CN112980696A - 一种产香植物内生真菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产香植物内生真菌及其应用，涉及农业和食品生产领域，所述的产香真菌为木霉属Trichoderma spp.2‑63，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2020年10月26日，保藏编号：CCTCC NO.M2020642，该菌产生浓郁的椰子味香气，产香物质在挥发性气体中所占比例高，且为主要的抑菌物质。该产香菌可用于防治马铃薯早疫病、枸杞根腐病、苹果腐烂病、番茄灰霉病、西瓜枯萎病、小麦赤霉病、马铃薯干腐病，拓展了广谱性病害防治的研究思路，在一定范围内解决了我国在生防菌剂开发和利用上受到的限制。
Description
技术领域
本发明涉及农业和食品生产领域，具体为一种产香植物内生真菌及其应用。
背景技术
真菌挥发性物质是指真菌产生的各种含碳气态化合物的混合物，具有分子量小、易挥发、能在空气和土壤中自由扩散等特性。木霉属属于子囊菌门粪壳菌纲肉座菌目肉座菌科，广泛分布于土壤、植物根茎、树皮等生态环境中。木霉属在农业方面被用作生防制剂防治各种作物、蔬菜和水果的病害。近年来研究发现，部分木霉种能产生挥发性气体，具有强的抗真菌和促进植物生长的活性，由于该属产生的挥发性物质经研究表明可安全应用于农业和食品生产领域，显示了该属真菌挥发物作为生物农药的广泛应用前景。本发明对一株产浓郁椰子香味的木霉属真菌进行了形态和分子鉴定，并利用HS-SPME-GC-MS联用技术鉴定其挥发性物质组成，平板对峙法研究了其对常见植物病原真菌的拮抗活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产香植物内生真菌及其应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：提供一种产香植物内生真菌及其应用，
第一方面，本发明提供一种产香植物内生真菌的应用，所述的产香真菌为木霉属Trichoderma spp.2-63，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2020年10月26日，保藏编号：CCTCC NO.M 2020642，该菌产生浓郁的椰子味香气，产香物质在挥发性气体中所占比例高，所述内生真菌的分离纯化步骤为，
S1、取百里香嫩茎4-5cm，先用自来水冲洗，75％酒精浸泡3min,无菌水冲洗3次，再用体积分数0.1％升汞漂洗30s，无菌水冲洗；
S2、消毒后的百里香茎，在超净工作台于无菌条件下切成1cm*1cm的小块；
S3、置于PDA平板培养基内，每个平皿中等距接种4块，3个重复；
S4、置于28℃条件下培养；
S5、对照：最后一次的洗涤液均匀涂布在空白平板上；
S6、每天定时记录平板上分离物的生长情况，待5-6天后余接种材料处挑取菌丝，转接至新得PDA培养基继续培养，直到分离到单一菌株。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述内生真菌的鉴定分为形态学鉴定和分子生物学鉴定。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述形态学鉴定步骤为，
1)产香真菌2-63菌株在PDA培养基上28℃恒温培养；
2)将在PDA上培养了3d的产香菌株置于28℃的培养箱中；
3)打开灯光，胁迫生长，培养4d。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述分子生物学鉴定步骤为，
①真菌基因组DNA抽提；
②核糖体rDNA-ITS区段扩增。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述内生真菌对马铃薯早疫病菌、枸杞根腐病菌、苹果腐烂病菌、番茄灰霉病菌、西瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌和马铃薯干腐病菌的抑菌作用，其具体步骤是，取一块病原真菌菌饼放在已灭菌的PDA平板中心，距离病原真菌菌饼两侧3cm处的两个点对称接种2-63内生真菌，每个菌两个平行，以不接内生真菌的培养皿为对照，于28℃恒温黑暗条件下培养，培养4d测量抑菌直径，计算公式为，菌丝生长抑制率＝(对照菌落生长直径-处理菌落生长直径)/(对照菌落生长直径-4mm)×100％得出抑菌率，根据结果可以得出2-63菌株有较好的抑菌效果，对七种病原真菌都有拮抗作用。
第二方面，本发明提供一种产香植物内生真菌的应用，包括以下步骤：
A1、所述真菌2-63经培养，并产生浓郁的椰子味香气，
A2、所述真菌2-63的培养步骤为香气成分提取和挥发性物质GC-MS分析条件，
A3、所述把香气成分提取，将培养的2-63真菌制成4mm的菌饼，
A4、再装入固相微萃取瓶中，并利用顶空探头直接提取气体，
A5、所述挥发性物质GC-MS分析条件为色谱条件、程序升温、进样方式为、质谱条件和溶剂延迟，所述色谱条件，色谱柱为HP-5MS：325℃：30m×250μm×0.25μm，程序升温，柱初温50℃，保持0，以10℃/min升温至160℃，保持2min，再以10℃/min升温至200℃；载气为高纯氦气，柱流速1.0ml/min；进样方式为，分流进样，分流比为10:1，质谱条件，E1离子源，电子能量70eV，扫描范围，50-550amu，溶剂延迟2min，
A6、所述2-63在PDA培养基上第3d开始产香，7d左右香气浓度达到最大，利用GC-MS技术，从该菌挥发性成分中鉴定出2种已知化合物。
由于采用了上述技术方案，本发明相对现有技术来说，取得的技术进步是：
(1)具有强的抑菌作用：对马铃薯早疫病菌、枸杞根腐病菌、苹果腐烂病菌、番茄灰霉病菌、西瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌、马铃薯干腐病菌等抑菌率达到70％以上。
(2)与标准品作比较，该菌产香物质6-戊基-2H-吡喃-2-酮的量大，可作为食品的绿色添加剂以及香料添加物。
附图说明
图1为本发明的PDA培养示意图；
图2为本发明的菌丝孢子示意图；
图3为本发明的气质出峰示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：提供一种产香植物内生真菌及其应用，
第一方面，本发明提供一种产香植物内生真菌，所述的产香真菌为木霉属Trichoderma spp.2-63，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2020年10月26日，保藏编号：CCTCC NO.M 2020642，该菌产生浓郁的椰子味香气，产香物质在挥发性气体中所占比例高，内生真菌的分离纯化步骤为，
S1、取百里香嫩茎4-5cm，先用自来水冲洗，75％酒精浸泡3min,无菌水冲洗3次，再用体积分数0.1％升汞漂洗30s，无菌水冲洗；
S2、消毒后的百里香茎，在超净工作台于无菌条件下切成1cm*1cm的小块；
S3、置于PDA平板培养基内，每个平皿中等距接种4块，3个重复；
S4、置于28℃条件下培养；
S5、对照：最后一次的洗涤液均匀涂布在空白平板上；
S6、每天定时记录平板上分离物的生长情况，待5-6天后余接种材料处挑取菌丝，转接至新得PDA培养基继续培养，直到分离到单一菌株。
实施例1
请参阅图1-图3所示，本发明提供一种技术方案：其内生真菌的鉴定分为形态学鉴定和分子生物学鉴定；
(1)形态学鉴定步骤为，
1)产香真菌2-63菌株在PDA培养基上28℃恒温培养，生长较快，4d长满全皿，菌落白色，白色棉絮状菌丝，从中央向外围辐射生长，在边缘呈现白色菌丝簇，菌落反面白色，该菌在PDA平板上不产生孢子；
2)将在PDA上培养了3d的产香菌株置于28℃的培养箱中，打开灯光，胁迫生长，培养4d，平板上出现白绿相间的孢子簇，分生孢子梗绿色，多分枝，分生孢子梗大小36.3-52μm，长条形，分生孢子梗上多瓶梗，顶端单生或成簇生长分生孢子，分生孢子绿色，光滑，椭圆形至球形，单生或成簇生，大小为2-3μm；
3)打开灯光，胁迫生长，培养4d。
(2)分子生物学鉴定，对菌株2-63的分子鉴定实验，包括以下步骤，
①真菌基因组DNA抽提：基因组DNA提取采用真菌基因组DNA提取试剂盒提取，并置于-20℃冰箱保存备用；
②核糖体rDNA-ITS区段扩增：以真菌基因组rDNA为模板进行PCR扩增，扩增循环反应条件为：94℃预变形3min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min；35个循环，4℃保存；ITS-PCR扩增反应在50μL反应体系中进行(见下表)。引物:ITS1 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
PCR反应体系
电泳检测及切胶纯化测序：通过鉴定2-63内生真菌为木霉属；
实施例2
请参阅图1-图3所示，在实施例1的基础上，内生真菌对马铃薯早疫病菌、枸杞根腐病菌、苹果腐烂病菌、番茄灰霉病菌、西瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌和马铃薯干腐病菌的抑菌作用，其具体步骤是：取一块病原真菌菌饼放在已灭菌的PDA平板中心，距离病原真菌菌饼两侧3cm处的两个点对称接种2-63内生真菌，每个菌两个平行，以不接内生真菌的培养皿为对照，于28℃恒温黑暗条件下培养，培养4d测量抑菌直径，计算公式为：菌丝生长抑制率＝(对照菌落生长直径-处理菌落生长直径)/(对照菌落生长直径-4mm)×100％得出抑菌率，根据结果可以得出2-63菌株有较好的抑菌效果，对七种病原真菌都有拮抗作用。
实验结果如下表所示：
如上表所示：产香真菌2-63菌株对7种植物病原真菌的抑制率均在70％以上；
第二方面，本发明提供一种产香植物内生真菌的应用，包括以下步骤：
A1、所述真菌2-63经培养，并产生浓郁的椰子味香气，
A2、所述真菌2-63的培养步骤为香气成分提取和挥发性物质GC-MS分析条件，
A3、所述把香气成分提取，将培养的2-63真菌制成4mm的菌饼，
A4、再装入固相微萃取瓶中，并利用顶空探头直接提取气体，
A5、所述挥发性物质GC-MS分析条件为色谱条件、程序升温、进样方式为、质谱条件和溶剂延迟，所述色谱条件，色谱柱为HP-5MS：325℃：30m×250μm×0.25μm，程序升温，柱初温50℃，保持0，以10℃/min升温至160℃，保持2min，再以10℃/min升温至200℃；载气为高纯氦气，柱流速1.0ml/min；进样方式为，分流进样，分流比为10:1，质谱条件，E1离子源，电子能量70eV，扫描范围，50-550amu，溶剂延迟2min，
A6、所述2-63在PDA培养基上第3d开始产香，7d左右香气浓度达到最大，利用GC-MS技术，从该菌挥发性成分中鉴定出2种已知化合物。
第二方面，本发明提供一种产香植物内生真菌的应用，包括以下施工步骤：
本发明的有益效果为：
(1)具有强的抑菌作用：对马铃薯早疫病菌、枸杞根腐病菌、苹果腐烂病菌、番茄灰霉病菌、西瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌、马铃薯干腐病菌等抑菌率达到70％以上。
(2)与标准品做比较，该菌产香物质6-戊基-2H-吡喃-2-酮的量大，可作为食品的绿色添加剂以及香料添加物
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种产香植物内生真菌，其特征在于：所述的产香真菌为木霉属Trichodermaspp.2-63，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2020年10月26日，保藏编号：CCTCC NO.M 2020642，该菌产生浓郁的椰子味香气，产香物质在挥发性气体中所占比例高，且为主要的抑菌物质，所述内生真菌的分离纯化步骤为，
S1、取百里香嫩茎4-5cm，先用自来水冲洗，75％酒精浸泡3min,无菌水冲洗3次，再用体积分数0.1％升汞漂洗30s，无菌水冲洗；
S2、消毒后的百里香茎，在超净工作台于无菌条件下切成1cm*1cm的小块；
S3、置于PDA平板培养基内，每个平皿中等距接种4块，3个重复；
S4、置于28℃条件下培养；
S5、对照：最后一次的洗涤液均匀涂布在空白平板上；
S6、每天定时记录平板上分离物的生长情况，待5-6天后余接种材料处挑取菌丝，转接至新得PDA培养基继续培养，直到分离到单一菌株。
2.根据权利要求1所述的一种产香植物内生真菌，其特征在于：所述内生真菌的鉴定分为形态学鉴定和分子生物学鉴定。
3.根据权利要求2所述的一种产香植物内生真菌，其特征在于：所述形态学鉴定步骤为，
1)产香真菌2-63菌株在PDA培养基上28℃恒温培养；
2)将在PDA上培养了3d的产香菌株置于28℃的培养箱中；
3)打开灯光，胁迫生长，培养4d。
4.根据权利要求2所述的一种产香植物内生真菌，其特征在于：所述分子生物学鉴定步骤为，
①真菌基因组DNA抽提；
②核糖体rDNA-ITS区段扩增。
5.根据权利要求1所述的一种产香植物内生真菌，其特征在于：所述内生真菌对马铃薯早疫病菌、枸杞根腐病菌、苹果腐烂病菌、番茄灰霉病菌、西瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌和马铃薯干腐病菌的抑菌作用。
6.根据权利要求1所述的一种产香植物内生真菌的应用，其特征在于：包括以下步骤，
A1、所述真菌2-63经培养，并产生浓郁的椰子味香气，
A2、所述真菌2-63的培养步骤为香气成分提取和挥发性物质GC-MS分析条件，
A3、所述把香气成分提取，将培养的2-63真菌制成4mm的菌饼，
A4、再装入固相微萃取瓶中，并利用顶空探头直接提取气体，
A5、所述挥发性物质GC-MS分析条件为色谱条件、程序升温、进样方式为、质谱条件和溶剂延迟，
A6、所述2-63在PDA培养基上第3d开始产香，7d左右香气浓度达到最大，利用GC-MS技术，从该菌挥发性成分中鉴定出2种已知化合物。
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| CN202110041370.XA CN112980696A (zh) | 2021-01-13 | 2021-01-13 | 一种产香植物内生真菌及其应用 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113528355A (zh) * | 2021-08-13 | 2021-10-22 | 黑龙江省农业科学院马铃薯研究所 | 一种拮抗马铃薯多种病原真菌的木霉菌及其应用 |
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2021
- 2021-01-13 CN CN202110041370.XA patent/CN112980696A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113528355A (zh) * | 2021-08-13 | 2021-10-22 | 黑龙江省农业科学院马铃薯研究所 | 一种拮抗马铃薯多种病原真菌的木霉菌及其应用 |
| CN113528355B (zh) * | 2021-08-13 | 2022-10-04 | 黑龙江省农业科学院马铃薯研究所 | 一种拮抗马铃薯多种病原真菌的木霉菌及其应用 |
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