CN105733976A - 一种降解石油的复合菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

一种降解石油的复合菌剂，其特征在于，包括威尼斯不动杆菌LCL?1与迪茨氏菌CN?3，所述威尼斯不动杆菌与所述迪茨氏菌的活菌数比例为1～50:10～200，所述威尼斯不动杆菌LCL?1的保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为M 2015538；所述迪茨氏菌CN?3的保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏号为M 2015537。上述降解石油的复合菌剂，从石油污染的土壤中分离的不动杆菌属和迪茨氏菌属，具有高效的石油降解能力，且两种菌种之间具有很好的协同作用，可以通过菌株间的共生、互生等关系，从而弥补单一菌剂降解率低的缺点，大大提高了石油降解能力。此外，还提供该复合菌剂的制备方法与该复合菌剂在石油降解方面的应用。

Description

一种降解石油的复合菌剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及石油污染治理技术领域，尤其涉及一种降解石油的复合菌剂及其制备方法与应用。
背景技术
石油是现代工业的“血液”，但随着石油开采量的日益增大，在开采、运输、储藏以及事故性泄露中，石油大量进入环境，严重污染了土壤、地下水、河流和海洋。尤其是近几十年来，石油已成为土壤、水体等环境的主要污染物之一。在石油污染的修复方法中，微生物修复因其具有处理效果好、成本低、适应性强、无二次污染等特点，是一项清洁环境的低投资、高效益、便于应用、发展潜力大的新兴技术。
在用微生物降解石油污染方面国内外开展了很多相关研究。最早的是美国海洋微生物学家Zobell于1964年用原油和润滑油浓度为1.0g/100cm3进行海洋细菌降解石油烃速率研究。中国在这方面的研究起步较晚，目前有不少单位开展石油微生物降解的研究工作，如江苏省农业科学院、中国石油天然气总公司、胜利油田等，并且也取得了一定的成果，如向廷生等从青海油田地层中分离到3种不同的菌株，并研究了此3种菌株在实验条件下对青海原油的降解情况，结果表明菌株B是一种有应用前景的微生物。李海花等从石油污染的土壤中分离驯化得到特征明显的石油降解菌，并对其降解性能进行了初步研究。而在此研究方面取得较大突破的是南开大学土磊教授领导的课题组，该课题组对20世纪90年代发现的一种嗜热脱氮土壤杆菌NG80-2的基因组遗传信息及其代谢途径进行了研究，最终在国际上首次鉴定了长链烷烃(俗称“重烃”)的微生物降解途径。
对溢油污染环境进行无害化的生物修复是近年来的研究热点。目前，国内的溢油生物修复实验多数停留在实验室阶段陆地土壤修复，或对于溢油修复菌剂的研究基本限于陆地土壤修复。国际上，Edwards等对墨西哥湾溢油环境的 研究表明，微生物在环境的恢复过程中发挥了决定性作用。对溢油污染岸滩或海岸的生物修复实践也有较为成功的案例。
不同的微生物对不同的成分有不同的降解能力，或者在降解中起到不同的作用，因此接种混合的微生物菌株可能对石油污染控制有更好的效果，Lazar等人曾发现，将多种能降解石蜡的菌混合投加后，降解率有明显的提高。可见研究混合菌株的特性和菌种组成也是研究石油生物降解的重要方面。然而国内外学者的研究大部分集中在石油降解菌株的筛选、石油降解机理以及土壤修复工艺方面，这些研究逐步证实了石油污染土壤微生物修复的可行性，但很少涉及菌剂生产的研究。
发明内容
鉴于此，有必要提供一种能够高效降解石油的复合菌剂及其制备方法与应用。
一种降解石油的复合菌剂，其特征在于，包括威尼斯不动杆菌LCL-1与迪茨氏菌CN-3，所述威尼斯不动杆菌与所述迪茨氏菌的活菌数比例为1～50:10～200，所述威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)LCL-1的保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏号为M 2015538，保藏日期为2015年9月15日。保藏单位地址：武汉，中国典型培养物保藏中心(武汉大学)。邮编：430072。
所述迪茨氏菌(Dietzia sp.)CN-3的保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏号为M 2015537，保藏日期为2015年9月15日。保藏单位地址：武汉，中国典型培养物保藏中心(武汉大学)。邮编：430072。
在其中一个实施例中，所述威尼斯不动杆菌LCL-1与迪茨氏菌CN-3保存于菌种保存液中，所述菌种保存液含有如下重量百分数的以下组分：壬基酚聚氧乙烯醚4.6％～4.8％，十二烷基苯磺酸钠2.8％～3.0％，柠檬酸0.6％～0.8％，乙酸0.1％～0.3％，甘油0.2％～0.4％，黄原胶0.05％～0.07％，硫酸钠0.6％～0.8％，氯化钾0.2％～0.4％，乙醇2.2％～2.4％，乙酸乙酯0.02％～0.04％，水88％～89％。
一种降解石油的复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
将威尼斯不动杆菌的种子液以8％-12％的接种量接入pH4.5-pH5.5的LB培养基中，通入无菌空气，置于28℃-32℃、通气量0.20m3/h-0.30m3/h、搅拌速度140rpm-160rpm的条件下发酵培养14h-18h，得到威尼斯不动杆菌发酵培养液；
将迪茨氏菌的种子液以8％-12％的接种量接入pH7.0-pH8.0的LB培养基中，通入无菌空气，置于28℃-32℃、通气量0.20m3/h-0.30m3/h、搅拌速度140rpm-160rpm的条件下发酵培养56h-60h，得到迪茨氏菌发酵培养液；
将所述威尼斯不动杆菌发酵培养液、所述迪茨氏菌发酵培养液与菌种保存液以1:1:2的体积比混合，得到所述降解石油的复合菌剂，其中，所述威尼斯不动杆菌和所述迪茨氏菌的活菌数比例为1～50:10～200，所述菌种保存液含有如下重量百分数的以下组分：壬基酚聚氧乙烯醚4.6％～4.8％，十二烷基苯磺酸钠2.8％～3.0％，柠檬酸0.6％～0.8％，乙酸0.1％～0.3％，甘油0.2％～0.4％，黄原胶0.05％～0.07％，硫酸钠0.6％～0.8％，氯化钾0.2％～0.4％，乙醇2.2％～2.4％，乙酸乙酯0.02％～0.04％，水88％～89％。
在其中一个实施例中，所述威尼斯不动杆菌的种子液的制备方法如下：
采用灭菌液体LB培养基，将威尼斯不动杆菌接种到pH4.5-pH5.5的试管培养基中，接种后置于28℃-32℃的摇床中活化培养22h-26h；
采用灭菌液体LB培养基，将试管培养基中的威尼斯不动杆菌转接于pH4.5-pH5.5的锥形瓶培养基中，置于28℃-32℃的摇床中，振荡培养22h-26h，得到所述威尼斯不动杆菌的种子液。
在其中一个实施例中，所述威尼斯不动杆菌采用如下方法分离得到：
将石油污染的土壤接入已灭菌的LB培养液中，于28℃-32℃的摇床培养22h-26h，经分离纯化后得到所述威尼斯不动杆菌。
在其中一个实施例中，所述迪茨氏菌的种子液的制备方法如下：
采用灭菌液体LB培养基，将迪茨氏菌接种到pH7.0-pH8.0的试管培养基中，接种后置于28℃-32℃的摇床中活化培养22h-26h；
采用灭菌液体LB培养基，将试管培养基中的迪茨氏菌转接于pH7.0-pH8.0的锥形瓶培养基中，置于28℃-32℃的摇床中，振荡培养22h-26h，得到所述迪茨氏菌的种子液。
在其中一个实施例中，所述迪茨氏菌采用如下方法分离得到：
将石油污染的土壤接入已灭菌的LB培养液中，于28℃-32℃的摇床培养22h-26h，经分离纯化后得到所述迪茨氏菌。
在其中一个实施例中，LB培养基的组分如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。
一种采用如权利要求1所述的降解石油的复合菌剂降解石油的方法，包括如下步骤：
按1:1的体积比将所述降解石油的复合菌剂转接至石油培养基中，在180rpm、30℃避光条件下培养3周，其中，所述石油培养基含有如下重量百分数的以下组分：壬基酚聚氧乙烯醚4.6％～4.8％，十二烷基苯磺酸钠2.8％～3.0％，柠檬酸0.6％～0.8％，乙酸0.1％～0.3％，甘油0.2％～0.4％，黄原胶0.05％～0.07％，硫酸钠0.6％～0.8％，氯化钾0.2％～0.4％，乙醇2.2％～2.4％，乙酸乙酯0.02％～0.04％，水88％～89％，原油3g/L。
上述降解石油的复合菌剂可应用于生物修复原油污染土壤。
上述降解石油的复合菌剂，从石油污染的土壤中分离的不动杆菌属和迪茨氏菌属，具有高效的石油降解能力，且两种菌种之间具有很好的协同作用，可以通过菌株间的共生、互生等关系，从而弥补单一菌剂降解率低的缺点，大大提高了石油降解能力。
附图说明
图1为一实施方式的降解石油的复合菌剂的制备方法的流程图。
图2为复合菌剂、威尼斯不动杆菌与迪茨氏菌对石油的降解效果图。
图3为复合菌剂、威尼斯不动杆菌与迪茨氏菌对烷烃组分的降解效果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，如下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一实施方式的降解石油的复合菌剂，包括威尼斯不动杆菌LCL-1与迪茨氏菌CN-3，威尼斯不动杆菌与迪茨氏菌的活菌数比例为1～50:10～200，威尼斯不动杆菌LCL-1的保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏号为M 2015538。迪茨氏菌CN-3的保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏号为M 2015537。
威尼斯不动杆菌Acinetobacter venetianus LCL-1的形态如下：
细胞短粗杆状，革兰氏阴性，无芽孢和鞭毛。在LB培养基上的菌落为圆形，边缘整齐，乳白色，有光泽。
迪茨氏菌Dietzia sp.CN-3的形态如下：
细胞杆状，常呈V字型排列，革兰氏阳性。在LB培养基上的菌落为圆形，光滑，不透明，前期呈白色，后期呈橙红色。
LB培养液的组分如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L；酵母提取物(Yeast extract)5g/L；氯化钠(NaCl)5g/L。
上述降解石油的复合菌剂中，威尼斯不动杆菌LCL-1与迪茨氏菌CN-3保存于菌种保存液中。菌种保存液含有如下重量百分数的以下组分：壬基酚聚氧乙烯醚4.6％～4.8％，十二烷基苯磺酸钠2.8％～3.0％，柠檬酸0.6％～0.8％，乙酸0.1％～0.3％，甘油0.2％～0.4％，黄原胶0.05％～0.07％，硫酸钠0.6％～0.8％，氯化钾0.2％～0.4％，乙醇2.2％～2.4％，乙酸乙酯0.02％～0.04％，水88％～89％。
一实施方式的上述降解石油的复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
S10、将威尼斯不动杆菌的种子液以8％-12％的接种量接入pH4.5-pH5.5的LB培养基中，通入无菌空气，置于28℃-32℃、通气量0.20m3/h-0.30m3/h、搅拌速度140rpm-160rpm的条件下发酵培养14h-18h，得到威尼斯不动杆菌发酵培养液。
威尼斯不动杆菌的种子液的制备方法如下：
S110、将从东营采集的石油污染的土壤接入已灭菌的LB培养液中，于28℃-32℃的摇床培养22h-26h，经分离纯化后得到威尼斯不动杆菌。
S110中，分离纯化的方法如下：
采用稀释涂布法在灭菌固体LB培养基上进行平板涂布，待菌长出后，用接种针将菌株接种至另一灭菌固体LB培养基上进行划线法分离，重复划线分离操作，直至形成形态单一的纯化菌落，得到威尼斯不动杆菌。
LB培养液在121℃高压灭菌20分钟左右。
S120、采用灭菌液体LB培养基，将威尼斯不动杆菌接种到pH4.5-pH5.5的试管培养基中，接种后置于28℃-32℃的摇床中活化培养22h-26h。
S130、采用灭菌液体LB培养基，将试管培养基中的威尼斯不动杆菌转接于pH4.5-pH5.5的锥形瓶培养基中，置于28℃-32℃的摇床中，振荡培养22h-26h，得到威尼斯不动杆菌的种子液。
S20、将迪茨氏菌的种子液以8％-12％的接种量接入pH7.0-pH8.0的LB培养基中，通入无菌空气，置于28℃-32℃、通气量0.20m3/h-0.30m3/h、搅拌速度140rpm-160rpm的条件下发酵培养56h-60h，得到迪茨氏菌发酵培养液。
迪茨氏菌的种子液的制备方法如下：
S210、将从东营采集的石油污染的土壤接入已灭菌的LB培养液中，于28℃-32℃的摇床培养22h-26h，经分离纯化后得到迪茨氏菌。
S210中，分离纯化的方法如下：
采用稀释涂布法在灭菌固体LB培养基上进行平板涂布，待菌长出后，用接种针将菌株接种至另一灭菌固体LB培养基上进行划线法分离，重复划线分离操作，直至形成形态单一的纯化菌落，得到迪茨氏菌。
S220、采用灭菌液体LB培养基，将迪茨氏菌接种到pH7.0-pH8.0的试管培养基中，接种后置于28℃-32℃的摇床中活化培养22h-26h。
S230、采用灭菌液体LB培养基，将试管培养基中的迪茨氏菌转接于pH7.0-pH8.0的锥形瓶培养基中，置于28℃-32℃的摇床中，振荡培养22h-26h，得到迪茨氏菌的种子液。
S30、将威尼斯不动杆菌发酵培养液、迪茨氏菌发酵培养液与菌种保存液以1:1:2的体积比混合，得到降解石油的复合菌剂。其中，威尼斯不动杆菌和迪茨氏菌的活菌数比例为1～50:10～200。菌种保存液含有如下重量百分数的以下组分：壬基酚聚氧乙烯醚4.6％～4.8％，十二烷基苯磺酸钠2.8％～3.0％，柠檬酸0.6％～0.8％，乙酸0.1％～0.3％，甘油0.2％～0.4％，黄原胶0.05％～0.07％，硫酸钠0.6％～0.8％，氯化钾0.2％～0.4％，乙醇2.2％～2.4％，乙酸乙酯0.02％～0.04％，水88％～89％。
上述降解石油的复合菌剂，从石油污染的土壤中分离的不动杆菌属和迪茨 氏菌属，具有高效的石油降解能力，且两种菌种之间具有很好的协同作用，可以通过菌株间的共生、互生等关系，从而弥补单一菌剂降解率低的缺点，大大提高了石油降解能力。将威尼斯不动杆菌和迪茨氏菌保存于菌种保存液中，由于菌种保存液具有显著的乳化效果，可有效乳化分散石油，大大增加石油与菌剂的接触面积，从而使石油得到更充分的降解。
上述降解石油的复合菌剂，用于改善石油污染的土壤，能有效降解石油中的饱和烃，降解率可达95％左右，并且该菌剂的保存期可以延长至45～60天，可满足实现工业生产在经济上的要求。
上述降解石油的复合菌剂的制备方法简单，容易操作，适合工业化生产。
上述降解石油的复合菌剂可以用于降解石油。上述降解石油的复合菌剂降解石油的方法，包括如下步骤：
按1:1的体积比将降解石油的复合菌剂转接至石油培养基中，在180rpm、30℃避光条件下培养3周。其中，石油培养基含有如下重量百分数的以下组分：壬基酚聚氧乙烯醚4.6～4.8％，十二烷基苯磺酸钠2.8～3.0％，柠檬酸0.6～0.8％，乙酸0.1～0.3％，甘油0.2～0.4％，黄原胶0.05～0.07％，硫酸钠0.6～0.8％，氯化钾0.2～0.4％，乙醇2.2～2.4％，乙酸乙酯0.02～0.04％，水88～89％，原油3g/L。
将降解后的石油培养基通过萃取、过滤、定容以及柱层析法对石油组分进行分离测定，并根据峰面积计算相对降解率。具体操作如下：
[1]萃取将50mL二氯甲烷(分析纯)加入到100mL降解后的石油培养基中，利用分液漏斗使有机相和水相分离，将石油组分萃取出来，重复2-3次。
[2]过滤在漏斗中塞入浸泡过二氯甲烷(分析纯)的棉花，将不溶物滤出。
[3]定容将过滤好的石油样品吹干并加入正己烷溶解，定容至25mL。
[4]柱层析法分离石油组分
a.称量。称取经马弗炉高温处理过的硅胶3g、氧化铝2g、无水硫酸钠1g。
b.搅成匀浆。分别将硅胶、氧化铝、无水硫酸钠用正己烷浸泡并搅成匀浆。
c.装柱。先用正己烷润洗硅胶柱，并分别将硅胶、氧化铝、无水硫酸钠按顺序装入。注意敲打结实，防止出现气泡影响分离效果。
d.上样。往装好的硅胶柱中加入1mL石油样品。
e.正己烷洗脱。共用20mL正己烷。待石油样品液面至无水硫酸钠处加入1mL正己烷，反复重复几次至石油样品清洗干净，再将剩余的正己烷加入硅胶柱。
f.二氯甲烷与正己烷混合溶液洗脱。二氯甲烷与正己烷的混合液共15mL，二氯甲烷与正己烷的体积比为2:1。先加入5mL混合液，待液面至无水硫酸钠处换瓶，即收集到饱和烃组分。再将剩余的10mL混合液加入硅胶柱。
g.甲醇洗脱。共用15mL甲醇(分析纯)。待混合液液面至无水硫酸钠处加入5mL甲醇，流完后换瓶，即收集到芳香烃组分。再将剩余的10mL甲醇加入硅胶柱，以此收集胶质组分。
h.不同石油组分的处理。待溶解饱和烃、芳香烃和胶质组分的溶剂挥发后，分别用1.5mL正己烷(色谱纯)、1.5mL正己烷(色谱纯)和1.5mL甲醇(分析纯)溶解三种组分并装入色谱瓶中。
(5)石油组分的GC-MS分析：气相色谱(Agilent HP7890Plus)；质谱检测器(Agilent HP5975)；色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱；进样口温度：280℃；离子源温度：250℃。载气为氦气(99.999％)，流速1mL/min。程序升温：50℃保持2min，以6℃/min升至300℃，300℃保持10min。扫描模式：SCAN、SIM模式；扫描质量范围：50～500。进样：HP7683自动进样器，不分流进样1μL。数据采集和处理：HP3365化学工作站。
结果表明，上述降解石油的复合菌剂用于降解石油时，复合菌剂表现出明显的协同降解效应，降解效果良好。
此外，上述降解石油的复合菌剂还可以应用于生物修复原油污染土壤。主要应用于对陆地溢油污染油田的生物修复。
下面为具体实施例部分。
实施例1
(1)威尼斯不动杆菌和迪茨氏菌的分离：将从东营采集的石油污染的土壤接入已灭菌的LB培养液中，于30℃的摇床培养24h，经分离纯化后分别得 到威尼斯不动杆菌和迪茨氏菌。
(2)试管培养基：采用灭菌液体LB培养基，将威尼斯不动杆菌接种到pH4.5的试管培养基中，接种后置于摇床30℃下活化培养24h。采用灭菌液体LB培养基，将迪茨氏菌接种到pH7.5的试管培养基中，接种后置于摇床30℃下活化培养24h。
(3)扩大培养基：采用灭菌液体LB培养基，将试管培养基中的威尼斯不动杆菌转接于pH4.5的锥形瓶培养基中，置于30℃的摇床中，振荡培养24h，作为种子液。采用灭菌液体LB培养基，将试管培养基中的迪茨氏菌转接于pH7.5的锥形瓶培养基中，置于30℃的摇床中，振荡培养24h，作为种子液。
(4)液体发酵培养基：在发酵罐中采用pH4.5和pH7.5的液体LB培养基，121℃高压灭菌20分钟左右，待灭菌培养液冷却至30℃时，将锥形瓶中的威尼斯不动杆菌按10％的比例接种至pH4.5的发酵罐的培养基中，通入0.25m3/h的无菌空气，搅拌速度为150rpm，于30℃培养16h，得到威尼斯不动杆菌菌液。将锥形瓶中的迪茨氏菌菌液按10％的比例接种至pH7.5的发酵罐的培养基中，通入0.25m3/h的无菌空气，搅拌速度为150rpm，于30℃培养58h，得到迪茨氏菌菌液。
(5)按照体积比为1:1:2的比例，将威尼斯不动杆菌菌液和迪茨氏菌菌液加入至菌种保存液中混合均匀，制得复合菌剂。其中威尼斯不动杆菌和迪茨氏菌菌液的活菌数比例为1～50:10～200。菌种保存液含有如下重量百分数的以下组分：壬基酚聚氧乙烯醚4.6％～4.8％，十二烷基苯磺酸钠2.8％～3.0％，柠檬酸0.6％～0.8％，乙酸0.1％～0.3％，甘油0.2％～0.4％，黄原胶0.05％～0.07％，硫酸钠0.6％～0.8％，氯化钾0.2％～0.4％，乙醇2.2％～2.4％，乙酸乙酯0.02％～0.04％，水88％～89％。
(6)将上述复合菌剂置于10℃保藏。
(7)将50mL实施例1制备的复合菌剂转接至50mL石油培养基中，在180rpm、30℃避光条件下培养3周。其中，石油培养基的组分为：壬基酚聚氧乙烯醚4.6％～4.8％，十二烷基苯磺酸钠2.8％～3.0％，柠檬酸0.6％～0.8％，乙酸0.1％～0.3％，甘油0.2％～0.4％，黄原胶0.05％～0.07％，硫酸钠0.6％～0.8％， 氯化钾0.2％～0.4％，乙醇2.2％～2.4％，乙酸乙酯0.02％～0.04％，水88％～89％，原油3g/L。结果显示，复合菌剂对石油的降解效果高达95.12％。
实施例2
(1)威尼斯不动杆菌和迪茨氏菌的分离：将石油污染的土壤接入已灭菌的LB培养液中，于28℃的摇床培养26h，经分离纯化后分别得到威尼斯不动杆菌和迪茨氏菌。
(2)试管培养基：采用灭菌液体LB培养基，将威尼斯不动杆菌接种到pH4.5的试管培养基中，接种后置于28℃的摇床中活化培养26h。采用灭菌液体LB培养基，将迪茨氏菌接种到pH7.0的试管培养基中，接种后置于28℃的摇床中活化培养26h。
(3)扩大培养基：采用灭菌液体LB培养基，将试管培养基中的威尼斯不动杆菌转接于pH4.5的锥形瓶培养基中，置于28℃的摇床中，振荡培养26h，作为种子液。采用灭菌液体LB培养基，将试管培养基中的迪茨氏菌转接于pH7.0的锥形瓶培养基中，置于28℃的摇床中，振荡培养26h，作为种子液
(4)液体发酵培养基：在发酵罐中采用pH4.5和pH7.0的液体LB培养基，121℃高压灭菌20分钟左右，待灭菌培养液冷却至30℃时，将锥形瓶中的威尼斯不动杆菌按8％的比例接种至pH4.5的发酵罐的培养基中，通入0.20m3/h的无菌空气，搅拌速度为140rpm，于28℃培养18h，得到威尼斯不动杆菌菌液。将锥形瓶中的迪茨氏菌菌液按8％的比例接种至pH7.0的发酵罐的培养基中，通入0.20m3/h的无菌空气，搅拌速度为140rpm，于28℃培养60h，得到迪茨氏菌菌液。
(5)按照体积比为1:1:2的比例，将威尼斯不动杆菌菌液和迪茨氏菌菌液加入至菌种保存液中混合均匀，制得复合菌剂。其中威尼斯不动杆菌和迪茨氏菌菌液的活菌数比例为1～50:10～200。菌种保存液含有如下重量百分数的以下组分：壬基酚聚氧乙烯醚4.6％～4.8％，十二烷基苯磺酸钠2.8％～3.0％，柠檬酸0.6％～0.8％，乙酸0.1％～0.3％，甘油0.2％～0.4％，黄原胶0.05％～0.07％，硫酸钠0.6％～0.8％，氯化钾0.2％～0.4％，乙醇2.2％～2.4％，乙酸乙酯 0.02％～0.04％，水88％～89％。
(6)将上述复合菌剂置于20℃保藏。
(7)将50mL实施例2制备的复合菌剂转接至50mL石油培养基中，在180rpm、30℃避光条件下培养3周。其中，石油培养基的组分为：壬基酚聚氧乙烯醚4.6％～4.8％，十二烷基苯磺酸钠2.8％～3.0％，柠檬酸0.6％～0.8％，乙酸0.1％～0.3％，甘油0.2％～0.4％，黄原胶0.05％～0.07％，硫酸钠0.6％～0.8％，氯化钾0.2％～0.4％，乙醇2.2％～2.4％，乙酸乙酯0.02％～0.04％，水88％～89％，原油3g/L。结果显示，复合菌剂对石油的降解效果高达93.62％。
实施例3
(1)威尼斯不动杆菌和迪茨氏菌的分离：将从东营采集的石油污染的土壤接入已灭菌的LB培养液中，于32℃的摇床培养22h，经分离纯化后分别得到威尼斯不动杆菌和迪茨氏菌。
(2)试管培养基：采用灭菌液体LB培养基，将威尼斯不动杆菌接种到pH5.5的试管培养基中，接种后置于32℃的摇床中活化培养22h。采用灭菌液体LB培养基，将迪茨氏菌接种到pH8.0的试管培养基中，接种后置于32℃的摇床中活化培养22h。
(3)扩大培养基：采用灭菌液体LB培养基，将试管培养基中威尼斯不动杆菌转接于pH5.5的锥形瓶培养基中，置于32℃的摇床中，振荡培养22h，作为种子液。采用灭菌液体LB培养基，将试管培养基中的迪茨氏菌转接于pH8.0的锥形瓶培养基中，置于32℃的摇床中，振荡培养22h，作为种子液。
(4)液体发酵培养基：在发酵罐中采用pH5.5和pH8.0的液体LB培养基，121℃高压灭菌20分钟左右，待灭菌培养液冷却至30℃时，将锥形瓶中的威尼斯不动杆菌按12％的比例接种至pH5.5的发酵罐的培养基中，通入0.30m3/h的无菌空气，搅拌速度为160rpm，于32℃培养14h，得到威尼斯不动杆菌菌液。将锥形瓶中的迪茨氏菌菌液按12％的比例接种至pH8.0的发酵罐的培养基中，通入0.30m3/h的无菌空气，搅拌速度为160rpm，于32℃培养56h，得到迪茨氏菌菌液。
(5)按照体积比为1:1:2的比例，将威尼斯不动杆菌菌液和迪茨氏菌菌液加入至菌种保存液中混合均匀，制得复合菌剂。其中威尼斯不动杆菌和迪茨氏菌菌液的活菌数比例为1～50:10～200。菌种保存液含有如下重量百分数的以下组分：壬基酚聚氧乙烯醚4.6％～4.8％，十二烷基苯磺酸钠2.8％～3.0％，柠檬酸0.6％～0.8％，乙酸0.1％～0.3％，甘油0.2％～0.4％，黄原胶0.05％～0.07％，硫酸钠0.6％～0.8％，氯化钾0.2％～0.4％，乙醇2.2％～2.4％，乙酸乙酯0.02％～0.04％，水88％～89％。
(6)将上述复合菌剂置于4℃保藏。
(7)将50mL实施例3制备的复合菌剂转接至50mL石油培养基中，在180rpm、30℃避光条件下培养3周。其中，石油培养基的组分为：壬基酚聚氧乙烯醚4.6％～4.8％，十二烷基苯磺酸钠2.8％～3.0％，柠檬酸0.6％～0.8％，乙酸0.1％～0.3％，甘油0.2％～0.4％，黄原胶0.05％～0.07％，硫酸钠0.6％～0.8％，氯化钾0.2％～0.4％，乙醇2.2％～2.4％，乙酸乙酯0.02％～0.04％，水88％～89％，原油3g/L。结果显示，复合菌剂对石油的降解效果高达94.58％。
对比例1
将实施例1制备的单一迪茨氏菌菌液50mL转接至50mL石油培养基中，在180rpm、30℃避光条件下培养3周。石油培养基的组分同实施例1。迪茨氏菌CN-3对石油的降解效果为87.48％。
对比例2
将实施例1制备的单一降解菌威尼斯不动杆菌菌液50mL转接至50mL石油培养基中，在180rpm、30℃避光条件下培养3周。石油培养基的组分同实施例1。威尼斯不动杆菌LCL-1对石油的降解效果为83.34％。
实验结果显示：
威尼斯不动杆菌和迪茨氏菌的复合菌剂比单一降解菌菌液具有更高的石油降解率。如图1所示，实施例1的复合菌剂、对比例1的CN-3、对比例2 的LCL-1对石油的相对降解率分别为95.12％、87.48％和83.34％。
威尼斯不动杆菌和迪茨氏菌的复合菌剂通过降解菌之间的协同效应使石油中烷烃组分充分降解。如图2所示，经过3周的摇床培养，对比例1的迪茨氏菌CN-3和对比例2的威尼斯不动杆菌LCL-1对烷烃组分都具有较好的降解效果，均达到80％以上。而加入实施例1制备的复合菌剂，对石油烷烃的降解最彻底，迪茨氏菌和威尼斯不动杆菌表现出明显的协同降解效应，使降解效果高达95.12％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种降解石油的复合菌剂，其特征在于，包括威尼斯不动杆菌LCL-1与迪茨氏菌CN-3，所述威尼斯不动杆菌与所述迪茨氏菌的活菌数比例为1～50:10～200，所述威尼斯不动杆菌LCL-1的保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏号为M 2015538；所述迪茨氏菌CN-3的保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏号为M 2015537。
2.如权利要求1所述的降解石油的复合菌剂，其特征在于，所述威尼斯不动杆菌LCL-1与迪茨氏菌CN-3保存于菌种保存液中，所述菌种保存液含有如下重量百分数的以下组分：壬基酚聚氧乙烯醚4.6％～4.8％，十二烷基苯磺酸钠2.8％～3.0％，柠檬酸0.6％～0.8％，乙酸0.1％～0.3％，甘油0.2％～0.4％，黄原胶0.05％～0.07％，硫酸钠0.6％～0.8％，氯化钾0.2％～0.4％，乙醇2.2％～2.4％，乙酸乙酯0.02％～0.04％，水88％～89％。
3.一种降解石油的复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将威尼斯不动杆菌的种子液以8％-12％的接种量接入pH4.5-pH5.5的LB培养基中，通入无菌空气，置于28℃-32℃、通气量0.20m3/h-0.30m3/h、搅拌速度140rpm-160rpm的条件下发酵培养14h-18h，得到威尼斯不动杆菌发酵培养液；
将迪茨氏菌的种子液以8％-12％的接种量接入pH7.0-pH8.0的LB培养基中，通入无菌空气，置于28℃-32℃、通气量0.20m3/h-0.30m3/h、搅拌速度140rpm-160rpm的条件下发酵培养56h-60h，得到迪茨氏菌发酵培养液；
将所述威尼斯不动杆菌发酵培养液、所述迪茨氏菌发酵培养液与菌种保存液以1:1:2的体积比混合，得到所述降解石油的复合菌剂，其中，所述威尼斯不动杆菌和所述迪茨氏菌的活菌数比例为1～50:10～200，所述菌种保存液含有如下重量百分数的以下组分：壬基酚聚氧乙烯醚4.6％～4.8％，十二烷基苯磺酸钠2.8％～3.0％，柠檬酸0.6％～0.8％，乙酸0.1％～0.3％，甘油0.2％～0.4％，黄原胶0.05％～0.07％，硫酸钠0.6％～0.8％，氯化钾0.2％～0.4％，乙醇2.2％～2.4％，乙酸乙酯0.02％～0.04％，水88％～89％。
4.如权利要求3所述的降解石油的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述威尼斯不动杆菌的种子液的制备方法如下：
采用灭菌液体LB培养基，将威尼斯不动杆菌接种到pH4.5-pH5.5的试管培养基中，接种后置于28℃-32℃的摇床中活化培养22h-26h；
采用灭菌液体LB培养基，将试管培养基中的威尼斯不动杆菌转接于pH4.5-pH5.5的锥形瓶培养基中，置于28℃-32℃的摇床中，振荡培养22h-26h，得到所述威尼斯不动杆菌的种子液。
5.如权利要求4所述的降解石油的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述威尼斯不动杆菌采用如下方法分离得到：
将石油污染的土壤接入已灭菌的LB培养液中，于28℃-32℃的摇床培养22h-26h，经分离纯化后得到所述威尼斯不动杆菌。
6.如权利要求3所述的降解石油的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述迪茨氏菌的种子液的制备方法如下：
采用灭菌液体LB培养基，将迪茨氏菌接种到pH7.0-pH8.0的试管培养基中，接种后置于28℃-32℃的摇床中活化培养22h-26h；
采用灭菌液体LB培养基，将试管培养基中的迪茨氏菌转接于pH7.0-pH8.0的锥形瓶培养基中，置于28℃-32℃的摇床中，振荡培养22h-26h，得到所述迪茨氏菌的种子液。
7.如权利要求6所述的降解石油的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述迪茨氏菌采用如下方法分离得到：
将石油污染的土壤接入已灭菌的LB培养液中，于28℃-32℃的摇床培养22h-26h，经分离纯化后得到所述迪茨氏菌。
8.如权利要求3至7中任意一项所述的降解石油的复合菌剂的制备方法，其特征在于，LB培养基的组分如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。
9.一种采用如权利要求1所述的降解石油的复合菌剂降解石油的方法，其特征在于，包括如下步骤：
按1:1的体积比将所述降解石油的复合菌剂转接至石油培养基中，在180rpm、30℃避光条件下培养3周，其中，所述石油培养基含有如下重量百分数的以下组分：壬基酚聚氧乙烯醚4.6％～4.8％，十二烷基苯磺酸钠2.8％～3.0％，柠檬酸0.6％～0.8％，乙酸0.1％～0.3％，甘油0.2％～0.4％，黄原胶0.05％～0.07％，硫酸钠0.6％～0.8％，氯化钾0.2％～0.4％，乙醇2.2％～2.4％，乙酸乙酯0.02％～0.04％，水88％～89％，原油3g/L。
10.如权利要求1所述的降解石油的复合菌剂在生物修复原油污染土壤中的应用。
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