基于海洋“专性解烃菌”(the obligatehydrocarbonoclastic bacteria，OHCB)协同降解石油效应的一种复合菌液及其制备方法。

背景技术

海洋溢油的频繁发生不仅给海洋养殖业、旅游业等造成巨大的经济损失，还会对海洋生态环境及人类健康造成长远的负面影响。因此，如何消除海洋溢油污染、修复受损海洋生态环境成为海洋环境保护的重要内容之一。生物修复技术由于具有成本低、较彻底、无二次污染等优点，逐渐成为处理溢油的一种有效途径。

海洋专性解烃菌是一类溢油发生前在海洋环境中丰度很低甚至低于检测限，溢油发生后可以迅速增殖并以石油组分为唯一碳源和能源的微生物。它们当中包括Alcanivorax(食烷菌属)、Cycloclasticus(解环菌属)、Marinobacter(海杆菌属)、Marinobacterium(海细菌属)、Neptunomonas、Oleispira(油螺旋菌属)、Thalassolituus等属的细菌。20世纪90年代兴起的溢油原位生物修复技术，正是通过添加海水中缺乏的氮、磷元素刺激这类细菌的生长、加快石油降解速率来实现的。由于这类细菌在溢油去除过程中作用显著，并且具有迥异于陆源耐盐降解菌的生长特性、难以获得纯培养，所以它们是一种重要的、相对稀缺的海洋菌种资源。但是采用单独一种专性解烃菌往往存在石油降解速率低、修复效果差的问题。

在溢油这种成分极其复杂的有机污染物降解过程中，在不同降解菌之间存在着各种复杂的关系，降解菌之间的协同效应是彻底降解溢油污染物的必然方式。因此，如何充分利用海洋专性解烃菌之间的协同效应、制备复合菌液对海洋溢油进行生物修复，已成为海洋溢油生物修复技术研究的难点。

发明内容

本发明的目的是提供一种协同降解石油的复合菌液及其制备方法，即利用微生物之间在石油降解过程中的协同效应，用3株每洋专性解烃菌制备降解石油的复合菌液，以高效快速的对海洋岸滩溢油污染环境进行生物修复。

本发明涉及的复合菌液的菌种为2个种、3株海洋专性解烃菌，其中1种(2株)是食烷菌(Alcanivoraxsp.)，另外1种(1株)是海杆菌(Marinobacter sp.)；上述3株细菌已分别于2009年8月20日、2010年4月16日保藏至中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号分别为CGMCC No.3735(菌株Alcanivorax sp.97CO-5)、CGMCC No.3736(菌株Alcanivorax sp.97CO-6)、CGMCC No.3244(菌株Marinobacter sp.PY97S)，其纯培养的主要特征如下：

(1)菌株PY97S能够降解包括萘、2-甲基萘、2，-二甲基萘、联苯、苊、芴、菲、蒽、二苯并呋喃、二苯并噻吩、苯并[α]芘在内的至少11种PAHs。采用GC-MS测定了菌株PY97S对典型PAHs菲的降解率，发现它对初始浓度为0.2g/L的菲在10d后的降解率可达到99％。

(2)菌株97CO-5、97CO-6均能够以原油或柴油为唯一碳源和能源生长，并且都能够将含有原油的培养基的表面张力从58mN/m降低至28～30mN/m，说明这些菌株可以产生生物表面活性剂以提高传质速率，加快石油降解过程。

本发明的技术方案为：

1、协同降解石油的复合菌液：

(1)本发明的复合菌液是由食烷菌97CO-5、食烷菌97CO-6和海杆菌PY97S的发酵培养液组成：将对数生长后期(OD₆₀₀分别为0.5～1.5，细胞密度为10⁸～10⁹CFU/mL)的3株海洋专性解烃菌(97CO-5、97CO-6、PY97S)的发酵培养液均匀混合制成复合菌液；

(2)本发明的复合菌液中3株菌的细胞浓度均为10⁷～10⁹CFU/mL。

2、食烷菌97CO-5、食烷菌97CO-6和海杆菌PY97S的发酵培养液制备步骤如下：

(1)制备种子液：将超低温(-80℃)保藏的菌种分别接入50mL～10L的M8培养基或乙酸钠培养基，在18～35℃、50～200rpm、避光的条件下培养至对数生长后期，分别制备三种种子液；

(2)发酵培养液制备：将上述的种子液按照1％～10％的接种量分别接入15L～500L的M8培养基或乙酸钠培养基，发酵条件为发酵温度控制在18～35℃、通气量控制在0.10～0.50m³/h、桨叶搅拌速度控制在50rpm～300rpm、在消泡电极的控制下自动流加消泡剂进行消泡；培养到各自细胞密度为10⁸～10⁹CFU/mL时停止发酵，即制得各发酵培养液；最后将发酵培养液混合制得复合菌液。

3、制得的复合菌液通过大容量低温离心机进行3～10倍浓缩，将复合菌液或浓缩液置于4℃保藏。

其中，M8培养基每升含22.79g NaCl，11.18g MgCl₂·6H₂O，3.98g Na₂SO₄，1.46g CaCl₂·2H₂O，1.30gTAPSO，0.72g KCl，0.27g NH₄Cl，89.00mg Na₂HPO₄·7H₂O，83.00mg NaBr，31.00mg NaHCO₃，27.00mgH₃BO₃，24.00mg SrCl₂·6H₂O，2.60mg NaF，2.00mg FeCl₂·4H₂O，2g乙酸钠，0.5g蛋白胨，0.5g酵母提取物，0.5g马铃薯浸出粉，0.2g葡萄糖，0.2g蔗糖，0.05g苹果酸钠，0.05g柠檬酸三钠，0.05g酒石酸钾钠，pH7.8；用于菌株97CO-5、97CO-6的培养；

乙酸钠培养基每升含22.79g NaCl，11.18g MgCl₂·6H₂O，3.98g Na₂SO₄，1.46g CaCl₂·2H₂O，1.30gTAPSO，0.72g KCl，0.27g NH₄Cl，89.00mg Na₂HPO₄·7H₂O，83.00mg NaBr，31.00mg NaHCO₃，27.00mgH₃BO₃，24.00mg SrCl₂·6H₂O，2.60mg NaF，2.00mg FeCl₂·4H₂O，2g乙酸钠，pH7.6；用于菌株PY97S的培养。

本发明的复合菌液适合于较低环境温度的石油污染生物降解，并且其降解速率较快，在2周后即可降解82％初始浓度为10g/L的原油；该复合菌液比单一降解菌菌液具有更高的石油降解率，对石油中烷烃组分和芳香烃组分(包括高分子量芳香烃)的降解更充分。

附图说明

图1为本发明以重量法测定石油降解率比较示意图。

图2为本发明以生物降解后石油中的部分烷烃组分的半定量结果比较示意图(相对于氘代正二十四烷)。

图3为本发明以生物降解后石油中的部分芳香烃组分的相对含量结果比较示意图(相对于氘代三联苯)。

其中：NC，不接种的阴性对照处理；PY97S、97CO-5、97CO-6，分别为单一菌株培养液；

图2中的nC18～nC31是不同碳链长度的正构烷烃；Py，植烷。

图3中的C0-N，萘；C0-P，菲；C0-D，二苯并噻吩；C1-N～C4-N，取代基为1～4个碳原子直链烷烃的萘；C1-P-C4-P，取代基为1～4个碳原子直链烷烃的菲；C1-D～C3-D，取代基为1～3个碳原子直链烷烃的二苯并噻吩。

具体实施方式

实施例1：协同降解石油的复合菌液的制备步骤：

(1)制备种子液：分别配制M8培养基各10L用于菌株97CO-5、97CO-6的培养，配制乙酸钠培养基10L用于菌株PY97S的培养。将超低温保藏的冻存菌种按照2％的接种量分别接入上述两种培养基，即菌株97CO-5、97CO-6分别接种到10LM8培养基，菌株PY97S接种到10L乙酸钠培养基，在25℃、150rpm、避光的条件下培养至对数生长后期，制备种子液。

(2)菌液发酵培养

分别配制M8培养基各200L用于菌株97CO-5、97CO-6的发酵罐培养，配制乙酸钠培养基200L用于菌株PY97S的发酵罐培养；将种子液按照5％的接种量分别接入M8培养基或乙酸钠培养基，即菌株97CO-5、97CO-6的种子液分别接种到200L M8培养基，菌株PY97S的种子液接种到200L乙酸钠培养基。其发酵条件为通气量0.25m³/h，桨叶搅拌速度150rpm，发酵温度25℃。在消泡电极的控制下采取流加豆油的常规方式消泡，提高菌体发酵产率，停止发酵时细胞密度为10⁸～10⁹CFU/mL。

(3)将下罐后的3株海洋专性解烃菌的培养液均匀混合，以制备约600L石油降解复合菌液；复合菌液中食烷菌97CO-5，食烷菌97CO-6，海杆菌PY97S的细胞密度各自为10⁷～10⁹CFU/mL。用大容量4℃低温离心机在8000rpm、15min的条件下离心以制备5倍浓缩的石油降解复合菌液制剂浓缩液，便于运输和使用。

(4)将上述复合菌液浓缩液置于4℃保藏。

实施例2本发明降解石油效果的检验方法为：

(1)配制石油降解效果检验培养基每升含22.79g NaCl，11.18g MgCl₂·6H₂O，3.98g Na₂SO₄，1.46gCaCl₂·2H₂O，1.30g TAPSO，0.72gKCl，0.27g NH₄Cl，89.00mg Na₂HPO₄·7H₂O，83.00mg NaBr，31.00mgNaHCO₃，27.00mg H₃BO₃，24.00mg SrCl₂·6H₂O，2.60mg NaF，2.00mg FeCl₂·4H₂O，10g原油，pH7.6。

(2)石油降解实验：将单一降解菌PY97S、97CO-5、97CO-6的菌液及复合菌液均按照2％的比例分别接到100mL石油培养基中；不接种微生物的处理作为阴性对照；上述每种处理设3个重复。在150rpm、20℃、避光的条件下培养2周。采用重量法及GC-MS分析、比较单一降解菌培养液和复合菌液对原油的降解率及石油降解后产物的多元色谱图。

(3)样品前处理：将降解后的石油样品及阴性对照在10000rpm的条件下离心10min去除细菌细胞，准确量取50mL二氯甲烷萃取其中的残余油污。从二氯甲烷相准确量取2mL溶液，先用无水Na₂SO₄脱水，再用0.22μm耐有机溶剂滤膜过滤，经氮气吹干后以正己烷重新溶解，并添加相应内标(氘代正二十四烷为正构烷烃的内标，氘代三联苯为多环芳烃的内标)，移入GC样品瓶中并定容至1mL，用于GC-MS对石油降解后残留的烷烃、芳香烃组分进行分析测定。另外从二氯甲烷相吸取20mL溶液，用于重量法计算降解率。

(4)重量法测定石油降解率：将萃取液转移到尖底烧瓶中，在40℃的条件下旋转蒸发，称量带有残留油污的烧瓶总重，减去烧瓶本身重量，得到残留油污的重量m，按照以下公式计算求得降解率：

[(m₀-2.5m)/m₀]×100％(m₀为最初加入培养基中的石油重量)

(5)石油组分的GC-MS分析：气相色谱(Agilent HP7890 Plus)；质谱检测器(Agilent HP5975)；色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱；进样口温度：280℃；离子源温度：250℃。载气为氦气(99.999％)，流速1mL/min。程序升温：50℃保持2min，以6℃/min升至300℃，300℃保持10min。扫描模式：SCAN、SIM模式；扫描质量范围：50～500。进样：HP7683自动进样器，不分流进样1μL。数据采集和处理：HP3365化学工作站。

本发明的实验结果如下：

1、复合菌液比单一降解菌菌液具有更高的石油降解率：采用重量法测定了生物降解后培养基中残留石油的重量，并计算降解率。如图1所示，复合菌液的处理相对于降解菌97CO-5菌液、97CO-6菌液的处理具有更高的降解率，它们对石油的降解率分别为82％、53％和47％。

2、复合菌液通过降解菌之间的协同效应使石油中烷烃组分充分降解：如图2所示，经过2周的摇床培养，海杆菌PY97S对烷烃组分的降解作用不显著，食烷菌97CO-5、97CO-6对烷烃组分具有较好的降解效果，而加入复合菌液的处理对石油烷烃的降解最彻底，表现出明显的协同降解效应。从烷烃色谱峰的半定量结果来看，复合菌液对石油中C11～C35的烷烃组分的降解是最彻底的。

3、复合菌液通过降解菌之间的协同效应使石油中芳香烃组分(包括高分子量芳香烃)充分降解：如图3所示，经过2周的摇床培养，海杆菌PY97S对出峰时间较早的低分子量芳香烃组分的降解效果比较显著，但是对出峰时间较晚的高分子量芳香烃组分的降解作用不太显著；食烷菌97CO-5、97CO-6对高、低分子量的烷基化芳香烃组分均具有较好的降解效果；而加入复合菌液的处理对石油芳香烃的降解效果最好，显然有特别明显的协同降解效应。从石油中芳香烃组分的相对丰度变化来看，复合菌液对石油中芳香烃的降解是很佳的。

综上所述，本发明的协同降解石油的复合菌液特别用于对海洋溢油污染的海岸线或滩涂地带进行生物修复。

Claims

1.一种协同降解石油的复合菌液，其特征在于该复合菌液由食烷菌(Alcanivorax sp.)97CO-5：CGMCC No.3735、食烷菌(Alcanivoraxsp.)97CO-6：CGMCC No.3736和海杆菌(Marinobacter sp.)PY97S：CGMCC No.3244的发酵培养液组成。

2.如权利要求1所述的协同降解石油的复合菌液，其特征在于该复合菌液中食烷菌97CO-5、食烷菌97CO-6和海杆菌PY97S的细胞浓度均为10⁷～10⁹CFU/mL。

3.如权利要求1所述的协同降解石油的复合菌液，其特征在于上述复合菌液用离心机在8000rpm、15min离心制得5倍浓缩液后于4℃保藏。

4.权利要求1所述的协同降解石油的复合菌液的制备方法，其特征在于将超低温保藏的97CO-5菌种和97CO-6菌种按2％的接种量分别接种到M8培养基，将超低温保藏的PY97S菌种按2％的接种量接种到乙酸钠培养基，且均在25℃、150rpm转速、避光的条件下培养到对数生长后期制备种子液；再将食烷菌97CO-5、97CO-6的种子液以5％的接种量分别接入M8培养基，海杆菌PY97S的种子液以5％的接种量接入乙酸钠培养基，均在25℃、通气量0.25m³/h、桨叶搅拌速度150rpm，流加消泡剂消泡的条件下培养到细胞密度为10⁸～10⁹CFU/mL时停止发酵，分别制得发酵培养液；最后将发酵培养液混合制得复合菌液。

5.如权利要求4所述的协同降解石油的复合菌液的制备方法，其特征在于上述的流加消泡剂消泡是采取自动流加豆油的方式消泡。

6.权利要求1所述的协同降解石油的复合菌液应用于海洋溢油污染的海岸线或滩涂的生物修复。