CN108795771A - 麝香霉菌株及其制备的香料 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物工程技术领域，尤其涉及麝香霉菌株及其制备的香料。本发明提供的菌种为内生真菌麝香霉Muscodor sp.Y‑L‑43，其培养产物中富含多种挥发性组分，可用来制备天然香料。

Description

麝香霉菌株及其制备的香料

技术领域

本发明涉及微生物工程技术领域，尤其涉及麝香霉菌株及其制备的香料。

背景技术

香料、香精对食品、卷烟、饲料、化妆品和制药工业极其重要。目前，世界上香料、香精的产量约151亿美元，占据了25％左右的食品添加剂市场，且逐年增长。现今生产的香料、香精中约85％的产品是通过化学合成方法得到的。但是用化学法合成的香料存在以下严重的缺陷：一是大量的化学合成物质滥用给人们的健康带来危害；二是化学方法合成中由于缺乏专一的底物,造成产品纯度下降；三是化学合成的产物中常含消旋混合物，如从中提取目的异构体或手性香料将是非常困难并且花费巨大；四是人们对化学合成的添加剂用于食品、化妆品等日益反感。随着人们生活水平的提高，对食品添加剂需求趋向于天然、健康、安全、营养和多功能性。天然香精香料是高价值的精细化工产品和食品添加剂，而原来从天然动、植物提取的天然香料，由于原料有限，提取成本高，远远满足不了市场的需求。

目前，领域内常见的利用微生物制备天然香料主要通过：(1)用酶工程制备天然香料，例如有香兰素、内酯、酯类香料、叶醇等，生物酶的局限有以下几个原因：①酶的活性的保持。酶分子在生物体内的环境中表现出高度的活性是因为酶所处的环境以及其他分子对它的调控，一旦离开那种环境，酶的活性将大大降低，甚至失活。②酶制备的困难。酶制剂包括提取、精制、固定化等一系列复杂的工艺。目前发现的生物酶有几千种，生物体内几乎每一个生化反应都有酶的催化，但实验室制备出的酶不过几百种，而用于工业生产的商品酶仅有几十种(大部分为含有蛋白和少量其他酶的粗酶液制品，而不是纯酶)，用于手性化合物拆分和不对称合成的酶又是其中极小一部分(只有脂肪酶和酯酶等几种)，这使酶的应用产生很大的局限性。③酶的稳定性问题。酶本质上是一个手性的、有催化功能的蛋白质。它的稳定性受到物理环境、化学环境和生物环境的考验，热、紫外线等物理条件的变化，有机溶剂、pH等化学条件的变化，微生物的腐败作用等可以使酶变性，从而引起活性降低，甚至失活。④酶的成本问题。酶的生产原料一般来自动、植物和微生物，所以生产成本高，价格比化学催化剂贵，竞争力较差。(2)以天然植物为底物，如以桂花、水为底物，加入改良的酵母菌培养，可以产生桂花香韵的培养产物，与从桂花中提取的天然精油香味非常接近，但其依然无法得到大规模的培养获得。

麝香霉(Muscodor sp.)，之前有命名为产气霉，是一类属于炭角菌科的内生真菌，最早由Worapong等(2001)从肉桂树分离所得，人们利用其特有的形态学、生理学、生物化学方面的特征及核糖体RNA的序列来寻找和鉴定新的麝香霉属内生真菌，其显著特征是能产生挥发性有机化合物(volatile organic compounds，简称VOCs)，这些VOCs具有广泛的生物活性，能抑制或杀死许多病原真菌、病原细菌和一些昆虫，然而不同的菌株，其活性效果不同。由于麝香霉能产生有广泛抑菌活性的VOCs，科学家们利用GC-MS等化学分析手段分离鉴定了麝香霉产生的VOCs成分，发现不同菌株产生的VOCs成分不尽相同，其活性效果与其VOCs成分相关，以往，领域内关注的皆是麝香霉的抑菌效果。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供麝香霉菌株及其制备的香料，本发明提供的麝香酶菌株能够培养产生代谢产物，具有挥发性香气物质，可作为香原料提取天然香料。

本发明提供了保藏编号为CCTCC NO：M 2016760的麝香酶菌株。

本发明提供的麝香霉Muscodor sp.Y-L-43分离自我国云南纳板河采集野生状态下的野生稻，该菌株培养产生的代谢产物，具有挥发性香气物质，可作为香原料提取天然香料。

本发明还提供了保藏编号为CCTCC NO：M 2016760的麝香酶菌株在制备香料中的应用。

本发明提供的麝香酶菌种的保藏采用PDA固体培养基，斜面培养，10～30℃保存菌株。具体的，步骤包括：

将菌株接种到PDA斜面培养基，培养至新鲜的菌丝长出，加入经3次高压灭菌的石蜡将菌丝淹没，盖上冷冻保存管盖子，于常温下或10℃冰箱保存。

本发明提供的麝香酶菌种的保藏也可采用冷冻保存液，进行冷冻保存。温度为-80℃。具体的，步骤包括：取生长旺盛期的菌块，加入高压灭菌的冷冻保存液，将菌块淹没。将冷冻保存管依次于4℃和-20℃下放置1h后，转移至-80℃超低温冰箱中进行长期保存。

本发明提供的麝香酶菌种的活化也采用PDA固体培养基，25℃，24h黑暗条件下活化7d。

本发明还提供了一种香料的制备方法，该方法培养保藏编号为CCTCCNO：M2016760的麝香酶菌株，获得含有香料的培养物，所述培养物经提取制得香料。

在本发明实施例中，培养采用固体培养，所述培养的培养基的pH值为5.5～6.5，由小米、珍珠岩和营养液制得；

所述营养液包括土豆汁和：

葡萄糖10g/L～120g/L；

脱脂大豆粉100g/L～280g/L；

蛋白胨20g/L～200g/L；

磷酸二氢钾6g/L～22g/L；

硫酸镁3g/L～6g/L。

一些具体实施例中，所述培养的培养基的pH值为6。

一些具体实施例中，所述培养的培养基的制备方法为：每100g生小米中加入55～65ml土豆汁，用灭菌锅于120～122℃加热14～16分钟，得熟小米；冷却后与珍珠岩和营养液混合制的培养基。

所述熟小米与珍珠岩的质量比为100：(19～21)。

每120g熟小米与珍珠岩的混合物加入营养液24～26ml。

所述营养液的制备方法为：葡萄糖0.5～3g、脱脂大豆粉5～7g，蛋白胨(peptone)1～5g，磷酸二氢钾0.3～0.55g，硫酸镁0.15g，用25～50mL土豆汁溶解后调节pH至6，得营养液。所述营养液制备中涉及的物质的质量与体积仅作为实例，为了大量生产目的，在实际操作中可成倍扩大。

本发明所述的固体培养(solid-state fermentation，SSF)是在指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度固态基质中，用一种或多种微生物进行的一个生物反应过程。从生物反应过程的角度考虑，固态培养是以气相为连续相的生物反应过程，更为具体的，我们可以认为固体培养是一种在培养基为固体微粒的情况下进行利用的一种培养手段。固体培养与液体培养相比有许多显著的优点：培养基更为便宜、低能耗、投入成本低、更容易控制培养体积、产生的废水较少。以培养基的用料为例，用于固体培养的培养基比较单纯，一般来说，例如谷物类、小麦麸、小麦草、大宗谷物或农产品等均可被使用，所以培养原料成本较经济。

在本发明实施例中，所述培养的条件为黑暗，温度为23℃～28℃，时间为5～10天。

一些实施例中，培养的温度为25℃，时间为7天。

在本发明实施例中，所述提取的溶剂选自水、醇类、丙酮、氯仿、乙醚、苯或石油醚。

一些具体实施例中，提取采用的溶剂为乙醇水溶液或石油醚。

具体的，乙醇水溶液中乙醇的体积分数为65％。

在本发明实施例中，所述提取的方法为回流提取，温度为50℃～60℃，时间为8h；然后收集提取液，经过滤、浓缩后，以90vol％～100vol％的乙醇洗涤，再次过滤、浓缩，制得香料。

所述乙醇的体积分数为95％。

所述提取中，提取溶剂与培养物的体积-质量比为1L：200g。

所述提取的温度优选为55℃。

所述过滤后，取滤液。

所述浓缩采用减压浓缩挥去乙醇。

所述洗涤为将浓缩后的浸膏与乙醇混合，冷冻(-20摄氏度)静置2h后，再次过滤、浓缩。

本发明还提供了一种香料，由保藏编号为CCTCC NO：M 2016760的麝香酶菌株培养，其中包括异丁酸、β-金合欢烯、广藿香奥醇、石竹烯(I1)、环氧马兜铃烯和δ-愈创木烯。

本发明所述香料中还包括3-异丙基-6,8a-二甲基-1,2,4,5,8,8a-六氢薁、(3aS,8aS)-6,8a-二甲基-3-(丙-2-乙二烯)-1,2,3,3a,4,5,8,8a-八氢薁。

经检测，本发明所述的向量中，包括以下挥发性成分：

本发明提供的香料作为食品、药品或化妆品的添加剂的应用。

本发明提供的菌种为内生真菌麝香霉Muscodor sp.Y-L-43，其培养产物中富含多种挥发性组分，用来制备天然香料，克服了微生物技术制备香料过程中需要生物酶催化或以植物为底物的技术缺陷，通过原料的天然性实现天然香料的提取，本发明所述的内生真菌即生活在地上部分、活的植物组织内并不引起明显疾病症状的真菌。内生真菌通过固体培养——浸提可得具有香气的天然净油，具有广发的应用开发前景。本发明具有以下几个优点：(1)条件温和有些在温和条件下实现水溶液中化学方法不可能完成的多步反应，反应安全，反应在常温、常压下进行，生产场地和设备要求低；(2)环境良好培养完成，产品分离后形成的三废少；(3)无菌生产；(4)培养设备具有通用性；(5)克服了长期以来从动、植物作为天然香料惟一来源而存在的有效成分含量低，分离困难，受气候和动、植物病害影响、不破幻现有天然资源等缺陷。

生物保藏说明

麝香酶，分类命名：Muscodor sp.Y-L-43，于2016年12月16日保藏在保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为：中国武汉武汉大学。保藏编号为CCTCC NO：M 2016760。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明；

图1示麝香霉Muscodor sp.Y-L-43菌落图，具体为麝香霉Muscodor sp.Y-L-43在PDA生长7天的菌落正面照片，菌丝白色，呈辐射状生长；

图2示麝香霉Muscodor sp.Y-L-43净油总离子流图，其中横坐标为保留时间，纵坐标是峰度；随着保留时间推荐，低沸点的化合物首先出峰。

具体实施方式

本发明提供了麝香霉菌株及其制备的香料，，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

材料：

供试菌株为麝香霉Muscodor sp.Y-L-43。麝香霉Muscodor sp.Y-L-43。保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏号CCTCC NO：M 2016760；保藏时间：2016年12月16日。

本发明所涉及的仪器包括超净工作台、恒温培养箱、电子天平、pH计、烘箱、电磁炉、微波炉、冰箱、真空干燥箱、、MLS3750型高压灭菌锅、BS233S型分析天平等。

本发明涉及四种培养基，分别为PDA培养基、PDB培养基、2％麦芽汁琼脂培养基和冷冻保存培养基，其配制方法分别如下：

PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂1.5％，自来水1000mL。取定量土豆切成均匀小块，加水煮沸20分钟至土豆易成土豆泥，8层纱布过滤，加入20g葡萄糖，冷却，加自来水定容至1000mL，三角瓶装1.5％的琼脂，加入液体，封装，121℃、15min高压灭菌待用。

PDB培养基(马铃薯葡萄糖培养基)：土豆200g，葡萄糖20g，自来水1000mL。取定量土豆切成均匀小块，加水煮沸20分钟至土豆易成土豆泥，8层纱布过滤，加入20g葡萄糖，冷却，加自来水定容至1000mL，封装，121℃、15min高压灭菌待用。

2％麦芽汁琼脂培养基(malt extract agar,MEA)：在麦芽浸出粉20g、琼脂20g中加蒸馏水定容至1000mL；然后进行常规的高温灭菌(1.1个大气压，121℃下灭菌20min)。

冷冻保存培养基(液体)：葡萄糖10g，酵母提取物1g，酶解酪蛋白0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，丙三醇(甘油)180mL。用蒸馏水将葡萄糖、酵母提取物、酶解酪蛋白和酸水解酪蛋白溶解后，再加入甘油、最后用蒸馏水定容至1000mL，121℃、灭菌20min。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1、

1、Muscodor sp.Y-L-43菌株的分离获得

从我国云南纳板河采集野生状态下的野生稻，将采集的野生稻用自来水漂洗干净，野生稻叶片在75％(v/v)酒精溶液中消毒30秒，然后在1％(v/v)次氯酸钠溶液中消毒10分种，无菌水漂洗3次。用无菌刀片将叶片切成约0.6cm长的片段，置于含50μg·ml-1氨苄青霉素和50μg·ml-1链霉素的2％麦芽汁琼脂培养基(MEA)平皿上，25℃暗培养，待菌丝长出后，将菌丝顶端移接到PDA培养基；分离得到菌落白色，呈辐射状蔓延，25℃暗培养，在PDA培养基上连续三次接种，确认为单菌落，没有其他真菌或者细菌共同生长，认为是获得纯培养，命名为Muscodor sp.Y-L-43。。

该菌株在培养皿上致密呈白色，呈辐射状蔓延(图1)，生长数月后出现炭角菌科菌株的典型特征：从菌落中心处开始出现黑色炭化菌丝的菌株。

1.1、菌株的鉴定

1.1.1基因组DNA提取

将菌株Muscodor sp.Y-L-43接种在PDA平板上25℃黑暗培养一周。用接种针挑取少量菌丝块于1.5ml无菌离心管中，放入直径1mm和5mm的钢珠各5粒，在液氮中浸泡1分钟，随后在JXFSTPRP冷冻研磨机(上海净信科技有限公司)上充分研磨样品。使用真菌基因组DNA快速提取试剂盒(Axygen)进行提取Muscodor sp.Y-L-43基因组DNA。加入400μl AP1和4μl RNaseA(10mg/ml)，漩涡振荡。随后在65℃水浴孵育20分钟，充分裂解样本。加入130μlAP2，充分混匀，在冰浴上放置5分钟。14,000rpm离心8分钟，小心吸取上清液到一个新的1.5ml无菌离心管中，加入1.5倍体积的AP3/E，用枪头进行吹打混匀得到混合液，先加650μl混合液加入一个吸附柱AC中(吸附柱放在收集管中)，13,000rpm离心40秒，倒掉收集管中的废液，重复上述步骤直至加完所有混合液。在吸附柱中加入600μl漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，弃废液。将吸附柱AC重新放回收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量出去残留的漂洗液。取出吸附柱AC放入新的1.5ml无菌离心管中，在吸附膜的中间部位加入100μl洗脱缓冲液EB，室温放置5分钟，12,000rpm离心1分钟，即获得DNA样品，在-20℃保存备用。

1.1.2PCR扩增

对菌株Muscodor sp.Y-L-43的核糖体转录间隔区(ITS)基因序列进行测定。菌株Muscodor sp.Y-L-43的ITS基因的PCR正向扩增引物ITS1-F：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，反向扩增引物ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC，ITS基因的PCR扩增反应条件为：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，55℃退火40秒，72℃延伸50秒，35次循环；最后72℃延伸10分钟。

PCR反应体系为50μL，包括：

其中，2×Es Taq MasterMix购自Vazyme公司，含有Es Taq DNA Polymerase，2xEs Taq PCR buffer，3mM MgCl2和400μM dNTP mix。

1.1.3PCR产物的纯化(用AxyPrep DNAGel Extraction Kit试剂盒进行纯化)

1)在紫灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量(提前记录1.5ml离心管重量)，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100ul体积)。

2)加入3个(本发明中使用300μl)凝胶体积的BufferDE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合(每2-3min)，直至凝胶块完全熔化(约6分钟)。注：BufferDE-A为红色液体。在熔化凝胶过程中，可以帮助观察凝胶是否完全熔化。

3)加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B(即，加入150μl的BufferDE-B)，混合均匀。当分离的DNA片段小于400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇。注：加BufferDE-B后混合物颜色变为黄色，充分混匀以保证形成均一的黄色溶液。备注说明：根据引物设计位点，NSA3-NLC2扩增产物片段大小为950bp，NSI1-NLB4的扩增产物片段约800bp，其他的引物的扩增产物大小为200-250bp。

4)吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管(原始状态时，该DNA制备管被置于2ml(试剂盒内提供)离心管)中，12000g离心1min。弃滤液。

5)将制备管置回2ml离心管，加500μl的Buffer W1，12000g离心30s，弃滤液。

6)将制备管置回2ml离心管，加700μl的Buffer W2，12000g离心30s，弃滤液。以同样的方法再加700μl的Buffer W2洗涤一次，12000g离心1min。注：(a)确认在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。(b)两次使用Buffer W2冲洗能确保盐分被完全清除，消除对后续实验的影响。

7)将制备管置回2ml离心管中，12000g离心1min。

8)将DNA制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在DNA制备管的过滤膜中央加25-30ul的Eluent或去离子水，室温静置1min。12000g离心1min(收集过滤液，滤液中含的就是PCR的扩增产物)。洗脱DNA。

将纯化好的PCR产物送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序，得到以下序列如SEQ ID NO:1所示。测序结果在GenBank数据库中进行同源序列搜索以进一步确定其分类地位。将以上序列上传到NCBI中进行比对，得出菌株Muscodor sp.Y-L-43的分类地位，该菌株为麝香霉(Muscodor sp.)，属于真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，粪壳菌纲Sordariomycetes，炭角菌目Xylariales，炭角菌科Xylariaceae。

1.2Muscodor sp.Y-L-43菌株的保藏和保存

上述所得的菌株进行了如下保藏：Muscodor sp.Y-L-43，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2016年12月16日，保藏号：CGMCC NO：M 2016760。

1.2.1Muscodor sp.Y-L-43菌株的常温或低温保存。

在超净工作台，于2ml无菌冷冻保存管加入不超过1.5ml融化的PDA培养基，盖上冷冻保存管盖子，倾斜放置。待凝固后，将要保存的Muscodor sp.Y-L-43菌株接种到斜面培养基，数天后，Muscodor sp.Y-L-43菌丝成功定殖于斜面，可见新鲜的菌丝长出，加入经3次高压灭菌的石蜡将菌丝淹没，盖上冷冻保存管盖子，于常温下或10℃冰箱保存。使用时，用无菌接种针挑取菌组织，接种于平板PDA培养基上与25℃培养箱内进行活化。

1.2.2Muscodor sp.Y-L-43菌株的冷冻保存

当Muscodor sp.Y-L-43在PDA平板上生长旺盛期，置于超净工作台上，将PDA上的菌落挖取4-5块菌块，置于2ml无菌冷冻保存管，加入高压灭菌的冷冻保存液，将Muscodorsp.Y-L-43菌块淹没。盖上冷冻保存管盖子，将冷冻保存管依次于4℃和-20℃下放置1h后，转移至-80℃超低温冰箱中进行长期保存；或者使用程序降温仪，使其不至于细胞内结冰，将组织温度降到适于-80℃超低温冰箱保存。使用时，于室温中自然解冻，挑取其中的菌块接种于平板PDA培养基上进行活化。

实施例2麝香霉Muscodor sp.Y-L-43固体培养

本发明所述的固体培养(solid-state fermentation，SSF)是在指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度固态基质中，用一种或多种微生物进行的一个生物反应过程。从生物反应过程的角度考虑，固态培养是以气相为连续相的生物反应过程，更为具体的，我们可以认为固体培养是一种在培养基为固体微粒的情况下进行利用的一种培养手段。固体培养与液体培养相比有许多显著的优点：培养基更为便宜、低能耗、投入成本低、更容易控制培养体积、产生的废水较少。以培养基的用料为例，用于固体培养的培养基比较单纯，一般来说，例如谷物类、小麦麸、小麦草、大宗谷物或农产品等均可被使用，所以培养原料成本较经济。

用灭菌牙签挑取少量麝香霉Muscodor sp.Y-L-43PDA斜面保存管中的菌丝，接种在PDA培养基平皿中，置于恒温光照培养箱中(25℃，24h黑暗)活化培养7d。按照0.1～0.3％(质量％)的接种量接种至固体培养培养基上，在黑暗中于23～28℃的培养温度下培养5～10天得到麝香霉Muscodor sp.Y-L-43培养产物；固体培养培养基由以下成分组成：熟小米100g、珍珠岩19～21g和营养液24～26ml；熟小米的制备方法为：在100g生小米中加入55～65ml土豆汁，用灭菌锅于120～122℃加热14～16分钟，得熟小米；营养液的制备方法为：将葡萄糖0.5～3g、脱脂大豆粉5～7g，蛋白胨(peptone)1～5g，磷酸二氢钾0.3～0.55g，硫酸镁0.15g，用25～50ml的土豆汁溶解后调节pH至6，得营养液(呈糊状)。

实施例3乙醇浸提法制备麝香霉Muscodor sp.Y-L-43天然香料

本实施例以乙醇为溶剂，对麝香霉Muscodor sp.Y-L-43的200g固体培养产物的进行浸提，方法如下：收集固态培养物；添加1L 65％乙醇，提取温度水浴55℃；回流浸提8h；过滤、减压浓缩制得浸膏；添加200mL 95％乙醇,冷冻静置2h,过滤除杂质；浓缩制得净油。

对Muscodor sp.Y-L-43净油成分测定

内生真菌Muscodor sp.菌株Y-L-43得到的净油采用固相萃取/气相色谱/质谱技术(Solid phase microextraction/Gas chromatograph/Mass spetra,SPME/GC/MS)分析。

GC-MS分析条件：气质联用仪Agilent 6890N/6075B，化学工作站AgilentG1701DA，色谱柱Agilent HP-5MS毛细管柱(5％苯基甲基硅氧烷：30m×0.25mm×0.25μm)；色谱条件：载气为氦气；程序升温：初温30℃，保持3min，以5℃/min的速度升至220℃，保持1min；以3℃min^-1的速度升至250℃，保持1min；以10℃min^-1的速度升至280℃，保持5min；以20℃min^-1的速度升至300℃，保持10min。进样口温度290℃，进样量1μL；分流比5：1；溶剂延迟2min；质谱条件：EI电离能量70eV；离子源温度230℃；质量扫描范围60-600a.m.u。

通过GC/MS分析，得到各成分的总离子流图(图2)，采用NIST14谱库检索法确定各组分的化学成分，并按峰面积归一法计算各组分的相对百分含量，测试分析结果结合图2及表1。

表1：麝香霉Muscodor sp.Y-L-43净油主要成分

感官评价显示，麝香霉Muscodor sp.Y-L-43净油主调清雅花香和木香，包括异丁酸、β-金合欢烯、广藿香奥醇、石竹烯(I1)、环氧马兜铃烯、δ-愈创木烯等物质。主要组分为：(1)异丁酸，含量比例为14.2711％，其主要用来生产相应的酯，可用作合成香精底物和溶剂；(2)β-金合欢烯，含量比例为7.1455％，其有青香、花香并伴有香脂香气，在前调和中调中保留持久，主要天然存在于甜橙油、玫瑰油、依兰油和桔子油等精油中，在烟叶应用中存在于主流烟气中，难溶于水，溶于乙醇、乙醚、氯仿，能与大多数其它香料混合；(3)广藿香奥醇(含量3.1005％)、δ-愈创木烯(含量2.5733％)香气清淡，优雅的木香风味存在于净油中调，天然存在于广藿香油和其它精油中。(4)其他物质：石竹烯(I1)(含量17.8006％)、环氧马兜铃烯(含量11.7348％)、3-异丙基-6,8a-二甲基-1,2,4,5,8,8a-六氢薁(含量21.5956％)、(3aS,8aS)-6,8a-二甲基-3-(丙-2-乙二烯)-1,2,3,3a,4,5,8,8a-八氢薁(含量14.2367％)目前未分析出香气及特性，有待后续发现并开发利用。

实施例4石油醚浸提法制备麝香霉Muscodor sp.Y-L-43天然香料

本实施例以石油醚为溶剂，对麝香霉Muscodor sp.Y-L-43的200g固体培养产物的进行浸提，方法如下：收集麝香霉Muscodor sp.Y-L-43固态培养物干；添加1L石油醚，提取温度水浴55℃；回流浸提6h；过滤、减压浓缩制得浸膏；添加200mL 95％乙醇,冷冻静置2h,过滤除杂质；浓缩制得净油。本实施例得到的净油组分与实施例一一致，净油中主要组分包括异丁酸、β-金合欢烯、广藿香奥醇、石竹烯(I1)、环氧马兜铃烯、δ-愈创木烯等物质。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 贵州中烟工业有限责任公司

<120> 麝香霉菌株及其制备的香料

<130> MP1704721

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 519

<212> DNA

<213> Muscodor sp.

<400> 1

cattacagag ttttctaaac tcccaaccct atgtgaactt acctttgttg cttcggcggc 60

ggaggctacc ctgcggggga ttaccactta gtgattaccc tgcagtccca ggtacatttg 120

ttacccggta gtcatccccg ccggcggcca actaaactct gttttctttg gaattctgaa 180

tcataaactt aattagttaa aactttcaac aacggatctc ttggttctgg catcgatgaa 240

gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt 300

tgaacgcaca ttgcgcccat tagcattcta gtgggcatgc ctgttcgagc gtcatttcac 360

cacttaagcc ctgttgctta gcgttgggag cctacggcat agcccgtagc tccttaaagt 420

gattggcgga gttggttctc actctaagcg tagtaactat atctcgcttt tgtagtggtt 480

ccggcccctg ccgtaaaacc ccttatataa aggttgacc 519

Claims (10)

1.保藏编号为CCTCC NO：M 2016760的麝香酶菌株。

2.保藏编号为CCTCC NO：M 2016760的麝香酶菌株在制备香料中的应用。

3.一种香料的制备方法，其特征在于，培养保藏编号为CCTCC NO：M 2016760的麝香酶菌株，获得含有香料的培养物，所述培养物经提取制得香料。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述培养采用固体培养，所述培养的培养基的pH值为5.5～6.5，由小米、珍珠岩和营养液制得；

所述营养液包括土豆汁和：

葡萄糖10g/L～120g/L；

脱脂大豆粉100g/L～280g/L；

蛋白胨20g/L～200g/L；

磷酸二氢钾6g/L～22g/L；

硫酸镁3g/L～6g/L。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述培养的条件为黑暗，温度为23℃～28℃，时间为5～10天。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述提取的溶剂选自水、醇类、丙酮、氯仿、乙醚、苯或石油醚。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述提取的方法为回流提取，温度为50℃～60℃，时间为6～8h；然后收集提取液，经过滤、浓缩后，以90vol％～100vol％的乙醇洗涤，再次过滤、浓缩，制得香料。

8.一种香料，其特征在于，由保藏编号为CCTCC NO：M 2016760的麝香酶菌株制得，其中包括异丁酸、β-金合欢烯、广藿香奥醇、石竹烯(I1)、环氧马兜铃烯和δ-愈创木烯。

9.根据权利要求8所述的香料，所述香料中还包括3-异丙基-6,8a-二甲基-1,2,4,5,8,8a-六氢薁、环氧水菖蒲烯、(3aS,8aS)-6,8a-二甲基-3-(丙-2-乙二烯)-1,2,3,3a,4,5,8,8a-八氢薁。

10.权利要求8或9所述的香料作为食品、卷烟、药品或化妆品的添加剂的应用。