CN108130299B - 一株降解石油烃的微生物菌株及联合修复剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株降解石油烃的微生物菌株，所述微生物菌株为门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina PM，保藏编号为CCTCC NO：M2017347。同时还提供一种油污土壤联合修复剂，所述联合修复剂包括上述的微生物菌剂，还包括吸油材料。本发明以筛选降解多环芳烃类物质为主的微生物菌群为出发点，获得一株高效降解石油烃的菌株。并从节约能源与使用廉价材料的角度出发，利用农田的玉米秸秆为原料，以苯乙烯和甲基丙烯酸丁酯‑苯乙烯的混合物为接枝单体，制备出高效的吸油材料PGS和BMGS。通过降解实验，得到改性玉米秸秆BMGS能够在短时间内迅速联合微生物快速降解油污土壤中的石油，降解效果十分明显。

Description

一株降解石油烃的微生物菌株及联合修复剂

技术领域

本发明提供了一株能够降解石油烃的微生物菌株及联合修复剂，能够有效降解多种石油烃，能够用于联合治理油污土壤。

背景技术

治理油污土壤的方法主要有化学浸出法和热处理以及生物修复法。在这些方法中，物理修复和化学修复很难完全达到修复要求，主要表现为易产生二次污染、修复效果不理想、能耗高、综合利用程度低和资源回收率低等问题。而生物修复技术被认为是一种绿色环保、无二次污染、高效、可彻底降解污染物的具有发展前景的石油污染修复方法，该技术关键在于利用功能微生物来高效降解多种石油烃组分。

发明内容

本发明针对目前治理油污土壤的现状，提供了一株能够有效降解石油烃例如正构烷烃、霍烷和芳香烃的微生物菌株，能够用于治理石油污染土壤，将其制备得到微生物菌剂，并进一步提供了该微生物菌剂与吸油材料联合作用修复石油污染土壤的方法。该微生物菌株为门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)，命名为PM，将其于2017年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2017347。

本发明的第一个目的是提供一株降解石油烃的微生物菌株，所述微生物菌株为门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina PM，保藏编号为CCTCC NO：M2017347。

本发明的第二个目的是提供一种利用上述的微生物菌株制备得到的微生物菌剂。

本发明的第三个目的是提供一种如上述的微生物菌剂的制备方法，将权利要求1中所述的门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina PM CCTCC NO：M2017347接种活化后进行发酵得到的，作为优选，所述发酵的条件为：温度29～31℃，240～260r/min下摇床进行有氧发酵。

本发明的第四个目的是提供上述的微生物菌株或微生物菌剂在降解石油烃或治理油污土壤中的应用；

作为优选，所述石油烃包括正构烷烃、霍烷和芳香烃。

本发明的第五个目的是提供一种油污土壤联合修复剂，所述联合修复剂包括上述的微生物菌剂，还包括吸油材料。

作为优选，所述吸油材料为利用苯乙烯或甲基丙烯酸丁酯-苯乙烯的混合物改性的玉米秸秆。

作为优选，所述利用苯乙烯改性的玉米秸秆的制备方法为：在惰性气体环境，温度为60℃时，将玉米秸秆、引发剂过氧化苯甲酰、改性剂苯乙烯和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺混合后进行反应，除杂，得到改性玉米秸秆；

所述利用甲基丙烯酸丁酯-苯乙烯改性的玉米秸秆的制备方法为：在惰性气体环境，温度为50℃时，将玉米秸秆、引发剂硝酸铈铵、改性剂苯乙烯和甲基丙烯酸丁酯，以及交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺混合后进行反应，除杂，得到改性玉米秸秆。

作为优选，所述微生物菌剂和吸油材料的用量比为4-6ml：1-1.5g；

作为优选，所述微生物菌剂和吸油材料的用量比为6ml：1g。

本发明的第六个目的是提供上述联合修复剂的制备方法，将微生物菌剂和吸油材料混合，待微生物菌剂被吸油材料完全吸附后，得到联合修复剂。

本发明的第七个目的是提供上述的联合修复剂在降解石油烃或快速修复油污土壤中的应用。

本发明的第八个目的是提供一种快速修复油污土壤的方法，将上述联合修复剂加入含油土壤，再加入营养液进行修复油污土壤；作为优选，在修复过程中翻动土壤。翻动土壤可以加速油污土壤的修复，对于翻动土壤的频率没有特殊要求，比如可以每天一次。

本发明对营养液的成分没有具体要求，只要能够对本发明的微生物菌剂进行扩大培养即可。

本发明以筛选降解多环芳烃类物质为主的微生物菌群为出发点，获得一株高效降解石油烃的菌株。并从节约能源与使用廉价材料的角度出发，利用农田的玉米秸秆为原料，以苯乙烯和甲基丙烯酸丁酯-苯乙烯的混合物为接枝单体，制备出高效的吸油材料PGS和BMGS。通过降解实验，得到改性玉米秸秆BMGS能够在短时间内迅速联合微生物快速降解油污土壤中的石油，降解效果十分明显。通过表征、吸油、土壤降解实验，探究两种材料的吸油效果以及降油特性与微生物之间的关系，并提供出油污土壤现场微生物修复技术的具体实施措施，可使得3％浓度的油污土壤最大降解率达到78％左右，5％浓度的油污土壤最大降解率达到69％左右。是一种高效、经济、持久且对环境扰动小的治理方案，具有显著的经济效益和社会效益。本发明公开的石油污染土壤微生物修复菌剂的制备及修复方法具有很高的实用价值，可广泛应用于石油污染土壤、海岸沙滩、采油废水和黄土塬区石油污染土壤TPH污染物的生物修复控制技术。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为油污土壤降解变化。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

营养肉汤培养基的配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH7.4～7.6。

实施例1微生物菌剂的制备

(1)微生物菌株的获得

该菌株来源于陕西姬塬油田附近的油污土壤中，以原油为唯一碳源，通过筛选富集分离法，最终分离筛选出具有高效石油降解能力的一株菌，鉴定结果见表1所示。

表1菌株鉴定结果

将该筛选得到的菌株于2017年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2017347。

(2)微生物菌株接种活化

在无菌条件下，将门多萨假单胞菌PM(Pseudomonas mendocina PM)CCTCC NO：M2017347接种到装有营养肉汤培养基的三角瓶中(灭菌后)进行初次发酵，放置30℃、250r/min的摇床中有氧培养48h，待用。

(3)微生物菌剂的制备

将上述培养了48h的门多萨假单胞菌PM(Pseudomonas mendocina PM)CCTCC NO：M2017347按照5％(体积百分比)的接入量接入发酵罐中进行二次发酵培养，发酵培养基为：营养肉汤培养基，发酵温度为30℃，250r/min下摇床有氧培养24h后得到该菌种子液。放置4℃冰箱保存，待用。

实施例2微生物菌剂对油污土壤的修复实验

一、本发明的微生物菌剂对正构烷烃、霍烷、芳香烃的实验室降解实验：

实验分两组：空白油样组和PM油样实验组。

PM油样实验组的实验过程为：

在无菌条件下，取实施例1制备得到的微生物菌剂1.5ml，接入20ml无机盐培养基的三角烧瓶，培养基含10mg原油(无机盐培养基配方：NH₄NO₃ 3g/L，K₂HPO₄ 1.6g/L，KH₂PO₄3g/L，微量元素液6mL，蒸馏水1000mL；微量元素液(g/L):MgSO₄·7H₂O 0.15，FeSO₄·7H₂O0.18，CuSO₄ 0.15，无水CaCl₂ 0.02，Na₂EDTA·2H₂O 0.02，pH 7.1，121℃高压蒸汽灭菌20min)，30℃摇床震荡培养15天后取出原油，在原油中加入10ml氯仿，放入超声波仪器中破乳15分钟，倒入滴液漏斗中将氯仿萃取出来，重复三次，再放入水浴中蒸发将氯仿蒸发至尽，剩下的物质准确称量后定容10ml，即为GC-MS测试降解油样。

空白对照组的实验过程为：不加入微生物菌剂，其余实验条件及实验过程与PM油样实验组相同。

GC-MS实验条件：

载气选用氦气，流速1.0ml/min；DB-5MS毛细管柱，分流进样，分流比10:1，进样量1μl；尾吹流量10.0ml/min；进样口温度为250℃，离子源温度为230℃；柱温采用程序升温，初温40℃，保持8分钟，再以10℃/min升至220℃，保持17分钟，再以10℃/min升至290℃，保持10分钟；离子化方程(EI)，离子化能量为70eV。质谱全扫描(Scan)定性，扫描范围：45-500amu。

试验结果如下：

表2菌株降解正构烷烃生标特征比较

由表2可知，从正构烷烃26种物质的降解率可以看出，15天时，实施例1的微生物菌剂对于正构烷烃降解都有明显优势。菌种的∑C21‐/∑C22+均小于1，表明该菌在降解正构烷烃时高碳数烷烃的降解速率明显大于低碳数烷烃，对原油作用15天后其Pr/Ph比值均呈明显的增大趋势且均小于1，反映出原油中类异戊二烯烷烃在细菌15天的作用过程中仍发生了轻微的降解，使部分植烷(C₂₀H₄₂M＝282)脱去一个甲基转化为姥鲛烷(C₁₉H₄₀M＝268)。Pr/C17和Ph/C18均增大且都小于1，说明降解后C17与C18的含量分别比姥鲛烷和植烷高，原油受细菌15天作用过程中烷烃受到较明显的降解，而类异戊二烯烷烃则比较稳定。

表3菌株降解霍烷生标特征比较

由表3可知，实施例1的微生物菌剂能促使五环三萜类化合物(霍烷)的手性碳R构型向更稳定的S构型转化，并在15天时(C31αβ-22S/22(S+R)＝0.600)就已经达到转化终点。经本发明的微生物菌剂作用过的样品Ts/Tm值均大于原始油样的该值，说明本发明的微生物菌剂作用能促使五环三萜类化合物立体构型中不稳定构型向稳定性构型转化。∑藿烷/∑正构烷烃比值明显小于原油(0.394)，达到0.158，表明原油遭受该菌降解时藿烷系列的降解速率明显大于正构烷烃系列。

表4菌株降解芳香烃比较

由表4可知，15天残油样中并未检测出萘，证明萘在15天前已经被本发明的微生物菌剂的强烈去甲基反应降解完全。PM的菲/正构烷烃比值为0.100，明显小于原始油样的0.169值，表明本发明的微生物菌剂作用原油时菲系列的降解速率明显大于正构烷烃。同理，屈/正构烷烃比值中PM均大于原始油样的值，表明本发明的微生物菌剂作用原油时正构烷烃的降解速率明显大于屈系列。PM的屈/正构烷烃比值为0.021，明显小于原始油样的0.077值，表明本发明的微生物菌剂作用原油时屈系列的降解速率明显大于正构烷烃。整体而言，PM菌的菲/正构烷烃比值和屈/正构烷烃比值均小于原油，说明本发明的微生物菌剂对芳香烃有较好的降解优势。

由上述对正构烷烃、霍烷、芳香烃进行降解实验可知，本发明的微生物菌剂对三种物质均有较好的降解优势。

二、本发明的微生物菌剂对油污土壤修复的现场试验

在自然环境下，将本发明的微生物菌剂60ml加入1kg原油污染土壤中，然后再加入无机盐营养液500ml，最后将土壤中的原油浓度调整为3～5％的质量浓度。实验周期为30天，每天翻耕一次，定期对油污土壤中各组分含量进行测定。加入的无机盐营养液配方为：NH₄NO₃ 3.0g/L，K₂HPO₄ 1.6g/L，KH₂PO₄ 3g/L，微量元素液6ml，蒸馏水1000ml。微量元素液：MgSO₄·7H₂O 0.15g/L，FeSO₄·7H₂O 0.18g/L，CuSO₄ 0.15g/L，无水CaC1₂ 0.02g/L，Na₂EDTA·2H₂O 0.02g/L，pH 7.1，121℃高压蒸汽灭菌20min。测定结果见表5。

表5现场高、低浓度的油泥含量变化(g/kg)

由表5可以看出，随着时间的变化，总石油量、饱和烃及芳香烃都有明显的降解，其中饱和烃的降解速度是最快的，因为菌剂降解饱和烃所需要的能量最小，在将大多数饱和烃降解完后菌剂变化转向较难降解的芳香烃，降解芳香烃所需要的能量比饱和烃大，所以菌剂在降解过程中会选择先降解饱和烃再降解烷烃，在第30天的时候，低浓度总残余量为7.54g，高浓度为36.58g，此时降解率分别为78％、69％，随着时间的变化，虽然降解率在增大，但幅度在减小。除此之外，随着实验进一步进行，外界的温度的逐渐降低也会影响修复效果。在整个降解过程中非烃跟沥青质的含量变化非常小的。非烃中大多是高分子脂肪酸，而沥青质分子量更高，在500-100000之间，微生物降解他们的速度很慢，短期内这两种物质的变化很小，但含量会有所减小。可以看出，这是一种高效、经济、持久且对环境扰动小的治理方案，具有显著的经济效益和社会效益。本发明的微生物菌剂具有很高的实用价值，可广泛应用于石油污染土壤、海岸沙滩、采油废水和黄土塬区石油污染土壤TPH污染物的生物修复控制技术。

实施例3微生物菌剂与吸油材料对油污土壤的联合修复实验

一般来说，吸油材料可分为无机矿物材料、合成有机材料和天然有机材料。无机矿物材料(如黏土、氧化硅、蛭石等)吸油能力低、油水选择差，限制了它在环境中的广泛应用；合成有机材料(如聚氨脂)虽然具有高效的吸油特性，却存在合成成本高、吸油副产物多、吸油后难于处理等问题。与此相比，天然有机材料(如玉米)有着巨大优势，不仅廉价易得，吸油后还能够完全从油污土壤中去除，环境危害少；可与其他方法(如微生物修复法)联合使用；并且能够通过简单的改性获得高效的吸油率。

目前，提高天然有机材料吸油性能的方式主要为增加材料的亲油疏水性和扩充材料表面积及空隙率，前者可通过酰化、接枝共聚等方法进行处理，后者可利用蒸煮加热解碳化和微生物法加以改造。相对于其他方法，接枝共聚能够有针对性地提高材料的性能。西北地区作为玉米的主要产区，有着大量废弃的秸秆材料，若因地取材，不仅可变废为宝，还能增加资源的利用率，玉米秸秆经过化学改性后在纤维结构中引入特定功能基团，使得改性玉米秸秆对特定的重金属离子具有高的选择性与吸附容量，将成为生物基吸附材料的重要开发方向，为将来替代价格相对较贵的吸附材料活性炭、离子树脂等奠定基础，为秸秆的高效利用提供了重要途径。

正是因为上述原因，在考虑成本和效率双重条件下，本发明以玉米秸秆为基材，以苯乙烯和甲基丙烯酸丁酯-苯乙烯的混合物为接枝单体，综合两类单体的优点进行物理-化学复合交联制备高效吸油材料。同时，将本发明的微生物菌剂添加到制备好的吸油材料中，研究微生物菌剂与吸油材料联合修复油污土壤的方法，以期为油污土壤的治理提供一种无二次污染的价廉高效的修复技术。并进行了以下实验：

一、改性玉米秸秆的制备

通过化学改性以玉米秸秆为原料制备出两种高效吸油率的材料，以玉米秸秆(RMS)为原料，苯乙烯或甲基丙烯酸丁酯-苯乙烯的混合物为接枝单体，通过化学改性制备出两种材料，苯乙烯改性的材料用PGS(phenylethylene-grafted maize straw)表示，甲基丙烯酸丁酯和苯乙烯联合改性的材料用BMGS(butyl methacrylate grafted maizestalks)表示。

玉米秸秆化学改性的方法：

将玉米秸秆(RMS)粉末和蒸馏水加入放有磁力搅拌磁的四口烧瓶内，把四口烧瓶放在已加有硅油的DF-I集热式磁力加热搅拌器中，四口烧瓶连接冷凝管，向四口烧瓶通入高纯氮气10min后，在一定温度下加入定量的引发剂，反应单体苯乙烯(Ph)和甲基丙烯酸丁酯(BMA)、交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺进行反应。当反应结束，趁热抽滤，同时用蒸馏水和乙醇洗涤数次后放在60℃的真空干燥箱中烘干。将烘干的材料用甲苯进行索氏提取48h，目的是去除反应生成的均聚物，获得纯化的改性材料。索氏提取48h后，先用60℃的热水洗涤数次，再用乙醇洗涤，后放在真空干燥箱中烘干,备用。具体为：

A、苯乙烯改性的方法

称量18g已干燥好的玉米秸秆粉末装进500ml的四口烧瓶，同时加入300ml去离子水后，放入搅拌磁。将烧瓶置于DF-I磁力加热搅拌器内，设定温度为60℃，加热到设定温度后通入氮气10min。将称量好的1.8g引发剂过氧化苯甲酰(BP)、2.0ml单体苯乙烯(Ph)、0.12g交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MDA)混合后用注射器注入四口烧瓶内,反应6h，反应过程一直保持通氮气。当反应时间到后，卸下装置，趁热将反应物抽滤，同时用蒸馏水和乙醇(98％)洗涤，再放到真空干燥箱中烘干至恒重。将烘干的材料用甲苯进行索氏提取48h，彻底除去材料含有的水分，除掉反应过程中生成的均聚物，使获得的改性材料得到纯化。连续回流抽提48h后，用60℃的热水和乙醇洗涤抽滤，再置于真空干燥箱内烘干，最后将烘干的改性材料PGS放到电冰箱内冷藏备用。

B、甲基丙烯酸丁酯-苯乙烯的改性方法

称量30g玉米秸秆粉末加进500ml的四口烧瓶中，同时加入300ml去离子水，放入搅拌磁。将烧瓶置于DF-I磁力加热搅拌器内，设定温度为50℃，加热到设定温度后通入氮气10min。再加入0.3837g硝酸铈铵，0.4374g苯乙烯，29.86g甲基丙烯酸丁酯和0.0300g交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MDA)。反应时间15h后，取下反应物趁热抽滤，放入真空干燥箱干燥后进行索氏提取，再抽滤后干燥，获得纯化的改性材料BMGS，放入冰箱冷藏备用。

二、微生物菌剂和不同吸油材料联合时对油污土壤的联合修复实验

在本实施例中，利用实施例1所制备的微生物菌剂和不同吸油材料联合对油污土壤进行修复处理，添加土壤体积比为4～6.0％的微生物菌剂联合用于修复7％浓度以下的油污土壤。

具体操作如下：

(1)准备实施例1制备的微生物菌剂；

(2)准备玉米秸秆RMS、改性玉米秸秆PGS和BMGS；

(3)将步骤(1)制备的微生物菌剂分别与步骤(2)的玉米秸秆RMS、改性玉米秸秆PGS或BMGS混合均匀，使得微生物菌剂被玉米秸秆RMS、改性玉米秸秆PGS或BMGS完全吸附，得到联合修复剂，将联合修复剂与油污土壤均匀混合，探究微生物菌剂与吸油材料的联合降油效果并进行讨论。

实验分5组，每个花盘分别加入1kg筛好的土样，然后加入实施例1制备的微生物菌剂60ml，和/或加入玉米秸秆RMS、PGS或BMGS 10g。每一组再分别加3％质量浓度的标准油，边翻土样边喷洒标准油，使土样与标准油混合均匀，实验温度为室温。其中，第1组仅加入3％质量浓度的标准油，作为自然降解的对照组，其他各组都加无机盐营养液500ml。无机盐营养液成分为：NH₄NO₃ 3.0g/L，K₂HPO₄ 1.6g/L，KH₂PO₄ 3g/L，微量元素液6ml，蒸馏水1000ml。微量元素液：MgSO₄·7H₂O 0.15g/L，FeSO₄·7H₂O 0.18g/L，CuSO₄ 0.15g/L，无水CaC1₂ 0.02g/L，Na₂EDTA·2H₂O 0.02g/L，pH 7.1，121℃高压蒸汽灭菌20min。实验设计如下：

第1组是3％质量浓度的标准油，作为对照组。

第2组是在第一组的基础上+60ml的微生物菌剂。

第3组是在第二组的基础上+10g的RMS。

第4组是第一组的基础上+60ml微生物菌剂+10g BMGS。

第5组是第一组的基础上+60ml微生物菌剂+10g PGS。

分别测试了3、14、21天各组的残留量，实验结果见表6。结果表明，没有经过任何改性的RMS组降解效果很一般；改性后的PGS组不如BMGS组。其中，第4组3％油+60ml菌剂+10gBMGS残留总量最少，可见其降油效果最佳。

表6土壤的残油总量(g)

三、微生物菌剂与改性玉米秸秆两者不同比例时对油污土壤的联合修复实验

在本实施例中，利用实施例1所制备的微生物菌剂和改性玉米秸秆BMGS混合均匀对油污土壤进行修复处理，添加土壤体积比为4～6.0％的微生物菌剂联合用于修复7％浓度以下的油污土壤。

具体操作如下：

(1)准备实施例1制备的微生物菌剂；

(2)准备改性玉米秸秆BMGS；

(3)将步骤(1)制备的微生物菌剂与步骤(2)的改性玉米秸秆BMGS混合均匀，使得微生物菌剂被改性玉米秸秆BMGS完全吸附，得到联合修复剂，将联合修复剂与油污土壤均匀混合，探究微生物菌剂与改性玉米秸秆BMGS的联合降油效果并进行讨论。

实验分6组，每个花盘分别加入1kg筛好的土样，然后分别加入实施例1制备的微生物菌剂40、50、60ml，并分别加入玉米秸秆BMGS 10、15g。每一组再分别加3％质量浓度的标准油，边翻土样边喷洒标准油，使土样与标准油混合均匀，实验温度为室温。各组都加无机盐营养液500ml。保持每天翻土一次，实验周期为一个月。其中无机盐营养液成分为：NH₄NO₃3.0g/L，K₂HPO₄ 1.6g/L，KH₂PO₄ 3g/L，微量元素液6ml，蒸馏水1000ml。微量元素液：MgSO₄·7H₂O 0.15g/L，FeSO₄·7H₂O 0.18g/L，CuSO₄ 0.15g/L，无水CaC1₂ 0.02g/L，Na₂EDTA·2H₂O0.02g/L，pH 7.1，121℃高压蒸汽灭菌20min。实验设计如表7所示。

分别测试了0、7、15、30天各组的残留量，实验结果见表7。由表7可知，经过30天的菌剂与改性玉米秸秆BMGS的联合降解，第3组3％油+60ml菌剂+10g BMGS残留总量达到负值，说明已将3％的原油全部降解完毕，而其他各组均有不同程度地剩余量，由此可见第3组3％油+60ml菌剂+10g BMGS降油效果最佳。

由此可知，改性材料BMGS与微生物菌剂联合对油污土壤的降解作用是非常明显的。一方面，改性材料BMGS具备储存一定的营养液成分，改性秸秆的存在就是给微生物降解提供了充足的吸氧量和需水量。在改性秸秆与微生物互补的作用下，分解石油烃的速率才会被加速。另一方面，保持每天翻土一次，就会使油污土壤的通透性增加，油与水均匀混合，在改性秸秆的促进作用下，土壤中的油会被改性秸秆所乳化，微生物活动的限制就减小，分解油污土壤加快。

表7残油量对数值

四、微生物菌剂和改性玉米秸秆BMGS联合时对油污土壤的联合修复实验

从表6中的第4组可知，3％油+60ml菌剂+10g BMGS组合降油效果最佳，因此，我们进一步用本发明的微生物菌剂和改性玉米秸秆BMGS模拟自然降解油污土壤法进行实验。具体实验过程如下：

每个花盘分别加入1kg筛好的土样，再分别按照下述实验设计加入不同的组分，并在第2组-第6组中另外再加入500ml的营养液。其中，营养液成分为：NH₄NO₃ 3.0g/L，K₂HPO₄1.6g/L，KH₂PO₄ 3g/L，微量元素液6ml，蒸馏水1000ml。微量元素液：MgSO₄·7H₂O 0.15g/L，FeSO₄·7H₂O 0.18g/L，CuSO₄ 0.15g/L，无水CaC1₂ 0.02g/L，Na₂EDTA·2H₂O 0.02g/L，pH7.1，121℃高压蒸汽灭菌20min。实验设计如下：

第1组加入3％质量浓度的标准油，边翻土样边喷洒标准油，使土样与标准油混合均匀，作为对照组；

第2组是加入3％质量浓度的标准油+60ml的微生物菌剂；

第3组是加入3％质量浓度的标准油+60ml的微生物菌剂+10g的RMS；

第4组是加入1.5％质量浓度的标准油+60ml的微生物菌剂+10g的BMGS；

第5组是加入3％质量浓度的标准油+60ml的微生物菌剂+10g的BMGS；

第6组是加入5％质量浓度的标准油+60ml的微生物菌剂+10g的BMGS。

调人工气候箱的温度30℃，湿度50％，光照4级。人工气候箱连接上YC-D25超声波加湿器，定期向加湿器加蒸馏水，保持人工气候箱的湿度为50％。为了确保土壤含水率为30％，花盘里的土壤一天加一次水。为了使土壤中的微生物接氧面积充足，正常生长繁殖，油水均匀混合，土壤透气疏松，保持每天翻土一次。每周检测TPH降解率、原油各组分及微生物数量，观察油泥颜色，及时调整营养元素含量，直至受污土壤颜色接近正常，TPH含量达标。采用回归方程分析土壤中的残油量，结果详见表8。

表8残油量对数值

由表8可知，在土壤受油污染程度相同的条件下，所加改性秸秆BMGS(第5组)的油污土壤半衰期为14.84天，原秸秆RMS(第3组)的油污土壤半衰期为33.01天，未加秸秆(第1组)的油污土壤半衰期为37.47天；在改性材料BMGS的加入量一致的条件下，含1.5％标准油的土壤半衰期为10.60天,最大降解率达到94％；含3.0％标准油的土壤半衰期为14.84天，最大降解率达到78％，含5.0％标准油的土壤半衰期为19.52天，最大降解率达到69％。经过甲基丙烯酸丁酯-苯乙烯改性的玉米秸秆材料BMGS的吸油量为10.3g/g。

由以上可知，改性后的玉米秸秆BMGS是一种高吸油量、低密度、无毒和可生物降解的天然吸附材料。土壤中的油会在改性秸秆的作用下形成液化小滴，改性秸秆使油与水的溶合阻力减小，微生物就容易进入土壤分解石油烃，降解速率就会加快。另一方面，在改性秸秆的促进作用下，土壤中的油会被改性秸秆所乳化，微生物活动的限制就减小，分解油污土壤加快。可见改性秸秆的存在能够给微生物降解提供了充足的吸氧量，需水量。另外，本发明的微生物菌剂有着更好的生物活性和生长繁殖能力，两者结合，可使得3％浓度的油污土壤最大降解率达到78％左右，5％浓度的油污土壤最大降解率达到69％左右。

五、本发明的微生物菌剂和改性玉米秸秆的联合对油污土壤中总石油烃、饱和烃、芳香烃的降解效果实验

在每千克油污土壤(油污土壤中原油的重量浓度不同)中加入60ml的微生物菌剂和10g不同的吸油材料，无机盐营养液500ml(无机盐营养液成分：NH₄NO₃ 3.0g/L，K₂HPO₄1.6g/L，KH₂PO₄ 3g/L，微量元素液6ml，蒸馏水1000ml。微量元素液：MgSO₄·7H₂O 0.15g/L，FeSO₄·7H₂O 0.18g/L，CuSO₄ 0.15g/L，无水CaC1₂ 0.02g/L，Na₂EDTA·2H₂O 0.02g/L，pH7.1，121℃高压蒸汽灭菌20min)，在室温下进行试验，用实施例2中方法进行了现场试验检测，得出本发明的菌剂和改性秸秆结合时，对总石油烃、饱和烃、芳香烃的降解效果较单独使用微生物菌剂时更佳。结果见表9。

表9土壤高、低浓度石油组分降解率(％)

六、本发明的微生物菌剂和改性玉米秸秆BMGS的联合在短时间内迅速降解油污土壤中的石油实验

选取降油效果比较好的质量比为4％的油污土壤1000g作为实验材料，配比为标准油40g，改性秸秆BMGS 10g，菌剂量60ml，无机盐营养液500ml。BMGS组是采用苯乙烯和甲基丙烯酸丁酯联合改性的玉米秸秆加本发明的微生物菌剂联合作用，对照组为未改性秸秆加本发明的微生物菌剂联合作用，空白组为只将本发明的微生物菌剂加入油污土壤。在室温下进行实验，测定石油降解率。实验结果见表10和图1。

表10各组分油污土壤中石油降解率随时间的变化

利用改性玉米秸秆对油污土壤的生物修复作用主要表现在两个方面。一方面利用玉米秸秆的疏水性和混合菌液的亲水性使漂浮于水体表面的石油烃类能依附于玉米秸秆上，和均匀分布在废水中的菌剂充分接触。经改性的玉米秸秆内部疏松多孔，更容易吸附石油使之与混合菌液充分接触。另一方面与菌液充分接触的石油烃类物质，在菌剂的作用下乳化降解，达到油污土壤生物修复的效果。

图1为油污土壤降解变化；其中，图a为降油率随时间变化，图b为降油幅度随时间变化。

从图1(a)可以看出三组油污土壤中，原油降解率均呈现先上升后持平的状态。其中实验组BMGS的降解率达84.98％，对照组的为57.97％，而空白组仅为36.93％，足可见改性玉米秸杆BMGS的显著作用。0～7d原油降解有一个指数增长的趋势，一周左右各种指标达到了较为理想的水平，石油降解幅度的最大。此时由于微生物能够得到充足营养，所以生长繁殖速度很快，菌剂量急剧增多，酶活也达到最高，降解幅度发生很大变化。15天后，BMGS和对照组的降油幅度变化甚微，且呈现波动状态，这是因为锥形瓶中微生物数量已经达到平衡，而且残油量较小，营养物质匮乏，微生物代谢活动缓慢。另外微生物代谢过程中有毒物质的积累过多反过来也会抑制微生物的生长，因而降油幅度很小。后期对照组的石油降解能力略高于实验组BMGS，这是由于对照组的残油量较大，唯一碳源稍多，微生物数量也多，因而后期降解幅度大一点。如此可见改性玉米秸秆BMGS能够在短时间内迅速联合微生物菌剂快速降解油污土壤中的石油，降解效果十分明显。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株降解石油烃的微生物菌株，其特征在于：所述微生物菌株为门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina PM，保藏编号为 CCTCC NO： M2017347。

2.一种利用权利要求 1 所述的微生物菌株制备得到的微生物菌剂。

3.一种如权利要求 2 所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：将权利要求 1 中所述的门多萨假单胞菌 Pseudomonas mendocina PM CCTCC NO： M2017347 接种活化后进行发酵得到的，所述发酵的条件为：温度 29～31℃， 240～260r/min 下摇床进行有氧发酵。

4.权利要求 1 所述的微生物菌株或权利要求 2 所述的微生物菌剂在降解石油烃或治理油污土壤中的应用；

所述石油烃包括正构烷烃、霍烷和芳香烃。

5.一种油污土壤联合修复剂，其特征在于：所述联合修复剂包括权利要求 2 所述的微生物菌剂，还包括吸油材料；所述吸油材料为利用苯乙烯或甲基丙烯酸丁酯-苯乙烯的混合物改性的玉米秸秆。

6.根据权利要求 5 所述的联合修复剂，其特征在于：所述利用苯乙烯改性的玉米秸秆的制备方法为：在惰性气体环境，温度为 60℃时，将玉米秸秆、引发剂过氧化苯甲酰、改性剂苯乙烯和交联剂 N,N-亚甲基双丙烯酰胺混合后进行反应，除杂，得到改性玉米秸秆；

所述利用甲基丙烯酸丁酯-苯乙烯改性的玉米秸秆的制备方法为：在惰性气体环境，温度为 50℃时，将玉米秸秆、引发剂硝酸铈铵、改性剂苯乙烯和甲基丙烯酸丁酯，以及交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺混合后进行反应，除杂，得到改性玉米秸秆。

7.根据权利要求 5 所述的联合修复剂，其特征在于：所述微生物菌剂和吸油材料的用量比为 4-6ml： 1-1.5g。

8.权利要求 5-7 任一项所述的联合修复剂的制备方法，其特征在于：将微生物菌剂和吸油材料混合，待微生物菌剂被吸油材料完全吸附后，得到联合修复剂。

9.权利要求 5-7 任一项所述的联合修复剂在降解石油烃或快速修复油污土壤中的应用；

所述石油烃包括正构烷烃、霍烷和芳香烃。

10.一种快速修复油污土壤的方法，其特征在于：将权利要求 5-7 任一的联合修复剂加入含油土壤，再加入营养液进行修复油污土壤；在修复过程中翻动土壤。

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